KR20210015937A - 방광암을 치료하기 위한 방법 - Google Patents

Abstract

방광암을 치료하기 위한 방법이 본원에 제공된다.

Description

방광암을 치료하기 위한 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

적용가능하지 않음

STING (인터페론 유전자의 자극인자)는 시토졸 중에서 dsDNA에 대한 선천성 반응에서의 신호전달 분자이다. STING 결실이 다수의 인간 암에서 보고된 바 있다. 게다가 인간 암에서의 STING 신호전달의 탈조절이 또한 흑색종 (Xia T, et al., "Recurrent Loss of STING Signaling in Melanoma Correlates with Susceptibility to Viral Oncolysis" Cancer Res. 2016) 및 결장암에서 보고된 바 있다. (Xia T, et al., "Deregulation of STING Signaling in Colorectal Carcinoma Constrains DNA Damage Responses and Correlates With Tumorigenesis" Cell Rep. 2016;14:282-97). 흥미롭게도 이들 연구에서 게놈 분석 결과는 STING의 상실 발현이 유전자 결실 또는 돌연변이로 인한 것이 아니라 후성적 변화를 통한 것이라고 제시하였다. (Xia, Cancer Res. 2016; Xia, Cell Rep. 2016). STING의 암 방어 활성은 또한 마우스 모델 연구로부터 획득된 증거에 의해 뒷받침된다. STING 녹아웃 마우스는 결함이 있는 종양 제어를 나타냈다. (Woo SR, et al. "STING-dependent cytosolic DNA sensing mediates innate immune recognition of immunogenic tumors" Immunity 2014;41:830-42).

또한 종양발생 방어에서의 STING의 역할은 신경교종 (Ohkuri T, et al., "Protective role of STING against gliomagenesis: Rational use of STING agonist in anti-glioma immunotherapy" Oncoimmunology. 2015;4:e999523), 및 결장암 (Zhu Q, et al., "Cutting edge: STING mediates protection against colorectal tumorigenesis by governing the magnitude of intestinal inflammation" J. Immunol. 2014;193:4779-82)을 비롯한 여러 마우스 자연 모델에 입증된 바 있다. 이러한 항종양 효과는 NF-kB 및 STAT3의 과다활성화에 반대작용하는 능력으로 인한 것일 수 있다. (Okihuri 2015). STING 경로의 활성화는 또한 전임상 마우스 종양 모델에서 강력한 활성을 나타냈다. (Woo 2014; Chandra D, et al. "STING ligand c-di-GMP improves cancer vaccination against metastatic breast cancer" Cancer Immunol Res. 2014;2:901-10; Corrales L, et al., "Direct Activation of STING in the Tumor Microenvironment Leads to Potent and Systemic Tumor Regression and Immunity" Cell Rep. 2015;11:1018-30; Curran E, et al. "STING Pathway Activation Stimulates Potent Immunity against Acute Myeloid Leukemia" Cell Rep. 2016;15:2357-66; Tang CH, et al. "Agonist-Mediated Activation of STING Induces Apoptosis in Malignant B Cells" Cancer Res. 2016;76:2137-52). 이러한 항종양 활성은 종양 혈관계의 파괴에 이어서 적응 면역 반응의 유도에 의한 것일 가능성이 있다. (Corrales L, et al., "The host STING pathway at the interface of cancer and immunity" J. Clin. Invest. 2016;126:2404-11). 따라서, 종양 미세환경에서 효능제에 의한 STING의 직접 또는 종양내 자극은 암을 치료하기 위한 신규 접근법을 나타낼 수 있다.

