CN102387810A - 鉴别可用于治疗肿瘤的pten的细胞外形式 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种包含SEQ ID NO:1的经分离的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(phosphatase and tensin homolog long polypeptide,PTEN-long)、其片段和类似物,编码所述多肽的核酸和包含所述多肽的组合物。本发明提供使用PTEN-long、其片段和类似物抑制实体肿瘤中的血管生成、治疗实体肿瘤和抑制实体肿瘤生长的方法。
Description
相关申请案
本申请要求2009年2月17申请的美国临时申请案第61/207,974号的优先权,所述专利的内容以引用的方式并入本文中。
本文所揭示的工作是在政府支持下在国家癌症研究所(National Cancer Institute)的第CA082783号补助金下进行的。因此,美国政府对本发明具有某些权利。
在本申请案中,各种出版物在括号中以第一作者和年份来引用。这些参考文献的完整引用会在紧接于权利要求书前方的说明书的结尾找到。这些公开案的揭示内容以全文引用的方式并入本申请案中以更全面地描述与本发明相关的现有技术。
技术领域
无
背景技术
PTEN肿瘤抑制因子(PTEN tumor suppressor)(参见WO98/34624,其以全文引用的方式并入本文中)是一种细胞质磷酸酶,其使重要的第二信使磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸脱磷酸(phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate)(马哈马(Maehama)和迪克森(Dixon)1998)。这一活性下调由Akt的PIP3活化引发的许多致癌信号,包括抗细胞凋亡路径(apoptotic pathway)、细胞周期进程和增加细胞代谢(苏黎氏(Sulis)和帕森斯(Parsons)2003)。PTEN在癌症中的作用,从其在许多不同肿瘤类型中经常在遗传上丧失或功能上丧失,而显而易见(邦努(Bonneau)和隆基(Longy)2000)。最初发现其在神经胶质癌中缺失,此后又发现与前列腺、乳房、子宫内膜、黑素细胞、肾和肺的肿瘤发生有关。PTEN的生殖系突变也与遗传性癌症体质综合症有关,诸如考登氏综合症(Cowden′sSyndrome)(英格(Eng)2003)。PTEN丧失的小鼠模型已重演其在杂合子小鼠和组织特异性基因剔除者(tissue specific knockout)中,在许多不同组织类型中作为肿瘤抑制因子的作用(迪克里斯托凡诺(Di Cristofano),佩塞(Pesce)等人1998;夸比-阿多(Kwabi-Addo),吉利(Giri)等人2001;佩曲西利(Petrocelli)和斯林克兰(Slingerland)2001;尤(You),卡斯特里隆(Castrillon)等人2002;弗雷泽(Fraser),朱(Zhu)等人2004)。
PTEN蛋白含有N端双特异性磷酸酶结构域(N-terminal dual specificityphosphatase domain)和C端C2磷脂结合结构域(C-terminal C2phospholipid binding domain),随后为因内部存在磷酸化位点而具有调控重要性的未结构化尾部(李(Lee),杨(Yang)等人1999;瓦兹奎兹(Vazquez),拉马斯瓦米(Ramaswamy)等人2000;托雷斯(Torres)和普里度(Pulido)2001;瓦兹奎兹(Vazquez),格罗斯曼(Grossman)等人2001)。PTEN蛋白主要存在于细胞质中,然而,有越来越多的证据证明PTEN存在于细胞核中,这一定位通过NEDD4-1使蛋白质单泛素化(monoubiquitination)进行调控(贝克(Baker)2007;王(Wang),特罗特曼(Trotman)等人2007)。
在起始密码子(start codon)AUG处发生翻译起始之前核糖体对5′UTR进行扫描。尽管核糖体用来决定适当起始密码子的实际方式仍未完全了解,但mRNA本身与序列存在指示起始前复合物(pre-initiation complex)在何处减慢其扫描并开始翻译的某些性质。已显示经典“科扎克序列(Kozak sequence)”CCACCATGG(其中加下划线的ATG是起始密码子(initiation codon))是最有利于起始的序列情形(sequencecontext)(科扎克(Kozak)1991)。mRNA二级结构也可能通过实际减慢起始前复合物的扫描来促进起始,因为扫描在阅读前需要解螺旋酶来解开二级结构(科扎克((Kozak))1990)。
在某些转录物中,翻译起始可从非AUG密码子开始进行。这通常仅包含从转录物翻译来的总蛋白质中的较小百分比并且结果是产生N端不同的蛋白质的混合物质。科扎克(Kozak)描述从非AUG密码子起始翻译的效率并且发现在活体外GUG和CUG都能够起始翻译,但效率低得多(科扎克(Kozak)1989)。进一步研究已显示,甲硫氨酸的可用性可通过仍不清楚的机制来改变翻译起始的混乱性,但可能涉及由营养物敏感性激酶(nutrientsensitive kinase)使eIF2磷酸化,eIF2是43S起始前复合物的组分(赫尔希(Hershey)1991;汉纳(Hann)1994)。
已显示许多蛋白质从替代性起始密码子(alternate initiation codon)开始翻译而来。转录因子(transcription factor)c-myc具有替代性上游CUG起始密码子,当进行翻译时,其在蛋白质的N端添加14个氨基酸(汉纳(Hann)和埃森曼(Eisenman)1984)。已显示这种替代性同功异型物(alternate isoform)在伯基特氏淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma)中被选择性破坏(汉纳(Hann),金(King)等人1988)。在组织培养物中,当甲硫氨酸处于低浓度时,较长形式的myc主要在高细胞密度下转录(汉纳(Hann),索罗安布朗(Sloan-Brown)等人1992)。进一步研究已揭示,较长形式的c-myc具有生长抑制性且具有一组与经典c-myc蛋白不同的转录目标(汉纳(Hann),迪克特(Dixit)等人1994)。(弗洛基维兹(Florkiewicz)和萨默(Sommer)1989)(普拉茨(Prats),卡格德(Kaghad)等人1989)。
另外,已知蛋白质的实际亚细胞定位可由替代性起始密码子决定。在小鼠原致癌基因(proto-oncogene)int-2从上游替代性起始的情况下,CUG密码子编码细胞核定位,而AUG密码子编码用于定位于分泌路径(secretory pathway)的信号肽(signalpeptide)(阿科兰德(Acland),迪克森(Dixon)等人1990)。类似现象在人类FGF3中被描述,其中从AUG翻译的蛋白质指定为分泌路径,而从上游CUG翻译的蛋白质定位于细胞核(基弗(Kiefer),阿科兰德(Acland)等人1994)。此外,在诸如TEF-1和PRPS-3等一些真核生物蛋白质中,蛋白质完全从CUG密码子起始(平(Taira),饭笹(Iizasa)等人1990;肖(Xiao),戴维德森(Davidson)等人1991)。
指定为分泌(secretion)的蛋白质通过称为信号肽的一段疏水性氨基酸靶向内质网(endoplasmic reticulum)(布洛贝尔(Blobel),沃尔特(Walter)等人1979)。通常存在于蛋白质的N端的信号肽在翻译时结合信号识别颗粒(signal recognition particle,SRP)且使核糖体暂停并易位到粗糙内质网,在那里结合SRP受体。一旦核糖体对接,SRP-SRP受体复合物被释放,翻译通过Sec61易位子(translocon)从新开始穿过ER的内腔。在可溶性蛋白质从Sec易位子释放蛋白质后,信号肽随后裂解。在蛋白质跨越细胞薄膜(membrane)的情况下,跨膜螺旋(transmembrane helix)充当ER易位的信号肽。这些蛋白质在高尔基体(golgi)中广泛地经糖基化修饰并以分泌小泡形式穿梭到质膜(plasmamembrane)(阿尔伯特(Alberts)2002)。
已显示有许多分泌性蛋白质(secreted protein)对于癌症很重要。举例而言,已显示Wnt信号传导路径(signaling pathway)在肺癌中会发生改变。Wnt是卷曲蛋白(Frizzled)受体家族的一种分泌性配体(secreted ligand)。卷曲蛋白的Wnt活化使散乱蛋白(disheveled)解离β-连环蛋白(β-catenin)降解复合物,其包括APC,从而使β-连环蛋白含量升高并易位到细胞核,在那里其可相互作用并反式活化(transactivate)TCF转录因子。APC中的钝化突变和β-连环蛋白中的活化突变已在遗传性与偶发性结肠癌中被详细说明。另外,许多细胞外配体拮抗剂(extracellular ligand antagonist)(诸如SFRP和Wnt-5a)与Wnt竞争相同的卷曲蛋白受体。两者都已显示是肿瘤抑制因子;SFRP基因剔除小鼠发展出淋巴瘤,且已在黑色素瘤中检测到Wnt-5a的外遗传沉默(epigeneticsilencing)。
所有关于PTEN的公开报导都已指出,蛋白质定位于细胞质或细胞核中。发现许多细胞外蛋白质(磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)和多配体蛋白聚糖(syndecan))结合PTEN,分泌路径中所涉及的许多蛋白质(内质网钙结合蛋白(reticulocalbin)和钙腔蛋白(calumenin))也结合PTEN。假设PTEN进入分泌路径,从而可以进行所述相互作用。事实上,如本文所揭示,存在新颖的差异翻译的蛋白质,称为PTEN-long,其含有N端信号肽并且其被细胞外分泌。
发明内容
一种包含具有SEQ ID NO:1中所示序列的连续氨基酸残基的经分离的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含具有SEQ ID NO:5中所示序列的连续氨基酸残基的其类似物,或其各自的变异体。
一种多肽,其包含(i)SEQ ID NO:1的残基1至173,或(ii)包含SEQ ID NO:5的残基1至173的其类似物,或(iii)SEQ ID NO:1的残基22至516。
一种药物组合物,其含有包含连续氨基酸残基的磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),所述氨基酸残基具有SEQ ID NO:1中所示序列,或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含具有SEQ ID NO:5中所示序列的连续氨基酸残基的其类似物。
一种治疗受试者的实体肿瘤的方法,其包含给予所述受试者一定量的包含具有SEQ IDNO:1中所示序列的连续氨基酸残基的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含具有SEQ ID NO:5中所示序列的连续氨基酸残基的其类似物,以有效治疗受试者的实体肿瘤。
