CN108181214B - 使用atap肽治疗疾病的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用ATAP肽治疗疾病的方法和组合物。具体的，本发明涉及ATAP‑iRGD‑M8和铂类药物的组合在制备用于联合治疗肿瘤性疾病的药物中的用途，包含ATAP‑iRGD‑M8和铂类药物的药物组合物，包括物理上相互隔离的多肽药物组合物和铂类药物组合物的药盒产品，制备所述药物组合物的方法以及对药物组合物进行质量检测的方法。本发明包含ATAP‑iRGD‑M8和铂类药物的药物组合物具有优良的抗肿瘤效果并且具有优良的药学性能。

Description

使用ATAP肽治疗疾病的方法和组合物
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种多肽、含有多肽的药物组合物及其应用。
背景技术
尾锚定(tail-anchored，TA)蛋白质，包括Bcl-2家族成员，特征性地在羧基(C)末端通过单疏水节段束缚于磷脂双层，其中分子的大部分位于胞质溶胶中。Bcl-2是哺乳动物基因家族和它们产生的蛋白质的原型。Bcl-2相关蛋白的生物功能不可避免地与它们的特定的亚细胞定位相关联；细胞质、内质网(ER)膜或线粒体外膜(MOM)。研究表明Bcl-2家族成员可调节线粒体外膜透化作用(MOMP)并且可以促凋亡(例如，Bax、BAD、Bak、Bok、Bcl-Xs、Bik、Bim、Bid、Egl-1、以及Diva等等)或抗凋亡(例如，Bcl-2proper、Bcl-xL、Mcl-1、CED-9、A1、Bcl-w、以及Bfl-1等等)。
Bcl-2家族成员和若干病症有关，包括：癌症，例如黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、和肺癌；神经性障碍，例如精神分裂症；以及免疫紊乱。癌症和增生包括各种非常复杂的疾病；然而，它们均具有一个共同的特点，即所有细胞是高度增殖的并且能够持续分裂，且不进行终末分化。这就证实了在这些以及其他的相关病症的病因中对于减少凋亡的作用。
虽然目前的几种癌症疗法可促进癌细胞死亡和抑制癌细胞生长，但这些中的许多疗法对于癌症患者是高度毒性的并且它们的给药导致许多使人不愉快的和不堪忍受的副作用。此外，许多目前可应用的癌症疗法表明仅对特定病因的癌症或增生有效。因此，非常期望这样的治疗，即可以在大量的癌细胞类型和起源的范围内促进癌细胞死亡，并且对于患者在很大程度上是无毒性的。
近来，人们已经证明了抗凋亡Bfl-1在氨基酸147-175处包含独特的两亲性尾锚定肽(ATAP)。如本文所述，Bfl-1ATAP包含带电荷的氨基酸，其线性连接于α-螺旋的一侧。在人基因组中，同源ATAP序列存在于另一种肿瘤抑制基因中，即人子宫颈癌抑制基因-1(HCCS-1)。在HCCS1的N端的另外的线粒体靶向信号(MTS)有助于其线粒体靶向和凋亡功能。
已经证实，ATAP肽能够调节凋亡级联反应。因此，ATAP肽可以适合用于高效治疗剂以治疗多种疾病，包括细菌感染、癌症以及增生性疾病。
CN105061580A(中国专利申请号201510511414.5)公开了一种经分离的多肽、或它的类似物或衍生物，由26至50个氨基酸组成，该多肽包括典型的SEQ ID NO：36示出的氨基酸序列，其中，所述多肽形成两亲性螺旋结构，靶向线粒体外膜，通过破坏线粒体通透性诱发凋亡。另外，该发明的多肽还包括SEQ ID NO：38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51以及53，其中SEQ ID NO53为包括38个氨基酸的肽，其余为包括29个氨基酸的肽。上述SEQ ID NO：36的氨基酸序列为：KFEPKSGWMTFLEVTGKICEMLSLLKQYC。
典型的SEQ ID NO：36肽还在Ko等人的文献(Ko，J.，Choi，K.，Pan，Z.，Lin，P.，Weisleder，N.，Kim，C.W.，Ma，J.(2007)Tail-anchoring domain of Bfl-1targetsmitochondria and induces apoptosis by its amphipathic property.J.CellSci.120:2912-23)中公开，如该Ko文献图1之C记载的称为ATAP片段的147-175残基。
De等人的文献(De G，Ko JK，Tan T，Zhu H，Li H，Ma J(2014).Amphipathic tail-anchoring peptide is a promising therapeutic agent for prostate cancertreatment.Oncotarget.2014,5:7734-47)中公开一种全新结构设计的多肽，其主要是将典型的SEQ ID NO：36肽19位C替换为A，并与通称为iRGD的片段CRGDKGPDC连接(脱除左侧一个C)，形成表2所述M5的肽，其氨基酸序列为KFEPK SGWET FLEVT GKIAE MLSLL KQYC RGDKGPDC，该M5亦称为ATAP-iRGD-M5。
De文献还记载，出于生物学活性改进的需要，在该ATAP-iRGD-M5的K端再增加一个赖氨酸K，形成称为M6的多肽K KFEPK SGWET FLEVT GKIAE MLSLL KQYC R GDKGPDC；接着出于溶解性和稳定性改进的需要，将该M6肽的氨基端乙酰化以及羧基端酰胺化，形成称为M8的多肽，其氨基酸序列为：Ac-KKFEPKSGWMTFLEVTGKIAEMLSLLKQYCRGDKGPDC-amide。试验结果显示，该M8多肽呈现优良的生物学活性和优良的溶解性和稳定性。如De文献中提到的，其中所涉及的M5、M6、M8等多肽可通过综合文献方法制得，亦可通过本领域常规的多肽合成方法(例如Fmoc固相合成法)获得或者通过商业途径合成得到(例如委托GL Biochem Ltd制备)。
肿瘤(包括良性肿瘤和恶性肿瘤，后者通常亦称为癌症)是人类面临的最重大的疾病之一。铂类药物在肿瘤治疗中具有极其重要的临床价值。典型的铂类药物有顺铂(Cisplatin)、卡铂(Carboplatin)、奥沙利铂(Oxalipaltin)、奈达铂(Nedaplatin)、宋铂(Sunplatin)、乐铂(Lobaplatin)、米铂(Miriplatin)、锡铂、顺氯卡铂、依铂、碳铂、洛铂、诺贝铂或赛特铂等。