게다가, 방광암은 남성 및 여성에서 각각 4번째 및 11번째의 가장 흔한 암이고, 초기 단계의 암 환자에 대해서 유일한 약물 투여 경로를 갖는다 (Kamat et al., "What is new in non-muscle-invasive bladder cancer in 2016?" Turk J Urol 2017;43(1):9-13). 2018년에, 미국에서 대략 81,190명의 방광암의 신규 케이스가 추정되고, 방광암으로 인한 약 17,240명의 사망이 예상된다 (미국 암 학회 웹사이트). BCG (바실루스 칼메트-게랭)의 투여는 고위험 비-근육 침습성 방광암 (NMIBC)에 대한 최전선 치료 옵션이다. 불행하게도, 환자 중 최대 40%가 BCG 치료에 대해 반응하지 않을 것이고, 이들 환자 중 다수가 근치적 방광절제술 절차를 겪어 전체 방광을 제거해야 하고 (Zlotta, A.R., et al., "The management of BCG failure in non-muscle-invasive bladder cancer: an update," Can Urol Assoc J 2009;3(Suppl4):S199-205), 환자는 수술 후 삶의 질이 더 불량하게 된다. 따라서, 근치적 방광절제술을 회피하거나 또는 지연시키기 위한 대안적 방광암 요법에 대한 중요한 미충족 의료 필요가 있다.

실시양태는 방광암의 치료를 필요로 하는 환자에게 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 방광암을 치료하는 방법을 제공할 수 있다:

일부 실시양태에서 본원에 보고된 바와 같은 실시양태에 따라 투여된 제약상 허용되는 염은 디암모늄 염 또는 트리에틸 아민 (TEA) 염이다. 추가 실시양태는 방광암의 치료를 필요로 하는 환자에게 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 투여함으로써 방광암의 치료를 제공할 수 있다.

추가 실시양태는 방광암의 치료를 필요로 하는 환자에게 화합물 2 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 방광암을 치료하는 방법을 제공할 수 있다:

추가 실시양태는 방광암을 치료하기 위한 제약 조성물의 제조를 위한 본원에 보고된 바와 같은 화합물 1, 화합물 2 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공할 수 있다.

실시양태는 방광암에 대한 치료에서의 화합물 1, 화합물 2, 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 1, 화합물 2 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물의 용도를 제공할 수 있다.

실시양태는 화합물 1, 화합물 2, 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 1, 화합물 2 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물에 의해 치료가능한 방광암을 갖는 개체를 확인하는 것; 및 방광암이 치료가능한 것으로 확인된 상기 개체에게 치료 유효량의 화합물 1, 화합물 2, 제약상 허용되는 염 또는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방광암을 치료하는 방법을 제공할 수 있다.

일부 실시양태에서 개체는 환자에서 REF STING 변이체 대립유전자의 존재에 의해 화합물 1, 화합물 2, 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 1, 화합물 2, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물에 의해 치료가능한 방광암을 갖는 것으로 확인된다.

일부 실시양태는 REF STING 대립유전자를 갖는 환자에게 화합물 1, 화합물 2, 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 1, 화합물 2 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 방광암을 치료하는 방법을 제공한다.

일부 실시양태는 WT STING 대립유전자 갖는 환자에게 화합물 1, 화합물 2, 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.

일부 실시양태는 AQ STING 대립유전자를 갖는 환자에게 화합물 1, 화합물 2 또는 화합물 1, 화합물 2의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 1, 화합물 2 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.

일부 실시양태는 HAQ STING 대립유전자를 갖는 환자에게 화합물 1, 화합물 2 또는 화합물 1, 화합물 2의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 1, 화합물 2 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 화합물 1은 유리 산으로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 화합물은 NH₄ 염으로서 또는 트리에틸 아민 (TEA) 염으로서 제공된다.

실시양태는, 상기에 언급된 바와 같이, 방광암의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 방광암을 치료하는 방법을 제공할 수 있다.

실시양태는, 상기에 보고된 바와 같이, 방광암의 치료를 필요로 하는 환자에게 화합물 1, 화합물 2 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 방광암을 치료하는 방법을 제공할 수 있다. 본원에 보고된 바와 같이 치료되는 방광암은 요로상피 암종일 수 있다.