一种抑制受试者的实体肿瘤的生长的方法,其包含给予所述受试者一定量的包含具有SEQ ID NO:1中所示序列的连续氨基酸残基的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含具有SEQ ID NO:5中所示序列的连续氨基酸残基的其类似物,以有效抑制受试者的实体肿瘤的生长。
一种抑制受试者的实体肿瘤中的血管生成的方法,其包含给予所述受试者一定量的包含具有SEQ ID NO:1中所示序列的连续氨基酸残基的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含具有SEQ ID NO:5中所示序列的连续氨基酸残基的其类似物,以有效抑制受试者的实体肿瘤中的血管生成。
一种诱导受试者的实体肿瘤中的血管的血管上皮细胞发生细胞凋亡的方法,其包含给予所述受试者一定量的包含具有SEQ ID NO:1中所示序列的连续氨基酸残基的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含具有SEQ ID NO:5中所示序列的连续氨基酸残基的其类似物,以有效诱导受试者的实体肿瘤中的血管的血管上皮细胞发生细胞凋亡。
一种治疗受试者的实体肿瘤的方法,其包含给予所述受试者一定量的表达载体,所述表达载体编码包含SEQ ID NO:1的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含SEQ ID NO:5的其类似物,以在实体肿瘤的细胞中表达有效治疗所述受试者的实体肿瘤的量的PTEN-long、PTEN-long片段或其类似物。
一种包含SEQ ID NO:1的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQID NO:1的残基22至516的其片段,或包含SEQ ID NO:5的其类似物,其用于治疗受试者的实体肿瘤,抑制受试者的实体肿瘤生长,诱导受试者的实体肿瘤中的血管上皮细胞发生细胞凋亡,或抑制受试者的实体肿瘤中的血管生成。
一种组合物,其包含键合非肽试剂(non-peptide agent)的包含SEQ ID NO:1的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含SEQ ID NO:5的其类似物,所述非肽试剂分别增加PTEN-long、PTEN-long片段或其类似物的血浆半衰期(plasma half-life)。
一种经分离的核酸,其编码包含SEQ ID NO:1的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或编码包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或编码包含SEQ ID NO:5的其类似物。
一种表达载体(expression vector),其包含编码包含SEQ ID NO:1的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含SEQ ID NO:5的其类似物的核酸。
一种转化细胞(trans formed cell),其能够表达包含SEQ ID NO:1的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含SEQ ID NO:5的其类似物,其中所述细胞已将编码PTEN-long或其类似物的重组DNA整合到其基因组中。
一种宿主细胞(host cell),其能够表达包含SEQ ID NO:1的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含SEQID NO:5的其类似物,其中所述宿主细胞包含编码PTEN-long或其类似物的质粒。
一种方法,其包含混合(1)包含SEQ ID NO:1的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含SEQ ID NO:5的其类似物;和(2)增加PTEN-long或其类似物的血浆半衰期的非肽试剂,以使得包含SEQ ID NO:1的PTEN-long或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段或包含SEQ ID NO:5的其类似物键合非肽试剂,所述非肽试剂分别增加PTEN-long、PTEN-long片段或其类似物的血浆半衰期。
一种经分离的核酸分子,其由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6核酸序列的具有至少20个核苷酸的片段或在严格条件下分别与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6核酸序列的互补序列或与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6特异性杂交的其互补序列(complement)组成。
一种经分离的抗体或其片段,其中所述抗体或其片段结合(1)包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-173的PTEN-long多肽;或(2)包含SEQ ID NO:5的其类似物;或(3)具有SEQID NO:3中所示序列的氨基酸;或(4)包含SEQ ID NO:1的残基22至516的PTEN-long片段。
一种经分离的抗体或其片段,其中所述抗体或其片段结合PTEN-long的构象抗原决定基(conformational epitope),其中所述PTEN-long包含SEQ ID NO:1的残基1-173中所示的序列,但其中所述抗体不结合PTEN。
一种经分离的抗体或其片段,其中所述抗体或其片段结合PTEN-long的抗原决定基,其中所述PTEN-long包含SEQ ID NO:1的残基1-173中所示的序列,但其中所述抗体不结合PTEN。
一种SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的肽片段,所述片段具有抗肿瘤、抗血管生成或抗细胞凋亡活性。
附图说明
图1.PTEN-long构筑体(Construct)的图。显示形成用来驱动从内源性起始位点(endogenous start site)或替代性起始位点(alternate start site)开始表达PTEN的组合的表达构筑体。经典PTEN以黑色显示,而UTR中的翻译区以灰色显示。
图2.智人(Homo sapiens)PTEN mRNA的图。PTEN mRNA编码与所示经典ATG起始密码子同框且位于其上游的173个氨基酸。翻译从经典ATG上游的核苷酸-519处的CTG开始。延长部分显示为SEQ ID NO:1的残基1-173。
图3.PTEN直系同源物的N端的比对(Alignment)。在Vector NTI(英杰公司(Invitrogen))上使用BLOSUM62计分矩阵(scorematrix)比对来自指定物种的PTEN蛋白序列。智人和小家鼠(Mus musculus)(阿斯特里克斯(asterix))的延长的N端序列使用ORFinder(NCBI),从公开的mRNA,使用距离经典AUG起始密码子为-519(智人)和-520(小家鼠)处的CUG替代性起始密码子翻译。来自智人的mRNA序列(NM_000314)和来自小家鼠的mRNA序列(NM_008960)。意大利蜂(Apis mellifera)序列是从贝勒医学院蜜蜂基因组计划(Baylor College of Medicine Honey Bee Genome Proj ect)获得。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)PTEN的蛋白质序列(Daf-18)是从Wormbase下载。黄牛(Bos Taurus)(XM_613125)和黑猩猩(Pan troglodytes)(XP_521544)是从NCBI下载。
图4.存在PTEN-long的证据。A)考察具有两种不同PTEN抗体的不同细胞系。MCF10A和HEK293是PTEN的野生型。BT549和HCC1937是PTEN缺失型(PTEN null)并且ZR-75-1在PTEN(L136)处具有突变;B)进一步考察具有识别PTEN与PTEN-long两者的PTEN单克隆抗体的不同细胞系;C)Wt ES细胞表达大量PTEN-long。PTEN-long对这些细胞中的稳定PTEN shRNA表达敏感并且完全不存在于PTEN基因剔除细胞中。pAkt含量在很大程度上与PTEN含量反相关;D)PTEN siRNA使得阻断HEK293细胞中PTEN和PTEN-long的表达。E)质粒在PTEN缺失型PC3细胞系中的外源性表达。PTENorf仅编码从起始密码子AUG开始的ORF(第2泳道)。添加ATR(ATR=替代性翻译区)使得能够微弱地翻译PTEN-long(第3泳道)。上游起始位点突变为ATG使蛋白质补体完全转变为PTEN-long(第5和第6泳道)。ATG起始密码子突变为ATA消除了55kDa条带(第4和第6泳道)。F)针对由5′ATR编码的氨基酸所产生且用于HEK293的细胞溶胞物(cell lysate)以及过度表达PTENorf或编码5′ATR的质粒(ATG/ATG)的PTEN缺失型U87细胞系中的抗体。PTEN-long可见于仅过度表达5′ATR的细胞中。U87细胞中所观察到的背景条带存在于印迹(blot)底部。
图5.信号肽预测。翻译PTEN 5′UTR序列且输入SignalIP3.0中。使用真核生物信号肽的隐马尔可夫模型(Hidden markov model)进行预测。N区(N-region)表示信号肽的带正电N端序列。H区是信号肽的疏水性核心。C区是由脯氨酸标记的轻微极性区域,脯氨酸通常破坏疏水性核心的螺旋。裂解概率(cleavage probability)预示裂解位点释放信号肽从而允许蛋白质释放到ER内腔中。(戴贝(Dalbey)和黑金(Heijne),2002)。预测在位置21处发生裂解。
图6.伴刀豆球蛋白A(ConcanavalinA)捕捉(pulldown)。溶解HEK293细胞且使用伴刀豆球蛋白琼脂糖捕捉糖基化蛋白质。通过SDS-PAGE分解洗脱液且针对PTEN(6H2.1)进行免疫印迹。相对于输入量,可在捕捉物中观察到PTEN-long富集。注意到较长PTEN条带的富集。PTEN具有多个可能的O-糖基化位点(O-glycosylation site),但仅具有一个N-糖基化位点。我们在捕捉分析中使用结合糖部分的凝集素伴刀豆球蛋白-A(lectinconcanavalin-A)来确定HEK293细胞中PTEN补体的一部分是否被糖基化。我们能够纯化含约50%PTEN-long的PTEN混合物,其中PTEN-long相对于正常PTEN大量富集。这说明PTEN-long是糖基化的且PTEN的细胞质55kDa形式是糖基化的或PTEN-long在细胞外裂解。
