BR112021001349A2 - sais de compostos e cristais dos mesmos - Google Patents
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Abstract
A presente invenção fornece cristais de sais de amônia de (1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34R,36R,39S,41R)-29,41-difluoro-34,39-bis(sulfanil)-2,33,35,38,40,42-hexaoxa-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-deca-aza-34¿5,39¿5-difosfaoctaciclo[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]dotetraconta-5,7,9,11,15,19,21,23,25-nonaeno-34,39-diona (Composto (I)), sais de sódio de Composto (I) ou Composto (I), que têm um potencial a ser usado como substância de fármaco em produtos farmacêuticos.
Description
[0001] A presente invenção se refere aos sais de compostos e cristais dos mesmos.
[0002] STING (estimulador de genes interferon) é uma molécula de sinalização na resposta inata ao dsDNA no citosol. Deleção de STING foi relatada em diversos cânceres humanos. Adicionalmente, desregulação da sinalização de STING em cânceres humanos também foi relatada em melanoma (Xia T, et al., "Recurrent Loss of STING Signaling in Melanoma Correlates with Susceptibility to Viral Oncolysis" Cancer Res. 2016) e câncer de cólon. (Xia T, et al., "Deregulation of STING Signaling in Colorectal Carcinoma Constrains DNA Damage Responses and Correlates With Tumorigenesis" Cell Rep. 2016;14:282 a 97). Interessantemente, nesses estudos, os resultados de análise genômica mostraram que a expressão perdida de STING não ocorre devido à deleção ou mutação de gene, mas sim através de alterações epigenéticas. (Xia, Cancer Res. 2016; Xia, Cell Rep. 2016). A atividade de proteção contra o câncer de STING também é sustentada pela evidência obtida a partir de estudos de modelo de camundongo. Camundongos de knockout de STING demonstraram controle tumoral defeituoso. (Woo SR, et al. "STING- dependent cytosolic DNA sensing mediates innate immune recognition of immunogenic tumors" Immunity 2014;41:830 a 42).
[0003] Adicionalmente, o papel de STING na proteção contra ontogênese foi demonstrado em diversos modelos espontâneos de camundongo que incluem glioma (Ohkuri T, et al., "Protective role of STING against gliomagenesis: Rational use of STING agonist in anti-glioma immunotherapy" Oncoimmunology. 2015;4:e999523), e câncer de cólon (Zhu Q, et al., "Cutting edge: STING mediates protection against colorectal tumorigenesis by governing the magnitude of intestinal inflammation" J. Immunol. 2014;193:4.779 a 82). Esse efeito antitumoral pode ocorrer devido a sua habilidade para combater superativação de NF-kB e STAT3. (Ohkuri 2015). Ativação da trajetória de STING também demonstrou atividade potente em modelos tumorais de camundongo pré-clínicos. (Woo 2014; Chandra D, et al. "STING ligand c-di-GMP improves câncer vaccination against metastatic breast câncer" Cancer Immunol Res. 2014;2:901 a 10; Corrales L, et al., "Direct Activation of STING in the Tumor Microenvironment Leads to Potent and Systemic Tumor Regression and Immunity" Cell Rep. 2015;11:1.018 a 30; Curran E, et al. "STING Pathway Activation Stimulates Potent Immunity against Acute Myeloid Leukemia" Cell Rep. 2016;15:2.357 a 66; Tang CH, et al. "Agonist-Mediated Activation of STING Induces Apoptosis in Malignant B Cells" Cancer Res. 2016;76:2.137 a 52). Essa atividade antitumoral é provável devido à ruptura da vasculatura tumoral e seguida pela indução de resposta imunológica adaptável. (Corrales L, et al., "The host STING pathway at the interface of cancer and immunity" J. Clin. Invest. 2016;126:2.404 a 11). Consequentemente, o estímulo direto de STING em um microambiente tumoral através de um agonista pode representar uma abordagem inovadora para tratamento de diversos tipos de câncer.
[0004] Um composto representado pela Fórmula (I), a saber, (1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34R,36R,39S,41R)-29,41-difluoro-34,39- bis(sulfanil)-2,33,35,38,40,42-hexaoxa-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-deca-aza- 34λ5,39λ5-difosfaoctaciclo[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]dotetraconta- 5,7,9,11,15,19,21,23,25-nonaeno-34,39-diona (de agora em diante denominado Composto (I)), suprime o crescimento de tumores.
[0005] Geralmente, as propriedades físicas de um composto, sais do mesmo e os seus cristais usados como um produto farmacêutico influenciam na biodisponibilidade de um fármaco, na pureza de um ingrediente farmacêutico ativo, na prescrição de uma preparação e similares. Portanto, um objetivo da presente invenção é fornecer sais do composto (I) ou cristais do mesmo, com um potencial para serem usados como substância de fármaco em produtos farmacêuticos.
[0006] O presente inventor constatou que sais do Composto (I) ou cristais do mesmo, com um potencial para serem usados como substância de fármaco em produtos farmacêuticos, desse modo, completam a invenção.
[0007] Especificamente, a presente invenção fornece <1> a <50> a seguir.
[0008] <1> Cristal de sal de amônia de (1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34R,36R,39S,41R)-29,41-difluoro-34,39- bis(sulfanil)-2,33,35,38,40,42-hexaoxa-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-deca-aza- 34λ5,39λ5-difosfaoctaciclo[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]dotetraconta- 5,7,9,11,15,19,21,23,25-nonaeno-34,39-diona (Composto (I)), sal de sódio de Composto (I) ou Composto (I).
[0009] <2> Cristal, de acordo com <1>, que é um cristal de sal de amônia de (1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34R,36R,39S,41R)-29,41-difluoro- 34,39-bis(sulfanil)-2,33,35,38,40,42-hexaoxa-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-deca- aza-34λ5,39λ5- difosfaoctaciclo[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]dotetraconta- 5,7,9,11,15,19,21,23,25-nonaeno-34,39-diona (Composto (I)).
[0010] <3> Cristal, de acordo com <2>, que é um cristal de sal de diamônia de (1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34R,36R,39S,41R)-29,41-difluoro- 34,39-bis(sulfanil)-2,33,35,38,40,42-hexaoxa-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-deca- aza-34λ5,39λ5- difosfaoctaciclo[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]dotetraconta- 5,7,9,11,15,19,21,23,25-nonaeno-34,39-diona (Composto (I)).
[0011] <4> Cristal (Forma 1), de acordo com <3>, que tem um pico de difração em um ângulo de difração (2θ ± 0,2°) de 8,3° em uma difração de raio X de pó.
[0012] <5> Cristal (Forma 1), de acordo com <4>, que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,4, 8,3 e 16,6 em uma difração de raio X de pó.
[0013] <6> Cristal (Forma 1), de acordo com <4>, que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,4, 8,3, 12,7, 16,6 e 25,4 em uma difração de raio X de pó.
[0014] <7> Cristal (Forma 1), de acordo com <4>, que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,4, 8,3, 12,7, 14,6, 16,6, 18,1, 22,1, 22,8, 24,4 e 25,4 em uma difração de raio X de pó.
[0015] <8> Cristal (Forma 1), de acordo com <7>, que tem um padrão de difração de raio X de pó substancialmente igual ao padrão de difração de raio X de pó mostrado na Figura 3.
[0016] <9> Cristal (Forma 1), de acordo com qualquer um dentre <4> a <8>, que é um hidrato.
[0017] <10> Cristal (Forma 2), de acordo com <3>, que tem um pico de difração em um ângulo de difração (2θ ± 0,2°) de 9,0° em uma difração de raio X de pó.
[0018] <11> Cristal (Forma 2), de acordo com <10>, que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 9,0°, 15,4° e 20,8° em uma difração de raio X de pó.
[0019] <12> Cristal (Forma 2), de acordo com <10>, que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 9,0°, 15,4°, 20,8°, 24,0° e 30,0° em uma difração de raio X de pó.
[0020] <13> Cristal (Forma 2), de acordo com <10>, que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 7,0°, 9,0°, 11,8°, 13,2°, 15,4°, 19,7°, 20,8°, 24,0°, 30,0° e 31,1° em uma difração de raio X de pó.
[0021] <14> Cristal (Forma 2), de acordo com <13>, que tem um padrão de difração de raio X de pó substancialmente igual ao padrão de difração de raio X de pó mostrado na Figura 4.
[0022] <15> Cristal (Forma 2), de acordo com qualquer um dentre <10> a <14>, que é um hidrato.
[0023] <16> Cristal (Forma 3), de acordo com <3>, que tem um pico de difração em um ângulo de difração (2θ ± 0,2°) de 7,4° em uma difração de raio X de pó.
[0024] <17> Cristal (Forma 3), de acordo com <16>, que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 7,4°, 16,0° e 21,4° em uma difração de raio X de pó.
[0025] <18> Cristal (Forma 3), de acordo com <16>, que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,0°, 7,4°, 9,3°, 16,0° e 21,4° em uma difração de raio X de pó.
[0026] <19> Cristal (Forma 3), de acordo com <16>, que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,0°, 7,4°, 9,3°, 12,6°, 16,0°, 16,6°, 18,1°, 21,4°, 22,0° e 22,8° em uma difração de raio X de pó.
[0027] <20> Cristal (Forma 3), de acordo com <19>, que tem um padrão de difração de raio X de pó substancialmente igual ao padrão de difração de raio X de pó mostrado na Figura 5.
[0028] <21> Cristal (Forma 3), de acordo com qualquer um dentre <16> a <20>, que é um hidrato.
[0029] <22> Cristal (Forma 4), de acordo com <3>, que tem um pico de difração em um ângulo de difração (2θ ± 0,2°) de 9,7° em uma difração de raio X de pó.
[0030] <23> Cristal (Forma 4), de acordo com <22>, que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 9,7°, 14,0° e 26,9° em uma difração de raio X de pó.
[0031] <24> Cristal (Forma 4), de acordo com <22>, que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 9,7°, 14,0°, 17,4°, 22,3° e 26,9° em uma difração de raio X de pó.
[0032] <25> Cristal (Forma 4), de acordo com <22>, que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 5,9°, 7,6°, 9,7°, 11,6°, 14,0°, 16,0°, 17,4°, 22,3°, 24,6° e 26,9° em uma difração de raio X de pó.
[0033] <26> Cristal (Forma 4), de acordo com <25>, que tem um padrão de difração de raio X de pó substancialmente igual ao padrão de difração de raio X de pó mostrado na Figura 6.
[0034] <27> Cristal (Forma 5), de acordo com <3>, que tem um pico de difração em um ângulo de difração (2θ ± 0,2°) de 20,0° em uma difração de raio X de pó.
[0035] <28> Cristal (Forma 5), de acordo com <27>, que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 10,9°, 20,0° e 23,6° em uma difração de raio X de pó.
[0036] <29> Cristal (Forma 5), de acordo com <27>, que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 10,9°, 17,7°, 18,9°, 20,0° e 23,6° em uma difração de raio X de pó.
[0037] <30> Cristal (Forma 5), de acordo com <27>, que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 9,0°, 9,6°, 10,9°, 13,0°, 15,3°, 17,7°, 18,9°, 20,0°, 21,5° e 23,6° em uma difração de raio X de pó.
[0038] <31> Cristal (Forma 5), de acordo com <30>, que tem um padrão de difração de raio X de pó substancialmente igual ao padrão de difração de raio X de pó mostrado na Figura 7.
[0039] <32> Cristal, de acordo com <2>, que é um cristal de sal de monoamônia de (1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34R,36R,39S,41R)-29,41- difluoro-34,39-bis(sulfanil)-2,33,35,38,40,42-hexaoxa- 4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-deca-aza-34λ5,39λ5- difosfaoctaciclo[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]dotetraconta- 5,7,9,11,15,19,21,23,25-nonaeno-34,39-diona (Composto (I)).
[0040] <33> Cristal (Forma 6), de acordo com <32>, que tem um pico de difração em um ângulo de difração (2θ ± 0,2°) de 17,0° em uma difração de raio X de pó.
[0041] <34> Cristal (Forma 6), de acordo com <33>, que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 17,0°, 21,6° e 25,9° em uma difração de raio X de pó.
[0042] <35> Cristal (Forma 6), de acordo com <33>, que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 15,1°, 16,4°, 17,0°, 21,6° e 25,9° em uma difração de raio X de pó.
[0043] <36> Cristal (Forma 6), de acordo com <33>, que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,9°, 8,5°, 12,0°, 15,1°, 16,4°, 17,0°, 21,0°, 21,6°, 22,8° e 25,9° em uma difração de raio X de pó.
[0044] <37> Cristal (Forma 6), de acordo com <36>, que tem um padrão de difração de raio X de pó substancialmente igual ao padrão de difração de raio X de pó mostrado na Figura 8.
[0045] <38> Cristal, de acordo com <1>, que é um cristal de sal de sódio de (1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34R,36R,39S,41R)-29,41-difluoro- 34,39-bis(sulfanil)-2,33,35,38,40,42-hexaoxa-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-deca- aza-34λ5,39λ5- difosfaoctaciclo[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]dotetraconta- 5,7,9,11,15,19,21,23,25-nonaeno-34,39-diona (Composto (I)).
[0046] <39> Cristal, de acordo com <38>, que tem um pico de difração em um ângulo de difração (2θ ± 0,2°) de 6,1° em uma difração de raio X de pó.
[0047] <40> Cristal, de acordo com <39>, que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,1°, 9,3° e 16,6° em uma difração de raio X de pó.
[0048] <41> Cristal, de acordo com <39>, que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,1°, 9,3°, 15,9°, 16,6° e 22,3° em uma difração de raio X de pó.
[0049] <42> Cristal, de acordo com <39>, que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,1°, 9,3°, 13,4°, 14,8°, 15,9°, 16,6°, 20,6°, 22,3°, 23,5° e 24,4° em uma difração de raio X de pó.
[0050] <43> Cristal, de acordo com <42>, que tem um padrão de difração de raio X de pó substancialmente igual ao padrão de difração de raio X de pó mostrado na Figura 9.
[0051] <44> Cristal, de acordo com <1>, que é um cristal de (1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34R,36R,39S,41R)-29,41-difluoro-34,39- bis(sulfanil)-2,33,35,38,40,42-hexaoxa-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-deca-aza- 34λ5,39λ5-difosfaoctaciclo[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]dotetraconta- 5,7,9,11,15,19,21,23,25-nonaeno-34,39-diona (Composto (I)).
[0052] <45> Cristal, de acordo com <44>, que tem um pico de difração em um ângulo de difração (2θ ± 0,2°) de 5,6° em uma difração de raio X de pó.
[0053] <46> Cristal, de acordo com <45>, que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 5,6°, 13,9° e 16,8° em uma difração de raio X de pó.
[0054] <47> Cristal, de acordo com <45>, que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 5,6°, 8,9°, 11,4°, 13,9° e 16,8° em uma difração de raio X de pó.
[0055] <48> Cristal, de acordo com <45>, que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 5,6°, 7,9°, 8,9°, 11,4°, 13,9°, 16,8°, 22,1° e 23,1° em uma difração de raio X de pó.
[0056] <49> Cristal, de acordo com <48>, que tem um padrão de difração de raio X de pó substancialmente igual ao padrão de difração de raio X de pó mostrado na Figura 10.
[0057] <50> Composição farmacêutica que compreende o cristal, de acordo com qualquer um dentre <1> a <49>.
[0058] Os sais do Composto (I) e os cristais dos mesmos fornecidos pela presente invenção têm propriedades, tal como higroscopicidade, conforme mostrado nos exemplos descritos posteriormente, e um potencial a ser usado como substância farmacológica em produtos farmacêuticos.
[0059] [Fig. 1] A Figura 1 mostra um espectrógrafo de RMN de ¹H para sal de amônia de Composto (I).
[0060] [Fig. 2A] A Figura 2A mostra resultado de cristalografia de raio-X (desenhos ORTEP) para um cristal de sal de amônia de Composto (I), em que duas moléculas estão presentes na unidade de cristal assimétrico.
[0061] [Fig. 2B] A Figura 2B mostra Resultado de cristalografia de raio-X (desenhos ORTEP) para uma primeira molécula na unidade de cristal assimétrico.
[0062] [Fig. 2C] A Figura 2C mostra Resultado de cristalografia de raio-X (desenhos ORTEP) para uma segunda molécula na unidade de cristal assimétrico.
[0063] [Fig. 3] A Figura 3 mostra um padrão de difração de raio X de pó do cristal (Forma 1) do sal de diamônia de Composto (I) obtido no Exemplo 1. A abscissa mostra o ângulo de difração (2θ) e a ordenada mostra a intensidade de pico.
[0064] [Fig. 4] A Figura 4 mostra um padrão de difração de raio X de pó do cristal (Forma 2) do sal de diamônia de Composto (I) obtido no Exemplo 2. A abscissa mostra o ângulo de difração (2θ) e a ordenada mostra a intensidade de pico.
[0065] [Fig. 5] A Figura 5 mostra um padrão de difração de raio X de pó do cristal (Forma 3) do sal de diamônia de Composto (I) obtido no Exemplo 3. A abscissa mostra o ângulo de difração (2θ) e a ordenada mostra a intensidade de pico.
[0066] [Fig. 6] A Figura 6 mostra um padrão de difração de raio X de pó do cristal (Forma 4) do sal de diamônia de Composto (I) obtido no Exemplo 4. A abscissa mostra o ângulo de difração (2θ) e a ordenada mostra a intensidade de pico.
[0067] [Fig. 7] A Figura 7 mostra um padrão de difração de raio X de pó do cristal (Forma 5) do sal de diamônia de Composto (I) obtido no Exemplo 5. A abscissa mostra o ângulo de difração (2θ) e a ordenada mostra a intensidade de pico.
[0068] [Fig. 8] A Figura 8 mostra um padrão de difração de raio X de pó do cristal (Forma 6) do sal de monoamônia de Composto (I) obtido no Exemplo 6. A abscissa mostra o ângulo de difração (2θ) e a ordenada mostra a intensidade de pico.
[0069] [Fig. 9] A Figura 9 mostra um padrão de difração de raio X de pó do cristal do sal de sódio de Composto (I) obtido no Exemplo 7. A abscissa mostra o ângulo de difração (2θ) e a ordenada mostra a intensidade de pico.
[0070] [Fig. 10] A Figura 10 mostra um padrão de difração de raio X de pó do cristal do Composto (I) obtido no Exemplo 8. A abscissa mostra o ângulo de difração (2θ) e a ordenada mostra a intensidade de pico.
[0071] [Fig. 11] A Figura 11 é um gráfico que mostra higroscopicidade do cristal (Forma 1) do sal de diamônia de Composto (I) obtido no Exemplo 1. A abscissa mostra a umidade relativa e a ordenada mostra a alteração de peso.
[0072] [Fig. 12] A Figura 12 é um gráfico que mostra higroscopicidade do cristal (Forma 2) do sal de diamônia de Composto (I) obtido no Exemplo 2. A abscissa mostra a umidade relativa e a ordenada mostra a alteração de peso.