도 1은 화합물 1a의 합성을 나타낸다. 이 합성은 또한 2018년 2월 17일에 출원된 미국 특허 출원 번호 15/898,533에 보고되고, 이는 본원에 참조로 포함된다.
도 2a 및 도 2b는 화합물 1 및 화합물 1a의 대안적 합성을 나타낸다. 그 대안적 합성은 또한 도 2c 내지 도 2e에 나타낸다.
도 3은 화합물 1에 대한 ¹H NMR 분광 사진을 나타낸다.
도 4a, 도 4b 및 도 4c는 각각 화합물 1의 비대칭 결정, 비대칭 결정으로부터의 제1 분자, 및 비대칭 결정으로부터의 제2 분자에 대한 X선 결정학 결과 (ORTEP 도면)를 나타낸다.
도 5는 화합물 1과의 복합체로 인간 WT STING의 X선 결정 구조의 도면을 나타낸다.
도 6은 화합물 1과의 복합체로 인간 REF STING C-말단 도메인을 나타낸다.
도 7은 MRI에 의해 정량화된 제20-21일로부터의 종양 부피를 나타낸다.
도 8은 방광암 치료 실시예 4에서의 모든 군에 대한 생존 곡선을 나타낸다.
도 9는 WT STING (pLenti-WT 인간 STING-Puro)에 대한 발현 벡터 지도를 나타낸다.
도 10 및 도 11은 실시예 108을 수반하고, CT26 이중 종양 모델에서 화합물 1a의 치유 활성을 나타낸다.
도 12는 실시예 109를 수반하고, 처리된 종양에 대한 종양 부피 플롯 및 생존 곡선을 나타낸다.
도 13은 실시예 110을 수반하고, 처리된 종양에 대한 종양 부피 플롯 및 생존 곡선을 나타낸다.

방광암을 치료하는데 유용할 수 있는 화합물 (화합물 1) 및 그의 제약상 허용되는 염, 뿐만 아니라 제약 조성물이 본원에 제공된다. 화합물 2 또는 그의 제약상 허용되는 염, 뿐만 아니라 화합물 2 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물이 방광암을 치료하는데 또한 유용할 수 있다. 화합물은 인터페론 유전자의 자극인자 (STING)를 활성화할 수 있다.

이는 화합물 1이다:

이는 화합물 2이다:

일부 실시양태에서, 화합물 1은 유리 산으로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 화합물은 예를 들어 NH₄ 염으로서 제공된다. "화합물 1a"에 대한 언급은 화합물 1의 디암모늄 염을 나타낼 것이다.

실시양태는 방광암의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 화합물 1, 화합물 2 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 방광암을 치료하는 방법을 제공할 수 있다.

본원에 보고된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 뿐만 아니라 제약상 허용되는 부형제를 포함하는, 방광암을 치료하기 위한 제약 조성물이 또한 제공될 수 있다. 본원에 보고된 바와 같은 실시양태는 방광암을 치료하거나 또는 방광암의 치료에 유용한 의약을 제조하는데 사용될 수 있다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 인 원자 (P₁,P₂)에 결합된 치환기가 단일 및 이중 결합 둘 다를 갖는 경우에, 이들이 호변이성질체화될 수 있을 것임을 인지할 것이다. 예를 들어, 화합물은 평형상태에서 호변이성질체화할 수 있다. 한 예는 하기에 제시된다:

이러한 호변이성질체는 청구범위의 범주 내에 포함된 것으로 간주되어야 한다. 주어진 화합물에 대한 어느 하나의 호변이성질체의 구조 표현은 동일한 화합물을 나타낼 것이다.

치료 방법

실시양태는 방광암의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 방광암을 치료하는 방법을 제공할 수 있다.

일부 실시양태에서, 화합물 1은 그의 유리 산 또는 제약상 허용되는 염으로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 투여되는 화합물은 그의 NH₄ 염, 유리 산 또는 제약상 허용되는 염으로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 화합물은 NH₄ 염으로서 제공된다.