第一代抗癌药物——顺铂，是顺式一二氯二氨合铂的简称，常缩写为DDP或CDDP，属难溶性化合物。顺铂的特点主要是高效广谱的抗癌药，抗癌作用强，抗癌活性高。对肿瘤抑制率可达61％～98％，尤其对于实体瘤和对一般化疗不甚敏感肿瘤疗效较为显著。顺铂及其类似物的应用发展基本囊括了这些年来实体瘤治疗所取得的成就。顺铂对男性睾丸非精原细胞性肿瘤有特效。对晚期卵巢癌、头颈部肿瘤也可达到明显缓解，并使宫颈癌、肺癌、胃癌、骨肉瘤、间皮瘤、子宫内膜癌等的临床有效率得到很大的改观。
第二代铂类抗癌药——卡铂，其全称是1,1-环丁二羧酸二合铂。卡铂的化学稳定性好，水溶性较好，其溶解度比顺铂高16倍。主要毒副作用是骨髓抑制，这是其主要的剂量限制性毒性。卡铂的作用机制与顺铂相同，可以替代顺铂用于某些癌症的治疗。其他副作用诸如肾毒性、胃肠道反应、听力下降、神经毒性均远远低于顺铂，卡铂可作为非小细胞肺癌、肝癌等的首选治疗药物(联合用药)，还可作为膀胱癌、子宫癌等数种癌症的次选治疗药。我国在使用卡铂治疗食道癌、头颈部癌和胃癌等方面也有许多成功的经验。
第三代铂类抗癌药——奥沙利铂(oxaliplatin)，其是一种新型的铂类化合物，其铂原子与(1R,2R)-1,2-(DACH)载体和一个草酸基团形成螫合物，全称为草酸【反式-左旋-1,2-二氨环已烷】铂。奥沙利铂的作用机制与顺铂相同，但有不同的广谱的体外细胞毒性和体内抗肿瘤作用。在对顺铂存在内源性或获得性耐药的结肠癌及其他实体瘤中，依然表现出抗瘤活性。其广泛的抗瘤谱可能与形成了不同的加合物结构并避开了某些铂类耐药机制(特别是错配修复缺陷和旁路复制机制)有关。奥沙利铂对非霍杰金氏白血病、卵巢癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、头颈部癌有效。对先前已用过5-FU治疗的结肠癌患者，奥沙利铂依然显示出活性。用奥沙利铂时辰疗法治疗结肠癌被认为是最好的方法之一。
其他铂类抗癌药包括奈达铂(Nedaplatin)在日本上市，全称是顺式-乙醇酸-二氨合铂(Ⅱ)，缩写CDGP。奈达铂药对小鼠P388白血病，B16黑色素瘤，Lewis肺癌的抗肿瘤作用优于顺铂。但在L1210，DDP自血病模型上与顺铂交叉耐药。骨髓抑制是其剂量限制性毒性，可以辅以水化和利尿进行预防。Ⅱ期单药对头颈部癌、睾丸肿瘤、肺癌(SCLC和NSCLC)、食道癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌答应率大于或等于25％。对前列腺癌和乳腺癌答应率低。Ⅲ期试验证实顺铂，长春碱和奈达铂，长春碱治疗NSCLC的疗效相似。另外，乐铂，其全称是环丁烷乳酸盐二甲胺合铂(Ⅱ)。该药由德国AstaMedica AG Frankfurt开发。其作用机理除影响DNA的合成、复制以外，还可以影响pmyc基因的表达。该药的抗肿瘤效果与顺铂和卡铂的作用相当或者更好。乐铂对多种肿瘤有效。许多对顺铂和卡铂有应答的病人对乐铂也有应答，无论是初治或经最初的治疗病情未缓解者。临床上主要用于治疗慢性粒细胞性白血病、不能手术的转移性乳腺癌、转移性小细胞肺癌。
临床上将不同种类的抗肿瘤药物联合使用是有益的。例如本发明提及的ATAP多肽与铂类药物联合使用，预期能够呈现优良的生物学效果。然而，令人遗憾的是，本发明人发现，在制备这类联合用药的组合制剂过程中，显示出明显不利于临床应用的问题。
因此，本领域技术人员期待提供一种联合用药以治疗肿瘤的有益方法，例如通过有效克服组合制剂相关技术问题以提供一种临床有益的组合治疗制剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种使用ATAP肽治疗疾病的方法，特别是使用ATAP肽和铂联合治疗肿瘤的方法，另一目的在于为这种联合治疗方法提供一种组合物。进一步的，本发明另一目的在于提供一种对这种组合物进行质量检测的方法。
为此，本发明第一方面提供了使用ATAP-iRGD-M8和铂类药物组合作为药物用于联合治疗肿瘤性疾病的方法，或者本发明第一方面提供了ATAP-iRGD-M8和铂类药物的组合在制备用于联合治疗肿瘤性疾病的药物中的用途。
在本发明中，ATAP-iRGD-M8，其氨基酸序列为：Ac-KKFEPKSGWMTFLEVTGKIAEMLSLLKQYCRGDKGPDC-amide，该M8多肽在本领域通常亦称为ATAP-iRGD-M8，在本发明中，如未另外说明，提及ATAP-iRGD-M8、M8、ATAP-M8、多肽、M8多肽、ATAP-iRGD-M8肽、ATAP-M8肽等时均是指该封端的38肽，除非其上下文语境中明显不是指该38肽。
根据本发明第一方面的方法或者用途，其中所述肿瘤选自：白血病(包括急性白血病、急性淋巴白血病、急性髓细胞性白血病、成髓细胞白血病、前髓细胞性白血病、粒-单核细胞型白血病、单核细胞性白血病、红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴白血病)、真性红细胞增多、淋巴瘤、何杰金病、非何杰金病、多发性骨髓瘤、特发性巨球蛋白血症、实体瘤、肉瘤和癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯肿瘤、子宫颈癌、子宫癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、硬脑膜肉瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜神经细胞瘤、肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈部癌、胰腺癌、黑色素瘤等。
根据本发明第一方面的方法或者用途，其中所述铂类药物选自：顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、宋铂、乐铂、米铂、锡铂、顺氯卡铂、依铂、碳铂、洛铂、诺贝铂或赛特铂等。
根据本发明第一方面的方法或者用途，其中所述药物中，所述ATAP-iRGD-M8与所述铂类药物的重量比为1：0.05～20。
根据本发明第一方面的方法或者用途，其中所述药物中，所述ATAP-iRGD-M8与所述铂类药物的重量比为1：0.1～10。
根据本发明第一方面的方法或者用途，其中所述药物中，所述ATAP-iRGD-M8与所述铂类药物的重量比为1：0.2～5。
根据本发明第一方面的方法或者用途，其中所述药物中，所述ATAP-iRGD-M8与所述铂类药物的重量比为1：0.25～4。
根据本发明第一方面的方法或者用途，其中所述药物是用于注射或口服使用的制剂形式，优选是用于注射使用的制剂形式。
