MX2011008695A - Identificacion de forma extracelular del peptido largo del homologo de tensina que se puede usar para tratar tumores. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan una fosfatasa humana aislada y péptido largo homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende SEQ ID NO:1, fragmentos y análogos de los mismos, ácidos nucleicos que codifican esos y composiciones que los comprenden. Se proporcionan métodos para inhibir la angiogénesis en un tumor sólido, tratar un tumor sólido, e inhibir el crecimiento de un tumor sólido al usar PTEN largo, fragmentos y análogos de los mismos.

Description

IDENTIFICACIÓN DE FORMA EXTRACELULAR DEL PÉPTIDO LARGO DEL HOMÓLOGO DE TENSINA QUE SE PUEDE USAR PARA TRATAR TUMORES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una fosfatasa humana aislada y péptido largo homólogo de tensina (PETEN largo) que comprende SEQ ID N0:1, fragmentos y análogos de los mismos, ácidos nucleicos que codifican esos y composiciones que los comprenden.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El supresor de tumores PTEN (véase el documento WO 98/34624 el cual se incorpora por la presente a manera de referencia en su totalidad) es una fosfatasa citoplásmica que desfosforila el segundo fosfatidilinositol-3, 4 5-trifosfato mensajero importante (Maehama y Dixon 1998) . Esta actividad regula por decremento, muchas de las señales oncogénicas iniciadas por la activación de PIP3 de Akt que incluye vías antiapoptóticas , la progresión del ciclo celular y el incremento del metabolismo celular (Sulis y Parsons 2003). Esta función del PTEN en el cáncer es evidente de su pérdida frecuente, ya sea genéticamente ó funcionalmente, en muchos tipos de tumores diferentes (Bonneau y Longy 2000) . Descubierto originalmente como suprimido en los cánceres gliales, desde entonces se ha implicado en la tumorigénesis de la próstata, mama, endometrio, melanocitos, ríñones y pulmones. Las mutaciones germinales en el PTEN también se relacionaron con síndromes de predisposición de cáncer hereditario tal como Síndrome de Cowden (Eng 2003) . Modelos de ratón de PTEN perdido han recapitulado su función como un supresor de tumores tanto en el ratón heterocigoto como en las supresiones genéticas especificas de tejido en muchos tipos de tejido diferentes (Di Cristofano, Pesce y colaboradores 1998; wabi-Addo, Giri y colaboradores 2001; Petrocelli and Slingerland 2001; You, Castrillon y colaboradores 2002; Fraser, Zhu y colaboradores 2004).

La proteína PTEN contiene un dominio de fosfatasa de especificidad doble en el N-terminal y un domino de enlace a fosfolípidos C2 en el C-terminal, seguido por una cola no estructurada de importancia reguladora debido a los sitios de fosforilación encontrados dentro (Lee, Yang y colaboradores 1999; Vázquez, Ramaswamy y colaboradores 2000; Torres y Pulido 2001; Vázquez, Grossman y colaboradores 2001) . La proteína PTEN es en su mayor parte citoplásmica sin embargo existe una creciente evidencia por una presencia de PTEN en el núcleo, una ubicación que. es regulada por la monoubiquitinación de la proteína por NEDD4-1 (Baker 2007; Wang, Trotman y colaboradores 2007) .

El escaneo de ribosomas del 5'UTR precede el inicio de traducción que se lleva a cabo en el codón de inicio, AUG. Aunque el medio actual por el cual el ribosoma decide el codón de inicio apropiado sigue siendo incompletamente entendido, existen ciertas propiedades de tanto el mRNA solo como la secuencia que dictará donde el complejo de pre-inicio disminuirá su clasificación y comienza a traducirse. La "secuencia Kozak" clásica CCACCATGG, donde el ATG subrayado es el codón de inicio, se ha mostrado que es el contexto de secuencia más favorable para el inicio (Kozak 1991) . La estructura secundaria de mRNA también promueve el inicio probablemente por una disminución actual de la clasificación del complejo de pre-inicio que requiere una helicasa para fusionar las estructuras secundarias antes de la lectura (Kozak 1990) .

En ciertos transcritos, el inicio de traducción puede llevarse a cabo de codones no AUG. Esto comprende usualmente solo un porcentaje menor de la proteina total traducida de un transcrito y el resultado es una especie mezclada de proteínas 'que varían en su N-terminal. Kozak delineó las eficiencias del inicio de traducción de codones no AUG y descubrió que el GUG y CUG fueron capaces de iniciar la traducción in vitro sin embargo mucho menos eficientemente (Kozak 1989) . Además la investigación ha mostrado que la disponibilidad de metionina puede alterar la promiscuidad de el inicio de traducción a través de un mecanismo que sigue siendo no claro, pero probablemente implique la fosforilación de eIF2, un componente del complejo de pre-inicio 43S, por una cinasa sensible a nutrientes (Hershey 1991; Harm 1994) .

Se ha mostrado una variedad de proteínas que se traducen de codones de inicio alternos. El factor de transcripción, c-myc, tiene un codón de inicio CUG cadena arriba alterno que cuando se traduce, agrega 14 aminoácidos a el N-terminal de la protéína (Harm y Eisenman 1984) . Se ha mostrado que esta isoforma alterna se altera selectivamente en el linfoma de Burkitt (Harm, King y colaboradores 1988) . En el cultivo de tejidos la forma más larga de myc se transcribe predominantemente en faltas densidades celulares cuando la metionina está en. una baja concentración (Hann, Sloan-Brown y colaboradores 1992) . Además los estudios han revelado que la forma más larga de c-myc es inhibidora de crecimiento y tiene un conjunto diferente de objetivos transcripcionales que la proteína c-myc (Hann, Dixit y colaboradores 1994) . ( Florkiewicz y Sommer 1989) (Prats, Kaghad y colaboradores 1989) .

Adicionalmente , se sabe que la localización sub-celular actual de una proteína se puede dictar por codones de inicio alternos. En el caso del inicio alterno del pro- oncogen int-2 de ratón de un codón CUG cadena arriba codifica una ubicación nuclear mientras que el codón AUG codifica un péptido de señal para la localización a la via secretora (Acland, Dixon y colaboradores 1990) . Se describió un fenómeno similar en el FGF3 humano, en el cual la proteina traducida de AUG se destina para la via secretora mientras que la proteina traducida de un CUG cadena arriba se localiza en el núcleo (Kiefer, Acland y colaboradores 1994). Adicionalmente, en algunas proteínas eucarióticas , tales como TEF-1 y PRPS-3, la proteína se inicia completamente de un codón CUG (Taira, Iizasa y colaboradores 1990; Xiao, Davidson y colaboradores 1991).

Las proteínas que son destinadas para la secreción se fijan como objetivo al retículo endoplásmico por un estiramiento de aminoácidos hidrofóbicos llamados un péptido de señal (Blobel, alter y colaboradores 1979) . Encontrado usualmente en el N-terminal de las. proteínas, el péptido de señal se enlaza a la partícula .de reconocimiento de señal (SRP) en la traducción y hace que el ribosoma se detenga y translocalice al retículo endoplásmico rugoso donde se enlaza al receptor SRP. Una vez que el ribosoma se acopla, el complejo receptor SRP-SRP se libera y' la traducción se reanuda a través del lumen de la ER a través del translocon Sec61. El péptido de señal luego se escinde en el caso de proteínas solubles que liberan la proteina del translocon Sec. En el caso de proteínas que abarcan una membrana, la hélice transmembrana sirve como un péptido de señal para la translocación ER. Esta proteína se modifica extensamente mediante glicosilación en el aparato de golgi y se transportan a la membrana plasmática en vesículas secretoras (Alberts 2002) .

Existe una variedad de proteínas secretadas que se ha mostrado que son importantes en el cáncer. Se ha mostrado por ejemplo que la vía de señalización Wnt se altera en el cáncer de pulmón. El Wnt es un ligando secretado por la familia de receptores Frizzled. La activación de Wnt de Frizzled hace que se desordenen para desasociar el complejo de degradación ß-catenina, que incluye APC, permitiendo que los niveles de ß-catenina se eleven y transloquen al núcleo donde pueden interactuar y transactivar el factor de transcripción TCF. Se ha detallado la inactivación de mutaciones en APC y la activación de mutaciones en ß-catenina en cáncer de colon tanto heredado como esporádico. Adicionalmente, una variedad dé antagonistas del ligando extracelular tal como SFRP y Wnt-5a compiten por los mismos receptores Frizzled como Wnt. Se ha mostrado que ambos son supresores de tumores; el ratón genéticamente deficiente SFRP desarrolla tumores linfoides y se ha detectado silenciamiento epigenético de Wnt-5a en melanomas .

Todos los reportes publicados de PTEN han indicado que la proteína se localiza ya sea en el citoplasma o en el núcleo. Se descubrió que una variedad de proteínas extracelulares (glipicanos y sindecanos) se enlazan a PTEN, como lo hizo una variedad de proteínas implicadas en la vía secretora ( reticulocalbina y calumenina) . Se asumió que el PTEN entró a la vía secretora para permitir estas interacciones. De hecho, como se da a conocer en este documento, existe una proteína diferencialmente traducida novedosa, llamada PTEN largo, que contiene un péptido de señal N-terminal y que es secretado extracelularmente.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Una fosfatasa humana aislada y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende residuos de aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N0:1 o un análogo de ios mismos que comprenden residuos de aminoácido consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5, o una variante de cada uno de los mismos.

Un polipéptido comprende (i) residuos 1 hasta 173 de SEQ ID N0:1, o (ii) un análogo, del mismo que comprende residuos 1 hasta 173 de SEQ ID. NO: 5, o (iii) residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1.

Una composición . farmacéutica que comprende fosfatase y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende residuos de aminoácido consecutivos tiene la secuencia expuesta en SEQ ID N0:1, o un fragmento de los mismos que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un análogo de los mismos que comprende residuos de aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5.

Un método para tratar un tumor sólido en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad de una fosfatasa humana y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende residuos de aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N0:1, o un fragmento de los mismos que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un análogo de los mismos que comprende residuos de aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: '5, efectivos para tratar el tumor sólido en el sujeto.

Un método para inhibir el crecimiento de un tumor sólido en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad de una fosfatasa humana y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende residuos de aminoácido consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N0:1, o un fragmento de los mismos que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un análogo de los mismos que comprende residuos de aminoácido consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5, efectivos para inhibir el crecimiento del tumor sólido en el sujeto.

Un método para inhibir la angiogénesis en un tumor sólido en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad de una fosfatasa humana y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende residuos de aminoácido consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N0:1, o un fragmento de los mismos que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un análogo de los mismos que comprende residuos de aminoácido consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5, efectivos para inhibir la angiogénesis en el tumor sólido en el sujeto.

Un método para inducir la apoptosis de una célula epitelial vascular de un vaso sanguíneo en un tumor sólido en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad de una fosfatasa humana y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprenden residuos de aminoácido consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N0:1, o un fragmento de los mismos que comprenden residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un análogo de los mismos que comprenden residuos de aminoácido consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5, efectivos para inducir la apoptosis de la célula epitelial vascular en el vaso sanguíneo en el tumor sólido en el sujeto.

Un método para tratar un tumor sólido en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad de un vector de expresión que codifica la fosfatasa humana y el polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprenden SEQ ID N0:1, o un fragmento de los mismos que comprenden residuos 22 a 516 de SEQ ID NO:l, o un análogo de los mismos que comprenden SEQ ID NO: 5, para expresar el PTEN largo, fragmento de PTEN largo, o el análogo del mismo, en células del tumor sólido en una cantidad efectiva para tratar el tumor sólido en el sujeto..

Una fosfatasa humana y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) comprenden SEQ ID N0:1 o un fragmento de los mismos que comprenden residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un análogo de los mismos que comprenden SEQ ID NO: 5 para el uso en el tratamiento de un tumor sólido en un sujeto, para inhibir el crecimiento de un tumor sólido en un sujeto, para inducir la apoptosis de una célula epitelial vascular en un tumor sólido en un sujeto, o para inhibir la angiogénesis en un tumor sólido en un sujeto.