[0073] [Fig. 13] A Figura 13 é um gráfico que mostra higroscopicidade do cristal (Forma 5) do sal de diamônia de Composto (I) obtido no Exemplo 5. A abscissa mostra a umidade relativa e a ordenada mostra a alteração de peso.
[0074] [Fig. 14] A Figura 14 é um gráfico que mostra higroscopicidade do cristal (Forma 6) do sal de monoamônia de Composto (I) obtido no Exemplo 6. A abscissa mostra a umidade relativa e a ordenada mostra a alteração de peso.
[0075] [Fig. 15] A Figura 15 é um gráfico que mostra higroscopicidade do cristal do sal de sódio de Composto (I) obtido no Exemplo
7. A abscissa mostra a umidade relativa e a ordenada mostra a alteração de peso.
[0076] [Fig. 16] A Figura 16 mostra um mapa de vetor de expressão para WY STING (STING-Puro de ser humano de pLenti-WT).
[0077] [Fig. 17] A Figura 17 acompanha Exemplo de Teste Farmacológico 6 e mostra atividade curativa de sal de diamônia de Composto (I) em um modelo tumoral duplo CT26.
[0078] [Fig. 18] A Figura 18 acompanha Exemplo de Teste Farmacológico 6 e mostra atividade curativa de sal de diamônia de Composto (I) em um modelo tumoral duplo CT26.
[0079] [Fig. 19] A Figura 19 acompanha Exemplo de Teste Farmacológico 7 e mostra uma plotagem de volume tumoral para tumores tratados e curva de sobrevivência.
[0080] [Fig. 20] A Figura 20 acompanha Exemplo de Teste Farmacológico 8 e mostra uma plotagem de volume tumoral para tumores tratados e curva de sobrevivência.
[0081] [Fig. 21] A Figura 21 mostra um termograma TG-DTA do cristal (Forma 1).
[0082] [Fig. 22] A Figura 22 mostra padrões de difração de raio X de pó do cristal (Forma 1) em temperatura ambiente (o padrão inferior) e acima de 60 °C (o padrão superior).
[0083] [Fig. 23] A Figura 23 mostra a comparação de padrões de difração de raio X de pó: 1) o padrão de cristal (Forma 1) analisado através do método de transmissão (o inferior), 2) o padrão da amostra de cristal (Forma 1) aquecida acima de 60 °C, que é analisada através do método de reflexão (o médio), 3) o padrão de cristal (Forma 2) analisado através do método de transmissão (o superior).
[0084] [Fig. 24] A Figura 24 mostra padrões de difração de raio-X de pó do cristal (Forma 1) em várias temperaturas: 1) temperatura ambiente (o padrão inferior), 2) 61 a 71 °C (o padrão médio), 3) 125 a 134 °C (o padrão superior).
[0085] [Fig. 25] A Figura 25 mostra isoterma de adsorção e dessorção da Forma 1 a 25 °C.
[0086] [Fig. 26] A Figura 26 mostra comparação dos padrões de PXRD da Forma 1 entre antes (o padrão inferior) e depois do armazenamento a 25°C e 94% de RH por 4 dias (o padrão superior)
[0087] Um sal do Composto (I) da presente invenção, um cristal do mesmo e métodos de produção dos mesmos serão descritos em detalhes.
[0088] Conforme usado no presente documento, um "sal" se refere a uma entidade química constituída pelo Composto (I) como o componente ácido e um número específico de equivalentes de uma base para o Composto (I). Aqui, o termo "um sal de (1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34R,36R,39S,41R)-29,41-difluoro-34,39- bis(sulfanil)-2,33,35,38,40,42-hexaoxa-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-deca-aza- 34λ5,39λ5-difosfaoctaciclo[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]dotetraconta- 5,7,9,11,15,19,21,23,25-nonaeno-34,39-diona (Composto (I)) representado pela Fórmula (I), e uma base selecionada dentre o grupo que consiste em hidróxido de sódio, carbonato de sódio, amônia em etanol e hidróxido de amônia, etc.” é usado com o mesmo significado de " um sal de (1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34R,36R,39S,41R)-29,41-difluoro-34,39- bis(sulfanil)-2,33,35,38,40,42-hexaoxa-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-deca-aza- 34λ5,39λ5-difosfaoctaciclo[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]dotetraconta- 5,7,9,11,15,19,21,23,25-nonaeno-34,39-diona (Composto (I)) representado pela Fórmula (I) formado com uma base selecionada dentre o grupo que consiste em hidróxido de sódio, carbonato de sódio, amônia em etanol e hidróxido de amônia, etc."
[0089] Exemplos de um "sal", usado no presente documento, incluem sais com bases inorgânicas, e em particular, sais farmaceuticamente aceitáveis são preferenciais.
[0090] Um sal do Composto (I) também pode ser um solvato ou um hidrato. Conforme usado no presente documento, um solvato ou um hidrato do sal de Composto (I) significa um sólido formado a partir do sal do Composto (I) juntamente com moléculas de solvente ou molécula de água. Exemplos do solvente no solvato incluem: um solvente de cetona tal como uma acetona, metil etil cetona ou ciclo-hexanona; um solvente de éster tal como acetato de etila ou acetato de metila; e solvente de éter tal como 1, 2-dimetoxietano ou éter metil-terc-butílico; um solvente de álcool tal como metanol, etanol, 1- propanol ou isopropanol; um solvente polar tal como N-metil-2-pirrolidona, N,N- dimeilformamida ou sulfóxido de dimetila.
[0091] Conforme usado no presente documento, um "cristal" se refere a um cristal do sal de Composto (I) ou um cristal do Composto (I). Consequentemente, um cristal do sal de amônia de Composto (I), por exemplo, significa um cristal do sal formado entre o Composto (I) e a amônia (ou hidróxido de amônia). Adicionalmente, um cristal de sal de diamônia de Composto (I), por exemplo, significa um cristal do sal formado entre uma molécula do Composto (I) e duas moléculas de amônia (ou hidróxido de amônia).
[0092] Exemplos de cristais preferenciais no presente documento incluem: (a1) um cristal (Forma 1) de sal de diamônia de Composto (I), que tem um pico de difração em um ângulo de difração (2θ ± 0,2°) de 8,3 em uma difração de raio X de pó; (a2) um cristal (Forma 1) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 8,3 e 16,6 em uma difração de raio X de pó; (a3) um cristal (Forma 1) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,4, 8,3 e 16,6 em uma difração de raio X de pó; (a4) um cristal (Forma 1) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,4, 8,3, 12,7, 16,6 e 25,4 em uma difração de raio X de pó; (a5) um cristal (Forma 1) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,4, 8,3, 12,7, 16,6, 22,1, 22,8 e 25,4 em uma difração de raio X de pó; (a6) um cristal (Forma 1) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,4, 8,3, 12,7, 14,6, 16,6, 18,1, 22,1, 22,8, 24,4 e 25,4 em uma difração de raio X de pó; (b1) um cristal (Forma 2) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em um ângulo de difração (2θ ± 0,2°) de 9,0 em uma difração de raio X de pó; (b2) um cristal (Forma 2) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 9,0 e 15,4 em uma difração de raio X de pó; (b3) um cristal (Forma 2) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 9,0, 15,4 e 20,8 em uma difração de raio X de pó; (b4) um cristal (Forma 2) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 9,0, 15,4, 20,8, 24,0 e 30,0 em uma difração de raio X de pó; (b5) um cristal (Forma 2) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 9,0, 11,8, 15,4, 20,8, 24,0, 30,0 e 31,1 em uma difração de raio X de pó; (b6) um cristal (Forma 2) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 7,0, 9,0, 11,8, 13,2,15,4, 19,7, 20,8, 24,0, 30,0 e 31,1 em uma difração de raio X de pó; (c1) um cristal (Forma 3) de sal de diamônia de Composto (I), que tem um pico de difração em um ângulo de difração (2θ ± 0,2°) de 7,4 em uma difração de raio X de pó; (c2) um cristal (Forma 3) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 7,4 e 16,0 em uma difração de raio X de pó; (c3) um cristal (Forma 3) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 7,4, 16,0 e 21,4 em uma difração de raio X de pó;
(c4) um cristal (Forma 3) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,0, 7,4, 9,3, 16,0 e 21,4 em uma difração de raio X de pó; (c5) um cristal (Forma 3) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,0, 7,4, 9,3, 12,6, 16,0, 16,6 e 21,4 em uma difração de raio X de pó; (c6) um cristal (Forma 3) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,0, 7,4, 9,3, 12,6, 16,0, 16,6, 18,1, 21,4, 22,0 e 22,8 em uma difração de raio X de pó; (d1) um cristal (Forma 4) de sal de diamônia de Composto (I), que tem um pico de difração em um ângulo de difração (2θ ± 0,2°) de 9,7 em uma difração de raio X de pó; (d2) um cristal (Forma 4) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 9,7 e 14,0 em uma difração de raio X de pó; (d3) um cristal (Forma 4) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 9,7, 14,0 e 26,9 em uma difração de raio X de pó; (d4) um cristal (Forma 4) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 9,7, 14,0, 17,4, 22,3 e 26,9 em uma difração de raio X de pó; (d5) um cristal (Forma 4) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 7,6, 9,7, 14,0, 17,4, 22,3, 24,6 e 26,9 em uma difração de raio X de pó; (d6) um cristal (Forma 4) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 5,9, 7,6, 9,7, 11,6, 14,0, 16,0, 17,4, 22,3, 24,6 e 26,9 em uma difração de raio X de pó; (e1) um cristal (Forma 5) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em um ângulo de difração (2θ ± 0,2°) de 20,0 em uma difração de raio X de pó; (e2) um cristal (Forma 5) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 20,0 e 23,6 em uma difração de raio X de pó; (e3) um cristal (Forma 5) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 10,9, 20,0 e 23,6 em uma difração de raio X de pó; (e4) um cristal (Forma 5) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 10,9, 17,7, 18,9, 20,0 e 23,6 em uma difração de raio X de pó; (e5) um cristal (Forma 5) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 10,9, 13,0, 17,7, 18,9, 20,0, 21,5 e 23,6 em uma difração de raio X de pó; (e6) um cristal (Forma 5) de sal de diamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 9,0, 9,6, 10,9, 13,0, 15,3, 17,7, 18,9, 20,0, 21,5 e 23,6 em uma difração de raio X de pó; (f1) um cristal (Forma 6) de sal de monoamônia de Composto (I), que tem um pico de difração em um ângulo de difração (2θ ± 0,2°) de 17,0 em uma difração de raio X de pó; (f2) um cristal (Forma 6) de sal de monoamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 17,0 e 25,9 em uma difração de raio X de pó; (f3) um cristal (Forma 6) de sal de monoamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 17,0, 21,6 e 25,9 em uma difração de raio X de pó; (f4) um cristal (Forma 6) de sal de monoamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 15,1, 16,4, 17,0, 21,6 e 25,9 em uma difração de raio X de pó; (f5) um cristal (Forma 6) de sal de monoamônia de Composto (I),
que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 12,0, 15,1, 16,4, 17,0, 21,6, 22,8 e 25,9 em uma difração de raio X de pó; (f6) um cristal (Forma 6) de sal de monoamônia de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,9, 8,5, 12,0, 15,1, 16,4, 17,0, 21,0, 21,6, 22,8 e 25,9 em uma difração de raio X de pó; (g1) um cristal de sal de sódio de Composto (I), que tem um pico de difração em um ângulo de difração (2θ ± 0,2°) de 6,1 em uma difração de raio X de pó; (g2) um cristal de sal de sódio de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,1 e 16,6 em uma difração de raio X de pó; (g3) um cristal de sal de sódio de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,1, 9,3 e 16,6 em uma difração de raio X de pó; (g4) um cristal de sal de sódio de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,1, 9,3, 15,9, 16,6 e 22,3 em uma difração de raio X de pó; (g5) um cristal de sal de sódio de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,1, 9,3, 13,4, 15,9, 16,6, 20,6 e 22,3 em uma difração de raio X de pó; (g6) um cristal de sal de sódio de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,1, 9,3, 13,4, 14,8, 15,9, 16,6, 20,6, 22,3, 23,5 e 24,4 em uma difração de raio X de pó; (h1) um cristal de Composto (I), que tem um pico de difração em um ângulo de difração (2θ ± 0,2°) de 5,6 em uma difração de raio X de pó; (h2) um cristal de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 5,6 e 13,9 em uma difração de raio X de pó;
(h3) um cristal de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 5,6, 13,9 e 16,8 em uma difração de raio X de pó; (h4) um cristal de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 5,6, 8,9 , 11,4, 13,9 e 16,8 em uma difração de raio X de pó; e (h5) um cristal de Composto (I), que tem picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 5,6, 7,9, 8,9, 11,4, 13,9, 16,8, 22,1 e 23,1 em uma difração de raio X de pó.
[0093] Os picos em uma difração de raio X de pó, descritos acima, são característicos para cada um dentre o cristal (Forma 1) de sal de diamônia de Composto (I), o cristal (Forma 2) de sal de diamônia de Composto (I), o cristal (Forma 3) de sal de diamônia de Composto (I), o cristal (Forma 4) de sal de diamônia de Composto (I), o cristal (Forma 5) de sal de diamônia de Composto (I), o cristal (Forma 6) de sal de monoamônia de Composto (I), o cristal de sal de sódio de Composto (I) e o cristal de Composto (I).
[0094] Em geral, podem surgir erros nos ângulos de difração (2θ) dentro da faixa de ± 0,2 em difração de raios X de pó e, assim, se deve considerar que os valores dos ângulos de difração descritos acima incluem valores dentro da faixa de cerca de ± 0,2°. Estão incluídos na presente invenção, portanto, não apenas cristais com picos exatamente nos mesmos ângulos de difração na difração de raios X de pó, mas também cristais com picos dentro de uma faixa de erro de cerca de ± 0,2° dos ângulos de difração. Portanto, "que tem um pico de difração em um ângulo de difração (2θ ± 0,2°) de 8,3°, conforme usado no presente documento, por exemplo, significa "que tem um pico de difração em um ângulo de difração (2θ) de 8,1° a 8,5°. O mesmo é válido para outros ângulos de difração.
[0095] Geralmente, as intensidades de pico e as larguras de meio valor do ângulo de difração (2θ) em difração de raios X de pó são diferentes para cada medição devido às diferenças nas condições de medição e nas dispersões de tamanho e formato de cada partícula de cristal de pó e nem sempre estável mesmo que as formas dos cristais sejam as mesmas. Portanto, no caso de comparar um padrão de difração de raios X de pó, quando ângulos de difração (2θ) são os mesmos, mas as intensidades de pico, intensidades de pico relativas e larguras de meio valor são diferentes, essas diferenças não significam que as formas medidas de cristais sejam diferentes entre si. Assim, um cristal de sal que tem um perfil de difração de raios X de pó, que tem as diferenças acima mencionadas com relação aos picos de difração característicos de um determinado cristal de sal de acordo com a presente invenção, significa que o cristal tem a mesma forma de cristal do sal de acordo com a presente invenção.
[0096] Conforme usado no presente documento, "que tem um padrão de difração de raios X de pó substancialmente igual ao padrão de difração de raios X de pó mostrado na Figura 3" significa que inclui não apenas o caso que tem exatamente o mesmo padrão de difração de raios X de pó conforme mostrado na Figura 3, mas também o caso que intensidades de pico, intensidades de pico relativas e larguras de meio valor são diferentes ou o caso de ter os picos característicos dentro de uma faixa de erro de aproximadamente ± 0,2 dos ângulos de difração. Assim, cada cristal que tem esse perfil de difração de raios X de pó significa que o cristal é idêntico ao do cristal de acordo com a presente invenção.
[0097] Métodos para produzir um sal do Composto (I) e um cristal do mesmo serão descritos em detalhes.
[0098] (Produção do Composto (I))
[0099] Composto (I) pode ser sintetizado conforme descrito especificamente no Exemplo de Produção 1 ou no Exemplo de Produção 2 abaixo.
[0100] (Método para produzir um sal do Composto (I))
[0101] Um sal do Composto (I) pode ser obtido através de um método convencional para produzir um sal. Especificamente, o mesmo pode ser produzido, por exemplo, suspendendo ou dissolvendo-se o Composto (I) em um solvente, com aquecimento, caso necessário, então, adicionando-se uma base (por exemplo, hidróxido de sódio, carbonato de sódio para sal de sódio; amônia em etanol e hidróxido de amônia para sal de mono ou diamônia) na suspensão ou solução obtida e agitando ou deixando-se a suspensão ou solução resultante por diversos minutos até diversos dias em temperatura ambiente ou com resfriamento de banho de gelo. Um sal do Composto (I) pode ser obtido como cristais ou substâncias amorfas de acordo com os métodos de produção. Exemplos dos solventes a serem usados nesses métodos incluem solventes alcoólicos tais como etanol, 1-propanol e isopropanol; acetonitrila; solventes cetônicos, tais como acetona e 2-butanona; solventes do tipo éster, tal como acetato de etila; solventes do tipo hidrocarboneto saturado, tais como hexano e heptano; solventes do tipo éter, tal como éter t-butil-metílico ou água. Cada um desses solventes pode ser usado sozinho, ou dois ou mais podem ser misturados e usados.
[0102] (Método para produzir um cristal do sal do Composto (I))
[0103] Um cristal do sal do Composto (I) pode ser produzido pelos métodos mencionados acima para produzir um sal do Composto (I) ou por dissolução com calor de um sal do Composto (I) em um solvente e cristalização do mesmo através de resfriamento com agitação.
[0104] Um sal do Composto (I) a ser usado na cristalização pode estar em qualquer forma: o mesmo pode ser um solvato, um hidrato, um anidrato, uma substância amorfa, uma substância cristalina (que inclui aqueles que consistem em uma pluralidade de polimorfos cristalinos) ou uma combinação dos mesmos.
[0105] Exemplos dos solventes a serem usados na cristalização incluem solventes alcoólicos, tais como metanol, etanol, isopropanol e 1- propanol; acetonitrila; solventes do tipo amida, tal como N,N-dimetilformamida;
solventes do tipo éster, tal como acetato de etila; solventes do tipo hidrocarboneto saturado, tais como hexano e heptano; solventes do tipo cetona, tais como acetona e 2-butanona; solventes do tipo éter, tal como éter t- butil-metílico ou água. Além disso, cada um desses solventes pode ser usado sozinho, ou dois ou mais podem ser misturados e usados.
[0106] A quantidade do solvente a ser usada pode ser adequadamente selecionada, desde que o limite inferior seja a quantidade com a qual a forma livre do Composto (I) ou do sal do mesmo é dissolvida com o aquecimento ou a suspensão pode ser agitada, e desde que o limite superior seja a quantidade com a qual o rendimento do cristal não é significativamente reduzido.