根据本发明第一方面的方法或者用途，其中所述药物是呈无菌溶液或无菌粉末形式的制剂形式。
根据本发明第一方面的方法或者用途，其中所述药物是呈冷冻干燥粉针剂的形式。
根据本发明第一方面的方法或者用途，其中所述呈冷冻干燥粉针剂形式的药物中包含作为冻干赋形剂的糖类物质。在一个实施方案中，所述的糖类物质选自葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇及其组合。作为冻干赋形剂的用量通常是不作限定的，而是根据生产实践以获得有益赋形效果的量添加，例如通常来说这些冻干赋形剂的添加量是所述多肽重量的0.5～10倍，例如是所述多肽重量的1～5倍。
根据本发明第一方面的方法或者用途，其中所述药物中还包括氯化钠和枸橼酸。已经发现，在本发明药物制备浓度条件下，例如在冷冻干燥前配液以及冷冻干燥时程内，当铂类药物添加到多肽溶液中时，会促使多肽聚集形成团，这是需要避免的。出人意料的是，当多肽中同时添加有规定量的氯化钠和枸橼酸时，可以有效的避免这种聚集发生。
根据本发明第一方面的方法或者用途，其中所述药物中还包括氯化钠和枸橼酸钠。ATAP-iRGD-M8与氯化钠和枸橼酸的重量比为1：0.02～0.1：0.05～0.2。
根据本发明第一方面的方法或者用途，其中所述药物中还包括氯化钠和枸橼酸钠。ATAP-iRGD-M8与氯化钠和枸橼酸的重量比为1：0.025～0.05：0.05～0.15。
根据本发明第一方面的方法或者用途，其中所述药物中还包含酸碱调节剂，其量是，使得所述药物在用水稀释至多肽浓度在0.2～0.5mg/ml浓度范围时，溶液的pH值在4.0～7.0范围内。由于药物中的各种添加物本身基本上呈近中性，因此通常而言酸碱调节剂可以不加即可达到上述范围。在需要添加时少量即可获得上述pH范围。优选的酸碱调节剂选自盐酸和氢氧化钠，例如使用盐酸溶液和氢氧化钠溶液。
进一步的，本发明第二方面提供了一种药物组合物，其中包含ATAP-iRGD-M8和铂类药物。
根据本发明第二方面的药物组合物，其中所述铂类药物选自：顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、宋铂、乐铂、米铂、锡铂、顺氯卡铂、依铂、碳铂、洛铂、诺贝铂或赛特铂等。
根据本发明第二方面的药物组合物，所述ATAP-iRGD-M8与所述铂类药物的重量比为1：0.05～20。
根据本发明第二方面的药物组合物，所述ATAP-iRGD-M8与所述铂类药物的重量比为1：0.1～10。
根据本发明第二方面的药物组合物，所述ATAP-iRGD-M8与所述铂类药物的重量比为1：0.2～5。
根据本发明第二方面的药物组合物，所述ATAP-iRGD-M8与所述铂类药物的重量比为1：0.25～4。
根据本发明第二方面的药物组合物，其是用于注射或口服使用的制剂形式，优选是用于注射使用的制剂形式。
根据本发明第二方面的药物组合物，其是呈无菌溶液或无菌粉末形式的制剂形式。
根据本发明第二方面的药物组合物，其是呈冷冻干燥粉针剂的形式。
根据本发明第二方面的药物组合物，其中包含作为冻干赋形剂的糖类物质。在一个实施方案中，所述的糖类物质选自葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇及其组合。作为冻干赋形剂的用量通常是不作限定的，而是根据生产实践以获得有益赋形效果的量添加，例如通常来说这些冻干赋形剂的添加量是所述多肽重量的0.5～10倍，例如是所述多肽重量的1～5倍。
根据本发明第二方面的药物组合物，其中还包括氯化钠和枸橼酸。已经发现，在本发明药物组合物制备浓度条件下，例如在冷冻干燥前配液以及冷冻干燥时程内，当铂类药物添加到多肽溶液中时，会促使多肽聚集形成团，这是需要避免的。出人意料的是，当多肽中同时添加有规定量的氯化钠和枸橼酸时，可以有效的避免这种聚集发生。
根据本发明第二方面的药物组合物，其中所述药物中还包括氯化钠和枸橼酸钠。在一个实施方案中，ATAP-iRGD-M8与氯化钠和枸橼酸的重量比为1：0.02～0.1：0.05～0.2。
根据本发明第二方面的药物组合物，其中所述药物中还包括氯化钠和枸橼酸钠。在一个实施方案中，ATAP-iRGD-M8与氯化钠和枸橼酸的重量比为1：0.025～0.05：0.05～0.15。
根据本发明第二方面的药物组合物，其中还包含酸碱调节剂，其量是，使得所述药物在用水稀释至多肽浓度在0.2～0.5mg/ml浓度范围时，溶液的pH值在4.0～7.0范围内。由于药物组合物中的各种添加物本身基本上呈近中性，因此通常而言酸碱调节剂可以不加或者添加少量需要获得上述pH范围。优选的酸碱调节剂选自盐酸和氢氧化钠，例如使用盐酸溶液和氢氧化钠溶液。
进一步的，本发明第三方面提供了对药物组合物(或者制备该药物组合物过程中的包含肽类和铂类药物二者的各种制剂中间体)进行质量检测的方法，所述药物组合物中包含ATAP-iRGD-M8和铂类药物，该方法包括如下步骤：
(1)照《中华人民共和国药典》2015年版四部“0903不溶性微粒检查法”之“第一法(光阻法)”进行；
(2)取所述药物组合物，任选的用微粒检査用水溶解和/或稀释至多肽药浓度为2mg/ml或者小于2mg/ml的溶液；
(3)用光阻法微粒检测仪测定步骤(2)所得溶液中的微粒数，以每1ml溶液中粒径10μm～25μm的粒子数为n1，每1ml溶液中粒径大于25μm的粒子数为n2，计算每1ml溶液中平均粒子数N，其中N＝n1+2.5×n2。
本发明质量检测方法可以用平均匀粒子数N来表征和评价产品中不溶性微粒的总体量。
根据本发明第三方面的方法，其中所述铂类药物选自：顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、宋铂、乐铂、米铂、锡铂、顺氯卡铂、依铂、碳铂、洛铂、诺贝铂或赛特铂等。
根据本发明第三方面的方法，所述ATAP-iRGD-M8与所述铂类药物的重量比为1：0.05～20。
根据本发明第三方面的方法，所述ATAP-iRGD-M8与所述铂类药物的重量比为1：0.1～10。
根据本发明第三方面的方法，所述ATAP-iRGD-M8与所述铂类药物的重量比为1：0.2～5。
根据本发明第三方面的方法，所述ATAP-iRGD-M8与所述铂类药物的重量比为1：0.25～4。
根据本发明第三方面的方法，其是用于注射或口服使用的制剂形式，优选是用于注射使用的制剂形式。
根据本发明第三方面的方法，其是呈无菌溶液或无菌粉末形式的制剂形式。
根据本发明第三方面的方法，其是呈冷冻干燥粉针剂的形式。
