CN112512531A - 用于膀胱癌的治疗的方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于膀胱癌的治疗的方法。

Description

用于膀胱癌的治疗的方法

对相关申请的交叉引用

不涉及。

背景技术

STING(干扰素基因刺激因子)是对胞质溶胶中的dsDNA的先天性应答中的信号传递分子。已报道过多种人类癌症中的STING缺失。此外，还报道过在黑色素瘤(Xia T等，"Recurrent Loss of STING Signaling in Melanoma Correlates with Susceptibilityto Viral Oncolysis"Cancer Res.2016)和结肠癌(Xia T等，"Deregulation of STINGSignaling in Colorectal Carcinoma Constrains DNA Damage Responses andCorrelates With Tumorigenesis"Cell Rep.2016；14:282-97)中，人类癌症中的STING信号传递下调。有意思的是，在上述研究中，基因组分析结果显示STING的表达丧失并非起因于基因缺失或突变，而是起因于表观遗传学改变(Xia,Cancer Res.2016；Xia,CellRep.2016)。STING的癌症保护活性也得到了来自小鼠模型研究的证据的支持。STING敲除小鼠表现出有缺陷的肿瘤控制(Woo SR等，"STING-dependent cytosolic DNA sensingmediates innate immune recognition of immunogenic tumors"Immunity 2014；41:830-42)。

此外，STING在保护个体发生中的作用已在包括胶质瘤(Ohkuri T等，"Protectiverole of STING against gliomagenesis:Rational use of STING agonist in anti-glioma immunotherapy"Oncoimmunology.2015；4:e999523)和结肠癌(Zhu Q等，"Cuttingedge:STING mediates protection against colorectal tumorigenesis by governingthe magnitude of intestinal inflammation"J.Immunol.2014；193:4779-82)在内的若干自发性小鼠模型中得到证实。该抗肿瘤效应可能是来自其对抗NF-κB和STAT3的过度激活的能力(Okihuri 2015)。STING通路的激活还在临床前期小鼠肿瘤模型中表现出强力的活性(Woo 2014；Chandra D等，"STING ligand c-di-GMP improves cancer vaccinationagainst metastatic breast cancer"Cancer Immunol Res.2014；2:901-10；Corrales L等，"Direct Activation of STING in the Tumor Microenvironment Leads to Potentand Systemic Tumor Regression and Immunity"Cell Rep.2015；11:1018-30；Curran E等，"STING Pathway Activation Stimulates Potent Immunity against Acute MyeloidLeukemia"Cell Rep.2016；15:2357-66；Tang CH等，"Agonist-Mediated Activation ofSTING Induces Apoptosis in Malignant B Cells"Cancer Res.2016；76:2137-52)。该抗肿瘤活性可能是来自肿瘤血管的破坏和随后诱导的适应性免疫应答(Corrales L等，"Thehost STING pathway at the interface of cancer and immunity"J.Clin.Invest.2016；126:2404-11)。因此，通过激动剂对肿瘤微环境中的STING予以直接的或肿瘤内的刺激可能代表了用于治疗癌症的新型手段。

而且，膀胱癌是在男性和女性中分别为第4位、第11位常见的癌症，其早期癌症患者有独特的药物施予途径(Kamat等，“What is new in non-muscle-invasive bladdercancer in 2016？”Turk J Urol2017；43(1):9-13)。2018年，美国的新发膀胱癌病例数估计约为81,190例，而预期死于膀胱癌的人数约为17,240(美国癌症协会网站)。施予BCG(卡介苗)是用于高风险非肌层侵入性膀胱癌(NMIBC)的一线治疗选项。不幸的是，高达40％的患者对BCG治疗无响应，且其中大部分患者必须接受根治性膀胱切除术以去除整个膀胱(Zlotta,A.R.等，“The management of BCG failure in non-muscle-invasive bladdercancer:an update,”Can Urol Assoc J2009；3(Suppl4):S199-205)，致使患者术后生活质量低下。因此，通过有效的其他膀胱癌疗法来避免或推迟根治性膀胱切除术的医学需求亟待满足。

发明概述

实施方式可提供治疗需要治疗的患者中的膀胱癌的方法，其包括向患者施予化合物1或其药学上可接受的盐：

在一些实施方式中，根据本文报道的实施方式所施予的药学上可接受的盐是二铵盐或三乙胺(TEA)盐。其他实施方式可提供通过向需要治疗膀胱癌的患者施予包含化合物1或其药学上可接受的盐、和药学上可接受的赋形剂的药物组合物进行的膀胱癌治疗。

其他实施方式可提供治疗需要治疗的患者中的膀胱癌的方法，其包括向患者施予化合物2或其药学上可接受的盐：

其他实施方式可提供本文报道的化合物1、化合物2、或其药学上可接受的盐在用于治疗膀胱癌的药物组合物的制备中的应用。

实施方式可提供化合物1、化合物2、其药学上可接受的盐、或者包含化合物1、化合物2、或其药学上可接受的盐的药物组合物在用于膀胱癌的治疗中的应用。

实施方式可提供治疗膀胱癌的方法，其包括：鉴定出患有可通过化合物1、化合物2、其药学上可接受的盐、或者包含化合物1、化合物2、或其药学上可接受的盐的药物组合物来治疗的膀胱癌的个体；和向所述个体施予治疗有效量的已鉴定为能够治疗膀胱癌的化合物1、化合物2、药学上可接受的盐或药物组合物。

在一些实施方式中，个体通过患者中的REF STING变异等位基因的存在而被鉴定为患有可通过化合物1、化合物2、其药学上可接受的盐、或者包含化合物1、化合物2、或其药学上可接受的盐的药物组合物来治疗的膀胱癌。

一些实施方式提供了治疗具有REF STING等位基因的患者中的膀胱癌的方法，其包括向所述患者施予化合物1、化合物2、其药学上可接受的盐、或者包含化合物1、化合物2、或其药学上可接受的盐的药物组合物。

一些实施方式提供了治疗具有WT STING等位基因的患者中的膀胱癌的方法，其包括向所述患者施予化合物1、化合物2、其药学上可接受的盐、或者包含化合物1或其药学上可接受的盐的药物组合物。

一些实施方式提供了治疗具有AQ STING等位基因的患者中的膀胱癌的方法，其包括向所述患者施予化合物1、化合物2、化合物1的药学上可接受的盐、化合物2的药学上可接受的盐、或者包含化合物1、化合物2、或其药学上可接受的盐的药物组合物。

一些实施方式提供了治疗具有HAQ STING等位基因的患者中的膀胱癌的方法，其包括向所述患者施予化合物1、化合物2、化合物1的药学上可接受的盐、化合物2的药学上可接受的盐、或者包含化合物1、化合物2、或其药学上可接受的盐的药物组合物。

在一些实施方式中，化合物1以游离酸的形式提供。在一些实施方式中，化合物以NH₄盐或三乙胺(TEA)盐的形式提供。

实施方式可提供治疗有需要的患者中的膀胱癌的方法，其包括向患者施予治疗有效量的如上所述的化合物1或其药学上可接受的盐。

实施方式可提供治疗患者中的膀胱癌的方法，其包括向所述患者施予本文所报道的化合物1、化合物2、其药学上可接受的盐、或药物组合物。本文报道的所治疗的膀胱癌可以是尿路上皮癌。

附图说明

图1显示了化合物1a的合成。该合成也报道于2018年2月17日提交的美国专利申请号15/898,533中，并通过引用整合于本文中。

图2A和图2B显示了化合物1和化合物1a的另一合成。该另一合成还示于图2C至图2E中。

图3显示了化合物1的¹H NMR谱图。

图4A、图4B和图4C分别显示了化合物1的不对称晶体、不对称晶体的第一分子、和不对称晶体的第二分子的X射线晶体学结果(ORTEP图)。

图5显示了与化合物1复合的人WT STING的X射线晶体结构的图。

图6显示了与化合物1复合的人REF STING C端结构域。

图7显示了自第20～21天由MRI定量得到的肿瘤体积。

图8显示了膀胱癌治疗实施例4中的所有组别的存活曲线。

图9显示了WT STING的表达载体图(pLenti-WT人STING-Puro)。

图10和图11与实施例108关联，显示了化合物1a在CT26双瘤模型中的治疗活性。

图12与实施例109关联，显示了受治肿瘤的肿瘤体积散点图和存活曲线。

图13与实施例110关联，显示了受治肿瘤的肿瘤体积散点图和存活曲线。

具体实施方式

本文提供了可用于治疗膀胱癌的化合物(化合物1)及其药学上可接受的盐、以及药物组合物。化合物2或其药学上可接受的盐、以及包含化合物2或其药学上可接受的盐的药物组合物也可用于治疗膀胱癌。化合物可活化干扰素基因刺激因子(STING)。

以下为化合物1：

以下为化合物2：

在一些实施方式中，化合物1以游离酸的形式提供。在一些实施方式中，化合物以例如NH₄盐的形式提供。提及“化合物1a”，指化合物1的二铵盐。

实施方式可提供治疗有需要的患者中的膀胱癌的方法，其包括向患者施予治疗有效量的化合物1、化合物2、或其药学上可接受的盐。

还可提供用于治疗膀胱癌的药物组合物，其包含本文报道的化合物或其药学上可接受的盐、以及药学上可接受的赋形剂。本文报道的实施方式可用于治疗膀胱癌或用于制备对于膀胱癌治疗有用的药物。

本领域技术人员将认识到，在与磷原子(P₁、P₂)键合的取代基同时具有单键和双键的情况下，它们可能容易发生互变异构。例如，化合物可处于互变异构平衡。一个例子如下所示：

这些互变异构体应被认为落入权利要求的范围之内。给定化合物的任一种互变异构体的结构表征均可代表该化合物。

治疗方法

实施方式可提供治疗有需要的患者中的膀胱癌的方法，其包括向患者施予治疗有效量的化合物1或其药学上可接受的盐。

在一些实施方式中，化合物1以游离酸或其药学上可接受的盐的形式提供。在一些实施方式中，施予的化合物以NH₄盐、游离酸、或其药学上可接受的盐的形式提供。在一些实施方式中，化合物以NH₄盐的形式提供。

一些实施方式提供了治疗膀胱癌的方法，其包括向需要治疗的患者施予治疗有效量的STING激动剂。在这些实施方式中，施予可以但不必须是通过膀胱内方式的施予(intravesicular administration)。可用于治疗膀胱癌、且可以但不必须以膀胱内方式进行施予的、潜在的STING激动剂的例子包括但不限于2018年2月17日提交的美国专利申请号15/898,533；2018年2月17日提交的PCT申请号PCT/US2018/018556；2018年2月17日提交的PCT申请号PCT/US2018/018561；US 2014/0205653 A1；US 2014/0329889 A1；US 2014/0341976 A1；US 2007/0149462 A1；WO 2018/098203 A1；WO 2018/198076 A1；WO 2018/198084 A1；WO 2018/140831 A2；US 2014/0341976 A1；WO 2015/185565 A1；US 7,709,458B2；US 7,592,326；US 7,569,555 B2；US 2014/0205653 A1；US 2014/0341976 A1；US2015/0056224 A1；US 2016/0362441 A1；US 2017/0158724 A1；US 2017/044206 A1；US 5,547,941；US 7,569,555 B2；US 7,592,326 B2；US 7,709,458 B2；US 9,549,944 B2；WO2009/133560 A1；WO 2015/074145 A1；WO 2015/077354 A1；WO 2015/185565 A1；WO 2016/100261 A1；WO 2016/120305 A1；WO 2016/145102 A1；WO 2017/027645 A1；WO 2017/027646 A1；WO 2017/075477 A1；WO 2019/043634 A2；WO 2019/046496 A1；WO 2019/046498 A1；WO 2019/046500 A1；WO 2019/046511 A1；WO 2017/093933 A1；WO 2017/123657 A1；WO 2017/175156 A1；EP 1740,192B1；CN 102199183 A；Fu,J.等，“STINGAgonist Formulated Cancer Vaccines Can Cure Established Tumors Resistant toPD-1Blockade,”Sci.Translational Med.,7(283):283ra52,(April 15,2015)；Corrales,L.等，“Direct Activation of STING in the Tumor Microenvironment Leads toPotent and Systemic Tumor Regression and Immunity,”Cell Reports,11:1018-1030(2015)；和Lioux,T.等，“Design,Synthesis,and Biological Evaluation of NovelCyclic Adenosine-Inosine Monophosphate(cAIMP)Analogs That Activate Stimulatorof Interferon Genes(STING),”J.Med.Chem.,59:10253-10267(2016)中鉴定的STING激动剂。所有上述文献(包括文献中化合物)都通过引用整合到本文中；如果任一上述文献中的任意部分与本说明书中的任何内容相矛盾或不一致，则以本说明书为准。

剂量

用于治疗膀胱癌的最佳剂量可针对每种化合物而使用已知的方法经验性地确定，并取决于多种因素，包括：试剂的活性；个体的年龄、体重、健康概况、性别和饮食；施予的时间和途径；以及个体正在使用的其他药物。可以使用本领域普遍已知的常规测试和方案确立最佳剂量。上述化合物的施予可以通过任何合适的途径。

本文使用的“药学上可接受的盐”指本申请文件中的化合物的酸加成盐或碱加成盐。药学上可接受的盐是保留了母体化合物的活性，并且对其施予对象、及在其施予环境中不会造成任何不适当的有害或不良影响的任何盐。药学上可接受的盐包括但不限于金属配合物及无机酸盐和羧酸盐。药学上可接受的盐还包括例如铝盐、钙盐、铁盐、镁盐、锰盐和复合盐等金属盐。此外，药学上可接受的盐包括但不限于酸式盐、例如乙酸盐、天冬氨酸盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、乙酰氧基乙基盐(axetil)、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、丁酸盐、依地酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯苯甲酸盐、柠檬酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯十二烷基硫酸盐(estolic)、乙磺酰基盐(esyl)、乙烷磺酸盐(esylic)、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐(gluceptic)、葡糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酸盐、羟乙酰基氨苯胂酸盐(glycolylarsanilic)、环已基氨基磺酸盐(hexamic)、己基间苯二酸盐(hexylresorcinoic)、海巴酸盐(hydrabamic)、氢溴酸盐、盐酸盐、氢氯酸盐、氢碘酸盐、羟萘酸盐、羟乙磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲基磺酸盐、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、粘康酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、草酸盐、对硝基甲磺酸盐、帕莫酸盐、泛酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、邻苯二甲酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、氨基磺酸盐、对氨基苯磺酸盐、磺酸盐、硫酸盐、单宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐等。还可制备钠盐和钾盐。

实施方式可以是二铵盐。药学上可接受的盐可衍生自包括但不限于半胱氨酸的氨基酸。用于生产盐形式的化合物的方法是本领域技术人员已知的(参见例如，Stahl等，Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,Wiley-VCH；Verlag Helvetica Chimica Acta,Zurich,2002；Berge等，J.Pharm.Sci.66:1,1977)。