图7.PTEN和PTEN-β结合乙酰肝素(heparan)。使小鼠肝提取物通过1ml HiTrap乙酰肝素琼脂糖(Heparan sepharose)(安玛西亚公司(Amersham))柱。用500mM NaCl洗涤所述柱且用连续柱体积的1M NaCl洗脱蛋白质。通过SDS-PAGE使用PTEN单克隆抗体分析洗脱份(Fraction)中的PTEN。先前已显示PTEN对于带高度负电的物质具有亲和力,一种造成PTEN偏好高阴离子性PtdIns(3,4,5)P3的性质(达斯(Das),迪克森(Dixon)等人2003)。因为乙酰肝素是带最多负电的生物分子之一,所以我们假定乙酰肝素有效介导PTEN与细胞外基质(extracellular matrix)的结合。使用来自小鼠肝脏的蛋白质提取物,我们发现PTEN以高亲和力结合乙酰肝素。此外,从使用1M NaCl从肝素琼脂糖柱上连续洗脱PTEN也洗脱出PTEN-long。
图8.蛋白酶保护分析。将HEK293细胞再悬浮于递增浓度的蛋白酶K(proteinaseK)中。将Triton添加到含有最高浓度的蛋白酶K的反应中至最终浓度为0.2%。用PMSF停止反应且在拉姆利缓冲液(laemlli buffer)中制备细胞溶胞物。通过SDS-PAGE在8%聚丙烯酰胺凝胶上解析溶胞物且针对PTEN(6H2.1)、AKT、E-钙粘素(E-cadherin)进行免疫印迹。PTEN免疫印迹的较大条带表示PTEN-long。这些数据显示E-钙粘素和PTEN-long主要位于细胞表面上。
图9.来自条件培养基的肝素亲和纯化的PTEN和PTEN-long的高盐洗脱。可在从条件培养基进行亲和纯化后从HiTrap肝素(安玛西亚公司(Amersham))柱洗脱PTEN和PTEN-long。针对PTEN尾部(上方)的单克隆抗体与对翻译到5′ATR中的氨基酸具有特异性的抗体都识别质量为约55kDa的蛋白质条带。
图10.从人类血清纯化PTEN。用蛋白质A/G预清除来自AB血液的人类血清中的抗体并且经肝素琼脂糖。通过SDS-PAGE解析洗脱液并且针对PTEN进行免疫印迹或仅使用二级抗体(secondary)进行以控制重链污染。
图11A-11C.PTEN-long的抗血管生成活性。(A)PTEN-long在发育中的视网膜中的血管和毛细血管的子集中表达。这种表达模式与PTEN的经典形式形成鲜明对比且与PTEN-long在诱导这些区域中发生的血管退化中的作用一致。当根据右上方的全视网膜溶胞物的蛋白质印迹(western blot),利用高氧(B)诱导这种血管退化过程,并且通过在低氧条件下内皮细胞中的PTEN-long丧失(C)诱导这种血管退化过程时,PTEN-long的显著上调使这一相关性得到增强。这些发现表明PTEN-long适用作抗血管生成疗法,例如治疗糖尿病性视网膜病变以及高增生性血管病症。箭头指示CD34和PTEN-long阳性组织(血管)。
图12.PTEN-long的促细胞凋亡活性。如所指示,在用经纯化PTEN-long处理24小时的MCF-10A乳房上皮细胞中诱导细胞凋亡。卡斯蛋白酶3(Caspase 3)裂解指示细胞凋亡活性。
图13.用PTEN-long处理小鼠。用PTEN-long或空载体对照(Empty Vector Control)处理十天后通过测径器(Caliper)测量所测得的肿瘤尺寸的图。用含ATG/ATG PTEN-long的pcDNA3.1His V5载体转染293细胞。在转染后48小时制备细胞质溶胞物且流经V5-抗体珠粒并用V5肽洗脱。下方展示V5-珠粒纯化洗脱液的蛋白质印迹。最初观察到PTEN-long可用于治疗肿瘤。使用U87胶质母细胞瘤细胞(glioblastoma cell)(1百万个)注入scid小鼠的乳房脂肪垫中来建立异种移植物(Xenograft)。在移植后约两周开始处理。
图14.用PTEN-long处理小鼠的结果。图展示用对照和PTEN-long注射液处理14天的小鼠的存活分率(以天计)。
图15.将PTEN(缺乏5′UTR的PTENorf)、PTEN-long和氨基酸305处的G突变为R(其类似于PTENorf中的G129R突变)的PTEN-long的指定构筑体转染到293细胞中。使用来自这些细胞的经纯化蛋白质,显示PTEN-long是活性磷酸酶,而PTEN-long G305R突变体(其在PTEN中为G129R)使磷酸酶活性降低。
图16.在使用PTEN-long(G305R)突变体的实验中显示,磷酸酶活性是PTEN-long活性所必需的。基于PTEN文献,已知在C2结构域内所作的截短使蛋白质不稳定,并且基于PTEN晶体结构,相信C2结构域与磷酸酶结构域之间的相互作用对于磷酸酶活性至关重要。因此,在C端,PTEN-long活性的最小结构域将需要C2结构域,但不需要尾部。在N端,预测的裂解位点是在氨基酸21处,且因此蛋白质的功能区在这一区域内。就这一点来说,重要的是应注意,当用PTEN或用PTEN-long平行处理U87肿瘤时,PTEN处理未观察到明显作用,仅PTEN-long处理有明显作用。
图17.从经含ATG/ATG-PTEN long的具有His和V5标签的pcDNA3.1表达载体转染的293细胞中纯化PTEN-long。在Ni+柱洗脱后,在凝胶过滤柱中解析洗脱液。OD280以蓝线显示。洗脱份7-18中富含PTEN-long。这一实验的产量为约1mg。箭头指示PTEN-long和迁移改变的PTEN-long产物。
图18A-18B.(A)LNCaP前列腺癌细胞对PTEN-long经纯化蛋白质的剂量反应(DoseResponse),使用细胞死亡作为读数(蛋白质是通过ARVYS进行纯化)。1×等于每毫升0.33微克。在无生长因子的培养基中处理细胞。24小时后,用无血清培养基洗涤细胞且在拉姆利样品缓冲液(Laemmli sample buffer)中溶解。对于指定蛋白质进行蛋白质印迹。(B)用PTEN-long、PTEN-long(G305R)或模拟对照(Mock control)处理的U87胶质母细胞瘤细胞显示诱导细胞凋亡,如PARP裂解和丝氨酸473处pAKT信号的下调所指示。这些数据进一步证实PTEN-long可诱导细胞凋亡和减少PI3K/AKT信号传导。
图19A-19C.如利用测径器和使用荧光素酶报导基因(luci ferase reporter)结合精诺真(xenogen)活动物成像系统所测量,经AKTA纯化的PTEN-long蛋白能够在五天时间内减小肿瘤尺寸。每天给与小鼠约0.05mg PTEN-long持续五天。将1百万个U87胶质母细胞瘤细胞注射至由于感染FUW-荧光素酶-neo而表达荧光素酶的乳房脂肪垫中,从而建立异种移植物。在用精诺真成像系统成像前10分钟,腹膜内给小鼠注射荧光素(luciferin)。(A)在处理前(左图)和处理第五天(右图)对4只小鼠进行荧光素酶测量。(B)在处理前和在处理5天期间进行测径器测量,以cm2计。(C)如图中所成像的利用精诺真系统检测到的光子。显示小组中四只小鼠的标准误差。对第0天至第5天检测到的光子进行学生t检验(Student t-test)。
图20.在独立实验中,让U87肿瘤生长到1.5cm2,随后用PTEN(orf-403氨基酸;n=5)、PTEN-long(G305R;n=5)或野生型PTEN-long(n=4)处理。处理5天后,经PTEN-long处理的小鼠的平均发光变化(average change luminescence)显示显著减少,但经PTEN或PTEN-long(G305R)处理的小组未减少。发光减少与肿瘤尺寸减小有关。这些数据说明PTEN-long需要5′ATR和磷酸酶活性来起作用。
图21A-21C.经PTEN-long处理的U87异种移植物的分析说明细胞凋亡的活化和PI3K信号传导的抑制。如上所述处理肿瘤5天。(A)指定处理5天后收集经PTEN-long野生型和G305R处理的肿瘤并溶解以进行蛋白质印迹分析(western analysis)。PTEN-long的野生型蛋白质能够降低FOXO和AKT磷酸化并活化卡斯蛋白酶-3裂解。(B)将如所指定处理5天的代表性肿瘤固定于福尔马林(formalin)中并用石蜡包埋。针对检测已裂解的卡斯蛋白酶-3(细胞凋亡的标记物)的抗体将切片染色。经PTEN-long处理的细胞的凋亡细胞百分比显著增加,P=0.0419,学生t检验。(C)已裂解卡斯蛋白酶-3染色的代表性影像。
图22A-22B.在用PTEN-long处理5天的相同肿瘤中,血管数目大大减少。指定处理5天后收集经PTEN-long野生型和G305R处理的肿瘤且固定于福尔马林中并用石蜡包埋。针对检测CD31(作为血管内衬的内皮细胞的标记物)的抗体将切片染色。(A)经PTEN-long处理的细胞的每个视野内的血管数目显著减少(40×物镜),P=0.007579,学生t检验。(B)CD31染色的代表性影像。
图23A-23B.在6个组(每组n=3)中建立U87异种移植物,且通过肌肉内(IM)、腹膜内(IP)、肿瘤内(IT)、皮下(SC)、静脉内(IV)注射,用PTEN-long处理四天。(A)如利用测径器所测量的第0天至第4天的平均肿瘤尺寸变化(CM2)。(B)右侧展示精诺真成像的代表性影像。从这一数据,我们可推断出与未经处理的小鼠相比,所有注射方法都会影响肿瘤生长,并且仅经IM处理的小组显示退化量显著较低。
图24A-24C.对来自乳房、脑部和前列腺的6个细胞系进行异种移植实验(Xenograftexperiment)。上方是对4个乳癌细胞系所绘制的变化图。(A、B和D)经过指定处理天数,如利用测径器所测量的肿瘤表面积(cm2)的图。(C)处理仅24小时后即见到HCT-1143细胞中的变化。在所有四个细胞系中,处理后的肿瘤尺寸明显减小。
图25.PTEN-long结合于细胞。将PTEN-long蛋白添加到在冰上的U87细胞培养基中持续10分钟,固定,接着针对PTEN-long用识别它的抗体进行染色。
图26.迈尔斯分析(Miles Assay):PTEN-long抑制血管渗透性(vascularpermeability)的诱导。这种抑制可通过将经纯化蛋白质与PTEN抗体(6H2.1)一起预培育来逆转。PTEN-long能够抑制VEGF诱导的血管渗透性。这种诱导可通过将PTEN-long与针对PTEN产生的抗体一起预培育来恢复,但用对照IgG不能恢复。
具体实施方式
一种包含具有SEQ ID NO:1中所示序列的连续氨基酸残基的经分离的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含具有SEQ ID NO:5中所示序列的连续氨基酸残基的其类似物,或其各自的变异体。
一种多肽,其包含(i)SEQ ID NO:1的残基1至173,或(ii)包含SEQ IDNO:5的残基1至173的其类似物,或(iii)SEQ ID NO:1的残基22至516。
一种药物组合物,其含有包含连续氨基酸残基的磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),所述连续氨基酸残基具有SEQ ID NO:1中所示序列,或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含具有SEQ ID NO:5中所示序列的连续氨基酸残基的其类似物。
一种治疗受试者的实体肿瘤的方法,其包含给予所述受试者一定量的包含具有SEQ IDNO:1中所示序列的连续氨基酸残基的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含具有SEQ ID NO:5中所示序列的连续氨基酸残基的其类似物,以有效治疗受试者的实体肿瘤。