根据本发明第三方面的方法，其中包含作为冻干赋形剂的糖类物质。在一个实施方案中，所述的糖类物质选自葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇及其组合。作为冻干赋形剂的用量通常是不作限定的，而是根据生产实践以获得有益赋形效果的量添加，例如通常来说这些冻干赋形剂的添加量是所述多肽重量的0.5～10倍，例如是所述多肽重量的1～5倍。
根据本发明第三方面的方法，其中还包括氯化钠和枸橼酸。已经发现，在本发明药物组合物制备浓度条件下，例如在冷冻干燥前配液以及冷冻干燥时程内，当铂类药物添加到多肽溶液中时，会促使多肽聚集形成团，这是需要避免的。出人意料的是，当多肽中同时添加有规定量的氯化钠和枸橼酸时，可以有效的避免这种聚集发生。
根据本发明第三方面的方法，其中所述药物中还包括氯化钠和枸橼酸钠。在一个实施方案中，ATAP-iRGD-M8与氯化钠和枸橼酸的重量比为1：0.02～0.1：0.05～0.2。
根据本发明第三方面的方法，其中所述药物中还包括氯化钠和枸橼酸钠。在一个实施方案中，ATAP-iRGD-M8与氯化钠和枸橼酸的重量比为1：0.025～0.05：0.05～0.15。
根据本发明第三方面的方法，其中还包含酸碱调节剂，其量是，使得所述药物在用水稀释至多肽浓度在0.2～0.5mg/ml浓度范围时，溶液的pH值在4.0～7.0范围内。由于药物组合物中的各种添加物本身基本上呈近中性，因此通常而言酸碱调节剂可以不加或者添加少量需要获得上述pH范围。优选的酸碱调节剂选自盐酸和氢氧化钠，例如使用盐酸溶液和氢氧化钠溶液。
进一步的，本发明第四方面涉及一种药盒产品，其包括物理上相互隔离的多肽药物组合物和铂类药物组合物，以及任选的溶解两种药物组合物的溶媒。术语“物理上相互隔离”例如是两种药物组合物分别存在于不同的玻璃瓶中，两个玻璃瓶置于一个包装盒中，在临床应用时将两种药物溶解和/或稀释并混合在一起，接着用于临床给药。
根据本发明第四方面的药盒产品，其中所述多肽药物组合物中包含ATAP-iRGD-M8。
根据本发明第四方面的药盒产品，其中所述铂类药物组合物中包含选自下列的铂类药物：顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、宋铂、乐铂、米铂、锡铂、顺氯卡铂、依铂、碳铂、洛铂、诺贝铂或赛特铂等。
根据本发明第四方面的药盒产品，其中所述ATAP-iRGD-M8与所述铂类药物的重量比为1：0.05～20。
根据本发明第四方面的药盒产品，其中所述ATAP-iRGD-M8与所述铂类药物的重量比为1：0.1～10。
根据本发明第四方面的药盒产品，其中所述ATAP-iRGD-M8与所述铂类药物的重量比为1：0.2～5。
根据本发明第四方面的药盒产品，其中所述ATAP-iRGD-M8与所述铂类药物的重量比为1：0.25～4。
根据本发明第四方面的药盒产品，其中其是用于注射或口服使用的制剂形式，优选是用于注射使用的制剂形式。
根据本发明第四方面的药盒产品，其中所述多肽药物组合物和铂类药物组合物各自独立的是呈无菌溶液或无菌粉末形式的制剂形式。
根据本发明第四方面的药盒产品，其中所述多肽药物组合物和铂类药物组合物各自独立的是呈冷冻干燥粉针剂的形式。
根据本发明第四方面的药盒产品，其中所述多肽药物组合物和铂类药物组合物各自独立的包含作为冻干赋形剂的糖类物质。在一个实施方案中，所述的糖类物质选自葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇及其组合。作为冻干赋形剂的用量通常是不作限定的，而是根据生产实践以获得有益赋形效果的量添加，例如通常来说这些冻干赋形剂的添加量是所述多肽重量的0.5～10倍，例如是所述多肽重量的1～5倍。
根据本发明第四方面的药盒产品，其中所述多肽药物组合物中还包括氯化钠和枸橼酸。已经发现，在本发明多肽药物组合物与铂类药物组合物混合时，由于接触到较高浓度的铂类药物，会促使多肽聚集形成团，这是需要避免的。出人意料的是，当多肽中同时添加有规定量的氯化钠和枸橼酸时，可以有效的避免这种聚集发生。已经发现当将两种药物在溶液中混合且铂类药物浓度大于1mg/ml时，多肽药物会出现显著的不溶性微粒形成过程，而当铂类药物浓度小于0.5mg/ml特别是小于0.25mg/ml时，这种不溶性微粒形成的现象不明显。此外，将这些形成的不溶性微粒过滤后，测定所得滤液中铂类药物和肽类药物的减少情况，发现溶液中肽有减产而铂类药物基本无变化，表明这种不溶性微粒主要是由多肽形成的，即，本发明肽在遇到高浓度铂类药物时会有聚集倾向。
根据本发明第四方面的药盒产品，其中所述多肽药物组合物中，ATAP-iRGD-M8与氯化钠和枸橼酸的重量比为1：0.02～0.1：0.05～0.2。
根据本发明第四方面的药盒产品，其中所述多肽药物组合物中，ATAP-iRGD-M8与氯化钠和枸橼酸的重量比为1：0.025～0.05：0.05～0.15。
根据本发明第四方面的药盒产品，其中所述多肽药物组合物和铂类药物组合物各自独立的还包含酸碱调节剂，其量是，使得所述药物在用水稀释至多肽浓度在0.2～0.5mg/ml浓度范围时，溶液的pH值在4.0～7.0范围内。由于药物组合物中的各种添加物本身基本上呈近中性，因此通常而言酸碱调节剂可以不加或者添加少量需要获得上述pH范围。优选的酸碱调节剂选自盐酸和氢氧化钠，例如使用盐酸溶液和氢氧化钠溶液。
进一步的，本发明第五方面提供了制备药物组合物的方法，所述药物组合物中包含ATAP-iRGD-M8和铂类药物；该方法包括如下步骤：
(1)使所述ATAP-iRGD-M8和铂类药物以及任选的其它药用辅料用注射用水溶解；
(2)过滤除菌，分装到玻璃瓶中，得到溶液形式的药物组合物；或者，任选的
(3)除去(例如通过冷冻干燥除去)所述溶液中的水，得到冷冻干燥粉针剂形式的药物组合物。
在制备本发明组合物时，水的量是可以容易的根据生产实践调整的，例如，在一个实施方案中，水的量是使得最终呈溶液形式的药物组合物中或者冷冻干燥前溶液中固形物的浓度为3～20％，例如为3～15％，例如为3～12％。
根据本发明第五方面的方法，其中所述铂类药物选自：顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、宋铂、乐铂、米铂、锡铂、顺氯卡铂、依铂、碳铂、洛铂、诺贝铂或赛特铂等。
根据本发明第五方面的方法，所述ATAP-iRGD-M8与所述铂类药物的重量比为1：0.05～20。
根据本发明第五方面的方法，所述ATAP-iRGD-M8与所述铂类药物的重量比为1：0.1～10。