[0107] Um cristal semente (por exemplo, o cristal do sal de Composto (I) desejado) pode ser adicionado ou pode não ser adicionado durante a cristalização. A temperatura na qual o cristal semente é adicionado não é particularmente limitada, porém, é preferencialmente de 0 a 80 °C.
[0108] Como a temperatura a ser empregada quando o sal do Composto (I) é dissolvido por aquecimento, aquela em que o Composto (I) se dissolve pode ser adequadamente selecionada dependendo do solvente, mas está preferencialmente dentro da faixa entre a temperatura em que o solvente de recristalização começa a ser submetido a refluxo e 50 °C e, mais preferencialmente 65 a 55 °C.
[0109] Esfriamento durante a cristalização poderia fornecer substâncias que contêm diferentes formas de cristais (polimorfismo) no caso de resfriamento rápido. É, portanto, desejável realizar o resfriamento enquanto se controla a taxa de resfriamento conforme apropriado com base no seu efeito na qualidade, tamanho de grãos e semelhantes do cristal. É preferencial, por exemplo, uma taxa de resfriamento de 40 a 5 °C/hora. É mais preferencial resfriamento a uma taxa de resfriamento, por exemplo, de 25 a 5 °C/hora.
[0110] Ademais, a temperatura de cristalização final pode ser selecionada adequadamente para o rendimento, qualidade e similaridades do cristal, mas é preferencialmente 30 a -25 °C.
[0111] O cristal-alvo pode ser obtido por isolamento do cristal formado através de um procedimento de filtração convencional, lavagem do cristal coletado por filtração com um solvente se necessário, e secagem adicional do cristal. Como solvente a ser usado para lavar o cristal, se pode usar o mesmo solvente que na cristalização. Além disso, cada um desses solventes pode ser usado sozinho, ou dois ou mais podem ser misturados e usados. Preferencialmente, por exemplo, é acetona, 2-butanona, acetato de etila, éter metil t-butílico, hexano ou um solvente misturado de hexano/2- butanona.
[0112] O cristal isolado pelo procedimento de filtração pode ser apropriadamente seco deixando-o exposto ao ar ou sob fluxo de nitrogênio, ou por aquecimento.
[0113] Como tempo de secagem, se pode selecionar como apropriado o tempo que leva até a quantidade de solvente residual se tornar inferior à quantidade predefinida, dependendo da quantidade de produção, do aparelho de secagem, da temperatura de secagem e semelhantes. Além disso, a secagem pode ser realizada sob fluxo de ar ou sob pressão reduzida. O grau de redução da pressão pode ser selecionado, conforme apropriado, dependendo da quantidade de produção, do aparelho de secagem, da temperatura de secagem e semelhantes. O cristal obtido pode ser mantido exposto ao ar conforme necessário após a secagem.
[0114] (Método para produzir um cristal de Composto (I))
[0115] Um cristal de Composto (I) pode ser obtido através de um método convencional para produzir um cristal, conforme mostrado acima.
[0116] Uma composição farmacêutica da presente invenção poderia ser preparada misturando-se aditivos farmaceuticamente aceitáveis ao sal do Composto (I) ou o cristal do mesmo. Uma composição farmacêutica da presente invenção poderia ser preparada de acordo com o método conhecido, tal como um método descrito nas regras gerais para preparações da
Farmacopeia Japonesa 17ª edição.
[0117] Uma composição farmacêutica da presente invenção poderia ser administrada a pacientes apropriadamente dependendo da forma de dosagem.
[0118] Uma composição farmacêutica da presente invenção tem aplicabilidade como um agente terapêutico para tratamento de cânceres desde que o sal de Composto (I) ou o cristal do mesmo possa ativar, potentemente, a trajetória de STING e mostrar atividades antitumorais potentes. Exemplos de cânceres incluem glioma, melanoma e câncer de cólon.
[0119] A dosagem do sal do Composto (I) ou do cristal do mesmo varia dependendo do grau do sintoma, da idade, sexo, peso corporal, forma farmacêutica, o tipo do sal, o tipo específico da doença e similares. No caso de adultos, tipicamente, cerca de 30 μg a 10 g, preferencialmente 100 μg a 5 g e, mais preferencialmente, 100 μg a 1 g por dia é oralmente administrado, ou cerca de 30 μg a 1 g, preferencialmente 100 μg a 500 mg e, mais preferencialmente 100 μg a 300 mg por dia é administrado por injeção, em cada caso, em uma dose única ou em doses divididas.
[0120] Doravante, a presente invenção será descrita em detalhes com os exemplos de produção e exemplos. No entanto, a presente invenção não pretende ser limitada por estes exemplos.
[0121] As abreviações a seguir podem ser usadas ao longo dos exemplos: DMT: 4,4′-dimetoxitritila (DMTO-: )
Bz: benzoila CE: cianoetila
( ) DEAD: azodicarboxilato de dietila DIAD: azodicarboxilato de di-isopropila DCM: diclorometano DDTT: N, N-dimetil-N'-(3-tioxo-3H-1,2,4-ditiazol-5-il)formimidamida
DMOCP: 2-óxido de 2-cloro-5,5-dimetil-1,3,2-dioxafosfinano
TBS: t-butildimetilsilila 3H-benzo[c][1,2]ditiol-3-ona:
MTBE: éter metil-t-butílico Difração de raios X de pó
[0122] Cada amostra cristalina foi colocada no estágio de amostra de um difratômetro de raio-X de pó e a análise foi realizada sob uma das seguintes condições.
[0123] Condições de método de transmissão
[0124] Equipamento: X'Pert Pro MPD ou Empyrean (Spectris)
[0125] Fonte de raio-X: CuKα (45 kV, 40 mA)
[0126] Sistema óptico: Espelho de focalização
[0127] Fenda de Soller: 0,02 ou 0,04 radiano
[0128] Detector: Detector X'Celerator ou PIXcel1D (sistema de detecção semicondutor)
[0129] Modo: Transmissão
[0130] Faixa de varredura: de 3° ou 5° a 35° ou 40°
[0131] Tamanho da etapa: 0,013°, 0,017° ou 0,033°
[0132] Tempo de etapa de varredura: 9, 19, 305, 1.976 ou 2.000 segundos
[0133] Retentor de amostra: Filme Kapton (marca registrada)
[0134] [0042]Condições de método de reflexo
[0135] Equipamento: RINT TTR-III (Rigaku)
[0136] Fonte de raio-X: CuKα (50 kV, 300 mA)
[0137] Detector: contador de cintilação
[0138] Modo: Reflexo
[0139] Fenda: 0,5 mm (fenda divergente), aberta (fenda de dispersão), aberta (fenda de recebimento de luz)
[0140] Taxa de varredura: 5° ou 10°/minuto
[0141] Intervalo de amostragem: 0,02°
[0142] Faixa de varredura: de 3° ou 5° a 35°
[0143] Retentor de amostra: retentor de alumínio RMN de 1H: ressonância magnética nuclear de próton
[0144] O acoplamento constante é registrado em hertz (Hz). As abreviações dos padrões de divisão são as seguintes:
[0145] s: singleto, d: dupleto, t: tripleto, q: quarteto, m: multiplex, bs: singleto amplo, br s: singleto amplo, dd: dupleto de dupletos, dt: dupleto de tripletos, br d: dupleto amplo, br t: tripleto amplo
[0146] A menos que seja indicado de outra forma, espectros de RMN de 1H foram obtidos em uma RMN Bruker 300 MHz ou 400 MHz. Higroscopicidade
[0147] O sólido obtido foi ponderado em um copo de amostragem e o copo de amostragem foi colocado dentro de uma câmara isotérmica a 25 °C. A umidade relativa (RH) foi controlada de 0% a 95% com o uso de um sistema de sorção a vapor gravimétrica e o peso da amostra em cada estágio de RH foi medido dentro de um intervalo de tempo predeterminado (por exemplo, a cada 2 minutos). A alteração de peso em cada estágio de RH foi avaliada de uma maneira gradual e, então, foi finalmente determinada sob os seguintes critérios. A alteração de peso máxima para cada medição é menor que 0,01% (p/p) em 5 minutos ou 0,002% (p/p) em 1 minuto. Exemplo de Produção 1: Síntese do Composto (I) Etapa A
[0148] A uma mistura de (2R,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin- 9-il)-2-((bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)metil)-4-fluorotetra-hidrofuran-3-ila(2- cianoetila)di-isopropilfosforamidita (Composto (1)) (mistura de diastereoisômeros de fósforo; 80,0 g, 91,332 mmol, 1 eq., nº de catalogo da ChemGenes Corporation ANP-9151), álcool alílico (9,63 ml, 142 mmol, 1,55 eq)
e trifenilfosfino (38,3 g, 146 mmol, 1,60 eq.) em THF (1,1 l) foi adicionado DEAD (40% em peso de solução em tolueno; 54,2 ml, 137 mmol, 1,5 eq.) em temperatura de meio ambiente. Agitação continuou em temperatura de meio ambiente e a reação foi monitorada através de LC/MS. Mediante conclusão (19 h), a mistura foi concentrada em vácuo (35 °C) e a mistura resultante foi purificada através de cromatografia de coluna de gel de sílica (800 g x 2 colunas, 40 a 60% de EtOAc em n-heptano tamponado com 0,5% de trietilamina) para gerar o Composto (2) como uma espuma branca (84,2 g, rendimento quantitativo, mistura de diastereoisômeros de fósforo).
[0149] RMN de 1H (mistura de diastereoisômeros de fósforo de 3:2, 400 MHz, CDCl3) δ1,14-1,21 (m, 12 H), 2,40 (t, J=6,2 Hz, 1,2 H), 2,59 (t, J=6,2 Hz, 0,8 H), 3,27 (d, J=8,6 Hz, 1 H), 3,52-3,66 (m, 5 H), 3,78 (s 2,4 H), 3,79 (s 3,6 H), 4,28 - 4,34 (m, 1 H), 4,84 - 4,96 (m, 0,4 H), 4,99 (d, J=5,5 Hz, 2 H), 4,95-5,10 (m, 0,6 H), 5,05 (d, J=10,9 Hz, 1 H), 5,22 (d l, J=17,6 Hz, 1 H), 5,64 (d l, J=53,2 Hz, 0,6 H), 5,70 (d l, J=51,6 Hz, 0,4 H), 5,96 - 6,75 (m, 1 H), 6,20 (d, J=16,0 Hz, 0,6 H), 6,24 (d, J=17,2Hz, 0,4 H), 6,74 - 6,79 (m, 4 H), 7,02 - 7,06 (m, 2H), 7,17 - 7,24 (m, 8 H), 7,32 - 7,34 (m, 2 H), 7,41 - 7,44 (m, 2 H), 8,11 (s, 1H), 8,52 (s, 0,4 H), 8,54 (s, 0,6 H). Etapa B
[0150] A uma solução de Composto (2) (3,00 g, 3,28 mmol, 1 eq.)
em acetonitrila (30 ml) foi adicionado água (0,118 ml, 6,55 mmol, 2,0 eq.) e sal de trifluoroacetato de piridina (0,759 g, 3,93 mmol, 1,2 eq.). Após agitação a temperatura de meio ambiente por 1 minuto, terc-butilamina (14,5 g, 21,0 ml, 0,20 mol, 60 eq.) foi adicionada. Mediante clivagem completa de grupo cianoetila (monitorada por LC/MS), a mistura de reação foi concentrada em vácuo e azeotropada duas vezes com acetonitrila. A mistura bruta foi dissolvida em DCM (45,0 ml) e tratada com água (0,118 ml, 6,55 mmol, 2,0 eq.) e NaHSO4-SiO2 (1,18 g, 6,55 mmol, 2 eq.) em temperatura de meio ambiente. Mediante clivagem completa de grupo DMT (monitorada por LC/MS, aproximadamente 1 hora), a mistura de reação foi filtrada e enxaguada duas vezes com DCM/MeOH (9/1, 20 ml). Os filtrados combinados foram concentrados em vácuo e tratados com mistura de 1:1 de n-heptano/tolueno (~30 ml). A camada superior foi removida por decantação. A mesma operação foi repetida uma vez mais com n-heptano/tolueno (1/1, 30 ml) e a camada inferior foi azeotropada duas vezes com acetonitrila para gerar o Composto (3) (100% de rendimento teórico assumido). O produto foi usado na etapa seguinte sem purificação adicional. Etapa C
[0151] A uma mistura de Composto (3) (1,56 g, 3,27 mmol, 1 eq.) e Composto (1) (3,00 g, 3,28 mmol, 1 eq.) em acetonitrila (30 ml) foi adicionado sal de trifluoroacetato de piridina (azeotropicamente seco com piridina; 0,760 g, 3,94 mmol, 1,25 eq.). Após 5 minutos, DDTT (0,840 g, 4,09 mmol, 1,30 eq., nº de catalogo da ChemGenes Corporation RN-1588) foi adicionada e, mediante sulfurização completa (monitorada por LC/MS), a mistura de reação foi concentrada em vácuo. O resíduo foi dissolvido em DCM (30 ml) e tratado com água (0,57 ml, 32 mmol, 10 eq.) e 6% de ácido dicloroacético (1,56 ml, 18,9 mmol, 6,0 eq.) em DCM (30 ml). Após 20 minutos, a reação foi arrefecida com piridina (20 ml) e concentrada em vácuo. O resíduo foi azeotropado com piridina para gerar o Composto (4) (3,22 g, 100% de rendimento teórico assumido). O produto foi usado na próxima etapa sem purificação adicional. Etapa D
[0152] A uma solução de Composto (4) (3,22 g, 3,15 mmol, 1 eq.) em piridina (100 ml) foi adicionado DMOCP (1,45 g, 7,88 mmol, 2,50 eq.) em temperatura de meio ambiente. Mediante macrociclização completa (monitorada por LC/MS), água (1,7 ml, 94,5 mmol, x10 vezes com relação ao DMOCP) foi adicionada seguida por 3H-benzo[c][1,2]ditiol-3-ona (0,795 g, 4,73 mmol, 1,5 eq.). Mediante sulfurização completa (aproximadamente 40 minutos), a mistura de reação foi parcialmente concentrada em vácuo até aproximadamente 15 ml e despejada em uma mistura de NaHCO 3 (50 ml) e água (30 ml) aquosa e saturada. Após 10 min de agitação em temperatura de meio ambiente, a mistura foi extraída com mistura de 1:1 de EtOAc/MTBE (60 ml x 3 vezes). As camadas orgânicas foram combinadas, lavadas com salmoura (25 ml), secas sobre MgSO4 e concentradas em vácuo. O resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna de gel de sílica (0 a 20% de MeOH em DCM) para gerar o Composto (5) (3,31 g, 3,20 mmol, 100% de rendimento teórico assumido) como um óleo marrom. O produto foi usado na etapa seguinte sem purificação adicional. Etapa E
[0153] A uma solução de Composto (5) (3,31 g, 3,20 mmol, 1 eq.) em acetonitrila (66,2 ml) foi adicionado brometo de 2-nitrobenzila (2,42 g, 11,2 mmol, 3,50 eq.) e trietilamina (1,78 ml, 12,8 mmol, 4,00 eq.). Mediante a reação completa (monitorada por LC/MS, aproximadamente 20 horas em temperatura de meio ambiente), a mistura de reação foi concentrada em vácuo e purificada através de cromatografia de coluna de gel de sílica (60% de acetato de etila/n- heptano até 100% de acetato de etila) para gerar 0,568 g de produto como uma mistura de diastereoisômeros de fósforo. Separação por HPLC preparatória dos diastereoisômeros gerou o Composto (6) (isômero SR; 0,225 g, 0,180 mmol, 5,6% de rendimento geral do Composto (2)) e Composto (7) (isômero RR; 0,187 g, 0,149 mmol, 4,7% de rendimento geral do Composto (2)).
[0154] Composto (6) (SpRp) 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ(ppm): 8,63 (s, 1H), 8,61 (s, 1H), 8,04 - 8,00 (m, 2H), 7,99 (s, 1H), 7,90 (s, 1H), 7,65 - 7,44 (m, 8H), 7,40 - 7,31 (m, 4H), 7,25 - 7,21 (m, 4H), 6,15 - 5,89 (m, 5H), 5,61 (dd, J = 52,0, 5,1 Hz, 1H), 5,55 (ddd, J = 51,2, 4,7, 2,7 Hz, 1H), 5,51 - 5,42 (m, 1H), 5,31 - 5,22 (m, 2H), 5,11 (dd, J = 3,9, 9,8 Hz, 2H), 5,04 - 4,95 (m, 4H), 4,55 - 4,37 (m, 7H), 4,29 - 4,12 (m, 3H).