一种抑制受试者的实体肿瘤的生长的方法,其包含给予所述受试者一定量的包含具有SEQ ID NO:1中所示序列的连续氨基酸残基的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含具有SEQ ID NO:5中所示序列的连续氨基酸残基的其类似物,以有效抑制受试者的实体肿瘤的生长。
一种抑制受试者的实体肿瘤中的血管生成的方法,其包含给予所述受试者一定量的包含具有SEQ ID NO:1中所示序列的连续氨基酸残基的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含具有SEQ ID NO:5中所示序列的连续氨基酸残基的其类似物,以有效抑制受试者的实体肿瘤中的血管生成。
一种诱导受试者的实体肿瘤中的血管的血管上皮细胞发生细胞凋亡的方法,其包含给予所述受试者一定量的包含具有SEQ ID NO:1中所示序列的连续氨基酸残基的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含具有SEQ ID NO:5中所示序列的连续氨基酸残基的其类似物,以有效诱导受试者的实体肿瘤中的血管的血管上皮细胞发生细胞凋亡。
在本文所述方法的一实施例中,肿瘤是癌性肿瘤。在本文所述方法的一实施例中,癌性肿瘤是受试者的神经胶质细胞、前列腺、卵巢、子宫、子宫内膜、乳房、黑素细胞、肾、肺、结肠、头部、颈部或胰脏的肿瘤。
在本文所述方法的一实施例中,癌性肿瘤是由PTEN或由PI3K路径(PI3Kpathway)活化或呈PTEN阴性。
在本文所述方法的一实施例中,PTEN-long或其类似物或PTEN-long片段通过直接引入实体肿瘤中来给予受试者。在本文所述方法的一实施例中,PTEN-long或其类似物或PTEN-long片段是注射至实体肿瘤中。在本文所述方法的一实施例中,PTEN-long或其类似物或PTEN-long片段是通过导管直接引入实体肿瘤中。在本文所述方法的一实施例中,PTEN-long或其类似物或PTEN-long片段是通过直接引入供应实体肿瘤的血管中来给予受试者。在本文所述方法的一实施例中,PTEN-long或其类似物或PTEN-long片段是注射至供应实体肿瘤的血管中。在本文所述方法的一实施例中,PTEN-long或其类似物或PTEN-long片段是通过导管直接引入供应实体肿瘤的血管中。在本文所述方法的一实施例中,PTEN-long或其类似物或PTEN-long片段是静脉内给予受试者。在本文所述方法的一实施例中,PTEN-long或其类似物或PTEN-long片段是皮下给予受试者。
一种治疗受试者的实体肿瘤的方法,其包含给予所述受试者一定量的表达载体,所述表达载体编码包含SEQ ID NO:1的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含SEQ ID NO:5的其类似物,以在实体肿瘤的细胞中表达有效治疗所述受试者的实体肿瘤的量的PTEN-long、PTEN-long片段或其类似物。
一种包含SEQ ID NO:1的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQID NO:1的残基22至516的其片段,或包含SEQ ID NO:5的其类似物,其用于治疗受试者的实体肿瘤,抑制受试者的实体肿瘤的生长,诱导受试者的实体肿瘤的血管上皮细胞发生细胞凋亡,或抑制受试者的实体肿瘤中的血管生成。
在用于本文所述用途的化合物的一实施例中,肿瘤是癌性肿瘤。在本文所述方法的一实施例中,癌性肿瘤是神经胶质癌、前列腺癌、乳癌、子宫内膜癌、黑素细胞癌、肾癌或肺癌肿瘤。
在用于本文所述用途的化合物的一实施例中,癌性肿瘤是由PTEN或由PI3K路径活化或呈PTEN阴性。
一种组合物,其包含键合非肽试剂的包含SEQ ID NO:1的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含SEQ ID NO:5的其类似物,所述非肽药剂分别增加PTEN-long、PTEN-long片段或其类似物的血浆半衰期。
在一实施例中,本文所述组合物进一步包含药物载剂。在本文所述组合物的一实施例中,增加血浆半衰期的非肽试剂是聚乙二醇(PEG)。在所述组合物的一实施例中,PEG键合PTEN-long、PTEN-long片段或其类似物的C端或N端。在所述组合物的一实施例中,增加血浆半衰期的非肽试剂是氯甲酸-9-芴基甲酯(Fmoc)或(7-磺酸基)-9-芴基甲氧羰基。
一种经分离的核酸,其编码包含SEQ ID NO:1的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或编码包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或编码包含SEQ ID NO:5的其类似物。
在一实施例中,核酸包含具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6中所示序列的连续核苷酸。在一实施例中,核酸包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6中所示序列的连续核苷酸残基503至2243。在一实施例中,核酸包含具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7中所示序列的连续核苷酸。在一实施例中,核酸包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7中所示序列的连续核苷酸残基503至2243。在一实施例中,核酸是RNA。在一实施例中,核酸是DNA。在一实施例中,核酸是cDNA。
一种表达载体,其包含核酸,所述核酸编码包含SEQ ID NO:1的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含SEQ IDNO:5的其类似物。
一种转化细胞,其能够表达包含SEQ ID NO:1的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含SEQ ID NO:5的其类似物,其中所述细胞已将编码PTEN-long或其类似物的重组DNA整合到其基因组中。
一种宿主细胞,其能够表达包含SEQ ID NO:1的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含SEQ ID NO:5的其类似物,其中所述宿主细胞包含编码PTEN-long或其类似物的质粒。
在一实施例中,宿主细胞是细菌细胞。在一实施例中,宿主细胞是哺乳动物细胞。
一种方法,其包含混合(1)包含SEQ ID NO:1的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含SEQ ID NO:5的其类似物;和(2)增加PTEN-long或其类似物的血浆半衰期的非肽试剂,以使得包含SEQ ID NO:1的PTEN-long或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段或包含SEQ ID NO:5的其类似物键合非肽试剂,所述非肽试剂分别增加所述PTEN-long、PTEN-long片段或其类似物的血浆半衰期。
一种经分离的核酸分子,其由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6核酸序列的具有至少20个核苷酸的片段或在严格条件下与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的核酸序列的互补序列或与SEQ ID NO:2SEQ ID NO:6特异性杂交的其互补序列组成。
一种经分离的抗体或其片段,其中所述抗体或其片段结合(1)包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-173的PTEN-long多肽;或(2)包含SEQ ID NO:5的其类似物;或(3)具有SEQID NO:3中所示序列的氨基酸;或(4)包含SEQ ID NO:1的残基22至516的PTEN-long片段。
在一实施例中,抗体是单克隆抗体(monoclonal antibody)。在一实施例中,抗体是抗体片段。在一实施例中,抗体片段是Fab、Fab′、F(ab′)2或Fv片段。在一实施例中,抗体片段是单链抗体(single-chain antibody)。在一实施例中,抗体是人源化抗体(humanized antibody)。
一种经分离的抗体或其片段,其中所述抗体或其片段结合PTEN-long的构象抗原决定基(conformational epitope),其中所述PTEN-long包含SEQ ID NO:1的残基1-173中所示的序列,但其中抗体不结合PTEN。
在一实施例中,抗体结合包含SEQ ID NO:1的残基153-173中的任一者的抗原决定基(epitope)。
一种经分离的抗体或其片段,其中所述抗体或其片段结合PTEN-long的抗原决定基,其中所述PTEN-long包含SEQ ID NO:1的残基1-173中所示的序列,但其中抗体不结合PTEN。
在一实施例中,抗体结合SEQ ID NO:1的残基153-173或其一部分。
一种SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的肽片段,所述片段具有抗肿瘤、抗血管生成或抗细胞凋亡活性。在一实施例中,肽包含5-10个、10-20个、20-30个或30-40个氨基酸。在一实施例中,肽包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸1-173。在一实施例中,肽包含SEQ IDNO:1的连续氨基酸残基22至516。在一实施例中,肽不包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的连续氨基酸残基174至576。
如本文中所使用,物质的“防治有效(prophylactically effective)”量是有效预防或延迟给予所述物质的受试者的特定病理学病状(given pathologicalcondition)发作的量。
如本文中所使用,物质的“治疗有效(therapeutically effective)”量是有效治疗、改善或减轻罹患特定病理学病状且给予所述物质的受试者的特定病理学病状的症状或病因的量。
在一实施例中,治疗或防治有效量为每次给药每位受试者约1mg试剂至每次给药每位受试者约1g试剂。在另一实施例中,治疗或防治有效量为每位受试者约10mg试剂至每位受试者500mg试剂。在另一实施例中,治疗或防治有效量为每位受试者约50mg试剂至每位受试者200mg试剂。在另一实施例中,治疗或防治有效量为每位受试者约100mg试剂。在另一实施例中,治疗或防治有效量是选自每位受试者50mg试剂、每位受试者100mg试剂、每位受试者150mg试剂、每位受试者200mg试剂、每位受试者250mg试剂、每位受试者300mg试剂、每位受试者400mg试剂和每位受试者500mg试剂。
