JP5116663B2 - 転移癌の処置のための治療用ペプチド - Google Patents
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Description
本発明は、癌治療学の領域に関する。特にそれは、転移癌の成長を阻害する、遅延させる、および減少させる方法に関する。
乳腺上皮が、秩序正しい、ホルモンの影響を受けた、および成長因子に依存する組織から転移性新生物の一つへ進行することには、多くの段階が含まれる。これらは、成長制御の損失、アポトーシスおよび老化の回避、間充織への浸潤、および続いて起こる血管内異物侵入ならびに二次的な部位での管外溢出を含む。侵入する能力はこの過程で鍵となる過程であり、そして、浸潤は接着結合の正常な機能に主に阻害される。正常に機能している接着結合は、隣接する細胞(E-カドヘリンホモタイプな(homotypic)相互作用を介して)および細胞内アクチン細胞骨格(β-カテニンを介して)を連結する一組のタンパク質相互作用に依存的である。腫瘍抗原MUC1は、E-カドヘリンからβ-カテニンを隔離することによる接着結合タンパク質の調節不全を促進するタンパク質である。この提案は、細胞浸潤におけるMUC1/β-カテニン相互作用の機能的な重要性を理解して、細胞浸潤および転移を阻害する手段としてこれらの相互作用を妨害するために機序を同定することに向けられる。
本発明の第1の態様に従って、融合ペプチドを提供する。融合タンパク質は、以下の構造を有する:
A-B-C または C-B-A。
Aは、付着高分子の細胞膜を通過する移動を増強させるタンパク質形質導入ドメインである。Bは、0〜5アミノ酸残基のスペーサーである。Cは、6〜15アミノ酸残基のポリペプチドである。Cは、PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO:1)の全てまたは一部を含み、かつCの一部は、GGSSLS(SEQ ID NO:2)を含む。
A-B-C または C-B-A。
Aは、付着高分子の細胞膜を通過する移動を増強させるタンパク質形質導入ドメインである。Bは、0〜5アミノ酸残基のスペーサーである。Cは、6〜15アミノ酸残基のポリペプチドである。Cは、PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO:1)の全てまたは一部を含み、かつCの一部は、GGSSLS(SEQ ID NO:2)を含む。さらに、前記6〜15アミノ酸残基の少なくとも一つは、荷電していない極性アミノ酸は荷電していない極性アミノ酸を交換するように、または無極性アミノ酸は無極性アミノ酸残基を交換するように、または酸性アミノ酸は酸性アミノ酸を交換するように、保存的に置換される。
A-B-C または C-B-A。
Aは、付着高分子の細胞膜を通過する移動を増強させるタンパク質形質導入ドメインである。Bは、0〜5アミノ酸残基のスペーサーである。Cは、6〜15アミノ酸残基のポリペプチドである。Cは、PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO:1)の全てまたは一部を含み、かつCの一部は、GGSSLS(SEQ ID NO:2)を含む。さらに、前記6〜15アミノ酸残基の一つは、A残基で置換される。
本発明の基礎をなしている発見は、発癌性MUC1およびβ-カテニンが癌浸潤を促進するだけでなく、発癌性MUC1およびβ-カテニンの相互作用を(MUC1模倣ペプチド[MEB]を用いて)妨げることにより、本発明者らが癌の浸潤および転移を阻害できることである。
ペプチド設計:
本発明者らは、公開されたβ-カテニン結合部位を包含するMUC1細胞質ドメインに対するペプチドを設計した(Li et al., 1998; Li et al., 2001a; Li et al, 2001b)。EGFRおよびc-srcによりMUC1のチロシンがリン酸化されるため、本発明者らは、新生の、およびチロシンがリン酸化されている、両方の25merペプチドを設計し、β-カテニンとの相互作用に関するチロシンリン酸化の要件を決定する。さらに、本発明者らは、細胞浸潤をさらに阻害するかどうかを決定するために、チロシン残基がグルタミン酸残基に変異したペプチドを設計した。これらのペプチドの全ては、American Peptide Company (Sunnyvale, CA)により合成される。ペプチドは85%の純度レベルで産生され(HPLCによって精製され、質量分析によって検定される)、かつ、同定を目的としてC末端でビオチン化される。