根据本发明第五方面的方法，所述ATAP-iRGD-M8与所述铂类药物的重量比为1：0.2～5。
根据本发明第五方面的方法，所述ATAP-iRGD-M8与所述铂类药物的重量比为1：0.25～4。
根据本发明第五方面的方法，其是用于注射或口服使用的制剂形式，优选是用于注射使用的制剂形式。
根据本发明第五方面的方法，其是呈无菌溶液或无菌粉末形式的制剂形式。
根据本发明第五方面的方法，其是呈冷冻干燥粉针剂的形式。
根据本发明第五方面的方法，其中包含作为冻干赋形剂的糖类物质。在一个实施方案中，所述的糖类物质选自葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇及其组合。作为冻干赋形剂的用量通常是不作限定的，而是根据生产实践以获得有益赋形效果的量添加，例如通常来说这些冻干赋形剂的添加量是所述多肽重量的0.5～10倍，例如是所述多肽重量的1～5倍。
根据本发明第五方面的方法，其中还包括氯化钠和枸橼酸。已经发现，在本发明药物组合物制备浓度条件下，例如在冷冻干燥前配液以及冷冻干燥时程内，当铂类药物添加到多肽溶液中时，会促使多肽聚集形成团，这是需要避免的。出人意料的是，当多肽中同时添加有规定量的氯化钠和枸橼酸时，可以有效的避免这种聚集发生。
根据本发明第五方面的方法，其中所述药物中还包括氯化钠和枸橼酸钠。在一个实施方案中，ATAP-iRGD-M8与氯化钠和枸橼酸的重量比为1：0.02～0.1：0.05～0.2。
根据本发明第五方面的方法，其中所述药物中还包括氯化钠和枸橼酸钠。在一个实施方案中，ATAP-iRGD-M8与氯化钠和枸橼酸的重量比为1：0.025～0.05：0.05～0.15。
根据本发明第五方面的方法，其中还包含酸碱调节剂，其量是，使得所述药物在用水稀释至多肽浓度在0.2～0.5mg/ml浓度范围时，溶液的pH值在4.0～7.0范围内。由于药物组合物中的各种添加物本身基本上呈近中性，因此通常而言酸碱调节剂可以不加或者添加少量需要获得上述pH范围。优选的酸碱调节剂选自盐酸和氢氧化钠，例如使用盐酸溶液和氢氧化钠溶液。
根据本发明任一方面的任一实施方案，其中在ATAP-iRGD-M8与铂类药物共存的溶液(例如呈溶液形式的药物组合物，或者制备冻干粉针剂过程中冻干前的溶液组合物)中，铂类药物的浓度大于1mg/ml，特别是大于5mg/ml。
本发明任一方面的任一实施方案可以与其它任一方面的任一实施方案进行组合，只要这种组合不会出现矛盾。下面对本发明作进一步阐述。
本发明所述ATAP-iRGD-M8具有如下氨基酸序列：Ac-KKFEPKSGWMTFLEVTGKIAEMLSLLKQYCRGDKGPDC-amide，其左端亦可称为乙酰基，右端亦可称为酰胺基。
铂类药物进入人体细胞后会与很多胞内物质结合，其中大部分结合物能够产生细胞毒性或者毒副作用。一般认为铂类药物直接作用于DNA，限制DNA的解旋从而抑制其复制是铂类药物发挥抗肿瘤作用机制的主要途径。铂类药物抑制DNA复制主要发生在细胞有丝分裂G2期，与其他抗肿瘤药物一样，铂类药物抑制DNA复制的作用是非特异性的。由于癌细胞比正常细胞增殖快，DNA合成迅速，并且癌细胞应对受损DNA的修复功能不完善，因此，癌细胞比正常细胞对铂药的细胞毒作用更敏感，从而显示出良好的抗肿瘤作用。近几年的研究还发现，铂类药物与DNA形成的加合物能够和一些蛋白质结合，从而导致细胞内一系列非正常信号因子的产生，诱导细胞的死亡。
ATAP抗癌作用机制方面，从Bfl-1(氨基酸147-175)衍生的两亲尾锚定性肽(ATAP)可以特异性靶向线粒体触发凋亡。对比其他以线粒体为靶向的治疗，ATAP有着独特的可以避开Bcl-2家族蛋白并诱导有效凋亡的作用。尤其是，ATAP可以不在Bax和Bak的参与下透过线粒体的膜，Bax和Bak通常会影响载体药物能以及影响载体药物在癌症细胞(包括前列腺细胞)内的表达。此外，ATAP诱导的凋亡不受Bcl-2或其他抗凋亡家族成员的影响，Bcl-2或其他抗凋亡家族成员常常在癌细胞中过表达。ATAP展现出了作为治疗药物独特的优势即ATAP可避开Bcl-2介导的保护机制并有效地杀死对化疗产生抗性的癌细胞。
将本发明的ATAP与铂类药物组合使用用于治疗肿瘤性疾病时将会呈现令人期待的临床效果。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
本发明所用ATAP-iRGD-M8参照CN103012565A中的Fmoc固相合成法进行制备，所得M8的HPLC纯度大于98.5％。在制备组合物时每次投料至少为1000瓶，但是描述配方组成时通常以1瓶量加以阐明。
一、组合物的制备例
制备例1：制备包含ATAP-iRGD-M8和铂类药物的组合物(粉针剂)
配方(每瓶)：
ATAP-iRGD-M8：50mg，
铂类(奥沙利铂)：多肽量的1倍，
甘露醇：多肽量的2.5倍，
氯化钠：多肽量的0.04倍，
枸橼酸：多肽量的0.1倍；
冻干前注射用水，其在冻干后除去的，其用量是使冻干前溶液中固形物浓度为5％。
制法：(1)使所述ATAP-iRGD-M8和铂类药物以及赋形剂、氯化钠、枸橼酸用注射用水溶解；(2)过滤除菌，分装到玻璃瓶中，得到溶液；(3)通过冷冻干燥除去所述溶液中的水，得到冷冻干燥粉针剂形式的药物组合物。
制备例2：制备包含ATAP-iRGD-M8和铂类药物的组合物(粉针剂)
配方(每瓶)：
ATAP-iRGD-M8：50mg，
铂类(奥沙利铂)：多肽量的5倍，
乳糖：多肽量的0.5倍，
氯化钠：多肽量的0.025倍，
枸橼酸：多肽量的0.15倍；
冻干前注射用水，其在冻干后除去的，其用量是使冻干前溶液中固形物浓度为3％。
制法：(1)使所述ATAP-iRGD-M8和铂类药物以及赋形剂、氯化钠、枸橼酸用注射用水溶解；(2)过滤除菌，分装到玻璃瓶中，得到溶液；(3)通过冷冻干燥除去所述溶液中的水，得到冷冻干燥粉针剂形式的药物组合物。
制备例3：制备包含ATAP-iRGD-M8和铂类药物的组合物(粉针剂)
配方(每瓶)：
ATAP-iRGD-M8：50mg，
铂类(奥沙利铂)：多肽量的0.2倍，
蔗糖：多肽量的10倍，
氯化钠：多肽量的0.05倍，
枸橼酸：多肽量的0.05倍；
冻干前注射用水，其在冻干后除去的，其用量是使冻干前溶液中固形物浓度为8％。
制法：(1)使所述ATAP-iRGD-M8和铂类药物以及赋形剂、氯化钠、枸橼酸用注射用水溶解；(2)过滤除菌，分装到玻璃瓶中，得到溶液；(3)通过冷冻干燥除去所述溶液中的水，得到冷冻干燥粉针剂形式的药物组合物。
制备例4：制备包含ATAP-iRGD-M8和铂类药物的组合物(粉针剂)