“给予(Administering)”试剂可使用所属领域的技术人员已知的各种方法和传递系统(delivery system)中的任一者来实施或进行。给予可为例如静脉内、经口、经鼻、腹膜内、通过脑脊液、通过植入物、经粘膜、经皮、肌肉内、血管内、动脉内、冠状动脉内、心肌内或皮下。
术语“PTEN-long类似物(PTEN-long analogue)”涵盖具有一个或一个以上经修饰氨基酸,但保留与SEQ ID NO:1的至少90%序列相似性,且如通过下文所述的活体内(invivo)研究所测量保留或改善抑制肿瘤生长的活性的多肽。明确排除PTEN本身(即由仅SEQID NO:1的残基174-576定义的多肽)。
术语“PTEN-long变异体(PTEN-long variant)”涵盖在PTEN-long的N端或C端或两者具有一个或一个以上其它氨基酸(通常具有少于5个其它氨基酸)且如通过下文所述的活体内研究所测量保留或者改善抑制肿瘤生长的活性的多肽。
术语“PTEN-long类似物变异体(PTEN-long analogue variant)”涵盖在PTEN-long类似物(即SEQ ID NO:5)的N端或C端或两者具有一个或一个以上其它氨基酸(通常具有少于5个其它氨基酸)且如通过下文所述的活体内研究所测量保留或者改善抑制肿瘤生长的活性的多肽。
本文中提及PTEN-long类似物的所有实施例在加以必要的变更下都适用于PTEN-long变异体。
PTEN-long有时另外称为PTEN-beta、PTEN-β、PTEN-S。
用于PTEN-long、PTEN-long类似物、PTEN-long变异体、PTEN-long类似物变异体或其各自的接合物(conjugate)的可注射药物传递系统包括溶液、悬浮液、凝胶、微球体和聚合可注射液(polymeric injectable),且可包含赋形剂,诸如溶解性改变剂(solubility-altering agent)(例如乙醇、丙二醇和蔗糖)和聚合物(例如聚辛酰基丙酮(polycaprylactone)和PLGA类)。可植入系统(Implantable system)包括棒状物和盘状物,且可含有赋形剂,诸如非限制性实例PLGA和聚辛酰基丙酮。
用于本发明的组合物和化合物的口服传递系统(Oral delivery system)包括片剂和胶囊。这些系统可含有赋形剂,诸如粘合剂(例如羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)、其它纤维素物质和淀粉)、稀释剂(例如乳糖和其它糖、淀粉、磷酸二钙和纤维素物质)、崩解剂(例如淀粉聚合物和纤维素物质)和润滑剂(例如硬脂酸盐和滑石粉)。
用于本发明的组合物和化合物的经粘膜传递系统(Transmucosal deliverysystem)包括贴片、片剂、栓剂、子宫托、凝胶和乳膏,且可含有赋形剂,诸如增溶剂和增强剂(例如丙二醇、胆汁盐和氨基酸)和其它媒剂(例如聚乙二醇、脂肪酸酯和衍生物,以及亲水性聚合物,诸如羟丙基甲基纤维素和透明质酸)。
用于本发明的组合物和化合物的经皮传递系统(Dermal delivery system)包括例如水性和非水性凝胶、乳膏、多重乳液、微乳液、脂质体、软膏、水性和非水性溶液、洗剂、气雾剂、烃类基质和散剂,且可含有赋形剂,诸如增溶剂、渗透增强剂(例如脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)和亲水性聚合物(例如聚卡波非(polycarbophil)和聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone))。在一实施例中,医药学上可接受的载剂是脂质体或经皮增强剂。
用于本发明的组合物和化合物的可复原传递系统(reconstitutable deliverysystem)的溶液、悬浮液和散剂包括媒剂,诸如悬浮剂(例如树胶、三仙胶(zanthans)、纤维素和糖)、保湿剂(例如山梨糖醇)、增溶剂(例如乙醇、水、PEG和丙二醇)、表面活性剂(例如月桂基硫酸钠、斯盘(Spans)、吐温(Tweens)和十六烷基吡啶)、防腐剂和抗氧化剂(例如对羟基苯甲酸酯(paraben)、维生素E和C以及抗坏血酸)、抗结块剂、涂布剂和螯合剂(例如EDTA)。
如本文中所使用,“5′ATR”是如下文实验部分中所述的5′替代性翻译区。
如本文中所使用,“药物载剂(pharmaceutical carrier)”是用于向动物或人类传递本发明化合物或组合物的医药学上可接受的溶剂、悬浮剂或媒剂。载剂可为液体、气雾剂、凝胶或固体且根据所考虑的计划给药方式进行选择。
“非肽试剂”的意思是任何化学实体,包括(但不限于)糖酸聚合物(glycomer)、聚合物、小分子(即基于烃的分子或分子量小于1000的有机分子)、脂质、脂质体。非肽试剂的实例包括(但不限于)PEG、Fmoc和FMS。
如本文中所使用,“实体肿瘤”包括癌性和非癌性实体肿瘤。癌性实体肿瘤包括(但不限于)胆道癌;脑癌,包括胶质母细胞瘤和神经管母细胞瘤(medulloblastoma);乳腺癌;子宫颈癌;绒膜癌;结肠癌;子宫内膜癌;食道癌;胃癌;上皮内赘生物(intraepithelial neoplasm),包括鲍温氏病(Bowen′s disease)和佩吉特氏病(Paget′s disease);肝癌;肺癌;淋巴瘤,包括霍奇金氏病(Hodgkin′s disease)和淋巴细胞性淋巴瘤;神经母细胞瘤;口腔癌,包括鳞状细胞癌;卵巢癌,包括由上皮细胞、基质细胞、生殖细胞和间叶细胞引起的卵巢癌;胰腺癌;前列腺癌;结肠直肠癌;肉瘤,包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤;皮肤癌,包括黑色素瘤、卡堡氏肉瘤(Kaposi′ssarcoma)、基底细胞癌(basocellular cancer)和鳞状细胞癌;睾丸癌,包括胚细胞肿瘤(精原细胞瘤、非精原细胞瘤[畸胎瘤、绒膜癌])、基质肿瘤和生殖细胞肿瘤;甲状腺癌,包括甲状腺腺癌和髓样癌;和肾癌,包括腺癌和威尔姆氏瘤(Wilms tumor),但不包括非实体组织肿瘤,诸如白血病和其它血液学赘生物,包括急性淋巴细胞和骨髓性白血病;多发性骨髓瘤;AIDS相关白血病和成人T细胞白血病淋巴瘤。
序列表的SEQ ID NO:1是全长PTEN-long蛋白序列。SEQ ID NO:1的氨基酸残基1至173表示PTEN-long中由5′ATR mRNA序列编码的新颖残基(参见以下SEQ ID NO:2的描述)。PTEN的经典起始甲硫氨酸是SEQ ID NO:1的氨基酸残基174。
SEQ ID NO:2是全长PTEN-long mRNA序列。PTEN-long的5′ATR序列开始于SEQ IDNO:2的核苷酸513(非经典CUG起始密码子)且终止于SEQ ID NO:2的核苷酸1031。5′ATR与开始于SEQ ID NO:2的核苷酸1032处的经典AUG起始密码子且终止于SEQ ID NO:2的核苷酸2243的PTEN开放阅读框(open reading frame)同框。因此,PTEN-long开放阅读框从SEQ ID NO:2的核苷酸513延伸到SEQ ID NO:2的核苷酸2243且导致PTEN的N端增加173个氨基酸。所述蛋白质被称为PTEN-long。
SEQ ID NO:3是对应于全长PTEN-long mRNA序列的cDNA。
SEQ ID NO:4是包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基153至173的PTEN-long蛋白序列的肽。这一独特肽代表不存在于PTEN中的来源于PTEN-long的独特抗原决定基。
SEQ ID NO:5是全长PTEN-long类似物蛋白质序列。PTEN-long的氨基酸残基1在类似物中从Leu变为Met以增加蛋白质产量。
SEQ ID NO:6是经修饰的全长PTEN-long类似物mRNA序列。PTEN-long类似物的5′ATR序列开始于SEQ ID NO:6的核苷酸513(经工程改造的AUG起始密码子)且终止于SEQ IDNO:6的核苷酸1031。
SEQ ID NO:7是对应于经修饰的全长PTEN-long类似物mRNA序列的经修饰的cDNA。
当说明书中给出范围时,应了解所述范围包括所述范围内的所有整数和0.1单位,和其任何子范围。举例来说,77%至90%的范围包括77.0%、77.1%、77.2%、77.3%、77.4%、77.5%、77.6%、77.7%、77.8%、77.9%、80.0%、80.1%、80.2%、80.3%、80.4%、80.5%、80.6%、80.7%、80.8%、80.9%和90.0%,以及范围80%至81.5%等。
本文所述的各种要素的所有组合都在本发明的范围内。
本发明将通过参考随后的实验详情获得充分了解,但所属领域的技术人员将容易了解,所详述的具体实验仅说明本发明,本发明将在下文随后的权利要求书中更全面地描述。
实验详情
PTEN肿瘤抑制因子是癌症中最常改变的基因之一。其充当磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸的脂质磷酸酶,而磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸又抑制来自磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和Akt的致癌信号传导。对PTEN mRNA进行的检查揭示770bp的5′非翻译区(UTR)与PTEN开放阅读框(ORF)同框。在这一UTR ORF中,在弱科扎克(Kozak)序列中在经典AUG起始密码子上游的513个碱基对处存在替代性CUG起始密码子。虽然经典PTEN ORF的表达产生迁移到约55kDa的蛋白质,但含有5′UTR的PTEN cDNA的表达能够产生称为PTEN-long的70kDa第二蛋白质。起始位点的突变表明55kDa PTEN是从经典起始密码子开始的翻译产生,而PTEN-long是从上游替代性起始位点起始。使用不同PTEN抗体进行的免疫印迹说明PTEN-long在多种细胞系中的内源性存在。在小鼠ES细胞中进行的阻断基因表达和基因剔除研究证实这种较大蛋白质实际上是PTEN。所添加的N端蛋白质序列编码信号肽和裂解位点,表明PTEN-long进入分泌路径。PTEN-long优先结合凝集素伴刀豆球蛋白A,这说明其被糖基化。此外,可通过亲和纯化,使用针对PTEN的抗体以及硫酸乙酰肝素从条件培养基纯化PTEN-long。在活体内蛋白酶保护分析中PTEN-long也对降解敏感,而正常PTEN不会,这表明PTEN-long定位于细胞膜外部。
