BR112020024605A2 - Métodos para o tratamento de câncer de bexiga - Google Patents

Abstract

métodos para o tratamento de câncer de bexiga. trata-se de métodos para o tratamento de câncer de bexiga.

Description

“MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DE CÂNCER DE BEXIGA” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Não aplicável.

ANTECEDENTES

[0002] STING (estimulador de genes de interferon) é uma molécula sinalizadora na resposta inata ao dsDNA no citosol. A deleção de STING foi relatada em vários cânceres humanos. Além disso, a desregulação da sinalização de STING em cânceres humanos também foi relatada em melanoma (Xia T, et al., “Recurrent Loss of STING Signaling in Melanoma Correlates with Susceptibility to Viral Oncolysis” Cancer Res. 2016) e câncer de cólon. (Xia T, et al., “Deregulation of STING Signaling in Colorectal Carcinoma Constrains DNA Damage Responses and Correlates With Tumorigenesis” Cell Rep. 2016; 14: 282 a 297). Curiosamente, nesses estudos, os resultados da análise genômica mostraram que a perda de expressão de STING não se deve à deleção ou mutação do gene, mas por meio de alterações epigenéticas. (Xia, Cancer Res. 2016; Xia, Cell Rep. 2016). A atividade de proteção contra o câncer de STING também é apoiada por evidências obtidas a partir de estudos de modelos de camundongos. Camundongos knockout para STING mostraram controle de tumor defeituoso. (Woo SR, et al. “STING-dependent cytosolic DNA sensing mediates innate imune recognition of immunogenic tumors” Immunity 2014; 41: 830 a 842).

[0003] Além disso, o papel de STING na proteção da ontogênese foi demonstrado em vários modelos espontâneos de camundongo, incluindo glioma (Ohkuri T, et al., “Protective role of STING against gliomagenesis: Rational use of STING agonist in anti-glioma immunotherapy” Oncoimmunology. 2015; 4: e999523) e câncer de cólon (Zhu Q, et al., "Cutting edge: STING mediates protection against colorretal tumorigenesis by governing the magnitude of intestinal inflammation" J. Immunol. 2014; 193: 4.779 a 4.482). Esse efeito antitumoral pode ser devido à sua capacidade de conter a sobreativação de NF-kB e STAT3. (Okihuri 2015). A ativação da via STING também mostrou atividade potente em modelos pré-clínicos de tumor de camundongo. (Woo 2014; Chandra D, et al. “STING ligand c-di-GMP improves cancer vaccination against metastatic breast cancer” Cancer Immunol Res. 2014; 2: 901 a 910; Corrales l, et al., “Direct Activation of STING in the Tumor Microenvironment Leads to Potent and Systemic Tumor Regression and Immunity” Cell Rep. 2015; 11: 1.018 a 1.030; Curran E, et al. “STING Pathway Activation Stimulates Potent Immunity against Acute Myeloid Leukemia” Cell Rep. 2016; 15: 2.357 a 2.366; Tang CH, et al. “Agonist-Mediated Activation of STING Induces Apoptosis in Malignant B Cells” Cancer Res. 2016; 76: 2.137 a

2.152). Essa atividade antitumoral é provavelmente devido à ruptura da vasculatura tumoral e seguida pela indução da resposta imune adaptativa. (Corrales l, et al., “The host STING pathway at the interface of cancer and immunity” J. Clin. Invest. 2016; 126: 2.404 a 2.411). Consequentemente, a estimulação direta ou intratumoral de STING em um microambiente tumoral por um agonista pode representar uma nova abordagem para o tratamento do câncer.

[0004] Além disso, o câncer de bexiga é o quarto e o décimo primeiro câncer mais comum em homens e mulheres, respectivamente, com uma via única de administração de fármacos para pacientes com câncer em estágio inicial (Kamat et al., “What is new in non-muscle-invasive bladder cancer in 2016?” Turk J Urol 2017; 43(1): 9 a 13). Em 2018, aproximadamente

81.190 novos casos de câncer de bexiga foram estimados nos Estados Unidos, e cerca de 17.240 mortes por câncer de bexiga são esperadas (site da American Cancer Society). A administração de BCG (Bacillus Calmette-Gueri) é a opção de tratamento de linha de frente para o câncer de bexiga não invasivo do músculo de alto risco (NMIBC). Infelizmente, até 40% dos pacientes não responderão ao tratamento com BCG e muitos desses pacientes terão que se submeter a um procedimento de cistectomia radical para remover toda a bexiga (Zlotta, AR, et al., “The management of BCG failure in non- muscle-invasive bladder cancer: an update”, Can Urol Assoc J 2009; 3(Suppl4):

S199 a 205) deixando os pacientes com pior qualidade de vida após a cirurgia. Portanto, há uma necessidade médica significativa não atendida de terapias alternativas eficazes para o câncer de bexiga para evitar ou atrasar a cistectomia radical.

BREVE SUMÁRIO

[0005] As modalidades podem fornecer um método para tratar câncer de bexiga em um paciente em necessidade de tratamento, que compreende administrar ao paciente o Composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: (Composto 1)

[0006] Em algumas modalidades, o sal farmaceuticamente aceitável administrado de acordo com modalidades, como relatado no presente documento, é um sal de diamônio ou um sal de trietilamina (TEA). As modalidades adicionais podem fornecer tratamento de câncer de bexiga administrando a um paciente em necessidade de tratamento para câncer de bexiga uma composição farmacêutica que inclui o Composto 1 ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0007] As modalidades adicionais podem fornecer um método para tratar câncer de bexiga em um paciente em necessidade de tratamento, que compreende administrar ao paciente Composto 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:

Composto 2

[0008] As modalidades adicionais podem fornecer uso do Composto 1, Composto 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como relatado no presente documento para preparação de uma composição farmacêutica para tratar câncer de bexiga.

[0009] As modalidades podem fornecer uso do Composto 1, Composto 2, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou composição farmacêutica incluindo o Composto 1, Composto 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em um tratamento de câncer de bexiga.

[0010] As modalidades podem fornecer um método para tratar câncer de bexiga que compreende identificar um indivíduo com um câncer de bexiga tratável pelo Composto 1, Composto 2, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma composição farmacêutica que inclui o Composto 1, Composto 2, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; e administrar ao dito indivíduo uma quantidade terapeuticamente aceitável do Composto 1, Composto 2, um sal farmaceuticamente aceitável ou composição farmacêutica através da qual o câncer de bexiga foi identificado como tratável.

[0011] Em algumas modalidades, o indivíduo é identificado como tendo um câncer de bexiga tratável pelo Composto 1, Composto 2, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma composição farmacêutica que inclui o Composto 1, Composto 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, por uma presença de um alelo variante REF STING no paciente.

[0012] Algumas modalidades fornecem um método para tratar câncer de bexiga em um paciente como alelo REF STING que compreende administrar ao dito paciente o Composto 1, Composto 2, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma composição farmacêutica que inclui o Composto 1, Composto 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0013] Algumas modalidades fornecem um método para tratar câncer em um paciente com alelo WT STING que compreende administrar ao dito paciente um Composto 1, Composto 2, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma composição farmacêutica que inclui o Composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0014] Algumas modalidades fornecem um método para tratar câncer em um paciente com alelo AQ STING que compreende administrar ao dito paciente o Composto 1, Composto 2, um sal farmaceuticamente aceitável do Composto 1, Composto 2 ou uma composição farmacêutica que inclui o Composto 1, Composto 2, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0015] Algumas modalidades fornecem um método para tratar câncer em um paciente com alelo HAQ STING que compreende administrar ao dito paciente Composto 1, Composto 2, um sal farmaceuticamente aceitável do Composto 1, Composto 2 ou uma composição farmacêutica que inclui o Composto 1, Composto 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0016] Em algumas modalidades, o Composto 1 é fornecido como um ácido livre. Em algumas modalidades, o composto é fornecido como um sal NH4 ou como um sal de trietilamina (TEA).

[0017] As modalidades podem fornecer um método para tratar câncer de bexiga em um paciente em necessidade do mesmo, incluindo administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente aceitável do Composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como relatado acima.

[0018] As modalidades podem fornecer um método para tratar câncer de bexiga em um paciente que compreende administrar ao dito paciente o Composto 1, Composto 2 ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma composição farmacêutica, como relatado no presente documento. Os cânceres de bexiga tratados como relatado no presente documento podem ser carcinoma urotelial.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0019] A Figura 1 mostra uma síntese do Composto 1a. Essa síntese também é relatada no Pedido de Patente nº US 15/898.533, depositado em 17 de fevereiro de 2018, e incorporado ao presente documento a título de referência.

[0020] A Figura 2A e Figura 2B mostram uma síntese alternativa do Composto 1 e Composto 1a. Essa síntese alternativa também é mostrada na Figura 2C a Figura 2E.

[0021] A Figura 3 mostra uma espectrografia de 1H RMN para o Composto 1.

[0022] A Figura 4A, Figura 4B e Figura 4C mostram resultados de cristalografia de raios X (desenhos ORTEP) para, respectivamente, um cristal assimétrico do Composto 1, uma primeira molécula do cristal assimétrico, e uma segunda molécula do cristal assimétrico.

[0023] A Figura 5 mostra um retrato da estrutura de cristal de raios X de WT STING humano em complexo com o Composto 1.

[0024] A Figura 6 mostra domínio C-terminal de REF STING humano em complexo com o Composto 1.

[0025] A Figura 7 mostra volumes tumorais quantificados por MRI dos dias 20 a 21.

[0026] A Figura 8 mostra curvas de sobrevivência para todos os grupos no Exemplo 4 em tratamento de câncer de bexiga.

[0027] A Figura 9 mostra um mapa de vetor de expressão para WT STING (STING-Puro humano de pLenti-WT).

[0028] A Figura 10 e Figura 11 acompanham o Exemplo 108 e mostram atividade curativa do Composto 1a em um modelo de tumor duplo CT26.

[0029] A Figura 12 acompanha o Exemplo 109 e mostra uma plotagem de volume tumoral para tumores tratados e curva de sobrevivência.

[0030] A Figura 13 acompanha o Exemplo 110 e mostra uma plotagem de volume tumoral para tumores tratados e curva de sobrevivência.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE MODALIDADES

[0031] É fornecido no presente documento um composto (Composto 1) e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, bem como composições farmacêuticas que podem ser úteis no tratamento de câncer de bexiga. O Composto 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, bem como composições farmacêuticas que incluem o Composto 2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, também podem ser uteis no tratamento de câncer de bexiga. Os compostos podem ativar o estimulador de genes de interferon (STING).

[0032] Esse é o Composto 1:

[0033] Esse é o Composto 2:

[0034] Em algumas modalidades, o Composto 1 é fornecido como um ácido livre. Em algumas modalidades, o composto é fornecido como, por exemplo, um sal de NH4. A referência a “Composto 1a” irá indicar um sal de diamônio do Composto 1.

[0035] As modalidades podem fornecer um método para tratar câncer de bexiga em um paciente em necessidade do mesmo, incluindo administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente aceitável do Composto 1, Composto 2 ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0036] As composições farmacêuticas para tratar o câncer de bexiga também podem ser fornecidas incluindo um composto, como relatado no presente documento, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, bem como um excipiente farmaceuticamente aceitável. As modalidades como relatado no presente documento podem ser usadaas para tratar câncer de bexiga ou para preparar medicamentos úteis para o tratamento de câncer de bexiga.

[0037] Os indivíduos versados na técnica reconhecem que onde substituintes ligados aos átomos de fósforo (P1, P2) têm ligações simples e duplas, eles podem ser suscetíveis à tautomerização. Por exemplo, os compostos podem tautomerizar em equilíbrio. Um exemplo é mostrado abaixo:

[0038] Esses tautomeros devem ser considerados como estando dentro do escopo das reivindicações. Uma representação estrutural de qualquer tautômero para um dado composto irá representar o mesmo composto. Métodos de Tratamento

[0039] As modalidades podem fornecer um método para tratar câncer de bexiga em um paciente em necessidade do mesmo, incluindo administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente aceitável de um Composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0040] Em algumas modalidades, o Composto 1 é fornecido como um ácido livre ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em algumas modalidades, o composto administrado é fornecido como um sal de NH4, um ácido livre ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em algumas modalidades, o composto é fornecido como um sal de NH4.

[0041] Algumas modalidades fornecem um método para tratar câncer de bexiga que compreende administrar a um paciente em necessidade de tratamento uma quantidade terapeuticamente aceitável de um agonista de STING. Nessas modalidades, a administração pode ser, mas nao é necessário ser, administração intravesicular. Exemplos de agonistas de STING potenciais que podem ser usados no tratamento de câncer de bexiga, e que podem ser, mas não precisam ser, administrados intravesicularmente, incluem, mas nao se limitam àqueles identificados no Pedido de Patente nº US 15/898.533, depositado em 17 de fevereiro de 2018; Pedido PCT n° PCT/US2018/018556, depositado em 17 de fevereiro de 2018; Pedido PCT n° PCT/US2018/018561, depositado em 17 de fevereiro de 2018; US 2014/0205653 A1; US

2014/0329889 A1; US 2014/0341976 A1; US 2007/0149462 A1; WO 2018/098203 A1; WO 2018/198076 A1; WO 2018/198084 A1; WO 2018/140831 A2; US 2014/0341976 A1; WO 2015/185565 A1; US 7.709.458 B2; US

7.592.326; US 7.569.555 B2; US 2014/0205653 A1; US 2014/0341976 A1; US 2015/0056224 A1; US 2016/0362441 A1; US 2017/0158724 A1; US 2017/044206 A1; US 5.547.941; US 7.569.555 B2; US 7.592.326 B2; US

7.709.458 B2; US 9.549.944 B2; WO 2009/133560 A1; WO 2015/074145 A1; WO 2015/077354 A1; WO 2015/185565 A1; WO 2016/100261 A1; WO 2016/120305 A1; WO 2016/145102 A1; WO 2017/027645 A1; WO 2017/027646 A1; WO 2017/075477 A1; WO 2019/043634 A2; WO 2019/046496 A1; WO 2019/046498 A1; WO 2019/046500 A1; WO 2019/046511 A1; WO 2017/093933 A1; WO 2017/123657 A1; WO 2017/175156 A1; EP 1740.192 B1; CN 102199183 A; Fu, J., et al., “STING Agonist Formulated Cancer Vaccines Can Cure Established Tumors Resistant to PD-1 Blockade”, Sci. Translational Med., 7(283): 283ra52, (15 de abril de 2015); Corrales, l. et al., “Direct Activation of STING in the Tumor Microenvironment Leads to Potent and Systemic Tumor Regression and Immunity”, Cell Reports, 11: 1.018 a 1.030 (2015); e Lioux, T. et al., “Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Novel Cyclic Adenosine- Inosine Monophosphate (cAIMP) Analogs That Activate Stimulator of Interferon Genes (STING)”, J. Med. Chem., 59: 10.253 a 10.267 (2016). Todos esses documentos, incluindo os compostos nos mesmos, estão incorporados ao presente documento a título de referência; se algum composto de qualquer um desses compostos contradizer ou de alguma forma for inconsistente com qualquer coisa nesse relatório descritivo, então, o controle é desse relatório descritivo. Dosagens

[0042] A dose ideal para o tratamento do câncer de bexiga pode ser determinada empiricamente para cada indivíduo usando métodos conhecidos e dependerá de uma variedade de fatores, incluindo a atividade dos agentes; a idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do indivíduo; o tempo e a via de administração; e outros medicamentos que o indivíduo está tomando. As dosagens ideais podem ser estabelecidas usando testes de rotina e procedimentos que são bem conhecidos na técnica. A administração dos compostos acima pode ser feita por qualquer via adequada.

[0043] “Sal farmaceuticamente aceitável”, tal como aqui utilizado refere-se a sais de adição de ácido ou sais de adição de base dos compostos na revelação. Um sal farmaceuticamente aceitável é qualquer sal que retém a atividade do composto original e não confere qualquer efeito indevidamente deletério ou indesejável sobre um indivíduo a quem é administrado e no contexto em que é administrado. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, complexos metálicos e sais de ácidos inorgânicos e carboxílicos. Os sais farmaceuticamente aceitáveis também incluem sais metálicos, como alumínio, cálcio, ferro, magnésio, manganês e sais complexos. Além disso, sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, sais de ácido como acético, aspártico, alquilssulfônico, arilssulfônico, axetil, benzenossulfônico, benzoico, bicarbônico, bissulfúrico, bitartárico, butírico, edetato de cálcio, camsílico, carbônico, clorobenzoico, cítrico, edético, edisílico, estólico, esil, esílico, fórmico, fumárico, glucético, glucônico, glutâmico, glicólico, glicolilarsanílico, hexâmico, hexilresorcinoico, hidrabâmico, bromídrico, clorídrico, cloridrato, iodídrico, hidroxinaftoico, isetiônico, láctico, lactobiônico, maleico, málico, malônico, mandélico, metanossulfônico, metilnítrico, metilssulfúrico, múcico, mucônico, napsílico, nítrico, oxálico, p-nitrometanossulfônico, pamoico, pantotênico, fosfórico, mono- hidrogênio fosfórico, di-hidrogênio fosfórico, ftálico, poligalactourônico, propiônico, salicílico, esteárico, succínico, sulfâmico, sulfanílico, sulfônico, sulfúrico, tânico, tartárico, teóclico, toluenossulfônico e similar. Os sais de sódio e sais de potássio também podem ser preparados.

[0044] As modalidades podem ser sais de diamônio. Os sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser derivados de aminoácidos incluindo, mas não se limitando a, cisteína. Os métodos para produzir compostos como sais são conhecidos daqueles indivíduos versados na técnica (consulte, por exemplo, Stahl et al., Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, Wiley-VCH; Verlag Helvetica Chimica Acta, Zurich, 2002; Berge et al., J. Pharm. Sci. 66: 1, 1977).

[0045] Uma “quantidade eficaz” ou “quantidade terapeuticamente aceitável” de um agente terapêutico é uma quantidade suficiente para fornecer um benefício terapêutico observável comparado a câncer de bexiga deixado sem tratamento em um indivíduo ou paciente.

[0046] Os agentes ativos como relatado no presente documento podem ser combinados com um carreador farmaceuticamente aceitável para fornecer formulações farmacêuticas dos mesmos. A escolha particular de carreador e formulação irá depender da via de administração particular para a qual a composição é destinada.

[0047] “Carreador farmaceuticamente aceitável” como usado no presente documento se refere a um carreador, adjuvante ou veiculo não tóxico que não destrói a atividade farmacológica do composto com o qual é formulado. Carreadores, adjuvantes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis que podem ser usados nas composições dessa invenção incluem, mas não se limitam a, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas parciais de glicerídeo de ácidos graxos vegetais saturados, água, sais ou eletrólitos, fosfato de hidrogênio dissódico, fosfato de hidrogênio potássico, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, pirolidona polivinílica, substâncias à base de celulose, polietileno glicol, carboximetilcelulose de sódio, poliacrilatos, ceras, polietileno glicol e gordura de lã.

[0048] As composições da presente invenção podem ser adequadas para administração parenteral, oral, spray de inalação, tópica, retal, nasal, bucal, intravesicular, vaginal ou administração de reservatório implantado, etc. Em algumas modalidades, a formulação compreende ingredientes que são de fontes naturais ou não naturais. Em algumas modalidades, a formulação ou carreador pode ser fornecido em uma forma estéril. Exemplos não limitadores de um carreador estéril incluem água livre de endotoxina ou água livre de pirogênio. As composições podem ser administradas através de administração intravesicular.

[0049] O termo “parenteral” como usado no presente documento inclui técnicas de injeção ou infusão subcutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-sinovial, intraesternal, intratecal, intra-hepática, intralesional e intracraniana ou infusão. Em modalidades particulares, os compostos são administrados por via intravenosa, oral, subcutânea ou via administração intramuscular. As formas injetáveis estéreis das composições dessa invenção podem ser suspensões aquosas ou oleaginosas. Essas suspensões podem ser formuladas de acordo com técnicas conhecidas na técnica, utilizando agentes dispersantes ou molhantes e agentes de suspensão adequados. A preparação injetável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injetável estéril em um diluente ou solvente não tóxico parentericamente aceitável. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão água, solução de Ringer e solução isotônica de cloreto de sódio. Além disso, óleos fixos estéreis são convencionalmente empregados como um solvente ou meio de suspensão. Em algumas modalidades, as composições são administradas por via intravesicular.