配方(每瓶)：
ATAP-iRGD-M8：50mg，
铂类(奥沙利铂)：多肽量的2倍，
葡萄糖：多肽量的1倍，
氯化钠：多肽量的0.03倍，
枸橼酸：多肽量的0.12倍；
冻干前注射用水，其在冻干后除去的，其用量是使冻干前溶液中固形物浓度为15％。
制法：(1)使所述ATAP-iRGD-M8和铂类药物以及赋形剂、氯化钠、枸橼酸用注射用水溶解；(2)过滤除菌，分装到玻璃瓶中，得到溶液；(3)通过冷冻干燥除去所述溶液中的水，得到冷冻干燥粉针剂形式的药物组合物。
制备例5：制备包含ATAP-iRGD-M8和铂类药物的组合物(粉针剂)
配方(每瓶)：
ATAP-iRGD-M8：50mg，
铂类(奥沙利铂)：多肽量的3.5倍，
甘露醇：多肽量的2倍，
氯化钠：多肽量的0.035倍，
枸橼酸：多肽量的0.075倍；
冻干前注射用水，其在冻干后除去的，其用量是使冻干前溶液中固形物浓度为12％。
制法：(1)使所述ATAP-iRGD-M8和铂类药物以及赋形剂、氯化钠、枸橼酸用注射用水溶解；(2)过滤除菌，分装到玻璃瓶中，得到溶液；(3)通过冷冻干燥除去所述溶液中的水，得到冷冻干燥粉针剂形式的药物组合物。
制备例6：制备包含ATAP-iRGD-M8和铂类药物的组合物(粉针剂)
配方(每瓶)：
ATAP-iRGD-M8：50mg，
铂类(卡铂)：多肽量的1倍，
甘露醇：多肽量的5倍，
氯化钠：多肽量的0.05倍，
枸橼酸：多肽量的0.1倍；
冻干前注射用水，其在冻干后除去的，其用量是使冻干前溶液中固形物浓度为10％。
制法：(1)使所述ATAP-iRGD-M8和铂类药物以及赋形剂、氯化钠、枸橼酸用注射用水溶解；(2)过滤除菌，分装到玻璃瓶中，得到溶液；(3)通过冷冻干燥除去所述溶液中的水，得到冷冻干燥粉针剂形式的药物组合物。
制备例7：制备包含ATAP-iRGD-M8和铂类药物的组合物(粉针剂)
配方(每瓶)：
ATAP-iRGD-M8：50mg，
铂类(卡铂)：多肽量的4倍，
甘露醇：多肽量的1倍，
氯化钠：多肽量的0.03倍，
枸橼酸：多肽量的0.15倍；
冻干前注射用水，其在冻干后除去的，其用量是使冻干前溶液中固形物浓度为7.5％。
制法：(1)使所述ATAP-iRGD-M8和铂类药物以及赋形剂、氯化钠、枸橼酸用注射用水溶解；(2)过滤除菌，分装到玻璃瓶中，得到溶液；(3)通过冷冻干燥除去所述溶液中的水，得到冷冻干燥粉针剂形式的药物组合物。
制备例8：制备包含ATAP-iRGD-M8和铂类药物的组合物(粉针剂)
配方(每瓶)：
ATAP-iRGD-M8：50mg，
铂类(顺铂)：多肽量的0.5倍，
甘露醇：多肽量的4倍，
氯化钠：多肽量的0.04倍，
枸橼酸：多肽量的0.8倍；
冻干前注射用水，其在冻干后除去的，其用量是使冻干前溶液中固形物浓度为6％。
制法：(1)使所述ATAP-iRGD-M8和铂类药物以及赋形剂、氯化钠、枸橼酸用注射用水溶解；(2)过滤除菌，分装到玻璃瓶中，得到溶液；(3)通过冷冻干燥除去所述溶液中的水，得到冷冻干燥粉针剂形式的药物组合物。
制备例9：制备包含ATAP-iRGD-M8和铂类药物的组合物(粉针剂)
配方(每瓶)：
ATAP-iRGD-M8：50mg，
铂类(顺铂)：多肽量的2倍，
甘露醇：多肽量的1.5倍，
氯化钠：多肽量的0.045倍，
枸橼酸：多肽量的0.1倍；
冻干前注射用水，其在冻干后除去的，其用量是使冻干前溶液中固形物浓度为5％。
制法：(1)使所述ATAP-iRGD-M8和铂类药物以及赋形剂、氯化钠、枸橼酸用注射用水溶解；(2)过滤除菌，分装到玻璃瓶中，得到溶液；(3)通过冷冻干燥除去所述溶液中的水，得到冷冻干燥粉针剂形式的药物组合物。
以上制备例1至制备例9，其中步骤(2)所得溶液可以作为注射液(即液体形式的药物组合物)直接使用，步骤(2)所得粉针剂(即固体形式的药物组合物)可以在临床应用前用注射用水或者其它注射溶媒溶解后用于肿瘤患者。
制备例11：制备包含ATAP-iRGD-M8和铂类药物的组合物(粉针剂)
分别照制备例1至制备例9的配方和制法，不同的仅是不添加氯化钠，可以分别在步骤(2)和步骤(3)中得到9批液体形式的药物组合物和9批固体形式的药物组合物。
制备例12：制备包含ATAP-iRGD-M8和铂类药物的组合物(粉针剂)
分别照制备例1至制备例9的配方和制法，不同的仅是不添加枸橼酸，可以分别在步骤(2)和步骤(3)中得到9批液体形式的药物组合物和9批固体形式的药物组合物。
制备例13：制备包含ATAP-iRGD-M8和铂类药物的组合物(粉针剂)
分别照制备例1至制备例9的配方和制法，不同的仅是不添加氯化钠和枸橼酸，可以分别在步骤(2)和步骤(3)中得到9批液体形式的药物组合物和9批固体形式的药物组合物。
上述制备例1至制备例9以及制备例11至制备例13所得组合物，未经酸碱调节剂调节，在用水稀释至多肽浓度在0.2～0.5mg/ml浓度范围时，溶液的pH值在4.0～7.0范围内。
二、试验例部分
试验例1：测定药物组合物中的不溶性微粒
测定方法包括如下步骤：(1)照《中华人民共和国药典》2015年版四部“0903不溶性微粒检查法”之“第一法(光阻法)”进行；(2)取所述药物组合物，任选的用微粒检査用水溶解和/或稀释至多肽药浓度为2mg/ml或者小于2mg/ml的溶液；(3)用光阻法微粒检测仪(ZWJ-20A型微粒检测仪)测定步骤(2)所得溶液中的微粒数，以每1ml溶液中粒径10μm～25μm的粒子数为n1，每1ml溶液中粒径大于25μm的粒子数为n2，计算每1ml溶液中平均粒子数N，其中N＝n1+2.5×n2。
用平均匀粒子数N来表征和评价产品中不溶性微粒的总体量。
众所周知，冷冻干燥过程中，从呈溶液状态的药液直到呈粉末状态的冷冻干燥粉末通常需要24～48小时甚至更长时间，在此过程中多肽与铂类一起共存于溶液中，因此，测定制备例1至制备例9以及制备例11至制备例13中，对于同一制备例，步骤(2)所得药液在0时(过滤除菌后即测定)、24时(过滤除菌后室温放置24小时)以及步骤(3)所得粉针0时(冻干完毕后24小时内)、6月(冻干完毕后室温放置6月)时的平均粒子数N，以步骤(2)所得药液在0时的N为基准，用下式计算考察样品(即药液24时、粉针0时、或粉针6月)的相对粒子数(％)：
相对粒子数(％)＝(考察样品平均粒子数N÷药液0时平均粒子数N)×100％