8um ポアサイズの Transwell inserts (Corning)を反転して、90ulのI型コラーゲン(ラット尾部、BD Scientific)ゲル混合物(2.2%重炭酸ナトリウム、1O×M199培地)で覆い、30分間凝固させておく。その後、ウェルを20%ウシ胎仔血清を含むDMEM中に反転させ、再水和させる。細胞取り込みを促進するために、ペプチドを5分間BioPORTER試薬(Sigma, St. Louis MO)と共にインキュベートし、ボルテックスし、無血清培地中の細胞に添加して(10ng/ml、100ng/ml、およびug/ml濃度が試験される)、Transwellの上部チャンバ中に設置する。その後細胞を、2、4、または24時間インキュベートする。培地を除去し、ゲルを4%パラホルムアルデヒドを用いて30分間固定し、かつPBS、pH 7.4に移す。コラーゲンゲルを、その後ビズベンズアミド(bizbenzamide)で40分間染色し、ゲルに侵入した全ての細胞を数えるか、または免疫蛍光アッセイに使用される。ペプチド処理した細胞の浸潤を、PBS/バイオポーター処理した対照細胞または無関係なペプチドで処理された細胞と比較する。
ペプチドをパルスされた細胞は、4-ウェルマイクロ培養皿中に注がれたコラーゲンゲルに侵入することができる。浸潤の後、細胞を溶解させ、コラーゲンを分解し(コラゲナーゼ処理を介して)、BCAアッセイ(Pierce)を実施した。タンパク質溶解物は、内因性MUC1およびβ-カテニン、ペプチドおよびβ-カテニン、ならびにE-カドヘリンおよびβ-カテニンの間の共沈殿のレベルを決定するために以前に記載されているように(Schroeder et al., 2003)免疫沈降される。簡単に言えば、溶解物は、SDS-PAGEで分離され直接PVDF膜(イモビロン)に転写されるか、または最初に免疫沈降して、その後SDS-PAGEで分離される。イムノブロッティングおよび免疫沈降に使用する抗体は、以下のソースから得ることができる:抗Muc1(Santa Cruz Biochemical)および抗β-カテニン(H-102、免疫沈降、およびC-18、イムノブロッティング、両方ともSanta Cruz Biochemicalより入手)。
コラーゲンゲルを通じて浸潤を受けている細胞は、インサイチュー(コラーゲンゲル中にある間)で免疫蛍光で標識される。コラーゲンゲル上の免疫蛍光のため、ゲルは、室温で5分間、10mM Pipes(pH 6.8)、50mM NaCl、300mM ショ糖、および3mM MgCl2中の0.5% Triton X-100により透過処理される。ゲルは、PBSおよびEnhancing Wash Buffer(Innovex)の1:1溶液中の、3% BSA(Sigma)、0.05% Tween 20でブロックされる。一次抗体は、4℃で終夜インキュベートされ、そして、ゲルはPBS:Enhancing Wash Buffer 1:1中で6時間洗浄される。二次抗体は、4℃で終夜インキュベートされ、室温で6時間再び洗浄される。ゲルは、その後スライドガラスに載せられ(mounted)、カバーガラスがかけられ(coverslipped)、ツァイス共焦点レーザー走査型顕微鏡(Zeiss laser scanning confocal microscope)を用いて分析される。以下の抗体が用いられる:抗ビオチン(ストレプトアビジン-Alexa594、1:500、Molecular Probes)、抗Muc1(1:100、Santa Cruz)、抗ビンクリン(V9131、1:400、Sigma Chemical Company)、抗β-カテニン(H-102、1:100、Santa Cruz Biochemical)、抗ファシン(fascin)(FCN01、1:50、Neomarkers)、およびファロイジン-Alexa546(1:100、Molecular Probes)。二次抗体は、Molecular ProbesのAlexa 488または546のいずれかであり得る。