[0155] Composto (7) (RpRp) 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ(ppm): 8,65 (s, 2H), 8,06 (dd, J = 1,4, 8,0 Hz, 2H), 7,98 (s, 2H), 7,57 - 7,52 (m, 6H), 7,47 - 7,32 (m, 6H), 7,25 - 7,21 (m, 4H), 6,15 (d, J = 18,7 Hz, 2H), 6,09 - 5,99 (m, 2H), 5,82-5,76 (m, 2H), 5,60 (dd, J = 51,8, 4,9 Hz, 2H), 5,27 (dd, J = 1,2, 17,2 Hz, 2H), 5,12 (dd, J = 1,0, 10,4 Hz, 2H), 5,06 - 4,96 (m, 4H), 4,55 - 4,40 (m, 4H), 4,36 - 4,24 (m, 4H), 4,21 - 4,02 (m, 2H). Tabela 1 Condições de HPLC preparatória: Instrumento Agilent 1200 Coluna Waters Sunfire Prep C18 OBD, Coluna de HPLC 5 um, 30 x 250 mm, nº 186003969 Taxa de fluxo 50 ml/min fase móvel A: água, B: acetonitrila Gradiente Tempo (min) 0 8 9,9 10 12
% de B 50 99 99 50 50 Tempo de Execução 12 min Volume de injeção 150 μl (0,08 g/ml em acetonitrila) detecção UV 254 nm Tempo de Composto (6) (SpRp) 7,7 min retenção Composto (7) (RpRp) 8,0 min Etapa F
[0156] A uma solução aquecida (90 °C) do Composto (6) (519 mg, 0,414 mmol, 1 eq.) em tolueno (519 ml) foi adicionado Hoveyda-Grubbs CatalystTM de 2a geração ((1,3-bis-(2,4,6-trimetilfenil)-2- imidazolidinilideno)dicloro(o-isopropoxifenilmetileno)rutênio; disponível pela SIGMA-ALDRITCH (marca registrada) nº de catalogo 569755; CAS 301224-40- 8; 91 mg, 0,15 mmol, 0,35 eq.) e quinona (0,102 ml, 1,243 mmol, 3,0 eq.). A mistura foi aquecida até refluxo e o progresso de reação foi monitorado por LC/MS. Após 3 horas um catalisador adicional foi adicionado (91 mg, 0,15 mmol, 0,35 eq.) e a reação continuou por mais 3 horas. Após resfriamento, a mistura foi tratada com DMSO (0,59 ml, 8,3 mmol, 20 eq.) em temperatura de meio ambiente por 15 horas, concentrada em vácuo e purificada através de cromatografia de coluna de gel de sílica (SiO2 25 g, 66% de acetato de etila em n-heptano até 100% de acetato de etila) para gerar o Composto (8) (200 mg, 0,163 mmol, 39% de rendimento) como uma espuma seca marrom. 1
[0157] H RMN (400 MHz, CDCl3) δ (ppm): 8,19 (s, 1H), 8,12 (dd, J = 7,8 Hz, 1,9 Hz, 1H), 8,10 (s, 1H), 8,02 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,89 (s, 1H), 7,63 (d l, J = 7,0 Hz, 1H), 7,53 - 7,41 (m, 10H), 7,35 - 7,30 (m, 2H), 7,25 - 7,20 (m, 4H), 6,23 (d, J = 17,6 Hz, 1H), 6,14 (d, J = 18,8 Hz, 1H), 5,86 - 5,75 (m, 1H), 5,75 (dt, J = 15,3, 5,0 Hz, 1H), 5,67 (dt, J = 15,3, 4,7 Hz, 1H), 5,60 (dd, J = 52,0, 3,9 Hz. 1H), 5,48 (dd, J = 50,4, 3,9 Hz. 1H), 5,50 - 5,39 (m, 1H), 4,91 - 4,64 (m, 4H), 4,57 - 4,25 (m, 9H), 4,15 (d, J = 7,03 Hz, 1H), 4,11 (d, J = 7,03 Hz, 1H). Etapa G
[0158] A uma solução de Composto (8) (88 mg, 0,072 mmol, 1 eq.) em 1,4-dioxano (1,76 ml) foi adicionado tiofenol (0,88 ml, 8,55 mmol, 119 eq.) e trietilamina (0,88 ml, 6,31 mmol, 88 eq.). A mistura resultante foi agitada em temperatura de meio ambiente. Mediante reação completa (monitorada por LC/MS, 13 horas), metanol (5,28 ml) e 28% de hidróxido de amônia (3,52 ml) foram adicionados e a mistura resultante foi aquecida até 50 °C. Mediante reação completa (monitorada por LC/MS, 5 horas), a mistura foi resfriada até temperatura de meio ambiente e a pasta fluida acastanhada resultante foi filtrada e enxaguada com água (15 ml). O filtrado foi filtrado novamente para remover sólidos adicionais. O filtrado final foi extraído duas vezes com uma mistura de 1:1 de tolueno e n-heptano (30 ml). A camada aquosa foi concentrada em vácuo e, então, ressuspensa em água (6 ml). O sólido resultante foi filtrado e o filtrado foi submetido à HPLC preparatória para gerar o sal de diamônia do Composto (I) (também denominado Composto (1a)) (39 mg, 0,050 mmol, 70% de rendimento) como um sólido branco.
[0159] Composto (1a) (SpRp, trans) 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ (ppm): 9,05 (s, 1H), 8,33 (s, 1H), 8,25 (s, 1H), 8,12 (s, 1H), 6,34 (s l, 2H), 5,88 (s l, 2H), 5,66 (d l, J = 51,6 Hz, 1H), 5,59 (d l, J = 52,2 Hz, 1H), 5,01 (s l, 2H), 4,68-4,34 (m, 6H), 4,07 - 3,82 (m, 2H), 3,79 - 3,55 (m, 2H); 31
[0160] RMN de P (162 MHz, CD3OD) δ(ppm): 55,48 (s, 1P), 55,16 (s, 1P). Tabela 2 Condições de HPLC preparatória de Composto (1a): Instrumento Agilent 1200/1260 AS/FC Coluna de HPLC Waters XBridge C18, 10 x 100 mm, nº 1413 Taxa de fluxo 3,0 ml/min Temperatura de coluna 35 °C A: 0,1% de NH4OH em água, B: 0,1% de NH4OH Fase móvel em acetonitrila Gradiente (% de B) 0 → 50 Tempo de Execução 20 min Volume de injeção 50 ul (4 mg/ml em água)
Detecção UV 260 nm Tempo de retenção 6,5 min Exemplo de Produção 2: (Síntese Alternativa para o Composto (1a)) Estágio 1
[0161] Composto (201) (570 g, 1,53 mol, 1 wt, 1 vol, 1 eq.) foi dissolvido em piridina (2,85 l, 35,2 mol, 4,89 wt, 5,0 vols, 23 eq.). A mistura foi resfriada até 2,6 °C e tratada com cloreto de 4,4'-dimetoxitritila (DMTCl; 543 g, 1,60 mol, 0,953 wt, 1,05 eq.). A mistura foi agitada em 0 a 5 °C por 2 h e, então, deixada para aquecer até a temperatura de meio ambiente. A reação foi monitorada por LC/MS e a conversão completa foi confirmada após agitação de um dia para o outro. A mistura de reação foi resfriada até abaixo de 5 °C e arrefecida através de tratamento com MeOH (124 ml, 3,05 mol, 0,172 wt, 0,217 vol, 2,0 eq.) por 15 minutos. A mistura foi coevaporada com tolueno (2,00 l, 3,04 wt, 3,51 vol) sob vácuo e, então, diluída com uma mistura de EtOAc (2,850 l, 4,5 wt, 5,0 vol) e n-heptano (2,85 l, 3,42 wt, 5,0 vol). A camada orgânica foi lavada com NaHCO3 saturado (9% em peso de solução em água; 2,0 l, 3,5 vol). Um EtOAc adicional (2,85 l, 4,5 wt, 5,0 vol) foi adicionado até dissolver completamente o produto bruto. Após terem sido agitadas por 5 minutos, as duas camadas foram separadas. A camada orgânica foi lavada com água (2,0 l, 3,5 wt, 3,5 vol). Sólido começou a precipitar lentamente fora da camada orgânica. A camada de água foi separada. A camada orgânica foi, então, concentrada até aproximadamente 1 vol. O produto bruto foi transformado em pasta fluida com uma mistura de n-heptano (2,00 l, 2,40 wt, 3,51 vol) e tolueno (0,50 l, 0,76 wt, 0,88 vol). Após agitação por 15 minutos, o sólido amarelo pálido foi coletado através de filtração a vácuo. O bolo filtrado foi sequencialmente enxaguado com: (1) uma mistura de n-heptano (0,60 l, 0,72 wt, 1,05 vol) e tolueno (0,30 l, 0,46 wt, 0,53 vol) e, então, (2) n-heptano (3,00 l, 3,6 wt, 5,26 vol). O sólido foi seco sem calor por 30 minutos e, então, transferido para bandejas para secagem a 50 °C em um forno a vácuo de um dia para o outro para gerar o Composto (202) como sólido amarelo pálido (996,7 g, 1,47 mol, 1,75 wt, 97% de rendimento). 1
[0162] H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ(ppm): 8,99 (s, 1H), 8,76 (s, 1H), 8,21 (s, 1H), 8,04 - 8,00 (m, 2H), 7,64 - 7,59 (m, 1H), 7,57 - 7,50 (m, 2H), 7,41 - 7,36 (m, 2H), 7,32 - 7,15 (m, 7H), 6,83 - 6,76 (m, 4H), 6,31 (dd, J = 2,5, 17,0 Hz, 1H), 5,68 (ddd, J = 2,3, 4,7, 52,7 Hz, 1H), 4,88 - 4,77 (m, 1H), 4,26 - 4,21 (m, 1H), 3,77 (s, 6H), 3,57 (dd, J = 3,1, 10,9 Hz, 1H), 3,43 (dd, J = 4,1, 10,7 Hz, 1H), 2,60 (s l, 1H). Estágio 1'
[0163] Composto (201) (430 g, 1,15 mol, 1 wt, 1 vol, 1 eq.) e imidazol (118 g, 1,73 mol, 0,274 wt, 1,50 eq.) foram dissolvidos em DMF (1,72 l, 3,78 wt, 4,0 vol) e a mistura resultante foi resfriada até 5 °C. TBS-Cl (191 g, 1,27 mol, 0,444 wt, 1,10 eq.) foi adicionado. A mistura foi agitada em 0 a 11 °C por 2 h, deixada para aquecer lentamente até temperatura de meio ambiente
(progresso monitorado por LCMS). A reação foi concluída 6 h após adição de TBS-Cl, deixada ainda para agitar em temperatura de meio ambiente por mais 20 h. A mistura foi resfriada até 2 °C e tratada com metanol (93 ml, 74 g, 2,3 mol, 0,17 wt, 0,22 wt, 2,0 eq.) por 10 minutos. A mistura de reação foi diluída com uma mistura de MTBE (1,72 l, 1,23 kg, 2,96 wt, 4,0 vol) e EtOAc (1,72 l, 1,55 kg, 3,60 wt, 4,0 vol) seguido por NH4Cl saturado (28% em peso de solução em água; 2,15 l, 5,0 vol). Sólidos começara a cair lentamente da solução. Permitiu-se que a mistura esquentasse até 24 °C e água (1,08 l, 1,08 kg, 2,5 wt, 2,5 vol) foi adicionada até (T interna = 22 °C). Mais sólidos começara a precipitar fora da mistura. Água adicional (1,08 l, 1,08 kg, 2,5 wt, 2,5 vol) e MTBE (1,40 l, 1,04 kg, 2,4 wt, 3,3 vol) foram adicionados na mistura. O sólido esbranquiçado foi coletado através de filtração a vácuo. O reator foi enxaguado com água (320 ml, 0,74 vol) e, então, MTBE (1,80 l, 1,33 kg, 3,10 wt, 4,19 vol) para transferir qualquer sólido restante até o filtro. O bolo filtrado foi enxaguado sequencialmente com: (1) água (1,80 l, 1,80 kg, 4,2 wt, 4,2 vol), (2) água (1,80 l, 1,80 kg, 4,2 wt, 4,2 vol), (3) uma mistura de MTBE (0,90 l, 0,67 kg, 1,5 wt, 2,1 vol) e n-heptano (0,90 l, 0,62 kg, 1,4 wt, 2,1 vol), (4) uma mistura de MTBE (0,90 l, 0,67 kg, 1,5 wt, 2,1 vol) e n-heptano (0,90 l, 0,62 kg, 1,4 wt, 2,1 vol). O sólido recuperado foi seco sob vácuo a 40 °C durante 2 dias para gerar o Composto (203) como sólido branco (483 g, 0,991 mol, 1,12 wt, 86% de rendimento). 1
[0164] H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ (ppm): 8,97 (s, 1H), 8,82 (s, 1H), 8,36 (s, 1H), 8,04 - 8,00 (m, 2H), 7,64 - 7,58 (m, 1H), 7,56 - 7,51 (m, 2H), 6,40 (dd, J = 2,3, 16,0 Hz, 1H), 5,45 (ddd, J = 2,7, 4,3, 53,1 Hz, 1H), 4,75 - 4,66 (m, 1H), 4,22 - 4,17 (m, 1H), 4,07 (dd, J = 2,3, 11,7 Hz, 1H), 3,91 (dd, J = 2,7, 11,7 Hz, 1H), 2,38 (dd, J = 2,7, 7,0 Hz, 1H), 0,92 (s, 9H), 0,11 (s, 3H), 0,11 (s, 3H). Estágio 2
[0165] Composto (202) (993 g, 1,47 mol, 1 wt, 1 vol, 1 eq.) e imidazol (150 g, 2,20 mol, 0,151 wt, 1,5 eq.) foram dissolvidos em DMF (3,48 l, 3,28 kg, 3,3 wt, 3,5 vol) e a mistura foi resfriada até 5 °C.
TBS-Cl (244 g, 1,62 mol, 0,245 wt, 1,10 eq.) foi adicionado.
A reação foi agitada em 0 a 5 °C por 2 h, deixada para aquecer lentamente até temperatura de meio ambiente e monitorada por LCMS.
Após 17 h, um imidazol adicional (100 g, 1,47 mol, 0,10 wt, 1,0 eq.) e TBS-Cl (111 g, 735 mmol, 0,112 wt, 0,50 eq.) foram adicionados e a agitação continuou em temperatura de meio ambiente por 2 h e a 35 °C por 2 h.
A mistura resultante foi resfriada até 13,6 °C e tratada com MeOH (119 ml, 2,94 mol, 2 eq.) por 10 minutos.
Em um reator separado foi adicionado gelo (5 kg, 5 wt) e NH4Cl saturado (28% em peso de solução em água; 5,0 l, 5 vol). A mistura de reação foi adicionada na mistura de gelo/NH4Cl.
Um sólido esbranquiçado começou a precipitar fora da solução imediatamente. 2 kg adicionais de gelo (2 kg, 2 wt) e água (3,0 l, 3 vol) foram adicionados na mistura.
O frasco de reação foi enxaguado com água (0,50 l, 0,5 vol) e o enxágue foi adicionado na mistura. n-Heptano (2,00 l, 2 vol) foi adicionado na mistura e a agitação continuou por 10 minutos.
O sólido esbranquiçado foi coletado através de filtração a vácuo.
O bolo filtrado foi enxaguado com: (1) água (4,0 l, 4,0 vol), (2) água (4,0 l, 4,0 vol), (3) n-heptano (4,0 l, 4,0 vol), (4) n- heptano (4,0 l, 4,0 vol). O sólido recuperado foi seco sob vácuo a 45 °C por 4 dias para gerar o Composto (204) como sólido esbranquiçado (1,095 kg, 1,39 mol, 1,10 wt, 94% de rendimento). 1
[0166] H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ (ppm): 9,09 (s, 1H), 8,78 (s, 1H), 8,28 (s, 1H), 8,02 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,63 - 7,59 (m, 1H), 7,55 - 7,50 (m, 2H), 7,37 (d, J = 7,1 Hz, 2H), 7,29 - 7,17 (m, 7H), 6,79 (d, J = 7,9 Hz, 4H), 6,29 (dd, J = 2,9, 16,2 Hz, 1H), 5,60 (ddd, J = 2,7, 3,9, 53,1 Hz, 1H), 4,78 (ddd, J = 4. 7, 6,4, 15,8 Hz, 1H), 4,26 - 4,22 (m, 1H), 3,77 (s, 6H), 3,58 (dd, J = 3,1, 10,9 Hz, 1H), 3,26 (dd, J = 3,7, 10,7 Hz, 1H), 0,85 (s, 9H), 0,10 (s, 3H), 0,02 (s, 3H). Estágio 3
[0167] Composto (204) (1.000 g, 1,27 mol, 1 wt, 1 vol, 1 eq.) e trans-2-buteno-1,4-diol (geometria de olefina confirmada por RMN de 1H; 335 g, 3,80 mol, 0,335 wt, 3,0 eq.) foram azeotropados duas vezes com THF (3,0 l, 3,0 vol). O resíduo foi dissolvido em uma mistura de THF (10 l, 10 vol) e tolueno (15 l, 15 vol). Trifenilfosfino (432 g, 1,65 mol, 0,432 wt, 1,3 eq.) foi adicionado e, então, a mistura de reação foi resfriada até -5 °C. DIAD (0,320 l, 1,65 mol, 333 g, 0,333 wt, 0,320 vol, 1,3 eq.) foi adicionada lentamente durante 20 minutos enquanto se mantém T interna abaixo de 5 °C. A reação foi agitada em 0 a 5 °C por 1 h e monitorada por LCMS. O banho de gelo foi removido e a mistura foi deixada para aquecer até rt. Após agitação de um dia para o outro (17 h), trifenilfosfino (83 g, 0,32 mol, 0,083 wt, 0,25 eq) e DIAD (62 ml, 0,32 mol, 64 g, 0,064 wt, 0,062 vol, 0,25 eq.) foram adicionados. Após mais 1 h a rt,
a mistura de reação foi diluída com MTBE (10 l, 10 vol), lavada duas vezes com NaCl meio saturado (18% em peso de solução em água; 2 x 4 l) e concentrada em vácuo até um óleo espesso. A mistura foi redissolvida em uma mistura de MTBE (4,00 l, 4 vol) e n-heptano (0,50 l, 0,5 vol) e, então, resfriada até 0 °C. Um cristal semente de óxido de trifenilfosfino foi adicionado na solução. Sólidos começaram lentamente a precipitar fora da solução e foram agitados de um dia para o outro. O sólido branco foi coletado através de filtração a vácuo e enxaguado com MTBE (2 l, 2 vol) para isolar 540 g de óxido de trifenilfosfino. O filtrado foi concentrado e purificado por meio de Biotage 150 l KP-Sil (SiO2 5 kg; pré-tratado com 1% de TEA em heptano/ EtOAc; eluentes: n-heptano/EtOAc (48 l de 33% de EtOAc com 1% de TEA, 24 l de 50% de EtOAc com 1% de TEA, 24 l de 66% de EtOAc com 1% de TEA) → 100% de EtOAc com 1% de TEA). A coluna foi monitorada através de TLC (2:1 de EtOAc/n-heptano). As frações de produto limpo foram combinadas e concentradas sob vácuo para gerar o Composto (205) como sólido de espuma branca pálido (634 g, conteve 14% em peso de coproduto derivado de DIAD, 545 g líquidos, 0,63 mol, 50% de rendimento ajustado). As frações de mistura foram combinadas e concentradas sob vácuo para gerar o sólido de espuma amarela pálido (750 g), que foi submetido à repurificação por meio de Biotage 150 M HP-Sphere (2,5 kg de SiO2; pré-tratado com 1% de TEA em n-heptano/EtOAc; amostra carregada com eluentes de tolueno: n-heptano/EtOAc/1% de TEA (12 l de 50% de EtOAc com 1% de TEA, 16 l de 66% de EtOAc com 1% de TEA) → EtOAc com 1% de TEA). A coluna foi monitorada através de TLC (2/1/0,03 de EtOAc/n-heptano/ TEA). As frações de produto limpo foram combinadas e concentradas sob vácuo para gerar o Composto adicional (205) como sólido de espuma branca pálido (206 g, 0,24 mol, 18% de rendimento). 1
[0168] H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ (ppm): 8,58 (s, 1H), 8,10 (s, 1H), 7,43 - 7,37 (m, 2H), 7,32 - 7,28 (m, 2H), 7,24 - 7,15 (m, 8H), 7,03 - 6,98 (m, 2H), 6,78 - 6,73 (m, 4H), 6,18 (dd, J = 2,7, 17,2 Hz, 1H), 5,88 (td, J = 5,5, 15,6 Hz, 1H), 5,77 (td, J = 5,1, 15,6 Hz, 1H), 5,60 (ddd, J = 2,7, 4,3,
53,1 Hz, 1H), 5,03 - 4,96 (m, 2H), 4,91 (ddd, J = 4,5, 6,6, 16,6 Hz, 1H), 4,18 - 4,14 (m, 1H), 3,88 - 3,82 (m, 2H), 3,78 (s, 6H), 3,52 (dd, J = 2,7, 10,9 Hz, 1H), 3,14 (dd, J = 3,5, 10,9 Hz, 1H), 0,85 (s, 9H), 0,10 (s, 3H), 0,01 (s, 3H). Estágio 4
[0169] Composto (205) (800 g, 0,930 mol, 1 wt, 1 vol, 1 eq.) e Composto (203) (522 g, 1,07 mol, 0,652 wt, 1,15 eq.) foram azeotropicamente secos com THF (2 x 3 l, 2 x 3,8 vol) e redissolvidos em THF (9,60 l, 8,45 kg, 12,0 vol) em rt. Trifenilfosfino (317 g, 1,21 mol, 0,396 wt, 1,30 eq.) foi adicionado e a mistura foi resfriada abaixo de -5 °C. DIAD (226 ml, 1,16 mol, 235 g, 0,294 wt, 0,283 vol, 1,25 eq.) foi adicionado T interna abaixo de 7 °C. Permitiu-se que a reação esquentasse até rt lentamente. A reação foi monitorada através de LCMS. Após 21 h, a mistura de reação foi concentrada em vácuo até um óleo espesso, azeotropada com n-heptano (2,00, 1,37 kg, 1,71 wt, 2,50 vol) e, então, redissolvida em uma mistura de MTBE (2,40 l, 1,78 kg, 2,2 wt, 3,0 vol) e n-heptano (800 ml, 547 g, 0,68 wt, 1,0 vol). A solução foi semeada com óxido de trifenilfosfino e resfriada até 5 °C, diluída com n- heptano (400 ml, 274 g, 0,34 wt, 0,50 vol) e agitada a 5 °C por 30 minutos. O precipitado de sólido branco foi coletado através de filtração a vácuo e enxaguado com mistura de 2:1 (v/v) de MTBE e n-heptano (1,8 l) para gerar óxido de trifenilfosfino (455 g). O filtrado foi concentrado sob vácuo e purificado por meio de Biotage 150L KP-Sil (5 kg de SiO2; pré-tratado com 1% de TEA; amostra carregada dissolvendo-se em eluentes de tolueno: 9:1 de n- heptano/EtOAc (16 l) e 15 TEA, 3,6:1 (46 l), 2:1 (20 l) e 1% de TEA, 1:1 (30 l) e 1% de TEA, e 100% de EtOAc (16 l) e 1% de TEA). As frações de produto limpo combinadas foram concentradas sob vácuo para gerar o Composto (206) como espuma de sólido esbranquiçado (662,2 g). As frações de mistura foram combinadas e concentradas sob vácuo (480 g). Um sólido insolúvel branco formado através da diluição com tolueno (300 ml) antes do carregamento em Biotage 150 L ser removido através de filtração a vácuo. O material solúvel em tolueno foi purificado por meio de Biotage 150 M HP-Sphere (2,5 kg de SiO2 (pré-tratados com 1% de TEA); carregamento de amostra com tolueno; eluentes: 2:1 de n-heptano/ EtOAc (26 l) em p/1% de TEA, 1:1 (25 l) em p/1% de TEA, 1:4 (34 l) em p/1% de TEA). A coluna foi monitorada através de TLC (1:1 de n-heptano/EtOAc). As frações de produto limpo combinadas foram concentradas sob vácuo para gerar o Composto adicional (206) como espuma de sólido esbranquiçado (165,5 g Total 662,2 + 165,5 g = 827,7 g, 930 mmol, 1,03 wt, 67% de rendimento). 1
[0170] H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ (ppm): 8,47 (s, 1H), 8,39 (s, 1H), 8,20 (s, 1H), 8,01 (s, 1H), 7,38 - 7,31 (m, 5H), 7,27 - 7,19 (m, 6H), 7,14 - 7,06 (m, 3H), 6,93 - 6,87 (m, 2H), 6,76 (d, J = 8,6 Hz, 4H), 6,26 (dd, J = 2,0, 16,0 Hz, 1H), 6,15 (dd, J = 2,7, 17,2 Hz, 1H), 5,86 (dd, J = 4,7, 15,2 Hz, 1H), 5,80 (dd, J = 4,7, 15,2 Hz, 1H), 5,51 (ddd, J = 2,7, 4,3, 52,8 Hz, 1H), 5,31 (ddd, J = 2,0, 4,3, 52,8 Hz, 1H), 4,87 (d, J = 4,7 Hz, 2H), 4,85 - 4,81 (m, 1H), 4,79 (d, J = 4,3 Hz, 2H), 4,71 - 4,59 (m, 1H), 4,20 - 4,13 (m, 2H), 4,06 (dd, J = 2,7, 11,3 Hz, 1H), 3,90 (dd, J = 2,7, 11,7 Hz, 1H), 3,77 (s, 6H), 3,52 (dd, J = 3,1, 10,9 Hz, 1H), 3,18 (dd, J = 3,9, 10,9 Hz, 1H), 0,92 (s, 9H), 0,84 (s, 9H), 0,10 (s, 3H), 0,09 (s, 6H), 0,07 (s, 3H). Estágio 5 e 6
[0171] A uma solução de Composto (206) (410,7 g, 309 mmol, 1 wt, 1 vol, 1 eq.) em piridina (1,23 l, 1,21 kg, 15,2 mol, 2,9 wt, 3,0 vol, 49 eq.) foi adicionado fosfito de difenila (90 ml, 109 g, 0,46 mol, 0,26 wt, 0,22 vol, 1,5 eq.). A reação foi agitada a rt e foi monitorada através de LCMS.