试剂、细胞系和抗体-蛋白酶K和伴刀豆球蛋白-A是购自西格马公司(Sigma)(密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))。肝素琼脂糖和HiTrap肝素HP柱是购自安玛西亚公司(Amersham)(新泽西州皮斯卡塔(Piscataway,NJ))。针对PTEN的抗体是购自赛信通公司(Cell Signaling)(马萨诸塞州丹弗斯(Danvers MA))和卡斯卡特公司(Cascade)(马萨诸塞州东温切斯特(Winchester MA))。Akt抗体是获自赛信通公司(Cell Signaling)(马萨诸塞州丹弗斯(Danvers MA))且E钙粘素抗体(E cadhein antibody)是获自阿普斯德特密理博(Upstate Millipore)(马萨诸塞州比尔里卡(Billerica,Ma))。通过依姆德实验室(Zymed Laboratories)(加利福尼亚州南旧金山(South San Fransisco,CA))得到的针对PTEN的新颖翻译中所见的抗原决定基PRHQQLLPSLSSFFFSHRLPD(SEQ ID NO:3)的经亲和纯化的多克隆抗体。二级抗体是购自皮尔斯公司(Pierce)(美国伊利诺斯州罗克福德(Rockford,IL))。HEK293、ZR-75-1、SKBR-3、MDAMB-361、BT549和PC3是获自美国模式培养物保藏中心(ATCC)(弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas,VA))且根据所提供的指南进行培养。
质粒和构筑体-如先前所报导,通过将PTEN cDNA(以U90351保藏于NCBI)克隆到pCEP4(英杰公司)的NotI位点中来产生编码PTEN的完整开放阅读框和5′非翻译区的pCEP4-PTEN(李(Li),辛普森(Simpson)等人1998)。进一步通过在用于克隆的原始NotI限制性位点(restriction site)的上游连接衔接子(adaptor)编码序列来在这一质粒上延长5′UTR。衔接子编码位于经典起始位点的-513的第一可能替代性CTG起始密码子上游的至多10个碱基对。假定替代性起始位点(putative alternate start site)突变为ATG的衔接子也可用于产生将有效地表达长形式的第二组表达构筑体。此外,经典起始密码子突变诱发为ATA也发生了,产生总共4种不同构筑体(图5.1)。也将这4种变异以及原始PTEN的开放阅读框亚克隆到MSCV(克隆技术公司(Clontech),加利福尼亚州芒廷维尤(Mountainview,CA))反转录病毒载体(retrovirus vector)中以通过感染进行稳定表达。
蛋白酶保护分析-将HEK293细胞收集于无胰蛋白酶的冰冷PBS中且将5×105个细胞等分试样与0.5μg/ml至10μg/ml递增浓度的蛋白酶K一起培育30分钟。包括使用0.1%Triton的对照以验证蛋白酶K降解指定蛋白质的能力。用5mM PMSF停止反应。在2×拉姆利样品缓冲液(125nM Tris(pH 6.8)、20%甘油、0.05%溴酚蓝、4%SDS、10%2-巯基乙醇)中溶解细胞且针对PTEN、Akt和E钙粘素进行免疫印迹。
从小鼠肝脏纯化PTEN-将来自C57BL6小鼠的肝脏于液氮中速冻,磨碎,并再悬浮于TNN缓冲液(50mM Tris(pH 7.4)、150mM NaCl、0.5%NP-40、5mM EDTA、3%甘油、1mM DTT、1×哺乳动物蛋白酶混合物抑制剂(Mammalian Protease Cocktail Inhibitor)[西格马公司(Sigma)])中。用研钵使悬浮液均质化且在4度下在40,000RPM下离心1小时。依次用0.45微米和0.22微米过滤器过滤上清液。用TNN使丙烯葡聚糖凝胶200尺寸排除柱(安玛西亚公司(Amersham))预平衡且以0.3ml/hr的速率施加样品,随后施加缓冲液。收集2ml洗脱份且汇集低分子量样品并施加于预平衡的HiTrap肝素HP柱(安玛西亚公司(Amersham))上。用3柱体积的TNN洗涤所述柱且逐步用3倍柱体积的0.3M、0.5M和1M NaCl TNN溶液洗脱蛋白质。以0.5ml增量收集洗脱份且针对PTEN进行免疫印迹。
从培养基纯化PTEN肝素-使HEK293细胞在15cm培养皿中的10%FBS DMEM中生长到融合状态(confluency)。将细胞与15ml无FBS的DMEM一起培育过夜。收集20个培养板的培养基且通过0.45微米过滤器过滤。使用AktaPrime(安玛西亚生物科技公司(AmershamBioscience)),在4℃下,使用4ml/min的流速,用DMEM使1ml肝素HP柱平衡。随后使条件培养基以1ml/min通过柱。用10体积的BC200(200mM NaCl、50mMT Tris(pH 7.4)、1mM EDTA、0.2%TritonX-100)洗涤柱。用5ml 1M NaCl以1ml/min以1ml洗脱份洗脱蛋白质。通过280nm下的OD测定各洗脱份的蛋白质浓度。用20%三氯乙酸使各洗脱份的一半沉淀,用冷丙酮洗涤,在真空下干燥。用20μl拉姆利溶解缓冲液复原蛋白质且使用针对PTEN和PTEN-long的抗体进行免疫印迹。
从血清纯化PTEN-来自AB血浆的人类血清是获自西格马公司(Sigma)。通过0.45微米过滤器过滤1ml血清且使用蛋白质A/G琼脂糖预清除抗体持续培育1小时。将肝素-琼脂糖(Heparin-agarose)与经过预清除的血清连同琼脂糖对照一起培育过夜且第二天用BC150(150mM NaCl、25mM Tris(pH 7.4)、1%NP-40、0.25%脱氧胆酸钠、1mM EDTA)洗涤。用拉姆利样品缓冲液洗脱蛋白质且针对PTEN进行免疫印迹或出于重链污染仅针对二级抗体进行。
伴刀豆球蛋白A捕捉-在亚融合状态下用BC500(500mM NaCl、20mM Tris(pH 7.4)、1%TritonX-100、1mM MnCl2、1mM CaCl2、1×蛋白酶抑制剂混合物)溶解HEK293细胞。离心细胞溶胞物并过滤。在4℃下用20微升伴刀豆球蛋白A琼脂糖(西格马公司(Sigma))捕捉1小时。用BC500洗涤树脂且用拉姆利样品缓冲液洗脱蛋白质。
结果
PTEN mRNA具有上游替代性起始位点
保藏于NCBI的PTEN mRNA(李(Li)和孙(Sun)1997;斯特克(Steck),佩斯豪思(Pershouse)等人1997)含有广泛的5′UTR。5′UTR区中的约770bp连续序列与起始密码子同框。在这一区域内不编码甲硫氨酸;然而,从距离经典起始密码子的-519处开始存在数个替代性起始CUG密码子。根据scansite(scansite.mit.edu)和prosite(www.ebi.ac.uk/ppsearch),这一序列的翻译揭示无可鉴别的结构域。这整个区域的翻译将向PTEN添加173个氨基酸,从而使其分子质量增加到约70千道尔顿(kilodaltons)(图2和SEQ ID NO:1)。
其它PTEN直系同源物的比对揭示智人UTR的翻译序列可在来自各种物种的PTEN的开放阅读框中发现。黑猩猩、黄牛、意大利蜂和秀丽隐杆线虫都含有与智人5′UTR的翻译产物同源的蛋白质序列(图3)。此外,智人5′UTR和小家鼠PTEN 5′UTR的比对显示广泛核苷酸同源性(未图示)。522个碱基对的小家鼠5′UTR与经典起始密码子同框翻译且揭示与智人5′UTR的翻译相比高度同源的蛋白质序列(图5.3)。5′UTR的同源性和其它物种的翻译蛋白质中来源于智人5′UTR的氨基酸序列的实际存在表明这一序列的进化重要性。
PTEN mRNA可从替代性上游位点起始翻译。PTEN ORF的过度表达产生55kDa的单一蛋白质条带。包括5′UTR可产生约70kDa的第二较大蛋白质条带。PTEN免疫印迹中的较大蛋白质条带也内源性存在于许多细胞系中且可利用不同单克隆抗体进行检测(图4)。这一较大蛋白质条带也存在于小鼠野生型ES细胞中而不存在于PTEN基因剔除小鼠ES细胞中,并且在稳定表达PTEN shRNA的小鼠ES克隆中减少(图4)。使用siRNA阻断HEK293细胞中的人类PTEN蛋白的基因表达也会引起70kDa蛋白质的基因表达阻断。
编码PTEN的ORF的质粒在PTEN缺失型PC3细胞系中的表达导致产生55kDa蛋白质。当也编码5′UTR的质粒过度表达时,产生70kDa蛋白质。上游假定起始密码子从CTG突变为ATG(图1,“ATG/ATG”)主要使免疫印迹图案(immunoblot pattern)转变成70kDa形式(图4)。通过突变诱发也证实55kDa条带来源于ATG起始密码子(图4“CTG/ATA”)。
因此,5′UTR足以起始较长形式的PTEN的翻译。因此,5′UTR称为5′ATR(替代性翻译区(Alternately Translated Region))且所检测到的较大蛋白质称为“PTEN-long”。
针对从5′ATR翻译的氨基酸产生的经亲和纯化的多克隆抗体并且用其证实在过度表达研究中重组PTEN-long的产生以及在HEK293细胞中内源性形式的产生(图4)。从HEK293细胞的全细胞溶胞物免疫印迹和PC3细胞中的过度表达研究来看,似乎存在多种形式的PTEN-long,此指出存在可能的翻译后修饰、未记录的拼接形式或甚至5′ATR中的替代性起始密码子。
PTEN-long编码N端信号肽
PTEN-long的N端序列含有一长串丙氨酸,其可能指示跨膜序列(transmembranesequence)或信号肽。使用SignalIP 3.0分析翻译序列(translated sequence)以高概率度(>95%)预测所述序列含有信号肽(图5)。信号肽特征性地包含碱性氨基酸,随后为疏水性段(hydrophobic stretch)。假定疏水性跨膜螺旋被脯氨酸破坏并且随后为略带极性的序列。也预测所述序列被裂解,表明蛋白质应释放到ER内腔中。
PTEN经糖基化
分泌性和细胞外蛋白质的标志之一是在高尔基体(golgi apparatus)中添加复合糖部分,这一过程称为糖基化。可通过N-糖基化将糖添加到共同序列N-X-S/T(X不能为脯氨酸)中的天冬酰胺上(古浦塔(Gupta)和布鲁纳克(Brunak)2002);丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的羟基也可以是所谓O-糖基化的目标(居乐纽斯(Julenius),莫尔格德(Molgaard)等人2005)。PTEN具有多个O-糖基化位点,但仅具有一个N-糖基化位点。在捕捉分析中使用凝集素伴刀豆球蛋白-A(结合糖部分)来确定HEK293细胞中的PTEN补体的一部分是否经糖基化。从这些细胞纯化到含约50%PTEN-long的PTEN混合物(图6)。这说明PTEN-long经糖基化而且PTEN的细胞质55kDa形式经糖基化或PTEN-long在细胞外裂解。
PTEN-long结合乙酰肝素且在细胞表面上发现
PTEN结合多种蛋白聚糖(proteoglycan),诸如多配体蛋白聚糖(syndecan)和磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican),这些蛋白聚糖被发现连接于细胞膜外层(outerleaflet of the membrane)。这些蛋白聚糖是肝素化程度最高的细胞外分子中的两者(波莱罗(Blero),张(Zhang)等人2005)。先前已显示PTEN对于带高度负电的物质具有亲和力,PTEN的这一性质造成其偏好高阴离子性PIP3(达斯(Das),迪克森(Dixon)等人2003)。因为乙酰肝素是带最多负电的生物分子之一,所以有可能乙酰肝素可介导PTEN与细胞外基质的结合。使用来自小鼠肝脏的蛋白质提取物,发现PTEN以高亲和力结合乙酰肝素。此外,使用1M NaCl从肝素琼脂糖柱上连续洗脱PTEN也洗脱得到PTEN-long(图7)。