原形質膜を横切るためのペプチドの能力を検証するために、ペプチドは、合成の間、FITC-タグで連結される。ペプチドは、HIVタンパク質TAT(転写活性化因子タンパク質をトランス活性化する)のタンパク質形質導入ドメインと結合し、これはエンドサイトーシス非依存的方法、およびエネルギー非依存的方法でペプチドが細胞膜を横断することを可能にする(Torchilin et al., 2001b)。ペプチド配列は、NH2-FITC-GGG-YARAAARQARA-MUC1ペプチド-COOHである。ペプチドは、本発明者らのインビトロシステム上で試験され、その後、静脈内か、または腹膜内に注射される。全身送達の間ペプチド分解を減少させるために、ペプチドは、修飾されたPEGを用いて小さいミセルまたはリポソームに接合されうるか(Torchilin et al., 2001a; Valero et al., 1999)、またはC末端アミド化もしくはN末端アセチル化などの末端修飾に供する。なお、β-ガラクトシダーゼに対するペプチドタグとしてのTATのPTDドメインを用いた以前の研究において、全身送達はマウス体内で、全てではないが、大部分の組織に形質導入されたペプチドにより得られたことを留意されたい(Schwarze et al., 1999)。
本発明者らの研究について、動物の統計学的に適切な数を得るために、本発明者らは、野生型、およびトランスジェニック動物の3つの最適化された用量群を含む処置群(arm)ごとに、20匹の動物を利用する。本発明者らは、このトランスジェニックモデルについて腫瘍発生の初期、中間、および遅いステージで動物を処置するために生後6週間、8週間、および10週間目で処置を開始する、本研究の追加の群を設ける。これにより、180匹のトランスジェニック動物、および80匹の野生型動物を使用することになる。本発明者らは、どちらが最良の送達をもたらすかを決定するために、腹膜内注射および静脈内注射の両方を試験する。
腫瘍成長をモニタリングするために、動物を週3回触診する。腫瘍の負荷量が体重の5%に達した場合、または動物が16週齢(約50%が肺転移を発生するタイムポイント)に達した場合、動物は屠殺される。乳腺、腫瘍、および肺の組織が回収され、メタカーン(methacarn)中で固定されるか、またはタンパク質溶解物が分析のために作製される。固定された肺は、転移性病変を同定するために、解剖用顕微鏡下で分析される。本発明者らは、肺の連続切片法ならびにヘマトキシリンおよびエオシン染色による転移の同定と比較して、MMTV-pyMTモデルにおいて本方法を以前に分析している(データ示さず)。本発明者らは、このトランスジェニックモデルにおける肺転移の同定において、2つの方法が100%一致すること見出した。
組織切片は、以前に説明されているように分析される(Schroeder et al., 2001)。組織免疫蛍光のために使用する抗体は、以下の通りである:抗Muc1(Santa Cruz Biochemical)、抗β-カテニン(H-102、1:500、Santa Cruz Biochemical、およびA11010-Alexa546、1:500、Molecular Probes)。組織切片を、パラフィンに包埋し、切り出し、蛍光タグ化ペプチドの存在を決定した。
タンパク質分解物は、以前に説明されているように産生される(Schroeder et al., 2003)。本発明者らは、ペプチド処置が生化学的複合体を形成するβ-カテニンおよびMUC1の能力を減少させているかどうか決定するために、種々の処置群を分析する。
本発明者らは、統計学的に有意な結果を作製するために必要とする動物の数を決定するために、アリゾナ癌センターのBiometry Coreを利用した。
乳癌浸潤に関するMUC1発現の機能的な重要性を調査するために、本発明者らは、β-カテニンと相互作用するドメインに対して設計されたMUC1模倣ペプチドと共に浸潤性乳癌細胞株をインキュベートした。本発明者らは、その後、フィルタを通したコラーゲンゲル中への浸潤におけるペプチド処置の効果をモニタリングした。