Una composición, que comprende fosfatasa humana y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprenden SEQ ID NO:l, o un fragmento de los mismos que comprenden residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un análogo de los mismos que comprenden SEQ ID NO: 5, enlazados a un agente no de péptido que incrementa la vida media en el plasma del PTEN largo, fragmento de PTEN largo, o el análogo del mismos, respectivamente.

Un ácido nucleico aislado que codifica una fosfatasa humana y un polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) comprende SEQ ID N0:1, o que codifica un fragmento de los mismos que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID NO:l, o que codifica un análogo de los mismos que comprende SEQ ID NO: 5.

Un vector de expresión comprende un ácido nucleico que codifica la fosfatasa humana y el polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende SEQ ID NO:l, o un fragmento de los mismos que comprenden residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un análogo de los mismos que comprende SEQ ID NO: 5.

Una célula transformada capaz de expresar fosfatasa humana y polipéptido largo .del homólogo de tensina (PTEN largo) comprende SEQ ID N0:1, o un fragmento de los mismos que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un análogo de los mismos que comprenden SEQ ID NO: 5, en donde la célula tiene integrado en su genoma un DNA recombinante que codifica el PTEN largo o un análogo del mismo.

Una célula hospedera capaz de expresar fosfatasa humana y polipéptido largo del ' homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende SEQ ID N0:1, o un fragmento de los mismos que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un análogo de los mismos que comprenden SEQ ID NO: 5, en donde la célula hospedera comprende un plásmido que codifica el PTEN-lardo o un análogo. del mismos.

Un proceso, que comprende mezclar (1) fosfatasa humana y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende SEQ ID NO:l, o un fragmento de los mismos que comprenden residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un análogo de los mismos que comprenden SEQ ID NO: 5, y (2) un agente no de péptido que' incrementa la vida media en el plasma del PTEN largo o el análogo del mismo, para hacer el PTEN largo que comprende SEQ ID NO:l, o el fragmento del mismo que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o el análogo del mismo que comprende SEQ ID NO: 5, enlazado al agente no de péptido que incrementa la vida media en el plasma del PTEN largo, fragmento de PTEN largo, o el análogo del mismos, respectivamente.

Una molécula de ácido nucleico aislada que consiste de por lo menos un fragmento de 20 nucleótidos de la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 6 o un complemento de la misma que se hibridiza específicamente bajo condiciones rigurosas a un complemento de la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 6, o a SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 6.

Un anticuerpo aislado, o fragmento del mismo en donde el anticuerpo o fragmento del mismo se enlaza a (1) polipéptido de PTEN largo que comprende los residuos de aminoácidos 1-173 de SEQ' ID N0:1 o (2) un análogo de los mismos que comprende SEQ ID NO: 5 o (3) los aminoácidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 3 o (4) un fragmento de residuos que comprenden PTEN largo 22 a 516 de SEQ ID NO: 1.

Un anticuerpo aislado o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo se enlaza a un epítopo conformacional de PTEN largo, en donde el PTEN largo comprende la secuencia expuesta en los residuos 1-173 de SEQ ID N0:1, pero en donde el anticuerpo no se enlaza a PTEN.

Un anticuerpo aislado o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo se enlaza a un epítopo de un PTEN largo, en donde el PTEN largo comprende la secuencia expuesta en los residuos 1-173 de SEQ ID N0:1, pero en donde el anticuerpo no se enlaza a PTEN.

Un fragmento de péptido de SEQ ID N0:1, o SEQ ID NO: 5, el fragmente que tiene actividad anti-tumor, anti- angiogénica, o anti-apoptótica .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Diagrama de constructos de PTEN largo. Los constructos de expresión que muestran las combinaciones creadas para conducir la expresión de PTEN ya sea de sitio de inicio endógeno o el sitio de inicio alterno. El PTEN canónico se muestra en negritas mientras que la región traducida en la UTR se muestra en gris.

Figura 2. Diagrama del PTEN mRNA de Homo sapiens.

El PETEN mRNA codifica 173 aminoácidos en el marco con y cadena arriba del codón de inicio ATG canónico mostrado. La traducción comienza cadena arriba del ATG canónico en un CTG en el nucleótido 519. Se muestran expandidos los residuos 1-173 de SEQ ID NO:l.

Figura 3. Alineación de el N-terminal de los ortólogos de PTEN. Las secuencias de proteina PTEN de especies indicadas se alinearon utilizando la matriz de registro BLOSUM62 en el Vector NTI (Invitrogen) . La secuencia N-terminal extendida para tanto Homo sapiens como Mus musculus (asterix) se tradujeron del mRNA publicado utilizando un codón de inicio alterno CUG en -519 {H. sapiens) y -520 (M. musculus) del codón de inicio AUG canónico utilizando el ORFinder (NCBI) . Secuencias de mRNA de Homo sapiens (NM_000314). y Mus musculus (N _008960 ) . Se obtuvo la secuencia de Apis mellifera de Baylor College of Medicine Honey Bee Genome Project. La secuencia de proteínas para el PTEN de Caenorhabditis elegans (Daf-18) se descargó de Wormbase. Bos Taurus (XM_613125) y Pan troglodytes (XP_521544) se descargaron de NCBI.

Figura 4. Evidencia para la existencia de PTEN largo. A) Levantamiento de diferentes líneas de células con dos anticuerpos PTEN diferentes. MCF10A y HEK293 son de tipo silvestre para el PTEN. BT549 y HCC1937 son PTEN nulo y ZR-75-1 tiene una mutación . en PTEN (L136) ; B) Levantamiento adicional de diferentes líneas de células con un anticuerpo monoclonal a PTEN que reconocen tanto PTEN como PTEN largo; C) Las células Wt ES expresan grandes cantidad de PTEN largo. El PTEN largo es sensible a la expresión de shRNA de PTEN estable en estas células y está completamente ausente en las células genéticamente deficientes de PTEN. Los niveles pAkt para la mayor parte siguen inversamente el nivel de PTEN; D) el siRNA de PTEN causa una supresión genética de tanto el PTEN como PTEN largo en las células HEK293. E) La expresión exógena de plásmidos en la línea de células PTEN nulo PC3. El PTENorf codifica solamente el ORF del codón de inicio AUG (línea 2) . La adición del ATR (ATR = región alternante traducida) es capaz de traducir débilmente el PTEN largo (linea 3) . La mutación del sitio de inicio cadena arriba a ATG cambió el complemento de la proteina que es completamente PTEN largo (lineas 5 y 6) . La mutación del codón de inicio ATG a ATA anuló la banda 55kDa. (lineas 4 y 6) . E) Se creó un anticuerpo para aminoácidos codificados por el 5'ATR y se utilizó en tanto un lisado celular de HEK293 asi como también en la linea de células PTEN nulo U87 que sobreexpresan ya sea el PTENorf o un plásmido que codifica el 5'ATR (ATG/ATG) . El PTEN largo se puede observar en las células que sobreexpresan solamente el 5'ATR. Una banda de fondo observada en las células U87 está presente en el fondo de la tinción.

Figura 5. Predicción del Péptido de señal. La secuencia PTEN 5'UTR se tradujo y se ingresó en SignalIP3.0. Se utilizó para predicción el modelo oculto de markov para péptido de señal eucarióticos . La N-región indica la secuencia N-terminal positivamente cargada del péptido de señal. La H-región es el núcleo hidrofóbico del péptido de señal.' La C-región es la región levemente polar marcada por una prolina que rompe usualmente la hélice del núcleo hidrofóbico. La probabilidad de escisión es predictiva de un sitio de escisión para liberar el péptido de señal, permitiendo que la proteina se libere en el lumen de la ER.

(Dalbey y Keijne.. 2002) . Se predice que la escisión se lleve a cabo en la posición 21.

Figura 6. Interacción de la Concanavalina A. Se lisaron células HEK293 y .se utilizó concanavalina sefarosa para interactuar las proteínas glicosiladas . Se resolvieron materiales eluídos por SDS-PAGE y se inmunotiñeron para PTEN (6H2.1) . Un enriquecimiento en el PTEN largo se puede observar en la interacción contra la entrada. Observar el enriquecimiento de la banda de PTEN más largo. El PTEN tiene múltiples sitios de 0-glicosilación, potenciales, pero solo un sitio de N-glicosilación . Se utilizó la concanavalina-A lectina, que se enlaza a porciones de azúcar, en un ensayo de interacción para determinar si se glicosila una porción del complemento de PTEN en células HEK293. Los inventores fueron capaces de purificar una mezcla de PTEN que fue de aproximadamente 50% de PTEN largo, un vasto enriquecimiento de PTEN largo sobre el PTEN normal. Esto muestra que el PTEN largo se glicosila. y que ya sea la forma 55kDa citoplásmica del PTEN se glicosila o que el PTEN largo se escinde extracelularmente .

Figura 7. El PTEN y el ????-ß se enlazan al heparán. El extracto de hígado de ratón se hizo pasar a través de una columna de heparán sefarosa HiTrap de 1 mi (Amersham) . La columna se- lavó con 500 mM de NaCl, y las proteínas se eluyeron con volúmenes de columna secuenciales de NaCl 1M. Se analizaron fracciones por SDS-PAGE para el PTEN utilizando un anticuerpo monoclonal de PTEN. Se ha mostrado previamente que el PTE tiene una afinidad para especies altamente de manera negativas cargadas, una propiedad del PTEN que conduce a su preferencia del Ptdlns (3, 4, 5) P3 altamente aniónico (Das, Dixon y colaboradores 2003) . Como la heparina es una de las moléculas biológicas más negativamente cargada, los inventores postularon que la heparina estuvo actualmente mediando el enlace del PTEN a la matriz extracelular . Utilizando extractor de proteina de hígados de ratón, los inventores descubrieron que el PTEN se enlaza a la heparina con alta afinidad. Adicionalmente , la elución .continua del PTEN de una columna de agarosa de heparina utilizando NaCl 1M, también eluyó el PTEN largo.

Figura 8. Ensayo de Protección de Proteasa. Se resuspendieron células HEK293 den concentraciones de incremento de proteinasa K. Se agregó Tritón en una concentración final de 0.2% a la reacción que contiene la concentración más alta de Proteinasa K. La reacción se detuvo con PMSF y los lisados celulares se hicieron en solución amortiguadora de laemlli. Se resolvieron los lisados por SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida al 8% y se inmunotiñeron para el PTEN (6H2.1), AKT, E-caderina. La banda más grande de la inmunotinción del PTEN se designa PTEN largo. Estos datos muestran que la E-Caderina y el PTEN largo están en gran parte sobre la superficie celular.

Figura 9. Alta elución de sal del PTEN y PTEN largo de la purificación por afinidad de heparina de un medio acondicionado. El PTEN y el PTEN largo se pueden eluir de una columna de heparina Hi.Trap (Amersham) después de la purificación por afinidad del medio acondicionado. Tanto una anticuerpo monoclonal a la cola del PTEN (arriba) como un anticuerpo especifico aminoácidos traducidos en el 5'ATR reconocen una banda de proteina de aproximadamente 55 kDa en masa .

Figura 10. Purificación del PTEN de suero humano. Se pre-limpió suero humano de sangre AB de anticuerpos con proteina A/G y se sometieron a heparina sefarosa. Los materiales eluidos se resolvieron por SDS-PAGE y se inmunotiñeron para PTEN o. con secundario para controlar la contaminación de cadena pesada.

Figuras 11A - 11C. Actividad anti-angiogénica del PTEN largo. (A) se expresa 'el PTEN largo en un subconjunto de vasos y capilares en la retina en desarrollo. Este patrón de expresión es enmarcado constante en contraste a aquel de la forma canónica del PTEN y es consistente con una regla para el PTEN largo en la inducción de la regresión vascular que se lleva a cabo en estas regiones. Esta correlación se fortalece por la regulación por incremento . marcada del PTEN largo, cuando este proceso de -regresión vascular se ha inducido por hiper-oxia como por la técnica de western blot de lisados de retina completos en la parte superior derecha (B) , y por la pérdida de PTEN largo en células endoteliales bajo condiciones epóxicas (C). Estas investigaciones indican la utilidad del PTEN largo como una terapia angiogénica, por ejemplo en retinopatia diabética, asi como también desórdenes vasculares hiper-proliferativos . Las flechas indican CD34 y PTEN largo positivos de tejido (vasos sanguíneos).