[0050] Para esse propósito, qualquer óleo fixo suave pode ser empregado, incluindo mono ou diglicerídeos sintéticos. Os ácidos graxos e seus derivados glicerídeos são úteis na preparação de injetáveis, assim como os óleos naturais farmaceuticamente aceitáveis, como óleo de oliva ou óleo de rícino, especialmente em suas versões polioxietiladas. Essas soluções ou suspensões de óleo também podem conter um diluente ou dispersante de álcool de cadeia longa, tal como carboximetilcelulose ou agentes de dispersão semelhantes que são comumente usados na formulação de dosagem farmaceuticamente aceitável incluindo emulsões e suspensões. Outros tensoativos comumente usados, tais como Tweens, Spans e outros agentes emulsificantes que são comumente usados na fabricação de sólidos, líquidos ou outras formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis também podem ser usados para os propósitos de formulação.

[0051] Para administração oral, um composto ou sal pode ser fornecido em uma forma de dosagem oral aceitável, incluindo, mas não se limitando a, cápsulas, comprimidos, suspensões ou soluções aquosas. No caso de comprimidos para uso oral, os carreadores comumente usados incluem lactose e amido de milho. Também podem ser adicionados agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio. Para administração oral em forma de cápsula, diluentes úteis incluem lactose e amido de milho seco. Quando suspensões aquosas são necessárias para uso oral, o ingrediente ativo pode ser combinado com agentes emulsificantes e de suspensão. Se desejado, certos agentes adoçantes, aromatizantes ou corantes também podem ser adicionados. Além disso, também podem ser adicionados conservantes. Exemplos adequados de conservantes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se limitam a, vários agentes antibacterianos e antifúngicos, como solventes, por exemplo, etanol, propilenoglicol, álcool benzílico, clorobutanol, sais de amônio quaternário e parabenos (tais como metil parabeno, etil parabeno, propil parabeno, etc.).

[0052] “Liberação imediata” pretende incluir uma liberação convencional, em que a liberação do fármaco começa imediatamente após a administração. Tal como aqui utilizado, o termo “liberação imediata” inclui formas de dosagem que permitem que o fármaco se dissolva no conteúdo gastrointestinal, sem intenção de atrasar ou prolongar a dissolução ou absorção do fármaco. O objetivo é que o fármaco seja liberado rapidamente após a administração, por exemplo, para que seja possível liberar pelo menos 80% do fármaco em aproximadamente 30 minutos após o início da dissolução em um teste de dissolução.

[0053] “Liberação sustentada” ou “liberação prolongada” inclui formas de dosagem cujas características de liberação de fármaco no curso do tempo e/ou localização são escolhidas para atingir objetivos terapêuticos ou de conveniência não oferecidos pelas formas de dosagem convencionais, como uma solução ou forma de dosagem de liberação imediata.

[0054] O termo “estado estacionário” significa que um nível de plasma para um determinado agente ativo foi alcançado e que é mantido com doses subsequentes do agente ativo em um nível que está igual ou acima do nível terapêutico mínimo eficaz e está abaixo do nível plasmático tóxico mínimo para um determinado agente ativo.

[0055] O termo “faixa de dose” como usado no presente documento refere-se a um limite superior e inferior de uma variação aceitável da quantidade de agente especificada. Normalmente, uma dose de um agente em qualquer quantidade dentro da faixa especificada pode ser administrada a pacientes submetidos a tratamento.

[0056] O termo “tratar” é usado neste documento para significar aliviar, reduzir ou aliviar pelo menos um sintoma de uma doença em um indivíduo. Por exemplo, em relação ao câncer de bexiga, o termo “tratar” pode significar interromper, retardar o início (ou seja, o período anterior à manifestação clínica de uma doença ou sintoma de uma doença) e/ou reduzir o risco de desenvolvimento ou agravamento de um sintoma de câncer de bexiga. O termo “proteger” é usado neste documento para significar prevenir atrasos ou tratar, ou todos, conforme apropriado, o desenvolvimento ou continuação ou agravamento dos sintomas de câncer de bexiga em um indivíduo.

[0057] O termo “indivíduo” ou “paciente” se destina a incluir animais, que são capazes de sofrer ou sserem afligidos com câncer de bexiga. Exemplos de indivíduos ou pacientes incluem mamíferos, por exemplo, humanos, cães, vacas, cavalos, porcos, ovelhas, cabras, gatos, camundongos, coelhos, ratos e animais transgênicos não humanos. Em certas modalidades, o indivíduo é um ser humano, por exemplo, um ser humano que sofre de, em risco de sofrer de ou potencialmente capaz de sofrer de câncer de bexiga.

[0058] O termo “cerca de” ou “aproximadamente” geralmente significa dentro de 20%, mais preferencialmente dentro de 10%, e mais preferencialmente ainda dentro de 5% de um dado valor ou faixa. Alternativamente, especialmente em sistemas biológicos, o termo “cerca de” significa aproximadamente dentro de um log (isto é, uma ordem de magnitude) de preferência dentro de um fator de dois de um determinado valor.

[0059] O uso dos termos “um” e “uma” e “o/a” e referentes semelhantes no contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações a seguir) devem ser interpretados para abranger tanto o singular quanto o plural, a menos que indicado de outra forma aqui ou claramente contradito pelo contexto. Os termos “compreende”, “tem”, “inclui” e “contém” devem ser interpretados como termos abertos (ou seja, significando "incluindo, mas não se limitando a"), a menos que indicado de outra forma. A recitação de intervalos de valores neste documento se destina meramente a servir como um método abreviado de referência individual a cada valor separado que está incluído dentro da faixa, a menos que indicado de outra forma aqui, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se fosse individualmente recitado neste documento.

[0060] Os distúrbios proliferativos de células exemplificadores que podem ser tratados usando um ou mais compostos divulgados neste documento incluem, mas não se limitam um câncer, uma condição pré-câncer ou pré-cancerosa e lesões metastáticas em tecidos e órgãos do corpo. Os distúrbios proliferativos celulares podem incluir hiperplasia, metaplasia e displasia.

[0061] Um composto aqui divulgado ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode ser usado para tratar ou prevenir um distúrbio proliferativo celular ou para tratar ou prevenir o câncer, em um indivíduo com risco aumentado de desenvolver câncer em relação à população como um todo, ou usado para identificar candidatos adequados para tais fins. Formulações Farmacêuticas e Vias de Administração

[0062] São aqui fornecidas formulações farmacêuticas compreendendo o Composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo para o tratamento de câncer de bexiga. As formulações farmacêuticas podem compreender adicionalmente um carreador ou excipiente, estabilizante, agente aromatizante e/ou agente corante.

[0063] O Composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo pode ser administrado por uma variedade de vias de administração conhecidas pelos versados na técnica. As vias de administração incluem administração oral e administração intravesicular. Em certas modalidades, uma base farmacêutica compreendendo o composto ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo pode ser tomada por via oral na forma de líquido, xarope, comprimido, cápsula, pó, borrifada, disco mastigável ou solúvel. Alternativamente, as formulações farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas por via intravenosa ou transdérmica. As vias de administração adicionais são conhecidas dos versados na técnica (ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro A. R., Ed., 20ª edição sup., Mack Publishing Co., Easton, Pa).

[0064] Em algumas modalidades, o composto ou sal farmaceuticamente aceitável é formulado na forma de pasta, gelatina ou suspensão. Por exemplo, o fármaco é dissolvido, aprisionado ou suspenso na forma de partículas de fármaco, partículas microencapsuladas ou partículas de fármaco-polímero em uma solução gelatinosa ou semissólido. Uma vantagem de uma gelatina básica oral é que é mais fácil administrar o fármaco a pacientes que têm dificuldade em engolir comprimidos, cápsulas ou pílulas. Em certas modalidades, o composto é completamente misturado e suspenso em um meio apropriado para formar uma pasta ou um gel. Agentes adicionais podem ser opcionalmente misturados para fornecer sabor durante a administração oral. Manteiga de amendoim ou alginato, aromatizado com framboesa e um adoçante, são exemplos dos muitos agentes adequados para mascarar o sabor. Em várias modalidades, a pasta ou gelatina também pode ser formulada com ligantes ou excipientes adequados conhecidos na técnica para administração tópica.

[0065] Os métodos de preparação de formulações de liberação sustentada na forma de comprimidos, cápsulas ou pílulas são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, a formulação de liberação sustentada é preparada revestindo o ingrediente ativo do fármaco com um polímero, de preferência um polímero insolúvel em água. Por exemplo, um polímero insolúvel em água usado no campo farmacêutico como um agente de revestimento de liberação sustentada, um agente de revestimento entérico ou um agente de revestimento gástrico. O polímero insolúvel em água pode incluir, por exemplo, etilcelulose, goma-laca purificada, goma-laca branca, copolímero RS de metacrilato de aminoalquila, ftalato de hidroxipropilmetilcelulose, succinato de acetato de hidroxipropilmetilcelulose, carboximetiletilcelulose, ftalato de acetato de celulose, copolímero l de ácido metacrílico, copolímero LD de ácido metacrílico, copolímero S de ácido metacrílico, copolímero E de metacrilato de aminoalquila ou dietilaminoacetato de acetal polivinílico.

[0066] O tipo, grau de substituição e peso molecular dos polímeros insolúveis em água podem depender da solubilidade do ingrediente ativo em água ou um álcool, o nível de liberação sustentado desejado e semelhantes. Os polímeros insolúveis em água podem ser usados sozinhos ou em combinação. Pode ser ainda incorporado um óleo hidrogenado, ácido esteárico ou cetanol como um agente auxiliar de revestimento e um triglicerídeo de cadeia média, triacetina, citrato de trietil ou cetanol como um plastificante.

[0067] Em algumas modalidades, a liberação sustentada é um comprimido ou grânulo do tipo matriz. O ingrediente ativo pode ser revestido com até 3 tipos diferentes de polímeros. Esses três tipos diferentes de polímeros podem incluir: 1) um polímero insolúvel em água, como etilcelulose; 2) um polímero gelificante independente do pH, tal como hidroxipropilmetilcelulose; e 3) um polímero gelificante dependente do pH, como alginato de sódio. Esses três tipos diferentes de polímeros podem ser usados juntos para atenuar a taxa de liberação dos fármacos.

Formas de Dosagem: Propriedades de Liberação

[0068] As formulações de liberação sustentada podem atingir um certo grau de efeito sustentado. No entanto, a exposição e/ou a biodisponibilidade do ingrediente ativo podem variar com base em uma variedade de fatores, tais como, por exemplo, a janela de absorção, os carreadores ou excipientes usados na fonte, o modo de entrega da fonte e/ou o tempo de trânsito do ingrediente ativo através do trato gastrointestinal do paciente.

[0069] Uma terapia pode conter pelo menos uma porção de liberação sustentada para realizar uma função de liberação sustentada e uma porção de liberação imediata para realizar uma função de liberação imediata. Em certas modalidades, quando a terapia está em uma forma de dosagem única, pode estar na forma de comprimidos formados a partir de uma mistura de grânulos de liberação sustentada que constituem uma porção de liberação sustentada e grânulos de liberação imediata constituindo uma porção de liberação imediata, um preparação de cápsula obtida enchendo uma cápsula com grânulos de liberação sustentada e grânulos de liberação imediata, ou comprimidos revestidos por pressão nos quais uma camada externa constituindo uma porção de liberação imediata é formada em um núcleo interno constituindo uma porção de liberação sustentada. No entanto, não há limitação para as modalidades acima.

[0070] Além disso, não há limitações particulares quanto ao estado de contenção do fármaco na composição ou em uma porção de liberação imediata ou uma porção de liberação sustentada; o composto pode ser disperso uniformemente na composição, porção de liberação imediata ou porção de liberação sustentada, ou pode estar contido em apenas uma parte da composição, porção de liberação imediata ou porção de liberação sustentada, ou pode estar contido de modo que haja um gradiente de concentração.

[0071] Uma porção de liberação sustentada na composição de acordo com a presente invenção pode conter pelo menos uma substância polimérica não dependente de pH ou substância polimérica dependente de pH para controlar a liberação de fármaco.

[0072] Uma substância polimérica não dependente de pH usada aqui pode compreender uma substância polimérica cujo estado de carga dificilmente muda sob condições de pH geralmente encontradas no trato gastrointestinal, especificamente de pH 1 a pH 8. Isso significa, por exemplo, uma substância polimérica que não tem grupos funcionais cujo estado de carga muda dependendo do pH, como grupos funcionais básicos, como grupos amino ou grupos funcionais ácidos, como grupos de ácido carboxílico. Note que a substância polimérica não dependente do pH pode ser incluída para dar à composição de acordo com a presente invenção uma função de liberação sustentada, mas também pode ser incluída para outro propósito. Além disso, a substância polimérica não dependente do pH usada na presente invenção pode ser insolúvel em água, ou pode inchar em água ou se dissolver em água para formar um gel.

[0073] Exemplos de substâncias poliméricas não dependentes de pH insolúveis em água incluem, mas não se limitam a, éteres de celulose, ésteres de celulose e copolímeros de ácido metacrílico-ácido acrílico (nome comercial Eudragit, fabricado por Rohm GmbH & Co. KG, Darmstadt, Alemanha). Os exemplos incluem, mas não se limitam a, éteres alquílicos de celulose, tais como etilcelulose (nome comercial Ethocel, fabricado por Dow Chemical Company, EUA), etilmetilcelulose, etilpropilcelulose ou isopropilcelulose e butilcelulose, éteres aralquílicos de celulose, tais como benzilcelulose, éteres cianoalquil celulose, tais como cianoetilcelulose, ésteres de ácido orgânico de celulose, tais como butirato de acetato de celulose, acetato de celulose, propionato de celulose ou butirato de celulose e propionato de acetato de celulose, copolímeros de acrilato de etila- metacrilato de metila (nome comercial Eudragit NE, fabricado por Rohm GmbH & Co. KG, Darmstadt, Alemanha) e RS copolímero de metacrilato de aminoalquila (nomes comerciais Eudragit RL, Eudragit RS). Não há limitações particulares no diâmetro médio de partícula de um polímero insolúvel em água usado na presente invenção, mas geralmente quanto menor este diâmetro médio de partícula, melhor o desempenho, com o diâmetro médio de partícula preferencialmente sendo de 0,1 a 100 µm, mais preferencialmente de 1 a 50 µm, particularmente de preferência de 3 a 15 µm, mais preferencialmente de 5 a 15 µm. Além disso, exemplos de substâncias poliméricas não dependentes do pH solúveis em água ou que aumentam de volume em água incluem, mas não se limitam a, óxido de polietileno (nome comercial Polyox, fabricado pela Dow Chemical Company, peso molecular 100.000 a 7.000.000), hidroxipropil cellullose de baixa substituição (nome comercial l-HPC, fabricado por Shin-Etsu Chemical, Japão), hidroxipropilcelulose (nome comercial HPC, fabricado por Nippon Soda, Co., Ltd, Japão), hidroxipropilmetilcelulose (nomes comerciais Metolose 60SH, 65SH, 90SH, fabricado pela Shin-Etsu Chemical, Japão) e metilcelulose (nome comercial Metolose SM, fabricado pela Shin-Etsu Chemical, Japão).

[0074] Em algumas modalidades, uma única substância polimérica não dependente do pH pode estar contida na composição ou uma pluralidade de substâncias poliméricas não dependentes do pH pode estar contida. A substância polimérica não dependente de pH, se usada nas modalidades aqui relatadas, pode ser uma substância polimérica insolúvel em água, mais preferencialmente etilcelulose, um copolímero de acrilato de etila- metacrilato de metila (nome comercial Eudragit NE), ou um copolímero RS de metacrilato de aminoalquila (nome comercial Eudragit RL, Eudragit RS). Particularmente preferencial é pelo menos um de etilcelulose e um copolímero RS de metacrilato de aminoalquila. Mais preferencial é a etilcelulose. Não existem limitações particulares na quantidade da substância polimérica não dependente do pH contida na composição; esta quantidade pode ser ajustada conforme apropriado de acordo com a finalidade, como controlar a liberação sustentada do fármaco.

[0075] Uma substância polimérica dependente de pH que pode ser usada nas modalidades relatadas neste documento pode ser uma substância polimérica cujo estado de carga muda sob condições de pH geralmente encontradas no trato gastrointestinal, especificamente de pH 1 a pH

8. Isso significa, por exemplo, uma substância polimérica com grupos funcionais cujo estado de carga muda dependendo do pH, como grupos funcionais básicos, como grupos amino, ou grupos funcionais ácidos, como grupos de ácido carboxílico. Os grupos funcionais dependentes de pH da substância polimérica dependente de pH são de preferência grupos funcionais ácidos, com a substância polimérica dependente de pH mais preferencialmente tendo grupos de ácido carboxílico.

[0076] Uma substância polimérica dependente do pH usada na presente invenção pode ser insolúvel em água, ou pode inchar em água ou se dissolver em água para formar um gel. Exemplos de substâncias poliméricas dependentes do pH utilizadas na presente invenção incluem, mas não se limitam a, substâncias poliméricas entéricas. Exemplos de substâncias poliméricas entéricas incluem, mas não se limitam a, copolímeros de ácido metacrílico-metacrilato de metila (Eudragit L100, Eudragit S100, fabricado por Rohm GmbH & Co. KG, Darmstadt, Alemanha), copolímeros de ácido metacrílico-acrilato de etila (Eudragit L100- 55, Eudragit L30D-55, fabricado por Rohm GmbH & Co. KG, Darmstadt, Alemanha), ftalato de hidroxipropilmetilcelulose (HP-55, HP-50, fabricado por Shin-Etsu Chemical, Japão), succinato de acetato de hidroxipropilmetilcelulose (AQOAT, fabricado pela Shin-Etsu Chemical, Japão), carboximetiletilcelulose (CMEC, fabricado pela Freund Corporation, Japão) e ftalato de acetato de celulose.

[0077] Exemplos de substâncias poliméricas dependentes de pH que incham em água ou se dissolvem em água para formar um gel incluem, mas não se limitam a, ácido algínico, pectina, polímero de carboxivinila e carboximetil celulose. Na presente invenção, uma única substância polimérica dependente do pH pode estar contida na composição, ou uma pluralidade de substâncias poliméricas dependentes do pH pode estar contida. A substância polimérica dependente de pH usada na presente invenção é preferencialmente uma substância polimérica entérica, mais preferencialmente um copolímero de ácido metacrílico-acrilato de etila, um copolímero de ácido metacrílico- metacrilato de metila, ftalato de hidroxipropilmetilcelulose ou succinato de acetato de hidroxipropilmetilcelulose, particularmente de preferência um copolímero de ácido metacrílico-acrilato de etila.

[0078] Ao usar uma substância polimérica dependente de pH no processo de fabricação de uma composição de acordo com a presente invenção, um produto comercialmente disponível de um tipo em pó ou granular, ou um tipo de suspensão em que a substância polimérica dependente de pH foi previamente dispersa em um solvente pode ser usado como está, ou um produto comercialmente disponível pode ser usado disperso em água ou um solvente orgânico. Quanto mais baixo for o diâmetro de partícula da substância polimérica dependente do pH, melhor será o desempenho, com a substância polimérica dependente do pH sendo preferencialmente do tipo pó. No caso de um copolímero de ácido metacrílico-acrilato de etila, um exemplo é Eudragit L100-55. Não há limitações particulares no diâmetro médio de partícula de uma substância polimérica dependente de pH usada na presente invenção, mas o diâmetro médio de partícula é preferencialmente de 0,05 a 100 µm, mais preferencialmente de 0,05 a 70 µm, mais preferencialmente de 0,05 a 50 µm. Além disso, não há limitações particulares sobre a quantidade da substância polimérica dependente do pH, por exemplo, no caso de uma substância polimérica entérica, a quantidade é geralmente de 0,1 a 90 partes em peso, de preferência de 1 a 70 partes em peso, mais preferencialmente de 5 a 60 partes em peso, particularmente de preferência de 10 a 50 partes em peso, com base em 100 partes em peso da composição.

[0079] Uma terapia de acordo com as modalidades relatadas neste documento pode conter ainda qualquer um dos vários aditivos, tais como qualquer um dos vários carreadores farmacologicamente aceitáveis, como diluentes, lubrificantes, aglutinantes e desintegrantes, bem como conservantes, corantes, adoçantes, plastificantes, agentes de revestimento de filme e assim por diante, conforme necessário. Exemplos de diluentes incluem, mas não se limitam a, lactose, manitol, fosfato de cálcio dibásico, amido, amido pré- gelatinizado, celulose cristalina, anidrido silícico leve, silicato de alumínio sintético, metassilicato de aluminato de magnésio ou semelhantes. Exemplos de lubrificantes incluem, mas não se limitam a, estearato de magnésio, estearato de cálcio, talco, estearil fumarato de sódio ou semelhantes. Exemplos de ligantes incluem, mas não se limitam a, hidroxipropilcelulose, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, hidroxipropilmetilcelulose, polivinilpirrolidona ou semelhantes. Exemplos de desintegrantes incluem, mas não se limitam a, carboximetilcelulose, carboximetilcelulose de cálcio, croscarmelose de sódio, carboximetilamido de sódio, hidroxipropilcelulose de baixa substituição ou semelhantes.