粘附于细胞膜外表面的PTEN-long应对蛋白酶降解敏感。在蛋白酶保护分析中,将活细胞与蛋白酶一起培育且因为脂质膜对于蛋白酶来说不能透过从而用以保护所有细胞内蛋白质,所以仅细胞外蛋白质降解。通过与PBS一起轻微搅拌而从贴壁培养物移出HEK293细胞且与递增浓度的蛋白酶K一起悬浮。用PMSF停止反应且用拉姆利缓冲液溶解细胞。PTEN-long对用蛋白酶K以及E-钙粘素(其为已知细胞外蛋白质)处理显示敏感性(图8)。另一方面,PTEN显示适当蛋白酶敏感性,此表明一定部分的55kDa物质也在细胞外(因为其经糖基化)或在使细胞质PTEN暴露于蛋白酶K的分析期间发生一些细胞溶解。包括使用细胞膜透过性Triton的对照以证明如果PTEN暴露于蛋白酶K,那么其可降解。这是否是PTEN的本来形式或是迁移到55kDa并保留PTEN抗体的C端抗原决定基的PTEN-long的裂解形式还有待观察。这一数据表明PTEN-long位于细胞表面上。
可溶性PTEN-long分泌到培养基中。
PTEN-long存在于细胞表面上并不排除蛋白质的一部分可溶并释放到细胞环境中的可能性。使用肝素琼脂糖从HEK293细胞的无血清条件培养基中亲和纯化PTEN-long。柱洗脱揭示培养基中存在迁移到50kDa分子量的PTEN(图9)。使用PTEN-long特异性抗体进行的免疫印迹揭示了相同的50kDa物质,表明这种蛋白质保留从替代性起始位点翻译而来的序列和来自PTEN单克隆抗体的C端抗原决定基的序列。这强烈地暗示观察到是55kDa的PTEN部分事实上是被裂解的来源于上游起始密码子的翻译产物。
进一步通过在经ATG/ATG构筑体转染的HEK293细胞中过度表达PTEN-long来证实PTEN分泌到培养基中。使用这些细胞产生无血清条件培养基过夜并且使用PTEN单克隆抗体6H2.1使PTEN从1ml培养基中免疫沉淀。成功地从培养基中使较大PTEN条带以及较小55kDa条带免疫沉淀。因为蛋白质过度表达,所以可能不能进行蛋白质的适当加工,这导致分泌完整尺寸的70kDa PTEN。
PTEN在人类血清中发现。
生理分泌性物质的最佳来源之一是血清。使用肝素琼脂糖从人类血清中亲和纯化PTEN。离心人类血清且过滤,去除微粒物质。随后用BC150按1∶5稀释并用蛋白质A/G广泛地预清除以去除IgG。将血清与少量肝素琼脂糖一起分批培育。用拉姆利缓冲液洗脱肝素琼脂糖并且针对PTEN对洗脱液进行印迹反应和仅针对二级抗体进行以消除重链污染。PTEN和PTEN-long都在人类血清中发现(图10)。
PTEN-long的抗血管生成活性
PTEN-long的抗血管生成作用通过以下进行证明:(1)PTEN-long通常在发育中的小鼠视网膜中弱表达,但在经历退化(involution)/细胞死亡的新生的生长血管中可见高水平表达(图11);(2)PTEN-long在肿瘤内的细胞凋亡血管中发现。此外,用从转染细胞部分纯化的PTEN-long处理上皮细胞,抑制细胞迁移并且诱导细胞凋亡(图12)。在培养物中的U87、HUVEC内皮细胞或293细胞中,经纯化的PTEN-long也会诱导与细胞凋亡活化相关的细胞死亡,如通过卡斯蛋白酶-3裂解所测量。
PTEN-long的活体内抗肿瘤和抗血管生成活性
图13显示用PTEN-long处理小鼠(A)。给小鼠(n=5)注射胶质母细胞瘤细胞系U87以在乳房脂肪垫的2个部位(左和右)形成异种移植物。肿瘤移植后,直接给一个肿瘤注射PTEN-long且对侧肿瘤不注射(w/PTEN-long)。也给一组5只小鼠的对照组注射(空载体)来源于用空载体转染的细胞的模拟纯化蛋白质的制剂。对侧肿瘤再次不注射(w/空载体)。在第1-11天和第13-14天处理小鼠。在指定日期用测径器测量最大直径(cm)。当肿瘤体积达到≥1cm时,处死小鼠。(B)通过将PTEN-long表达载体转染到293细胞中,并且使用V5亲和树脂进行部分纯化,随后用V5肽洗脱来制备蛋白质。图14展示用对照和PTEN-long注射液处理14天的小鼠的存活分率(以天计)。
视网膜染色
对p7鼠类视网膜中的PTEN-long和血管的染色揭示PTEN-long选择性染色,在鼠类视网膜血管发育的时刻,开始退化的玻璃样血管。针对PTEN-long的抗体是针对抗原决定基:N-PRHQQLLPSLSSFFFSHRLPD-C(SEQ ID NO:3)。使用BS1-凝集素(BS1-lectin)进行血管染色。
纯化
在一种纯化PTEN-long的方法中,用ATG/ATG PTEN-long转染293细胞且使细胞溶胞物通过Ni+亲和柱。始终使用Ni+柱,在AKTA纯化器上,使用咪唑洗脱缓冲液来纯化PTEN-long。
肿瘤退化
注射之前经PTEN(orf 403个氨基酸)或PTEN-long转染的U87细胞的异种移植物。注射后7天,与PTEN过度表达组(n=4中的4个)相比,在PTEN-long过度表达组中乳房血管减少。这表明PTEN-long可影响肿瘤环境。
讨论
在细胞溶胞物和组织的PTEN免疫印迹中整齐地观察到第二较大蛋白质条带。证实较大条带是PTEN的证据包括:用不同PTEN单克隆抗体检测到较大蛋白质条带;当用针对PTEN的siRNA处理细胞或剔除小鼠的PTEN基因座(locus)时,不存在较大蛋白质。观察到大于700个碱基对的PTEN的5′UTR与PTEN的经典起始密码子同框。此外,在PTEN上游的522个碱基对处存在CUG密码子,如果其翻译,那么可解释PTEN免疫印迹中的较大蛋白质条带的尺寸。尽管其与强的科扎克序列(Kozak sequence)无关,但其保留-1胞嘧啶和+1鸟苷序列。当翻译并添加到PTEN ORF上时,应形成约70kDa的蛋白质,其为所观察到的较大PTEN条带的分子质量。
这一序列的翻译存在于许多PTEN直系同源物的实际编码序列中。小鼠5′UTR也被检查,因为观察到小鼠组织溶胞物中具有类似条带。小鼠5′UTR核苷酸序列与智人5′UTR高度同源并且类似地与起始密码子同框。两个可能替代性起始密码子存在于-522和-516处且这一序列从那些位点的翻译揭示氨基酸序列与智人序列90%+同源。这种假定蛋白质的保守性是显著的并且表明了这一序列的进化重要性。为了较好地描述这一序列,将其改名为PTEN的5′ATR或替代性翻译区以描述其可能进行翻译。
如下构筑质粒:其中,PTEN的开放阅读框与5′ATR一起克隆并且单独将这一重组PTEN的表达与产生403个氨基酸的经典开放阅读框进行比较。与产生迁移到55kDa的单一条带的仅含有PTEN的经典ORF的表达质粒(expression plasmid)相比,包括5′ATR可产生迁移到约70kDa的第二较高PTEN蛋白条带。较大蛋白质仅占所翻译总蛋白质的一小部分;然而,假定起始位点突变为ATG使得蛋白质比率转向主要为较大形式。
从5′ATR得到的蛋白质序列的保守性表明了其超出了进化产物。N端含有一段脂肪族氨基酸,预测其为跨膜序列。使用Prosite和Signal 3.0IP预测PTEN-long的N端是信号肽,紧接于其后是蛋白酶裂解位点(protease cleavage site)。
使用活体内蛋白酶保护分析测试PTEN-long是否定位于细胞的细胞外表面上。PTEN-long显示随细胞外蛋白酶的量增加而逐渐降解,而PTEN则不会,这表明至少一些PTEN-long在细胞外且至少部分连接于细胞膜外层。这是暗示活性脂质磷酸酶位于细胞膜外层上的最引人产生兴趣的结果。先前在PTEN蛋白复合物中鉴别出外细胞膜结合型蛋白聚糖、磷脂酰肌醇蛋白聚糖和多配体蛋白聚糖的两个家族。
PTEN存在于细胞表面上并不排除可溶性分泌性PTEN的可能性。多配体蛋白聚糖和磷脂酰肌醇蛋白聚糖是肝素化程度最高的蛋白聚糖中的两者。乙酰肝素是带高度负电的葡糖胺聚糖且已显示PTEN对于阴离子具有亲和力,这部分解释了选择带高度负电的PIP3作为其底物的原因。从小鼠肝脏纯化PTEN的优化实验揭示PTEN和PTEN-long都可以使用肝素琼脂糖柱进行纯化。此外,使用肝素琼脂糖柱,从HEK293细胞的无血清条件培养基纯化得到约50kDa的蛋白质。经纯化的蛋白质被对PTEN具有特异性的单克隆抗体和针对PTEN-long中存在的独特氨基酸残基的多克隆抗体识别。先前PTEN-long抗体仅识别约70kDa的蛋白质条带。两种抗体都可以识别一个条带的观察结果表明可能正在发生蛋白水解加工(proteolytic processing),并且通过免疫印迹观察到的蛋白质是PTEN中保留两种抗体的抗原决定基的片段。PTEN和PTEN-long也都可以使用肝素亲和纯化从人类血清纯化。
在过去10年,已积累了设想PTEN序列的大量文献。本文证明存在新颖形式的PTEN,其从替代性位点翻译并且分泌到外层以及细胞外间隙中。
活体内结果显示PTEN-long是新颖抗肿瘤化合物,其通常存在于人类血清中并且具有抗血管生成和促细胞凋亡性质。
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Claims (58)
1.一种包含具有SEQ ID NO:1中所示序列的连续氨基酸残基的经分离的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(phosphatase and tensin homolog long polypeptide,PTEN-long),或包含具有SEQ ID NO:5中所示序列的连续氨基酸残基的其类似物,或其各自的变异体。
2.一种多肽,其特征在于,包含(i)SEQ ID NO:1的残基1至173,或(ii)包含SEQ IDNO:5的残基1至173的其类似物,或(iii)SEQ ID NO:1的残基22至516。
3.一种药物组合物,其特征在于,含有包含连续氨基酸残基的磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),所述氨基酸残基具有SEQ ID NO:1中所示序列,或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含具有SEQ ID NO:5中所示序列的连续氨基酸残基的其类似物。
4.一种治疗受试者的实体肿瘤的方法,其特征在于,包含给予所述受试者一定量的包含具有SEQ ID NO:1中所示序列的连续氨基酸残基的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含具有SEQ ID NO:5中所示序列的连续氨基酸残基的其类似物,以有效治疗受试者的实体肿瘤。
5.一种抑制受试者的实体肿瘤的生长的方法,其特征在于,包含给予所述受试者一定量的包含具有SEQ ID NO:1中所示序列的连续氨基酸残基的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含具有SEQ ID NO:5中所示序列的连续氨基酸残基的其类似物,以有效抑制受试者的实体肿瘤的生长。
6.一种抑制受试者的实体肿瘤中的血管生成的方法,其特征在于,包含给予所述受试者一定量的包含具有SEQ ID NO:1中所示序列的连续氨基酸残基的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含具有SEQ IDNO:5中所示序列的连续氨基酸残基的其类似物,以有效抑制受试者的实体肿瘤中的血管生成。