MUC1およびβ-カテニンは、転移性乳癌の自然発生的なモデルにおいて相互作用する。複数のモデル(MMTV-Wnt-1、MMTV-MUC1、および乳癌細胞株)がMuc1とβ-カテニンとの間の腫瘍特異的相互作用を示した一方、それらは様々な理由(ヒト疾患、腫瘍発症、および潜伏期への関連を含む)で臨床前モデルには最適ではない。それゆえ、本発明者らは、本発明者らのペプチドに基づく治療法を試験する適切なモデルとして役立ち得る、さらなるマウスモデルを探し出した。乳癌のMMTV-pyMT(マウス乳腺腫瘍ウイルス-プロモータ主導(driven)ポリオーマ中型(Middle)T抗原)モデルは、分析された動物のうち70%を上回る動物で肺に転移性である乳癌を発生するトランスジェニックマウスである(Guy et al., 1992a)。これは、(a) 転移性であり、(b) MUC1を含む多数の細胞シグナル伝達経路と相互作用するpyMT癌遺伝子により促進され(Spicer et al., 1995)、(c)12〜15週齢で腫瘍を発生するため治験のための良いモデルとなり、ならびに(d)組織学的に、非常に多様でかつ進行性の疾患を表す(Maglione et al., 2001)ことから、乳癌進行の優れたモデルである。本発明者らは、このモデルでMUC1とβ-カテニンとの間の相互作用を調べ、かつ、それらが腫瘍特異的な様式で相互作用することを見出した(図3)。Muc1およびβ-カテニンの両方が正常な乳腺および乳腺腫瘍中に発現する一方で(図3、下部2枚のパネル)、本発明者らは、正常な腺における2つのタンパク質の間の有意な生化学的相互作用を免疫沈降によって検出することができなかった。これに対して、実質的な相互作用は、腫瘍中のMuc1およびβ-カテニンとの間に観察された(図3、異なるマウスに由来する2つの腫瘍から示されたデータ。本発明者らは7つのさらなる腫瘍においてこれを繰り返した)。これらのデータは、これらの2つのタンパク質の間の相互作用が腫瘍特異的であり、これを、本発明者らのペプチドに基づく治療における使用に対する理想的なモデルとしていることを示す。本発明者らは、抑制性MUC1模倣ペプチドについての本発明者らの臨床前試験においてこのトランスジェニックマウスを使用することを計画する。
本発明者らは、MDA-MB-231およびMDA-MB-468浸潤性乳癌細胞株の浸潤を阻害する能力を得るために、TAT結合型MUC1模倣ペプチドを設計した。ペプチドを、細胞への侵入のためのTAT形質導入ドメインを運ぶように設計した。以下のペプチドを、設計し、作製し、試験した。
これは、TAT形質導入ドメインであり、結合ペプチドの細胞への取り込みを促進する。このペプチドは、陰性対照として用いられる。
このペプチドは、最小の相互作用部位を囲んでいる4つの付加された残基を有するβ-カテニン/MUC1相互作用部位を表す。
このペプチドは、最小の報告されたβ-カテニン/MUC1相互作用部位を表す。
このペプチドは、付加されたEGFR相互作用部位を有するMBTATペプチドである。
ペプチドによるMDA-MB-231細胞の処置は、β-カテニンの異なる局在化を示した。TAT対照ペプチド処置は、分散した局在化をもたらした。MEBTATペプチド処置は、接着斑および葉状仮足の部位でβ-カテニン局在化をもたらした。
治験1
MDA-MB-231細胞株を、24匹のマウスの乳房脂肪パッドに注射した(マトリゲル中)。これらのマウスを、その後3つの群に分け、1日1回、MWF、2週間注射した。
群IAは、MEBTATペプチド10 ug/体重1gで処置した(腹腔内)。
群IBは、MEBTATペプチド20 ug/体重1gで処置した(腹腔内)。
群ICは、TATペプチド20 ug/体重1gで処置した(腹腔内)。
MDA-MB-231細胞株を、16匹のマウスの乳房脂肪パッドに注射した(マトリゲル中)。これらのマウスを、その後2つの群に分け、1日1回、MTWThF、2週間注射した。
群IIAは、MEBTATペプチド20 ug/体重1gで処置した(静脈内)。
群IIBは、TATペプチド20 ug/体重1gで処置した(静脈内)。
MEB配列[PYEKVSAGNGGSSLS; SEQ ID NO:1]のアミノ酸について、一度に一つのアミノ酸をアラニンで置換した。(親アミノ酸残基の一つが既にアラニンだったため、14変異体しか存在しないことに注意されたい。)また、この実験は1回に各データポイントで4回の繰り返しを伴い行われた点に注意されたい。