治疗剂的“有效量”或“治疗有效量”是足以提供与未经治疗的对象或患者中的膀胱癌相比、可观察到的治疗益处的量。

本文报道的活性剂可以与药学上可接受的载体组合以提供其药物制剂。载体和制剂的特定选择将取决于意图施予组合物的特定途径。

本文使用的“药学上可接受的载体”指不破坏与其一同制剂化的化合物的药学活性的无毒载体、佐剂、或媒介物(vehicle)。可用于本发明的组合物中的药学上可接受的载体、佐剂或媒介物包括但不限于山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸、蜡、聚乙二醇和羊毛脂。

本发明的组合物可适用于肠胃外施予、经口施予、吸入喷雾施予、局部施予、直肠施予、经鼻施予、颊粘膜施予、膀胱内施予、阴道施予或植入式贮库施予等。在一些实施方式中，制剂包含来自天然或非天然来源的成分。在一些实施方式中，制剂或载体可以无菌形式提供。无菌载体的非限制性实例包括无内毒素水或无热原水。组合物可通过膀胱内方式的施予来进行施予。

本文使用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。在特定的实施方式中，化合物经静脉内、口服、皮下或肌内施予来进行施予。本发明的组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性混悬液。上述混悬液可使用合适的分散剂或润湿剂和助悬剂，根据本领域已知的技术进行配制。无菌可注射制品还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬液。可接受的媒介物和溶剂可使用水、林格氏液和等渗氯化钠溶液等。此外，无菌的非挥发性油类被常规地用作溶剂或悬浮介质。在一些实施方式中，组合物的施予在以膀胱内方式进行。

出于该目的，可使用包括合成的单甘油酯或二甘油酯在内的任何无刺激的非挥发性油。脂肪酸及其甘油酯衍生物可用于制备可注射剂，天然的药学上可接受的油类、例如橄榄油或蓖麻油也是如此，尤其是它们的聚氧乙烯化形式。这些油性溶液或混悬液还可含有长链醇稀释剂或分散剂，如羧甲基纤维素或通常用于配制包括乳液和混悬液在内的药学上可接受的剂型的类似分散剂。其他常用的表面活性剂、例如吐温、Spans和常用于药学上可接受的固体、液体或其他剂型的制造中的其他乳化剂也可用于配制的目的。

关于口服施予，化合物或盐可以以可接受的经口剂型提供，包括但不限于胶囊、片剂、水性混悬液或溶液。在用于经口使用的片剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。还可添加润滑剂，如硬脂酸镁。关于胶囊形式的经口施予，可用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当经口使用要求水性混悬液时，活性成分可与乳化剂和悬浮剂组合。必要时，还可添加某些甜味剂、风味剂或着色剂。此外还可添加防腐剂。药学上可接受的防腐剂的合适例子包括但不限于各种抗菌剂和抗真菌剂，如溶剂，例如乙醇、丙二醇、苯甲醇、氯丁醇、季铵盐、和对羟基苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯等)。

“立即释放(immediate release)”的含义包括药物在施予后立刻开始释放的常释(conventional release)。如本文中所使用的，术语“立即释放”包括在无意推迟或延长药物的溶出或吸收的情况下使药物在胃肠道内容物中溶出的剂型。目的是使药物在施予后快速释放，例如，使其能够在溶出试验中的溶出开始后约30分钟内释放至少80％的药物。“持续释放(sustained-release)”或“缓释(extended-release)”包括以下剂型，其药物释放的时程和/或位置特征经过选择，以实现溶液或立即释放剂型等常规剂型并未提供的治疗或便利性目的。术语“稳态”意指给定活性试剂已经达到、且通过活性试剂的后续剂量维持的下述血浆水平，所述水平处于或高于给定活性试剂的最低有效治疗水平且低于给定活性试剂的最低毒性血浆水平。

本文使用的术语“剂量范围”指特定试剂的量的可接受的变化的上限和下限。通常，可以向正在经历治疗的患者施予处于所述范围内的任何量的试剂剂量。

本文使用的术语“治疗”意指减轻、降低或缓解对象的疾病的至少一种症状。例如，术语“治疗”在涉及膀胱癌时可意指阻遏、推迟发病(即，在疾病或疾病症状的临床表现之前的时期)和/或降低膀胱癌的症状发展或恶化的风险。本文使用的术语“保护”意指预防、推迟或治疗(或视情况而包括上述全部)对象中的膀胱癌的症状的发展或持续或加重。

术语“对象”或“患者”意在包括能够罹患或受膀胱癌侵袭的动物。对象或患者的例子包括哺乳动物，例如人、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因的非人动物。在某些实施方式中，对象是人，例如罹患膀胱癌、或具有罹患膀胱癌的风险、或潜在地能够罹患膀胱癌的人。

术语“约”或“大约”一般意指在给定的数值或范围的20％以内、更优选10％以内、最优选5％以内。或者，尤其是在生物学体系中，术语“约”意指大致在给定数值的优选以2为因子的数量级倍数(log)(即，数量级)以内。

除非本文中另外指出或在上下文中明显矛盾，则在描述本发明的上下文中(尤其是在所附权利要求的上下文中)使用术语“一(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”及类似指代应理解为同时涵盖单数和复数。除非另外注明，则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应理解为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。除非本文中另外指出，则本文中对数值范围的列举仅意在用作分别指代该范围内的每个单独数值的简便方法，且每个单独数值都被整合在说明书中，如同其被个别地列举于本文中。

可使用本文公开的一种或多种化合物进行治疗的示例性细胞增殖障碍包括但不限于癌症、初癌(precancer)或癌前状态、和体内组织和器官的转移性病变。细胞增殖障碍可包括增生、化生和发育异常(dysplasia)。

本文公开的化合物或其药学上可接受的盐可用于治疗或预防细胞增殖障碍、或在相对于大多数群体而言具有更高癌症发展风险的对象中治疗或预防癌症、或用于鉴定用于上述目的的合适的候选物。

药物制剂和施予途径

本文提供了用于治疗膀胱癌的、包含化合物1或其药学上可接受的盐的药物制剂。药物制剂可还包含载体或赋形剂、稳定剂、风味剂和/或着色剂。

化合物1或其药学上可接受的盐可使用本领域技术人员已知的多种给药途径进行施予。施予途径包括经口施予和膀胱内施予。在一些实施方式中，包含化合物或其药学上可接受的盐的药物制剂可以以液体、糖浆、片剂、胶囊、粉剂、撒剂(sprinkle)、咀嚼片或可溶片(dissolvable disk)的形式口服。或者，本发明的药物制剂可静脉内施予或透皮施予。其他施予途径是本领域技术人员已知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,Gennaro A.R.,Ed.,20.sup.th Edition,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.)。

在一些实施方式中，化合物或药学上可接受的盐被配制为糊剂、胶浆剂(jelly)或混悬液。例如，将药物以药物颗粒、微囊化颗粒或药物-聚合物颗粒的形式而溶解、包埋或悬浮于胶状溶液或半固体中。口服胶浆制剂的一个优点在于其更容易将药物施予至吞咽片剂、胶囊或丸剂有困难的患者。在某些实施方式中，化合物被充分地混合和悬浮于合适的基质中，以形成糊剂或凝胶。可任选地混合其他试剂，以在经口施予过程中提供风味。用蔓越莓(raspberry)和甜味剂调味的花生酱或海藻酸盐是多种合适的掩味剂的例子。在各种实施方式中，也可以用本领域已知适合局部施予的粘结剂或赋形剂来配制糊剂或凝胶。

制备片剂、胶囊或丸剂形式的持续释放制剂的方法是本领域已知的。在一些实施方式中，持续释放制剂通过用聚合物、优选水不溶性聚合物包被药物的活性成分来进行制备。例如，在药物领域中用作持续释放包衣剂、肠溶包衣剂、或胃溶包衣剂的水不溶性聚合物。水不溶性聚合物可包括例如乙基纤维素、纯化虫胶(shellac)、白虫胶、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物RS、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素、羧甲基乙基纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、甲基丙烯酸共聚物L、甲基丙烯酸共聚物LD、甲基丙烯酸共聚物S、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物E、或聚乙烯醇缩乙醛二乙氨基乙酯。

水不溶性聚合物的类型、取代程度和分子量可取决于活性成分在水或醇中的溶解度、需要的持续释放水平等。水不溶性聚合物可以单独或组合地使用。还可掺入氢化油、硬脂酸、或鲸蜡醇作为包衣助剂，以及中链甘油三酯、三乙酸甘油酯、三乙酸柠檬酸酯或鲸蜡醇作为增塑剂。在一些实施方式中，持续释放制剂是基质型的片剂或颗粒剂。活性成分可以用多达3种不同类型的聚合物包被。这三种不同类型的聚合物可包括：1)水不溶性聚合物，如乙基纤维素；2)不依赖pH的胶凝聚合物，如羟丙基甲基纤维素；和3)依赖于pH的胶凝聚合物，如海藻酸钠。这三类不同类型的聚合物可共同用于减弱药物的释放速率。

剂型：释放特性

持续释放剂型可以实现一定程度的持续效果。然而，活性成分的暴露量(exposure)和/或生物利用度可基于例如吸收窗口、制剂中使用的载体或赋形剂、制剂的递送模式、和/或活性成分通过患者的胃肠道的转运时间等多种因素而变化。

治疗剂可含有至少一个用于执行持续释放功能的持续释放部分、和一个用于执行立即释放功能的立即释放部分。在某些实施方式中，当治疗剂为单一剂型时，其可以为以下形式：片剂，其由构成持续释放部分的持续释放颗粒、与构成立即释放部分的立即释放颗粒的混合物形成；胶囊制剂，其是通过用持续释放颗粒和立即释放颗粒填充胶囊而获得的；或压制包衣片剂，其在构成持续释放部分的内芯上形成有构成立即释放部分的外层。然而，对上述实施方式没有限制。

此外，对药物在组合物中或立即释放部分或持续释放部分中的容纳状态没有特殊的限制；化合物可以均匀地分散于组合物、立即释放部分或持续释放部分中，或者可以仅在组合物、立即释放部分或持续释放部分的一部分中含有药物，或者可以以存在浓度梯度的方式含有药物。

根据本发明的组合物中的持续释放部分可含有用于控制药物释放的至少一种不依赖pH的聚合物、或依赖pH的聚合物。

本文中使用的不依赖pH的聚合物可包括电荷状态在胃肠道常见pH条件下、尤其是在pH 1至pH 8下几乎不会变化的聚合物。这意味着例如不具有电荷状态根据pH而变化的官能团、例如氨基等碱性官能团、或羧酸基等酸性官能团的聚合物。需要注意，不依赖pH的聚合物可以出于赋予根据本发明的组合物持续释放功能的目的而被包含，但也可以出于其他目的而被包含。此外，用于本发明的不依赖pH的聚合物可以不溶于水，或者可在水中溶胀或溶解而形成凝胶。

水不溶性的、不依赖pH的聚合物的例子包括但不限于纤维素醚、纤维素酯、甲基丙烯酸-丙烯酸共聚物(商品名Eudragit，由Rohm GmbH&Co.KG,Darmstadt,Germany生产)。例子包括但不限于：纤维素烷基醚，例如乙基纤维素(商品名Ethocel，由Dow ChemicalCompany,USA生产)、乙基甲基纤维素、乙基丙基纤维素或异丙基纤维素、和丁基纤维素；纤维素芳烷基醚，例如苄基纤维素；纤维素氰烷基醚，例如氰乙基纤维素；纤维素有机酸酯，例如乙酸丁酸纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素或丁酸纤维素、乙酸丙酸纤维素；丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸甲酯共聚物(商品名Eudragit NE，由Rohm GmbH&Co.KG,Darmstadt,Germany生产)、和甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物RS(商品名Eudragit RL、Eudragit RS)。对用于本发明中的水不溶性聚合物的平均粒径没有特殊限制，但通常该平均粒径越小则性能越好，平均粒径优选为0.1至100μm，更优选为1至50μm，特别优选为3至15μm，最优选为5至15μm。另外，水溶性或水溶胀性的、不依赖pH的聚合物的例子包括但不限于聚氧乙烯(商品名Polyox，由Dow Chemical Company生产，分子量为100,000至7,000,000)、低取代羟丙基纤维素(商品名L-HPC，由Shin-Etsu Chemical,Japan生产)、羟丙基纤维素(商品名HPC，由Nippon Soda,Co.,Ltd,Japan生产)、羟丙基甲基纤维素(商品名Metolose 60SH、65SH、90SH，由Shin-Etsu Chemical,Japan生产)、和甲基纤维素(商品名Metolose SM，由Shin-Etsu Chemical,Japan生产)。

在一些实施方式中，组合物中可含有单一的不依赖pH的聚合物，或者可含有多种不依赖pH的聚合物。如果用于本文报道的实施方式中，则不依赖pH的聚合物可以是不溶于水的聚合物，更优选乙基纤维素、丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸甲酯共聚物(商品名EudragitNE)、或甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物RS(商品名Eudragit RL、Eudragit RS)。特别优选的是乙基纤维素和甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物RS中的至少一种。最优选的是乙基纤维素。对组合物中含有的不依赖pH的聚合物的量没有任何特殊的限制；所述量可根据控制持续的药物释放等目的而适当调节。

能够用于本文报道的实施方式中的依赖pH的聚合物可以是电荷状态在胃肠道中常见pH条件下、尤其是在pH 1至pH 8下变化的聚合物。这意味着例如具有电荷状态根据pH而变化的官能团、例如氨基等碱性官能团、或羧酸基等酸性官能团的聚合物。依赖pH的聚合物的、依赖pH的官能团优选为酸性官能团，其中依赖pH的聚合物最优选具有羧酸基。

用于本发明中的依赖pH的聚合物可以不溶于水，或者可在水中溶胀或溶解而形成凝胶。用于本发明中的依赖pH的聚合物的例子包括但不限于肠溶性聚合物。肠溶性聚合物的例子包括但不限于甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物(Eudragit L100、EudragitS100，由Rohm GmbH&Co.KG,Darmstadt,Germany生产)、甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物(Eudragit L100-55、Eudragit L30D-55，由Rohm GmbH&Co.KG,Darmstadt,Germany生产)、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(HP-55、HP-50，由Shin-Etsu Chemical,Japan生产)、乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素(AQOAT，由Shin-Etsu Chemical,Japan生产)、羧甲基乙基纤维素(CMEC，由Freund Corporation,Japan生产)、和乙酸邻苯二甲酸纤维素。

在水中溶胀或溶解而形成凝胶的依赖pH的聚合物包括但不限于海藻酸、果胶、羧乙烯基聚合物和羧甲基纤维素。在本发明中，组合物中可含有单一的依赖pH的聚合物，或者也可含有多种依赖pH的聚合物。用于本发明中的依赖pH的聚合物优选为肠溶性聚合物，更优选为甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物、甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素或乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素，特别优选为甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物。

当在根据本发明的组合物的生产过程中使用依赖pH的聚合物时，可以使用粉末型或颗粒型的市售产品，或者使用已将依赖pH的聚合物预先分散于溶剂中的混悬型产品，或者可以将上述市售产品分散于水中或有机溶剂中使用。依赖pH的聚合物的粒径越小则性能越好，依赖pH的聚合物优选为粉末型。在甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物的情况下，一个例子是Eudragit L100-55。对用于本发明中的依赖pH的聚合物的平均粒径没有特殊限制，但平均粒径优选为0.05至100μm，更优选0.05至70μm，最优选为0.05至50μm。另外，对依赖pH的聚合物的量没有特殊限制，例如，在肠溶性聚合物的情况下，以组合物的100重量份为基准，该量一般为0.1至90重量份，优选1至70重量份，更优选5至60重量份，特别优选10至50重量份。