Figura 12. Actividad pro-apoptótica del PTEN largo. Se indujo la apoptosis- en células epiteliales mamarias MCF-10A que se trataron con PTEN largo purificado durante 24 horas como se indica. La escisión de caspasa 3 fue indicativa de la actividad apoptótica.

Figura 13. Tratamiento de ratones con PTEN largo. La gráfica del tamaño del tumor se calibró por mediciones con Calibrador por más de diez días de tratamiento, con ya sea PTEN largo o un Control de Vector Vacío. Se transíectaron 293 células con ATG/ATG-PTEN largo en el vector pcDNA3.1 His V5. Se hicieron lisados citoplásmicos 4.8 horas después de la transíección y se hicieron pasar sobre cuentas de anticuerpo V5 y se eluyeron con péptido V5. La técnica western blot de los materiales eluídos de purificación con cuentas V5 se muestra a continuación. La observación final es que el PTEN largo se podría utilizar para tratar tumores. Los xenoinjertos se establecieron utilizando células de glioblastoma U87 (1 millón) inyectadas en la almohadilla de grasa mamaria de un ratón scid. El tratamiento se inició aproximadamente dos semanas después de la trasplantación.

Figura 14. Resultados de tratamiento de ratones con PTEN largo. La gráfica muestra la fracción de supervivencia de los ratones (en días) tratados con control e inyecciones de PTEN largo durante 14 días.

Figura 15. Los constructos indicados para el PTEN (PTENorf que carece de la 5'UTR), PTEN largo, y PTEN largo con una mutación G a R en el aminoácido 305, que es comparable a la mutación G129R en PTENorf, se transfectaron en 293 células. La utilización de la proteína codificada de estas células mostró que el PTEN largo es una fosfatasa activa, y que el mutante PTEN largo G305R (que es G129R en PTEN) reduce la actividad de la fosfatasa.

Figura 16. La actividad de la fosfatasa es esencial para la actividad del PTEN largo se muestra en los experimentos con el mutante PTEN largo (G305R) . Con base en la literatura del PTEN se sabe que las truncaciones hechas dentro del dominio C2 desestabilizan la proteína, y con base en la estructura de cristal del PTEN se cree que las interacciones entre el dominio C2 y los dominios de fosfatases son críticos para la actividad de la fosfatasa. Por lo tanto el dominio mínimo para la actividad del PTEN largo en el C-terminal reguerirá el dominio C2 pero no la cola. En el N-terminal el' sitio de escisión predicho está en el aminoácido 21, y por lo tanto la región funcional de la proteína está dentro de esta región. Con respecto a esto es importante observar que cuando se trataron U87 en paralelo con n PTEN o con PTEN largo, no se observó efecto significativo del tratamiento con PTEN, solamente el tratamiento con PTEN largo.

Figura 17. Purificación del PTEN largo de 293 células transíectadas con ATG/ATG-PTEN largo en el vector de expresión pcDNA3.1 con etiquetas His y V5. Después de la elución de columna Ni+, el material eluído se resolvió en una columna de filtración en gel . OD280 se muestra con línea azul. El PTEN largo se enriquece en fracciones 7-18. El rendimiento para este experimento fue de' aproximadamente 1 mg. Las flechas indican productos de PTEN largo y PTEN largo de migración alterada.

Figuras 18A - 18B. (A) Respuesta de dosis de células de cáncer de próstata LNCaP a proteínas purificadas con PTEN largo utilizando la muerte celular como una lectura (la proteína se purificó por AP.VYS) . lx iguala 0.33 microgramos por mi. Las células se trataron en un medio sin factores de crecimiento . Después de 24 horas, las células se lavaron con un medio sin suero y se lisaron en una solución amortiguadora de muestra de Laemmli. Se realizaron técnicas de western blots para proteínas indicadas. (B) células de glioblastoma U87 tratadas con PTEN largo, PTEN largo (G305R) o un control Simulado muestran la inducción de la apoptosis como se indica por la escisión de PARP y la regulación por decremento de la señal pAKT en serina 473. Estos datos confirman adicionalmente que el PTEN largo puede inducir la apoptosis y reduce la señalización PI3K/AKT.

Figuras 19A - 19C. ' La proteina PTEN largo purificadas con AKTA fue capaz de reducir el tamaño del tumor durante un período de cinco días, como es medido por ambos calibradores y utilizando un reportero de luciferasa en conjunción con un sistema de formación de imágenes de animales vivos de xenogen. A los ratones se les administró -0.05 mg de PTEN largo al día durante cinco días. Se establecieron los xenoinjertos con 1 millón de células glioblastoma U87 inyectadas en la almohadilla de grasa mamaria que expresa luciferasa debido a la infección con FU -luciferasa-neo . Los ratones se ' inyectaron con luciferina intraperitonealmente 10 minutos antes de la formación de imágenes con el Sistema de Formación de Imágenes de Xenogen. (A) Mediciones de luciferasa para 4 ratones antes (panel izquierdo) y en el quinto día del tratamiento (panel de derecho) . (B) Mediciones con calibrador en cm2 antes y durante los 5 días de tratamiento. (C) Fotones detectados por el sistema Xenogen como imágenes formadas en el panel. Se muestra un error estándar para cuatro ratones en cohorte. Prueba de t-Student para fotones detectados del día 0 al día 5.

Figura 20. En un experimento independiente, se dejaron desarrollar tumores U87 a 1.5 cm2 antes del tratamiento con PTEN (aminoácidos orf-403; n=5), PTEN largo (G305R; n=5) o PTEN largo de tipo silvestre (n=4) . Después de 5 días de tratamiento la luminiscencia de cambio promedio muestra una disminución significativa para los ratones tratados con PTEN largo, pero ninguna disminución para los cohortes tratados con PTEN o PTEN largo (G305R) . La luminiscencia reducida se correlacionó con el tamaño de tumor reducido. Estos datos muestran que el PTEN largo requiere la actividad de 5'ATR y fosfatasa para funcionar.

Figuras 21A - 21C. El análisis de los xenoinjertos U87 tratados con PTEN largo muestra la activación d de la apoptosis y la inhibición de la señalización PI3 . Los tumores se trataron durante 5 días como en lo anterior. (A) se cosecharon tumores trataos con PTEN largo de tipo silvestre y G305R después de 5 días de tratamiento indicado y se lisaron para les análisis western. La proteina de tipo silvestre para el PTEN largo fue capaz de reducir la fosforilación FOXO y AKT para activar la escisión de la caspasa-3. (B) Tumores representativos tratados durante 5 días como se indica se fijaron en formalina y se incrustaron en parafina las secciones se tiñeron para un anticuerpo que detecta la caspasa-3, escindida, un marcador de la apoptosis. Las células tratadas con PTEN largo tuvieron un incremento significativo en el porcentaje de células apoptóticas P=0.0419, prueba de t-Student. (C) Imágenes representativas de la tinción de la caspasa-3 escindida.

Figuras 22A - 22B. En el mismo tumor tratado con PTEN largo durante 5 días el número de vasos sanguíneos se redujo en gran medida. Los tumores tratados con PTEN largo de tipo silvestre y G305R se cosecharon después de 5 días de tratamiento indicado y se fijaron en formalina y se incrustaron en parafina. Las secciones se tiñeron para un anticuerpo que detecta CD31, un marcador de células endoteliales que recubren los vasos sanguíneos. (A) células tratadas con PTEN largo tuvieron una reducción significativa en el número de vasos por campo de vista (objetivo de 40x) P=0.007579, prueba de t-Student. (B) Imágenes representativas de la tinción CD31.

Figuras 23A - 23B. Se' establecieron xenoinjertos U87 en seis grupos (n=3/grupo) y se trataron durante cuatro días con PTEN largo por la vía de inyecciones Intramusculares (IM), Intraperitoneales (IP), Intratumorales (IT), Subcutáneas (SC) , Intravenosas (IV). (A) El cambio promedio en el tamaño del tumor (CM2) del día 0 al dia 4 se midió por calibrador. (B) Imágenes representativas de la formación de imágenes de xenogen se muestran en la derecha . Para estos datos los inventores pueden concluir que todos los métodos de inyección afectaron el crecimiento del tumor como es comparado con los ratones no tratados, y que solo el cohorte tratado con IM mostró una cantidad significativamente disminuida de regresión.

Figuras 24A - 24D. Se .corrieron experimentos de xenoinjerto en 6 líneas de células, de mama, cerebro, y próstata. Arriba están los cambios graficados en cuatro líneas de células de cáncer de mama. (A, B, y D) . Gráficas del área superficial del tumor (cm2) como es medido por el calibrador durante los días indicados de tratamiento. (C) el cambio én las células HCT-1143 se observa después de únicamente 24 horas de tratamiento. En todas las cuatro líneas de células existe una clara reducción en el tamaño del tumor después del tratamiento.

Figura 25. El PTEN largo se enlaza a las células. La proteína PTEN largo se agregó a un medio de células U87 sobre hielo durante 10 minutos, se fijo y luego se tiñó para el PTEN largo con el anticuerpo que lo reconoce.

Figura 26. Ensayo de Miles: La inducción de la permeabilidad vascular se inhibe por el PTEN largo. Esta inhibición se puede revertir mediante la pre-incubación de la proteina purificada con el anticuerpo PTEN (6H2.1). El PTEN largo es capaz de inhibir la inducción de la permeabilidad vascular por VEGF. Esta inducción se podría restaurar por la pre-incubación del PTEN largo con el anticuerpo contra el PTEN, pero no por la IgG de control.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Una fosfatasa humana aislada y polip-éptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende residuos de aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N0:1 o un análogo de los mismos que comprenden residuos de aminoácido consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5, o una variante de cada uno de los mismos.

Un polipéptido comprende (i) residuos 1 hasta 173 de SEQ ID NO:l, o ( i i ) un análogo del mismo que comprende residuos 1 hasta 173 de SEQ ID NO: 5, o (iii) residuos 22 a 516 de SEQ ID NO: 1.

Una composición farmacéutica que comprende fosfatasa y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende residuos de aminoácido consecutivos tiene la secuencia expuesta en SEQ ID N0:1, o un fragmento de los mismos que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un análogo de los mismos que comprende residuos de aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5.

Un método para tratar un tumor sólido en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad de una fosfatasa humana y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende residuos de aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N0:1, o un fragmento de los mismos que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un .análogo de los mismos que comprende residuos de aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5, efectivos para tratar el tumor sólido en el sujeto..

Un método para inhibir el crecimiento de un tumor sólido en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad de una fosfatasa humana y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende residuos de aminoácido consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N0:1, o un fragmento de los mismos que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID NO: i, o un análogo de los mismos que comprende residuos de aminoácido consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5, efectivos para inhibir el crecimiento del tumor sólido en el sujeto.

Un método para inhibir la angiogénesis en un tumor sólido en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad de una fosfatasa humana y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende residuos de aminoácido consecutivos que tienen la secuencia expuesta 'en SEQ ID N0:1, o un fragmento de los mismos que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un análogo de los mismos que comprende residuos de aminoácido consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5, efectivos para inhibir la angiogénesis en el tumor sólido en el sujeto.

Un método para inducir la apoptosis de una célula epitelial vascular de un vaso sanguíneo en un tumor sólido en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad de una fosfatasa humana y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprenden residuos de aminoácido consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N0:1, o un fragmento de los mismos que comprenden residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un análogo de los mismos que comprenden residuos de aminoácido consecutivos' que tienen . la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5, efectivos para inducir la apoptosis de la célula epitelial vascular en el vaso sanguíneo en el tumor sólido en el sujeto.