Claims (33)
- 以下の構造を有する融合ペプチド:
A-B-CまたはC-B-A
式中Aは、ヒト免疫不全ウイルスTATタンパク質(SGYGRKKRRQRRRC; SEQ ID NO:3)、アンテナペディア(SGRQIKIWFQNRRMKWKKC; SEQ ID NO: 4)、PTD-4(YARAAARQARA; SEQ ID NO:5)及びHSV I型タンパク質VP22(DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE; SEQ ID NO: 6)からなる群から選択される、付着高分子の細胞膜を通過する移動を増強させる、タンパク質形質導入ドメインであり;
式中Bは、0〜5アミノ酸残基のスペーサーであり;
式中Cは、PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO:1)からなるポリペプチドである。 - Aが、ヒト免疫不全ウイルスTATタンパク質(SGYGRKKRRQRRRC; SEQ ID NO:3)のタンパク質形質導入ドメインを含む、請求項1記載の融合ペプチド。
- Aが、アンテナペディア(SGRQIKIWFQNRRMKWKKC; SEQ ID NO: 4)のタンパク質形質導入ドメインを含む、請求項1記載の融合ペプチド。
- Aが、PTD-4(YARAAARQARA; SEQ ID NO:5)を含む、請求項1記載の融合ペプチド。
- Aが、HSV I型タンパク質VP22(DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE; SEQ ID NO: 6)のタンパク質形質導入ドメインを含む、請求項1記載の融合ペプチド。
- Bが、ポリアルギニン、ポリリジン、またはアルギニンおよびリジンの共重合体を含む、請求項1記載の融合ペプチド。
- Bが、グリシン-グリシン-グリシンを含む、請求項1記載の融合ペプチド。
- AがPTD-4(YARAAARQARA; SEQ ID NO:5)であり、BがGGGであり、かつCがPYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO:1)である、請求項1記載の融合ペプチド。
- 以下の構造を有する融合ペプチド:
A-B-CまたはC-B-A
式中Aは、ヒト免疫不全ウイルスTATタンパク質(SGYGRKKRRQRRRC; SEQ ID NO:3)、アンテナペディア(SGRQIKIWFQNRRMKWKKC; SEQ ID NO: 4)、PTD-4(YARAAARQARA; SEQ ID NO:5)及びHSV I型タンパク質VP22(DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE; SEQ ID NO: 6)からなる群から選択される、付着高分子の細胞膜を通過する移動を増強させるタンパク質形質導入ドメインであり;
式中Bは、0〜5アミノ酸残基のスペーサーであり;
式中Cは、PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO:1)からなるポリペプチドであり、ここで該9及び14位のアミノ酸残基の一つはA残基で置換される。 - 以下の構造:
A-B-CまたはC-B-A
を有する融合ペプチドを癌細胞に接触させる段階を含み、それによって癌細胞の侵襲性が減少するかまたは遅延される、癌細胞をインビトロ(in vitro)で処置する方法:
式中Aは、ヒト免疫不全ウイルスTATタンパク質(SGYGRKKRRQRRRC; SEQ ID NO:3)、アンテナペディア(SGRQIKIWFQNRRMKWKKC; SEQ ID NO: 4)、PTD-4(YARAAARQARA; SEQ ID NO:5)及びHSV I型タンパク質VP22(DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE; SEQ ID NO: 6)からなる群から選択される、付着高分子の細胞膜を通過する移動を増強させるタンパク質形質導入ドメインであり;
式中Bは、0〜5アミノ酸残基のスペーサーであり;