根据本文报道的实施方式的治疗剂还可根据需要而含有各种添加剂中的任意，如各种药学上可接受的载体中的任意，如稀释剂、润滑剂、粘结剂和崩解剂，以及防腐剂、着色剂、甜味剂、增塑剂、薄膜包衣剂等。稀释剂的例子包括但不限于乳糖、甘露醇、磷酸氢钙、淀粉、预胶化淀粉、结晶纤维素、轻质硅酸酐、合成硅酸铝、硅酸铝镁等。润滑剂的例子包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石、硬脂富马酸钠等。粘结剂的例子包括但不限于羟丙基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。崩解剂的例子包括但不限于羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素等。

防腐剂的例子包括但不限于对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯甲醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸等。着色剂的优选例子包括但不限于水不溶性色淀颜料(lake pigment)、天然色素(例如，β-胡萝卜素、叶绿素、氧化铁红)、氧化铁黄、氧化铁红、氧化铁黑等。甜味剂的优选例子包括但不限于糖精钠、甘草酸二钾、阿斯巴甜、甜叶菊等。增塑剂的例子包括但不限于甘油脂肪酸酯、柠檬酸三乙酯、丙二醇、聚乙二醇等。薄膜包衣剂的例子包括但不限于羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素等。

生产方法

为了生产本文所报道的实施方式，可以使用一种常规的方法、或者常规方法的组合。例如，将含有药物的颗粒作为持续释放部分或立即释放部分生产时，造粒是主要的操作，但其可以与其他操作组合，如混合、干燥、过筛和分类。作为造粒方法，可以使用例如向粉末添加粘结剂和溶剂并进行造粒的湿法造粒、将粉末压缩并进行造粒的干法造粒、添加加热融化的粘结剂并进行加热和造粒的熔融造粒等。

此外，关于造粒方法，还可以使用以下操作方法，如使用行星式搅拌机、螺杆搅拌机等的混合造粒法、使用Henschel搅拌机、Super搅拌机等的高速混合造粒法、使用圆筒式造粒机、旋转造粒机、螺杆挤出造粒机、制粒型(pellet mill type)造粒机等的挤出造粒法、湿式高剪切造粒法、流化床造粒法、压缩造粒法、粉碎造粒法或喷雾造粒法。造粒后，可进行使用干燥器、流化床等的干燥、粉碎和过筛，以得到使用的颗粒或细颗粒。此外，制备本发明的组合物时可使用造粒溶剂。对这类造粒溶剂没有特别的限制，可以是水或各种有机溶剂中的任何，例如水、低级醇如甲醇或乙醇、酮如丙酮或甲基乙基酮、二氯甲烷、或它们的混合物。

对于实施方式中所含有的持续释放颗粒，将至少一种药物和至少一种选自不依赖pH的聚合物与依赖pH的聚合物的物质混合，根据需要加入稀释剂和粘结剂，进行造粒而获得粒状物。所得到的粒状物用盘式干燥器、流化床干燥器等进行干燥，使用研磨机或振荡器进行筛分，从而可以得到持续释放颗粒。或者，作为本发明中生产持续释放颗粒的方法，可以使用干式压实机如辊式压实机或浆料压片机(slug tabletting machine)添加至少一种药物、至少一种选自不依赖pH的聚合物与依赖pH的聚合物的物质、以及根据需要添加的稀释剂和粘结剂，并在混合的同时进行压制成型，然后通过粉碎至合适的大小进行造粒。使用这类造粒机制备的粒状物可直接用作根据本发明的颗粒或细颗粒，或者可以使用动力磨(power mill)、辊式造粒机、转子速磨机(rotor speed mill)等进一步粉碎，筛分得到持续释放颗粒。需要注意的是，立即释放颗粒也可以按与持续释放颗粒相同的方式生产。

可以使用一种常规的方法、或者常规方法的组合来生产压制成型的产品，作为含有药物的持续释放部分或立即释放部分，或者作为本文报道的组合物。例如，使用至少一种药物、至少一种选自不依赖pH的聚合物与依赖pH的聚合物的物质、稀释剂如甘露醇或乳糖、粘结剂如聚乙烯吡咯烷酮或结晶纤维素、崩解剂如羧甲基纤维素钠或交聚维酮、和润滑剂如硬脂酸镁或滑石，使用常规方法进行压片，从而可以得到压制成型的产品。在此情况下，压片是压制成型产品的生产方法中的主要操作，但其可以与其他操作组合，如混合、干燥、糖衣成型和包衣。

压片的方法的例子包括但不限于：直接压制成型，其中将至少一种药物和药学上可接受的添加剂混合在一起，然后使用压片机将混合物直接压制成型为片剂；以及干粒压制或湿粒压制，其中在根据需要添加润滑剂或崩解剂后，将根据本发明的持续释放颗粒或立即释放颗粒进行压制成型。对压制成型中使用的压片机没有任何特殊的限制，可使用例如单冲压片机、旋转压片机或压制包衣型压片机(press-coated tabletting machine)。

根据本文的实施方式的含有药物的持续释放颗粒或立即释放颗粒、或压制成型产品可以以颗粒或片剂的形式作为组合物使用，但也可以进行进一步加工以生产组合物。例如，压制成型产品或颗粒可以使用如乙基纤维素、酪蛋白、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸共聚物L、乙酸邻苯二甲酸纤维素、虫胶等的薄膜基材进行薄膜包被，或者使用含有蔗糖、糖醇、阿拉伯胶粉、滑石等的糖衣液进行糖衣包被，从而生产薄膜包衣片剂或糖衣片剂。该包衣技术中的一种溶剂可以是纯化水，但也可使用有机溶剂如醇、酮、醚、氯化烃、或它们的混合物。此外，作为包被装置，可以使用在用于生产药物的包被技术中通常使用的装置，例子包括通过喷雾包衣液等进行包衣的喷雾包衣装置、和用于分层的转子流化床造粒机。

在生产胶囊制剂的情况下，可以通过使用自动胶囊填充机将上述持续释放颗粒或立即释放颗粒或微型片剂填充至硬明胶胶囊或HPMC胶囊中来制造胶囊制剂。或者，在用于逐管施予(per-tube administration)的制品或服用时与水等混合使用的干糖浆的情况下，上述持续释放颗粒或立即释放颗粒可以与增稠剂或分散剂混合，从而使这些颗粒分散，再将混合物制成颗粒或片剂。此外，可以使用水、以及选自分散剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、pH调节剂、甜味剂、风味剂、香料等的物质制备液体或胶浆剂。然而，关于其他生产方法，对以上内容没有限制。

为了可以更充分地理解本文描述的实施方式，给出以下实施例。应当理解的是，这些实施例仅用于说明性目的，不应被解释为限制。

实施例

以下缩写可用于全部实施例。

All：烯丙基

DMT：4,4’-二甲氧基三苯甲基

(DMTO-：

)

Bz：苯甲酰基

Hunig碱：i-Pr₂NEt(二异丙基乙胺)

AllylOH：烯丙醇

OAll：-OCH₂CHCH₂

ACN：乙腈

All：-CH₂CHCH₂

2-NitroBnBr：2-硝基苄溴

Bz：苯甲酰基

i-Pr：异丙基

CE：氰乙基

DEAD：偶氮二甲酸二乙酯

DIAD：偶氮二甲酸二异丙酯

DCM：二氯甲烷

DDTT：N,N-二甲基-N'-(3-硫代-3H-1,2,4-二噻唑-5-基)甲脒

DMOCP：2-氯-5,5-二甲基-1,3,2-二氧磷杂环己烷2-氧化物

TBS：叔丁基二甲基甲硅烷基

3H-苯并[c][1,2]二硫醇-3-酮：

实施例1：化合物1a的合成

该合成的完整路线可得自图1。

步骤A

在环境温度下，向(2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟四氢呋喃-3-基(2-氰乙基)二异丙基亚磷酰胺(化合物100)(磷非对映异构体的混合物；80.0g，91.332mmol，1当量，ChemGenes Corporation目录号#ANP-9151)、烯丙醇(9.63ml，142mmol，1.55eq)和三苯基膦(38.3g，146mmol，1.60当量)在THF(1.1L)中的混合物中添加DEAD(甲苯中的40wt％溶液；54.2ml，137mmol，1.5当量)。在环境温度下继续搅拌并通过LC/MS监控反应。完成后(19小时)，真空(35℃)浓缩混合物，将得到的混合物通过硅胶柱色谱纯化(800g x 2根柱，用0.5％三乙胺缓冲的正庚烷中的40至60％EtOAc)，由此得到作为白色泡沫的化合物101(84.2g，定量产率，磷非对映异构体的混合物)。

¹H NMR(磷非对映异构体的3:2混合物，400MHz，CDCl₃)δ1.14-1.21(m,12H)2.40(t,J＝6.2Hz,1.2H)2.59(t,J＝6.2Hz,0.8H)3.27(d,J＝8.6Hz,1H)3.52-3.66(m,5H)3.78(s2.4H)3.79(s 3.6H)4.28-4.34(m,1H)4.84-4.96(m,0.4H)4.99(d,J＝5.5Hz,2H)4.95–5.10(m,0.6H)5.05(d,J＝10.9Hz,1H)5.22(br d,J＝17.6Hz,1H)5.64(br d,J＝53.2Hz,0.6H)5.70(br d,J＝51.6Hz,0.4H)5.96–6.75(m,1H)6.20(d,J＝16.0Hz,0.6H)6.24(d,J＝17.2Hz,0.4H)6.74-6.79(m,4H)7.02–7.06(m,2H)7.17-7.24(m,8H)7.32-7.34(m,2H)7.41-7.44(m,2H)8.11(s,1H)8.52(s,0.4H)8.54(s,0.6H)。

步骤B

向化合物101(3.00g，3.28mmol，1当量)的乙腈溶液(30ml)中添加水(0.118ml，6.55mmol，2.0当量)和吡啶三氟乙酸盐(0.759g，3.93mmol，1.2当量)。在环境温度下搅拌1分钟后，添加叔丁基胺(14.5g，21.0ml，0.20mol，60当量)。在完全脱去氰乙基后(通过LC/MS监控)，在真空中浓缩反应混合物并与乙腈共沸两次。将粗混合物在环境温度下溶解于DCM(45.0ml)中并用水(0.118ml，6.55mmol，2.0当量)和NaHSO₄-SiO₂(1.18g，6.55mmol，2当量)处理。在完全脱去DMT基后(通过LC/MS监控，约1小时)，过滤反应混合物并用DCM/MeOH(9/1，20ml)冲洗两次。将合并的滤液在真空中浓缩并用正庚烷/甲苯的1:1混合物(～30ml)处理。倾析去除顶层。用正庚烷/甲苯(1/1，30ml)再一次重复相同操作，然后将底层与乙腈共沸两次，由此得到化合物102(假设理论产率100％)。将产物不进行进一步纯化地用于下一步骤中。

步骤C

向化合物102(1.56g，3.27mmol，1当量)和化合物101(3.00g，3.28mmol，1当量)在乙腈(30ml)中的混合物中添加吡啶三氟乙酸盐(与吡啶共沸干燥，0.760g，3.94mmol，1.25当量)。5分钟后，添加DDTT(0.840g，4.09mmol，1.30当量，ChemGenes Corporation目录号#RN-1588)，并在完全硫化后(通过LC/MS监控)，在真空中浓缩反应混合物。将残余物溶解于DCM(30ml)中并用水(0.57ml，32mmol，10当量)和DCM(30ml)中的6％二氯乙酸(1.56g，18.9mmol，6.0当量)处理。20分钟后，用吡啶(20ml)淬灭反应并在真空中浓缩。残余物与吡啶共沸，由此得到化合物103(3.22g，假设理论产率100％)。将产物不进行进一步纯化地用于下一步骤中。

步骤D

在环境温度下，向化合物103(3.22g，3.15mmol，1当量)的吡啶溶液(100ml)中添加DMOCP(1.45g，7.88mmol，2.50当量)。完全大环化之后(通过LC/MS监控)，添加水(1.7ml，94.5mmol，10倍于DMOCP)，再添加3H-苯并[c][1,2]二硫醇-3-酮(0.795g，4.73mmol，1.5当量)。完全硫化后(约40分钟)，将反应混合物在真空中部分浓缩至约15ml，并倾入饱和NaHCO₃水溶液(50ml)与水(30ml)的混合物中。在环境温度下搅拌10分钟后，将混合物用1:1混合的EtOAc/MTBE萃取(60ml x 3次)。合并有机层，用盐水(25ml)洗涤，用MgSO₄干燥并真空浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱(DCM中的0-20％MeOH)纯化，由此得到作为棕色油状物的化合物104(3.31g，3.20mmol，假设理论产率100％)。将产物不进行进一步纯化地用于下一步骤中。

步骤E

向化合物104(3.31g，3.20mmol，1当量)的乙腈溶液(66.2ml)中添加2-硝基溴苄(2.42g，11.2mmol，3.50当量)和三乙胺(1.78ml，12.8mmol，4.00当量)。经完全反应(通过LC/MS监控，环境温度下约20小时)，真空浓缩反应混合物，并通过硅胶柱色谱(60％乙酸乙酯/正庚烷至100％乙酸乙酯)纯化，由此得到0.568g作为磷非对映异构体混合物的产物。将非对映异构体通过制备型HPLC分离，由此得到化合物105(SR异构体，0.225g，0.180mmol，自化合物101的总产率为5.6％)和化合物106(RR异构体，0.187g，0.149mmol，自化合物101的总产率为4.7％)。

化合物105(SpRp)¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝8.63(s,1H),δ＝8.61(s,1H),8.04–8.00(m,2H),7.99(s,1H),7.90(s,1H),7.65-7.44(m,8H),7.40-7.31(m,4H),7.25-7.21(m,4H),6.15-5.89(m,5H),5.61(dd,J＝52.0,5.1Hz,1H),5.55(ddd,J＝51.2,4.7,2.7Hz,1H)5.51-5.42(m,1H),5.31-5.22(m,2H),5.11(dd,J＝3.9,9.8Hz,2H),5.04-4.95(m,4H),4.55-4.37(m,7H),4.29-4.12(m,3H)。

化合物106(RpRp)¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝8.65(s,2H),8.06(dd,J＝1.4,8.0Hz,2H),7.98(s,2H),7.57-7.52(m,6H),7.47-7.32(m,6H),7.25-7.21(m,4H),6.15(d,J＝18.7Hz,2H),6.09-5.99(m,2H),5.82-5.76(m,2H),5.60(dd,J＝51.8,4.9Hz,2H),5.27(dd,J＝1.2,17.2Hz,2H),5.12(dd,J＝1.0,10.4Hz,2H),5.06-4.96(m,4H),4.55-4.40(m,4H),4.36-4.24(m,4H),4.21-4.02(m,2H)。