일부 실시양태는 방광암의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 STING 효능제를 투여하는 것을 포함하는 방광암을 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 실시양태에서 투여는 소포내 투여일 수 있으나 요구되지는 않는다. 방광암의 치료에 사용될 수 있고, 요구되지는 않지만 소포내로 투여될 수 있는 잠재적 STING 효능제의 예는 2018년 2월 17일에 출원된 미국 특허 출원 번호 15/898,533; 2018년 2월 17일에 출원된 PCT 출원 번호 PCT/US2018/018556; 2018년 2월 17일에 출원된 PCT 출원 번호 PCT/US2018/018561; US 2014/0205653 A1; US 2014/0329889 A1; US 2014/0341976 A1; US 2007/0149462 A1; WO 2018/098203 A1; WO 2018/198076 A1; WO 2018/198084 A1; WO 2018/140831 A2; US 2014/0341976 A1; WO 2015/185565 A1; US 7,709,458 B2; US 7,592,326; US 7,569,555 B2; US 2014/0205653 A1; US 2014/0341976 A1; US 2015/0056224 A1; US 2016/0362441 A1; US 2017/0158724 A1; US 2017/044206 A1; US 5,547,941; US 7,569,555 B2; US 7,592,326 B2; US 7,709,458 B2; US 9,549,944 B2; WO 2009/133560 A1; WO 2015/074145 A1; WO 2015/077354 A1; WO 2015/185565 A1; WO 2016/100261 A1; WO 2016/120305 A1; WO 2016/145102 A1; WO 2017/027645 A1; WO 2017/027646 A1; WO 2017/075477 A1; WO 2019/043634 A2; WO 2019/046496 A1; WO 2019/046498 A1; WO 2019/046500 A1; WO 2019/046511 A1; WO 2017/093933 A1; WO 2017/123657 A1; WO 2017/175156 A1; EP 1740,192 B1; CN 102199183 A; Fu, J., et al., "STING Agonist Formulated Cancer Vaccines Can Cure Established Tumors Resistant to PD-1 Blockade," Sci. Translational Med., 7(283): 283ra52, (April 15, 2015); Corrales, L. et al., "Direct Activation of STING in the Tumor Microenvironment Leads to Potent and Systemic Tumor Regression and Immunity," Cell Reports, 11: 1018-1030 (2015); and Lioux, T. et al., "Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Novel Cyclic Adenosine-Inosine Monophosphate (cAIMP) Analogs That Activate Stimulator of Interferon Genes (STING)," J. Med. Chem., 59: 10253-10267 (2016)에서 확인되는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 그 안의 화합물을 포함하여 그 모든 문헌은 본원에 참조로 포함되고; 그 문헌 중 임의의 것의 임의의 구성요소가 본 명세서 중 어떤 것과 모순되거나, 또는 달리 불일치한 경우, 본 명세서가 우선한다.