结果显示：制备例1至制备例9的药液24时相对粒子数均在98～107％范围内，表明这些药液在放置24小时后平均粒子数基本无变化。制备例11至制备例13的药液24时相对粒子数均在215～252％范围内，表明这些药液在放置24小时后平均粒子数有显著增加；将这些微粒滤除后的溶液经HPLC法测定，其中铂类药物含量基本无变化但是肽类药物有明显的减少，表明这些不溶性微粒是由于多肽类药物聚集所致；在参考制备例11至制备例13的补充试验中，减少铂类药物的量使得所配药液中铂类药物浓度至5mg/ml、1mg/ml、0.2mg/ml时，发现5mg/ml、1mg/ml两种浓度的药液24时相对粒子数仍然可达到177～224％范围内，而0.2mg/ml浓度的药液24时相对粒子数在103～116％范围内，表明混合药液中当铂类药物浓度减小到1mg/ml以下例如0.25mg/ml以下例如0.2mg/ml时，不会造成多肽的明显聚集，而铂类药物浓度大于1mg/ml例如大于5mg/ml由于铂类药物的存在会造成多肽的明显聚集，然而由于铂类药物浓度低于1mg/ml时配制的药物临床不具适用性，例如铂类药物比例过小、药液浓度过低，因此配制包含较高浓度的多肽和铂类药物并且避免其中多肽聚集是必须考虑的。制备例1至制备例9的粉针0时相对粒子数均在95～109％范围内，表明这些实例的药液经历完整的冷冻干燥工序后多肽药物不会聚集。制备例11至制备例13的粉针0时相对粒子数均在226～266％范围内，与其药液24时的结果吻合，表明这些实例的药液在经历完整的冷冻干燥工序后多肽药物会聚集，并且这种聚集可能与肽和铂类药物均共存于同一溶液中有关。制备例1至制备例9的粉针6月相对粒子数均在97～108％范围内，制备例11至制备例13的粉针6月相对粒子数均在219～273％范围内，表明无论配方如何，这些实例的粉针在长期存放后不会出现多肽的聚集现象，进一步表明如果配方设计不理想则两种药物共存于同一溶液时才会出现肽的聚集。在补充的试验中，将制备例1至制备例9以及制备例11至制备例13的粉针6月每瓶用5％葡萄糖注射液100ml或者0.9％注射液100ml溶解/稀释并放置6小时后，制备例1至制备例9相对粒子数均在98～106％范围内，制备例11至制备例13相对粒子数均在224～271％范围内，表明不论配方如何，这些粉针在用注射用溶媒模拟临床用药时溶解/稀释后，6小时内未见多肽聚集，证实了这些组合物的临床应用安全性。
三、药盒例
(A)参照制备例1、制备例6、制备例8的配方和制法，不同的仅是不添加多肽药物和氯化钠、枸橼酸，得到铂类粉针剂组合物。(B)参照制备例1、制备例6、制备例8的配方和制法，不同的仅是不添加铂类药物，得到多肽粉针剂组合物；将由此所得三种多肽粉针组合物与(A)所得任一种铂类粉针组合物以1瓶：1瓶并加2瓶量的注射用水的比例溶解/混合后，该溶液在0时(混合完毕后即测定)、24时(混合后室温放置24小时)相对粒子数均在94～116％范围内，表明添加了氯化钠、枸橼酸的多肽组合物在与铂类药物溶解混合后不会出现多肽的聚集。(C)参照制备例1、制备例6、制备例8的配方和制法，不同的仅是不添加铂类药物和氯化钠、枸橼酸，得到多肽粉针剂组合物；将由此所得三种多肽粉针组合物与(A)所得任一种铂类粉针组合物以1瓶：1瓶并加2瓶量的注射用水的比例溶解/混合后，该溶液在0时(混合完毕后即测定)相对粒子数均在97～111％范围内，该溶液在24时(混合后室温放置24小时)相对粒子数均在182～216％范围内，表明未添加氯化钠、枸橼酸的多肽组合物在与铂类药物溶解混合后会出现多肽的聚集。
四、生物活性试验例
一般地讲，ATAP-M8多肽分子，人使用剂量范围5-25毫克/m2，采用静脉注射或静脉滴注给药方式。奥沙利铂，静脉滴注，单药注射剂量130毫克/m2。
生物活性试验1：ATAP-M8联合奥沙利铂对人胃癌MGC-803裸鼠移植瘤的抑制作用
本生物活性试验例参考CN103656615B(中国专利号201310674338.0)的方法进行，考察ATAP-M8联合奥沙利铂对人胃癌MGC-803裸鼠移植瘤的抑制作用。给药组别设置见以下表1。
表1：给药组别设置
Figure BDA0001575470400000171
治疗后根据瘤重获得的抑瘤率如表2所示。
表2：瘤重(g)和抑瘤率(％)
Figure BDA0001575470400000172
Figure BDA0001575470400000181
数据分析软件为SPSS，以均值±SD表示各组平均瘤重。抑瘤率＝(阴性组瘤重-治疗组瘤重)/阴性组瘤重×100％，根据T检验结果，*P<0.05为显著，**P<0.01为极显著性差异。
实验结果评价：
(a)普通联合用药时
Q高＝E(A+B)/(EA+EB-EA×EB)＝87.39％/(45.83％+48.13％-45.83％×48.13％)＝1.215，
Q低＝E(A+B)/(EA+EB-EA×EB)＝77.63％/(31.14％+33.77％-31.14％×33.77％)＝1.428。
(b)粉针联合用药时
Q高＝E(A+B)/(EA+EB-EA×EB)＝89.14％/(45.83％+48.13％-45.83％×48.13％)＝1.239，
Q低＝E(A+B)/(EA+EB-EA×EB)＝81.25％/(31.14％+33.77％-31.14％×33.77％)＝1.494。
根据计算，ATAP-M8与奥沙利铂形成冻干组合物联合用药与两个药物单独用药评价结果均为增强(++)作用，即协同作用。根据观察，动物联合用药状态好于单独用药，体重减少相对比单独用药要缓慢，说明毒副作用降低。
生物活性试验2：ATAP-M8联合奥沙利铂对人肺癌H460裸鼠移植瘤的抑制作用
剂量及分组参照生物活性试验1。治疗后根据瘤重获得的抑瘤率如表3所示。
表3：瘤重(g)和抑瘤率(％)
组别 瘤重(g) 抑瘤率％
G1 0.955±0.125 —
G2 0.604±0.102* 36.75
G3 0.516±0.104* 45.96
G4 0.559±0.126* 41.46
G5 0.495±0.094** 48.16
G6 0.385±0.136* 59.68
G7 0.315±0.081** 67.01
G8 0.224±0.094** 76.54
G9 0.155±0.126** 83.77
数据分析软件为SPSS，以均值±SD表示各组平均瘤重。抑瘤率＝(阴性组瘤重-治疗组瘤重)/阴性组瘤重×100％，根据T检验结果，*P<0.05为显著，**P<0.01为极显著性差异。
实验结果评价：
(a)普通联合用药时
Q高＝E(A+B)/(EA+EB-EA×EB)＝67.01％/(48.16％+45.96％-48.16％×45.96％)＝0.9308，