En una modalidad de los métodos descritos en este documento el tumor es un tumor canceroso. En una modalidad de los métodos descritos en este documento el tumor canceroso es un tumor de células gliales del sujeto, próstata, ovarios, útero, endometric, mama, melanocito, riñon, pulmón, colon, cabeza, cuell En una modalidad de los métodos descritos en este documento el tumor canceroso se activa por PTEN o por una trayectoria de PI3K o. es PTEN negativo.

En una modalidad de los métodos descritos en este documento el PTEN largo, o el análogo del mismo, o el fragmento de PTEN largo, se administran al sujeto mediante introducción directa en el tumor sólido. En una modalidad d de los métodos descritos en este documento el PTEN largo, o el análogo del mismo, o el fragmento de PTEN largo se inyectan en el tumor sólido. En una modalidad de los métodos descritos en este documento el PTEN largo, o el análogo del mismo, o el fragmento de PTEN largo se introducen directamente en el tumor sólido por un catéter. En una modalidad de los métodos descritos en este documento el PTEN largo, o el análogo del mismo, o. el fragmento de PTEN largo se administran al sujeto mediante introducción directa en un vaso sanguíneo que suministra al tumor sólido. En una modalidad de los métodos descritos en este documento el PTEN largo, o el análogo del mismo, o el fragmento de PTEN largo se inyectan en el vaso sanguíneo que suministra al tumor sólido. En una modalidad de los métodos descritos en este documento el PTEN largo, o el análogo del mismo, o el fragmento de PTEN largo se introducen directamente por un catéter en el vaso sanguíneo que suministra al tumor sólido. En una modalidad de los métodos descritos en este documento el PTEN largo, o el análogo del mismo, o el fragmento de PTEN largo, se administran al sujeto intravenosamente. En una modalidad de los métodos descritos en este documento el PTEN largo, o el análogo del mismo, o el fragmento de PTEN largo se administran al sujeto subcutáneamente.

Un método para tratar un tumor sólido en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad de un vector de expresión que codifica fosfatasa humana y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende SEQ ID N0:1, o un fragmento del mismo que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un análogo del mismo que comprenden SEQ ID NO: 5, para expresar PTEN largo, fragmento de PTEN largo, o el análogo del mismo, en células del tumor sólido en una cantidad efectiva para tratar el tumor sólido en el sujeto.

Una fosfatasa humana y un polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) comprende SEQ ID N0:1 o un fragmento del mismo que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un análogo del mismo que comprende SEQ ID NO: 5 para el uso en el tratamiento de un tumor sólido en un sujeto, para inhibir el crecimiento de un tumor sólido en un sujeto, para inducir la apoptosis de una célula epitelial vascular en un tumor sólido en un sujeto, o para inhibir la angiogénesis en un tumor sólido en un sujeto.

En una modalidad de un compuesto para los usos descritos en este documento el tumor es un tumor canceroso. En una modalidad de los métodos descritos en este documento, el tumor canceroso es un tumor canceroso glial, de la próstata, de mama, de endometrio, de melanocitos, de riñon, o de pulmón.

En una modalidad del compuesto para los usos descritos en este documento el tumor canceroso se activa por PTEN por una trayectoria de PI3K o es PTEN negativo.

Una composición que comprende una fosfatasa humana y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende SEQ ID N0:1, o un fragmento del mismo que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID NO:l, o un análogo del mismo que comprenden SEQ ID NO: 5, enlazado a un agente no de péptido que incrementa la vida media en el plasma del PTEN largo, fragmento de PTEN largo, o el análogo del mismo, respectivamente .

En una modalidad las composiciones descritas en este documento comprenden además un portador farmacéutico. En una modalidad de las composiciones descritas en este documento, el agente no de péptido e incrementa la vida media en el plasma es polietilenglicol (PEG) . En una modalidad de las composiciones descritas el PEG se enlaza a un C-terminal o a un N-terminal del PTEN largo, fragmento de PTEN largo, o el análogo del mismo. En una modalidad de las composiciones descritas el agente no de péptido que incrementa la vida media en el plasma es cloroformiato de 9-fluorenilmetilo (Fmoc) o ( 7-sulfo) -9-fluorenilmetoxicarbonilo .

Un ácido nucleico aislado que codifica una fosfatasa humana y un polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende SEQ ID N0:1, o que codifica un fragmento del mismo que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID NO: i, o que codifica un análogo del mismo que comprende SEQ ID NO: 5.

En una modalidad el ácido nucleico comprende nucleótidos consecutivos que tiene la secuencia expuestas en SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 6. En una modalidad el ácido nucleico comprende residuos de nucleótidos consecutivos 503 a 2243 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 6. En una modalidad el ácido nucleico comprende nucleótidos consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 7. En una modalidad el ácido nucleico comprende residuos de nucleótido consecutivos 503 a 2243 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO : 7. En una modalidad el ácido nucleico es un RNA. En una modalidad el ácido nucleico es un DNA. En una modalidad el ácido nucleico es un cDNA.

Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica fosfatase humana y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende SEQ ID NO:l, o un fragmento del mismo que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID NO:l, o un análogo del mismo que comprenden SEQ ID NO:5.

Una célula transformada capaz de expresar fosfatasa humana y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende SEQ ID NO:l, o un fragmento del mismo que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID NO:l, o un análogo del mismo que comprenden SEQ ID NO: 5, en donde la célula tiene integrado en su genoma un DNA recombinante que codifica el PTEN largo o un análogo del mismo.

Una célula hospedera capaz de expresar fosfatasa humana y polipéptido . largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende SEQ ID NO: I, o un fragmento del mismo que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID NO:l, o un análogo del mismo que comprende SEQ ID NO: 5, en donde la célula hospedera comprende un plásmido que codifica PTEN largo o un análogo del mismo.

En una modalidad, la célula hospedera es una célula bacteriana. En una modalidad la célula hospedera es una célula de mamífero.

Un proceso que comprende mezclar (1) fosfatasa humana y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende ID N0:1, o un fragmento del mismo que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un análogo del mismo que comprenden SEQ ID NO: 5, y (2) un agente no de péptido que incrementa la vida media en el plasma, del PTEN largo o el análogo del mismo, para elaborar PTEN largo que comprende SEQ ID N0:1, o el fragmento del mismo que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID NO : 1 ,· o el análogo del mismo que comprende SEQ ID NO: 5, enlazado a agente no de péptido que incrementa la vida media en el plasma del PTEN largo, fragmento de PTEN largo, o el análogo del mismo, respectivamente .

Una mclécula de ácido nucleico aislado consiste de por lo menos un fragmento de 20 nucleótidos de la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 6 o un complemento de la misma que se hibridiza específicamente bajo condiciones rigurosas a un complemento de la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 6, o a SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 6.

Un anticuerpo aislado,- o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo se enlaza a (1) polipéptido de PTEN largo que comprende residuos de aminoácidos 1-173 de SEQ ID N0:1 o (2) un análogo del' mismo que comprende SEQ ID NO: 5 o (3) los aminoácidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 3 o (4) un fragmento de PTEN largo que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1.

En una modalidad el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En una modalidad el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. En una modalidad el fragmento de anticuerpo es un fragmento de Fab, Fab' , F(ab')2, o de Fv. En una modalidad el fragmento de anticuerpo es un anticuerpo de cadena individual. En una modalidad el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

Un anticuerpo aislado o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo se enlaza a un epitopo conformacional de PTEN largo, en donde el PTEN largo comprende la secuencia expuesta en los residuos 1-173 de SEQ ID N0:1, pero en donde el anticuerpo no se enlaza a PTEN.

En una modalidad el anticuerpo se enlaza a un epitopo comprendido de cualquiera de los residuos 153-173 de SEQ ID NO: 1.

Un anticuerpo aislado o el fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo se enlaza a un epitopo de un PTEN largó, en donde el PTEN largo comprende la secuencia expuesta en los residuos 1-173 de SEQ ID N0:1, pero en donde el anticuerpo no se enlaza a PTEN.

En una modalidad del anticuerpo se enlaza a los residuos 153-173, o una porción de los mismos, o de SEQ ID N0:1.

Un fragmento de péptido de SEQ ID N0:1, o SEQ ID NO: 5, el fragmento que tiene actividad antitumor, anti-angiogénica, o ant i-apoptótica . En una modalidad, el péptido comprende 5-10, 10-20, 20-30, o 30-40 aminoácidos. En una modalidad, el péptido comprende los aminoácidos 1-173 de SEQ ID N0:1 o SEQ ID NO: 5. En una modalidad el péptido comprende residuos de aminoácido consecutivos 22 a 516 de SEQ ID NO:l. En una modalidad el péptido no comprende residuos de aminoácido consecutivos 174 a 576 de SEQ ID NO:l o SEQ ID NO: 5.

Como se utiliza en este documento, una cantidad "profilácticamente efectiva" de una sustancia es una cantidad efectiva para prevenir o retardar el inicio de una condición patológica dada en un sujeto al cual se le administra la sustancia.

Como se utiliza en este documento, una cantidad "terapéuticamente efectiva" de una sustancia es una cantidad efectiva para tratar, mejorar o disminuir un síntoma o causa de una condición patológica dada en un sujeto que sufre de la misma el sujeto al cual se le administra la sustancia.

En una modalidad, la cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva es de aproximadamente 1 mg de agente/sujeto a aproximadamente 1 g de agente/sujeto por dosificación. En otras modalidad, la cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva es de aproximadamente 10 mg de agente/sujeto a 500 mg de agente/sujeto. En una modalidad adicional, la cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva es de aproximadamente 50 mg de agente/sujeto a 200 mg de agente/sujeto. En una modalidad adicional, la cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva es de aproximadamente 100 mg de agente/sujeto. En aún una modalidad adicional, la cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva se selecciona de 50 mg de agente/sujeto, 100 mg de agente/sujeto, 150 mg de' agente/sujeto, 200 mg de agente/sujeto, 250 mg de agente/sujeto, 300 mg de agente/su eto, 400 mg de agente/sujeto y 500 mg de agente/suj eto .

"Administración" de un agente se puede efectuar o realizar utilizando cualquiera de los diversos métodos y sistemas de suministro conocidos per aquellas personas expertas en la técnica. La administración puede ser, por ejemplo, intravenosa, oral, nasal, intraperitoneal, a través del fluido cefalorraquídeo, a través de implante, de la transmucosa, transdérmico, intramuscular, intravascular , intra-arterial , intra-coronario, intra-miocardio o subcutáneo.

El término "análogo de PTEN largo" abarca polipéptidos que tienen uno o más aminoácidos modificados, pero retienen por lo. menos 90% de similitud de secuencia con SEQ ID N0:1, y que retienen o mejoran la actividad de la inhibición de crecimiento tumorál. como es medido por el estudio in vivo descrito a- partir de ahora. El PTEN mismo (es decir el polipéptido definido por únicamente los residuos 174-576 de SEQ ID N0:1) se excluye expresamente.

El término "variante de PTEN largo" abarca polipéptidos que tienen uno o más aminoácidos adicionales, que tienen típicamente menor que 5 aminoácidos adicionales en ya sea el N-terminal o el C-terminal del PTEN largo, o ambas, y lo cual retiene . o se mejora en la actividad de la inhibición del crecimiento tumoral como es medido por el estudio in vivo descrito a partir de ahora.

El término "variante del análogo de PTEN largo" abarca polipéptidos que tienen uno o más aminoácidos adicionales, que tienen típicamente menor que 5 aminoácidos adicionales en ya sea el N-terminal o el C-terminal del análogo de PTEN largo (es decir SEQ ID NO: 5), o ambas, y el cual retiene o se mejora en la actividad de la inhibición del crecimiento tumoral como es medido por el estudio in vivo descrito a partir de ahora.

Todas las modalidades en este documento con referencia al análogo de PTEN largo son aplicables mutatis mutandis a una variante' de PTEN largo.

El PTEN largo algunas veces se ha referido de otra manera como PTEN-beta, ????-ß, PTEN-S.