Após 2 h (80% de conversão) um fosfito de difenila adicional (29,9 ml, 36,2 g, 155 mmol, 0,088 wt, 0,073 vol, 0,50 eq.) foi adicionado.
Após mais 1 h adicional um fosfito de difenila extra (6,0 ml, 7,2 g, 31 mmol, 0,018 wt, 0,015 vol, 0,10 eq.) foi adicionado e a reação continuou por mais 0,5 h (98% de conversão). A mistura de reação foi adicionada a uma mistura de NaHCO3 saturado (9% em peso de solução em água; 2,1 l, 5 vol) e água (1,0 ml, 2,5 vol) enquanto se mantém T interna de 4,7 a 12 °C.
O reator foi enxaguado com um pequeno volume de
EtOAc. Agitação continuou em rt por 30 minutos e se monitorou a reação através de LCMS (100% de conversão). A mistura de reação foi extraída duas vezes com mistura de 1:1 de EtOAc e MTBE (2 x 8,2 l, 2 x 20 vol). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (4,1 l, 10 vol), concentradas em vácuo e azetropadas com tolueno (3 x 4,1 l, 3 x 10 vol; alimentação contínua) para remoção de piridina para gerar o Composto (207) (0,55 eq. de piridina permaneceu). Estágio 6
[0172] O Composto bruto (207) foi dissolvido em diclorometano (3,08 l, 4,07 kg, 9,9 wt, 7,5 vol) em temperatura de meio ambiente. Água (55,7 ml, 0,136 vol, 10 eq.) foi adicionada seguida por uma solução de ácido dicloroacético (77 ml, 120 g, 0,93 mol, 0,29 wt, 0,19 vol, 3,0 eq.) em DCM (3,08 l, 7,5 vol) enquanto se mantém a T interna abaixo de 25 °C. (Se transformou em uma solução laranja). Após 30 min, trietilsilano (Et3SiH; 494 ml, 359 g, 3,09 mol, 0,875 wt, 1,20 vol, 10,0 eq.) (T interna foi de 18,2 °C para 17 °C) foi adicionado e a agitação continuou por 20 min. Trietilamina (431 ml, 313 g, 3,09 mol, 0,762 wt, 1,05 vol, 10,0 eq.) foi adicionada (T interna foi de 17,8 °C para 22 °C). A mistura foi concentrada até 1,55 kg (3,8 wt), redissolvida em EtOAc (6,2 l, 5,5 kg, 14 wt, 15 vol), sequencialmente lavada com: (1) água (1,0 l, 2,5 vol) e NaHCO3 saturado (9% em peso de solução em água, 0,82 l, 2,0 vol). A solução de EtOAc de produto bruto foi armazenada em -20 °C de um dia para o outro; (0,82 l, 2,0 vol) no dia seguinte a solução foi concentrada em vácuo a 25 °C. A mistura bruta assim obtida (654 g) foi triturada com: (1) n-heptano (3,01 l, 7,5 vol), (2) uma mistura de n-heptano (2,46 l, 6,0 vol) e tolueno (0,82 l, 2,0 vol). A parte de solução (sobrenadante) foi decantada e o sólido que permaneceu no fundo foi dissolvido em acetonitrila (4,1 l, 10 vol). A mistura foi concentrada em vácuo a 25 °C e azeotropada com acetonitrila duas vezes para gerar o Composto (208). O produto foi usado para o estágio sem purificação subsequente (100% de rendimento teórico assumido). Estágio 7
Estágio 7a
[0173] Composto (208) (337 g, 309 mmol, 1 wt, 1 vol, 1 eq.) foi dissolvido em piridina anidra (13,5 l, 13,2 kg, 39 wt, 40 vol) em rt. Trietilamina (129 ml, 927 mmol, 94 g, 0,28 wt, 0,38 vol, 3,0 eq.) foi adicionada seguida por 2-óxido de 2-cloro-5,5-dimetil-1,3,2-dioxafosfinano (DMOCP; 103 g, 556 mmol, 0,31 wt, 1,80 eq.). A mistura resultante foi agitada em temperatura de meio ambiente por 30 minutos e monitorada através de LCMS (100% de conversão) para gerar o Composto (209). Estágio 7b
[0174] TEA (129 ml, 927 mmol, 94 g, 0,28 wt, 0,38 vol, 3,0 eq.), água (100 ml, 5,56 mol, 0,30 wt, 0,30 wt, 18 eq) e enxofre (34,7 g, 1,08 mol,
0,10 wt, 3,5 eq) foram adicionados na mistura acima de Composto (209). Após 90 minutos (100% de conversão), NaHCO3 (9% em peso de solução em água; 3,37 l, 10 vol) foi adicionado enquanto se mantém T interna abaixo de 30 °C (16,6 °C a 27 °C). A mistura resultante foi filtrada para remoção de sais. O filtrado foi concentrado, a mistura em vácuo, diluída com MTBE (5,1 l, 15 vol), e lavada duas vezes com NaCl (30% em peso de solução em água; 2 x 1,35 l, 2 x 4 vol). Sólidos insolúveis foram filtrados e o filtrado foi concentrado em vácuo e azeotropado com tolueno (4,0 l, 12 vol). O sólido resultante foi removido através de filtração e a mistura bruta foi dissolvida em tolueno e purificado por meio de Biotage 150 L KP-Sil (5 kg de SiO2; pré-tratado com n- heptano/EtOAc/TEA (1,5/1,5/0,03 CV); eluído com: EtOAc/TEA (3/0,03 CV), EtOAc/MeOH/TEA (4/0,2/0,04 CV), EtOAC/MeOH/TEA (2/0,2/0,02CV). A coluna foi monitorada através de TLC (EtOAC/MeOH/TEA=9/1/0,1). Frações que contêm o isômero Sp foram combinadas e concentradas sob vácuo para gerar o Composto (210) como sólido de espuma rosa claro (isômero Sp; 154 g, 128 mmol, 0,46 wt, 41,3% de rendimento). Frações que contêm o isômero Rp foram combinadas e concentradas sob vácuo para gerar o Composto (212) como sólido de espuma rosa claro (isômero Rp; 64 g, 53 mmol, 0,19 wt, 17% de rendimento). Composto (210) (isômero Sp): 1
[0175] H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ (ppm): 8,51 (s, 1H), 8,50 (s, 1H), 8,22 (s, 1H), 8,14 (s, 1H), 7,49 - 7,44 (m, 2H), 7,38 - 7,27 (m, 4H), 7,25 - 7,21 (m, 2H), 7,14 (t, J = 7,1 Hz, 2H), 6,44 (dd, J = 2,5, 13,9 Hz, 1H), 6,18 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 5,78 (td, J = 6,3, 15,6 Hz, 1H), 5,69 (td, J = 4,7, 15,6 Hz, 1H), 5,56 (dd, J = 3,9, 50,8 Hz, 1H), 5,20 - 5,06 (m, 1H), 4,95 - 4,79 (m, 4H), 4,69 (dd, J = 4,3, 16,0 Hz, 1H), 4,54 - 4,38 (m, 3H), 4,35 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 4,32 - 4,29 (m, 1H), 4,05 (dd, J = 1,6, 11,7 Hz, 1H), 3,91 (dd, J = 3,1, 11,7 Hz, 1H), 3,14 - 3,06 (m, 6H), 1,30 (t, J = 7,4 Hz, 9H), 0,91 (s, 9H), 0,90 (s, 9H), 0,12 (s, 3H), 0,08 (s, 3H), 0,06 (s, 3H), 0,05 (s, 3H) Composto (212) (isômero Rp):
[0176] H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ(ppm): 8,54 (s, 1H), 8,38 (s, 1H), 8,33 (s, 1H), 8,01 (s, 1H), 7,39 - 7,09 (m, 10H), 6,39 (dd, J = 2,3, 14,1 Hz, 1H), 6,13 (d, J = 17,2 Hz, 1H), 5,72 (d, J = 3,1 Hz, 2H), 5,68 (dd, J = 4,3, 51,2 Hz, 1H), 5,43 - 5,29 (m, 1H), 5,10 - 4,96 (m, 3H), 4,90 - 4,83 (m, 2H), 4,78 - 4,72 (m, 1H), 4,52 (ddd, J = 3,9, 6,6, 17,2 Hz, 1H), 4,44 - 4,35 (m, 2H), 4,31 - 4,26 (m, 1H), 4,20 - 4,12 (m, 2H), 3,87 (dd, J = 3,5, 11,7 Hz, 1H), 3,79 - 3,77 (m, 1H), 3,15 - 3,09 (m, 6H), 1,33 (t, J = 7,4 Hz, 9H), 0,94 (s, 9H), 0,89 (s, 9H), 0,13 (s, 3H), 0,12 (s, 3H), 0,10 (s, 3H), 0,09 (s, 3H). Estágio 8
[0177] Composto (210) (221 g, 183 mmol, 1 wt, 1 vol, 1 eq) foi dissolvido em uma mistura de piridina (530 ml, 6,56 mol, 519 g, 2,3 wt, 2,4 vol) e TEA (2,65 l, 19,0 mol, 1,93 kg, 8,7 wt, 12 vol, 104 eq.). Tri-hidrofluoreto de trietilamina (264 ml, 1,62 mol, 262 g, 1,2 wt, 1,2 vol, 8,9 eq. como complexo, 27 eq. de HF) foi adicionado e a mistura foi agitada em rt enquanto a conversão foi monitorada através de LCMS. Após 3 h (97% de conversão), metoxitrimetilsilano (TMSOMe; 1,40 l, 10,2 mol, 1,06 kg, 4,8 wt, 6,3 vol, 55 eq.) foi adicionado e a agitação continuou por 30 minutos. Um sólido pegajoso revestiu o reator. A parte de solução (sobrenadante) foi decantada. O sólido foi triturado duas vezes com tolueno (2 x 2,2 l, 2 x 10 vol; sobrenadante decantado). O sólido bruto que permaneceu no reator foi dissolvido em diclorometano (2,2 l, 10 vol) e lavado com NH4Cl (28% em peso de solução em água; 2,2 l, 10 vol). A camada aquosa foi extraída novamente com diclorometano (2,2 l, 10 vol). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com uma mistura de NaCl (36% em peso de solução em água; 1,1 l, 5 vol) e água (1,1 l, 5 vol) e, então, concentradas sob vácuo para gerar o Composto (211) como espuma seca bronze (152 g, 155 mmol, 0,70 wt, 85% de rendimento). O produto bruto foi levado para a próxima etapa sem purificação. Estágio 9
[0178] Composto (211) (150 g, 153 mmol, 1 wt, 1 vol, 1 eq.) foi azeotropado com acetonitrila (4 l, 27 vol) e, então, redissolvido em acetonitrila (1,05 l, 0,83 kg, 5,5 wt, 7,0 vol) em rt. Brometo de 2-nitrobenzila (44,4 g, 205 mmol, 0,30 wt, 1,34 eq) foi adicionado em rt e a reação foi monitorada através de LCMS. Após 23 h (100% de conversão), EtOAc (1,50 l, 10 vol), NH 4Cl (28% em peso de solução em água; 300 ml, 2 vol) e água (300 ml, 2 vol) foram adicionados (pH = 6) e a mistura resultante foi parcialmente concentrada sob vácuo a 25 °C até um peso de 1,11 kg. EtOAc (2,25 l, 15 vol) foi adicionado e a mistura foi agitada por 5 minutos. As duas camadas foram separadas. A camada aquosa foi extraída com acetato de etila (750 ml, 5 vol). As camadas orgânicas combinadas foram sequencialmente lavadas com: (1) uma mistura de NaCl (36% em peso de solução em água; 300 ml, 2 vol) e água (300 ml, 2 vol) e (2) água (600 ml, 4 vol). A camada orgânica foi, então, concentrada sob vácuo e azeotropada com n-heptano (1,50 l, 10 vol). MTBE (0,95 l, 6,3 vol) foi adicionado ao sólido bruto e a mistura foi aquecida a 40 °C. A mistura foi diluída com EtOAc (300 ml, 2 vol) e lentamente resfriada até 0 °C. Permitiu-se que o sólido denso assentasse e o sobrenadante foi bombeado para fora através de um tubo de frita de filtro. O sólido foi enxaguado duas vezes com MTBE (2 x 300 ml, 2 x 2 vol; sobrenadante bombeado para fora através do tubo de frita de filtro toda vez) e seco sob vácuo a 40 °C de um dia para o outro para gerar o Composto (212) como sólido amarelo pálido (156 g). O filtrado foi concentrado sob vácuo, o que rende um óleo marrom (17,8 g), que foi submetido à purificação por meio de Biotage Snap-Ultra 340 g (eluentes: 0 a 5% de MeOH em EtOAc) para gerar o Composto adicional (212) como sólido amarelo pálido (5,8 g). Total 156 g + 5,8 g = 161,8 g (152 mmol líquidos, 95% puro, 99% de rendimento) 1
[0179] H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ (ppm); 8,46 (s, 1H), 8,15 (s, 1H), 8,10 (s, 1H), 8,09 - 8,06 (m, 1H), 7,89 (s, 1H), 7,54 - 7,51 (m, 1H), 7,49 - 7,45 (m, 4H), 7,37 - 7,28 (m, 3H), 7,24 - 7,19 (m, 3H), 7,16 - 7,11 (m, 2H), 6,22 (d, J = 16,8 Hz, 1H), 6,14 (dd, J = 2,7, 17,2 Hz, 1H), 5,83 - 5,61 (m, 3H), 5,60 - 5,48 (m, 1H), 5,07 (dd, J = 3,5, 51,6 Hz, 1H), 5,06 - 4,96 (m, 1H), 4,79 (dd, J = 4,9, 15,8 Hz, 1H), 4,69 (d, J = 5,9 Hz, 2H), 4,67 - 4,56 (m, 1H), 4,48 - 4,40 (m, 3H), 4,37 - 4,30 (m, 1H), 4,27 (d, J = 5,9 Hz, 2H), 4,19 - 4,13 (m, 1H), 3,93 - 3,85 (m, 1H), 3,85 - 3,78 (m, 1H) Estágio 10 e 11
Estágio 10
[0180] Composto (212) (95% puro, 73,2 g líquidos, 72,3 mmol, 1 wt, 1 vol, 1 eq.) e N,N,N',N'-tetraisopropilfosforodiamidita de 2-cianoetila (25,3 ml, 79,5 mmol, 0,33 wt, 0,35 vol, 1,10 eq.) foram azeotropados com acetonitrila anidra três vezes (3 x 2 l), redissolvidos em diclorometano (0,73 l, 10 vol) e resfriados até 0 a 5 °C. Tetrazolida de di-isopropilamônia (6,19 g, 36,1 mmol, 0,085 wt, 0,50 eq.) foi adicionada. A mistura resultante de reação foi agitada a
0 °C por 10 h, aquecida até 10 °C durante 2 h, mantida a 10 °C por 10 h e aquecida até rt durante 2 h. A reação foi monitorada através de LCMS e TLC (EtOAc com 0,5% de TEA). Após 18 h, acetonitrila anidra (0,73 l, 10 vol) foi adicionada e a mistura foi armazenada a -20 °C sobre 3 dias. Estágio 11a
[0181] A mistura do Estágio 10 foi aquecida até temperatura de meio ambiente e adicionada por meio de um funil com torneira em porções (100 ml a cada 30 minutos, durante 9 h) em uma mistura de sal de trifluoroacetato de piridina (azetropada antecipadamente com piridina duas vezes; 41,9 g, 217 mmol, 0,57 wt, 3,0 eq.) e acetonitrila (5,85 l, 80 vol). A reação foi monitorada através de LCMS. Após 13 h, uma solução de N,N,N',N'- tetraisopropilfosforodiamidita de 2-cianoetila (5,8 ml, 18 mmol, 0,25 eq.) em acetonitrila (24 ml) foi adicionada durante 4 h. A quantidade do reagente adicional foi determinada com base no Composto restante (212) (~30% com base em LCMS). Mais conversão do diol foi observada após 6 h. Estágio 11b
[0182] ((Dimetilaminometilideno)amino)-3H-1,2,4-ditiazolina-3- tiona (DDTT; 20,8 g, 101 mmol, 0,28 wt, 1,4 eq.) foi adicionada e agitação continuou por 1 h. A mistura de reação foi parcialmente concentrada até ~800 ml e diluída com MTBE (1,46 l, 20 vol), NaHCO3 (9% em peso de solução em água; 1,1 l, 15 vol) e água (0,37 l, 5 vol). pH = 8. As camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída com uma mistura de MTBE (1,46 l, 20 vol) e EtOAc (1,10 l, 15 vol). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas duas vezes com NaCl 30% aquoso (2 x 0,73 l, 2 x 10 vol), concentradas sob vácuo a 35 °C e azeotropadas com tolueno (1,46 l, 20 vol). LCMS e TLC (EtOAc) indicaram o Composto (215) (SpRp, desejado): Composto (217) (SpSp) = 5: 1
[0183] O produto bruto foi purificado por meio de Biotage 150 M KP-Sil, (2,5 kg de SiO2; eluentes: EtOAc/n-heptano: 2:1 (4 CV), 3:1 (2,5 CV), 4:1 (2,5 CV), 100% EA (3 CV), 5 a 10% de MeOH em EA 4 CV) para gerar o Composto (215) (36 g, 31,5 mmol, 44% de rendimento).