투여량

방광암의 치료를 위한 최적 용량은 공지된 방법을 사용하여 각각의 개체에 대해 경험적으로 결정될 수 있으며, 작용제의 활성; 개체의 연령, 체중, 전반적 건강, 성별 및 식이; 투여의 시간 및 경로; 및 개체가 복용하고 있는 다른 의약을 포함한 각종 인자에 따라 달라질 것이다. 최적 투여량은 관련 기술분야에 널리 공지된 상용 시험 및 절차를 사용하여 확립될 수 있다. 상기 화합물의 투여는 임의의 적합한 경로에 의한 것일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "제약상 허용되는 염"은 본 개시내용에서 화합물의 산 부가염 또는 염기 부가 염을 지칭한다. 제약상 허용되는 염은 모 화합물의 활성을 유지하는 임의의 염이고, 이를 투여받는 대상체에 대해 및 이를 투여하는 맥락에서 임의의 과도하게 해롭거나 바람직하지 않은 효과를 부여하지 않는다. 제약상 허용되는 염은 무기 산 및 카르복실산 둘 다의 염 및 금속 착물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 제약상 허용되는 염은 또한 금속 염, 예컨대 알루미늄, 칼슘, 철, 마그네슘, 망가니즈 및 착물 염을 포함한다. 게다가, 제약상 허용되는 염은 산 염, 예컨대 아세트산, 아스파르트산, 알킬술폰산, 아릴술폰산, 악세틸, 벤젠술폰산, 벤조산, 이탄산, 이황산, 이타르타르산, 부티르산, 에데트산칼슘, 캄실산, 탄산, 클로로벤조산, 시트르산, 에데트산, 에디실산, 에스톨산, 에실, 에실산, 포름산, 푸마르산, 글루셉트산, 글루콘산, 글루탐산, 글리콜산, 글리콜릴아르사닐산, 헥삼산, 헥실레조르신산, 히드라밤산, 브로민화수소산, 염산, 히드로클로라이드, 아이오딘화수소산, 히드록시나프토산, 이세티온산, 락트산, 락토비온산, 말레산, 말산, 말론산, 만델산, 메탄술폰산, 메틸질산, 메틸황산, 뮤신산, 뮤콘산, 나프실산, 질산, 옥살산, p-니트로메탄술폰산, 파모산, 판토텐산, 인산, 모노히드로겐 인산, 디히드로겐 인산, 프탈산, 폴리갈락투론산, 프로피온산, 살리실산, 스테아르산, 숙신산, 술팜산, 술파닐산, 술폰산, 황산, 탄닌산, 타르타르산, 테오클산, 톨루엔술폰산 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 나트륨 염 및 칼륨 염이 또한 제조될 수 있다.

실시양태는 디암모늄 염일 수 있다. 제약상 허용되는 염은 시스테인을 포함하나 이에 제한되지는 않는 아미노산으로부터 유래될 수 있다. 염으로서의 화합물을 제조하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Stahl et al., Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, Wiley-VCH; Verlag Helvetica Chimica Acta, Zurich, 2002; Berge et al., J. Pharm. Sci. 66: 1, 1977] 참조).

치료제의 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 대상체 또는 환자에서 비치료되어 남아있는 방광암과 비교하여 관찰가능한 치료 이익을 제공하기에 충분한 양이다.

본원에 보고된 바와 같은 활성 작용제는 제약상 허용되는 담체와 조합되어 그의 제약 제제를 제공할 수 있다. 담체 및 제제의 특정 선택은 조성물이 의도되는 특정한 투여 경로에 따라 달라질 것이다.

본원에서 사용된 바와 같은 "제약상 허용되는 담체"는 함께 제제화되는 화합물의 약리학적 활성을 파괴하지 않는 무독성 담체, 아주반트 또는 비히클을 지칭한다. 본 발명의 조성물에서 사용될 수 있는 제약상 허용되는 담체, 아주반트 또는 비히클은 소르브산, 소르브산칼륨, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 삼규산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스계 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모 지방을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 조성물은 비경구, 경구, 흡입 스프레이, 국소, 직장, 비강, 협측, 소포내, 질 또는 이식 저장소 투여 등에 적합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제는 천연 또는 비-천연 공급원으로부터의 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제 또는 담체는 멸균 형태로 제공될 수 있다. 멸균 담체의 비제한적인 예에는 무-내독소수 또는 무-발열원수가 포함된다. 조성물은 소포내 투여를 통해 투여될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활막내, 흉골내, 척수강내, 간내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 특정의 실시양태에서, 화합물은 정맥내로, 경구로, 피하로, 또는 근육내 투여에 의해 투여된다. 본 발명의 조성물의 멸균 주사가능한 형태는 수성 또는 유질 현탁액일 수 있다. 이들 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 관련 기술분야에 공지된 기술에 따라 제제화될 수 있다. 멸균 주사가능한 제제는 또한 비독성의 비경구로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사가능한 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 고정 오일이 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용된다. 일부 실시양태에서 조성물은 소포내로 투여된다.