Los sistemas de suministro de fármacos inyectables para el PTEN largo, análogo de PTEN largo, variante de PTEN largo, variante del PTEN largo, o conjugados de cada uno de los mismos, incluyen soluciones, suspensiones, geles, rnicroesferas, e inyectables poliméricos y pueden comprender excipientes tales como agentes de alteración de solubilidad (por ejemplo, etanol, propilenglicol y sacarosa) y polímeros (por ejemplo, policaprilactonas y PLGA's). Los sistemas implantables incluyen barras y discos, y pueden contener excipientes tales como los ejemplos no limitantes PLGA y policaprilactona.

Los sistemas de suministro oral para las composiciones y compuestos de la invención incluyen tabletas y cápsulas. Estos pueden contener excipientes tales como aglutinantes (por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa, polivinilpirrol idona , otros materiales celulósicos v almidón), diluentes (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, fosfato de dicalcio y materiales celulósicos) , agentes desintegrantes (por ejemplo, polímeros de almidón y materiales celulósicos) y agentes de lubricación (por ejemplo, estearatos y talco) .

Los sistemas de suministro transmucosales para las composiciones y compuestos de la invención incluyen parches, tabletas, supositorios, pesario, geles y cremas, y pueden contener excipientes tales como solubilizantes y potenciadores (por ejemplo, propiienglicol , sales biliares y aminoácidos) , y otros vehículos (por ejemplo, polietilenglicol , ásteres de ácido graso y derivados, y polímeros hidrofí 1 icos tales como hidroxipropilmetilcelulosa y ácido hialurónico) .

Los sistemas de suministro dérmicos para las composiciones y compuestos de la invención incluyen, por ejemplo, geles acuosos y no acuosos, cremas, múltiples emulsiones, microemulsiones, liposomas, ungüentos, soluciones acuosos y no acuosas, lociones, aerosoles, bases y polvos de hidrocarburos, y pueden contener excipientes tales como solubilizantes, potenciadores de permeación (por ejemplo, ácidos grasos, ésteres de ácido graso, alcoholes graos y aminoácidos), y polímeros hidrofilicos (por ejemplo, policarbofilo y polivinilpirrolidona) . En una modalidad, el portador farmacéuticamente aceptable es un liposoma o un potenciador transdérmico .

Soluciones, suspensiones y polvos para sistemas de suministro reconstituibles para las composiciones y compuestos de la invención incluyen vehículos tales como agentes de suspensión (por ejemplo, gomas, xantanos, celulósicos y azúcares), humectantes (por ejemplo, sorbitol), solubilizantes (por ejemplo, etanol, agua, PEG y propilenglicol ) , surfactantes .(por ejemplo, laurilsulfato de sodio, Spans, Tweens, y cetil-piridina ) , conservadores y antioxidantes (por ejemplo, parabenos, vitaminas E y C, ácido ascórbico) , agentes anti-aglomerantes , agentes de recubrimiento y agentes quelantes (por ejemplo, EDTA) .

Como se utiliza en este documento, "5'ATR" es la región alternamente traducida 5' como se describe en la sección experimental a partir de ahora.

Como se utiliza en este documento, un "portador farmacéutico" es un solvente farmacéuticamente aceptable, agente de suspensión o vehículo, para administrar los presentes compuestos o composiciones al animal o humano. El portador puede ser líquido, aerosol, gel o sólido y se selecciona con la manera planeada de administración en mente.

"Agente no de péptido" propondrá cualquier entidad química, incluyen, sin limitación, un glicómero, un polímero, una molécula pequeña (es decir, una molécula basada en hidrocarburos o molécula orgánica que tiene un peso molecular de menor que 1000), un lípido, un liposoma. Ejemplos de agentes no de péptido incluyen, pero no se limitan a, PEG, Fmoc y FMS .

"Tumor sólido" como se. utiliza en este documento incluye tumores sólidos cancerosos y no cancerosos. Tumores sólidos cancerosos incluyen, sin limitación, cáncer del tacto biliar, cáncer de cerebro, incluyendo glioblastomas y meduloblastomas ; cáncer de mama; cáncer cervical; coriocarcinoma; cáncer de colon; cáncer endometrial; cáncer del esófago; cáncer gástrico; neoplasmas intra-epiteliales , incluyendo enfermedad de Bowen y enfermedad de Paget; cáncer del hígado; cáncer de pulmón; linfomas, incluyendo enfermedad de Hodgkin y linfomas linfocíticos ; neuroblastomas ; cáncer oral, incluyendo carcinomas de . células escamosas; cáncer ovárico, incluyendo aquellos que sufren de células epiteliales, células esternales, células germinales y células mesenquimales ; cáncer de páncreas; cáncer de próstata; cáncer colorectal; sarcomas, incluyendo leiomiosarcoma , rabdomiosarcoma, liposarcoma, ' fibrosarcoma y osteosarcoma ; cáncer de piel, incluyendo elanoma, sarcoma de Kaposi, cáncer basocelular y cáncer de células escamosas; cáncer testicular, incluyendo tumores germinales (seminoma, no semino a [teratomas, coriocarcinomas] ) , tumores estromales y tumores de células germinales; cáncer de tiroides, incluyendo adenocarcinoma de tiroides y carcinoma medular; y cáncer renal incluyendo adenocarcinoma y tumor de Wilms, pero excluye tumores de tejidos no sólidos tales como leucemias y otros neoplasmas hematológicos , incluyendo leucemia linfocitica y mielogenosa aguda; mieloma múltiple; leucemias asociadas con SIDA y linfoma de leucemia de células T adultas.

SEQ ID N0:1 del listado de secuencias es la secuencia de proteina PTEN largo de longitud completa. Los residuos de aminoácidos 1 a 173 de SEQ ID N0:1 representan los residuos novedosos de PTEN largo que se codifican por la secuencia 5' ATR mRNA (véase la descripción de SEQ ID NO: 2 a continuación) . La metionina iniciadora canónica del PTEN es el residuo de aminoácido 174 de SEQ ID N0:1.

SEQ ID NO: 2 es la secuencia de PTEN largo mRNA de longitud completa. La secuencia 5' ATR de PTEN largo comienza en el nucleótido 513 de SEQ ID NO: 2, el codón de inicio CUG no canónico, y termina en el nucleótido 1031 de SEQ ID NO: 2. La 5 ' ATR está dentro del marco con el marco de lectura abierto PTEN, que comienza en el codón de inicio AUG canónico en un nucleótido 1032 de SEQ ID NO: 2 y termina en el nucleótido 2243 de SEQ ID NO: 2. De esta manera, el marco de lectura abierto de PTEN largo se extiende desde el nucleótido 513 de SEQ ID NO: 2 al nucleótido 2243 de SEQ ID NO: 2 y conduce a la adición de 173 aminoácidos al N-terminal del PTEN. La proteina es referida como el PTEN largo.

SED ID NO: 3 es el cDNA que corresponde a la secuencia PTEN largo mRNA de longitud completa.

SEQ ID NO: 4 es el polipéptido de la secuencia de la proteína PTEN largo que comprende residuos de aminoácidos 153 a 173 de SEQ ID NO:l. Este único péptido representa un único epítopo derivado de PTEN largo que no se encuentra en el PTEN.

SEQ ID NO: 5 es una secuencia de proteínas del análogo de PTEN largo de longitud completa. El residuo de aminoácido 1 del PTEN largo se ha cambiado de Leu a Met en el análogo para incrementar los rendimientos de la proteína.

SEQ ID NO: 6 es la secuencia de mRNA del análogo de PTEN largo de longitud completa modificada. La secuencia 5' ATR del análogo de PTEN largo comienza en el nucleótido 513 de SEQ ID NO: 6, en el codón de inicio AUG diseñado, y terminan en el nucleótido 1031 de ' SEQ ID NO: 6.

SEQ ID NO: 7 es el cDNA modificado que corresponde a la secuencia de mRNA del análogo de PTEN largo de longitud completa modificadas.

Donde se proporciona un intervalo en la especificación se entiende que el intervalo incluye todos los números enteros y 0.1 unidades dentro de ese intervalo, y cualquier subintervaio del mismo. Por ejemplo, un intervalo de 77 a 90% incluye 77.0%, 77.1%, 77.2%, 77.3%, 77.4%, 77.5%, 77.6%, 77.7%, 77.8%, 77.9%, 80.0%, 80.1%, 80.2%, 80.3%, 80.4%, 80.5%, 80.6%, 80.7%, 80.8%, 80.9%, y 90.0%, asi como también el intervalo de- 80% a 81.5% etcétera.

Todas las combinaciones de los diversos elementos descritos en este documento están dentro del alcance de la invención .

Esta invención se entenderá mejor por referencia a los detalles experimentales que' siguen, pero aquellas personas expertas en la técnica apreciarán fácilmente que los experimentos específicos detallados son solamente ilustrativos de la invención como se describen más completamente en las reivindicaciones que siguen posteriormente.

Detalles Experimentales El supresor de tumores ??? es uno de los genes más comúnmente alterados en el cáncer. Funciona como una fosfatasa de lipidos de fosfatidilinositiol-3 , 4 , 5-trifosfato que a su vez suprime la señalización oncogénica del fosfa t idilinositol-3-cinasa (PI3K) y Akt . La inspección de PTEN mRNA reveló que la región no traducida 5 (UTR) está dentro del marco con el marco de lectura abierto (ORF) del PTEN para 770bp. Dentro de este UTR ORF, existe un codón de inicio CUG alterno dentro de una secuencia Kozak débil en 513 pares base cadena arriba del codón de inicio AUG canónico. Mientras que la expresión del PTEN ORF canónico genera una proteina que migra a aproximadamente 55kDa, la expresión del cDNA del PTEN que contiene la 5' UTR es capaz de generar una segunda proteina en 70kDa llamada PTEN largo. La mutación de los sitios de inicio indicó que el PTEN de 55kDa es generado de la traducción en el codón de inicio canónico mientras que el PTEN largo se inicia desde el sitio de inicio alterno cadena arriba. La inmunotinción con diferentes anticuerpos de PTEN mostró la presencia endógena' del PTEN largo en múltiples lineas de células. Estudios de supresión genética y silenciamiento génico en células ES de ratón confirmaron que esta proteina más grande fue de hecho el PTEN. La secuencia de proteínas N-terminal adicionada codificó un péptido de señal y un sitio de escisión, indicando que el PTEN largo entra a la vía secretora. El PTEN largo se enlaza de manera preferente a la iectina con concanavalina A, que muestra que se glicosila. Adicionalmente, el PTEN largo se puede purificar de medios acondicionados mediante purificación por afinidad utilizando tanto un anticuerpo al PTEN asi como también sulfato de heparina. El PTEN largo también es sensible a la degradación en un ensayo de protección de proteasa in vivo mientras que el PTEN normal no lo es, indicando que el PTEN largo se localiza en el exterior de la membrana celular.

Reactivos , líneas de células y anticuerpos - la Proteinasa K y concanavalina A se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO) . La heparina sefarosa y la columna de HP de heparina HiTrap se adquirieron de Amersham (Piscataway, NJ) . Los anticuerpos PTEN se adquirieron de Cell Signaling (Danvers MA) y Cascade (Winchester A) . El anticuerpo Akt se obtuvo de Cell Signaling (Danvers MA) y el anticuerpo de cadeina E de Upstate Miliipore (Billerica, Ma) . Un anticuerpo purificado por afinidad policlonal contra el epitopo PRHQQLLPSLSSFFFSHRLPD (SEQ ID N0:3), encontrado en la traducción novedosa de PTEN,. se realizó por Zymed Laboratories (South San Francisco, CA) . Los anticuerpos secundarios se adquirieron de Pierce (Rockford, IL) . El HEK293, ZR-75-1, SKBR-3, MDAMB-361, BT549, y PC3 se obtuvieron de ATCC (Manassas, VA) y se desarrollaron de acuerdo con las guias suministradas.