[0080] Exemplos de conservantes incluem, mas não se limitam a, ésteres de ácido paraoxibenzoico, clorobutanol, álcool benzílico, álcool fenetílico, ácido desidroacético, ácido sórbico ou semelhantes. Os exemplos preferenciais de corantes incluem, mas não se limitam a, pigmentos de laca insolúveis em água, pigmentos naturais (por exemplo, beta-caroteno, clorofila, óxido férrico vermelho), óxido férrico amarelo, óxido férrico vermelho, óxido férrico preto ou semelhantes. Os exemplos preferenciais de adoçantes incluem, mas não se limitam a, sacarina de sódio, glicirrizato dipotássico, aspartame, estévia ou semelhantes. Exemplos de plastificantes incluem, mas não se limitam a, ésteres de ácidos graxos de glicerol, citrato de trietila, propilenoglicol, polietileno glicol ou semelhantes. Exemplos de agentes de revestimento de filme incluem, mas não se limitam a, hidroxipropilmetilcelulose, hidroxipropilcelulose ou semelhantes. Métodos de Fabricação

[0081] Para fabricar modalidades como relatado no presente documento, um único método convencional ou uma combinação de métodos convencionais pode ser usado. Por exemplo, ao fabricar grânulos contendo fármacos como uma porção de liberação sustentada ou uma porção de liberação imediata, a granulação é a operação principal, mas isso pode ser combinado com outras operações, tais como mistura, secagem, peneiramento e classificação. Como método de granulação, por exemplo, um método de granulação úmida em que um aglutinante e um solvente são adicionados ao pó e a granulação é realizada, um método de granulação seca em que o pó é comprimido e a granulação é realizada, um método de granulação fundida em que um aglutinante que funde com o aquecimento é adicionado e o aquecimento e a granulação são realizados, ou semelhante pode ser usado.

[0082] Além disso, de acordo com o método de granulação, um método de operação, como um método de mistura de granulação usando um misturador planetário, um misturador de parafuso ou semelhante, um método de mistura de granulação de alta velocidade usando um misturador Henschel, um super misturador ou semelhante, um método de granulação por extrusão usando um granulador cilíndrico, um granulador giratório, um granulador de extrusão de parafuso, um granulador do tipo moedor de pélete ou semelhante, um método de granulação a úmido de alto cisalhamento, um método de granulação em leito fluidizado, um método de granulação por compressão, um método de granulação por esmagamento ou um método de granulação por pulverização pode ser usado. Após a granulação, a secagem com um secador, um leito fluidizado ou semelhante, o craqueamento e a peneiração podem ser realizados para obter os grânulos ou grânulos finos para uso. Além disso, um solvente de granulação pode ser usado na preparação da composição de acordo com a presente invenção. Não há limitações particulares a esse solvente de granulação, que pode ser água ou qualquer um dos vários solventes orgânicos, por exemplo, água, um álcool inferior, como metanol ou etanol, uma cetona, como acetona ou metiletilcetona, cloreto de metileno ou uma mistura dos mesmos.

[0083] Para grânulos de liberação sustentada contidos em modalidades, pelo menos um fármaco e pelo menos um selecionado de substâncias poliméricas não dependentes de pH e substâncias poliméricas dependentes de pH são misturados, um diluente e um aglutinante são adicionados conforme necessário, e a granulação é realizada para obter matéria granular. A matéria granular obtida é seca usando um secador de bandeja, um secador de leito fluidizado ou similar, e a peneiração é realizada usando um moinho ou um oscilador, através do qual os grânulos de liberação sustentada podem ser obtidos. Alternativamente, como um método de fabricação de grânulos de liberação sustentada na presente invenção, é possível adicionar pelo menos um fármaco, pelo menos um selecionado de substâncias poliméricas não dependentes de pH e substâncias poliméricas dependentes de pH e, conforme necessário, um diluente e um aglutinante usando um compactador a seco, como um compactador de rolo ou uma máquina de fazer comprimidos em bloco, e realizar a moldagem por compressão enquanto mistura, e então realizar a granulação por quebra até um tamanho adequado. A matéria granular preparada usando tal granulador pode ser usada na forma de grânulos ou grânulos finos de acordo com a presente invenção, ou pode ser posteriormente quebrada usando um moinho de potência, um granulador de rolo, um moinho de velocidade de rotor ou semelhante, e peneirada para obter grânulos de liberação sustentada. Observe que os grânulos de liberação imediata também podem ser fabricados como para os grânulos de liberação sustentada.

[0084] Um produto moldado por compressão pode ser fabricado como uma porção de liberação sustentada contendo fármaco ou porção de liberação imediata, ou como uma composição relatada neste documento usando um único método convencional ou uma combinação de métodos convencionais. Por exemplo, pelo menos um fármaco, pelo menos um selecionado a partir de substâncias poliméricas não dependentes de pH e substâncias poliméricas dependentes de pH, um diluente como manitol ou lactose, um ligante como polivinilpirrolidona ou celulose cristalina, um desintegrante como carmelose sódica ou crospovidona, e um lubrificante como estearato de magnésio ou talco são usados, e a compressão é realizada usando um método comum, pelo qual o produto moldado por compressão pode ser obtido. Neste caso, a formação de comprimidos é a operação principal no método de fabricação do produto moldado por compressão, mas isso pode ser combinado com outras operações, como mistura, secagem, formação de revestimento de açúcar e revestimento.

[0085] Exemplos do método para a formação de comprimidos incluem, mas não se limitam a, moldagem por compressão direta em que pelo menos um fármaco e aditivos farmacologicamente aceitáveis são misturados e, em seguida, a mistura é diretamente moldada por compressão em comprimidos usando uma máquina de fazer comprimidos, e compressão de grânulos a seco ou compressão de grânulos a úmido em que grânulos de liberação sustentada ou grânulos de liberação imediata de acordo com a presente invenção são submetidos à moldagem por compressão após adição de um lubrificante ou desintegrante conforme necessário. Não há limitações particulares na máquina de fazer comprimidos usada na moldagem por compressão; por exemplo, uma máquina de fazer comprimidos de uma única punção, uma máquina de fazer comprimidos giratória ou uma máquina de fazer comprimidos revestida por pressão pode ser usada.

[0086] Os grânulos de liberação sustentada contendo fármaco ou grânulos de liberação imediata, ou produto moldado por compressão de acordo com modalidades aqui podem ser usados como estão na forma de grânulos ou um comprimido como a composição, mas também podem ser submetidos a processamento adicional para fabricar a composição. Por exemplo, o produto moldado por compressão ou grânulos podem render um revestimento de filme usando um material de base de filme, como etilcelulose, caseína, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, copolímero l de ácido metacrílico, ftalato de acetato de celulose, goma laca ou semelhante, ou render um revestimento de açúcar usando um líquido de revestimento de açúcar contendo sacarose, álcool de açúcar, pó de goma arábica, talco ou semelhante, produzindo assim comprimidos revestidos por filme ou comprimidos revestidos por açúcar. Um solvente nessa técnica de revestimento pode ser água purificada, mas também pode ser usado um solvente orgânico como um álcool, uma cetona, um éter ou um hidrocarboneto clorado, ou uma mistura dos mesmos. Por exemplo, etanol, acetona, cloreto de metileno ou semelhante pode ser usado como um solvente orgânico. Além disso, como o aparelho de revestimento, um aparelho normalmente usado em técnicas de revestimento para a fabricação de medicamentos pode ser usado, com exemplos incluindo um aparelho de revestimento por pulverização em que o revestimento é realizado por pulverização de um líquido de revestimento ou semelhante, e um granulador de leito fluidizado de rotor para formação de camadas.

[0087] No caso de fabricação de preparações de cápsulas, as preparações de cápsulas podem ser fabricadas enchendo grânulos de liberação sustentada ou grânulos de liberação imediata como acima, ou minicomprimidos em cápsulas de gelatina dura ou cápsulas de HPMC usando uma máquina automática de enchimento de cápsulas. Alternativamente, no caso das preparações para administração por tubo ou um xarope seco que é usado misturado com água ou semelhante quando tomado, grânulos de liberação sustentada ou grânulos de liberação imediata como acima podem ser misturados com um espessante ou um dispersante, de modo a dispersar esses grânulos, sendo a mistura então transformada em grânulos ou comprimidos. Além disso, um líquido ou gelatina pode ser feito usando água e substâncias selecionadas de dispersantes, emulsificantes, espessantes, conservantes, ajustadores de pH, adoçantes, aromatizantes, fragrâncias e assim por diante. No entanto, com relação a outros métodos de fabricação, não há limitações para os citados acima.

[0088] Para que as modalidades aqui descritas possam ser mais completamente compreendidas, os seguintes exemplos são apresentados. Deve ser entendido que esses exemplos são apenas para fins ilustrativos e não devem ser interpretados como limitantes.

EXEMPLOS

[0089] As abreviações a seguir podem ser usadas ao longo dos exemplos. All: alila DMT: 4,4′-Dimetoxitritila (DMTO-: ) Bz: benzoíla Base de Hunig: i-Pr2NEt (diisopropiletilamina) AllylOH: álcool alílico OAll: -OCH2CHCH2 ACN: acetonitrila All: -CH2CHCH2 2-NitroBnBr: brometo de 2-nitrobenzila Bz: benzoíla i-Pr: isopropila CE: cianoetila ( ) DEAD: azodicarboxilato de dietila DIAD: azodicarboxilato de diisopropila DCM: diclorometano DDTT: N,N-dimetil-N'-(3-tioxo-3H-1,2,4-ditiazol-5-il)formimidamida

DMOCP: 2-cloro-5,5-dimetil-1,3,2-dioxafosfinano 2-óxido TBS: t-butildimetilsilila 3H-benzo[c][1,2]ditiol-3-ona:

[0090] Exemplo 1 -- Síntese do Composto 1a

[0091] Um esquema completo dessa síntese está disponível na Figura 1. Etapa A (100) (101)

[0092] A uma mistura de diisopropilfosforamidita de (2R,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-2-((bis(4- metoxifenil)(fenil)metoxi)metil)-4-fluorotetra-hidrofuran-3-il(2-cianoetila) (Composto 100) (mistura de diastereômeros de fósforo; 80,0 g, 91,332 mmoleses, 1 eq., ChemGenes Corporation catálogo n° ANP-9151), álcool alílico (9,63 ml, 142 mmoles, 1,55 eq.) e trifenilfosfina (38,3 g, 146 mmoles, 1,60 eq.) em THF (1,1 l) foi adicionado DEAD (40% em peso de solução em tolueno; 54,2 ml, 137 mmoles, 1,5 eq.) em temperatura ambiente. A agitação foi continuada em temperatura ambiente e a reação foi monitorada por LC/MS.

Após a conclusão (19 h), a mistura foi concentrada in vacuo (35 °C) e a mistura resultante foi purificada por cromatografia em coluna de gel de sílica (800 g x 2 colunas, 40 a 60% de EtOAc em n-heptano tamponado com 0,5% de trietilamina) para render o Composto 101 como uma espuma branca (84,2 g, rendimento quantitativo, mistura de diastereômeros de fósforo). 1

[0093] H RMN (3:2 mistura de diastereômeros de fósforo, 400 MHz, CDCl3) δ 1,14 - 1,21 (m, 12 H) 2,40 (t, J=6,2 Hz, 1,2 H) 2,59 (t, J=6,2 Hz, 0,8 H) 3,27 (d, J=8,6 Hz, 1 H) 3,52 - 3,66 (m, 5 H) 3,78 (s 2,4 H) 3,79 (s 3,6 H) 4,28 - 4,34 (m, 1 H) 4,84 - 4,96 (m, 0,4 H) 4,99 (d, J=5,5 Hz, 2 H) 4,95 – 5,10 (m, 0,6 H) 5,05 (d, J=10,9 Hz, 1 H) 5,22 (br d, J=17,6 Hz, 1 H) 5,64 (br d, J=53,2 Hz, 0,6 H) 5,70 (br d, J=51,6 Hz, 0,4 H) 5,96 – 6,75 (m, 1 H) 6,20 (d, J=16,0 Hz, 0,6 H) 6,24 (d, J=17,2Hz, 0,4 H) 6,74 - 6,79 (m, 4 H) 7,02 – 7,06 (m, 2H) 7,17 - 7,24 (m, 8 H) 7,32 - 7,34 (m, 2 H) 7,41 - 7,44 (m, 2 H) 8,11 (s, 1H) 8,52 (s, 0,4 H) 8,54 (s, 0,6 H). Etapa B (101) (102)

[0094] A uma solução do Composto 101 (3,00 g, 3,28 mmoles, 1 eq.) em acetonitrila (30 ml) foi adicionada água (0,118 ml, 6,55 mmoles, 2,0 eq) e sal de trifluoroacetato de piridina (0,759 g, 3,93 mmoles, 1,2 eq.). Após agitação em temperatura ambiente durante 1 minuto, terc-butilamina (14,5 g, 21,0 ml, 0,20 mol, 60 eq.) foi adicionado. Após clivagem completa de grupo cianoetila (monitorada por LC/MS), a mistura de reação foi concentrada in vacuo e azeotropada duas vezes com acetonitrila. A mistura crua foi dissolvida em DCM (45,0 ml) e tratada com água (0,118 ml, 6,55 mmoles, 2,0 eq.) e

NaHSO4-SiO2 (1,18 g, 6,55 mmoles, 2 eq.) em temperatura ambiente. Após clivagem completa do grupo DMT (monitorada por LC/MS, aproximadamente 1 hora), a mistura de reação foi filtrada e enxaguada duas vezes com DCM/MeOH (9/1, 20 ml). Os filtratos combinados foram concentrados in vacuo e tratados com mistura de n-heptano/tolueno de 1:1 (~30 ml). A camada de topo foi removida por decantação. A mesma operação foi repetida mais uma vez com n-heptano/tolueno (1/1, 30 ml) e a camada de fundo foi azeotropada duas vezes com acetonitrila para render o Composto 102 (100% de rendimento teórico assumido). O produto foi usado na etapa a seguir sem purificação adicional. Etapa C Cpd (101) (103) (102)

[0095] A uma mistura do Composto 102 (1,56 g, 3,27 mmoles, 1 eq.) e Composto 101 (3,00 g, 3,28 mmoles, 1 eq.) em acetonitrila (30 ml) foi adicionado sal de trifluoroacetato de piridina (azeotropicamente seco com piridina; 0,760 g, 3,94 mmoles, 1,25 eq.). Após 5 minutos, DDTT (0,840 g, 4,09 mmoles, 1,30 eq., ChemGenes Corporation catálogo n° RN-1588) foi adicionado e, após a sulfurização completa (monitorada por LC/MS), a mistura de reação foi concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido em DCM (30 ml) e tratado com água (0,57 ml, 32 mmoles, 10 eq.) e 6% de ácido dicloroacético (1,56 ml, 18,9 mmoles, 6,0 eq.) em DCM (30 ml). Após 20 minutos, a reação foi arrefecida com piridina (20 ml) e concentrada in vacuo. O resíduo foi azeotropado com piridina para render o Composto 103 (3,22 g, 100% de rendimento teórico assumido). O produto foi usado na etapa a seguir sem purificação adicional. Etapa D (103) (104)

[0096] A uma solução do Composto 103 (3,22 g, 3,15 mmoles, 1 eq.) em piridina (100 ml) foi adicionado DMOCP (1,45 g, 7,88 mmoles, 2,50 eq) em temperatura ambiente. Após macrociclização completa (monitorada por LC/MS), água (1,7 ml, 94,5 mmoles x10 vezes em relação a DMOCP) foi adicionada seguida por 3H-benzo[c][1,2]ditiol-3-ona (0,795 g, 4,73 mmoles, 1,5 eq.). Após sulfurização completa (aproximadamente 40 minutos), a mistura de reação foi parcialmente concentrada in vacuo a aproximadamente 15 ml e vertida em uma mistura de NaHCO3 aquoso saturado (50 ml) e água (30 ml). Após 10 min de agitação em temperatura ambiente, a mistura foi extraída com mistura de EtOAc/MTBE de 1:1 (60 ml x 3 vezes). As camadas orgânicas foram combinadas, lavadas com salmoura (25 ml), secas sobre MgSO4 e concentradas in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (0 a 20% de MeOH em DCM) para render o Composto 104 (3,31 g, 3,20 mmoles, 100% de rendimento teórico assumido) como um óleo marrom. O produto foi usado na etapa a seguir sem purificação adicional. Etapa E (105) (SpRp) (104) (106) (RpRp)

[0097] A uma solução do Composto 104 (3,31 g, 3,20 mmoles, 1 eq.) em acetonitrila (66,2 ml) foi adicionado brometo de 2-nitrobenzila (2,42 g, 11,2 mmoles, 3,50 eq.) e trietilamina (1,78 ml, 12,8 mmoles, 4,00 eq). Após reação completa (monitorada por LC/MS, aproximadamente 20 horas em temperatura ambiente), a mistura de reação foi concentrada in vacuo e purificada por cromatografia em coluna de gel de sílica (60% de acetato de etila/n-heptano a 100% de acetato de etila) para render 0,568 g de produto como uma mistura de diastereômeros de fósforo. A separação por HPLC preparativa dos diastereômeros rendeu o Composto 105 (isômero SR; 0,225 g, 0,180 mmol, 5,6% de rendimento total do Composto 101) e Composto 106 (isômero RR; 0,187 g, 0,149 mmol, 4,7% rendimento total do Composto 1).

[0098] Composto 105 (SpRp) 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ = 8,63 (s, 1H), δ = 8,61 (s, 1H), 8,04 – 8,00 (m, 2H), 7,99 (s, 1H), 7,90 (s, 1H), 7,65 - 7,44 (m, 8H), 7,40 - 7,31 (m, 4H), 7,25 - 7,21 (m, 4H), 6,15 - 5,89 (m, 5H), 5,61 (dd, J = 52,0, 5,1 Hz, 1H), 5,55 (ddd, J = 51,2, 4,7, 2,7 Hz, 1H) 5,51 - 5,42 (m, 1H), 5,31 - 5,22 (m, 2H), 5,11 (dd, J = 3,9, 9,8 Hz, 2H), 5,04 - 4,95 (m, 4H), 4,55 - 4,37 (m, 7H), 4,29 - 4,12 (m, 3H).

[0099] Composto 106 (RpRp) 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ = 8,65 (s, 2H), 8,06 (dd, J = 1,4, 8,0 Hz, 2H), 7,98 (s, 2H), 7,57 - 7,52 (m, 6H), 7,47 - 7,32 (m, 6H), 7,25 - 7,21 (m, 4H), 6,15 (d, J = 18,7 Hz, 2H), 6,09 - 5,99 (m, 2H), 5,82-5,76 (m, 2H), 5,60 (dd, J = 51,8, 4,9 Hz, 2H), 5,27 (dd, J = 1,2, 17,2 Hz, 2H), 5,12 (dd, J = 1,0, 10,4 Hz, 2H), 5,06 - 4,96 (m, 4H), 4,55 - 4,40 (m, 4H), 4,36 - 4,24 (m, 4H), 4,21 - 4,02 (m, 2H). Condições de HPLC preparativa: Instrumento Agilent 1200 Waters Sunfire Prep C18 OBD coluna, 5 µm, coluna de HPLC 30 x 250 mm, nº 186003969 Taxa de fluxo 50 ml/min Fase móvel A: água, B: acetonitrila

Tempo (min) 0 8 9.9 10 12 Gradiente B% 50 99 99 50 50 Tempo de execução 12 min Volume de injeção 150 ul (0,08 g/ml em acetonitrila) Detecção UV 254 nm Composto 105 7,7 min Tempo de (SpRp) retenção Composto 106 8,0 min (RpRp) Etapa F (105) (107)

[0100] A uma solução aquecida (90 °C) do Composto 105 (519 mg, 0,414 mmol, 1 eq.) em tolueno (519 ml) foi adicionado o catalisador de segunda geração Hoveyda-Grubbs Catalyst™ ((1,3-Bis-(2,4,6-trimetilfenil)-2- imidazolidinilideno)dicloro(o-isopropoxifenilmetileno)rutênio; disponível em SIGMA-ALDRITCH® catálogo nº 569755; CAS 301224-40-8; 91 mg, 0,15 mmol, 0,35 eq.) e quinona (0,102 ml, 1,243 mmol, 3,0 eq). A mistura foi aquecida até o refluxo e a progressão da reação foi monitorada por LC/MS. Após 3 horas, um catalisador adicional foi adicionado (91 mg, 0,15 mmol, 0,35 eq.) e a reação foi continuada por 3 horas adicionais. Após resfriamento, a mistura foi tratada com DMSO (0,59 ml, 8,3 mmoles, 20 eq.) em temperatura ambiente por 15 horas, concentrada in vacuo e purificada por cromatografia em coluna de gel de sílica (SiO2 25 g, 66% de acetato de etila em n-heptano para 100% de acetato de etila) para render o Composto 107 (200 mg, 0,163 mmol, 39% de rendimento) como uma espuma seca marrom.