7.一种诱导受试者的实体肿瘤中的血管的血管上皮细胞发生细胞凋亡的方法,其特征在于,包含给予所述受试者一定量的包含具有SEQ ID NO:1中所示序列的连续氨基酸残基的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含具有SEQ ID NO:5中所示序列的连续氨基酸残基的其类似物,以有效诱导受试者的实体肿瘤中的血管的血管上皮细胞发生细胞凋亡。
8.根据权利要求4、5、6或7所述的方法,其特征在于,所述肿瘤是癌性肿瘤。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述癌性肿瘤是受试者的神经胶质细胞、前列腺、卵巢、子宫、子宫内膜、乳房、黑素细胞、肾、肺、结肠、头部、颈部或胰脏的肿瘤。
10.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述癌性肿瘤是由PTEN或由PI3K路径活化或呈PTEN阴性。
11.根据权利要求4至10中任一权利要求所述的方法,其特征在于,所述PTEN-long或所述其类似物或所述PTEN-long片段通过直接引入所述实体肿瘤中来给予所述受试者。
12.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,所述PTEN-long或所述其类似物或所述PTEN-long片段是注射至所述实体肿瘤中。
13.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,所述PTEN-long或所述其类似物或所述PTEN-long片段是通过导管直接引入所述实体肿瘤中。
14.根据权利要求4至10中任一权利要求所述的方法,其特征在于,所述PTEN-long或所述其类似物或所述PTEN-long片段是通过直接引入供应所述实体肿瘤的血管中来给予所述受试者。
15.根据权利要求14所述的方法,其特征在于,所述PTEN-long或所述其类似物或所述PTEN-long片段是注射至供应所述实体肿瘤的所述血管中。
16.根据权利要求14所述的方法,其特征在于,所述PTEN-long或所述其类似物或所述PTEN-long片段是通过导管直接引入供应所述实体肿瘤的所述血管中。
17.根据权利要求4至10中任一权利要求所述的方法,其特征在于,所述PTEN-long或所述其类似物或所述PTEN-long片段是静脉内给予所述受试者。
18.根据权利要求4至10中任一权利要求所述的方法,其特征在于,所述PTEN-long或所述其类似物或所述PTEN-long片段是皮下给予所述受试者。
19.一种治疗受试者的实体肿瘤的方法,其特征在于,包含给予所述受试者一定量的表达载体,所述表达载体编码包含SEQ ID NO:1的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含SEQ ID NO:5的其类似物,以在所述实体肿瘤的细胞中表达有效治疗所述受试者的所述实体肿瘤的量的PTEN-long、PTEN-long片段或所述其类似物。
20.一种包含SEQ ID NO:1的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含SEQ ID NO:5的其类似物,其用于治疗受试者的实体肿瘤,抑制受试者的实体肿瘤的生长,诱导受试者的实体肿瘤中的血管上皮细胞发生细胞凋亡,或抑制受试者的实体肿瘤中的血管生成。
21.根据权利要求20所述的PTEN-long或其片段或所述其类似物,其特征在于,所述肿瘤是癌性肿瘤。
22.根据权利要求21所述的PTEN-long或其片段或其类似物,其特征在于,所述癌性肿瘤是神经胶质癌、前列腺癌、乳房癌、子宫内膜癌、黑素细胞癌、肾癌或肺癌肿瘤。
23.根据权利要求21所述的PTEN-long或其片段或所述其类似物,其特征在于,所述癌性肿瘤由PTEN或由PI3K路径活化或呈PTEN阴性。
24.一种组合物,其特征在于,包含键合非肽试剂的包含SEQ ID NO:1的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含SEQ ID NO:5的其类似物,所述非肽试剂分别增加所述PTEN-long、PTEN-long片段或所述其类似物的血浆半衰期。
25.根据权利要求24所述的组合物,其特征在于,进一步包含药物载剂。
26.根据权利要求24所述的组合物,其特征在于,增加所述血浆半衰期的所述非肽试剂是聚乙二醇(PEG)。
27.根据权利要求26所述的组合物,其特征在于,所述PEG键合所述PTEN-long、PTEN-long片段或所述其类似物的C端或N端。
28.根据权利要求24所述的组合物,其特征在于,增加所述血浆半衰期的所述非肽试剂是氯甲酸-9-芴基甲酯(Fmoc)或(7-磺酸基)-9-芴基甲氧羰基。
29.一种经分离的核酸,其特征在于,编码包含SEQ ID NO:1的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或编码包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或编码包含SEQ ID NO:5的其类似物。
30.根据权利要求29所述的核酸,其特征在于,所述核酸包含具有SEQ ID NO:2或SEQID NO:6中所示序列的连续核苷酸。
31.根据权利要求30所述的核酸,其特征在于,所述核酸包含SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:6中所示序列的连续核苷酸残基503至2243。
32.根据权利要求29所述的核酸,其特征在于,所述核酸包含具有SEQ ID NO:3或SEQID NO:7中所示序列的连续核苷酸。
33.根据权利要求32所述的核酸,其特征在于,所述核酸包含SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:7中所示序列的连续核苷酸残基503至2243。
34.根据权利要求29所述的核酸,其特征在于,所述核酸是RNA。
35.根据权利要求33所述的核酸,其特征在于,所述核酸是DNA。
36.根据权利要求35所述的核酸,其特征在于,所述核酸是cDNA。
37.一种表达载体,其特征在于,包含一种核酸,所述核酸编码包含SEQ ID NO:1的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含SEQ ID NO:5的其类似物。
38.一种转化细胞,其能够表达包含SEQ ID NO:1的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含SEQ ID NO:5的其类似物,其特征在于,所述细胞已将编码PTEN-long或其类似物的重组DNA整合到其基因组中。
39.一种宿主细胞,其能够表达包含SEQ ID NO:1的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含SEQ ID NO:5的其类似物,其特征在于,所述宿主细胞包含编码PTEN-long或其类似物的质粒。
40.根据权利要求39所述的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞是细菌细胞。
41.根据权利要求39所述的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
42.一种方法,其特征在于,包含混合(1)包含SEQ ID NO:1的人类磷酸酶和张力蛋白同源物长多肽(PTEN-long),或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的其片段,或包含SEQ IDNO:5的其类似物;和(2)增加PTEN-long或所述其类似物的血浆半衰期的非肽试剂,以使得包含SEQ ID NO:1的PTEN-long或包含SEQ ID NO:1的残基22至516的所述其片段或包含SEQ ID NO:5的所述其类似物键合所述非肽试剂,所述非肽试剂分别增加所述PTEN-long、PTEN-long片段或所述其类似物的所述血浆半衰期。
43.一种经分离的核酸分子,其特征在于,由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6核酸序列的具有至少20个核苷酸的片段或在严格条件下分别与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的所述核酸序列的互补序列或与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6特异性杂交的其互补序列组成。
44.一种经分离的抗体或其片段,其特征在于,所述抗体或其片段结合(1)包含SEQ IDNO:1的氨基酸残基1-173的PTEN-long多肽;或(2)包含SEQ ID NO:5的其类似物;或(3)具有SEQ ID NO:3中所示序列的氨基酸;或(4)包含SEQ ID NO:1的残基22至516的PTEN-long片段。
45.根据权利要求44所述的经分离的抗体,其特征在于,所述抗体是单克隆抗体。
46.根据权利要求44所述的经分离的抗体,其特征在于,所述抗体是抗体片段。
47.根据权利要求46所述的抗体片段,其特征在于,所述抗体片段是Fab、Fab′、F(ab′)2或Fv片段。
48.根据权利要求47所述的抗体,其特征在于,所述抗体片段是单链抗体。
49.根据权利要求44所述的抗体,其特征在于,所述抗体是人源化抗体。
50.一种经分离的抗体或其片段,其特征在于,所述抗体或其片段结合PTEN-long的构象抗原决定基,所述PTEN-long包含SEQ ID NO:1的残基1-173中所示的序列,但所述抗体不结合PTEN。
51.根据权利要求50所述的抗体,其特征在于,所述抗体结合由任一SEQ ID NO:1的残基153-173构成的抗原决定基。
52.一种经分离的抗体或其片段,其特征在于,所述抗体或其片段结合PTEN-long的抗原决定基,所述PTEN-long包含SEQ ID NO:1的残基1-173中所示的序列,但所述抗体不结合PTEN。
53.根据权利要求52所述的抗体,其特征在于,所述抗体结合SEQ ID NO:1的残基153-173或其一部分。
54.一种SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的肽片段,其特征在于,所述片段具有抗肿瘤、抗血管生成或抗细胞凋亡活性。
55.根据权利要求54所述的肽,其特征在于,所述肽包含5-10个、10-20个、20-30个或30-40个氨基酸。
56.根据权利要求54所述的肽,其特征在于,所述肽包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸1-173。
57.根据权利要求54所述的肽,其特征在于,包含SEQ ID NO:1的连续氨基酸残基22至516。
58.根据权利要求54或57所述的肽,其特征在于,不包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的连续氨基酸残基174至576。
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