Piásmidos y Constructos - pCEP4-PTEN, que codifica el marco de lectura abierto completo de PTEN y la región no traducida 5' se generaron como se reporta previamente por la clonación de cDNA PTEN (depositado en NCBI como s U90351) en el sito Notl de pCEP4 (Invitrogen) (Li, Simpson y colaboradores 1998) . La 5'UTR se extendió adicionalmente en este plásmido mediante - la ligación de un adaptador que codifica la secuencia cadena arriba del sitio de restricción Notl original utilizado para clonación. El adaptador codificó hasta 10 pares base cadena arriba del primer codón de inicio CTG alterno posible localizado en -513 del sitio de inicio canónico. Un adaptador en el cual el sitio de inicio alterno putativo se mutó a ATG también se utilizó para crear un segundo conjunto de constructos de expresión en las cuales la forma larga se expresaría eficientemente. Adicionalmente la mutagénesis del codón de inicio canónico a ATA también se realizó, produciendo en total 4 constructos diferentes (Figura 5.1) . Estas 4 variaciones así como también el marco de lectura abierto del PTEN original también se subclonaron en un vector de retrovirus MSCV (Clontech, Mountainview, CA) para expresión estable a través de infección.

Ensayo de Protección de la Proteasa - Se recolectaron células HEK293 en PBS enfriado con hielo sin tripsina y 5x10a alícuotas de células se incubaron durante 30 minutos con concentraciones de incremento de proteinasa K, de 0.5 ug/ml a 10 ug./ml . Un control con Tritón al 0.1% se incluyó para verificar la capacidad de la Proteinasa K para degradar las proteínas indicadas. La reacción se detuvo con 5 mM de PMSF. Las células se lisaron en una solución amortiguadora de muestra Laemmii 2x (Tris 125 nM pH 6.8, glicerol al 20%, azul de bromofenol al 0.05%, SDS al 4%, 2-mercaptoetanoi al 10%) y se mmunotiñeron para PTEN, Akt y caderina E.

Purificación de PTEN de hígados de ratón - Se congelaron instantáneamente hígados de ratones C57BL6 en nitrógeno líquido, se pulverizaron, y se resuspendieron en solución amortiguadora TNN (Tris 50mM pH 7.4, NaCl 150mM, NP-40 al 0.5%, EDTA 5mM, glicerol al 3%, DTT lmM, Inhibidores de Cóctel de Proasa de Mamífero ix ([Sigma]). La suspensión se homogenizó con un mortero y se centrifugó a 40,000 RPM a 4 grados durante 1 hora. El sobrenadante se filtró sucesivamente con filtros de 0.45 raicras y 0.22 mieras. Una columna de exclusión de tamaño sephacryl 200 (Amersham) se pre-equilibró con TNN y la muestra se aplicó a una velocidad de 0.3 ml/hr, seguido por solución amortiguadora. Se recolectaron 2 mi de fracciones y las muestras de peso molecular bajo se agruparon y se aplicaron a una columna de heparina HP HiTrap equilibrada (Amersham) . La columna se lavó con tres volúmenes de columna de TNN y la proteína se eluyó con volúmenes de columna 3x escalonado de 0.3M, 0.5M y 1M de soluciones de TNN NaCl . Las fracciones se recolectaron en incrementos de 0.5 mi y se inmunotiñeron para PTEN.

Purificación de heparina de PTEN del medio - se desarrollaron células HEK293 para confluencia en DMEM con FBS al 10% en cajas de 15 cm. Las células se incubaron durante toda la noche con 15 mi de DMEM sin FBS. Se recolectó el medio de las 20 placas y .se filtró a través de un filtro de 0.45 mieras. Una columna de Heparina HP de 1 mi se equilibró con DMEM utilizando Akt'aPrime (AmershamBioscience) utilizando un flujo de 4 ml/min a 4°C. El medio acondicionado se hizo pasar a través de la columna a 1 ml/minuto. La columna se lavó con 10 volúmenes de BC200 (NaCl 200 mM, Tris 50 mMT pH 7.4, EDTA 1 mM, Tritón X-100 al 0.2%). Las proteínas se eluyeron con 5 mi de NaCl 1 M a 1 ml/minuto en fracciones de 1 mi . La concentración de proteínas de cada fracción se determinó por la OD a 280nm. La mitad de cada fracción se precipitó con 20% con ácido tricloroacético , se lavó con acetona fría y se secó bajo vacío. La proteína se reconstituyó en 20 ul de solución amortiguador de lisis Laemmli y se inmunotiñó utilizando un anticuerpo para PTEN y PTEN largo.

Purificación del PTEN de Suero - Suero humano de plasma AB se obtuvo de Sigma. 1 mi de suero se filtró a través de un filtro de 0.45 mieras y se pre-limpió de anticuerpos utilizando proteina A/agarosa G durante 1 hora de incubación. La heparina-agarosa se incubó con el suero pre-limpio durante toda la noche junto con un control de sefarosa y se lavó al dia siguiente con BC150 (NaCl 150 mM, Tris 25 mM pH7.4, NP-40 al 1%, Na Desoxicolato al 0.25%, EDTA 1 mM) . Las proteínas se eluyeron con solución amortiguadora de muestra laemmli y se inmunotiñeron para PTEN o secundario solamente para contaminación de cadena pesada.

Interacción de la Concanavalina A - se Usaron células HEK293 en su confluencia con BC500 (NaCl 500 mM, Tris 20mM pH 7.4, Tritón X-100 al 1%, MnCl2 1 mM, CaCl2 1 mM, Cóctel de Inhibidor de Proteasa lx) . El lisado celular se centrifugó y se filtró. Se realizaron las interacciones con 20 microlitros de concanavalina A sefarosa (Sigma) durante 1 hora a 4°C. La resina se lavó con BC500 y la proteina se eluyó con solución amortiguadora de muestra a la Laemmli.

Resultados El PTEN mRNA tiene un sitio de inicio alterno cadena arriba PTEN mRNA depositado en NCBI (Li y Sun 1997; Steck, Pershouse y colaboradores 1997) contiene una 5'UTR extensiva. Aproximadamente 770 pb de secuencia contigua en la región 5'UTR está dentro del marco con el codón de inicio. No se codifican metioníñas en esta región; sin embargo, existen varios codones CUG de inicio alternos que comienzan en -519 del codón de inicio canónico. La traducción de estas secuencias no reveló dominios identificables de acuerdo con el sitio de exploración (scansite.mit.edu) y el prositio (www.ebi.ac.uk/ppsearch). . La traducción de esta región completa agregarla 173 aminoácidos PTEN incrementando su masa molecular a aproximadamente 70 kilodaltons (Figura 2 y SEQ ID NO : i ) .

La alineación de otros ortólogos de PTEN reveló que la secuencia traducida de la UTR de Homo sapiens se puede encontrar en los marcos de lectura abiertos del PTEN de varias especies. Pan troglodytes, Bos Taurus, Apis mellifera y Caenorhabditis elegans todas contienen el homólogo de la secuencia de proteina al producto traducido de la 5' UTR de Homo sapiens (Figura 3). Adicionalmente , la alineación de las 5' UTR de Homo sapiens y la PTEN 5' UTR de Mus musculus mostraron homología de nucleótidos extensiva (no mostrada) . La 5' UTR de Mus musculus se tradujo dentro del marco con el codón de inicio canónico para 522 pares base y revelaron una secuencia de proteínas altamente homologa cuando se comparó con la traducción de la 5'UTR de Homo sapiens (Figura 5.3). La homología de la 5'UTR y la presencia actual de la secuencia de aminoácidos derivada de la 5'UTR de Homo sapiens en las proteínas traducida de otras especies es indicativa de la importancia revolucionaria de esta secuencia.

El PTEN mRNA puede iniciar la traducción de un sitio cadena arriba alterna. La sobreexpresión del PTEN ORF generó una sola banda de proteínas en 55kDa. La inclusión de la 5'UTR dio por resultado una segunda banda de proteínas más grande de aproximadamente 70kDa. Una banda de proteína más grande en inmunotinciones de PTEN también estuvo presente en un número de líneas de células endógenamente y fue de detectable por diferentes anticuerpos monoclonales (Figura 4). Esta banda de proteína más grande también estuvo presente en células ES de tipo silvestre de ratón y estuvo ausente en células ES de ratón genéticamente deficiente de PTEN y disminuyó en clones Es de ratón que expresan establemente un PTEN shRNA (Figura 4). El silenciamiento génico de la proteína PTEN humana en células HEK293 utilizando siRNA también causó un silenciamiento génico de la proteína de 70 kDa.

La expresión de un plásmido que codifica el ORF del PTEN en la línea de células PC3 de PTEN nulo dio por resultado la generación de una proteína 55kDa. Cuando los plásmidos que también codificaron la 5'UTR se sobre-expresaron, se produjo una proteína 70kDa. La mutación del codón de inicio putativo cadena arriba de CTG o ATG (Figura 1, "ATG/ATG") cambió predominantemente el patrón de inmunotinción a la forma 70 kDa (Figura 4). La banda 55kDa también se confirmó por originarse del codón de inicio ATG mediante mutagénesis (Figura 4 "CTG/ATA").

De esta manera, la 5'UTR fue suficiente para iniciar la traducción de una forma más larga de PTEN. Por consiguiente, la 5'UTR se llamó 5'ATR para la región alternativamente traducida y la proteina más larga detectada se llamó " PTEN largo".

Se generó un anticuerpo policlonal purificado por afinidad contra aminoácidos traducidos de la 5'ATR y se utilizó para confirmar la producción del PTEN largo recombinante en estudios de sobreexpresión asi como también la forma endógena en las células HEK293 (Figura 4) . De la inmuno inción del lisado celular completo de células HEK293 y los estudios de sobreexpresión en células PC3, pareció que son múltiples formas de PTEN largo, indicando ya sea modificaciones postraduccionales · potenciales, formas de empalme no documentadas o aún codones de inicio alternos en la 5'ATR.

PTEN largo codifica un péptidc de señal N-terminal La secuencia N-terminal del PTEN largo contiene un estiramiento largo de aianinas que podría ser indicativo de ya sea una secuencia de transmembrana o un péptido de señal.

El análisis de la secuencia traducida utilizando SignalIP 3.0 predijo con un alto' grado de probabilidad (>95%) que la secuencia contiene un péptido de señal (Figura 5) . Un péptido de señal está comprendido característicamente de aminoácidos básicos seguido por un estiramiento hidrofóbico. La hélice de transmembrana hidrofóbica putativa se rompe por una prolina y se sigue por una secuencia de alguna manera polar. La secuencia también se predijo que se. escinde, indicando que la proteína se debe liberar en el lumen de la ER.

El PTEN se glicosila Una de las marcas distintivas de las proteínas secretadas extracelulares es la adición de porciones de azúcar complejas en el .aparato de golgi, un proceso conocido como glicosilación. Se pueden agregar azúcares a las asparaginas en la secuencia consenso N-X-S/T (X no puede ser prolina) por la vía de N-glicosilación (Guptá y Brunak 2002); ios grupos hidroxilo. de serinas, treoninas y tirosinas también pueden ser el objetivo de. lo que se ha llamado 0-glicosilación (Juleníus, Molgaard y colaboradores 2005). El PTEN tiene múltiples sitios de O-glicosilación, pero solo un sitio de N-glicosilación. La ectin-concanavalina-A, que se enlaza a porciones de azúcar se utilizó en un ensayo de interacción para determinar si se glicolizó una porción del complemento de PTEN en las células ???293. Una mezcla de PTEN que fue de aproximadamente PTEN largo al 50% (Figura 6) se purificó de estas células. Esto muestra que el PTEN largo se glicolisa y que ya sea la forma 55kDa citoplásmica del PTEN se glicolisa o que el PTEN largo se escinde extracelularmente .

El PTEN largo se enlaza al heparán y se encuentra en la superficie celular.