[0101] H RMN (400 MHz, CDCl3) δ = 8,19 (s, 1H), 8,12 (dd, J = 7,8 Hz, 1,9 Hz, 1H), 8,10 (s, 1H), 8,02 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,89 (s, 1H), 7,63 (br d, J = 7,0 Hz, 1H), 7,53 - 7,41 (m, 10H), 7,35 - 7,30 (m, 2H), 7,25 - 7,20 (m, 4H), 6,23 (d, J = 17,6 Hz, 1H), 6,14 (d, J = 18,8 Hz, 1H), 5,86 - 5,75 (m, 1H), 5,75 (dt, J = 15,3, 5,0 Hz, 1H), 5,67 (dt, J = 15,3, 4,7 Hz, 1H), 5,60 (dd, J = 52,0, 3,9 Hz, 1H), 5,48 (dd, J = 50,4, 3,9 Hz, 1H)5,50 – 5,39 (m, 1H), 4,91 - 4,64 (m, 4H), 4,57 - 4,25 (m, 9H), 4,15 (d, J = 7,03 Hz, 1H), 4,11 (d, J = 7,03 Hz, 1H). Etapa G (107) (1a)

[0102] A uma solução do Composto 107 (88 mg, 0,072 mmol, 1 eq.) em 1,4-dioxano (1,76 ml) foi adicionado tiofenol (0,88 ml, 8,55 mmoles, 119 eq.) e trietilamina (0,88 ml, 6,31 mmoles, 88 eq.). A mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente. Após reação completa (monitorada por LC/MS, 13 horas), metanol (5,28 ml) e 28% de hidróxido de amônio (3,52 ml) foram adicionados e a mistura resultante foi aquecida a 50 °C. Após a reação completa (monitorada por LC/MS, 5 horas), a mistura foi resfriada à temperatura ambiente e a pasta aquosa amarronzada resultante foi filtrada e enxaguada com água (15 ml). O filtrado foi filtrado novamente para remover sólidos adicionais. O filtrado final foi extraído duas vezes com uma mistura de tolueno e heptano de 1:1 (30 ml). A camada aquosa foi concentrada in vacuo e, então, ressuspensa em água (6 ml). O sólido resultante foi filtrado e o filtrado foi submetido à HPLC preparativa para render o sal de diamônio do Composto 1 (também referido como Composto 1a) (39 mg, 0,050 mmol, 70% de rendimento) como um sólido branco.

[0103] Composto 1a (SpRp, trans) 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ

= 9,05 (s, 1H), 8,33 (s, 1H), 8,25 (s, 1H), 8,12 (s, 1H), 6,34 (br s, 2H), 5,88 (br s, 2H), 5,66 (br d, J = 51,6 Hz, 1H), 5,59 (br d, J = 52,2 Hz, 1H) 5,01 (br s, 2H), 31 4,68 - 4,34 (m, 6H), 4,07 - 3,82 (m, 2H), 3,79 - 3,55 (m, 2H); P RMN (162 MHz, CD3OD) δ = 55,48 (s, 1P), 55,16 (s, 1P).

[0104] Condições de HPLC preparativa do Composto 1a: Instrumento Agilent 1200/1260 AS/FC coluna de HPLC Waters XBridge C18, 10 x 100 mm, nº 1413 Taxa de fluxo 3,0 ml/min Temperatura de 35 °C coluna A: 0,1% de NH4OH em água, B: 0,1% de NH4OH em Fase móvel acetonitrila Gradiente (B%) 0 → 50 Tempo de 20 min execução Volume de injeção 50 ul (4 mg/ml em água) Detecção UV 260 nm Tempo de retenção 6,5 min

[0105] Exemplo 1.1 – Síntese Alternativa para o Composto 1a

[0106] Uma via sintética alternativa para o Composto 1a é ajustada na Figura 2A e Figura 2B, bem como na Figura 2C e relatada abaixo. Estágio 1 (129) (130)

[0107] O Composto 129 (570 g, 1,53 mol, 1 % em peso, 1 vol, 1 eq.) foi dissolvido em piridina (2,85 l, 35,2 moles, 4,89% em peso, 5,0 vols, 23 eq.). A mistura foi resfriada a 2,6 °C e tratada com cloreto de 4,4’-dimetoxitritila (DMTCl; 543 g, 1,60 mol, 0,953% em peso, 1,05 eq.). A mistura foi agitada a 0 a 5 °C por 2 h e, então, deixada aquecer à temperatura ambiente. A reação foi monitorada por LC/MS e a conversão completa foi confirmada após agitação de um dia para o outro. A mistura de reação foi resfriada abaixo de 5 °C e arrefecida por tratamento com MeOH (124 ml, 3,05 moles, 0,172% em peso, 0,217 vol, 2,0 eq.) por 15 minutos. A mistura foi coevaporada com tolueno (2,00 l, 3,04% em peso, 3,51 vol) sob vácuo e, então, diluída com uma mistura de EtOAc (2,850 l, 4,5% em peso, 5,0 vol) e n-heptano (2,85 l, 3,42% em peso, 5,0 vol). A camada orgânica foi lavada com NaHCO3 saturado (9% em peso de solução em água; 2,0 l, 3,5 vol). Um EtOAc adicional (2,85 l, 4,5% em peso, 5,0 vol) foi adicionado para dissolver completamente o produto cru. Após agitado por 5 minutos, as duas camadas foram separadas. A camada orgânica foi lavada com água (2,0 l, 3,5% em peso, 3,5 vol). O sólido começou a precipitar lentamente fora da camada orgânica. A camada de água foi separada. A camada orgânica foi, então, concentrada a aproximadamente 1 vol. O produto cru foi misturado com uma mistura de n-heptano (2,00 l, 2,40% em peso, 3,51 vol) e tolueno (0,50 l, 0,76% em peso, 0,88 vol). Após agitação por 15 minutos, o sólido amarelo pálido foi coletado por filtração a vácuo. O bolo de filtro foi sequencialmente enxaguado com: (1) uma mistura de n-heptano (0,60 l, 0,72% em peso, 1,05 vol) e tolueno (0,30 l, 0,46% em peso, 0,53 vol), e depois (2) n- heptano (3,00 l, 3,6% em peso, 5,26 vol). O sólido foi seco sem calor por 30 minutos e depois transferido para bandejas para secar a 50 °C em um forno a vácuo de um dia para o outro para render o Composto 130 como sólido amarelo pálido (996,7 g, 1,47 mol, 1,75% em peso, 97% de rendimento). 1

[0108] H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 8,99 (s, 1H), 8,76 (s, 1H), 8,21 (s, 1H), 8,04 - 8,00 (m, 2H), 7,64 - 7,59 (m, 1H), 7,57 - 7,50 (m, 2H), 7,41 - 7,36 (m, 2H), 7,32 - 7,15 (m, 7H), 6,83 - 6,76 (m, 4H), 6,31 (dd, J = 2,5, 17,0 Hz, 1H), 5,68 (ddd, J = 2,3, 4,7, 52,7 Hz, 1H), 4,88 - 4,77 (m, 1H), 4,26 - 4,21 (m, 1H), 3,77 (s, 6H), 3,57 (dd, J = 3,1, 10,9 Hz, 1H), 3,43 (dd, J =

4,1, 10,7 Hz, 1H), 2,60 (br s, 1H). Estágio 1’ (129) (133)

[0109] O Composto 129 (430 g, 1,15 mol, 1% em peso, 1 vol, 1 eq.) e imidazol (118 g, 1,73 mol, 0,274% em peso, 1,50 eq.) foram dissolvidos em DMF (1,72 l, 3,78% em peso, 4,0 vol) e a mistura resultante foi resfriada a 5 °C. TBS-Cl (191 g, 1,27 mol, 0,444% em peso, 1,10 eq.) foi adicionada. A mistura foi agitada a 0 a 11 °C por 2 h, deixada aquecer lentamente à temperatura ambiente (progresso monitorado por LCMS). A reação foi concluída 6 h após a adição de TBS-Cl, ainda deixada agitar em temperatura ambiente por 20 h adicionais. A mistura foi resfriada a 2 °C e tratada com metanol (93 ml, 74 g, 2,3 moles, 0,17% em peso, 0,22% em peso, 2,0 eq.) por 10 minutos. A mistura de reação foi diluída com uma mistura de MTBE (1,72 l, 1,23 kg, 2,96% em peso, 4,0 vol) e EtOAc (1,72 l, 1,55 kg, 3,60% em peso, 4,0 vol) seguida por NH4Cl saturado (28% em peso de solução em água; 2,15 l, 5,0 vol). Os sólidos começaram a sair lentamente da solução. A mistura foi deixada aquecer a 24 °C e água (1,08 l, 1,08 kg, 2,5% em peso, 2,5 vol) foi adicionada a (T interna = 22 °C). Mais sólidos começaram a precipitar fora da mistura. Uma água adicional (1,08 l, 1,08 kg, 2,5% em peso, 2,5 vol) e MTBE (1,40 l, 1,04 kg, 2,4% em peso, 3,3 vol) foram adicionados à mistura. O sólido esbranquiçado foi coletado por filtração a vácuo. O reator foi enxaguado com água (320 ml, 0,74 vol) e depois MTBE (1,80 l, 1,33 kg, 3,10% em peso, 4,19 vol) para transferir qualquer sólido remanescente para o filtro. O bolo de filtro foi enxaguado sequencialmente com: (1) água (1,80 l, 1,80 kg, 4,2% em peso, 4,2 vol). (2) água (1,80 l, 1,80 kg, 4,2% em peso, 4,2 vol), (3) uma mistura de

MTBE (0,90 l, 0,67 kg, 1,5% em peso, 2,1 vol) e n-heptano (0,90 l, 0,62 kg, 1,4% em peso, 2,1 vol), (4) uma mistura de MTBE (0,90 l, 0,67 kg, 1,5% em peso, 2,1 vol) e n-heptano (0,90 l, 0,62 kg, 1,4% em peso, 2,1 vol). O sólido recuperado foi seco sob vácuo a 40 °C por 2 dias para render o Composto 133 como sólido branco (483 g, 0,991 mol, 1,12% em peso, 86% de rendimento). 1

[0110] H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 8,97 (s, 1H), 8,82 (s, 1H), 8,36 (s, 1H), 8,04 - 8,00 (m, 2H), 7,64 - 7,58 (m, 1H), 7,56 - 7,51 (m, 2H), 6,40 (dd, J = 2,3, 16,0 Hz, 1H), 5,45 (ddd, J = 2,7, 4,3, 53,1 Hz, 1H), 4,75 - 4,66 (m, 1H), 4,22 - 4,17 (m, 1H), 4,07 (dd, J = 2,3, 11,7 Hz, 1H), 3,91 (dd, J = 2,7, 11,7 Hz, 1H), 2,38 (dd, J = 2,7, 7,0 Hz, 1H), 0,92 (s, 9H), 0,11 (s, 3H), 0,11 (s, 3H). Estágio 2 (130) (131)

[0111] O Composto 130 (993 g, 1,47 mol, 1% em peso, 1 vol, 1 eq.) e imidazol (150 g, 2,20 moles, 0,151% em peso, 1,5 eq) foram dissolvidos em DMF (3,48 l, 3,28 kg, 3,3% em peso, 3,5 vol) e a mistura foi resfriada a 5 °C. TBS-Cl (244 g, 1,62 mol, 0,245% em peso, 1,10 eq.) foi adicionado. A reação foi agitada a 0 a 5 °C por 2 h, deixado aquecer lentamente à temperatura ambiente e monitorada por LCMS. Após 17 h, um imidazol adicional (100 g, 1,47 mol, 0,10% em peso, 1,0 eq) e TBS-Cl (111 g, 735 mmoles, 0,112% em peso, 0,50 eq) foram adicionados e a agitação foi continuada em temperatura ambiente por 2 h e a 35 °C por 2 h. A mistura resultante foi resfriada a 13,6 °C e tratada com MeOH (119 ml, 2,94 moles, 2 eq.) por 10 minutos. Em um reator separado foi adicionado gelo (5 kg, 5% em peso) e NH4Cl saturado (28% em peso de solução em água; 5,0 l, 5 vol). A mistura de reação foi adicionada à mistura de gelo/NH4Cl. Um sólido esbranquiçado começa a precipitar fora da solução imediatamente. 2 kg de gelo adicional (2 kg, 2% em peso) e água (3,0 l, 3 vol) foram adicionados à mistura. O frasco de reação foi enxaguado com água (0,50 l, 0,5 vol) e o rinsato foi adicionado à mistura. n-heptano (2,00 l, 2 vol) foi adicionado à mistura e a agitação foi continuada por 10 minutos. O sólido esbranquiçado foi coletado por filtração a vácuo. O bolo de filtro foi enxaguado com: (1) água (4,0 l, 4,0 vol), (2) água (4,0 l, 4,0 vol), (3) n-heptano (4,0 l, 4,0 vol), (4) n-heptano (4,0 l, 4,0 vol). O sólido recuperado foi seco sob vácuo a 45 °C por 4 dias para render o Composto 131 como sólido esbranquiçado (1,095 kg, 1,39 mol, 1,10% em peso, 94% de rendimento). 1

[0112] H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 9,09 (s, 1H), 8,78 (s, 1H), 8,28 (s, 1H), 8,02 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,63 - 7,59 (m, 1H), 7,55 - 7,50 (m, 2H), 7,37 (d, J = 7,1 Hz, 2H), 7,29 - 7,17 (m, 7H), 6,79 (d, J = 7,9 Hz, 4H), 6,29 (dd, J = 2,9, 16,2 Hz, 1H), 5,60 (ddd, J = 2,7, 3,9, 53,1 Hz, 1H), 4,78 (ddd, J = 4, 7, 6,4, 15,8 Hz, 1H), 4,26 - 4,22 (m, 1H), 3,77 (s, 6H), 3,58 (dd, J = 3,1, 10,9 Hz, 1H), 3,26 (dd, J = 3,7, 10,7 Hz, 1H), 0,85 (s, 9H), 0,10 (s, 3H), 0,02 (s, 3H). Estágio 3 (131) (132)

[0113] O Composto 131 (1.000 g, 1,27 mol, 1% em peso, 1 vol, 1 eq.) e trans-2-buteno-1,4-diol (geometria de olefina confirmada por 1H-RMN; 335 g, 3,80 moles, 0,335% em peso, 3,0 eq.) foram azeotropados duas vezes com THF (3,0 l, 3,0 vol). O resíduo foi dissolvido em uma mistura de THF (10 l,

10 vol) e tolueno (15 l, 15 vol). Trifenilfosfina (432 g, 1,65 mol, 0,432% em peso, 1,3 eq) foi adicionado e depois a mistura de reação foi resfriada a -5 °C.

DIAD (0,320 l, 1,65 mol, 333 g, 0,333% em peso, 0,320 vol, 1,3 eq.) foi adicionado lentamente por 20 minutos, enquanto mantinha a T interna abaixo de 5 °C.

A reação foi agitada a 0 a 5 °C por 1 h e monitorada por LCMS.

O banho de gelo foi removido e a mistura foi deixada aquecer até a ta.

Após agitação de um dia para o outro (17h), uma trifenilfosfina (83 g, 0,32 mol, 0,083% em peso, 0,25 eq.) e DIAD (62 ml, 0,32 mol, 64 g, 0,064% em peso, 0,062 vol, 0,25 eq.) foram adicionados.

Após 1 h adicional à ta, a mistura de reação foi diluída com MTBE (10 l, 10 vol), lavada duas vezes com NaCl meio saturado (18% em peso de solução em água; 2 x 4 l) e concentrada a vácuo até um óleo espesso.

A mistura foi dissolvida novamente em uma mistura de MTBE (4,00 l, 4 vol) r n-heptano (0,50 l, 0,5 vol) e depois resfriada a 0 °C.

Um cristal de semente de óxido de trifenilfosfina foi adicionado à solução.

Os sólidos lentamente começaram a precipitar fora da solução e foi agitada de um dia para o outro.

O sólido branco foi coletado por filtração a vácuo e enxaguado com MTBE (2 l, 2 vol) para isolart 540 g de óxido de trifenilfosfina.

O filtrado foi concentrado e purificado por Biotage 150L KP-Sil (SiO2 5 kg; pré-tratado com 1% TEA em Hep/etOAc; eluentes: heptano/EtOAc (48 l de 33% EtOAc com 1% TEA, 24 l de 50% EtOAc com 1% TEA, 24 l de 66% EtOAc com 1% TEA) → 100% EtOAc com 1% TEA). A coluna foi monitorada por TLC (2:1 EtOAc/n- heptano). As frações do produto limpo foram combinadas e concentradas sob vácuo para render o Composto 132 como um sólido de espuma branca pálida (634 g, continha 14% em peso de coproduto derivado de DIAD, líquido 545 g, 0,63 mol, 50% rendimento ajustado). As frações da mistura foram combinadas e concentradas sob vácuo para render sólido de espuma amarela pálida (750 g), que foi submetido à repurificação por Biotage 150M HP-Sphere (2,5 kg SiO2; pré-tratado com 1% TEA em Hep/EtOAc; amostra carregada com eluentes de tolueno: Hep/EtOAc/1%TEA (12 l de 50% EtOAc com 1% TEA,16L 66% EtOAc com 1% TEA) → EtOAc com 1% TEA). A coluna foi monitorada por

TLC (2/1/0,03 EtOAc/n-hep/TEA). As frações do produto limpo foram combinadas e concentradas sob vácuo para render o Composto 132 adicional como um sólido de espuma branca pálida (206 g, 0,24 mol, 18% de rendimento). 1

[0114] H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 8,58 (s, 1H), 8,10 (s, 1H), 7,43 - 7,37 (m, 2H), 7,32 - 7,28 (m, 2H), 7,24 - 7,15 (m, 8H), 7,03 - 6,98 (m, 2H), 6,78 - 6,73 (m, 4H), 6,18 (dd, J = 2,7, 17,2 Hz, 1H), 5,88 (td, J = 5,5, 15,6 Hz, 1H), 5,77 (td, J = 5,1, 15,6 Hz, 1H), 5,60 (ddd, J = 2,7, 4,3, 53,1 Hz, 1H), 5,03 - 4,96 (m, 2H), 4,91 (ddd, J = 4,5, 6,6, 16,6 Hz, 1H), 4,18 - 4,14 (m, 1H), 3,88 - 3,82 (m, 2H), 3,78 (s, 6H), 3,52 (dd, J = 2,7, 10,9 Hz, 1H), 3,14 (dd, J = 3,5, 10,9 Hz, 1H), 0,85 (s, 9H), 0,10 (s, 3H), 0,01 (s, 3H). Estágio 4 (132)(1 eq) (133) (1.5 eq) (134)