Composto (215) (SpRp): 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ(ppm): 8,59 (s, 1H), 8,10 (s, 1H), 8,03 - 7,99 (m, 1H), 7,91 (s, 1H), 7,56 - 7,53 (m, 2H), 7,49 - 7,40 (m, 5H), 7,35 - 7,28 (m, 2H), 7,24 - 7,16 (m, 4H), 6,92 (s, 1H), 6,29 (d, J = 14,9 Hz, 1H), 6,08 (d, J = 20,7 Hz, 1H), 5,97 - 5,83 (m, 1H), 5,76 (td, J = 4,7, 15,6 Hz, 1H), 5,61 - 5,51 (m, 2H), 5,40 (d, J = 4,3 Hz, 1H), 5,29 - 5,17 (m, 1H), 4,91 (dd, J = 7,4, 14,9 Hz, 1H), 4,86 - 4,75 (m, 3H), 4,63 (dd, J = 3,7, 9,2 Hz, 1H), 4,58 - 4,43 (m, 5H), 4,34 - 4,19 (m, 4H), 2,79 (td, J = 5,9, 16,8 Hz, 1H), 2,66 (td, J = 6,3, 16,8 Hz, 1H). 1
[0184] Composto (217) (SpSp) H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ (ppm): 8,11 (s, 1H), 8,03 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,94 (s, 1H), 7,90 (s, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,56 - 7,40 (m, 7H), 7,33 - 7,28 (m, 2H), 7,23 - 7,17 (m, 4H), 6,22 (d, J = 17,6 Hz, 1H), 6,15 (d, J = 18,8 Hz, 1H), 5,85 (dd, J = 3,5, 51,2 Hz, 1H), 5,75 - 5,45 (m, 5H), 4,95 - 4,23 (m, 14H), 2,82 (t, J = 6,1 Hz, 2H). Estágio 12
[0185] Composto (215) (71,6 g, 62,6 mmol, 1 wt, 1 vol, 1 eq.) foi dissolvido em 1,4-dioxano (0,43 l, 6 vol). Tiofenol (215 ml, 2,09 mol, 230 g, 3,2 wt, 3 vol, >30 eq.) foi adicionado seguido por trietilamina (215 ml, 1,54 mol, 156 g, 2,2 wt, 3 vol). Alguma exotermia foi observada (T interna aumentou em ~7 °C), portanto, o banho de água/gelo foi usado para resfriar e controlar T interna abaixo de 27 °C.
A reação foi monitorada através de LCMS.
Após 2 h, MeOH (0,57 l, 8 vol) e NH4OH (28% em peso; 15 mol, 0,57 l, 8 vol, >200 eq.) foram adicionados.
A mistura resultante foi aquecida a 50 °C por 5 h, resfriada até rt e agitada de um dia para o outro.
Após 14 h, a água (0,72 l, 10 vol) foi adicionada (nenhum sólido observado) e a mistura foi extraída três vezes com mistura de 1:1 (v/v) de n-heptano e tolueno (3 x 0,86 l, 3 x 12 vol), seguida por tolueno (0,57 l, 8 vol). A camada aquosa foi concentrada em vácuo em 40 a 50 °C e diluída com água (1,07 l, 15 vol). A pasta fluida resultante foi mantida de um dia para o outro em rt.
O sólido resultante foi filtrado, com enxágue com água (0,36 l, 5 vol). O filtrado ainda estava turvo e filtrado através de celite e um filtro Kuno.
Turvação ainda estava presente.
HCl (1,0 M de solução em água; 132 ml, 132 mmol, 2,1 eq.) foi adicionado durante 1 h e o pH foi verificado (pH <2). Agitação continuou em rt por 1 h e a mistura foi filtrada.
O bolo filtrado foi enxaguado com água (8 x 0,20 l), seco em um forno a vácuo a 35 °C por 2 dias e sem aquecimento por 1 dia para gerar o Composto (I) como sólido laranja pálido (44,88 g, 60,1 mmol, 0,63 wt, 96% de rendimento). Estágio 13
[0186] Ao Composto isento de ácido (I) (22,42 g, 30,03 mmol, 1 wt, 1 vol, 1 eq.) foi adicionado amônia (2,0 M de solução em MeOH; 220 ml, 440 mmol, 10 vol, 15 eq.). EtOH (55 ml, 2,5 vol) foi adicionado e a solução resultante foi filtrada através de um filtro Kuno (0,45 mícron; PTFE), com enxágue com mistura de 1:1 (v/v) de MeOH e EtOH (90 ml, 4 vol). O filtrado foi concentrado em vácuo a 30 °C, o que rende um sólido esbranquiçado, que foi seco em rt de um dia para o outro, moído com uma espátula (fácil de quebrar) e seco, adicionalmente, em vácuo em rt. O sólido isolado foi, então, suspenso em tolueno (250 ml) e agitado em rt por 30 minutos. O sólido foi, então, coletado através de filtração a vácuo e enxaguado com tolueno duas vezes (2 x 50 ml). O sólido foi, então, seco sob vácuo em um forno a vácuo para gerar 22,4 g de Composto (1a) (sal de diamônia de Composto (I)). Recristalização:
[0187] Composto (1a) (sal de diamônia de Composto (I)) (22,14 g, 28,36 mmol, 1 wt, 1 vol, 1 eq.) foi dissolvido em uma mistura de água (664 ml,
30 vol) e hidróxido de amônia (28% em peso; 2,5 ml, 18 mmol, 0,63 eq.) (pH = 9 a 10) e extraído com tolueno três vezes (3 x 300 ml, 3 x 14 vol), EtOAc três vezes (3 x 200 ml, 3 x 9 vol) e tolueno três vezes (3 x 300 ml, 3 x 14 vol). A camada aquosa resultante foi tratada com HCl (1,0 M de solução em água; 90 ml, 90 mmol, 3,2 eq.) durante um período de 3,5 horas (pH 2 ou menos). A mistura foi agitada por 30 minutos e, então, o precipitado sólido foi coletado através de filtração a vácuo. O bolo filtrado foi lavado com água três vezes (3 x 200 ml, 3 x 9 vol) e seco em vácuo de um dia para o outro. Amônia (2,0 M de solução em MeOH; 250 ml, 500 mmol, 17,6 eq.) e etanol (100 ml) foram adicionados ao sólido e a mistura resultante foi concentrada em vácuo até que cristais apareceram (~100 ml), nesse tempo a concentração foi parada e a mistura foi agitada por 20 minutos. Etanol (45 ml) foi adicionado e a mistura foi parcialmente concentrada (45 ml removidos). A mesma operação foi repetida duas vezes mais e, então, a mistura foi resfriada até 0 °C e agitada por 3,5 h. O sólido branco foi coletado através de filtração a vácuo e lavado com etanol frio (20 ml) seguido por acetato de etila (2 x 50 ml). O sólido branco foi seco sob vácuo em rt por 3 dias para gerar o Composto (1a) (sal de diamônia de Composto (I)) como sólido branco (16,6 g, 21,3 mmol, 0,75 wt, 75% de rendimento). O filtrado foi concentrado sob vácuo e seco sob vácuo em rt por 3 dias para gerar o Composto (1a) (sal de diamônia de Composto (I)) como sólido esbranquiçado (4,16 g, 5,3 mmol, 18% de rendimento).
[0188] Exemplo de Análise 1.2 - Análise de RMN de 1H do sal de amônia de Composto (I)
[0189] Um espectrográfico de RMN de 1H do sal de amônia de Composto (I) é mostrado na Figura 1. O espectro resultante foi: 1
[0190] H-RMN Espectro (400MHz, DMSO-d6, δH 2,49 ppm, 80°C)
[0191] δ(ppm): 8,59 (1H, s l), 8,36 (1H, s l), 8,14 (1H, s), 8,13 (1H, s), 6,29 (1H, m), 6,26 (1H, m), 5,78 (1H, m), 5,76 (2H, s), 5,22 (1H, m), 4,53 - 4,68 (2H, m), 4,38 (1H, m), 4,28 (1H, m), 4,21 - 4,24 (2H, m), 3,78 (1H, dd, J=12, 4Hz), 3,70 (1H, dd, J=13, 5 Hz), 3,05 - 3,13 (4H, m). [0074]
[0192] Exemplo de Análise 1.3 - Análise de Raio-X do sal de amônia de Composto (I)
[0193] Cerca de 2 mg do sal de amônia de Composto (I) foram dissolvidos em 600 μl de água. 120 μl dessa solução foram colocados em outro frasco de vidro e, então, esse frasco foi armazenado em recipiente fixado com 3 ml de MeCN em temperatura ambiente por 1 semana. Esse é o método de difusão a vapor de H2O/MeCN da preparação de amostra.
[0194] [0075]Um único cristal de bloco incolor (0,1 × 0,1 × 0,1 mm) encontrado na solução de cristalização foi distribuído em Parabar 10312 líquido e foi montado em um Dual-Thickness MicroMountsTM (MiTeGen). Os dados de difração foram coletados a -160 °C em XtaLAB PRO P200 MM007HF (Rigaku) com ω método de oscilação de eixo geométrico com o uso de radiação Cu-Kα monocromada espelhada de múltiplas camadas.
[0195] [0076]A Figura 2A mostra uma figura ORTEP de um cristal de sal de amônia de Composto (I), em que duas moléculas estão presentes em uma unidade assimétrica, juntamente com um número de moléculas de água desordenadas. A Figura 2B mostra uma figura ORTEP de uma das duas moléculas na unidade assimétrica da Figura 2A. A Figura 2C mostra uma figura ORTEP da outra molécula na unidade assimétrica da Figura 2A.
[0196] [0077]A estrutura de cristal do sal de amônia de Composto (I) foi resolvida com um fator R final de 0,1354. O parâmetro Flack foi de quase zero (0,083(17)), o que indica que a configuração absoluta de sal de amônia de Composto (I) é (R, S). A análise de estrutura de cristal também indicou que diversas moléculas de água estiveram presentes no canal grande do sal de amônia de Composto (I), o que indicou que as moléculas de água tiveram capacidade para escapar facilmente do canal. A análise também confirmou que as conformações de ambas moléculas cristalograficamente independentes na unidade assimétrica foram quase iguais.
Tabela 3 Parâmetros adicionais da análise de raio-X são mostrados abaixo: Temperatura 113 K Comprimento de onda 1,54184 Å Sistema cristalino, grupo de espaço Monoclínico, P21 Parâmetro de rede a = 8,1584(3) Å b = 35,451(2) Å c = 15,9146(6) Å β = 91,313(3) ° Volume 4.601,7(4) Å 3 Valor Z, densidade calculada 4, 1,127 g/cm3 Tamanho de cristal 0,1 × 0,1 × 0,1 mm Número total de reflexos/número de 52006/17198 reflexos únicos [R(intensidade)=0,0876] Integralidade 92,2% Determinação de fase Métodos diretos (SHELXT Versão 2014/5) Método de refinamento Mínimos quadrados de matriz completa em F2 (SHELXL versão 2014/7) Dados/parâmetros 17198/1116 Indicador de qualidade do ajuste 1,545 Resíduos: R(I>2σ(I)) 0,1354 Resíduos: Rw 0,3886 Parâmetro de Flack 0,083(17) Diferença de pico máximo e mínimo 1,17 e –0,88 e-/ Å 3
[0197] Exemplo 1 Preparação de cristal (Forma 1) de sal de diamônia de (1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34R,36R,39S,41R)-29,41-difluoro-34,39-
bis(sulfanil)-2,33,35,38,40,42-hexaoxa-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-deca-aza- 34λ5,39λ5-difosfaoctaciclo[28.6.4,13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]dotetraconta- 5,7,9,11,15,19,21,23,25-nonaeno-34,39-diona (Composto (I))
[0198] A uma suspensão de Composto (I) (138,5 mg) em acetato de isopropila (2,769 ml) foi adicionada uma mistura de solução aquosa de 28% de amônia (62 μl), acetato de isopropila (0,693 ml) e 2-propanol (0,138 ml), e a pasta fluida resultante foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. Os precipitados foram cortados através de filtração, enxaguados com acetato de isopropila (0,8 ml) e o sólido obtido foi seco sob pressão reduzida em temperatura ambiente por 2 horas para gerar o cristal titulado (126,8 mg). O cristal titulado foi identificado como um hidrato.
[0199] Exemplo 1 e 2 Preparação de cristal (Forma 1) de sal de diamônia de (1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34R,36R,39S,41R)-29,41-difluoro-34,39- bis(sulfanil)-2,33,35,38,40,42-hexaoxa-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-deca-aza- 34λ5,39λ5-difosfaoctaciclo[28.6.4,13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]dotetraconta- 5,7,9,11,15,19,21,23,25-nonaeno-34,39-diona (Composto (I))
[0200] A uma suspensão de Composto (I) (900 mg) em acetato de isopropila (18,0 ml) foi adicionada uma mistura de solução aquosa de 28% de amônia (400 μl), acetato de isopropila (4,5 ml) e 2-propanol (0,90 ml), e a pasta fluida resultante foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. Os precipitados foram cortados através de filtração, enxaguados com acetato de isopropila (4,5 ml) e o sólido obtido foi seco sob pressão reduzida em temperatura ambiente por 5 horas e a umidade sucessivamente absorvida mantendo-se sob 50% de umidade relativa em temperatura ambiente de um dia para o outro para gerar o cristal titulado (942 mg). O cristal titulado foi identificado como um hidrato.
[0201] Exemplo 2 Preparação de cristal (Forma 2) de sal de diamônia de (1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34R,36R,39S,41R)-29,41-difluoro-34,39-
bis(sulfanil)-2,33,35,38,40,42-hexaoxa-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-deca-aza- 34λ5,39λ5-difosfaoctaciclo[28.6.4,13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]dotetraconta- 5,7,9,11,15,19,21,23,25-nonaeno-34,39-diona (Composto (I))
[0202] Ao Composto (I) (143,6 mg) foram adicionados solução aquosa de 28% de amônia (1,724 ml) e etanol (1,718 ml), e a solução resultante foi concentrada para baixo até cerca de 0,86 ml sob pressão reduzida em 40 °C. Ao resíduo foi adicionado etanol (1 ml), e a solução foi concentrada para baixo até cerca de 0,86 ml sob pressão reduzida em 40 °C. Ao resíduo foi adicionado etanol (1 ml), e a solução resultante foi concentrada para baixo até 0,89 g sob pressão reduzida em 40 °C. A solução de resíduo foi agitada em temperatura ambiente por 0,5 horas e os precipitados caíram da solução. Acetato de isopropila foi gradualmente adicionado à pasta fluida (1,2 ml) gota-a-gota por 10 minutos, e a pasta fluida resultante foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. Os precipitados foram cortados através de filtração e o sólido obtido foi seco sob pressão reduzida em temperatura ambiente por 3,3 horas para gerar o cristal titulado (144mg). O cristal titulado foi identificado como um hidrato.