制备型HPLC条件：

步骤F

向经加热的(90℃)化合物105(519mg，0.414mmol，1当量)的甲苯溶液(519ml)中添加Hoveyda-Grubbs Catalyst^TM第2代((1,3-双-(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基)二氯(邻异丙氧基苯亚甲基)合钌，可购自

目录号569755，CAS301224-40-8，91mg，0.15mmol，0.35当量)和苯醌(0.102ml，1.243mmol，3当量)。加热混合物使其回流，通过LC/MS监控反应进程。3小时后，添加额外的催化剂(91mg，0.15mmol，0.35当量)，再继续反应3小时。冷却后，在环境温度下用DMSO(0.59ml，8.3mmol，20当量)处理混合物15小时，在真空中浓缩并通过硅胶柱色谱纯化(SiO₂ 25g，正庚烷中的66％乙酸乙酯至100％乙酸乙酯)，由此得到作为棕色干泡沫的化合物107(200mg，0.163mmol，产率39％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝8.19(s,1H),8.12(dd,J＝7.8Hz,1.9Hz,1H),8.10(s,1H),8.02(d,J＝8.2Hz,1H),7.89(s,1H),7.63(br d,J＝7.0Hz,1H),7.53-7.41(m,10H),7.35-7.30(m,2H),7.25-7.20(m,4H),6.23(d,J＝17.6Hz,1H),6.14(d,J＝18.8Hz,1H),5.86-5.75(m,1H),5.75(dt,J＝15.3,5.0Hz,1H),5.67(dt,J＝15.3,4.7Hz,1H),5.60(dd,J＝52.0,3.9Hz.1H),5.48(dd,J＝50.4,3.9Hz.1H)5.50–5.39(m,1H),4.91-4.64(m,4H),4.57-4.25(m,9H),4.15(d,J＝7.03Hz,1H),4.11(d,J＝7.03Hz,1H)。

步骤G

向化合物107(88mg，0.072mmol，1当量)的1,4-二氧杂环己烷溶液(1.76ml)中添加苯硫酚(0.88ml，8.55mmol，119当量)和三乙胺(0.88ml，6.31mmol，88当量)。在环境温度下搅拌所得到的混合物。经完全反应(通过LC/MS监控，13小时)，添加甲醇(5.28ml)和28％氢氧化铵(3.52ml)，将得到的混合物加热至50℃。经完全反应(通过LC/MS监控，5小时)，将混合物冷却至环境温度，过滤得到的褐色浆料并用水(15ml)冲洗。将滤液再次过滤以去除额外的固体。将最终滤液用甲烷和庚烷的1:1混合物(30ml)萃取两次。将水层真空浓缩，然后再次悬浮于水(6ml)中。滤去得到的固体并将滤液进行制备型HPLC，由此得到作为白色固体的化合物1二铵盐(也被称为化合物1a)(39mg，0.050mmol，产率70％)。

化合物1a(SpRp，反式)¹H NMR(400MHz，CD₃OD)δ＝9.05(s,1H),8.33(s,1H),8.25(s,1H),8.12(s,1H),6.34(br s,2H),5.88(br s,2H),5.66(br d,J＝51.6Hz,1H),5.59(brd,J＝52.2Hz,1H)5.01(br s,2H),4.68-4.34(m,6H),4.07-3.82(m,2H),3.79-3.55(m,2H)；31P NMR(162MHz,CD3OD)δ＝55.48(s,1P),55.16(s,1P)。

化合物1a制备型HPLC条件：

实施例1.1：化合物1a的替代合成

化合物1a的替代合成途径阐述于图2A和图2B以及图2C中，并报告如下。

阶段1

将化合物129(570g，1.53mol，1wt，1vol，1当量)溶解于吡啶(2.85L，35.2mol，4.89wt，5.0vols，23当量)中。将混合物冷却至2.6℃，并用4,4’-二甲氧基三苯甲基氯(DMTCL，543g，1.60mol，0.953wt，1.05当量)处理。在0至5℃下搅拌混合物2小时，然后使其升温至环境温度。通过LC/MS监控反应，搅拌过夜后确认到完全转化。将反应混合物冷却至5℃以下，用MeOH(124ml，3.05mol，0.172wt，0.217vol，2.0当量)处理15分钟淬灭。将混合物与甲苯(2.00L，3.04wt，3.51vol)在真空下共蒸发，然后用EtOAc(2.850L，4.5wt，5.0vol)和正庚烷(2.85L，3.42wt，5.0vol)的混合物稀释。将有机层用饱和NaHCO₃(9wt％水溶液，2.0L，3.5vol)洗涤。添加额外的EtOAc(2.85L，4.5wt，5.0vol)，完全溶解粗产物。搅拌5分钟后，将两层分离。将有机层用水(2.0L，3.5wt，3.5vol)洗涤。固体开始缓慢地自有机层沉淀出来。将水层分离。然后将有机层浓缩至约1vol。将粗产物用正庚烷(2.00L，2.40wt，3.51vol)和甲苯(0.50L，0.76wt，0.88vol)的混合物拌浆。搅拌15分钟后，通过真空过滤收集浅黄色固体。将滤饼依次用(1)正庚烷(0.60L，0.72wt，1.05vol)和甲苯(0.30L，0.46wt，0.53vol)的混合物；和(2)正庚烷(3.00L，3.6wt，5.26vol)冲洗。将固体不加热地干燥30分钟，然后转移至托盘中，在真空烘箱中于50℃干燥过夜，由此得到作为浅黄色固体的化合物130(996.7g，1.47mol，1.75wt，产率97％)。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.99(s,1H),8.76(s,1H),8.21(s,1H),8.04-8.00(m,2H),7.64-7.59(m,1H),7.57-7.50(m,2H),7.41-7.36(m,2H),7.32-7.15(m,7H),6.83-6.76(m,4H),6.31(dd,J＝2.5,17.0Hz,1H),5.68(ddd,J＝2.3,4.7,52.7Hz,1H),4.88-4.77(m,1H),4.26-4.21(m,1H),3.77(s,6H),3.57(dd,J＝3.1,10.9Hz,1H),3.43(dd,J＝4.1,10.7Hz,1H),2.60(br s,1H)

阶段1’

将化合物129(430g，1.15mol，1wt，1vol，1当量)和咪唑(118g，1.73mol，0.274wt，1.50当量)溶解于DMF(1.72L，3.78wt，4.0vol)中，将得到的混合物冷却至5℃。添加TBS-Cl(191g，1.27mol，0.444wt，1.10当量)。在0至11℃搅拌混合物2小时，使其缓慢地升温至环境温度(通过LC/MS监控反应)。反应完成于TBS-Cl添加6小时后，但仍允许在环境温度下继续搅拌20h。将混合物冷却至2℃，用甲醇(93ml，74g，2.3mol，0.17wt，0.22vol，2.0当量)处理10分钟。将反应混合物依次用MTBE(1.72L，1.23kg，2.96wt，4.0vol)和EtOAc(1.72L，1.55kg，3.60wt，4.0vol)的混合物、饱和NH₄Cl(28wt％水溶液，2.15L，5.0vol)进行稀释。固体开始缓慢地自溶液中沉降出来。使混合物升温至24℃并添加水(1.08L，1.08kg，2.5wt，2.5vol)至(内部温度(T-internal)＝22℃)。更多的固体开始自混合物中沉淀出来。将额外的水(1.08L，1.08kg，2.5wt，2.5vol)和MTBE(1.40L，1.04kg，2.4wt，3.3vol)添加至混合物。通过真空过滤收集灰白色(off-white)固体。将反应器用水(320ml，0.74vol)、然后用MTBE(1.80L，1.33kg，3.10wt，4.19vol)冲洗，以将任何剩余的固体转移至滤器。将滤饼依次用(1)水(1.80L，1.80kg，4.2wt，4.2vol)；(2)水(1.80L，1.80kg，4.2wt，4.2vol)；(3)MTBE(0.90L，0.67kg，1.5wt，2.1vol)和正庚烷(0.90L，0.62kg，1.4wt，2.1vol)的混合物；(4)MTBE(0.90L，0.67kg，1.5wt，2.1vol)和正庚烷(0.90L，0.62kg，1.4wt，2.1vol)的混合物冲洗。将回收的固体在真空下于40℃干燥2天，由此得到作为白色固体的化合物133(483g，0.991mol，1.12wt，产率86％)。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.97(s,1H),8.82(s,1H),8.36(s,1H),8.04-8.00(m,2H),7.64-7.58(m,1H),7.56-7.51(m,2H),6.40(dd,J＝2.3,16.0Hz,1H),5.45(ddd,J＝2.7,4.3,53.1Hz,1H),4.75-4.66(m,1H),4.22-4.17(m,1H),4.07(dd,J＝2.3,11.7Hz,1H),3.91(dd,J＝2.7,11.7Hz,1H),2.38(dd,J＝2.7,7.0Hz,1H),0.92(s,9H),0.11(s,3H),0.11(s,3H)。

阶段2

将化合物130(993g，1.47mol，1wt，1vol，1当量)和咪唑(150g，2.20mol，0.151wt，1.5当量)溶解于DMF(3.48L，3.28kg，3.3wt，3.5vol)中，将混合物冷却至5℃。添加TBS-Cl(244g，1.62mol，0.245wt，1.10当量)。在0至5℃下搅拌混合物2小时，使其缓慢地升温至环境温度并通过LC/MS监控。17小时后，添加额外的咪唑(100g，1.47mol，0.10wt，1.0当量)和TBS-Cl(111g，735mmol，0.112wt，0.50当量)，继续在环境温度下搅拌2小时，并于35℃搅拌2小时。将得到的混合物冷却至13.6℃，用MeOH(119ml，2.94mol，2.0当量)处理10分钟。向另外的反应器中加入冰(5kg，5wt)和饱和NH₄Cl(28wt％水溶液，5.0L，5.0vol)。将反应混合物添加至冰/NH₄Cl混合物。灰白色固体立刻开始自溶液中沉降出来。将额外的2kg冰(2kg，2wt)和水(3.0L，3vol)添加至混合物。将反应瓶用水(0.50L，0.5vol)冲洗，将冲洗液添加至混合物。将正庚烷(2.00L，2vol)添加至混合物，并继续搅拌10分钟。通过真空过滤收集灰白色固体。将滤饼用(1)水(4.0L，4.0vol)；(2)水(4.0L，4.0vol)；(3)正庚烷(4.0L，4.0vol)；(4)正庚烷(4.0L，4.0vol)冲洗。将回收的固体于45℃真空干燥4天，由此得到作为灰白色固体的化合物131(1.095kg，1.39mol，1.10wt，产率94％)。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝9.09(s,1H),8.78(s,1H),8.28(s,1H),8.02(d,J＝7.4Hz,2H),7.63-7.59(m,1H),7.55-7.50(m,2H),7.37(d,J＝7.1Hz,2H),7.29-7.17(m,7H),6.79(d,J＝7.9Hz,4H),6.29(dd,J＝2.9,16.2Hz,1H),5.60(ddd,J＝2.7,3.9,53.1Hz,1H),4.78(ddd,J＝4.7,6.4,15.8Hz,1H),4.26-4.22(m,1H),3.77(s,6H),3.58(dd,J＝3.1,10.9Hz,1H),3.26(dd,J＝3.7,10.7Hz,1H),0.85(s,9H),0.10(s,3H),0.02(s,3H)

阶段3

将化合物131(1000g，1.27mol，1wt，1vol，1当量)和反式-2-丁烯-1,4-二醇(烯烃几何结构已通过¹H NMR证实；335g，3.80mol，0.335wt，3.0当量)与THF(3.0L，3.0vol)共沸两次。将残余物溶解于THF(10L，10vol)和甲苯(15L，15vol)的混合物中。添加三苯基膦(432g，1.65mol，0.432wt，1.3当量)，然后将反应混合物冷却至-5℃。经20分钟缓慢地添加DIAD(0.320L，1.65mol，333g，0.333wt，0.320vol，1.3当量)，同时将内部温度维持为5℃以下。在0至5℃搅拌混合物1小时，并通过LC/MS监控。去除冰浴，并使混合物升温至室温。搅拌过夜(17小时)后，添加三苯基膦(83g，0.32mol，0.083wt，0.25当量)和DIAD(62ml，0.32mol，64g，0.064wt，0.062vol，0.25当量)。在室温下经过额外的1小时后，将反应混合物用MTBE(10L，10vol)稀释，用半饱和NaCl(18wt％水溶液，2x 4L)洗涤两次并真空浓缩至稠油状。将混合物重新溶解于MTBE(4.00L，4vol)和正庚烷(0.50L，0.5vol)的混合物中，然后冷却至0℃。将三苯基氧化膦的种晶添加至溶液中。固体开始缓慢自溶液中沉淀出来，搅拌过夜。真空过滤收集白色固体，并用MTBE(2L，2vol)洗涤，由此分离出540g三苯基氧化膦。浓缩滤液，通过Biotage 150L KP-Sil(SiO₂ 5kg；用Hep/etOAc中的1％TEA预处理；洗脱液：庚烷/EtOAc(48L含1％TEA的33％EtOAc，24L含1％TEA的50％EtOAc，24L含1％TEA的66％EtOAc)→100％含1％TEA的EtOAc)纯化。通过TLC(2:1EtOAc/正庚烷)监控柱。合并纯净的产物级分，并真空浓缩，由此得到作为浅白色(pale white)泡沫固体的化合物132(634g，含有14wt％DIAD衍生的副产物，净545g，0.63mol，调整后产率50％)。合并混合物级分，在真空下浓缩，由此得到浅黄色泡沫固体(750g)，将其通过Biotage 150M HP-Sphere(5kg SiO₂；用Hep/etOAc中的1％TEA预处理；用甲苯洗脱液加载样品：Hep/EtOAc/1％TEA(12L含1％TEA的50％EtOAc，16L含1％TEA的66％EtOAc)→含1％TEA的EtOAc)进行再纯化。通过TLC(2/1/0.03EtOAc/正庚烷/TEA)监控柱。合并纯净的产物级分，并真空浓缩，由此得到额外的作为浅白色泡沫固体的化合物132(206g，0.24mol，产率18％)。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.58(s,1H),8.10(s,1H),7.43-7.37(m,2H),7.32-7.28(m,2H),7.24-7.15(m,8H),7.03-6.98(m,2H),6.78-6.73(m,4H),6.18(dd,J＝2.7,17.2Hz,1H),5.88(td,J＝5.5,15.6Hz,1H),5.77(td,J＝5.1,15.6Hz,1H),5.60(ddd,J＝2.7,4.3,53.1Hz,1H),5.03-4.96(m,2H),4.91(ddd,J＝4.5,6.6,16.6Hz,1H),4.18-4.14(m,1H),3.88-3.82(m,2H),3.78(s,6H),3.52(dd,J＝2.7,10.9Hz,1H),3.14(dd,J＝3.5,10.9Hz,1H),0.85(s,9H),0.10(s,3H),0.01(s,3H)