[0115] O Composto 132 (800 g, 0,930 mol, 1% em peso, 1 vol, 1 eq.) e Composto 133 (522 g, 1,07 mol, 0,652% em peso, 1,15 eq.) foram azeotropicamente secos com THF (2 x 3 l, 2 x 3,8 vol) e redissolvidos em THF (9,60 l, 8,45 kg, 12,0 vol) à ta. Trifenilfosfina (317 g, 1,21 mol, 0,396% em peso, 1,30 eq.) foi adicionada e a mistura foi resfriada abaixo de -5 °C. DIAD (226 ml, 1,16 mol, 235 g, 0,294% em peso, 0,283 vol, 1,25 eq.) foi adicionado abaixo da T-interna de 7 °C. A reação foi deixada aquecer à ta lentamente. A reação foi monitorada por LCMS. Após 21 h, a mistura de reação foi concentrada a vácuo até um óleo espesso, azeotropada com n-heptano (2,00, 1,37 kg, 1,71% em peso, 2,50 vol) e depois redissolvida em uma mistura de MTBE (2,40 l, 1,78 kg, 2,2% em peso, 3,0 vol) e n-heptano (800 ml, 547 g, 0,68% em peso, 1,0 vol). A solução foi semeada com óxido de trifenilfosfina e coletada a 5 °C, diluída com n-heptano (400 ml, 274 g, 0,34% em peso, 0,50 vol) e agitada a 5 °C por 30 minutos. O precipitado de sólido branco foi coletado por filtração a vácuo e enxaguado com mistura de 2:1 (v/v) de MTBE e n-Heptano (1,8 l) para render óxido de trifenilfosfina (455 g). O filtrado foi concentrado sob vácuo e purificado por Biotage 150 l KP-Sil (SiO2 5 kg; pré-tratado com 1% TEA; amostra carregada pela dissolução em eluentes de tolueno: 9:1 heptano/EtOAc (16 l) e 15 TEA, 3,6:1 (46 l), 2:1 (20 l) e 1% TEA, 1:1 (30 l) e 1% TEA, e 100% EtOAc (16 l) e 1% TEA). As frações do produto limpo combinadas foram concentradas sob vácuo para render o Composto 134 como espuma de sólido esbranquiçado (662,2 g). As frações da mistura foram combinadas e concentradas sob vácuo (480 g). Um sólido insolúvel branco formado por diluição com tolueno (300 ml) antes de carregamento em Biotage 150 l foi removido por filtração a vácuo. O material solúvel em tolueno foi purificado por Biotage 150M HP-Sphere (SiO2 2,5 kg (pré-tratado com 1% TEA); carregamento de amostra com tolueno; eluentes: 2:1 heptano/EtOAc (26 l) p/ 1% TEA, 1:1 (25 l) p/ 1% TEA, 1:4 (34 l) p/ 1% TEA). A coluna foi monitorada por TLC (1:1 heptano/EtOAc). As frações do produto limpo combinadas foram concentradas sob vácuo para render Composto 134 adicional como espuma de sólido esbranquiçado (165,5 g. Total 662,2+165,5 g = 827,7 g, 930 mmoles, 1,03% em peso, 67% de rendimento). 1

[0116] H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 8,47 (s, 1H), 8,39 (s, 1H), 8,20 (s, 1H), 8,01 (s, 1H), 7,38 - 7,31 (m, 5H), 7,27 - 7,19 (m, 6H), 7,14 - 7,06 (m, 3H), 6,93 - 6,87 (m, 2H), 6,76 (d, J = 8,6 Hz, 4H), 6,26 (dd, J = 2,0, 16,0 Hz, 1H), 6,15 (dd, J = 2,7, 17,2 Hz, 1H), 5,86 (dd, J = 4,7, 15,2 Hz, 1H), 5,80 (dd, J = 4,7, 15,2 Hz, 1H), 5,51 (ddd, J = 2,7, 4,3, 52,8 Hz, 1H), 5,31 (ddd, J = 2,0, 4,3, 52,8 Hz, 1H), 4,87 (d, J = 4,7 Hz, 2H), 4,85 - 4,81 (m, 1H), 4,79 (d, J = 4,3 Hz, 2H), 4,71 - 4,59 (m, 1H), 4,20 - 4,13 (m, 2H), 4,06 (dd, J = 2,7, 11,3 Hz, 1H), 3,90 (dd, J = 2,7, 11,7 Hz, 1H), 3,77 (s, 6H), 3,52 (dd, J = 3,1, 10,9 Hz, 1H), 3,18 (dd, J = 3,9, 10,9 Hz, 1H), 0,92 (s, 9H), 0,84 (s, 9H), 0,10 (s, 3H), 0,09 (s, 6H), 0,07 (s, 3H). Estágio 5-6

(134) (135) (136)

[0117] A uma solução do Composto 134 (410,7 g, 309 mmoles, 1% em peso, 1 vol, 1 eq.) em piridina (1,23 l, 1,21 kg, 15,2 moles, 2,9% em peso, 3,0 vol, 49 eq.) foi adicionado fosfito de difenila (90 ml, 109 g, 0,46 mol, 0,26% em peso, 0,22 vol, 1,5 eq). A reação foi agitada à ta e foi monitorada por LCMS. Após 2 h (80% de conversão), um fosfito de difenila adicional (29,9 ml, 36,2 g, 155 mmoles, 0,088% em peso, 0,073 vol, 0,50 eq.) foi adicionado. Após 1 h adicional, um fosfito de difenila extra (6,0 ml, 7,2 g, 31 mmoles, 0,018% em peso, 0,015 vol, 0,10 eq.) foi adicionado e a reação foi continuada por mais 0,5 h (98% de conversão). A mistura de reação foi adicionada a uma mistura de NaHCO3 saturado (9% em peso de solução em água; 2,1 l, 5 vol) e água (1,0 l ml, 2,5 vol) enquanto mantinha T interna 4,7 a 12 °C. O reator foi enxaguado com um pequeno volume de EtOAc. A agitação continuou à ta por 30 minutos e monitorou a reação por LCMS (100% de conversão). A mistura de reação foi extraída duas vezes com mistura 1:1 de EtOAc e MTBE (2 x 8,2 l, 2 x 20 vol). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (4,1 l, 10 vol), concentradas a vácuo e azeotropadas com tolueno (3 x 4,1 l, 3 x 10 vol; alimentação contínua) para remoção de piridina para render o Composto 135 (0,55 eq. de piridina restante).

[0118] Estágio 6 –O Composto 135 cru foi dissolvido em diclorometano (3,08 l, 4,07 kg, 9,9% em peso, 7,5 vol) em temperatura ambiente. Água (55,7 ml, 0,136 vol, 10 eq.) foi adicionada seguida por uma solução de ácido dicloroacético (77 ml, 120 g, 0,93 mol, 0,29% em peso, 0,19 vol, 3,0 eq.) em DCM (3,08 l, 7,5 vol), enquanto mantinha a T interna abaixo de 25 °C. (Tornando-se uma solução laranja). Após 30 min, trietilsilano (Et3SiH; 494 ml, 359 g, 3,09 moles, 0,875% em peso, 1,20 vol, 10,0 eq.) (T interna deixada de 18,2 °C a 17 °C) foi adicionado e a agitação foi continuada por 20 min.

Trietilamina (431 ml, 313 g, 3,09 moles, 0,762% em peso, 1,05 vol, 10,0 eq) foi adicionada (T interna deixada de 17,8 °C a 22 °C). A mistura foi concentrada a 1,55 kg (3,8% em peso), redissolvida em EtOAc (6,2 l, 5,5 kg, 14% em peso, 15 vol), sequencialmente lavada com: (1) água (1,0 l, 2,5 vol) e NaHCO3 saturado (9% em peso de solução em água, 0,82 l, 2,0 vol). A solução EtOAc de produto cru foi armazenada a -20 °C de um dia para o outro; 0,82 l, 2,0 vol) e no dia seguinte, uma solução foi concentrada a vácuo a 25 °C.

A mistura crua assim obtida (654 g) foi triturada com: (1) n-heptano (3,01 l, 7,5 vol), (2) uma mistura de n-heptano (2,46 l, 6,0 vol) e tolueno (0,82 l, 2,0 vol). A parte da solução (sobrenadante) foi decantada e o sólido restante no fundo foi dissolvido em acetonitrila (4,1 l, 10 vol). A mistura foi concentrada a vácuo a 25 °C e azeotropada com acetonitrila duas vezes para render o Composto 136. O produto foi usado para o estágio subsequente sem purificação (100% teórico de rendimento presumido). Estágio 7

(136) (137) dr 3-4:1

+ (240) (Isômero R)

(138) (Isômero S)

[0119] Estágio 7a Composto 136 (337 g, 309 mmoles, 1% em peso, 1 vol, 1 eq.) foi dissolvido em piridina anidra (13,5 l, 13,2 kg, 39% em peso, 40 vol) à ta. Trietilamina (129 ml, 927 mmoles, 94 g, 0,28% em peso, 0,38 vol, 3,0 eq.) foi adicionada seguida por 2-cloro-5,5-dimetil-1,3,2- dioxafosfinano 2-óxido (DMOCP; 103 g, 556 mmoles, 0,31% em peso, 1,80 eq.). A mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente por 30 minutos e monitorada por LCMS (100% de conversão) para gerar o Composto 137.

[0120] Estágio 7b TEA (129 ml, 927 mmoles, 94 g, 0,28% em peso, 0,38 vol, 3,0 eq), água (100 ml, 5,56 moles, 0,30% em peso, 0,30% em peso, 18 eq) e enxofre (34,7 g, 1,08 mol, 0,10% em peso, 3,5 eq.) foram adicionados à mistura de Composto 137 acima. Após 90 minutos (100% de conversão), NaHCO3 (9% em peso de solução em água; 3,37 l, 10 vol) foi adicionado enquanto mantinha a T interna abaixo de 30 °C (16,6 °C a 27 °C). A mistura resultante foi filtrada para remoção de sais. O filtrado foi concentrado, a mistura em vácuo diluída com MTBE (5,1 l, 15 vol), e lavada duas vezes com NaCl (30% em peso de solução em água; 2 x 1,35 l, 2 x 4 vol). Os sólidos insolúveis foram filtrados e o filtrado foi concentrado em vácuo e azeotropado com tolueno (4,0 l, 12 vol). O sólido resultante foi removido por filtração e a mistura crua foi dissolvida em tolueno e purificada por Biotage 150L KP-Sil (SiO2 5 kg; pré-tratada com Hep/EtOAc/TEA (1,5/1,5/0,03 CV); eluída com: EtOAc/TEA (3/0,03 CV), EtOAc/MeOH/TEA (4/0,2/0,04 CV), EtOAC/MeOH/TEA (2/0,2/0,02CV) A coluna foi monitorada por TLC (EtOAC/MeOH/TEA=9/1/0,1). As frações contendo o isômero Sp foram combinadas e concentradas sob vácuo para render o Composto 138 como um sólido de espuma rosa claro (isômero Sp; 154 g, 128 mmoles, 0,46% em peso, 41,3% de rendimento). As frações contendo o isômero Rp foram combinadas e concentradas sob vácuo para render o Composto 240 como um sólido de espuma rosa claro (isômero Rp; 64 g, 53 mmoles, 0,19% em peso, 17% de rendimento).

[0121] Composto 138 (isômero Sp):

[0122] H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 8,51 (s, 1H), 8,50 (s, 1H), 8,22 (s, 1H), 8,14 (s, 1H), 7,49 – 7,44 (m, 2H), 7,38 - 7,27 (m, 4H), 7,25 - 7,21 (m, 2H), 7,14 (t, J = 7,1 Hz, 2H), 6,44 (dd, J = 2,5, 13,9 Hz, 1H), 6,18 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 5,78 (td, J = 6,3, 15,6 Hz, 1H), 5,69 (td, J = 4,7, 15,6 Hz, 1H), 5,56 (dd, J = 3,9, 50,8 Hz, 1H), 5,20 - 5,06 (m, 1H), 4,95 - 4,79 (m, 4H), 4,69 (dd, J = 4,3, 16,0 Hz, 1H), 4,54 - 4,38 (m, 3H), 4,35 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 4,32 - 4,29 (m, 1H), 4,05 (dd, J = 1,6, 11,7 Hz, 1H), 3,91 (dd, J = 3,1, 11,7 Hz, 1H), 3,14 - 3,06 (m, 6H), 1,30 (t, J = 7,4 Hz, 9H), 0,91 (s, 9H), 0,90 (s, 9H), 0,12 (s, 3H), 0,08 (s, 3H), 0,06 (s, 3H), 0,05 (s, 3H).

[0123] Composto 240 (isômero Rp): 1

[0124] H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 8,54 (s, 1H), 8,38 (s, 1H), 8,33 (s, 1H), 8,01 (s, 1H), 7,39 - 7,09 (m, 10H), 6,39 (dd, J = 2,3, 14,1 Hz, 1H), 6,13 (d, J = 17,2 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 3,1 Hz, 2H), 5,68 (dd, J = 4,3, 51,2 Hz, 1H), 5,43 - 5,29 (m, 1H), 5,10 - 4,96 (m, 3H), 4,90 - 4,83 (m, 2H), 4,78 - 4,72 (m, 1H), 4,52 (ddd, J = 3,9, 6,6, 17,2 Hz, 1H), 4,44 – 4,35 (m, 2H), 4,31 - 4,26 (m, 1H), 4,20 – 4,12 (m, 2H), 3,87 (dd, J = 3,5, 11,7 Hz, 1H), 3,79 - 3,77 (m, 1H), 3,15 - 3,09 (m, 6H), 1,33 (t, J = 7,4 Hz, 9H), 0,94 (s, 9H), 0,89 (s, 9H), 0,13 (s, 3H), 0,12 (s, 3H), 0,10 (s, 3H), 0,09 (s, 3H). Estágio 8 (138) (139)

[0125] Composto 138 (221 g, 183 mmoles, 1% em peso, 1 vol, 1 eq.) foi dissolvido em uma mistura de piridina (530 ml, 6,56 moles, 519 g, 2,3% em peso, 2,4 vol) e TEA (2,65 l, 19,0 moles, 1,93 kg, 8,7% em peso, 12 vol, 104 eq). Tri-hidrofluoreto de trietilamina (264 ml, 1,62 mol, 262 g, 1,2% em peso, 1,2 vol, 8,9 eq como complexo, 27 eq. HF) foi adicionado e a mistura foi agitada à ta, enquanto a conversão era monitorada por LCMS. Após 3h (97%

de conversão), metoxitrimetilsilano (TMSOMe; 1,40 l, 10,2 moles, 1,06 kg, 4,8% em peso, 6,3 vol, 55 eq.) foi adicionado e a agitação foi continuada por 30 minutos. Um sólido pegajoso revestiu o reator. A parte de solução (sobrenadante) foi decantada. O sólido foi triturado duas vezes com tolueno (2 x 2,2 l, 2 x 10 vol; sobrenadante decantado). O sólido cru restante no reator foi dissolvido em diclorometano (2,2 l, 10 vol) e lavada com NH4Cl (28% em peso de solução em água; 2,2 l, 10 vol). A camada aquosa foi extraída de volta com diclorometano (2,2 l, 10 vol). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com uma mistura de NaCl (36% em peso de solução em água; 1,1 l, 5 vol) e água (1,1 l, 5 vol), e depois concentradas sob vácuo para render o Composto 139 como uma espuma seca castanha (152 g, 155 mmoles, 0,70% em peso, 85% de rendimento). O produto cru foi levado para a próxima etapa sem purificação. Estágio 9 (139) (140)

[0126] Composto 139 (150 g, 153 mmol, 1% em peso, 1 vol, 1 eq.) foi azeotropado com acetonitrila (4 l, 27 vol) e depois redissolvido em acetonitrila (1,05 l, 0,83 kg, 5,5% em peso, 7,0 vol) à ta. Brometo de 2- nitrobenzila (44,4 g, 205 mmoles, 0.30% em peso, 1,34 eq) foi adicionado à ta e a reação foi monitorada por LCMS. Após 23 h (100% de conversão), EtOAc (1,50 l, 10 vol), NH4Cl (28% em peso de solução em água; 300 ml, 2 vol) e água (300 ml, 2 vol) foram adicionados (pH = 6) e a mistura resultante foi parcialmente concentrada sob vácuo a 25 °C até um peso de 1,11 kg. EtOAc (2,25 l, 15 vol) foi adicionado e a mistura foi agitada por 5 minutos. As duas camadas foram separadas. A camada aquosa foi extraída com acetato de etila (750 ml, 5 vol). As camadas orgânicas combinadas foram sequencialmente lavadas com: (1) uma mistura de NaCl (36% em peso de solução em água; 300 ml, 2 vol) e água (300 ml, 2 vol) e (2) água (600 ml, 4 vol). A camada orgânica foi depois concentrada sob vácuo e azeotropada com n-heptano (1,50 l, 10 vol). MTBE (0,95 l, 6,3 vol) foi adicionado ao sólido cru e a mistura foi aquecida a 40 °C. A mistura foi diluída com EtOAc (300 ml, 2 vol) e lentamente resfriada a 0 °C. O sólido denso foi deixado assentar e o sobrenadante foi bombeado através de um tubo de fritas de filtro. O sólido foi enxaguado duas vezes com MTBE (2 x 300 ml, 2 x 2 vol; sobrenadante bombeado através do tubo de fritas de filtro cada vez) e seco sob vácuo a 40 °C de um dia para o outro para render o Composto 140 como sólido amarelo pálido (156 g). O filtrado foi concentrado sob vácuo rendendo um óleo marrom (17,8 g), que foi submetido à purificação por Biotage Snap-Ultra 340 g (eluentes: 0 a 5% MeOH em EtOAc) para render Composto 140 adicional como sólido amarelo pálido (5,8 g). Total 156 g + 5,8 g = 161,8 g (líquido 152 mmoles, 95% puro, 99% de rendimento). 1

[0127] H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 8,46 (s, 1H), 8,15 (s, 1H), 8,10 (s, 1H), 8,09 - 8,06 (m, 1H), 7,89 (s, 1H), 7,54 - 7,51 (m, 1H), 7,49 - 7,45 (m, 4H), 7,37 - 7,28 (m, 3H), 7,24 - 7,19 (m, 3H), 7,16 - 7,11 (m, 2H), 6,22 (d, J = 16,8 Hz, 1H), 6,14 (dd, J = 2,7, 17,2 Hz, 1H), 5,83 - 5,61 (m, 3H), 5,60 - 5,48 (m, 1H), 5,07 (dd, J = 3,5, 51,6 Hz, 1H), 5,06 - 4,96 (m, 1H), 4,79 (dd, J = 4,9, 15,8 Hz, 1H), 4,69 (d, J = 5,9 Hz, 2H), 4,67 - 4,56 (m, 1H), 4,48 - 4,40 (m, 3H), 4,37 – 4,30 (m, 1H), 4,27 (d, J = 5,9 Hz, 2H), 4,19 - 4,13 (m, 1H), 3,93 - 3,85 (m, 1H), 3,85 – 3,78 (m, 1H). Estágios 10-11

(140) (141) (142) (143) (SR) dr~5:1 + (241) (SS)

[0128] Estágio 10 Composto 140 (95% puro, líquido 73,2 g, 72,3 mmoles, 1% em peso, 1 vol, 1 eq.) e 2-cianoetil N,N,N’,N’- tetraisopropilfosforodiamidita (25,3 ml, 79,5 mmoles, 0,33% em peso, 0,35 vol, 1,10 eq.) foram azeotropados com acetonitrila anidro três vezes (3 x 2 l), redissolvidos em diclorometano (0,73 l, 10 vol) e resfriados a 0 a 5 °C. Tetrazolida de diisopropilamônio (6,19 g, 36,1 mmol, 0,085% em peso, 0,50 eq) foi adicionado. A mistura resultante de reação foi agitada a 0 °C por 10 h, aquecida a 10 °C por 2 h, mantida a 10 °C por 10 h e aquecida até a ta por 2 h. A reação foi monitorada por LCMS e TLC (EtOAc com 0,5% TEA). Após 18 h, acetonitrila anidro (0,73 l, 10 vol) foi adicionado e a mistura foi armazenada a - 20 °C por 3 dias.

[0129] Estágio 11a A mistura do Estágio 10 foi aquecida à temperatura ambiente eadicionada por um funil de gotejamento em porções (100 ml a cada 30 minutos, por 9 h) em uma mistura de sal de trifluoroacetato de piridina (azetropada juntamente com piridina duas vezes; 41,9 g, 217 mmoles, 0,57% em peso, 3,0 eq) e acetonitrila (5,85 l, 80 vol). A reação foi monitorada por LCMS. Após 13 h, uma solução de 2-cianoetil N,N,N’,N’- tetraisopropilfosforodiamidita (5,8 ml, 18 mmoles, 0,25 eq) em acetonitrila (24 ml) foi adicionada por 4 h. A quantidade do reagente adicional foi determinada com base no Composto 140 restante (~30% com base em LCMS). Mais conversão do diol foi observada após 6 h.

[0130] Estágio 11b ((Dimetilaminometilideno)amino)-3H-1,2,4- ditiazolina-3-tiona (DDTT; 20,8 g, 101 mmoles, 0,28% em peso, 1,4 eq.) foi adicionada e agitação foi continuada por 1 h. A mistura de reação foi parcialmente concentrada a ~800 ml e diluída com MTBE (1,46 l,20 vol), NaHCO3 (9% em peso de solução em água; 1,1 l, 15 vol) e água (0,37 l, 5 vol). pH= 8. As camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída com uma mistura de MTBE (1,46 l, 20 vol) e EtOAc (1,10 l, 15 vol). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas duas vezes com 30% NaCl aq. (2 x 0,73 l, 2 x 10 vol), concentradas sob vácuo a 35 °C e azeotropadaa com tolueno (1,46 l, 20 vol). LCMS e TLC (EtOAc) indicaram o Composto 143 (SpRp, desejado) : Composto 241 (SpSp) = 5 : 1.