Q低＝E(A+B)/(EA+EB-EA×EB)＝59.68％/(41.46％+36.75％-41.46％×36.75％)＝0.9477，
根据计算，ATAP-M8与奥沙利铂联合用药与单独用药评价结果均为单纯相加(+)作用，根据观察，动物联合用药状态好于单独用药，体重减少相对比单独用药要缓慢，说明毒副作用降低。
(b)粉针联合用药时
Q高＝E(A+B)/(EA+EB-EA×EB)＝83.77％/(48.16％+45.96％-48.16％×45.96％)＝1.163，
Q低＝E(A+B)/(EA+EB-EA×EB)＝76.54％/(41.46％+36.75％-41.46％×36.75％)＝1.215，
根据计算，ATAP-M8与奥沙利铂形成组合物联合用药与两个药物单独用药评价结果均为增强(++)作用，即协同作用。根据观察，动物联合用药状态好于单独用药，体重减少相对比单独用药要缓慢，说明毒副作用降低。
生物活性试验3：ATAP-M8联合奥沙利铂对人肝癌SMMC-7721裸鼠移植瘤的抑制作 用
剂量及分组参照生物活性试验1。治疗后根据瘤重获得的抑瘤率如表4所示。
表4：瘤重(g)和抑瘤率(％)
组别 瘤重(g) 抑瘤率％
G1 0.897±0.103 —
G2 0.613±0.109* 31.66
G3 0.578±0.132* 35.56
G4 0.571±0.095** 36.34
G5 0.512±0.121* 42.92
G6 0.209±0.087** 76.70
G7 0.274±0.116* 69.45
G8 0.170±0.098** 81.04
G9 0.086±0.092** 90.41
数据分析软件为SPSS，以均值±SD表示各组平均瘤重。抑瘤率＝(阴性组瘤重-治疗组瘤重)/阴性组瘤重×100％，根据T检验结果，*P<0.05为显著，**P<0.01为极显著性差异。
实验结果评价：
(a)普通联合用药时
Q高＝E(A+B)/(EA+EB-EA×EB)＝76.70％/(42.92％+35.56％-42.92％×35.56％)＝1.213，
Q低＝E(A+B)/(EA+EB-EA×EB)＝69.45％/(36.34％+31.66％-36.34％×31.66％)＝1.229，
根据计算，ATAP-M8与奥沙利铂形成组合物联合用药与两个药物单独用药评价结果均为增强(++)作用，即协同作用，根据观察，动物联合用药状态好于单独用药，体重减少相对比单独用药要缓慢，说明毒副作用降低。
(b)粉针联合用药时
Q高＝E(A+B)/(EA+EB-EA×EB)＝90.41％/(42.92％+35.56％-42.92％×35.56％)＝1.430，
Q低＝E(A+B)/(EA+EB-EA×EB)＝81.04％/(36.34％+31.66％-36.34％×31.66％)＝1.434，
根据计算，ATAP-M8与奥沙利铂形成组合物联合用药与两个药物单独用药评价结果均为增强(++)作用，即协同作用，根据观察，动物联合用药状态好于单独用药，体重减少相对比单独用药要缓慢，说明毒副作用降低。

Claims (19)

1.一种药物组合物，其中包含ATAP-iRGD-M8、铂类药物、氯化钠和枸橼酸；ATAP-iRGD-M8和铂类药物二者的重量比为1：0.2~5，ATAP-iRGD-M8与氯化钠和枸橼酸的重量比为1：0.025~0.05：0.05~0.15；铂类药物选自：顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、宋铂、乐铂、米铂、锡铂、顺氯卡铂、依铂、碳铂、洛铂、诺贝铂或赛特铂。
2.根据权利要求1的药物组合物，所述ATAP-iRGD-M8与所述铂类药物的重量比为1：0.25~4。
3.根据权利要求1的药物组合物，其是用于注射或口服使用的制剂形式。
4.根据权利要求1的药物组合物，其是用于注射使用的制剂形式。
5.根据权利要求1的药物组合物，其是呈无菌溶液或无菌粉末形式的制剂形式。
6.根据权利要求1的药物组合物，其是呈冷冻干燥粉针剂的形式。
7.根据权利要求6的药物组合物，其中包含作为冻干赋形剂的糖类物质，该糖类物质选自葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇及其组合。
8.根据权利要求7的药物组合物，冻干赋形剂的添加量是所述多肽重量的0.5~10倍。
9.根据权利要求7的药物组合物，冻干赋形剂的添加量是所述多肽重量的1~5倍。
10.制备权利要求1的药物组合物的方法，包括如下步骤：
(1)使所述ATAP-iRGD-M8和铂类药物以及氯化钠和枸橼酸用注射用水溶解；
(2)过滤除菌，分装到玻璃瓶中，得到溶液形式的药物组合物；
(3)除去所述溶液中的水，得到冷冻干燥粉针剂形式的药物组合物。
11.根据权利要求10的方法，水的量是使得最终呈溶液形式的药物组合物中或者冷冻干燥前溶液中固形物的浓度为3~20%。
12.一种药盒产品，其包括物理上相互隔离的多肽药物组合物和铂类药物组合物，以及任选的溶解两种药物组合物的溶媒，所述多肽药物组合物中包含ATAP-iRGD-M8、氯化钠和枸橼酸，ATAP-iRGD-M8与氯化钠和枸橼酸的重量比为1：0.025~0.05：0.05~0.15，所述铂类药物组合物中包含选自下列的铂类药物：顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、宋铂、乐铂、米铂、锡铂、顺氯卡铂、依铂、碳铂、洛铂、诺贝铂或赛特铂；所述ATAP-iRGD-M8与所述铂类药物的重量比为1：0.2~5。
13.根据权利要求12的药盒产品，所述ATAP-iRGD-M8与所述铂类药物的重量比为1：0.25~4。
14.根据权利要求12的药盒产品，其是用于注射使用的制剂形式。
15.根据权利要求12的药盒产品，所述多肽药物组合物和铂类药物组合物各自独立的是呈无菌溶液或无菌粉末形式的制剂形式。
16.根据权利要求12的药盒产品，所述多肽药物组合物和铂类药物组合物各自独立的是呈冷冻干燥粉针剂的形式。
17.根据权利要求12的药盒产品，所述多肽药物组合物和铂类药物组合物各自独立的包含作为冻干赋形剂的糖类物质，该糖类物质选自葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇及其组合。
18.根据权利要求12的药盒产品，冻干赋形剂的添加量是所述多肽重量的0.5~10倍。
19.权利要求1~9任一项所述药物组合物在制备用于联合治疗肿瘤性疾病的药物中的用途。
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