El PTEN enlazado a un número de proteoglicanos , tales como sindecanos y glipicanos, que se encuentran unidos a la hoja externa de la membrana. Estos protoglicanos son dos de las moléculas extracelulares más heparini zadas (Blero, Zhang y colaboradores 2005) . Se ha mostrado previamente que el PTEN tiene alta afinidad para especies altamente de manera negativa cargadas, una propiedad del PTEN que conduce a su preferencia del PIP3 altamente aniónico (Das, Dixon y colaboradores 2003) . Como el heparán es una de las moléculas biológicas más negativamente cargada, fue posible que el heparán pudiera mediar el enlace del PTEN a la matriz extracelular . Utilizando extractos de proteina de hígados de ratón, se descubrió que el PTEN se enlazó al heparán con alta afinidad. Adi cionalmente, la elución continua del PTEN de una columna de agarosa de heparina que utiliza NaCl 1M, también eluyó el PTEN largo (Figura 7} ..

El PTEN largo adherido a la superficie externa de una membrana celular, debe ser sensible a la degradación de la proteasa. En el ensayo de protección de proteasa, las células vivas se incubaron con una proteasa y solo se degradaron las proteínas extraceiulares ya que la membrana de lípidos es impermeable a la proteasa y sirve para proteger todas las proteínas intracelulares . Las células HEK293 se removieron del cultivo adherente por agitación leve con PB3 y se suspendieron con concentraciones de incremento de Proteinasa K. La reacción se detuvo con PMSF y las células se lisaron con solución amortiguadora laemlli. El PTEN largo mostró sensibilidad al tratamiento con Proteinasa K junto con la E-caderina, que es una proteína extracelular conocida (Figura 8) . El PTEN por otra parte mostró leve sensibilidad a la proteasa, lo que indica que alguna porción de las especies 55kDa también es extracelular (ya que se glicosila) o alguna lisis celular o llevada a cabo durante el ensayo que expuso el PTEN' citoplásmico a la Proteinasa K. Se incluyó un control con tritón permeabilizante de membrana para probar que el PTEN podría ser degradado si se expone a la Proteinasa K. queda por ver si este PTEN es apropiado o una forma escindida de PTEN largo que migra a 55kDa y retiene el epítopo C-terminal del anticuerpo PTEN. Estos datos indican que el PTEN largo está sobre la superficie celular.

PTEN largo soluble es secretado en el medio La posibilidad de que la porción de la proteina sea soluble y se libere en el entorno celular. La heparina sefarosa se utilizó para purificar por afinidad el PTEN largo del medio sin suero contenido en las células HEK293. La elución de la columna reveló la presencia de PTEN en el medio que rnigra en un peso molecular de 50kDa (figura 9). Una inmunotinción con el anticuerpo especifico de PTEN largo reveló la misma especie de 50kDa, indicando que esta proteina retiene la secuencia traducida del sitio de inicio alterno y la secuencia del epitopo C-terminal del anticuerpo monoclonal PTEN. Esto implica fuertemente que la porción del PTEN observó que es 55kDa de hecho es el producto de traducción escindido que se origina del codón de inicio cadena arriba.

La secreción de PTEN . en el medio se confirmó adicionalmente por la sobreexpresión del PTEN largo en las células HEK293 transfectadas con el constructo ATG/ATG. Estas células se utilizaron para producir un medio acondicionado sin suero durante toda la noche y el anticuerpo monoclonal PTEN 6H2.1 se utilizó para inmmunoprecipitar el PTEN de 1 mi del medio. La banda de PTEN más grande se imunoprecipitó exitosamente del medio junto con la banda 55kDa más baja. Debido a que la proteina se sobreexpresó, el procesamiento apropiado de la proteina probablemente no ocurrió lo cual da por resultado la secreción del- PTEN de 70kDa de tamaño completo.

El PTEN se encuentra en el suero humano.

Una de las mejores fuentes de material secretado fisiológico es el suero. La heparina sefarosa se utilizó para purificar por afinidad el PTEN del suero humano. El suero humano se hizo girar y se filtró para remover la materia particulada. Luego se diluyó 1:5 en BC150 y se pre-limpió extensivamente con proteína A/G para remover la IgG. EL suero se incubó a granel con una pequeña cantidad de heparina sefarosa. La heparina sefarosa se eluyó con solución amortiguadora laemmli y el material eluído se tiñó para PTEN y para solamente el anticuerpo secundario solo para excluir la contaminación de la cadena pesada. El PTEN y el PTEN largo se encontraron en el suero humano (figura 10).

Actividad anti-angiogénica del PTEN largo La función anti-angiogénica del PTEN largo se muestra por lo siguiente: (1) el PTEN largo se expresa normalmente de manera débil en la retina en desarrollo del ratón pero la expresión de alto nivel se observa en los vasos sanguíneos que son sometidos a involución/muerte celular durante el desarrollo neonatal (Figura 11); (2) el PTEN largo se encuentra en la apoptosis de vasos sanguíneos en tumores. Adicionalmente, las células epiteliales tratadas con PTEN largo, purificadas parcialmente de células transfectadas , 6.1 inhibieron la migración celular e indujeron la apoptosis. (Figura 12) . El PTEN largo purificado también puede inducir la muerte celular asociada con la activación de la apoptosis en U87, células endoteliales HUVEC, o 293 células en el cultivo, como es medido por la escisión de caspasa-3.

Actividad Anti-tumor y Anti-Angiogénica In Vivo del PTEN largo La Figura 13 muestra el tratamiento de ratones con PTEN largo (A) ratones (n=5) se inyectaron con la linea de células de glioblastoroa U87 para formar xenoinjertos en 2 sitios (izquierdo y derecho) en almohadillas de grasa mamarias. Después del injerto de tumor un tumor és inyectó directamente con PTEN largo y el tumor contra-lateral no se inyectó (p/PTEN largo) . Un conjunto de control de 5 ratones también se inyectó (Sin Vector) con una preparación de proteina purificada de control derivada de células transíectadas con vector vacio. Nuevamente, el tumor contra-lateral no se inyectó (p/Vector Vacio) . Los ratones se trataron en los días 1-11 y los días 13-14. El diámetro más largo (era) se midió con calibradores en los dias indicados. Los ratones se sacrificaron cuando el volumen del tumor alcanzó =1 era. (B) La proteina se preparó por transfección del vector de expresión de PTEN largo en 293 células y se purificó parcialmente utilizando la resina de afinidad V5 seguido por la elución con péptido VS . La Figura 14 muestra la fracción de supervivencia de los ratones (en días) tratados con inyecciones de control de PTEN largo durante 14 días.

Tinción Rezinal La tinción paira el PTEN largo y vasos sanguíneos en la retina de raurino p7 reveló que el PTEN largo tiñó selectivamente vasos hialoideos que están comenzando a retroceder en este punto en el desarrollo vascular retinal de murino. El anticuerpo a PTEN largo se dirigió contra el epítopo: N-PRHQQLLP3LSSFFFSHRLPD-C (SEQ ID NO : 3 ) . La tinción del vaso fue con BSl-lectina.

Purificación En un método para la purificación de células 293 de PTEN largo se transíectaron con PTEN largo ATG/ATG y el lisado celular se hizo pasar sobre una columna de afinidad Ni+. El PTEN largo se purificó consistentemente utilizando una columna de Ni+ en el Purificador AKTA utilizando solución amortiguadora de elución de imidazol.

Regresión del Tumor Xenoin ertos de células U87 transfectadas antes de la elución con ya sea PTEN (aminoácido orf 403) o PTEN largo. A 7 días pos la inyección existe una reducción en los vasos sanguíneos mamarios en el cohorte que sobreexpresa el PTEN largo como es comparado con el cohorte que sobreexpresa el¦ PTEN (n= 4 de 4). Esto sugiere que el PTEN largo puede afectar el entorno t mor 1.

Discusión Una segunda banda de proteina más larga en inmunotinciones de PTEN de Usados celulares y de tejido se observó regularmente. L'a evidencia que confirma que la banda más grande es PTEN incluye: las bandas de proteina más grande se detectaron por diferentes anticuerpos monoclonales de PTEN; la proteina más grande está ausente cundo las células se tratan con siRNA contra PTEN o el sitio de PTEN se suprime genéticamente en los ratones. La 5'UTR del PTEN se observó que está dentro del marco para más de 700 pares base con el codón de inicio clásico de PTEN. Adicionalmente , existen 522 pares base de codón CUG cadena arriba del PTEN, lo cual, si se traduce, podría ser el responsable del tamaño de la banda de proteína más grande en inmunotinciones de PTEN. Aunque no se asocia con una secuencia Kozak fuerte, retiene la citocina-1 y la secuencia de guanosina +1. Cuando se traduce y se agrega al PTEN ORF, una proteína de aproximadamente 70kDa debe ser creada, lo cual es la masa molecular de la banda de PTEN más grande que se ha observado.

La traducción de esta secuencia ya existió en una variedad de ortólogos de PTEN dentro de su secuencia de codificación actual. La 5'UTR de ratón también se inspeccionó debido a que una banda similar en los lisados de tejido de ratón se había observado. La secuencia de nucleótidos 5'UTR de ratón fue altamente homologa a la 5'UTR de Homo sapiens y de manera similar dentro del marco, con el codón de inicio. Existen dos codones de inicio alternos potenciales en -522 y -516 y la traducción de esta secuencia de esos sitios revela la secuencia de aminoácidos 90%+ .homologa a la secuencia de Homo sapiens. La conservación de esta proteína putativa es notable y demostró una importancia evolucionaría a esta secuencia. A fin de describir mejor esta secuencia, se renombró la 5'ATR o la región alternativamente traducida del PTEN para describir su potencial para la traducción.

Se construyó un plásmido en el cual el marco de lectura abierto del PTEN se clonó conjuntamente con la 5'ATR y la expresión de este PTEN recombinante se comparó con el marco de lectura abierta que produce 403 aminoácidos canónicos solo. La. inclusión de la 5'ATR generó una segunda, banda de proteína de PTEN más alta que migró a aproximadamente 70kDa como es comparado con los plásmidos de expresión que contienen solo el ORF canónico del PTEN, que creó una sola banda que migra a 55kDa. La proteína más grande es responsable por solo una porción menor de la proteína total traducida; sin. embargo, la mutación del sitio de inicio putativo a ATG cambió la relación de proteina predominantemente la forma más grande.

La conservación de la secuencia de proteínas de la 5'ATR indicó que era más que un artefacto de evolución. El N-terminal contuvo un estiramiento de aminoácidos alifáticos que se predijeron que son una secuencia transmembrana. El uso del Prositio y la Señal 3.0IP predijo que el N-terminal del PTEN largo fue un péptido de señal con un sitio de escisión de proteasa que lo sigue directamente.

Se utilizó un ensayo de protección de proteasa in vivo para probar si ' el PTEN largo se localizó en la superficie extracelular de las células. El PTEN largo mostró degradación progresiva con cantidades de incremento de proteasa extracelular, mientras que no lo hizo el PTEN, indicando que por lo menos algo del PTEN largo es extracelular y por lo menos en parte se une a la hoja externa de la membrana celular. Esto es un resultado más intrigante dada la aplicación de un lípido fosfatasa activa en la hoja externa de la membrana celular. Dos familias de proteoglicanos , glipicanos y sindecanos enlazados a la membrana externa, se identificaron previamente en un complejo de proteínas PTEN.

La presencia de PTEN en la superficie celular no excluye la posibilidad de un PTEN secretado soluble. Los sindecanos y glipicanos son dos de los proteoglicanos más pesadamente heparanados. El heparán es un glicosaminoglicano altamente de manera negativa cargado y el PTEN ha mostrado que tiene una afinidad por aniones, que explican en parte la selección de PIP3 altamente de manera negativa cargado como su substrato. Los experimentos de optimización de la purificación del PTEN de hígado de ratón reveló tanto el PTEN como el PTEN largo se podría purificar utilizando una columna de heparina sefarosa. Adicionalmente , se purificó una proteína de aproximadamente 50kDa, de medios sin suero acondicionados en células HEK293, utilizando una columna de heparina sefarosa. La proteína purificada se reconoció por un anticuerpo monoclonal específico contra PTEN y un anticuerpo policlonal contra residuos de aminoácidos únicos presentes en el PTEN largo. Previamente, el anticuerpo de PTEN largo reconoció solamente una banda de proteína de aproximadamente 70kDa. La observación dé que ambos anticuerpos podrían reconocer la banda indica que el procesamiento proteolítico está ocurriendo probablemente y que la proteína observada por la inmunot. inción es un fragmento de PTEN que retuvo los epítopos de ambos anticuerpos. Tanto el PTEN como el PTEN largo también se podrían purificar de suero humano utilizando la purificación por afinidad de heparina.