이러한 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디-글리세리드를 포함한 임의의 무자극 고정 오일이 사용될 수 있다. 지방산 및 그의 글리세리드 유도체가 주사제의 제조에 유용하고, 특히 그의 폴리옥시에틸화 버전에서 천연 제약상 허용되는 오일, 예컨대 올리브 오일 또는 피마자 오일도 유용하다. 이들 오일 용액 또는 현탁액은 또한 에멀젼 및 현탁액을 포함한 제약상 허용되는 투여 형태의 제제화에 통상적으로 사용되는 장쇄 알콜 희석제 또는 분산제, 예컨대 카르복시메틸 셀룰로스 또는 유사한 분산제를 함유할 수 있다. 다른 통상적으로 사용되는 계면활성제, 예컨대 제약상 허용되는 고체, 액체, 또는 다른 투여 형태의 제조시에 통상적으로 사용되는 트윈(Tween), 스판(Span) 및 다른 유화제는 또한 제제화 목적을 위해 사용될 수도 있다.

경구 투여를 위해, 화합물 또는 염은 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 포함하나 이에 제한되지는 않는 허용되는 경구 투여 형태로 제공될 수 있다. 경구 사용을 위한 정제의 경우에, 통상적으로 사용되는 담체는 락토스 및 옥수수 전분을 포함한다. 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트가 또한 첨가될 수 있다. 캡슐 형태로의 경구 투여를 위해, 유용한 희석제는 락토스 및 건조 옥수수전분을 포함한다. 경구 사용을 위해 수성 현탁액이 필요한 경우에, 활성 성분은 유화제 및 현탁화제와 배합된다. 원하는 경우에, 특정 감미제, 향미제 또는 착색제가 또한 첨가될 수 있다. 또한 보존제가 또한 첨가될 수 있다. 제약상 허용되는 보존제의 적합한 예는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예컨대 용매, 예를 들어 에탄올, 프로필렌 글리콜, 벤질 알콜, 클로로부탄올, 4급 암모늄 염 및 파라벤 (예컨대 메틸 파라벤, 에틸 파라벤, 프로필 파라벤 등)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

"즉시-방출"은 투여 직후에 약물의 방출이 시작되는 통상적인 방출을 포함하는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "즉시 방출"은 약물의 용출 또는 흡수를 지연시키거나 연장시킬 의도 없이, 약물을 위장 내용물에서 용출시키는 투여 형태를 포함한다. 목적은 투여 후 약물이 급속히 방출되도록 하는 것, 예를 들어 용출 시험에서 용출 시작 후 대략 30분 이내에 약물의 적어도 80%를 방출할 수 있도록 하는 것이다.

"지속-방출" 또는 "연장-방출"은 시간 경과 및/또는 위치의 약물-방출 특성이 통상적인 투여 형태 예컨대 용액 또는 즉시 방출 투여 형태에 의해 제공되지 않는 치료 또는 편의 목적을 달성하도록 선택되는 투여 형태를 포함한다.

용어 "정상 상태"는, 주어진 활성제에 대한 혈장 수준이 달성되고, 활성제의 후속 용량과 함께 주어진 활성제에 대해 최소 유효 치료 수준 이상이고 최소 독성 혈장 수준 미만인 수준에서 유지되는 것을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "용량 범위"는 특정된 작용제의 양의 허용되는 변이의 상한 및 하한을 지칭한다. 전형적으로, 명시된 범위 이내의 임의의 양의 작용제의 용량이 치료를 받는 환자에게 투여될 수 있다.

용어 "치료하다"는 대상체에서 질환의 적어도 하나의 증상을 경감, 감소 또는 완화시키는 것을 의미하도록 본원에서 사용된다. 예를 들어, 방광암과 관련하여, 용어 "치료하다"는 발병을 저지시키는 것, 지연시키는 것 (즉, 방광암의 질환 또는 증상의 임상적 징후 이전의 기간) 및/또는 방광암의 증상의 진행 또는 악화의 위험을 감소시키는 것을 의미할 수 있다. 용어 "보호하다"는 대상체에서 방광암의 증상의, 적절하게는, 진행 또는 지속 또는 악화를 예방하거나, 지연시키거나 치료하는 것, 또는 이 모두를 의미하도록 본원에서 사용된다.