[0203] Exemplo 3 Preparação de cristal (Forma 3) de sal de diamônia de (1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34R,36R,39S,41R)-29,41-difluoro-34,39- bis(sulfanil)-2,33,35,38,40,42-hexaoxa-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-deca-aza- 34λ5,39λ5-difosfaoctaciclo[28.6.4,13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]dotetraconta- 5,7,9,11,15,19,21,23,25-nonaeno-34,39-diona (Composto (I))
[0204] Aproximadamente 10 mg de cristal (Forma 1) de sal de diamônia de Composto (I) foram colocados em um dessecador dentro de uma incubadora a 25 °C, em que a condição de umidade foi controlada a 94% de RH com o uso de uma solução de nitrato de potássio saturada. A amostra sólida foi armazenada por 4 dias para gerar o cristal titulado (aproximadamente 10 mg). O cristal titulado foi identificado como um hidrato.
[0205] Exemplo 4
Preparação de cristal (Forma 4) de sal de diamônia de (1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34R,36R,39S,41R)-29,41-difluoro-34,39- bis(sulfanil)-2,33,35,38,40,42-hexaoxa-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-deca-aza- 34λ5,39λ5-difosfaoctaciclo[28.6.4,13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]dotetraconta- 5,7,9,11,15,19,21,23,25-nonaeno-34,39-diona (Composto (I))
[0206] A uma solução de Composto (I) (217,22 mg) em 2 mol/l de amônia em metanol (2,152 ml) foi adicionado etanol (0,869 ml), e a solução foi concentrada para baixo até cerca de 1,1 g sob pressão reduzida em 50 °C. O resíduo foi agitado em temperatura ambiente por 0,8 horas e os precipitados caíram da solução. Foi adicionado etanol (0,434 ml) na pasta fluida, e a mistura foi concentrada para baixo até cerca de 0,8 g sob pressão reduzida em 50 °C. Foi adicionado etanol (0,434 ml) no resíduo, e a mistura foi concentrada para baixo até cerca de 1,2 g sob pressão reduzida em 50 °C. Foi adicionado água (40 μl) na pasta fluida resultante, e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 1 hora e com resfriamento de gelo por 1,8 horas. Os precipitados foram cortados através de filtração, enxaguados sucessivamente com etanol (0,2 ml) e acetato de etila (0,2 ml), e o sólido obtido foi seco sob pressão reduzida em temperatura ambiente por 1 hora para gerar o cristal titulado (21,22 mg).
[0207] Exemplo 5 Preparação de cristal (Forma 5) de sal de diamônia de (1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34R,36R,39S,41R)-29,41-difluoro-34,39- bis(sulfanil)-2,33,35,38,40,42-hexaoxa-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-deca-aza- 34λ5,39λ5-difosfaoctaciclo[28.6.4,13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]dotetraconta- 5,7,9,11,15,19,21,23,25-nonaeno-34,39-diona (Composto (I))
[0208] A uma suspensão de Composto (I) (201,62 mg) em 2- propanol (5 ml) foi adicionada solução aquosa de 28% de amônia (36 μl), e a solução resultante foi agitada a 60 °C. Solução aquosa de 28% de amônia (108 μl) foi adicionada na solução e os precipitados caíra da solução. Após a temperatura ter sido espontaneamente diminuída até a temperatura ambiente,
os precipitados foram cortados através de filtração para gerar o cristal titulado (160 mg).
[0209] Exemplo 6 Preparação de cristal (Forma 6) de sal de monoamônia de (1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34R,36R,39S,41R)-29,41-difluoro-34,39- bis(sulfanil)-2,33,35,38,40,42-hexaoxa-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-deca-aza- 34λ5,39λ5-difosfaoctaciclo[28.6.4,13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]dotetraconta- 5,7,9,11,15,19,21,23,25-nonaeno-34,39-diona (Composto (I))
[0210] Ao sal de diamônia de Composto (I) obtido no Exemplo 5 (85,24 mg) foi adicionado etanol (4 ml), e a pasta fluida resultante foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. Então, os precipitados foram cortados através de filtração para gerar o cristal titulado (40,93 mg).
[0211] Exemplo 7 Preparação de cristal de sal de sódio de (1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34R,36R,39S,41R)-29,41-difluoro-34,39- bis(sulfanil)-2,33,35,38,40,42-hexaoxa-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-deca-aza- 34λ5,39λ5-difosfaoctaciclo[28.6.4,13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]dotetraconta- 5,7,9,11,15,19,21,23,25-nonaeno-34,39-diona
[0212] Ao Composto (I) (201,58 mg) foi adicionado metanol (5 ml), e a pasta fluida resultante foi agitada em temperatura ambiente. À pasta fluida foi adicionado 1 mol/l de solução de hidróxido de sódio aquosa (0,54 ml), e a solução resultante foi agitada a 60 °C por cerca de uma hora. Após a temperatura ter sido espontaneamente diminuída até temperatura ambiente, a solução foi concentrada para baixo sob fluxo de gás nitrogênio com agitação. Cristalização foi iniciada conforme o solvente foi gradualmente removido. O sólido obtido foi seco sob pressão reduzida em temperatura ambiente para gerar o cristal titulado (227 mg).
[0213] Exemplo 8 Preparação de cristal de (1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34R,36R,39S,41R)-29,41-difluoro-34,39-
bis(sulfanil)-2,33,35,38,40,42-hexaoxa-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-deca-aza- 34λ5,39λ5-difosfaoctaciclo[28.6.4,13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]dotetraconta- 5,7,9,11,15,19,21,23,25-nonaeno-34,39-diona
[0214] A uma solução de Composto (I) (500 mg) em uma mistura de etanol (2,5 ml), 2 mol/l de amônia em etanol (2,5 ml) e água (2,5 ml) foi adicionado ácido acético (0,572 ml) gota-a-gota, e a solução foi agitada em temperatura ambiente. À solução foi adicionado um cristal semente de composto (I) obtido de uma maneira similar ao seguinte Exemplo 8-2. Então, a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 10 minutos e os precipitados caíram da solução. À pasta fluida foi gradualmente adicionado ácido acético (1,144 ml) gota-a-gota por 45 minutos, e a pasta fluida resultante foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. Os precipitados foram cortados através de filtração, e enxaguados sucessivamente com etanol 67% aquoso frio (3,0 ml) e éter terc-butil-metílico (2,0 ml). O sólido obtido foi seco sob pressão reduzida em temperatura ambiente por 5 horas para gerar o cristal titulado (417 mg) em 83,4% de rendimento.
[0215] Exemplo 8 e 2 Preparação de cristal de (1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34R,36R,39S,41R)-29,41-difluoro-34,39- bis(sulfanil)-2,33,35,38,40,42-hexaoxa-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-deca-aza- 34λ5,39λ5-difosfaoctaciclo[28.6.4,13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]dotetraconta- 5,7,9,11,15,19,21,23,25-nonaeno-34,39-diona
[0216] Ao Composto (I) (497,5 mg) foram adicionados etanol (1,0 ml) e 2 mol/l de amônia em etanol (2,0 ml), e a mistura foi agitada em temperatura ambiente e dissolvida. A solução resultante foi filtrada através de um coxim de algodão e o coxim foi enxaguado com 2 mol/l de amônia em etanol (0,5 ml) e etanol (1,5 ml), e foi adicionada água (2,5 ml) à solução. À solução resultante adicionou-se gradualmente ácido acético (0,57 ml) gota-a- gota em temperatura ambiente por 30 minutos e os precipitados caíram da solução, e a pasta fluida foi agitada em temperatura ambiente por 37 minutos.
À pasta fluida foi gradualmente adicionado ácido acético (0,85 ml) gota-a-gota por 32 minutos, e a pasta fluida resultante foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. Os precipitados foram cortados através de filtração, e enxaguados sucessivamente com etanol 67% aquoso frio (4,0 ml) e água (4,0 ml). O sólido obtido foi seco sob pressão reduzida em temperatura ambiente de um dia para o outro e em 30 °C por 3 horas para gerar o cristal titulado (432,4 mg) em 86,9% de rendimento.
[0217] Exemplo 9 Termogravimetria e análise térmica diferencial (TG-DTA) para o cristal (Forma 1)
[0218] Aproximadamente 5 mg da amostra de cristal (Forma 1) foram precisamente ponderados em um tabuleiro de alumínio e, então, a análise foi realizada sob as seguintes condições. No termograma TG, a perda de peso devido à desidratação foi observada na faixa de temperatura ambiente até 130 °C.
[0219] Condições de medição
[0220] Atmosfera: fluxo de gás de nitrogênio de 100 ml/minuto
[0221] Tabuleiro de referência: tabuleiro de alumínio vazio
[0222] Taxa de aquecimento: 10 °C/minuto
[0223] Intervalo de amostragem: 1 segundo
[0224] Faixa de temperatura: temperatura ambiente até 300 °C
[0225] Exemplo 10 Difração de raio-X de pó em várias temperaturas
[0226] A amostra de cristal (Forma 1) foi colocada no estágio de amostra de um difratômetro de raio-X de pó e a análise foi realizada em temperatura ambiente e acima de 60 °C, em que a perda de peso significativa devido à desidratação foi observada no termograma TG-DTA do cristal (Forma 1). As condições de medição são como a seguir.
[0227] Condições de método de reflexo
[0228] Equipamento: RINT TTR-III (Rigaku)
[0229] Fonte de raio-X: CuKα (50 kV, 300 mA)
[0230] Detector: contador de cintilação
[0231] Modo: Reflexo
[0232] Fenda: 0,5 mm (fenda divergente), aberta (fenda de dispersão), aberta (fenda de recebimento de luz)
[0233] Taxa de varredura: 10°/minuto
[0234] Intervalo de amostragem: 0,02°
[0235] Faixa de varredura: 5° a 35°
[0236] Retentor de amostra: retentor de alumínio
[0237] No termograma TG-DTA do cristal (Forma 1) (Figura 21), perda de peso significativa devido à desidratação foi observada na faixa de temperatura de até 130 °C, acompanhada de picos endotérmicos. Quando o cristal (Forma 1) é aquecido, uma alteração significativa foi encontrada no padrão de difração de raio X de pó (PXRD) acima de 60 °C (Figura 22). Conforme mostrado na Figura 23, o padrão de PXRD alterado foi comparável com aquele do cristal (Forma 2). Então, o padrão de PXRD do cristal (Forma 2) foi alterado adicionalmente ao outro padrão a 125 °C ou acima do mesmo (Figura 24). Essas constatações indicaram que o cristal (Forma 1) e o cristal (Forma 2) seriam hidratos.
[0238] Exemplo 11
[0239] Em medição de higroscopicidade do cristal (Forma 1) na faixa de RH de 30% a 95% em 25 °C, um circuito de histerese entre processos de adsorção e dessorção foi observado conforme mostrado na Figura 25. No processo de adsorção, o nível de alteração de peso foi gradualmente aumentado em 1,7% até 80% de RH e, então, finalmente alcançou aproximadamente 19% em 95% de RH. Nenhuma alteração foi observada nos padrões de PXRD antes e após a medição de higroscopicidade. Em contraste, o padrão de PXRD da amostra de cristal (Forma 1) armazenada a 25 °C e 94% de RH por 4 dias foi diferente do padrão inicial conforme descrito na Figura 26. A forma de cristal do padrão de PXRD alterado foi definida como Forma 3.
Essas constatações provam que o cristal (Forma 3) é um hidrato. Exemplos de Testes Farmacológicos
[0240] Os exemplos de teste a seguir foram realizados para examinar os efeitos farmacológicos do Composto (1a). Exemplo de Teste Farmacológico 1: Ensaio de Repórter de Atividade de Antagonista STING HAQ
[0241] Células THP1-DualTM (InvivoGen, nº de cat thpd-nfis) foram aplicadas para determinação de EC50. Células THP1 DualTM foram caracterizadas para carregar o genótipo STING HAQ através do fornecedor Invivogen (Insight 201402-1). Células foram cultivadas e mantidas sob condições conforme recomendado pelo fabricante. A indução de trajetória de fator regulador de interferon (IRF) descrita no manual do fabricante foi seguida por determinação de EC50. Brevemente, células foram semeadas e tratadas com diferentes concentrações de composto por 20 h enquanto são incubadas a 37 °C, 5% de CO2. Células foram ressuspensas e solução de QUANTI-LucTM (nº de Cat : rep-qlc1) foi adicionada. Emissão de luz resultante foi medida através de luminômetro (Envision, Perkin Elmer). Sinais obtidos foram plotados e EC50 foi calculado com o software GraphPad Prism7. Valor de EC50 é relatado na Tabela 1 abaixo. [Tabela 4] Tabela 1 No de Composto EC50 (μM) de STING Humana HAQ 1a 4,1 EC50 (μM) de STING Humana do Composto (1a) foi medido na Tabela 1. Exemplo de Teste Farmacológico 2: Ensaio de Repórter Específico de Variante de STING
[0242] STING Humana tem 4 variantes principais que incluem as variantes WT, HAQ, REF e AQ. REF-STING, também denominado R232H, por exemplo, ocorre em cerca de 14% da população humana. Em comparação com o alelo de tipo selvagem, R232H diminuiu a resposta aos dinucleotídeos cíclicos bacterianos e metazoários. Detalhes dessas 4 variantes principais, assim como outras variantes raras, são relatados por Yi G, et al., "Single nucleotide polymorphisms of human STING can affect innate immune response to cyclic dinucleotides" PLoS One 2013; 8:e77846. Linhas celulares de repórter específico de variante de STING foram estabelecidas com o uso de células THP1-DualTM KO-STING (InvivoGen, nº de cat thpd-kostg) e três vetores de expressão de proteína de variante de STING. O mapa de vetor de expressão para WT STING é mostrado na Figura 16. Para os outros dois vetores de expressão, diferentes sequências de variante de STING foram usadas nesse vetor, com a WT STING substituída pela sequência de nucleotídeos apropriada.
[0243] Vetores de expressão de variante de STING para WT- STING, REF-STING, e AQ-STING foram preparados e estavelmente transfectados para células THP1-DualTM KO-STING para preparar ensaios de repórter específico de variante de STING para WT-STING, REF-STING e AQ- STING, respectivamente. Valores de EC50 foram determinados conforme descrito acima no Exemplo de Teste Farmacológico 1 para o ensaio de repórter de atividade de agonista STING HAQ. Resultados são mostrados abaixo na Tabela 2. As sequências de DNA usadas para essas variantes de STING são mostradas na SEQ ID NO: 1 (Sequência de Nucleotídeos de STING Humana WT), SEQ ID NO: 2 (Sequência de Nucleotídeos de STING Humana REF) e SEQ ID NO: 3 (Sequência de Nucleotídeos de STING Humana AQ).
[0244] STING Humana WT: atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcccagaaggc agccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcacactctccggt acctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggctgaggagctg cgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctgccccctccgc cgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgcccttcacttggatg cttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggccccagctgagatctc tgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcggatatctgcggct gatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctacggggtgcagt gagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctgaccccaacat tcgcttcctggataaactgccccagcagaccggtgaccgggctggcatcaaggatcgggtttacagcaacag catctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccacccccttgcagact ttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggccaaactcttctgc cggacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcctaccaggaa cctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggaggaaaaggaaga ggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagcctgagctcctc atcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga (SEQ ID NO: 1).
[0245] STING Humana REF: atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcccagaaggc agccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcacactctccggt acctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggctgaggagctg cgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctgccccctccgc cgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgcccttcacttggatg cttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggccccagctgagatctc tgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcggatatctgcggct gatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctacggggtgcagt gagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctgaccccaacat tcgcttcctggataaactgccccagcagaccggtgaccatgctggcatcaaggatcgggtttacagcaacag catctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccacccccttgcagact ttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggccaaactcttctgc cggacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcctaccaggaa cctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggaggaaaaggaaga ggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagcctgagctcctc atcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga (SEQ ID NO: 2).
[0246] STING Humana AQ: atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcccagaaggc agccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcacactctccggt acctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggctgaggagctg cgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctgccccctccgc cgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgcccttcacttggatg cttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggccccagctgagatctc tgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcggatatctgcggct gatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctacggggtgcagt gagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctgaccccaacat tcgcttcctggataaactgccccagcagaccgctgaccgagctggcatcaaggatcgggtttacagcaacag catctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccacccccttgcagact ttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggccaaactcttctgc cagacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcctaccaggaa cctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggaggaaaaggaaga ggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagcctgagctcctc atcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga (SEQ ID NO: 3). Exemplo de Teste Farmacológico 3: Ensaio de repórter de atividade de agonista de STING de camundongo
[0247] Células RAW-LuciaTM ISG (InvivoGen, nº de cat rawl-isg) foram usadas para um ensaio de repórter de agonista de STING de camundongo. Valores de EC50 foram determinados conforme descrito acima no Exemplo de Teste Farmacológico 1 no ensaio de repórter de atividade de agonista STING HAQ. Resultados são mostrados abaixo na Tabela 2. [Tabela 5] Tabela 2 Caracterização in vitro de Composto (1a) Composto EC50 (μM) de STING STING de DSF WT Humana camundongo STING △Tm WT HAQ REF AQ EC50 (μM) (°C) 1a 0,9 4,1 4,8 1,2 3,4 17,6 Exemplo de Teste Farmacológico 4: Ensaio de Fluorimetria de Varredura Diferencial (DSF)
[0248] Um ensaio de DSF foi empregado para medir a interação física entre composto e proteína de STING recombinante. Proteína de STING recombinante truncada (a.a.155-341) (SEQ ID NO: 4) foi expressa em E. coli e isolada para o ensaio, conforme descrito abaixo. A matriz de ensaio foi preparada em placas de 384 poços para um volume final de 10 μl por poço que consiste em 1 μm de proteína de STING recombinante (a.a. 155-341) (SEQ ID NO: 4), 100 mM de PBS pH 7,4, complementada com 100 mM de KCl, corante laranja 5X SYPRO e 50 μM de composto (concentração de DMSO final de 0 a 1%). Ensaios foram realizados em um sistema PCR em tempo real QuantStudio 12K Flex com o uso de um gradiente de temperatura de 25 °C a 95 °C em uma taxa de 0,05 °C/min, e filtros de excitação e emissão a 470 e 586 nm, respectivamente. De acordo com as curvas derivadas de fluorescência atribuídas pelo software Protein Thermal Shift (versão de algoritmo 1.3.) da Applied Biosystems (marca registrada), o derretimento térmico (Tm) da proteína de STING recombinante não ligada e ligada ao ligante, e a diferença em derretimento térmico (dTm D) foi calculada.