[0131] O produto cru foi purificado por Biotage 150M KP-Sil, (SiO2 2,5 kg; eluentes: EtOAc/Hep: 2:1 (4 CV), 3:1 (2,5 CV), 4:1 (2,5 CV), 100% EA (3 CV), 5-10% MeOH em EA 4 CV) para render o Composto 143 (36 g, 31,5 mmoles, 44% de rendimento). 1

[0132] Composto 143 (SpRp): H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 8,59 (s, 1H), 8,10 (s, 1H), 8,03 - 7,99 (m, 1H), 7,91 (s, 1H), 7,56 - 7,53 (m, 2H), 7,49 - 7,40 (m, 5H), 7,35 - 7,28 (m, 2H), 7,24 - 7,16 (m, 4H), 6,92 (s, 1H), 6,29 (d, J = 14,9 Hz, 1H), 6,08 (d, J = 20,7 Hz, 1H), 5,97 - 5,83 (m, 1H), 5,76 (td, J = 4,7, 15,6 Hz, 1H), 5,61 - 5,51 (m, 2H), 5,40 (d, J = 4,3 Hz, 1H), 5,29 - 5,17 (m, 1H), 4,91 (dd, J = 7,4, 14,9 Hz, 1H), 4,86 - 4,75 (m, 3H), 4,63 (dd, J = 3,7, 9,2 Hz, 1H), 4,58 - 4,43 (m, 5H), 4,34 - 4,19 (m, 4H), 2,79 (td, J = 5,9, 16,8 Hz, 1H), 2,66 (td, J = 6,3, 16,8 Hz, 1H). 1

[0133] Composto 241 (SpSp) H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 8,11 (s, 1H), 8,03 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,94 (s, 1H), 7,90 (s, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,56 - 7,40 (m, 7H), 7,33 - 7,28 (m, 2H), 7,23 - 7,17 (m, 4H), 6,22 (d, J = 17,6 Hz, 1H), 6,15 (d, J = 18,8 Hz, 1H), 5,85 (dd, J = 3,5, 51,2 Hz, 1H), 5,75 - 5,45 (m, 5H), 4,95 - 4,23 (m, 14H), 2,82 (t, J = 6,1 Hz, 2H). Estágio 12

(144) (143) (1)

[0134] Composto 143 (71.6 g, 62.6mmol, 1% em peso, 1 vol, 1 eq.) foi dissolvido em 1,4-dioxano (0,43 l, 6 vol). Tiofenol (215 ml, 2,09 moles, 230 g, 3,2% em peso, 3 vol, >30 eq) foi adicionado seguido por trietilamina (215 ml, 1,54 mol, 156 g, 2,2% em peso, 3 vol). Alguma exotermia foi observada (T interna aumentada por ~7 °C), portanto, água/banho de gelo foi usado paara resfriar e controlar a T interna abaixo de 27 °C. A reação foi monitorada por LCMS. Após 2 h, MeOH (0,57 l, 8 vol) e NH4OH (28% em peso%; 15 moles, 0,57 l, 8 vol, >200 eq) foram adicionados. A mistura resultante foi aquecida a 50 °C por 5 h, resfriada à ta e agitada de um dia para o outro. Após 14 h, água (0,72 l, 10 vol) foi adicionada (nenhum sólido foi observado) e a mistura foi extraída três vezes com mistura 1:1 (v/v) de n- heptano e tolueno (3 x 0,86 l, 3 x 12 vol), seguida por tolueno (0,57 l, 8 vol). A camada aquosa foi concentrada a vácuo a 40-50 °C e diluída com água (1,07 l, 15 vol). A pasta aquosa resultante foi mantida de um dia para o outro à ta. O sólido resultante foi filtrado, enxaguado com água (0,36 l, 5 vol). O filtrado ainda estava turvo e filtrado em celite e um filtro Kuno. A turvação ainda se manteve presente. HCl (1,0 M solução em água; 132 ml, 132 mmoles, 2,1 eq.) foi adicionado por 1 h e o pH foi verificado (pH <2). A agitação foi continuada à ta por 1 h e a mistura foi filtrada. O bolo de filtro foi enxaguado com água (8 x 0,20 l), seco em um forno a vácuo a 35 °C por 2 dias e sem calor por 1 dia para render o Composto 1 como sólido laranja pálido (44,88 g, 60,1 mmoles, 0,63%

em peso, 96% de rendimento). Estágio 13 (1) (ácido livre de API) (1a) (sal de diamônio de API)

[0135] Ao Composto 1 de ácido livre (22,42 g, 30,03 mmoles, 1% em peso, 1 vol, 1 eq.) foi adicionada amônia (2,0 M solução em MeOH; 220 ml, 440 mmoles, 10 vol, 15 eq). EtOH (55 ml, 2,5 vol) foi adicionado e a solução resultante foi filtrada em um filtro Kuno (0,45 micron; PTFE), enxaguada com mistura 1:1 (v/v) de MeOH e EtOH (90 ml, 4 vol). O filtrado foi concentrado a vácuo a 30 °C rendendo um sólido esbranquiçado, que foi seco à ta de um dia para o outro, triturado com uma espátula (fácil de quebrar) e seco adicionalmente a vácuo à ta. O sólido isolado foi então suspenso em tolueno (250 ml) e agitado à ta por 30 minutos. O sólido foi depois coletado por filtração a vácuo e enxaguado com tolueno duas vezes (2 x 50 ml). O sólido foi depois seco sob vácuo em um forno a vácuo para render 22,4 g do Composto 1a (o sal de diamônio do Composto 1).

[0136] Recristalização: Composto 1a (22,14 g, 28,36 mmoles, 1 peso, 1 vol, 1 eq) foi dissolvido em uma mistura de água (664 ml, 30 vol) e hidróxido de amônio (28% em peso; 2,5 ml, 18 mmoles, 0,63 eq) ) (pH = 9-10) e extraído com tolueno três vezes (3 x 300 ml, 3 x14 vol), EtOAc três vezes (3 x 200 ml, 3 x 9 vol) e tolueno três vezes (3 x 300 ml, 3 x 14 vol). A camada aquosa resultante foi tratada com HCl (solução 1,0 M em água; 90 ml, 90 mmoles, 3,2 eq) ao longo de um período de 3,5 horas (pH ≤ 2). A mistura foi agitada durante 30 minutos e, em seguida, o precipitado sólido foi recolhido por filtração a vácuo. O bolo de filtração foi lavado com água três vezes (3 x 200 ml, 3 x 9 vol) e seco a vácuo durante a noite. Amônia (solução 2,0 M em

MeOH; 250 ml, 500 mmol, 17,6 eq) e etanol (100 ml) foram adicionados ao sólido e a mistura resultante foi concentrada a vácuo até aparecerem cristais (~ 100 ml), momento em que a concentração parou e a mistura foi agitada durante 20 minutos. Etanol (45 ml) foi adicionado e a mistura foi parcialmente concentrada (45 ml removidos). A mesma operação foi repetida mais duas vezes e, em seguida, a mistura foi resfriada a 0 °C e agitada durante 3,5 h. O sólido branco foi coletado por filtração a vácuo e lavado com etanol frio (20 ml) seguido por acetato de etila (2 x 50 ml). O sólido branco foi seco sob vácuo à temperatura ambiente por 3 dias para dar Composto 1a como um sólido branco (16,6 g, 21,3 mmol, 0,75 em peso, rendimento de 75%). O filtrado foi concentrado sob vácuo e seco sob vácuo à temperatura ambiente por 3 dias para dar Composto 1a como um sólido esbranquiçado (4,16 g, 5,3 mmol, 18% de rendimento).

[0137] Exemplo 1.2 – Análise 1H RMN de Composto 1

[0138] Um espectrógrafo 1H RMN de Composto 1a é mostrado na Figura 3. O espectro resultante foi:

[0139] Espectro 1H-RMN (400MHz, DMSO-d6, δH 2,49 ppm, 80 °C)

[0140] δ(ppm)：3,05-3,13(4H, m), 3,70(1H, dd, J=13, 5 Hz), 3,78(1H, dd, J=12, 4Hz), 4,21-4,24(2H, m), 4,28(1H, m), 4,38(1H, m), 4,53- 4,68(2H, m), 5,22(1H, m), 5,76(2H, s), 5,78(1H, m), 6,26(1H, m), 6,29(1H, m), 8,13(1H, s), 8,14(1H, s), 8,36(1H, brs), 8,59(1H, brs).

[0141] Exemplo 1.3 – Análise de Raios X do Composto 1

[0142] Cerca de 2 mg do Composto 1 foram dissolvidos em 600 ul de água. 120 ul desta solução foram colocados em outro frasco de vidro e então esse frasco foi armazenado em recipiente fixo com 3 ml de MeCN em temperatura ambiente por 1 semana. Este é o método de difusão de vapor H2O/MeCN de preparação de amostra.

[0143] Um bloco de cristal único incolor (0,1 x 0,1 x 0,1 mm) encontrado na solução de cristalização foi disperso em Parabar 10312 líquido e foi montado em um Dual-Thickness MicroMountsTM (MiTeGen). Os dados de difração foram coletados a -160 °C no XtaLAB PRO P200 MM007HF (Rigaku) com o método de oscilação do eixo ω usando radiação de Cu-Kα monocromada em espelho multicamadas.

[0144] A Figura 4A mostra uma figura ORTEP das moléculas do Composto 1 em uma unidade assimétrica, juntamente com uma série de moléculas de água desordenadas. A Figura 4B mostra a estrutura cristalina de uma das moléculas do Composto 1 da Figura 4A. A Figura 4C mostra a estrutura cristalina da outra molécula do Composto 1 mostrada na Figura 4A.

[0145] A estrutura de cristal do Composto 1 foi resolvida com um fator R final de 0,1354. O parâmetro Flack era quase zero (0,083 (17)), indicando que a configuração absoluta do Composto 1 é (R, S). A análise da estrutura cristalina também indicou que muitas moléculas de água estavam presentes no grande canal do Composto 1, o que indicava que as moléculas de água eram capazes de escapar facilmente do canal. A análise também confirmou que as conformações de ambas as moléculas cristalograficamente independentes da unidade assimétrica eram quase as mesmas.

[0146] Outros parâmetros da análise de raios-X são mostrados abaixo: Temperatura 113 K Comprimento de onda 1,54184 Å Sistema cristalino, grupo espacial Monoclínico, P21 Parâmetro de rede a = 8,1584(3) Å b = 35,451(2) Å c = 15,9146(6) Å β = 91,313(3) ° Volume 4601,7(4) Å3 Valor Z, densidade calculada 4, 1,127 g/cm3 Tamanho de cristal 0,1 × 0,1 × 0,1 mm

Número total de reflexões/número de 52006/17198 reflexões exclusivas [R(intensidade)=0,0876] Integridade 92,2 % Determinação de fase Métodos diretos (SHELXT Versão 2014/5) Método de refinamento Mínimos quadrados de matriz completa em F2 (SHELXL versão 2014/7) Dados/parâmetro 17198/1116 Indicador de qualidade de ajuste 1,545 Residuais: R (I> 2σ (I)) 0,1354 Residuais: Rw 0,3886 Parâmetro Flack 0,083(17) Diferença de pico máximo e mínimo 1,17 e –0,88 e-/Å3

[0147] Exemplo 2 - Complexo de Confirmação da Estrutura de Raios-X com WT STING

[0148] Para entender melhor o mecanismo de ligação ao alvo de nossos novos compostos, a estrutura cristalina de raios-X de WT STING em complexo com os compostos foi determinada.

[0149] A. Expressão e purificação do domínio C-terminal WT STING (resíduo 155-341)

[0150] A sequência de DNA que codifica a proteína WT STING humana do aminoácido 155 a 341 (SEQ ID NO: 4) foi clonada no vetor pET21b, seguindo um marcador His-TEV-Sumo em seu N-terminal (SEQ ID NO: 5). A sequência do pET21b foi depositada em addgene e está disponível aqui: addgene.org/vector-database/2550/; essa sequência é aqui incorporada por referência.

[0151] As células do códon mais BL21 (DE3) de E. coli foram transformadas com este plasmídeo e a expressão da proteína recombinante foi induzida com isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosídeo 0,1 mM (IPTG). A proteína foi purificada a partir da fração solúvel do lisado celular por cromatografia de afinidade Ni-NTA. A etiqueta His-TEV-Sumo foi removida por sumo protease e foi separada de WT STING 155-341 sem etiqueta, usando uma segunda coluna de afinidade Ni-NTA. A proteína foi ainda purificada por cromatografia de troca aniônica e exclusão de tamanho, e foi armazenada em tampão contendo 20 mM Tris HCl pH 7,5 e 150 mM NaCl na concentração de 35 mg/ml.

[0152] B. Cristalização e determinação da estrutura do Domínio C-terminal WT STING no complexo com o Composto 1

[0153] Para cocristalizar WT STING 155-341, com Composto 1, a proteína WT STING foi diluída para 10 mg/ml usando o tampão de armazenamento (20 mM Tris HCl pH 7,5 e 150 mM NaCl) e misturada com Composto 1 (100 estoque mM em DMSO) na proporção molar de 1:5. A mistura foi incubada durante 4 horas a 4 °C e centrifugada a 13.000 rpm durante 20 min antes da cristalização. As bandejas de tela de cristalização foram configuradas usando o método de difusão de vapor de gota suspensa a 18 °C. Os cristais foram cultivados pela mistura de 1 μl de solução WT STING/Composto 1 com um volume igual de solução de poço, contendo HEPES 100 mM pH 7,5, CaCl2 200 mM e 15% (peso/vol) PEG 8000. 20% (peso/volume) PEG 400 foi usado como reagente crioprotetor quando os cristais foram congelados rapidamente em nitrogênio líquido. Conjuntos de dados de difração foram coletados com um detector Pilatus na linha de luz SSRF BL19U1 e processados com HKL3000 e o programa SCALEPACK2MTZ no pacote de software CCP4.

[0154] A estrutura de WT STING 155-341 ligado ao Composto 1 foi determinada por substituição molecular usando o programa PHASER (Maximum Likelihood Molecular Replacement), com PDB ID 4F9E como o modelo de pesquisa inicial. A presença de Composto 1 entre a interface do dímero de WT STING foi confirmada em um mapa de diferença Fo-Fc calculado com as fases do modelo. O modelo foi construído e concluído manualmente com o programa Coot e refinado com o programa Refmac5 no pacote de software CCP4. A estrutura refinada final foi relatada em uma resolução de 2,38 Å no grupo espacial P212121 com célula unitária medida em a = 33,820, b = 78,110, c = 132,212, α = 90,00, β = 90,00, γ = 90,00. Duas cópias de WT STING 155-341 foram identificadas em cada unidade assimétrica de ligação a uma molécula de Composto 1 na interface do dímero.

[0155] C. Interação do Composto 1 com WT STING observada na estrutura de cristal de raios X

[0156] [0153] A Figura 5 mostra uma imagem da estrutura de cristal de raios X de WT STING humano em complexo com o Composto 1. Examinamos a estrutura de cristal de raios X de WT STING humano em complexo com o Composto 1, que foi cocristalizado a partir de uma amostra de Composto 1a. O composto se liga a uma bolsa de interface formada por um dímero da proteína WT STING. As duas faces da base de adenina do composto formam interação de empilhamento π-π com Tyr240 e o grupo de guanidina de Arg238, respectivamente. O ligante de olefina trans forma a interação de van der Waals com a porção alifática da cadeia lateral de Arg 238. O substituinte de flúor na posição C2' do grupo ribose de ninhos de compostos em um orifício hidrofóbico definido por Thr263, Pro264 e Tyr163. O grupo tiofosfato carregado negativamente do composto forma ponte de sal com Arg238 e interações de ligação H com Ser162 e Thr267, respectivamente. Além disso, o grupo tiofosfato também forma interação eletrostática com o grupo guanidina de Arg 232. A região da alça LID de WT STING, consistindo em resíduo 226 a 243, envolve os dois grupos de base e o ligante de olefina trans.

[0157] A. Expressão e purificação do domínio C-terminal REF STING (resíduo 155-341, SEQ ID NO: 6)

[0158] A. Expression and purification of REF STING C-terminal Domain (resíduo 155-341, SEQ ID NO: 6)

[0159] A sequência de DNA que codifica a proteína STING REF humana do aminoácido 155 a 341 (SEQ ID NO: 6) foi clonada no vetor pET21b, seguindo um marcador His-TEV-Sumo em seu N-terminal (SEQ ID NO: 7). A sequência do pET21b foi depositada em addgene e está disponível aqui: addgene.org/vector-database/2550/; essa sequência é aqui incorporada por referência.

[0160] Códon mais células de E. coli BL21 (DE3) foram transformadas com este plasmídeo, e a expressão da proteína recombinante foi induzida com 0,1 mM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG). Proteína foi purificada da fração solúvel de lisado celular por cromatografia de afinidade Ni-NTA. A etiqueta His-TEV-Sumo foi removida por sumo protease e foi separada da REF STING_155-341 sem etiqueta usando uma segunda coluna de afinidade Ni-NTA. A proteína foi ainda purificada por cromatografia de troca aniônica e exclusão de tamanho, e foi armazenada em tampão contendo Tris HCl 20 mM pH 7,5 e NaCl 150 mM em concentração de 24 mg/ml.

[0161] B. Cristalização e determinação da estrutura do domínio C- terminal de REF STING no complexo com o Composto 1

[0162] Para cocristalizar REF STING_155-341 com Composto 1, a proteína REF STING foi diluída a 10 mg/ml usando o tampão de armazenamento (20 mM Tris HCl pH 7,5 e 150 mM NaCl) e misturada com Composto 1 (100 estoque mM em DMSO) na razão molar de 1:5. A mistura foi incubada por 4 horas a 4 °C e centrifugada a 13.000 rpm por 20 min antes da cristalização. As bandejas de tela de cristalização foram configuradas usando o método de difusão de vapor de gota suspensa a 18 °C. Os cristais foram cultivados misturando 1 μl de solução REF STING/Composto 1 com um volume igual de solução de poço, contendo HEPES 100 mM pH 7,5, CaCl2 200 mM e 15% (peso/vol) PEG 8000. 20% (peso/volume) PEG 400 foi usado como reagente crioprotetor quando os cristais foram congelados rapidamente em nitrogênio líquido. Conjuntos de dados de difração foram coletados com um detector Pilatus no feixe de luz SSRF BL18U1 e processados com HKL3000 e o programa SCALEPACK2MTZ no pacote de software CCP4. Essa estrutura é mostrada na Figura 6.

[0163] A estrutura de REF STING_155-341, ligada ao Composto 1, foi determinada por substituição molecular usando o programa PHASER (Substituição Molecular de Máxima Verossimilhança), usando a estrutura WT STING 155-341 previamente determinada (como descrito acima) como o modelo de pesquisa inicial. A presença de Composto 1 entre a interface do dímero de REF STING, foi confirmada em um mapa de diferença Fo-Fc calculado com as fases do modelo. O modelo foi construído e concluído manualmente com o programa Coot e refinado com o programa Refmac5 no pacote de software CCP4. A estrutura refinada final foi relatada em uma resolução de 2,76 Å no grupo espacial P212121 com célula unitária medida em a = 33,733, b = 77,831, c = 131,689, α = 90,00, β = 90,00, γ = 90,00. Duas cópias de REF STING 155-341 foram identificadas em cada unidade assimétrica que se liga a uma molécula de Composto 1 na interface do dímero.

[0164] C. Interação de Composto 1 com REF STING observada em estrutura de cristal de raios X

[0165] A Figura 6 mostra a estrutura de cristal de raios X de REF STING humano em complexo com o Composto 1, que foi cocristalizado a partir de uma amostra de Composto 1a. O composto se liga a uma bolsa de interface formada por um dímero da proteína STING. As duas faces da base de adenina do composto formam interação de empilhamento π-π com Tyr240 e o grupo de guanidina de Arg238, respectivamente. O ligante trans olefina forma interação de van der Waals com a porção alifática da cadeia lateral de Arg238, enquanto a porção de guanidina da cadeia lateral de Arg238 forma interação de empilhamento π-π com o grupo imidazol da cadeia lateral de His232 de fora. O ligante de olefina está em contato com o par de interação das cadeias laterais de Arg238 e His232. O substituinte de flúor na posição C2' do grupo ribose de ninhos de compostos em um orifício hidrofóbico definido por Thr263, Pro264 e

Tyr163. O grupo tiofosfato carregado negativamente do composto forma ponte de sal com Arg238 e interações de ligação H com Ser162 e Thr267, respectivamente. A região do loop LID de REF STING, consistindo de resíduo 226 a 243, envolve os dois grupos de base e o ligante de olefina trans.