阶段4

将化合物132(800g，0.930mol，1wt，1vol，1当量)和化合物133(522g，1.07mol，0.652wt，1.15当量)与THF(2x 3L，2x3.8vol)共沸干燥，并于室温下重新溶解于THF(9.60L，8.45kg，12.0vol)中。添加三苯基膦(317g，1.21mol，0.396wt，1.30当量)，并将混合物冷却至-5℃以下。添加DIAD(226ml，1.16mol，235g，0.294wt，0.283vol，1.25当量)，内部温度为7℃以下。使反应缓慢地升温至室温。通过LC/MS监控反应。21小时后，将反应混合物真空浓缩至稠油状，并与正庚烷(2.00L，1.37kg，1.71wt，2.50vol)共沸，然后重新溶解于MTBE(2.40L，1.78kg，2.2wt，3.0vol)和正庚烷(800ml，547g，0.68wt，1.0vol)的混合物中。向溶液中加入三苯基氧化膦种晶，并冷却至5℃，用正庚烷(400ml，274g，0.34wt，0.50vol)稀释并于5℃搅拌30分钟。真空过滤收集白色固体沉淀，用MTBE和正庚烷的2:1(v/v)混合物(1.8L)冲洗，由此得到三苯基氧化膦(455g)。真空浓缩滤液，并通过Biotage 150L KP-Sil(SiO₂ 5kg；用1％TEA预处理；通过溶解于甲苯洗脱液中上样：9:1庚烷/EtOAc(16L)加15TEA，3.6:1(46L)，2:1(20L)加1％TEA，1:1(30L)加1％TEA，以及100％EtOAc(16L)加1％TEA)进行纯化。真空浓缩被合并的纯净产物级分，由此得到作为灰白色固体泡沫的化合物134(662.2g)。合并混合物级分，并于真空下浓缩(480g)。真空过滤去除在加载至Biotage150L之前由甲苯(300ml)稀释而形成的白色不溶性固体。通过Biotage 150M HP-Sphere(SiO₂ 5kg(用1％TEA预处理)；通过溶解于甲苯洗脱液中加载样品；2:1庚烷/EtOAc(26L)w/1％TEA，1:1(25L)w/1％TEA，1:4(34L)w/1％TEA)纯化。通过TLC(1:1庚烷/EtOAc)监控柱。将合并的纯净产物级分于真空下浓缩，由此得到额外的作为灰白色固体泡沫的化合物134(165.5g，共计662.2+165,5g＝827.7g，930mmol，1.03wt，产率67％)。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.47(s,1H),8.39(s,1H),8.20(s,1H),8.01(s,1H),7.38-7.31(m,5H),7.27-7.19(m,6H),7.14-7.06(m,3H),6.93-6.87(m,2H),6.76(d,J＝8.6Hz,4H),6.26(dd,J＝2.0,16.0Hz,1H),6.15(dd,J＝2.7,17.2Hz,1H),5.86(dd,J＝4.7,15.2Hz,1H),5.80(dd,J＝4.7,15.2Hz,1H),5.51(ddd,J＝2.7,4.3,52.8Hz,1H),5.31(ddd,J＝2.0,4.3,52.8Hz,1H),4.87(d,J＝4.7Hz,2H),4.85-4.81(m,1H),4.79(d,J＝4.3Hz,2H),4.71-4.59(m,1H),4.20-4.13(m,2H),4.06(dd,J＝2.7,11.3Hz,1H),3.90(dd,J＝2.7,11.7Hz,1H),3.77(s,6H),3.52(dd,J＝3.1,10.9Hz,1H),3.18(dd,J＝3.9,10.9Hz,1H),0.92(s,9H),0.84(s,9H),0.10(s,3H),0.09(s,6H),0.07(s,3H)。

阶段5～6

向化合物134(410.7g，309mol，1wt，1vol，1当量)的吡啶溶液(1.23L，1.21kg，15.2mol，2.9wt，3.0vol，49当量)中添加亚磷酸二苯酯(90ml，109g，0.46mol，0.26wt，0.22vol，1.5当量)。将反应于室温搅拌并通过LCMS监控。2小时后(80％转化)，添加额外的亚磷酸二苯酯(29.9ml，36.2g，155mmol，0.088wt，0.073vol，0.50当量)。额外的1小时后，添加额外的亚磷酸二苯酯(6.0ml，7.2g，31mmol，0.018wt，0.015vol，0.10当量)，继续反应0.5小时(98％转化)。将反应混合物添加至饱和NaHCO₃(9wt％水溶液，2.1L，5vol)和水(1.0Lml，2.5vol)的混合物中，同时保持内部温度为4.7至12℃。将反应器用少量EtOAc冲洗。室温下继续搅拌30分钟，并通过LCMS监控(100％转化)。将反应混合物用EtOAc和MTBE的1:1混合物(2x 8.2L，2x 20vol)萃取两次。将合并的有机层用水(4.1L，10vol)洗涤，真空浓缩并与甲苯共沸(3x 4.1L，3x 10vol；连续投料)以去除吡啶，由此得到化合物135(剩余0.55当量吡啶)。

阶段6–在环境温度下，将粗化合物135溶解于二氯甲烷(3.08L，4.07kg，9.9wt，7.5vol)中。添加水(55.7ml，0.136vol，10当量)，然后添加二氯乙酸(77ml，120g，0.93mol，0.29wt，0.19vol，3.0当量)的DCM溶液(3.08L，7.5vol)，同时保持内部温度为25℃以下。(转变为橙色溶液)。30分钟后，添加三乙基硅烷(Et₃SiH；494ml，359g，3.09mol，0.875wt，1.20vol，10.0当量)，并继续搅拌20分钟。添加三乙胺(431ml，313g，3.09mol，0.762wt，1.05vol，10.0当量)(内部温度从17.8℃至22℃)。将混合物浓缩至1.55kg(3.8wt)，重新溶解于EtOAc(6.2L，5.5kg，14wt，15vol)中，依次用(1)水(1.0L，2.5vol)和饱和NaHCO₃(9wt％水溶液，0.82L，2.0vol)洗涤。将粗产物EtOAc溶液(0.82L，2.0vol)储存于-20℃过夜，次日，将溶液于25℃真空浓缩。将得到的粗混合物用(1)正庚烷(3.01L，7.5vol)，(2)正庚烷(2.46L,6.0vol)和甲苯(0.82L，2.0vol)的混合物研磨。弃去溶液部分(上清液)，将剩余在底部的固体溶解于乙腈(4.1L，10vol)中。25℃下真空浓缩混合物，并与乙腈共沸两次，由此得到化合物136。将产物不经纯化地用于后续阶段(假设理论产率100％)。

阶段7

阶段7a：在室温下，将化合物136(337g，309mmol，1wt，1vol，1当量)溶解于无水吡啶(13.5L，13.2kg，39wt，40vol)中。添加三乙胺(129ml，927mmol，94g，0.28wt，0.38vol，3.0当量)，再添加2-氯-5,5-二甲基-1,3,2-二氧磷杂环己烷2-氧化物(DMOCP；103g，556mmol，0.31wt，1.80当量)。将得到的混合物在环境温度下搅拌30分钟，通过LCMS监控(100％转化)，由此生成化合物137。

步骤7b：将TEA(129ml，927mmol，94g，0.28wt，0.38vol，3.0当量)、水(100ml，5.56mol，0.30wt，0.30wt，18当量)和硫(34.7g，1.08mol，0.10wt，3.5当量)添加至上述化合物137的混合物中。90分钟后(100％转化)，添加NaHCO₃(9wt％水溶液，3.37L，10vol)，同时保持内部温度为30℃以下(16.6℃至27℃)。将得到的混合物过滤以去除盐。真空浓缩滤液混合物，用MTBE(5.1L，15vol)稀释，并用NaCl(30wt％水溶液，2x 1.35L，2x 4vol)洗涤两次。滤除不可溶的固体，将滤液真空浓缩并与甲苯(4.0L，12vol)共沸。过滤去除得到的固体，并将粗混合物溶解于甲苯中，通过Biotage150L KP-Sil(SiO₂ 5kg；用Hep/EtOAc/TEA(1.5/1.5/0.03CV)预处理；用：EtOAc/TEA(3/0.03CV)、EtOAc/MeOH/TEA(4/0.2/0.04CV)、EtOAC/MeOH/TEA(2/0.2/0.02CV)洗脱)纯化。通过TLC(EtOAc/MeOH/TEA＝9/1/0.1)监控柱。合并含有Sp异构体的级分，真空浓缩，由此得到作为浅粉色泡沫固体的化合物138(Sp异构体；154g，128mmol，0.46wt，产率41.3％)。合并含有Rp异构体的级分，在真空下浓缩，由此得到作为浅粉色泡沫固体的化合物240(Rp异构体；64g，53mmol，0.19wt，产率17％)。

化合物138(Sp异构体)：

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.51(s,1H),8.50(s,1H),8.22(s,1H),8.14(s,1H),7.49–7.44(m,2H),7.38-7.27(m,4H),7.25-7.21(m,2H),7.14(t,J＝7.1Hz,2H),6.44(dd,J＝2.5,13.9Hz,1H),6.18(d,J＝15.2Hz,1H),5.78(td,J＝6.3,15.6Hz,1H),5.69(td,J＝4.7,15.6Hz,1H),5.56(dd,J＝3.9,50.8Hz,1H),5.20-5.06(m,1H),4.95-4.79(m,4H),4.69(dd,J＝4.3,16.0Hz,1H),4.54-4.38(m,3H),4.35(d,J＝5.5Hz,1H),4.32-4.29(m,1H),4.05(dd,J＝1.6,11.7Hz,1H),3.91(dd,J＝3.1,11.7Hz,1H),3.14-3.06(m,6H),1.30(t,J＝7.4Hz,9H),0.91(s,9H),0.90(s,9H),0.12(s,3H),0.08(s,3H),0.06(s,3H),0.05(s,3H)

化合物240(Rp异构体)：

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.54(s,1H),8.38(s,1H),8.33(s,1H),8.01(s,1H),7.39-7.09(m,10H),6.39(dd,J＝2.3,14.1Hz,1H),6.13(d,J＝17.2Hz,1H),5.72(d,J＝3.1Hz,2H),5.68(dd,J＝4.3,51.2Hz,1H),5.43-5.29(m,1H),5.10-4.96(m,3H),4.90-4.83(m,2H),4.78-4.72(m,1H),4.52(ddd,J＝3.9,6.6,17.2Hz,1H),4.44–4.35(m,2H),4.31-4.26(m,1H),4.20–4.12(m,2H),3.87(dd,J＝3.5,11.7Hz,1H),3.79-3.77(m,1H),3.15-3.09(m,6H),1.33(t,J＝7.4Hz,9H),0.94(s,9H),0.89(s,9H),0.13(s,3H),0.12(s,3H),0.10(s,3H),0.09(s,3H)

阶段8

将化合物138(221g，183mmol，1wt，1vol，1当量)溶解于吡啶(530ml，6.56mol，519g，2.3wt，2.4vol)和TEA(2.65L，19.0mol，1.93kg，8.7wt，12vol，104当量)的混合物中。添加三乙胺三氟化氢(264ml，1.62mol，262g，1.2wt，1.2vol，8.9当量络合物，27当量HF)，在室温下搅拌混合物，同时通过LCMS监控转化。3小时后(97％转化)，添加甲氧基三甲基硅烷(TMSOMe；1.40L，10.2mol，1.06kg，4.8wt，6.3vol，55当量)，并继续搅拌30分钟。粘稠的固体包被反应器。弃去溶液部分(上清液)。将固体用甲苯(2x 2.2L，2x 10vol；弃去上清液)研磨两次。将反应器中剩余的粗固体溶解于二氯甲烷(2.2L，10vol)中，并用NH₄Cl(28wt％水溶液，2.2L，10vol)洗涤。将水层用二氯甲烷(2.2L，10vol)反萃取。将合并的有机层用NaCl(36wt％水溶液，1.1L，5vol)和水(1.1L，5vol)的混合物洗涤，然后真空浓缩，由此得到作为棕褐色干燥泡沫的化合物139(152g，155mmol，0.70wt，产率85％)。将粗产物不经纯化地用于下一步骤。

阶段9

将化合物139(150g，153mmol，1wt，1vol，1当量)和乙腈(4L，27vol)共沸，然后在室温下重新溶解于乙腈(1.05L，0.83kg，5.5wt，7.0vol)中。在室温下添加2-硝基溴苄(44.4g，205mmol，0.30wt，1.34当量)，并通过LC/MS监控反应。23小时后(100％转化)，添加EtOAc(1.50L，10vol)、NH₄Cl(28wt％水溶液，300ml，2vol)和水(300ml，2vol)(pH＝6)，将得到的混合物于25℃真空部分浓缩至重量为1.11kg。添加EtOAc(2.25L，15vol)，搅拌混合物5分钟。将两层分开。水层用乙酸乙酯(750ml，5vol)萃取。将合并的有机层依次用：(1)NaCl(36wt％水溶液，300ml，2vol)和水(300ml，2vol)的混合物，和(2)水(600ml，4vol)洗涤。然后，将有机层真空浓缩并与正庚烷(1.50L，10vol)共沸。将MTBE(0.95L，6.3vol)添加至粗固体中，并将混合物于40℃加热。将混合物用EtOAc(300ml，2vol)稀释，并缓慢地冷却至0℃。使致密的固体沉降，并将上清液经过滤器玻璃管泵出。将固体用MTBE(2x300ml，2x 2vol；每次经过滤器玻璃管泵出的上清液)冲洗两次，在40℃下真空干燥过夜，由此得到作为浅黄色固体的化合物140(156g)。真空浓缩滤液，产生棕色油(17.8g)，再经Biotage Snap-Ultra340g(洗脱液：EtOAc中的0至5％MeOH)纯化，由此得到额外的作为浅黄色固体的化合物140(5.8g)。共计156g+5.8g＝161.8g(净152mmol，纯度95％，产率99％)。

¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.46(s,1H),8.15(s,1H),8.10(s,1H),8.09-8.06(m,1H),7.89(s,1H),7.54-7.51(m,1H),7.49-7.45(m,4H),7.37-7.28(m,3H),7.24-7.19(m,3H),7.16-7.11(m,2H),6.22(d,J＝16.8Hz,1H),6.14(dd,J＝2.7,17.2Hz,1H),5.83-5.61(m,3H),5.60-5.48(m,1H),5.07(dd,J＝3.5,51.6Hz,1H),5.06-4.96(m,1H),4.79(dd,J＝4.9,15.8Hz,1H),4.69(d,J＝5.9Hz,2H),4.67-4.56(m,1H),4.48-4.40(m,3H),4.37–4.30(m,1H),4.27(d,J＝5.9Hz,2H),4.19-4.13(m,1H),3.93-3.85(m,1H),3.85–3.78(m,1H)

阶段10～11

阶段10：将化合物140(纯度95％，净73.2g，72.3mmol，1wt，1vol，1当量)和2-氰乙基N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(25.3ml，79.5mmol，0.33wt，0.35vol，1.10当量)与无水乙腈共沸3次(3x2L)，重新溶解于二氯甲烷(0.73L，10vol)中并冷却至0-5℃。添加二异丙基铵盐四氮唑(6.19g，36.1mmol，0.085wt，0.50当量)。将得到的反应混合物于0℃搅拌10小时，经2小时升温至10℃，于10℃保持10小时，然后经2小时升温至室温。通过LCMS和TLC(含0.5％TEA的EtOAc)监控反应。18小时后，添加无水乙腈(0.73L，10vol)，将混合物在-20℃下储存3天以上。