용어 "대상체" 또는 "환자"는 방광암을 앓고 있거나 그에 의해 고통받을 수 있는, 동물을 포함하는 것으로 의도된다. 대상체 또는 환자의 예는 포유동물, 예를 들어, 인간, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 마우스, 토끼, 래트, 및 트랜스제닉 비-인간 동물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간, 예를 들어 방광암을 앓고 있거나, 앓을 위험이 있거나, 또는 잠재적으로 앓을 가능성이 있는 인간이다.

용어 "약" 또는 "대략"은 통상적으로 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 보다 바람직하게는 10% 이내, 가장 바람직하게는 5% 이내인 것을 의미한다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템에서, 용어 "약"은 주어진 값의 로그 (즉, 10배) 이내, 바람직하게는 2배 이내의 대략을 의미한다.

본 발명을 기재하는 맥락에서 (특히, 하기 특허청구범위의 맥락에서) 단수형 및 유사한 지시대상의 사용은 본원에 달리 나타내거나 또는 문맥상 분명하게 모순되지 않는 한, 단수 및 복수를 둘 다 포함하는 것으로 해석된다. 용어 "포함하는", "갖는", "비롯한" 및 "함유하는"은 달리 언급되지 않는 한, 제약을 두지 않는 용어 (즉, "포함하나, 이에 제한되지는 않는"을 의미함)로서 해석되어야 한다. 본원에서 값의 범위에 대한 언급은 본원에 달리 나타내지 않는 한, 단지 상기 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 지칭하는 약칭 방법으로서 제공되는 것으로 의도되며, 각각의 개별 값은 본원에 개별적으로 열거된 것처럼 본 명세서에 포함된다.

본원에 개시된 1종 이상의 화합물을 사용하여 처리될 수 있는 예시적인 세포 증식성 장애는 신체에서 조직 및 기관에서 암, 전암 또는 전암성 상태, 및 전이성 병변을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 세포 증식성 장애는 증식증, 화생 및 이형성증을 포함할 수 있다.

본원에 개시된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 전체적인 집단에 비해 암의 증가된 발생 위험을 갖는 대상체에서 세포 증식성 장애를 치료하거나 또는 예방하는데, 또는 암을 치료하거나 또는 예방하는데 사용될 수 있거나, 또는 이러한 목적을 위한 적합한 후보를 확인하는데 사용될 수 있다.

제약 제제 및 투여 경로

방광암의 치료를 위한 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 제제가 본원에 제공된다. 제약 제제는 추가적으로 담체 또는 부형제, 안정화제, 향미제 및/또는 착색제를 포함할 수 있다.

화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 투여 경로를 사용하여 투여될 수 있다. 투여 경로는 경구 투여 및 소포내 투여를 포함한다. 특정 실시양태에서, 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 제제는 액체, 시럽, 정제, 캡슐, 분말, 스프링클, 츄어블, 또는 용해성 디스크의 형태로 경구로 복용될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 제약 제제는 정맥내 또는 경피 투여될 수 있다. 추가적 투여 경로는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro A. R., Ed., 20.sup.th Edition, Mack Publishing Co., Easton, Pa.] 참조).