[0166] Exemplo 4 - Avaliação in vivo de Composto 1a em um modelo de câncer de bexiga murina usando via de administração intravesicular

[0167] O modelo ortotópico de câncer de bexiga murina MBT-2 foi estabelecido e caracterizado por Lee, et al., ("Tumor Establishment Features of Orthotopic Murine Bladder Cancer Models", Urological Oncology 2012; 53: 396 a 400) em 2012 e mostrou uma histologia semelhante à do câncer de bexiga humana. Portanto, este modelo foi escolhido para avaliar a atividade anticâncer de bexiga do Composto 1. O protocolo com procedimento de pré-tratamento com HCl descrito por Lee, et al. foi aplicado para estabelecer o modelo. Em resumo, 30 µl de solução de HCl 0,1 N foram injetados na bexiga de camundongo através de um cateter e a solução de HCl foi deixada na bexiga por 15 segundos. Em seguida, a solução de HCl foi substituída por 30 µl de solução de NaOH 0,1 N seguida por uma etapa de lavagem com 1 X PBS (pH 7,4). O procedimento de implantação de células tumorais de acompanhamento foi modificado da literatura original. Resumidamente, após uma etapa de lavagem, as células tumorais MBT-2 (2 x106 células em 50 µl de meio RPMI1640) foram instiladas na bexiga e deixadas permanecer por 45 minutos. Ao final desse período de 45 minutos, a bexiga foi drenada.

[0168] Três dias após a implantação das células tumorais, os camundongos foram tratados com doses variadas de Composto 1a, BCG (OncoTICE®, Merck Canada Inc.), anticorpo PD-1 anticamundongo (clone n° RMP1-14, Bioxcell) e um combinação de Composto 1a e anticorpo PD-1 com o cronograma resumido na Tabela 1. Tanto o Composto 1a quanto BCG foram administrados por via intravesicular, enquanto o anticorpo PD1 foi por injeção intraperitoneal.

[0169] Em cada dia de dosagem, BCG foi diluído em NaCl 0,9%

(Lavoisier, França) para atingir a concentração final de 16,875 mg/ml para dosagem. Qualquer solução de dosagem restante foi descartada após o uso. Para o anticorpo anti-PD-1, 1 x PBS (Lonza, França) foi usado para diluir a solução estoque para preparar 1 mg/ml de solução de trabalho para dosagem. Para Composto 1a, uma solução estoque de 10 mg/ml foi primeiro preparada dissolvendo o pó seco em 1 x PBS. Em seguida, concentrações variadas de Composto 1a, incluindo 5 mg/ml (400 µg/grupo de camundongo), 2,5 mg/ml (200 µg/grupo de camundongo) e 1,25 mg/ml (100 µg/grupo de camundongo) foram preparadas por diluição adicional da solução estoque com 1 x PBS.

[0170] Tabela 1. Agentes de tratamento e esquemas de cronograma de dosagem Programa Nº Grupo Tratamento Dose Via de Inj. de animais tratamento 1 10 Veículo - IVe1 Q7Dx3 1,35 2 10 BCG IVe Q7Dx3 mg/camundongo 3 10 Anticorpo PD1 10 mg/kg/inj IP 2 TWx2 100 IVe 4 10 Composto 1ª Q7Dx3 µg/camundongo 200 IVe 5 10 Composto 1ª Q7Dx3 µg/camundongo 400 IVe 6 10 Composto 1ª Q7Dx3 µg/camundongo 400 IVe Composto 1ª Q7Dx3 7 10 µg/camundongo Anticorpo PD1 10 mg/kg/inj IP TWx2

1. IVe, instalação intravesical

2. IP, injeção intraperitoneal

[0171] A partir dos dias 20-21, o crescimento do tumor na bexiga foi quantificado por MRI (imagem de ressonância magnética) e os tamanhos de tumor de todos os camundongos foram representados graficamente como mostrado na Figura 7. A Figura 7 mostra a quantificação do volume tumoral por MRI de dias 20-21 de todos os animais de estudo. Como mostrado na Figura 7, todos os grupos tratados com Composto 1a (Grupo 4 a 7) mostraram volumes tumorais muito menores do que o grupo veículo (Grupo 1), grupo BCG (Grupo 2) e grupo de anticorpo PD1 (Grupo 3).

[0172] O Composto 1a também mostrou um benefício de sobrevivência estatisticamente significativo em relação aos animais tratados com veículo, como mostrado na Figura 8.

[0173] Tanto o BCG quanto o anticorpo anti-PD1 falharam em mostrar atividade anticâncer significativa neste modelo ortotópico de câncer de bexiga de camundongo, sugerindo que o modelo usado é um modelo resistente/refratário ao anticorpo BCG/PD1.

[0174] Exemplo 103 – Ensaio de Repórter de Atividade Agonista de HAQ STING

[0175] As células THP1-Dual™ (InvivoGen, nº Cat thpd-nfis) foram aplicadas para determinação de EC50. As células THP1 Dual™ foram caracterizadas como portadoras do genótipo HAQ STING pelo fornecedor Invivogen (Insight 201402-1). As células foram cultivadas e mantidas nas condições recomendadas pelo fabricante. A indução da via do fator regulador de interferon (IRF) descrita no manual do fabricante foi seguida para a determinação de EC50. Em resumo, as células foram semeadas e tratadas com diferentes concentrações do composto por 20 horas enquanto incubadas a 37 °C, 5% de CO2. As células foram ressuspensas e a solução QUANTI-Luc™ (nº Cat: Rep-qlc1) foi adicionada. A emissão de luz resultante foi medida por luminômetro (Envision, Perkin Elmer). Os sinais obtidos foram plotados e EC50 foi calculado com o software GraphPad Prism7.

[0176] Valores (µM) de EC50 de STING humano para Composto 1a são relatados na Tabela 2, abaixo.

[0177] Exemplo 104 – Ensaio Repórter Específico de Variante de

STING

[0178] STING humano tem 4 variantes principais, incluindo variantes WT, HAQ, REF e AQ. REF-STING, também referido como R232H, por exemplo, ocorre em cerca de 14% da população humana. Em comparação com o alelo de tipo selvagem, R232H diminuiu a resposta a dinucleotídeos cíclicos bacterianos e metazoários. Os detalhes dessas 4 variantes principais, bem como outras variantes raras, são relatados por Yi G, et al., “Single nucleotide polymorphisms of human STING can affect innate immune response to cyclic dinucleotides” PLoS One 2013; 8: e77846. As linhas de células repórter específicas da variante STING foram estabelecidas usando células THP1-Dual™ KO-STING (InvivoGen, nº Cat thpd-kostg) e três vetores de expressão da proteína variante STING. O mapa do vetor de expressão para WT STING é mostrado na Figura 9. Para os outros dois vetores de expressão, diferentes sequências de variantes de STING foram usadas naquele vetor, com o WT STING substituído pela sequência de nucleotídeos apropriada.

[0179] Os vetores que expressam a variante STING para WT- STING, REF-STING e AQ-STING foram preparados e transfectados de forma estável em células THP1-Dual™ KO-STING para preparar ensaios repórter específicos da variante STING para WT-STING, REF- STING e AQ-STING, respectivamente. Os valores de EC50 foram determinados conforme descrito acima no Exemplo 103 para o ensaio repórter de atividade agonista HAQ STING. Os resultados são mostrados abaixo na Tabela 2, abaixo. As sequências de DNA utilizadas para essas variantes de STING são mostradas em SEQ ID NO: 1 (Sequência de Nucleotídeos de STING humano WT), SEQ ID NO: 2 (Sequência de Nucleotídeos de REF STING humano) e SEQ ID NO: 3 (Sequência de Nucleotídeos de AQ STING humano).

[0180] STING Humano WT:

[0181] atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcc cagaaggcagccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcac actctccggtacctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggct gaggagctgcgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctg ccccctccgccgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgccct tcacttggatgcttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggcccca gctgagatctctgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcgg atatctgcggctgatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctac ggggtgcagtgagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctg accccaacattcgcttcctggataaactgccccagcagaccggtgaccgggctggcatcaaggatcgggttta cagcaacagcatctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccaccc ccttgcagactttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggcca aactcttctgccggacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcc taccaggaacctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggagga aaaggaagaggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagc ctgagctcctcatcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga (SEQ ID NO: 1).

[0182] STING humano REF:

[0183] atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcc cagaaggcagccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcac actctccggtacctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggct gaggagctgcgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctg ccccctccgccgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgccct tcacttggatgcttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggcccca gctgagatctctgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcgg atatctgcggctgatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctac ggggtgcagtgagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctg accccaacattcgcttcctggataaactgccccagcagaccggtgaccatgctggcatcaaggatcgggttta cagcaacagcatctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccaccc ccttgcagactttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggcca aactcttctgccggacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcc taccaggaacctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggagga aaaggaagaggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagc ctgagctcctcatcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga (SEQ ID NO: 2)

[0184] STING humano AQ:

[0185] atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcc cagaaggcagccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcac actctccggtacctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggct gaggagctgcgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctg ccccctccgccgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgccct tcacttggatgcttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggcccca gctgagatctctgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcgg atatctgcggctgatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctac ggggtgcagtgagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctg accccaacattcgcttcctggataaactgccccagcagaccgctgaccgagctggcatcaaggatcgggttta cagcaacagcatctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccaccc ccttgcagactttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggcca aactcttctgccagacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcc taccaggaacctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggagga aaaggaagaggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagc ctgagctcctcatcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga (SEQ ID NO: 3)

[0186] Exemplo 105 -- Ensaio repórter de atividade agonista de STING de camundongo

[0187] Células ISG RAW-Lucia™ (InvivoGen, nº Cat rawl-isg) foram usadas para um ensaio repórter agonista de STING de camundongo. Os valores de EC50 foram determinados conforme descrito acima no Exemplo 103 no ensaio repórter de atividade agonista HAQ STING. Os resultados são mostrados abaixo na Tabela 2.

[0188] Exemplo 106 -- Ensaio de Fluorimetria de Varredura Diferencial (DSF)

[0189] Um ensaio DSF foi empregado para medir a interação física entre os compostos e a proteína STING recombinante. A proteína STING recombinante truncada (a.a.155-341) (SEQ ID NO: 4) foi expressa em E. coli e isolada para o ensaio, conforme descrito abaixo. A matriz de ensaio foi preparada em placas de 384 poços para um volume final de 10 μl por poço consistindo em proteína STING recombinante 1 μM (aa 155-341) (SEQ ID NO: 4), PBS 100 mM pH 7,4, suplementado com KCl 100 mM, Corante laranja 5X SYPRO e composto 50 µM (conc. Final em DMSO 0-1%). Os ensaios foram realizados em um sistema QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR usando um gradiente de temperatura de 25 °C a 95 °C a uma taxa de 0,05 ° C/min, e filtros de excitação e emissão a 470 e 586 nm, respectivamente. De acordo com as curvas derivadas de fluorescência atribuídas pelo software Applied Biosystems® Protein Thermal Shift (algoritmo versão 1.3.), A fusão térmica (Tm) da proteína STING recombinante não ligada e ligada ao ligante e a diferença na fusão térmica (∆Tm D) foi calculada.

[0190] Em geral, compostos com valores de ∆Tm maiores que 0 são considerados como tendo uma interação física com a proteína testada, e o valor de ∆Tm está positivamente associado à afinidade de ligação do composto. Aqui, o Composto 1a mostrou o ∆Tm de 17,6 (Tabela 2), indicando interação física com a proteína STING.

[0191] Tabela 2 Caracterização in vitro do Composto 1a Composto EC50 de STING humano (μM) EC50 de DSF WT STING de STING ∆Tm

WT HAQ REF AQ camundongo (°C) (μM) 1a 0,9 4,1 4,8 1,2 3,4 17,6

[0192] Exemplo 107 - Ensaio de estimulação de PBMC humano ex vivo

[0193] Sangue humano de 5 doadores saudáveis foi coletado usando tubos de heparina de sódio BD Vacutainer de 10,0 ml (nº cat 367874). O isolamento de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foi feito usando tubos SIGMA ACCUSPIN 50ml (nº cat A2055) e sigma ACCUSPIN

System-HISTOPAQUE-1077 (nº cat A7054) usando o protocolo fornecido pelo fabricante. A camada de PBMC foi colhida e lavada com solução salina tamponada com fosfato (PBS), conforme sugerido pela Sigma. PBMC foram contados e finalmente suspensos @ 1x10e6/ml em RPMI (corning nº cat 10- 041-CV) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) (Gibco nº cat

20140.79). 1 ml de célula (1x10e6) foi transferido para tubo de ensaio de polipropileno de fundo redondo Falcon 5 ml (nº cat 352063) e estimulados com diferentes concentrações (0, 0,1, 1, 10 uM) por 24 horas em incubadora de 5% de CO2 a 37 °C.

[0194] Após 24 horas de incubação, os tubos foram centrifugados a 1.400 rpm por 5 minutos e os sobrenadantes foram colhidos. O sobrenadante foi armazenado a -80 °C para medição subsequente de IFNβ. A medição de IFNβ foi feita usando o kit básico de IFN-β humano (Meso Scale Diagnostics nº cat K151ADA) e o protocolo fornecido pelo fabricante foi usado. A estimativa de IFN-beta foi feita lendo a placa de ensaio no MESO SECTOR Imager 2400 e usando o programa MSD Discovery Workbench 4.0. Após 24 horas, a proteína IFNβ foi analisada. Os resultados mostraram que o Composto 1a pode induzir a produção de proteína IFNβ PBMC humana primária de uma maneira dependente da dose.

[0195] Os resultados mostrados na Tabela 3 refletem uma média de medições conduzidas usando cinco doadores diferentes.

[0196] Tabela 3: Ensaio de estimulação de PBMC humano ex vivo PBS Composto 1a (Controle) 0,1 μM 1 μM 10 μM IFNβ (pg/ml) 0 21,3±17,8 227,5±62,4 540,2±215,0

[0197] Para quantificação de mRNA de IFNβ, o RNA total foi isolado usando o RNeasy Mini Kit (Qiagen, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. O mRNA de IFNβ foi quantificado pelo ensaio qPCR.

Resumidamente, o RNA total (400 ng a 1.000 ng) foi convertido em cDNA em um volume de reação de 60 µl usando SuperScript VILO MasterMix (Life Technologies, EUA). Os cDNAs obtidos (10 ng) foram subsequentemente amplificados usando ensaios de expressão Applied Biosystems TaqMan usando primers específicos de RNA para IFNB1 (Hs01077958_s1) e GAPDH (Hs99999905_m1). Uma análise qPCR foi realizada com TaqMan Fast Advanced Master Mix (Life Technologies, EUA) no sistema de PCR em tempo real Applied Biosystems Quantstudio 12K Flex, com uma etapa inicial de 2 min a 50 °C seguida de 95 ° C por 2 s e 40 ciclos de 95 °C por 1 s e 60 °C por 20 s. A expressão relativa do gene foi calculada após a normalização contra o gene de referência GAPDH usando o método 2 − ΔΔCT. Os cálculos foram feitos usando o software Applied Biosystems Quantstudio 12K Flex v1.2.2. As alterações nas dobras do mRNA de IFNβ vs. amostras de tratad de veículo estão resumidas na Tabela 4. Os resultados mostraram que Composto 1a pode induzir mRNA de IFNβ em PBMC primários de uma maneira dependente da dose e do tempo. A Tabela 4 mostra uma média calculada a partir de cinco doadores diferentes.

[0198] Tabela 4 - Ensaio de estimulação de 3 horas e 24 horas de PBMC humano ex vivo (mRNA) IFNβ mRNA (mudanças Composto 1a de dobra vs. amostras tratadas com veículo) 0,1μM 1μM 10μM 1973,3 ± 3 h de tratamento 51,0 ± 21,7 219,8 ± 69,8 1023,0 10652,3 ± 24157,3 ± 24 h de tratamento 28,1 ± 28,9 4992,4 9224,2

[0199] Exemplo 108 -- Efeito anticâncer do Composto 1a no modelo de tumor duplo CT26

[0200] O Composto 1a foi testado quanto à sua atividade anticâncer no modelo de tumor duplo CT26, que é um modelo de câncer de cólon de camundongo. Camundongos Balb/cJ fêmeas de 5-6 semanas de idade (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine) foram implantados subcutaneamente com células tumorais CT26 em ambos os lados de cada animal, 105 células para cada lado. Para o estudo A, o tratamento foi iniciado 5 dias (1,25 mg/kg, 2,5 mg/kg e 5 mg/kg) após a implantação do tumor, quando a média dos tumores atingiu aproximadamente 100 mm3. Para o estudo B, o tratamento foi iniciado 8 dias (0,6 mg/kg e 10 mg/kg) após a implantação do tumor, quando a média dos tumores atingiu aproximadamente 120 mm 3. O esquema de tratamento é descrito na Tabela 5 e na Tabela 6.

[0201] Tabela 5 Esquema de dosagem para estudo A Grupo Nº de Tratamento Via e Programa Animais A 6 Veículo (1 x PBS) I.T.*; dose única B 6 5 mg/kg Composto 1a I.T.; dose única C 6 2,5 mg/kg Composto 1a I.T.; dose única D 6 1,25 mg/kg Composto 1a I.T.; dose única *I.T. é intratumoral.

[0202] Tabela 6 Esquema de dosagem para estudo B Grupo Nº de Tratamento Via e Programa Animais A 5 Veículo (1 x PBS) I.T.*; dose única B 5 10 mg/kg Composto 1a I.T.; dose única C 5 0,6 mg/kg Composto 1a I.T.; dose única *I.T. é intratumoral.

[0203] Todos os camundongos do estudo têm dois tumores CT26 subcutâneos. O "tumor tratado" indica o tumor com administração direta de composto, enquanto "tumor não tratado" indica o tumor sem administração direta de composto. O volume do tumor foi seguido ao longo da experiência. O volume do tumor é medido duas vezes por semana após o início do tratamento. A carga tumoral é calculada a partir de medições do calibre pela fórmula para o volume de um elipsóide prolato (LxW 2)/2, onde L e W são as respectivas medidas ortogonais de comprimento e largura (mm).

[0204] O Composto 1a mostrou atividade potente e curativa no modelo de tumor duplo CT26 (Figura 10 e Figura 11). Para tumores tratados, uma taxa de cura de 20% foi detectada mesmo com a dose mais baixa testada no estudo (Figura 8, dose de 0,6 mg/kg). Ao mesmo tempo, a maior dose (10 mg/kg) curou 100% dos animais daquele tumor ao final do estudo. Para os tumores não tratados, um efeito antitumoral dependente da dose também foi evidente. O grupo de dose superior (10 mg/kg) mostrou 80% de efeitos curativos; todas as doses mais baixas também mostraram atividade de inibição do crescimento do tumor. Assim, foi observada uma janela terapêutica de 0,6 mg/kg a 10 mg/kg para o Composto 1a, com atividade antitumoral observada não apenas localmente, mas também sistemicamente, com base nos efeitos no local distal não injetado do tumor. Em conclusão, esses resultados indicam que a administração local de Composto 1a pode induzir atividade anticâncer tanto local quanto sistêmica (abscopal).

[0205] Exemplo 109 -- Efeito anticâncer do Composto 1a no modelo metastático do fígado CT26

[0206] O Composto 1a foi testado quanto à sua atividade anticâncer em um modelo metastático de fígado CT26. Camundongos BALB/cJ fêmeas anestesiados de 5-6 semanas de idade (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine) foram implantados intra-esplenicamente com células tumorais CT26 que expressam luciferase (5 x 105 células por camundongo). Um período de espera subsequente de dez minutos permitiu que as células tumorais circulassem no fígado dos animais. Os baços foram então removidos e os animais foram suturados e recuperados. Três dias depois, as células tumorais CT26 (105 células por camundongo) foram novamente implantadas, desta vez por via subcutânea (sc) sob a área do membro anterior direito, para permitir o desenvolvimento de uma massa tumoral para administração do composto. Nove dias após a injeção intra-esplênica, o composto (10 mg/kg) foi administrado por via intratumoral, uma única vez, no tumor sc.

[0207] O efeito anticâncer local do composto foi medido por meio do seu efeito no tumor sc, enquanto o efeito abscopal do composto foi avaliado pela sobrevivência geral de camundongos tratados em comparação com camundongos de controle tratados com veículo, com base no efeito prejudicial do crescimento da massa tumoral em cada fígado de camundongo. O Composto 1a mostrou atividade potente para os tumores sc locais e também atividade sistêmica curativa em 9 de 10 animais tratados (Figura 12). Esses resultados indicam que a administração local de Composto 1a pode induzir atividade anticâncer tanto local quanto sistêmica (abscopal), incluindo lesão profunda, como no fígado.