式中Cは、PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO:1)からなるポリペプチドであるか、または該ポリペプチドの9及び14位のアミノ酸残基の一つがA残基で置換されたポリペプチドである。 - 癌細胞が乳癌細胞である、請求項10記載の方法。
- 癌細胞が卵巣癌細胞である、請求項10記載の方法。
- 以下の構造:
A-B-CまたはC-B-A
を有する融合ペプチド、
式中Aは、ヒト免疫不全ウイルスTATタンパク質(SGYGRKKRRQRRRC; SEQ ID NO:3)、アンテナペディア(SGRQIKIWFQNRRMKWKKC; SEQ ID NO: 4)、PTD-4(YARAAARQARA; SEQ ID NO:5)及びHSV I型タンパク質VP22(DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE; SEQ ID NO: 6)からなる群から選択される、付着高分子の細胞膜を通過する移動を増強させるタンパク質形質導入ドメインであり;
式中Bは、0〜5アミノ酸残基のスペーサーであり;
式中Cは、PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO:1)からなるポリペプチドであるか、または該ポリペプチドの9及び14位のアミノ酸残基の一つがA残基で置換されたポリペプチドである、
を含む、癌の侵襲性を減少または遅延させる、癌患者の処置において使用するための医薬。 - 癌が乳癌である、請求項13記載の医薬。
- 癌が卵巣癌である、請求項13記載の医薬。
- 融合ペプチドが血管内投与用に製剤化される、請求項13記載の医薬。
- 融合ペプチドが皮下投与用に製剤化される、請求項13記載の医薬。
- 融合ペプチドが腹膜内投与用に製剤化される、請求項13記載の医薬。
- 融合タンパク質がミセルまたはリポソームに結合される、請求項13記載の医薬。
- 融合タンパク質がエチルアミドキャッピングされる(ethylamide-capped)、請求項13記載の医薬。
- 化学療法薬と組み合わせて用いられる、請求項13記載の医薬。
- 化学療法薬がタキソールである、請求項21記載の医薬。
- 化学療法薬がシスプラチンである、請求項21記載の医薬。
- 抗腫瘍抗体と組み合わせて用いられる、請求項13記載の医薬。
- 抗体がHER2受容体に結合する、請求項24記載の医薬。
- 化学療法薬が放射性である、請求項21記載の医薬。
- 式中Aが、ヒト免疫不全ウイルスTATタンパク質(SGYGRKKRRQRRRC; SEQ ID NO:3)、アンテナペディア(SGRQIKIWFQNRRMKWKKC; SEQ ID NO: 4)、PTD-4(YARAAARQARA; SEQ ID NO:5)及びHSV I型タンパク質VP22(DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE; SEQ ID NO: 6)からなる群から選択される、付着高分子の細胞膜を通過する移動を増強させるタンパク質形質導入ドメインであり;
式中Bが、0〜5アミノ酸残基のスペーサーであり;
式中Cが、PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO:1)からなるポリペプチドであるか、または該ポリペプチドの9及び14位のアミノ酸残基の一つがA残基で置換されたポリペプチドである、
以下の構造:
A-B-CまたはC-B-A
を有する融合ポリペプチドをコードするベクターを含む細胞を、ポリペプチドを発現させる条件下で培養する段階;および
ポリペプチドを細胞または細胞培養培地から回収する段階、
を含む、癌患者を処置するためのポリペプチドを産生する方法。 - SEQ ID NO:1の位置9のN残基がA残基で置換される、請求項9記載の融合ペプチド。
- SEQ ID NO:1の位置14のL残基がA残基で置換される、請求項9記載の融合ペプチド。
- SEQ ID NO:1の位置9のN残基がA残基で置換される、請求項10記載の方法。
- SEQ ID NO:1の位置14のL残基がA残基で置換される、請求項10記載の方法。
- SEQ ID NO:1の位置9のN残基がA残基で置換される、請求項13記載の医薬。
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