Un cuerpo de literatura en los últimos 10 años ha acumulado asumir la secuencia de PTEN. Aquí se prueba la existencia de una forma novedosa de PTEN que se traduce de un sitio alterno y se secreta por tanto la hoja externa asi como también los espacios extracelulares .

Los resultados in vivo muestran que el PTEN largo es un compuesto de anticuerpo novedoso que está normalmente presente en suero humano y que tiene propiedades anti-angiogénicas y pro-apoptóticas .

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Claims (58)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Una fosfatasa humana aislada y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo), caracterizada porque comprende residuos de aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1 o un análogo de los mismos que comprenden residuos de aminoácido consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5, o una variante de cada uno de los mismos.

2. Un polipéptido, caracterizado porque comprende (i) residuos 1 hasta 173 de SEQ ID N0:1, o (ii) un análogo del mismo que comprende residuos 1 hasta 173 de SEQ ID NO: 5, o (iii) residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1.

3. Una composición farmacéutica que comprende fosfatasa y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) , caracterizada porque comprende residuos de aminoácido consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N0:1, o un fragmento de los mismos que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un análogo de los mismos que comprende residuos de aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5.

4. Un método para tratar un tumor sólido en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad de una fosfatasa humana y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende residuos de aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N0:1, o un fragmento de los mismos que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un análogo de los mismos que comprende residuos de aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5, efectivos para tratar el tumor sólido en el sujeto.

5. Un método para inhibir el crecimiento de un tumor sólido en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad de una fosfatasa humana y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende residuos de aminoácido consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N0:1, o un fragmento de los mismos que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un análogo de los mismos que comprende residuos de aminoácido consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5, efectivos para' inhibir el crecimiento del tumor sólido en el sujeto.

6. Un método para inhibir la angiogénesis en un tumor sólido en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad de una fosfatasa humana y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende residuos de aminoácido consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N0:1, o un fragmento de los mismos que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un análogo de los mismos que comprende residuos de aminoácido consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5, efectivos para inhibir la angiogénesis en el tumor sólido en el sujeto.

7. Un método para inducir la apoptosis de una célula epitelial vascular de un vaso sanguíneo en un tumor sólido en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad de una fosfatasa humana y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprenden residuos de aminoácido consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N0:1, o un fragmento de los mismos que comprenden residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un análogo de los mismos que comprenden residuos de aminoácido consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5, efectivos para inducir la apoptosis de la célula epitelial vascular en el vaso sanguíneo en el tumor sólido en el suj eto .

8. El método de conformidad con la reivindicación 4, 5, 6 o 7, caracterizado porque el tumor es un tumor canceroso.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el tumor canceroso es un tumor de células gliales, próstata, ovarios, útero, endometrio, mama, melanocito, riñon, pulmón., colon, cabeza, cuello o páncreas el sujeto.

10. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el tumor canceroso se activa por el PTEN o por una trayectoria de PI3K o es PTEN negativo.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, caracterizado porque el PTEN largo, o el análogo del mismo, o el fragmento de PTEN largo, se administra al sujeto por introducción directa en el tumor sólido .

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el PTEN largo, o el análogo del mismo, o el fragmento de PTEN largo se inyecta en el tumor sólido .

13. El método de conformidad con la rei indicación 11, caracterizado porque el PTEN largo, o el análogo del mismo, o el fragmento de PTEN largo se introduce directamente en el tumor sólido por un catéter.

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, caracterizado porque el PTEN largo, o el análogo del mismo, o el fragmento de PTEN largo se administra al sujeto por introducción directa en un vaso sanguíneo que suministra al tumor sólido.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el PTEN largo, o el análogo del mismo, o el fragmento de PTEN largo se inyecta en el vaso sanguíneo que suministra al tumor sólido.

16. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el PTEN largo, o el análogo del mismo, o el fragmento de PTEN largo se introduce directamente por un catéter en el vaso sanguíneo que suministra al tumor sólido.

17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones A a 10, caracterizado porque el PTEN largo, o el análogo del mismo, o el fragmento de PTEN largo, se administra al sujeto intravenosamente.

18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, caracterizado porque el PTEN largo, o el análogo del mismo, o el fragmento de PTEN largo se administra al sujeto subcutáneamente.

19. Un método para tratar un tumor sólido en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad de un vector de expresión que codifica la fosfatase humana y el polipéptido largo del homólogo de tensina (PTE largo) que comprenden SEQ ID N0:1, o un fragmento de los mismos que comprenden residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un análogo de los mismos que comprenden SEQ ID NO: 5, para expresa el PTEN largo, fragmento de PTEN largo, o el análogo del mismo, en células del tumor sólido en una cantidad efectiva para tratar el tumor sólido en el sujeto.

20. Una fosfatasa humana y polipéptido largo del homólogo de ténsina (PTEN largo), caracterizados porque comprenden SEQ ID NO: 1 o un fragmento de los mismos que comprenden residuos 22 a 516 de SEQ ID NO:l, o un análogo de los mismos que comprende SEQ ID NO: 5 para el uso en el tratamiento de un tumor sólido en un sujeto, para inhibir el crecimiento de un tumor sólido en un sujeto, para inducir la apoptosis de una célula epitelial vascular en un tumor sólido en un sujeto, o para inhibir la angiogénesis en un tumor sólido en un sujeto.

21. El PTEN largo o un fragmento del mismo o el análogo del mismo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el tumor es un tumor canceroso.

22. El PTEN largo o un fragmento del mismo o el análogo del mismo, de conformidad con la reivindicación. 21, caracterizado porque el tumor canceroso es un tumor de cáncer de cáncer glial, de próstata, dé mama, de endometrio, de melanocito, de riñon o de pulmón.

23. El PTEN largo o un fragmento del mismo o el análogo del mismo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el' tumor canceroso es activa por el PTEN por una trayectoria de PI3K o es PTEN negativo.

24. Una composición, caracterizada porque comprende fosfatase humana y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende SEQ ID N0:1, o un fragmento del mismo que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un análogo del mismo que comprenden SEQ ID NO: 5, enlazado a un agente no de péptido que incremente la vida media en el plasma del PTEN largo, fragmento de PTEN largo, o el análogo del mismo, respectivamente.

25. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque además comprende un portador farmacéutico.

26. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el agente no de péptido que incrementa la vida media en el plasma es polietilenglicol (PEG) .

27. La composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque el PEG se enlaza al C-terminal o a un N-terminal del PTEN largo, fragmento de PTEN largo, o el análogo del mismo.

28. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el agente no de péptido que incrementa la. vida media en el plasma es cloroformiato de 9-fluorenilmetilo (Fmoc) o (7-sulfo) -9-fluorenilmetoxicarbonilo .

29. Un ácido nucleico aislado que codifica una fosfatase humana y un polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo), caracterizado porque comprende SEQ ID NO:l, o que codifica un fragmento del mismo que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o que codifica un análogo del mismo que comprende SEQ ID NO: 5.

30. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el ácido nucleico comprende nucleótidos consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 6.

31. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el ácido nucleico comprende residuos de nucleótido consecutivos 503 a 2243 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 6.

32. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el ácido nucleico comprende nucleótidos consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 7.

33. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el ácido nucleico comprende residuos de nucleótido consecutivos 503 a 2243 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 7.

34. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el ácido nucleico es un RNA.

35. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el ácido nucleico es un DNA.

36. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el ácido nucleico es un cDNA.

37. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende un ácido nucleico que codifica fosfatasa humana y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende SEQ ID N0:1, o un fragmento del mismo que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID NO.: 1 , o un análogo del mismo que comprenden SEQ ID NO: 5.

38. Una célula transformada capaz de expresar fosfatasa humana y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo), caracterizada porque comprende SEQ ID NO: 1, o un fragmento del mismo que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un análogo de los mismos que comprenden SEQ ID NO: 5, en donde la célula tiene integrada en su genoma un DNA recombinante que codifica el PTEN largo o un análogo del mismo .

39. Una célula hospedera capaz de expresar fosfatasa humana y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo), caracterizada porque comprende SEQ ID N0:1, o un fragmento del mismo que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o un análogo del mismo que comprenden SEQ ID NO: 5, en donde la célula hospedera comprende un plásmido que codifica PTEN largo o un análogo de mismo.

40. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque la célula hospedera es una célula bacteriana.

41. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada . porque la célula hospedera es una célula de mamífero.

42. Un proceso, caracterizado porque comprende mezclar (1) fosfatasa humana y polipéptido largo del homólogo de tensina (PTEN largo) que comprende SEQ ID NO:l, o un fragmento de los mismos que comprenden residuos 22 a 516 de SEQ ID NO:l, c un análogo de los mismos que comprenden SEQ ID NO: 5, y (2) un agente no de péptido que incrementa la vida media en el plasma del PTEN largo o el análogo del mismo, para hacer el PTEN largo que comprende SEQ ID NO:l, o el fragmento del mismo que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID N0:1, o el análogo del mismo que comprende SEQ ID NO: 5, enlazado al agente no de péptido que incrementa la vida media en el plasma del PTEN largo, fragmento de PTEN largo, o el análogo del mismos, respectivamente.

43. Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque consiste de por lo menos un fragmento de 20 nucleótidos de la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 6 o un complemento de la misma que se hibridiza específicamente bajo condiciones rigurosas a un complemento de la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 6, o a SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 6.

44. Un anticuerpo aislado, o fragmento del mismo, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento del mismo se enlaza a (1) polipéptido de PTEN largo que comprende residuos de aminoácidos 1-173 de SEQ ID NO : 1 o (2) un análogo del mismo que comprende SEQ ID NO: 5 o (3) los aminoácidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 3 o (4) un fragmento de PTEN largo que comprende residuos 22 a 516 de SEQ ID NO: 1.

45. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

46. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.

47. El fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 46, 'caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es un fragmento de Fab, Fab', F(ab')2, o Fv.

48. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es un anticuerpo de cadena individual.

49. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

50. Un anticuerpo aislado o fragmento del mismo, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento del mismo se enlaza a un epitopo conformacional de PTEN largo, en donde en donde el PTEN largo comprende la secuencia en los residuos 1-173 de SEQ ID NO:l, pero el anticuerpo no se enlaza a PTEN.

51. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza a un epitopo comprendido de cualquiera de los residuos 153-173 de SEQ ID NO: 1.

52. Un anticuerpo aislado o fragmento del mismo, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento del mismo se enlaza a un epitopo de un PTEN largo, en donde el PTEN largo comprende la secuencia 'expuesta en los residuos 1-173 de SEQ ID NO:l, pero en donde el anticuerpo no se enlaza a PTEN.

53. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza a los residuos 153-173, o una porción del mismo, de SEQ ID NO: 1.

54. Un fragmento de péptido SEQ ID N0:1, o SEQ ID NO: 5, caracterizado porque el fragmento tiene actividad anti-tumor, anti-angiogénica , o anti-apoptótica .

55. El péptido de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el péptido comprende 5- 10, 10-20, 20-30, o 30-40 aminoácidos.

56. El péptido de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el péptido comprende los aminoácidos 1-173 de SEQ ID NO : 1 o SEQ ID NO: 5.

57. El péptido de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque comprende residuos de aminoácidos consecutivos 22 a 516 de SEQ ID NO:l.

58. El péptido de conformidad con la reivindicación 54 o 57, caracterizado porque no comprende residuos de aminoácido consecutivos 174 a 576 de SEQ ID NO:l o SEQ ID NO: 5.