阶段11a：使阶段10的混合物升温至环境温度，并通过滴液漏斗逐份地(每30分钟100mL，经9小时)添加至吡啶三氟乙酸盐(预先与吡啶共沸两次；41.9g，217mmol，0.57wt，3.0当量)和乙腈(5.85L，80vol)的混合物中。通过LCMS监控反应。13小时后，经4小时添加2-氰乙基N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(25.8mL，18mmol，0.25当量)的乙腈溶液(24mL)。附加试剂的量是基于剩余的化合物140确定的(～30％，基于LCMS)。在6小时后观察到更多的二醇转化。

阶段11b：

添加((二甲基氨基亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑啉-3-硫酮(DDTT；20.8g，101mmol，0.28wt，1.4当量)，并继续搅拌1小时。将反应混合物部分浓缩至～800mL，并用MTBE(1.46L，20vol)、NaHCO₃(9wt％水溶液；1.1L，15vol)和水(0.37L，5vol)稀释。pH＝8。将各层分开，并用MTBE(1.46L，20vol)和EtOAc(1.10L，15vol)的混合物萃取水层。合并的有机层用30％NaCl水溶液(2x0.73L，2x 10vol)洗涤两次，在35℃下真空浓缩，并与甲苯(1.46L，20vol)共沸。LCMS和TLC(EtOAc)显示化合物143(SpRp，目标):化合物241(SpSp)＝5:1。

通过Biotage 150M KP-Sil(SiO₂ 2.5kg；洗脱液：EtOAc/Hep：2:1(4CV)、3:1(2.5CV)、4:1(2.5CV)，100％EA(3CV)，EA中的5-10％MeOH 4CV)纯化粗产物，由此得到化合物143(36g，31.5mmol，产率44％)。

化合物143(SpRp)：¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.59(s,1H),8.10(s,1H),8.03-7.99(m,1H),7.91(s,1H),7.56-7.53(m,2H),7.49-7.40(m,5H),7.35-7.28(m,2H),7.24-7.16(m,4H),6.92(s,1H),6.29(d,J＝14.9Hz,1H),6.08(d,J＝20.7Hz,1H),5.97-5.83(m,1H),5.76(td,J＝4.7,15.6Hz,1H),5.61-5.51(m,2H),5.40(d,J＝4.3Hz,1H),5.29-5.17(m,1H),4.91(dd,J＝7.4,14.9Hz,1H),4.86-4.75(m,3H),4.63(dd,J＝3.7,9.2Hz,1H),4.58-4.43(m,5H),4.34-4.19(m,4H),2.79(td,J＝5.9,16.8Hz,1H),2.66(td,J＝6.3,16.8Hz,1H)。

化合物241(SpSp)¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ＝8.11(s,1H),8.03(d,J＝8.2Hz,1H),7.94(s,1H),7.90(s,1H),7.61(s,1H),7.56-7.40(m,7H),7.33-7.28(m,2H),7.23-7.17(m,4H),6.22(d,J＝17.6Hz,1H),6.15(d,J＝18.8Hz,1H),5.85(dd,J＝3.5,51.2Hz,1H),5.75-5.45(m,5H),4.95-4.23(m,14H),2.82(t,J＝6.1Hz,2H)。

阶段12

将化合物143(71.6g，62.6mmol，1wt，1vol，1当量)溶解于1,4-二氧杂环己烷(0.43L，6vol)中。添加苯硫酚(215ml，2.09mol，230g，3.2wt，3vol，>30当量)，再添加三乙胺(215ml，1.54mol，156g，2.2wt，3vol)。观察到一些放热(内部温度升高～7℃)，因此，使用水/冰浴进行冷却并控制内部温度为27℃以下。通过LCMS监控反应。2小时后，添加MeOH(0.57L，8vol)和NH₄OH(28wt％；15mol，0.57L，8vol，>200当量)。将得到的混合物在50℃加热5小时，冷却至室温，搅拌过夜。14小时后，添加水(0.72L，10vol)(未观察到固体)，将混合物用正庚烷和甲苯的1:1(v/v)混合物(3x 0.86L，3x 12vol)萃取三次，再用甲苯(0.57L，8vol)萃取。将水层在40-50℃下真空浓缩，并用水(1.07L，15vol)稀释。将得到的浆料在室温下保持过夜。滤出得到的固体，用水(0.36L，5vol)冲洗。滤液仍然浑浊，通过硅藻土和Kuno过滤器过滤。混浊仍然存在。经1小时添加HCl(1.0M水溶液；132ml，132mmol，2.1当量)，并检查pH(pH<2)。室温下继续搅拌1小时，将混合物过滤。将滤饼用水(8x 0.20L)冲洗，在真空烘箱中于35℃干燥2天，并在不加热的情况下干燥1天，由此得到作为浅橙色固体的化合物1(44.88g，60.1mmol，0.63wt，产率96％)。

阶段13：

向游离酸化合物1(22.42g，30.03mmol，1wt，1vol，1当量)中添加氨(2.0M的MeOH中的溶液；220ml，440mmol，10vol，15当量)。添加EtOH(55ml，2.5vol)，将得到的溶液通过Kuno过滤器(0.45微米，PTFE)过滤，用MeOH和EtOH的1:1(v/v)混合物(90mL，4vol)冲洗。将滤液于30℃真空浓缩，由此得到灰白色固体，将其干燥过夜，用抹刀研磨(容易磨碎)并进一步在室温下真空干燥。然后将分离的固体悬浮于甲苯(250ml)中，在室温下搅拌30分钟。然后通过真空过滤收集固体，并用甲苯冲洗两次(2x 50ml)。然后将固体于真空烘箱中真空干燥，由此得到22.4g化合物1a(化合物1的二铵盐)。

重结晶：将化合物1a(22.14g，28.36mmol，1wt，1vol，1当量)溶解于水(664ml，30vol)和氢氧化铵(28wt％；2.5ml，18mmol，0.63当量)的混合物(pH＝9-10)中，并用甲苯萃取三次(3x 300ml，3x14 vol)，用EtOAc萃取三次(3x 200ml，3x 9vol)，用甲苯萃取三次(3x300ml，3x14 vol)。将得到的水层用HCl(1.0M水溶液；90ml，90mmol，3.2当量)处理3.5小时(pH≤2)。搅拌混合物30分钟，然后通过真空过滤收集固体沉淀。将滤饼用水洗涤三次(3x200ml，3x 9vol)，真空干燥过夜。将氨(2.0M MeOH溶液；250ml，500mmol，17.6当量)和乙醇(100ml)添加至固体，将得到的混合物真空浓缩直至晶体出现(～100ml)，此时停止浓缩，搅拌混合物20分钟。添加乙醇(45ml)，将混合物部分浓缩(去除45mL)。将相同的操作再重复两次，然后将混合物冷却至0℃，并搅拌3.5小时。通过真空过滤收集白色固体，用冷乙醇(20mL)洗涤，再用乙酸乙酯(2x 50mL)洗涤。将白色固体在室温下真空干燥3天，由此得到作为白色固体的化合物1a(16.6g，21.3mmol，0.75wt，产率75％)。将滤液在真空下浓缩并于室温真空干燥3天，由此得到作为灰白色固体的化合物1a(4.16g，5.3mmol，产率18％)。

实施例1.2–化合物1的¹H NMR分析

化合物1a的¹H NMR谱图示于图3。得到的谱为：

¹H NMR谱(400MHz，DMSO-d6，δH 2.49ppm，80℃)

δ(ppm)：3.05-3.13(4H,m),3.70(1H,dd,J＝13,5Hz),3.78(1H,dd,J＝12,4Hz),4.21-4.24(2H,m),4.28(1H,m),4.38(1H,m),4.53-4.68(2H,m),5.22(1H,m),5.76(2H,s),5.78(1H,m),6.26(1H,m),6.29(1H,m),8.13(1H,s),8.14(1H,s),8.36(1H,brs),8.59(1H,brs)。

实施例1.3–化合物1的X射线分析

将约2mg的化合物1溶解于600μL水中。将120μL该溶液放入另一玻璃瓶中，然后将该瓶在室温下于含3mL MeCN的固定容器内储存1周。以上是样品制备的H₂O/MeCN蒸汽扩散法。

将发现于结晶溶液中的无色块状单晶(0.1×0.1×0.1mm)分散于液体Parabar10312中，并置于Dual-Thickness MicroMounts^TM(MiTeGen)上。使用多层镜单色化Cu-Kα射线，利用ω轴回摆法，于-160℃在XtaLAB PRO P200 MM007HF(Rigaku)上收集衍射数据。

图4A示出了不对称单元中的化合物1分子、以及多个无序水分子的ORTEP图。图4B示出了图4A中的化合物1分子之一的晶体结构。图4C示出了图4A所示化合物1的另一分子的晶体结构。

将化合物1的晶体结构用0.1354的最终R因子解析。Flack参数接近0(0.083(17))，表明化合物1的绝对构型为(R，S)。晶体结构分析还表明许多水分子存在于化合物1的大通道中，这表明水分子能够容易地自通道滑出。分析还确认到不对称单元的两个结晶学上独立的分子的构象是几乎相同的。

X射线分析的其他参数示出如下：

实施例2：X射线结构验证与WT STING的复合

为了进一步理解本发明的新化合物的靶结合机制，测定了与化合物复合的WTSTING的X射线晶体结构。

A.WT STING C-端结构域(残基155-341)的表达和纯化

将编码人WT STING蛋白的第155至341位氨基酸的DNA序列(序列号4)克隆至pET21b载体中，在其N-端接续His-TEV-Sumo标签(序列号5)。pET21b的序列已保存于addgene，并可获得自addgene.org/vector-database/2550/；该序列通过引用并入本文中。

用该质粒转化E.coli BL21(DE3)codon plus细胞，用0.1mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达。通过Ni-NTA亲和色谱，将蛋白质从细胞裂解液的可溶级分中纯化。将His-TEV-Sumo标签通过sumo蛋白酶去除，并使用另一个Ni-NTA亲和柱，与无标签的WT STING 155-341分离。将蛋白质通过阴离子交换和尺寸排阻色谱进一步纯化，并以35mg/ml浓度储存于含有20mM Tris·HCl pH 7.5和150mM NaCl的缓冲液中。

B.与化合物1复合的WT STING C-端结构域的结晶和结构测定

为了使WT STING 155-341与化合物1共结晶，将WT STING蛋白用储存缓冲液(20mMTris·HCl pH 7.5和150mM NaCl)稀释至10mg/ml，并与化合物1(100mM DMSO中储液)按1:5摩尔比混合。将混合物在4℃下孵育4小时，以13,000rpm离心20分钟，然后结晶。使用悬滴气相扩散法于18℃设置结晶筛盘。通过将1μL的WT STING/化合物1溶液与等体积的含有100mMHEPES pH 7.5、200mM CaCl₂和15％(wt/vol)PEG 8000的良溶液混合来生长晶体。在液氮中速冻晶体时，将20％(wt/vol)PEG 400用作冷冻保护剂。使用Pilatus检测仪，利用SSRFBL19U1光束收集衍射数据集，用HKL3000和CCP4软件套件中的程序SCALEPACK2MTZ进行处理。

利用程序PHASER(Maximum Likelihood Molecular Replacement)，以PDB ID4F9E作为初始检索模型，通过分子置换确定与化合物1结合的WT STING 155-341的结构。在用模型阶段计算的Fo-Fc差异图中，确认到化合物1存在于WT STING的二聚体界面之间。模型是用Coot程序手动构建和完成，并用CCP4软件套件中的Refmac5程序细化的。报告的最终细化结构在空间群P212121中，分辨率为

其测得的晶胞为a＝33.820，b＝78.110，c＝132.212，α＝90.00，β＝90.00，γ＝90.00。在每个于二聚体界面处与一分子化合物1结合的不对称单元中鉴定出2个拷贝的WT STING 155-341。

C.在X射线晶体结构中观察到的化合物1与WT STING的相互作用

图5示出了与化合物1复合的人WT STING的X射线晶体结构的图。我们检测了与化合物1复合的人WT STING的X射线晶体结构，其共结晶自化合物1a的样品。该化合物结合于由WT STING蛋白的二聚体形成的界面口袋处。化合物的腺嘌呤碱基的两个面分别与Tyr240和Arg238的胍基形成π-π堆积相互作用。反式烯烃接头与Arg238的侧链的脂肪族部分形成范德华氏相互作用。位于化合物的核糖基的C2’位的氟取代基藏于由Thr263、Pro264和Tyr163定义的疏水孔中。化合物的带负电荷的硫代磷酸基与Arg238形成盐桥，与Ser162和Thr267分别形成氢键相互作用。此外，硫代磷酸酯基还与Arg232的胍基形成静电相互作用。WT STING的LID环区由第226至243位残基组成，包围了两个碱基和反式烯烃接头。

实施例3：测定与化合物1复合的REF STING的X射线晶体结构

A.REF STING C-端结构域(残基155-341，序列号6)的表达和纯化

将编码人REF STING蛋白的第155至341位氨基酸的DNA序列(序列号6)克隆至pET21b载体中，在其N-端接续His-TEV-Sumo标签(序列号7)。pET21b的序列已保存于addgene，并可获得自addgene.org/vector-database/2550/；所述序列通过引用并入本文中。

用该质粒转化E.coli BL21(DE3)codon plus细胞，用0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达。通过Ni-NTA亲和色谱，将蛋白质从细胞裂解液的可溶级分中纯化。将His-TEV-Sumo标签通过sumo蛋白酶去除，并使用另一个Ni-NTA亲和柱，与无标签的REF STING 155-341分离。将蛋白质通过阴离子交换和尺寸排阻色谱进一步纯化，并以24mg/ml浓度储存于含有20mM Tris·HCl pH 7.5和150mM NaCl的缓冲液中。

B.与化合物1复合的REF STING C-端结构域的结晶和结构测定

为了使REF STING 155-341与化合物1共结晶，将REF STING蛋白用储存缓冲液(20mM Tris·HCl pH 7.5和150mM NaCl)稀释至10mg/ml，并与化合物1(100mM DMSO中储液)按1:5摩尔比混合。将混合物在4℃下孵育4小时，以13,000rpm离心20分钟，然后结晶。使用悬滴气相扩散法于18℃设置结晶筛盘。通过将1μL的REF STING/化合物1溶液与等体积的含有100mM HEPES pH 7.5、200mM CaCl₂和15％(wt/vol)PEG 8000的良溶液混合来生长晶体。在液氮中速冻晶体时，将20％(wt/vol)PEG 400用作冷冻保护剂。使用Pilatus检测仪，利用SSRF BL18U1光束收集衍射数据集，用HKL3000和CCP4软件套件中的程序SCALEPACK2MTZ进行处理。该结构示出于图6中。

利用程序PHASER(Maximum Likelihood Molecular Replacement)，使用之前确定的WT STING 155-341结构(如上所述)作为初始检索模型，通过分子置换确定与化合物1结合的REF STING155-341的结构。在用模型阶段计算的Fo-Fc差异图中，确认到化合物1存在于REF STING的二聚体界面之间。模型是用Coot程序手动构建和完成，并用CCP4软件套件中的Refmac5程序细化的。报告的最终细化结构在空间群P212121中，分辨率为