[0208] Exemplo 110 -- Efeito anticâncer do Composto 1a no modelo ortotópico cerebral GL261

[0209] Composto 1a foi testado quanto à sua atividade anticâncer em um modelo ortotópico cerebral GL261. GL261 é uma linha celular de glioma murino. As células de glioma de camundongo GL261 que expressam luciferase (2x104 células/camundongo) foram implantadas intracranialmente em camundongos albinos B6 fêmeas de 5-6 semanas de idade (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine). Três a 4 dias depois, as células GL261 foram implantadas subcutaneamente (106 células/camundongo) sob a área do membro anterior direito para permitir o desenvolvimento de uma massa tumoral para administração do composto. Dez dias após a implantação de células tumorais intracranianas, o composto (10 mg/kg) foi administrado por via intratumoral, uma única vez, no tumor sc. O efeito anticâncer local do composto foi medido através do seu efeito no tumor sc, enquanto o efeito abscopal do composto foi avaliado pela sobrevivência geral de camundongos tratados em comparação com camundongos de controle tratados com veículo, com base no efeito prejudicial da massa tumoral em crescimento no cérebro de cada rato. Composto 1a mostrou atividade potente em tumores sc locais e mostrou atividade sistêmica curativa em 5 de 8 animais tratados (Figura 13). Estes resultados indicam que a administração local de Composto 1a pode induzir atividade anticâncer tanto local quanto sistêmica (abscopal), incluindo lesão profunda, como no cérebro.

[0210] Exemplo 111 – Comparações

[0211] Os valores de EC50 foram calculados para ensaios de STING humanos de WT STING, HAQ STING, AQ STING e REF STING, em comparações diretas usando Composto 1a da presente divulgação, um ligante STING natural (2'3' cGAMP), e o suposto agonista de STING ML RR-S2 CDA, conforme relatado em Corrales, et al., "Direct Activation of STING in the Tumor Microenvironment Leads to Potent and Systemic Tumor Regression and Immunity", Cell Reports (2015) 11: 1018 -1030, que é aqui incorporado por referência. Os ensaios foram realizados conforme descrito nos exemplos apresentados acima. Observe que os valores de ensaio relatados na Tabela 7 foram limitados aos ensaios realizados nas comparações head-to-head e podem não refletir os valores médios determinados em um número maior de ensaios, conforme relatado acima ou em outro lugar. Observe ainda que "2'3' cGAMP" é o mesmo que "ML cGAMP", conforme relatado na publicação Cell Reports.

[0212] Tabela 7 EC50 humano (mM) (ensaio de 20 horas) Kd (WT) Composto (µM)

WT HAQ AQ REF 2’3’ cGAMP 0,07 61,7 57,9 56,5 33 a 100

ML RR-S2 0,4 5,9 8,4 5,5 >100

CDA Composto 1a 0,04 0,6 1,9 1,0 3,9

[0213] A Tabela 7 também relata constantes de ligação de dissociação (Kd) para a ligação de WT STING humano a cada um dos três compostos testados, conforme medido por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). ITC é uma técnica de titulação microcalorimética que mede as propriedades termodinâmicas associadas às interações intermoleculares. Com base nesses testes, Composto 1a parece formar a ligação mais forte com WT STING dos compostos testados.

[0214] Materiais

[0215] A proteína STING de tipo selvagem humano recombinante (aa, 139-379, H232R) foi gerada pela expressão de um construto em E. coli que codifica um domínio citosólico de WT STING humano compreendendo os aminoácidos 139 a 379.

[0216] Reagentes

[0217] Fontes de reagentes usados nesse estudo são mostrados abaixo: Reagente Fonte Nº de catálogo 1X PBS sem cálcio cálcio ou magnésio Corning 21-040-CV água deionizada MilliQ MilliQ Z000Q0V0T0 Liquinox Alconox 1201 NaOH EM SXO593-1 Metanol EMD Millipore MX0475-1 Compostos: Composto 1a 2’3’ cGAMP ML RR-S2 CDA

[0218] Preparação de tampão de proteína

[0219] A proteína STING foi armazenada a -60 °C em alíquotas de 90 µl e 100 µl cada uma a uma concentração de 3,0 mg/ml e 20 mg/ml,

respectivamente em PBS, pH 7,5 contendo 5% de glicerol. No dia da análise, alíquotas da proteína foram descongeladas, diluídas para 400 ul e trocadas por tampão em PBS usando uma unidade de filtro centrífugo Amicon Ultra (10k MW recorte, 0,5 ml) com pelo menos quatro centrifugações de 10 min 14.000 xg com uma microcentrífuga Eppendorf e então finalmente diluída para 20 µM a 30 µM (dependente da experiência) com 1X PBS. A concentração de proteína foi determinada usando um espectrofotômetro Nanodrop 2000 e um coeficiente de extinção de proteína de 22140 (M-1 cm-1).

[0220] Preparação de Amostra

[0221] Duzentos µl de soluções estoque 1 mM de Composto 1a, 2'3' cGAMP e ML RR-S2CDA foram fornecidos por tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Antes de cada experiência, as amostras foram diluídas para concentrações de 200 uM a 500 uM (dependente da experiência).

[0222] Métodos

[0223] Os ensaios foram realizados em uma unidade Affinity ITC (TA Instruments nº. 609003.901) equipada com o acessório de limpeza ITC (TA Instruments nº 601800.901). A solução de proteína STING, aproximadamente 400 µl contendo 20 µM a 30 µM de proteína STING, foi pipetada para a célula do calorímetro de 185 µl permitindo alguma sobrecarga aceitável. A célula de referência continha uma quantidade equivalente de água Milli-Q. A incubação foi realizada a 25 °C com injecções de 20 x 2,5 µl de compostos de 100 µM a 300 µM. O software de controle era ITC Run Ver. 3.3.0.0 (instrumentos TA) foi usado para obter os termogramas que consistem em vários picos de calor bruto (µcal/s) representando a taxa de calor em cada injeção. O software de análise Nano Analyze Ver. 3,70 (TA Instruments) foi usado para corrigir a linha de base, corrigir para o branco ou o calor da amostra de diluição (na saturação) e para integrar os picos da taxa de calor produzindo valores “Q” gráficos. As isotermas resultantes foram ajustadas com um modelo independente para derivar os parâmetros termodinâmicos.

[0224] Os valores Kd e n (razões molares nos pontos de inflexão da curva) foram derivados e relatados. As condições ideais para as concentrações de proteína e ligante foram derivadas de experimentos preliminares.

[0225] Resultados

[0226] Os termogramas de taxa de calor e suas isotermas resultantes para a ligação dos compostos testados a STING humana recombinante de tipo selvagem (aa, 139-379, H232R) foram determinados. A ligação de cada composto a STING era endotérmica, conforme indicado pelas taxas de calor negativas com calores de diluição exotérmicos (direção positiva) (observados após o composto ter atingido a saturação da proteína). 2',3' CGAMP mostrou produzir uma resposta endotérmica semelhante a várias variantes de STING. Composto 1a forneceu o Kd mais baixo de 0,04 µM, seguido por 2’3' cGAMP com um Kd de 0,07 µM e então ML RR-S2 CDA com um Kd de 0,40 µM. Todos os compostos forneceram valores de n próximos a 0,5, sugerindo que a proteína STING estava presente como um dímero e se ligava a 1 mol de composto por 2 mols de STING.

[0227] Exemplo 112 – Identificação de Metabólitos Potenciais

[0228] O Composto 1a foi incubado em hepatócitos de camundongo CD-1, camundongo Sprague Dawley, cachorro Beagle, macaco Cynomolgus e humano, para avaliar a formação dos metabólitos principais.

[0229] Materiais

[0230] Hepatócitos criopreservados agrupados foram adquiridos da ThermoFisher Scientific (Waltham, MA), Xenotech, LLC (Kansas City, KS) e In Vitro ADMET Laboratories (Columbia, MD), e os meios apropriados foram adquiridos da In Vitro ADMET Laboratories (Columbia, MD) e Life Technologies (Carlsbad, CA). A solução de coloração AOPI e o tampão de fosfato foram obtidos de Corning Life Sciences (Tewksbury, MA) e Nexcelom Bioscience (Lawrence, MA), respectivamente. Todos os produtos químicos, reagentes e solventes usados na análise eram de grau analítico ou para HPLC.

[0231] Projetos e Procedimentos Experimentais

[0232] Incubações Hepatócitas

[0233] O Composto 1a foi pesado e dissolvido em HPLC-água contendo 0,12% de ácido fórmico PBS para perfazer 1.020 mmoles/l. A solução foi então diluída 2,5 vezes individualmente para 4 mmoles/l e, em seguida, diluída 21.000 vezes com o meio Williams 'E contendo 0,1% de albumina de soro humano e 2 mmol/l de glutamina para fazer a solução estoque de trabalho com concentração de 20 μmol/l.

[0234] Antes das incubações, os hepatócitos criopreservados foram descongelados em banho de água a 37 °C. Um tubo de hepatócitos criopreservados foi adicionado a cada tubo cônico de 50 ml de meio de recuperação de hepatócitos criopreservado (UCRM) obtido de In Vitro ADMET Laboratories (Columbia, MD). As células foram centrifugadas em centrífuga Beckman (Brea, CA) com rotor GH 3.8 a 740 rpm por 10 minutos em temperatura ambiente de 4 °C. O sobrenadante foi removido e as células ressuspensas em meio de placas para contagem. Após as células serem ressuspensas em meio de plaqueamento, 20 µl da ressuspensão foram transferidos e misturados com 20 µl de solução de coloração AOPI. A solução foi suavemente misturada e as células foram contadas usando um Cellometer (Nexcelom, Lawrence, MA). Após a contagem, as células foram então ressuspensas em 1 ou 2 milhões de células viáveis/ml em meio E de Williams contendo 2 mmol/l de l-glutamina (pH 7,4).

[0235] A suspensão de hepatócitos (50 µl/ poço) foi adicionada a uma placa de 48 poços. Cinquenta microlitros de solução estoque de trabalho contendo Composto 1a (20 µmoles/ l) foram adicionadas para iniciar a reação. A placa foi colocada em uma incubadora de cultura de tecidos (5% CO 2/95% atmosfera umidificada com ar e 37 °C), e as reações foram encerradas com 200 µl de solução de parada consistindo em 100% de metanol/acetonitrila (1/1, v/v) com furosemida de 2.010 ng/ml e 0,2 μmol/l (R) -propranolol a 5, 30, 60, 120, 180 e 240 minutos. A mistura foi centrifugada e filtrada, e o sobrenadante foi coletado para análise. As concentrações finais de hepatócitos criopreservados foram de 1 x 106 células/ml. A concentração final de incubação de Composto 1a foi de 10 µmol/l.

[0236] Condições LC-MS/MS para identificação de metabólitos

[0237] O sistema LC-MS/MS era composto por um Shimadzu HPLC e um quadrupolo híbrido AB-SCIEX TripleTOF 5600 e espectrômetro de massa TOF (Framingham, MA). O HPLC Shimadzu (Kyoto, Japão), consistia em um módulo de barramento de comunicações (CBM-20A), um amostrador automático (SIL-30AC) com um trocador de rack conectado (Rack Changer II), duas bombas (LC-30AD) e uma coluna forno (CTO-30A). O espectrômetro de massa foi calibrado usando as soluções de calibração negativa e positiva AB- SCIEX APCI (Framingham, MA). As amostras obtidas nas incubações com hepatócitos foram analisadas nos modos de varredura negativo e positivo. O método analítico básico e as condições instrumentais são resumidos abaixo. A modificação das configurações do espectrômetro era dependente da necessidade do analito.

[0238] Condições LC-MS/MS: Configurações de Shimadzu LC30AD cromatografia: Tipo de coluna Agilent Eclipse XDB-C8, 5µ, 2,1x150mm, peça nº 993700- 906, número de série USSN002817 Fases móveis A: água/metanol = 95/5 (v/v) com acetato de amônio 5 mM Gradientes B: metanol/água = 95/5 (v/v) com acetato de amônio 5 mM Quociente de vazão 0-1 min a 1% B; 1-5 min linear a 10% B; 5-13 min linear a 95% B; 13-19,9 min a 95% B; 19,9-20 min linear a 1% B; 20-24min a 1% B Tempo de Análise 0,4 ml/min Temperatura da 24 min bandeja de amostra Volume de injeção 4 ºC

15 µl Configurações do espectrômetro de massa: Fonte de íons AB Sciex Hybrid Quadrupolo-TOF LC-MS/MS Triplo TOF 5600 Polaridade Fonte de íons DuoSpray Tensão de pulverização de íons (ISVF) Temperatura (TEM) Negativo ou Positivo Curtain Gas (CUR) 4.500 V ou 5.500 V GS1 550 ºC GS2 30 Configurações de 50 TOF-MS: Configurações de 50 TOF MS ^ 2:

[0239] Análise de Dados de Dados de Atividade

[0240] Os dados de espectrometria de massa foram adquiridos usando AB-Sciex Analyst TF (Versão 1.5.1; Framingham, MA). Cromatogramas e espectros foram obtidos usando AB-Sciex PeakView (Versão 2.2.0.1; Framingham, MA). A comparação das áreas de pico relativas para cromatogramas de íons extraídos foi baseada em ± 0,0002 Da da razão entre massa e carga exata esperada (m/z) para cada analito de interesse.

[0241] Resultados

[0242] Nenhum metabólito foi detectado nas incubações com hepatócitos. Nas condições analíticas apresentadas, Composto 1a apresentou um tempo de retenção de aproximadamente 7,8 minutos. No modo de varredura negativa, Composto 1a mostrou o íon molecular desprotonado m/z 745 (C24H25F2N10O8P2S2¯) e o íon molecular duplamente desprotonado m/z 372 (C24H24F2N10O8P2S22¯). Foram observados os principais íons produto MS/MS com m/z 533 (C19H19FN10O4PS¯) e m/z 186 (C9H8N5¯). Sob o modo de varredura positiva, Composto 1a mostrou o íon molecular protonado m/z 747 (C24H27F2N10O8P2S2+) e os principais íons de produto MS/MS com m/z 651 (C24 H26 F2 N10 O6PS+), m/z 252 (C10H11FN5O2+), e m/z 188 (C9H10N5+). Os dados MS e MS/MS são confirmativos para a estrutura do Composto 1a.

[0243] O Composto 1a foi estável nas incubações com hepatócitos de camundongo, rato, cachorro, macaco e humano. Nenhum metabólito aparente de Composto 1a foi identificado neste estudo. Nas amostras obtidas em incubações com hepatócitos, apenas o Composto 1a foi detectado e confirmado pelos fragmentos de espectrometria de massa em tandem (MS/MS).

[0244] Todos os documentos referenciados nesta divulgação são incorporados por referência aqui, contudo, se qualquer documento incorporado contradizer este relatório descritivo escrito, então este relatório descritivo escrito deve prevalecer. Aqueles versados na área reconhecerão que várias mudanças e modificações podem ser feitas no material fornecido neste documento, e que esse material está dentro do escopo e do espírito da divulgação.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS:

[0245] SEQ ID NO: 1 (STING humano WT):

[0246] atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcc cagaaggcagccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcac actctccggtacctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggct gaggagctgcgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctg ccccctccgccgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgccct tcacttggatgcttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggcccca gctgagatctctgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcgg atatctgcggctgatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctac ggggtgcagtgagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctg accccaacattcgcttcctggataaactgccccagcagaccggtgaccgggctggcatcaaggatcgggttta cagcaacagcatctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccaccc ccttgcagactttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggcca aactcttctgccggacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcc taccaggaacctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggagga aaaggaagaggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagc ctgagctcctcatcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga

[0247] SEQ ID NO: 2 (STING humano REF):

[0248] atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcc cagaaggcagccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcac actctccggtacctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggct gaggagctgcgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctg ccccctccgccgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgccct tcacttggatgcttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggcccca gctgagatctctgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcgg atatctgcggctgatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctac ggggtgcagtgagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctg accccaacattcgcttcctggataaactgccccagcagaccggtgaccatgctggcatcaaggatcgggttta cagcaacagcatctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccaccc ccttgcagactttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggcca aactcttctgccggacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcc taccaggaacctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggagga aaaggaagaggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagc ctgagctcctcatcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga

[0249] SEQ ID NO: 3 (STING humano AQ):

[0250] atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcc cagaaggcagccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcac actctccggtacctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggct gaggagctgcgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctg ccccctccgccgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgccct tcacttggatgcttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggcccca gctgagatctctgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcgg atatctgcggctgatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctac ggggtgcagtgagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctg accccaacattcgcttcctggataaactgccccagcagaccgctgaccgagctggcatcaaggatcgggttta cagcaacagcatctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccaccc ccttgcagactttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggcca aactcttctgccagacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcc taccaggaacctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggagga aaaggaagaggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagc ctgagctcctcatcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga

[0251] SEQ ID NO: 4 (resíduos de WT STING 155-341):

[0252] VAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAV

SQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDRAGIKDRVYSNSIYELL ENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILAD APESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEV

[0253] SEQ ID NO: 5 (His-TEV-Sumo-WT STING 155-341)

[0254] MHHHHHHSSGVDLGTENLYFQSNAMSDSEVNQEAKPEV

KPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYD GIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGGSVAHGLAWSYYIGYLRLILPELQA RIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTG DRAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSRED RLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQE EKEEV

[0255] SEQ ID NO: 6 (resíduos de REF STING 155-341):

[0256] VAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAV

SQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELL ENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILAD APESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEV

[0257] SEQ ID NO: 7 (His-TEV-Sumo-REF STING 155-341)

[0258] MHHHHHHSSGVDLGTENLYFQSNAMSDSEVNQEAKPEV

KPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYD GIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGGSVAHGLAWSYYIGYLRLILPELQA RIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTG DHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSRED RLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQE EKEEV

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES:

1. Método para tratar câncer de bexiga caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um paciente em necessidade de tratamento uma quantidade eficaz do Composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: (Composto 1).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito sal farmaceuticamente aceitável é um sal de diamônio.

3. Método para tratar câncer de bexiga caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um paciente em necessidade de tratamento uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica que compreende o Composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: (Composto 1) e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

4. Uso do Composto 1 ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo caracterizado pelo fato de que é para preparação de uma composição farmacêutica para tratar câncer de bexiga:

(Composto 1).

5. Uso do Composto 1, de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou de uma composição farmacêutica que compreende o Composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo caracterizado pelo fato de que é em um tratamento para câncer de bexiga: (Composto 1).

6. Método para tratar câncer de bexiga caracterizado pelo fato de que compreende: identificar um indivíduo com câncer de bexiga tratável pelo Composto 1, um sal farmaceuticamente aceitável do Composto 1, ou uma composição farmacêutica que compreende o Composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do Composto 1; e administrar ao dito indivíduo uma quantidade eficaz do composto, sal farmaceuticamente aceitável ou composição farmacêutica atarves do qual o câncer de bexiga foi identificado como tratável.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo é identificado como tendo um câncer de bexiga tratável pelo Composto 1, um sal farmaceuticamente aceitável do Composto 1 ou uma composição farmacêutica que compreende o Composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do Composto 1, por uma presençaa de um alelo variante REF STING no paciente.

8. Método para tratar câncer de bexiga em um paciente com alelo REF STING caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao dito paciente o Composto 1, um sal farmaceuticamente aceitável do Composto 1 ou uma composição farmacêutica que compreende o Composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do Composto 1.

9. Método para tratar câncer de bexiga em um paciente com alelo WT STING caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao dito paciente o Composto 1, um sal farmaceuticamente aceitável do Composto 1 ou uma composição farmacêutica que compreende o Composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do Composto 1.

10. Método para tratar câncer de bexiga em um paciente com alelo AQ STING caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao dito paciente o Composto 1, um sal farmaceuticamente aceitável do Composto 1 ou uma composição farmacêutica que compreende o Composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do Composto 1.

11. Método para tratar câncer de bexiga em um paciente com alelo HAQ STING caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao dito paciente o Composto 1, um sal farmaceuticamente aceitável do Composto 1 ou uma composição farmacêutica que compreende o Composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do Composto 1.

12. Método para tratar câncer de bexiga caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um paciente em necessidade de tratamento uma quantidade terapeuticamente aceitável de um agonista de STING.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 6 a 12, ou uso, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que a administração do Composto 1, de um sal farmaceuticamente aceitável do Composto 1 ou de uma composição farmacêutica que compreende o Composto 1 ou de um sal farmaceuticamente aceitável do Composto 1 é conduzida intravesicularmente.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 6 a 12, ou uso, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o câncer de bexiga é câncer de bexiga não invasivo muscular.

15. Método ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a administração do Composto 1, de um sal farmaceuticamente aceitável do Composto 1 ou de uma composição farmacêutica que compreende qualquer um dos citados anteriormente é por administração intravesicular.