[0249] Em geral, compostos com valores de ΔTm maiores que 0 são considerados por ter uma interação física com a proteína testada, e o valor de ΔTm é positivamente associado à afinidade de ligação de composto. Aqui, o Composto (1a) mostrou o ΔTm de 17,6 (Tabela 2 mostrada acima), que indica interação física com a proteína de STING. Exemplo de Teste Farmacológico 5: Ensaio de estímulo de PBMC humana ex vivo
[0250] Sangue humano de 5 doadores saudáveis foi coletado com o uso de 10,0 ml de tubos de heparina BD Vacutainer Sodium (nº de cat 367874). Isolamento de célula mononuclear de sangue periférico (PBMC) foi realizado com o uso de tubos SIGMA ACCUSPIN de 50 ml (nº de cat A2055) e sigma ACCUSPIN System-HISTOPAQUE-1077 (nº de cat A7054) com o uso do protocolo fornecido pelo fabricante. A camada de PBMC foi coletada e lavada com 1x de solução salina tamponada de fosfato (PBS) conforme sugerido pela
Sigma. PBMC foram contadas e finalmente suspensas em 1x10e6/ml em RPMI (nº de cat corning 10-041-CV) complementadas com 10% de soro bovino fetal (FBS) (nº de cat Gibco 20140,79). 1 ml de célula (1x10e6) foi transferido para o tubo de teste de polipropileno de fundo redondo de 5 ml da Falcon (nº de cat 352063) e estimulado com diferentes concentrações (0, 0,1, 1, 10 μM) por 24 horas em 5% de CO2 incubadora a 37 °C.
[0251] Após 24 horas de incubação, os tubos foram centrifugados a 1.400 rpm por 5 minutos e sobrenadantes foram coletados. Os sobrenadantes foram armazenados a -80 °C para medição de IFNβ subsequente. A medição de IFNβ foi realizada com o uso do kit base de IFN-β humano (nº de cat Meso Scale Diagnostics K151ADA) e o protocolo fornecido pelo fabricante foi usado. A estimativa de IFN-beta foi realizada lendo-se a placa de ensaio no visor MESO SECTOR 2400 e com o uso do programa MSD Discovery Workbench 4.0. Após 24 horas a proteína de IFNβ foi analisada. Os resultados mostraram que o Composto (1a) pode induzir a produção de proteína de IFNβ de PBMC humana primária de uma maneira dependente de dose. Resultados mostrados na Tabela 3 refletem uma média de medições conduzidas com o uso de cinco doadores diferentes. [Tabela 6] Tabela 3 Ensaio de estímulo de PBMC humana ex vivo Composto (1a) PBS (Controle) 0,1 μM 1 μM 10 μM IFNβ (pg/ml) 0 21,3±17,8 227,5±62,4 540,2±215,0
[0252] Para quantificação de mRNA de IFNβ, o RNA total foi isolado com o uso do mini kit RNeasy (Qiagen, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. mRNA de IFNβ foi quantificado pelo ensaio de qPCR. Brevemente, RNA total (400 ng a 1.000 ng) foi convertido em cDNA em um volume de reação de 60 μl com o uso de SuperScript VILO MasterMix (Life
Technologies, E.U.A.). cDNAs obtidos (10 ng) foram subsequentemente amplificados com o uso de ensaios de expressão Applied Biosystems TaqMan com o uso de iniciadores específicos de RNA para IFNB1 (Hs01077958_s1), e GAPDH (Hs99999905_m1). Uma análise de qPCR foi realizada com TaqMan Fast Advanced Master Mix (Life Technologies, E.U.A.) no sistema de PCT em tempo Real Applied Biosystems Quantstudio 12K Flex, com uma etapa de 2 minutos inicial a 50 °C seguida por 95 °C por 2 s e 40 ciclos de 95 °C por 1 s e 60 °C por 20 s. A expressão de gene relativa foi calculada após normalização contra o gene de referência GAPDH com o uso do método 2-ΔΔCT. Cálculos foram realizados com o uso do software Applied Biosystems Quantstudio 12K Flex v1.2.2. amostras tratadas com veículo contra fold changes de mRNA de IFNβ são resumidas na Tabela 4. Os resultados mostram que o Composto (1a) pode induzir mRNA de IFNβ em PBMC primária de uma maneira dependente de dose e tempo. Tabela 4 mostra uma média calculada a partir de cinco diferentes doadores. [Tabela 7] Tabela 4 Ensaio de estímulo de 3 h e 24 h de PBMC humana ex vivo (mRNA) mRNA de IFNβ Composto (1a) (amostras tratadas com veículo contra fold changes) 0,1 μM 1 μM 10 μM 51,0 ± Tratamento de 3 h 21,7 219,8 ± 69,8 1973,3 ± 1023,0 28,1 ± 10652,3 ± Tratamento de 24 h 28,9 4992,4 24157,3 ± 9224,2 Exemplo de Teste Farmacológico 6: Efeito anticâncer do Composto (1a) no modelo tumoral duplo CT26
[0253] Composto (1a) foi testado para sua atividade anticâncer em modelo tumoral duplo CT26, que é um modelo de camundongo com câncer de cólon. Camundongos do tipo Balb/cJ com 5 a 6 semanas de idade fêmeas (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine) foram implantados por via subcutânea com células tumorais CT26 em ambos os lados de cada animal, 10 5 células para cada lado. Para o estudo A, o tratamento foi iniciado 5 dias (1,25 mg/kg, 2,5 mg/kg e 5 mg/kg) após o implante tumoral, quando os tumores médios alcançaram aproximadamente 100 mm3. Para o estudo B, o tratamento foi iniciado 8 dias (0,6 mg/kg e 10 mg/kg) após o implante tumoral, quando os tumores médios alcançaram aproximadamente 120 mm 3. O esquema de tratamento é descrito na Tabela 5 e Tabela 6. [Tabela 8] Tabela 5 Esquema de dosagem para o estudo A Grupo n° de Animais Tratamento Rota e Programação A 6 Veículo (1 x PBS) I.T.*; dose única B 6 5 mg/kg de Composto (1a) I.T.; dose única C 6 2,5 mg/kg de Composto (1a) I.T.; dose única D 6 1,25 mg/kg de Composto (1a) I.T.; dose única *I.T. é intratumoral. [Tabela 9] Tabela 6 Esquema de dosagem para o estudo B Grupo n° de Animais Tratamento Rota e Programação A 5 Veículo (1 x PBS) I.T.*; dose única B 5 10 mg/kg de Composto (1a) I.T.; dose única C 5 0,6 mg/kg de Composto (1a) I.T.; dose única *I.T. é intratumoral.
[0254] Todos os camundongos no estudo têm dois tumores CT26 subcutâneos. O “tumor tratado" indica o tumor com administração direta de composto, enquanto o "tumor não tratado" indica o tumor sem administração de composto direta. Volume tumoral foi seguido ao longo do experimento. Volume tumoral é medido duas vezes semanalmente após o início do tratamento. O fardo tumoral é calculado a partir de medições de calibrador pela Fórmula para o volume de um elipsoide alongado (LxW 2)/2 em que L e W são as respectivas medições de comprimento e largura ortogonais (mm).
[0255] Composto (1a) mostrou atividade potente e curativa em modelo tumoral duplo CT26 (Figura 17 e Figura 18). Para tumores tratados, uma taxa de cura de 20% foi detectada mesmo na dose mais baixa testada no estudo (Figura 18, dose de 0,6 mg/kg). Ao mesmo tempo, a dose mais alta (10 mg/kg) curou 100% dos animais daquele tumor no fim do estudo. Para os tumores não tratados, um efeito antitumoral dependente de dose também esteve evidente. O grupo de dose superior (10 mg/kg) mostrou efeitos 80% curativos; todas as doses inferiores também mostraram atividade de inibição de crescimento tumoral. Portanto, uma janela terapêutica de 0,6 mg/kg a 10 mg/kg para o Composto (1a) foi observada, com atividade antitumoral vista não só localmente, mas também sistematicamente, com base em efeitos no sítio de tumor distal não injetado. Finalmente, esses resultados indicam que a administração local do Composto (1a) pode induzir atividade anticâncer tanto local quanto sistemática (abscopal). Exemplo de Teste Farmacológico 7: Efeito anticâncer do Composto (1a) no modelo metastático hepático CT26
[0256] Composto (1a) foi testado para sua atividade anticâncer em um modelo metastático hepático CT26. Camundongos do tipo BALB/cJ com 5 a 6 semanas de idade fêmeas anestesiados (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine) foram implantados por via intraesplênica com células tumorais CT26 que expressam luciferase (5 x 105 células por camundongo). Um período de espera de dez minutos subsequente permitiu que as células tumorais circulassem nos figados dos animais. Baços foram, então, removidos e os animais foram suturados e deixados para se recuperar. Três dias depois, células tumorais CT26 (105 células por camundongo) foram novamente implantadas, dessa vez por via subcutânea (sc) sob a área do membro posterior direito, para possibilitar o desenvolvimento de uma massa tumoral para a administração de composto. Nove dias após injeção intraesplênica, o composto (10 mg/kg) foi administrado por via intratumoral, uma única vez, no tumor sc.
[0257] O efeito anticâncer local do composto foi medido através de seu efeito no tumor sc, enquanto o efeito abscopal do composto foi avaliado pela sobrevivência geral dos camundongos tratados em comparação com camundongos de controle tratados com veículo, com base no efeito prejudicial da massa tumoral crescente em cada fígado de camundongo. Composto (1a) mostrou tanto atividade potente em direção aos tumores sc locais quanto atividade sistemática curativa em 9 dos 10 animais tratados (Figura 19). Esses resultados indicam que a administração local do Composto (1a) pode induzir atividade anticâncer tanto local quanto sistemática (abscopal) que inclui lesão profunda, tal como no fígado. Exemplo de Teste Farmacológico 8: Efeito anticâncer do Composto (1a) no modelo ortotópico cerebral GL261
[0258] Composto (1a) foi testado para sua atividade anticâncer em um modelo ortotópico cerebral GL261. GL261 é uma linha celular de glioma murino. Células de glioma de camundongo GL261 que expressam Luciferase (2x104 células/camundongo) foram implantadas por via intracraniana em camundongos albinos B6 com 5 a 6 semana de idade fêmeas (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine). Três a 4 dias depois, células GL261 foram implantadas por via subcutânea (106 células/camundongo) sob a área do membro posterior direito para permitir o desenvolvimento de uma massa tumoral para administração de composto. Dez dias após implante de célula tumoral intracraniana, composto (10 mg/kg) foi administrado por via intratumoral, uma única vez, no tumor sc.
[0259] O efeito anticâncer local do composto foi medido através de seu efeito no tumor sc, enquanto o efeito abscopal do composto foi avaliado pela sobrevivência geral dos camundongos tratados em comparação com camundongos de controle tratados com veículo, com base no efeito prejudicial da massa tumoral crescente em cada cérebro de camundongo. Composto (1a) mostrou tanto atividade potente em tumores sc locais quanto mostrou atividade sistemática curativa em 5 dos 8 animais tratados (Figura 20). Esses resultados indicam que a administração local do Composto (1a) pode induzir atividade anticâncer tanto local quanto sistemática (abscopal) que inclui lesão profunda, tal como no cérebro.
[0260] SEQ ID NO: 1 (STING Humana WT): atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcccagaaggc agccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcacactctccggt acctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggctgaggagctg cgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctgccccctccgc cgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgcccttcacttggatg cttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggccccagctgagatctc tgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcggatatctgcggct gatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctacggggtgcagt gagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctgaccccaacat tcgcttcctggataaactgccccagcagaccggtgaccgggctggcatcaaggatcgggtttacagcaacag catctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccacccccttgcagact ttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggccaaactcttctgc cggacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcctaccaggaa cctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggaggaaaaggaaga ggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagcctgagctcctc atcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga
[0261] SEQ ID NO: 2 (STING Humana REF): atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcccagaaggc agccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcacactctccggt acctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggctgaggagctg cgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctgccccctccgc cgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgcccttcacttggatg cttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggccccagctgagatctc tgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcggatatctgcggct gatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctacggggtgcagt gagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctgaccccaacat tcgcttcctggataaactgccccagcagaccggtgaccatgctggcatcaaggatcgggtttacagcaacag catctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccacccccttgcagact ttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggccaaactcttctgc cggacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcctaccaggaa cctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggaggaaaaggaaga ggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagcctgagctcctc atcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga
[0262] SEQ ID NO: 3 (STING Humana AQ): Atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcccagaaggc agccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcacactctccggt acctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggctgaggagctg cgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctgccccctccgc cgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgcccttcacttggatg cttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggccccagctgagatctc tgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcggatatctgcggct gatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctacggggtgcagt gagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctgaccccaacat tcgcttcctggataaactgccccagcagaccgctgaccgagctggcatcaaggatcgggtttacagcaacag catctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccacccccttgcagact ttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggccaaactcttctgc cagacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcctaccaggaa cctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggaggaaaaggaaga ggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagcctgagctcctc atcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga
[0263] SEQ ID NO: 4 (resíduos de WT STING 155 a 341):
Claims (34)
1. Cristal caracterizado por ser de sal de amônia de (1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34R,36R,39S,41R)-29,41-difluoro-34,39- bis(sulfanil)-2,33,35,38,40,42-hexaoxa-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-deca-aza- 34λ5,39λ5-difosfaoctaciclo[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]dotetraconta- 5,7,9,11,15,19,21,23,25-nonaeno-34,39-diona (Composto (I)), sal de sódio de Composto (I) ou Composto (I).
2. Cristal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser um cristal de sal de amônia de (1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34R,36R,39S,41R)-29,41-difluoro-34,39- bis(sulfanil)-2,33,35,38,40,42-hexaoxa-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-deca-aza- 34λ5,39λ5-difosfaoctaciclo[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]dotetraconta- 5,7,9,11,15,19,21,23,25-nonaeno-34,39-diona (Composto (I)).
3. Cristal, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por ser um cristal de sal de diamônia de (1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34R,36R,39S,41R)-29,41-difluoro-34,39- bis(sulfanil)-2,33,35,38,40,42-hexaoxa-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-deca-aza- 34λ5,39λ5-difosfaoctaciclo[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]dotetraconta- 5,7,9,11,15,19,21,23,25-nonaeno-34,39-diona (Composto (I)).
4. Cristal (Forma 1), de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por ter um pico de difração em um ângulo de difração (2θ ± 0,2°) de 8,3° em uma difração de raio X de pó.
5. Cristal (Forma 1), de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por ter picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,4, 8,3 e 16,6 em uma difração de raio X de pó.
6. Cristal (Forma 1), de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por ter picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,4, 8,3, 12,7, 16,6 e 25,4 em uma difração de raio X de pó.
7. Cristal (Forma 1), de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado por ser um hidrato.
8. Cristal (Forma 2), de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por ter um pico de difração em um ângulo de difração (2θ ± 0,2°) de 9,0° em uma difração de raio X de pó.
9. Cristal (Forma 2), de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por ter picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 9,0°, 15,4° e 20,8° em uma difração de raio X de pó.
10. Cristal (Forma 2), de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por ter picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 9,0°, 15,4°, 20,8°, 24,0° e 30,0° em uma difração de raio X de pó.
11. Cristal (Forma 2), de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado por ser um hidrato.
12. Cristal (Forma 3), de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por ter um pico de difração em um ângulo de difração (2θ ± 0,2°) de 7,4° em uma difração de raio X de pó.
13. Cristal (Forma 3), de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por ter picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 7,4°, 16,0° e 21,4° em uma difração de raio X de pó.
14. Cristal (Forma 3), de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por ter picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,0°, 7,4°, 9,3°, 16,0° e 21,4° em uma difração de raio X de pó.
15. Cristal (Forma 3), de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado por ser um hidrato.
16. Cristal (Forma 4), de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por ter um pico de difração em um ângulo de difração (2θ ± 0,2°) de 9,7° em uma difração de raio X de pó.
17. Cristal (Forma 4), de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por ter picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 9,7°, 14,0° e 26,9° em uma difração de raio X de pó.
18. Cristal (Forma 4), de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por ter picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 9,7°, 14,0°, 17,4°, 22,3° e 26,9° em uma difração de raio X de pó.
19. Cristal (Forma 5), de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por ter um pico de difração em um ângulo de difração (2θ ± 0,2°) de 20,0° em uma difração de raio X de pó.
20. Cristal (Forma 5), de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por ter picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 10,9°, 20,0° e 23,6° em uma difração de raio X de pó.
21. Cristal (Forma 5), de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por ter picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 10,9°, 17,7°, 18,9°, 20,0° e 23,6° em uma difração de raio X de pó.
22. Cristal, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por ser um cristal de sal de monoamônia de (1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34R,36R,39S,41R)-29,41-difluoro-34,39- bis(sulfanil)-2,33,35,38,40,42-hexaoxa-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-deca-aza- 34λ5,39λ5-difosfaoctaciclo[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]dotetraconta- 5,7,9,11,15,19,21,23,25-nonaeno-34,39-diona (Composto (I)).
23. Cristal (Forma 6), de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por ter um pico de difração em um ângulo de difração (2θ ± 0,2°) de 17,0° em uma difração de raio X de pó.
24. Cristal (Forma 6), de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por ter picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de
17,0°, 21,6° e 25,9° em uma difração de raio X de pó.
25. Cristal (Forma 6), de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por ter picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 15,1°, 16,4°, 17,0°, 21,6° e 25,9° em uma difração de raio X de pó.
26. Cristal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser um cristal de sal de sódio de (1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34R,36R,39S,41R)-29,41-difluoro-34,39- bis(sulfanil)-2,33,35,38,40,42-hexaoxa-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-deca-aza- 34λ5,39λ5-difosfaoctaciclo[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]dotetraconta- 5,7,9,11,15,19,21,23,25-nonaeno-34,39-diona (Composto (I)).
27. Cristal, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por ter um pico de difração em um ângulo de difração (2θ ± 0,2°) de 6,1° em uma difração de raio X de pó.
28. Cristal, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por ter picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,1°, 9,3° e 16,6° em uma difração de raio X de pó.
29. Cristal, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por ter picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 6,1°, 9,3°, 15,9°, 16,6° e 22,3° em uma difração de raio X de pó.
30. Cristal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser um cristal de (1R,3R,15E,28R,29R,30R,31R,34R,36R,39S,41R)-29,41-difluoro- 34,39-bis(sulfanil)-2,33,35,38,40,42-hexaoxa-4,6,9,11,13,18,20,22,25,27-deca- aza-34λ5,39λ5- difosfaoctaciclo[28.6.4.13,36.128,31.04,8.07,12.019,24.023,27]dotetraconta- 5,7,9,11,15,19,21,23,25-nonaeno-34,39-diona (Composto (I)).
31. Cristal, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por ter um pico de difração em um ângulo de difração (2θ ± 0,2°) de 5,6° em uma difração de raio X de pó.
32. Cristal, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por ter picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 5,6°, 13,9° e 16,8° em uma difração de raio X de pó.
33. Cristal, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por ter picos de difração em ângulos de difração (2θ ± 0,2°) de 5,6°, 8,9°, 11,4°, 13,9° e 16,8° em uma difração de raio X de pó.
34. Composição farmacêutica caracterizada por compreender o cristal conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 33.
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