其测得的晶胞为a＝33.733，b＝77.831，c＝131.689，α＝90.00，β＝90.00，γ＝90.00。在每个于二聚体界面处与一分子化合物1结合的不对称单元中鉴定出2个拷贝的REF STING 155-341。

C.在X射线晶体结构中观察到的化合物1与REF STING的相互作用

图6示出了与化合物1复合的人REF STING的X射线晶体结构，其共结晶自化合物1a的样品。化合物结合于由STING蛋白的二聚体形成的界面口袋处。化合物的腺嘌呤碱基的两个面分别与Tyr240和Arg238的胍基形成π-π堆积相互作用。反式烯烃接头与Arg238的侧链的脂肪族部分形成范德华氏相互作用，同时Arg238的侧链的胍部分从外侧与His232的侧链的咪唑基形成π-π堆积相互作用。烯烃接头与Arg238和His232相互作用的一对侧链接触。位于化合物的核糖基的C2’位的氟取代基藏于由Thr263、Pro264和Tyr163定义的疏水孔中。化合物的带负电荷的硫代磷酸酯基与Arg238形成盐桥，与Ser162和Thr267分别形成氢键相互作用。REF STING的LID环区由第226至243位残基组成，包围了两个碱基和反式烯烃接头。

实施例4：使用膀胱内施予途径的化合物1a的小鼠膀胱癌模型中的体内评估

MBT-2小鼠膀胱癌原位模型由Lee等人(“Tumor Establishment Features ofOrthotopic Murine Bladder Cancer Models,”Urological Oncology 2012；53:396-400)于2012年建立和表征，表现出与人膀胱癌相似的组织学。因此，挑选该模型评估化合物1的抗膀胱癌活性。将Lee等人描述的具有HCl预处理步骤的实验流程用于建立模型。简而言之，将30μL 0.1N HCl溶液通过导管注射入小鼠膀胱，并使HCl溶液在膀胱内停留15秒。然后将HCl溶液更换为30μL 0.1N NaOH溶液，随后包括一个用1X PBS(pH7.4)冲洗的步骤。后续的肿瘤细胞植入步骤是由原始文献调整而来的。简而言之，在冲洗步骤之后，将MBT-2肿瘤细胞(50μL RPMI1640培养基中的2x 10⁶个细胞)输注入膀胱内并使其停留45分钟。在该45分钟结束时，排空膀胱。

肿瘤细胞植入3天后，将小鼠用不同剂量的化合物1a、BCG(

MerckCanada Inc.)、抗小鼠PD-1抗体(克隆#RMP1-14,Bioxcell)和化合物1a与PD-1抗体的组合按表1总结的日程计划进行治疗。化合物1a和BCG均通过膀胱内途径施予，而PD1抗体通过腹膜内注射施予。

在给药的每一天，将BCG稀释于NaCl 0.9％(Lavoisier,France)以达到最终浓度16.875mg/mL，用于给药。所有的剩余给药溶液均在使用后弃去。关于抗PD-1抗体，使用1xPBS(Lonza,France)稀释储液从而制备1mg/mL用于给药的工作溶液。关于化合物1a，首先通过溶解干燥粉末于1x PBS中，制备10mg/mL储液。然后，通过用1x PBS进一步稀释储液，制备包括5mg/mL(400μg/小鼠的组)、2.5mg/mL(200μg/小鼠的组)和1.25mg/mL(100μg/小鼠的组)在内的不同浓度的化合物1a。

表1：治疗试剂和给药计划方案

1：IVe，膀胱内灌注

2：IP，腹膜内注射

自第20～21天，通过MRI(核磁共振成像)定量膀胱内的肿瘤生长，所有小鼠的肿瘤大小的图示见图7。图7示出了所有研究动物在第20～21天通过MRI进行的肿瘤体积定量。如图7所示，所有的化合物1a治疗组(组4至7)均显示出明显小于媒介物组(组1)、BCG组(组2)和PD1抗体组(组3)的肿瘤体积。

如图8所示，化合物1a还显示出相对于经媒介物处理的动物具有统计学显著的存活益处。

BCG和抗PD-1抗体均未能在该原位小鼠膀胱癌模型中显示出显著的抗癌活性，提示所使用的模型是BCG/PD1抗体耐受/难治性模型。

实施例103：HAQ STING激动剂活性报告基因分析

将THP1-Dual^TM细胞(InvivoGen,Cat#thpd-nfis)应用于EC₅₀测定。THP1-Dual^TM细胞已由供应商Invivogen(Insight 201402-1)表征为携带HAQ STING基因型。细胞在生产商推荐的条件下生长并维持。根据生产商的手册中描述的干扰素调控因子(IRF)通路诱导进行EC₅₀测定。简而言之，接种细胞，并用不同浓度的化合物处理20小时，同时在37℃、5％CO₂下孵育。再次悬浮细胞并添加QUANTI-Luc^TM溶液(Cat.#:rep-qlc1)。通过光度计(Envision,Perkin Elmer)测量获得的光发射。就得到的信号制图，用GraphPad Prism7软件计算EC₅₀。

化合物的人STING EC₅₀(μM)值报告于下表2中。

实施例104：STING变体特异性报告基因分析

人STING具有4种主要变体，包括WT、HAQ、REF和AQ变体。例如，REF STING，也被称为R232H，存在于约14％的人口中。与野生型等位基因相比，R232H对细菌和后生动物环二核苷酸的应答降低。这4种主要变体以及其他稀有变体的详细信息被Yi G等人，“Singlenucleotide polymorphisms of human STING can affect innate immune response tocyclic dinucleotides”PLoS One 2013；8:e77846报道。通过使用THP1-Dual^TM KO-STING细胞(InvivoGen,Cat#thpd-kostg)和三种STING变体蛋白表达载体，建立了STING变体特异性报告基因细胞系。WT STING的表达载体图示出于图9中。关于其他两种表达载体，在载体中使用了不同的STING变体序列，用合适的核苷酸序列取代了WT STING。

分别制备用于WT STING、REF STING和AQ STING的STING变体表达载体，并将其稳定地转染到THP1-Dual^TM KO-STING细胞中，以准备WT STING、REF STING和AQ STING的STING变体特异性报告基因分析。与上文实施例103中记载的HAQ STING激动剂活性报告基因分析同样地测定EC₅₀值。将结果示于下表2中。用于这些STING变体的DNA序列示出于序列号1(WT人STING的核苷酸序列)、序列号2(REF人STING的核苷酸序列)和序列号3(AQ人STING的核苷酸序列)。

WT人STING：

atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcccagaaggcagccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcacactctccggtacctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggctgaggagctgcgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctgccccctccgccgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgcccttcacttggatgcttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggccccagctgagatctctgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcggatatctgcggctgatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctacggggtgcagtgagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctgaccccaacattcgcttcctggataaactgccccagcagaccggtgaccgggctggcatcaaggatcgggtttacagcaacagcatctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccacccccttgcagactttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggccaaactcttctgccggacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcctaccaggaacctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggaggaaaaggaagaggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagcctgagctcctcatcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga(序列号1)

REF人STING：

atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcccagaaggcagccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcacactctccggtacctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggctgaggagctgcgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctgccccctccgccgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgcccttcacttggatgcttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggccccagctgagatctctgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcggatatctgcggctgatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctacggggtgcagtgagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctgaccccaacattcgcttcctggataaactgccccagcagaccggtgaccatgctggcatcaaggatcgggtttacagcaacagcatctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccacccccttgcagactttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggccaaactcttctgccggacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcctaccaggaacctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggaggaaaaggaagaggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagcctgagctcctcatcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga(序列号2)

AQ人STING：

atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcccagaaggcagccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcacactctccggtacctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggctgaggagctgcgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctgccccctccgccgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgcccttcacttggatgcttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggccccagctgagatctctgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcggatatctgcggctgatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctacggggtgcagtgagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctgaccccaacattcgcttcctggataaactgccccagcagaccgctgaccgagctggcatcaaggatcgggtttacagcaacagcatctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccacccccttgcagactttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggccaaactcttctgccagacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcctaccaggaacctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggaggaaaaggaagaggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagcctgagctcctcatcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga(序列号3)

实施例105：小鼠STING激动剂活性报告基因分析

将RAW-Lucia^TM ISG细胞(InvivoGen,Cat#rawl-isg)用于小鼠STING激动剂报告基因分析。与上文实施例103中记载的HAQ STING激动剂活性报告基因分析同样地测定EC₅₀值。将结果示于下表2中。

实施例106：差式扫描荧光(DSF)分析

运用DSF分析测量化合物和重组STING蛋白之间的物理相互作用。如下所述，将截短的重组STING蛋白(氨基酸155-341)(序列号4)表达于大肠杆菌中，并分离用于分析。在384孔板中制备分析基质，最终体积为每孔10μL，其由1μM重组STING蛋白(氨基酸155-341)(序列号4)、100mM PBS pH 7.4组成，并补充100mM KCl、5X SYPRO橙色染料和50μM化合物(最终DMSO浓度为0-1％)。在QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR系统上实施分析，采用25℃至95℃的温度梯度，速率为0.05℃/min，激发滤光片和发射光滤片分别为470和586nm。根据由Applied

Protein Thermal Shift软件(算法版本1.3)指定的荧光导数曲线，计算未结合的和结合配体的重组STING蛋白的热融(thermal melt)(Tm)以及热融差(dTm D)。

一般而言，认为具有大于0的ΔTm值的化合物与测试蛋白具有物理相互作用，且ΔTm的值与化合物结合亲和力呈正相关。此处，化合物1a显示出17.6的ΔTm(表2)，表明了与STING蛋白的物理相互作用。

表2：化合物1a体外表征

实施例107：离体人PBMC刺激分析

使用10.0mL BD Vacutainer肝素钠管(cat#367874)收集来自5名健康供体的人血。使用生产商提供的方案，使用SIGMA ACCUSPIN50ml管(cat#A2055)和sigma ACCUSPINSystem-HISTOPAQUE-1077(cat#A7054)分离外周血单核细胞(PBMC)。收获PBMC层，并按Sigma所建议地用1x磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤。对PBMC进行计数，并最终以1x10e⁶/ml悬浮于补充了10％胎牛血清(FBS)(Gibco cat#20140.79)的RPMI(康宁cat#10-041-CV)中。将1ml细胞(1x10e⁶个)转移至Falcon 5mL圆底聚丙烯试管(cat#352063)中，并在5％CO₂烘箱中于37℃用不同浓度(0、0.1、1、10μM)刺激24小时。

孵育24小时后，将试管在1400rpm离心5分钟，并收获上清液。将上清液储存于-80℃，用于后续的IFNβ测量。IFNβ测量使用人IFN-βBase试剂盒(Meso Scale Diagnosticscat#K151ADA)进行，并使用生产商提供的方案。通过在MESO SECTOR Imager 2400中读取测定板并使用MSD Discovery Workbench 4.0程序，完成了IFN-β评估。24小时后，分析IFNβ蛋白。结果显示化合物1a能够以剂量依赖性的方式诱导原代人PBMC IFNβ蛋白产生。

表3示出的结果反映了使用5个不同供体进行的测量的平均值。

表3：离体人PBMC刺激分析

对于IFNβmRNA定量，根据生产商的方案，使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen,Germany)分离总RNA。对IFNβmRNA通过qPCR分析进行定量。简而言之，使用SuperScriptVILO MasterMix(Life Technologies,USA)，将总RNA(400ng至1000ng)在60-μl反应体积中转化为cDNA。随后，将得到的cDNA(10ng)使用Applied Biosystems TaqMan表达分析，使用IFNB1(Hs01077958_s1)和GAPDH(Hs99999905_m1)的RNA特异性引物进行扩增。在AppliedBiosystems Quantstudio 12K Flex Real-Time PCR系统上，用TaqMan Fast AdvancedMaster Mix(Life Technologies,USA)实施qPCR分析，第一步为50℃、2min，随后实施95℃、2s，并以95℃、1s及60℃、20s实施40个循环。使用2-ΔΔCT法，针对内参基因GAPDH归一化后，计算相对基因表达。计算使用Applied Biosystems Quantstudio12K Flex软件v1.2.2进行。将IFNβmRNA相对于媒介物处理样品的倍数变化总结于表4中。结果显示，化合物1a能够以依赖于剂量和时间的方式在原代PBMC中诱导IFNβmRNA。表4示出了自5个不同供体计算得出的平均值。

表4：离体人PBMC 3小时&24小时刺激分析(mRNA)

实施例108：化合物1a对CT26双重肿瘤模型的抗癌效果

在作为小鼠结肠癌模型的CT26双重肿瘤模型中测试化合物1a的抗癌活性。针对5～6周龄的雌性Balb/cJ小鼠(Jackson Labs,Bar Harbor,Maine)皮下植入CT26肿瘤细胞于每只动物的两侧，每侧10⁵个细胞。对于研究A，治疗始于肿瘤植入后的第5天(1.25mg/kg、2.5mg/kg和5mg/kg)，此时平均肿瘤达到约100mm³。对于研究B，治疗始于肿瘤植入后的第8天(0.6mg/kg和10mg/kg)，此时平均肿瘤达到约120mm³。治疗日程记载于表5和表6中。

表5：研究A的给药方案

*I.T.为肿瘤内。

表6：研究B的给药方案

*I.T.为肿瘤内。

研究中的所有小鼠均具有两个皮下CT26肿瘤。“经治疗肿瘤”表示直接施予化合物的肿瘤，而“未治疗肿瘤”表示没有直接施予化合物的肿瘤。整个实验过程中对肿瘤体积进行跟踪。在开始治疗后，每周测量肿瘤体积两次。通过用于长椭球的体积公式(LxW²)/2，由卡尺测量结果计算肿瘤负荷，其中L和W分别是相互垂直的长度和宽度的测量结果(mm)。

化合物1a在CT26双重肿瘤模型中表现出强力的治疗活性(图10和图11)。对于经治疗肿瘤，即使在研究测试的最低剂量下，也检测到20％的治愈率(图8，0.6mg/kg剂量)。同时，最高剂量(10mg/kg)在研究结束时治愈了100％的具有该肿瘤的动物。对于未治疗肿瘤，剂量依赖性的抗肿瘤效果也是明显的。最高剂量组(10mg/kg)显示出80％治愈效果；所有的较低剂量也都显示出肿瘤生长抑制活性。因此，对于化合物1a，观察到的治疗窗为0.6mg/kg至10mg/kg，其抗肿瘤活性不仅局部可见，基于在未注射的远端肿瘤部位的效果，也在全身可见抗肿瘤活性。总而言之，上述结果表明化合物1a的局部施予能够诱导局部的和全身的(远端的)抗癌活性。

实施例109：化合物1a对CT26肝转移模型的抗癌效果

在CT26肝转移模型中测试化合物1a的抗癌活性。向麻醉的5～6周龄的雌性Balb/cJ小鼠(Jackson Labs,Bar Harbor,Maine)脾内植入表达荧光素酶的CT26肿瘤细胞(每只鼠5x 10⁵个细胞)。随后的等待期为10分钟，使肿瘤细胞循环进入动物肝脏。然后，去除脾脏，将动物缝合并使其恢复。3天后，再次植入CT26肿瘤细胞(每只鼠10⁵个细胞)，这次皮下(sc)植入于右前肢区域，从而能够发展为供化合物施予的肿瘤团块。脾内注射后第9天，将化合物(10mg/kg)一次性地肿瘤内施予至sc肿瘤内。

通过化合物对sc肿瘤的效果，测量它的局部抗癌效果，同时，基于每只小鼠肝脏中生长的肿瘤团块的有害效果，比较经治疗的小鼠和媒介物处理对照小鼠的总存活率，由此评估化合物的远端效果。化合物1a显示出对局部sc肿瘤的强力的活性，并在10只经治疗的动物中的9只中显示出治疗性的全身活性(图12)。上述结果表明，化合物1a的局部施予能够诱导局部和全身的(远端的)抗癌活性，包括例如在肝脏中的深处病变。

实施例110：化合物1a对GL261脑原位模型的抗癌效果

在GL261脑原位模型中测试化合物1a的抗癌活性。GL261是小鼠的神经胶质瘤细胞系。将表达荧光素酶的GL261小鼠神经胶质瘤细胞(2x 10⁴个细胞/小鼠)颅内植入5～6周龄的雌性B6白化小鼠(Jackson Labs,Bar Harbor,Maine)。3至4天后，将GL261细胞(10⁶个细胞/小鼠)皮下植入于右前肢区域，使其发展为供化合物施予的肿瘤团块。颅内肿瘤细胞植入10天后，将化合物(10mg/kg)一次性地肿瘤内施予至sc肿瘤内。通过化合物对sc肿瘤的效果，测量它的局部抗癌效果，同时，基于每只小鼠脑内生长的肿瘤团块的有害效果，比较经治疗的小鼠和媒介物处理对照小鼠的总存活率，由此评估化合物的远端效果。化合物1a显示出对局部sc肿瘤的强力的活性，并在8只经治疗过动物中的5只中显示出治疗性的全身活性(图13)。上述结果表明，化合物1a的局部施予能够诱导局部和全身的(远端的)抗癌活性，包括例如在脑中的深处病变。

实施例111：比较

在使用本公开的化合物1a、天然STING配体(2’3’cGAMP)和据称是STING激动剂的ML RR-S2 CDA(如Corrales等人，“Direct Activation of STING in the TumorMicroenvironment Leads to Potent and Systemic Tumor Regression and Immunity,”Cell Reports(2015)11:1018-1030(其通过引用并入本文)中所报道的)的头对头比较中，计算用于WT STING、HAQ STING、AQ STING和REF STING的人STING分析的EC₅₀值。如上文实施例所述进行分析。需要注意的是，表7中报道的分析值限于头对头比较中进行的分析，可能并未反映出如上文或别处报道的基于更多试验所测定的平均值。还需要注意的是，“2’3’cGAMP”与Cell Reports出版物中报道的“ML cGAMP”相同。

表7

表7还报道了通过等温滴定量热法(ITC)测得的人WT STING与三种测试化合物中的每一种的结合的解离结合常数(Kd)。ITC是测量与分子间相互作用相关的热力学特性的微量热滴定技术。基于上述测试，化合物1a表现出与测试化合物中的WT STING形成最强的结合。

材料

重组人野生型STING(氨基酸139-379，H232R)蛋白是通过在大肠杆菌中表达编码包含氨基酸139-379的、人WT STING的胞质结构域的构建体而生成的。

试剂

该研究中使用的试剂来源如下所示：

蛋白质缓冲液制备

将STING蛋白在含有5％甘油、pH 7.5的PBS中分别以3.0mg/mL和20mg/mL的浓度制成90μL及100μL的等分试样(aliquot)，储存于-60℃。在分析当天，解冻蛋白的等分试样，稀释至400μL，并使用Amicon Ultra离心过滤单元(10k MW截留，0.5mL)、用Eppendorf微量离心机进行至少四次的10min 14000x g离心，将缓冲液更换为PBS，然后用1x PBS最终稀释至20μM至30μM(取决于实验)。使用Nanodrop 2000分光光度计和22140(M^-1cm^-1)的蛋白质消光系数，确定蛋白质浓度。

样品制备

通过1.5mL微量离心管供应化合物1a、2’3’cGAMP和ML RR-S2CDA的200μL的1mM储液。在每次实验前，将样品稀释至200μM至500μM的浓度(取决于实验)。

方法

在装配了ITC清洁配件(TA Instruments no 601800.901)的Affinity ITC仪(TAInstruments no.609003.901)上实施分析。将约400μL含有20μM至30μM STING蛋白的STING蛋白溶液移液至185μL量热仪池(其允许部分可接受的过载)中。参照池含有等量的Milli-Q水。注射20x 2.5μL的100μM至300μM化合物，于25℃进行孵育。使用控制软件ITC RunVer.3.3.0.0(TA Instruments)获得热谱图，其包括多个原始热量(raw heat)峰(μcal/sec)，代表每次注射时的热速率(heat rate)。将分析软件Nano Analyze Ver.3.70(TAInstruments)用于基线校正、校正空白或样品稀释热(饱和状态)，以及用于将热速率峰合并以生成图形化的“Q”值。将得到的等温线与独立模型拟合，推导热力学参数。

推导并报告Kd和n值(曲线拐点处的摩尔比)。蛋白质和配体的浓度的最佳条件来自预备实验。

结果

确定了关于测试化合物与重组人野生型STING(氨基酸139-379，H232R)的结合的热速率谱图及由其得到的等温线。每种化合物与STING的结合都是吸热的，表现为负的热速率及稀释放热(正向)(在化合物已达到蛋白质饱和后观察到)。2’,3’cGAMP表现出对各种STING变体产生相似的吸热反应。化合物1a的Kd最低，为0.04μM，其次是2’3’cGAMP，Kd为0.07μM，再次是ML RR-S2 CDA，Kd为0.40μM。所有化合物都提供了接近0.5的n值，提示STING蛋白是作为二聚体存在，且每2mol STING结合1mol化合物。

实施例112：鉴定潜在的代谢物

将化合物1a孵育在CD-1小鼠、Sprague Dawley大鼠、比格犬、食蟹猴和人的肝细胞中，评估主要代谢物的形成。

材料

冷冻保存的混合肝细胞购自ThermoFisher Scientific(Waltham,MA)、Xenotech,LLC(Kansas City,KS)和In Vitro ADMET Laboratories(Columbia,MD)，合适的培养基购自In Vitro ADMET Laboratories(Columbia,MD)和Life Technologies(Carlsbad,CA)。AOPI染色溶液和磷酸盐缓冲液分别从Corning Life Sciences(Tewksbury,MA)和NexcelomBioscience(Lawrence,MA)获得。分析中使用的所有的化学品、试剂和溶剂都是分析级或HPLC级的。

实验设计和方法

肝细胞孵育

将化合物1a称重并溶解于含有0.12％甲酸PBS的HPLC-水中，制成1020mmol/L。然后，将溶液用含有0.1％人血清白蛋白和2mmol/L L-谷氨酰胺的Williams’E培养基各自稀释2.5倍至4mmol/L，再进一步稀释21000倍，制成20μmol/L浓度的工作储液。

孵育前，将冷冻保存的肝细胞在37℃水浴中解冻。将一管冷冻保存的肝细胞添加至各50-mL锥形管的冷冻保存肝细胞恢复培养基(UCRM)中，所述培养基自In Vitro ADMETLaboratories(Columbia，MD)获得。在室温4℃，将细胞在具有GH 3.8转子的Beckman离心机(Brea，CA)中以740rpm转动10分钟。去除上清液，将细胞再次悬浮于平板培养基中用于计数。将细胞再次悬浮于平板培养基中后，转移20μL新悬浮液并与20μL的AOPI染色溶液混合。将溶液轻轻地混合，并使用细胞计数仪(Nexcelom,Lawrence,MA)计数细胞。计数后，将细胞以100万或200万个活细胞/mL地再次悬浮于含有2mmol/L L-谷氨酰胺的Williams’E培养基(pH 7.4)中。

将肝细胞悬浮液(50μL/孔)添加至48孔板中。添加50微升含有化合物1a的工作储液(20μmol/L)，开始反应。将板放入组织培养温箱(5％CO₂/95％空气加湿气氛，37℃)中，并于5、30、60、120、180和240分钟用200μL含有100％甲醇/乙腈(1/1，v/v)、2010ng/mL呋塞米(furosemide)和0.2μmol/L(R)-心得安(propranolol)的终止缓冲液终止反应。将混合物离心并过滤，收集上清液用于分析。冷冻保存的肝细胞的最终浓度为1x 10⁶个细胞/mL。化合物1a的最终的孵育浓度为10μmol/L。

用于代谢物鉴定的LC-MS/MS条件

LC-MS/MS系统由Shimadzu HPLC、AB-SCIEX TripleTOF 5600hybrid quadrupole和TOF质谱仪(Framingham,MA)组成。Shimadzu HPLC(Kyoto，Japan)由通信总线模块(communications bus module)(CBM-20A)、附加支架更换器(Rack Changer II)的自动进样器(SIL-30AC)、双泵(LC-30AD)和柱温箱(CTO-30A)组成。质谱仪使用AB-SCIEX APCI正、负校准溶液(Framingham,MA)进行校准。将获得自与肝细胞孵育的样品在负扫描和正扫描模式下进行分析。基本分析方法和设备条件总结如下。质谱仪设置的调整取决于分析物的必要性。

LC-MS/MS条件：

活性数据的数据分析

使用AB-Sciex Analyst TF(Version 1.5.1；Framingham,MA)获得质谱数据。使用AB-Sciex PeakView(Version 2.2.0.1；Framingham,MA)获得色谱图和质谱图。提取的离子色谱图的相对峰面积的比较是基于对各目标分析物的预期精确质荷比(m/z)的±0.0002Da。

结果

从与肝细胞的孵育中未检测到代谢物。在所呈现的分析条件下，化合物1a显示出约7.8分钟的保留时间。在负扫描模式下，化合物1a显示出去质子化的分子离子m/z 745(C₂₄H₂₅F₂N₁₀O₈P₂S₂ ^-)和双去质子化的分子离子m/z 372(C₂₄H₂₄F₂N₁₀O₈P₂S₂ ^2-)。观察到了m/z533(C₁₉H₁₉FN₁₀O₄PS^-)和m/z 186(C₉H₈N₅ ^-)的主要MS/MS产物离子。在正扫描模式下，化合物1a显示出去质子化的分子离子m/z 747(C₂₄H₂₇F₂N₁₀O₈P₂S₂ ⁺)和m/z 651(C₂₄H₂₆F₂N₁₀O₆PS⁺)、m/z252(C₁₀H₁₁FN₅O₂ ⁺)及m/z 188(C₉H₁₀N₅ ⁺)的主要MS/MS产物离子。MS和MS/MS数据与化合物1a的结构相符。

化合物1a在与小鼠、大鼠、狗、猴和人的肝细胞孵育中是稳定的。该研究中未鉴定出化合物1a的明显代谢物。在从与肝细胞的孵育中得到的样品中，仅能通过串联质谱(MS/MS)的片段检测和验证化合物1a本身。

本公开文本引用的所有文献都通过引用并入到本文中，但如果有任何并入的文献与本书面说明书矛盾，则以本书面说明书为准。本领域技术人员可以认识到，可对本申请提供的材料进行各种改变和修饰，并且这些材料也落入本申请的范围和主旨中。

序列表

序列号1(WT人STING)：

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序列号2(REF人STING)：

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序列号3(AQ人STING)：

atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcccagaaggcagccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcacactctccggtacctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggctgaggagctgcgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctgccccctccgccgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgcccttcacttggatgcttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggccccagctgagatctctgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcggatatctgcggctgatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctacggggtgcagtgagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctgaccccaacattcgcttcctggataaactgccccagcagaccgctgaccgagctggcatcaaggatcgggtttacagcaacagcatctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccacccccttgcagactttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggccaaactcttctgccagacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcctaccaggaacctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggaggaaaaggaagaggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagcctgagctcctcatcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga

序列号4(WT STING残基155-341)：

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序列号5(His-TEV-Sumo-WT STING 155-341)

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序列号6(REF STING残基155-341)：

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序列号7(His-TEV-Sumo-REF STING 155-341)

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Claims (15)

1.治疗膀胱癌的方法，其包括向需要治疗的患者施予有效量的化合物1或其药学上可接受的盐：

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述药学上可接受的盐是二铵盐。

3.治疗膀胱癌的方法，其包括向需要治疗的患者施予有效量的的药物组合物，所述药物组合物包含化合物1或其药学上可接受的盐、和药学上可接受的赋形剂：

4.化合物1或其药学上可接受的盐在用于治疗膀胱癌的药物组合物的制备中的应用：

5.化合物1、其药学上可接受的盐、或者包含化合物1或其药学上可接受的盐的药物组合物在膀胱癌的治疗中的应用：

6.治疗膀胱癌的方法，其包括：

鉴定出患有可通过化合物1、化合物1的药学上可接受的盐、或者包含化合物1或化合物1的药学上可接受的盐的药物组合物来治疗的膀胱癌的个体；和

向所述个体施予有效量的已鉴定为能够治疗所述膀胱癌的所述化合物、药学上可接受的盐或药物组合物。

7.如权利要求6所述的方法，其中，所述个体通过患者中的REF STING变异等位基因的存在而被鉴定为患有可通过化合物1、化合物1的药学上可接受的盐、或者包含化合物1或化合物1的药学上可接受的盐的药物组合物来治疗的膀胱癌。

8.治疗具有REF STING等位基因的患者中的膀胱癌的方法，其包括向所述患者施予化合物1、化合物1的药学上可接受的盐、或者包含化合物1或化合物1的药学上可接受的盐的药物组合物。

9.治疗具有WT STING等位基因的患者中的膀胱癌的方法，其包括向所述患者施予化合物1、化合物1的药学上可接受的盐、或者包含化合物1或化合物1的药学上可接受的盐的药物组合物。

10.治疗具有AQ STING等位基因的患者中的膀胱癌的方法，其包括向所述患者施予化合物1、化合物1的药学上可接受的盐、或者包含化合物1或化合物1的药学上可接受的盐的药物组合物。

11.治疗具有HAQ STING等位基因的患者中的膀胱癌的方法，其包括向所述患者施予化合物1、化合物1的药学上可接受的盐、或者包含化合物1或化合物1的药学上可接受的盐的药物组合物。

12.治疗膀胱癌的方法，其包括向需要治疗的患者施予治疗有效量的STING激动剂。

13.如权利要求1～3或6～12中任一项所述的方法、或者权利要求4或5所述的应用，其中，化合物1、化合物1的药学上可接受的盐、或者包含化合物1或化合物1的药学上可接受的盐的药物组合物的施予以膀胱内方式进行。

14.如权利要求1～3或6～12中任一项所述的方法、或者权利要求4或5所述的应用，其中，膀胱癌为非肌层侵入性膀胱癌。

15.如权利要求1～14中任一项所述的方法或应用，其中，化合物1、化合物1的药学上可接受的盐、或包含前述中任一者的药物组合物的施予为通过膀胱内方式的施予。

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