일부 실시양태에서, 화합물 또는 제약상 허용되는 염은 페이스트, 젤리 또는 현탁액으로서 제제화된다. 예를 들어, 약물은 젤라틴 용액 또는 반고체의 약물 입자, 마이크로캡슐화된 입자, 또는 약물-중합체 입자의 형태로 용해, 포획 또는 현탁된다. 경구 젤리 제제의 이점은 정제, 캡슐 또는 환제를 삼키는데 어려움을 갖는 환자에게 약물을 투여하는 것이 더 용이하다는 점이다. 특정 실시양태에서, 화합물은 완전히 혼합되고 적절한 매질에 현탁되어 페이스트 또는 겔을 형성한다. 추가적 작용제를 임의로 혼합시켜 경구 투여 동안에 향미를 제공할 수 있다. 감미제 및 라즈베리 향미가 나는, 땅콩 버터 또는 알기네이트는 많은 적합한 맛 차폐제의 예이다. 다양한 실시양태에서, 페이스트 또는 젤리는 또한 국소 투여를 위한 관련 기술분야에 공지된 적합한 결합제 또는 부형제와 함께 제제화될 수 있다.

정제, 캡슐 또는 환제의 형태로 지속 방출 제제를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 지속 방출 제제는 약물의 활성 성분을 중합체, 바람직하게는 수불용성 중합체와 코팅함으로써 제조된다. 예를 들어, 수불용성 중합체는 제약 분야에 지속 방출 코팅제, 장용 코팅 작용제 또는 위 코팅제로서 사용된다. 수불용성 중합체는, 예를 들어, 에틸 셀룰로스, 정제된 셸락, 백색 셸락, 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 RS, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 아세테이트 숙시네이트, 카르복시메틸에틸-셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 메타크릴산 공중합체 L, 메타크릴산 공중합체 LD, 메타크릴산 공중합체 S, 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 E, 또는 폴리비닐 아세탈 디에틸아미노아세테이트를 포함할 수 있다.

수불용성 중합체의 유형, 치환도 및 분자량은 물 또는 알콜 중의 활성 성분의 용해도, 바람직한 지속 방출 수준 등에 의존할 수 있다. 수불용성 중합체는 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 코팅 보조제로서 수소화유, 스테아르산, 또는 세타놀, 및 가소제로서 중쇄 트리글리세리드, 트리아세틴, 트리에틸 시트레이트, 또는 세타놀 등을 추가로 혼입할 수 있다.

일부 실시양태에서, 지속 방출 제제는 매트릭스형 정제 또는 과립이다. 활성 성분은 최대 3종의 상이한 유형의 중합체로 코팅할 수 있다. 중합체 중 이들 3종의 상이한 유형은 하기를 포함할 수 있다: 1) 수불용성 중합체, 예컨대 에틸셀룰로스; 2) pH 독립적 겔화 중합체, 예컨대 히드록시프로필 메틸셀룰로스; 및 3) pH 의존성 겔화 중합체, 예컨대 알긴산나트륨. 이들 3종의 상이한 유형의 중합체를 함께 사용하여 약물의 방출 속도를 약화시킬 수 있다.

투여 형태: 방출 특성

지속-방출 제제는 일정한 정도의 지속 효과를 달성할 수 있다. 그러나, 활성 성분의 노출 및/또는 생체이용률은 각종 인자, 예컨대 예를 들어, 흡수 창, 제제에 사용된 담체 또는 부형제, 제제의 전달 방식, 및/또는 환자의 위장관을 통한 활성 성분의 통과 시간에 기초하여 달라질 수 있다.

요법은 지속-방출 기능을 수행하기 위한 적어도 하나의 지속-방출 부분 및 즉시 방출 기능을 수행하기 위한 하나의 즉시 방출 부분을 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 요법이 단일 투여 형태인 경우, 이는 지속-방출 부분을 구성하는 지속-방출 과립과 즉시-방출 부분을 구성하는 즉시-방출 과립의 혼합물로 형성된 정제, 지속-방출 과립 및 즉시-방출 과립으로 캡슐을 충전함으로써 수득된 캡슐 제제, 또는 즉시-방출 부분을 구성하는 외층이 지속-방출 부분을 구성하는 내부 코어 상에 형성되어 있는 프레스-코팅된 정제의 형태일 수 있다. 그러나, 상기 실시양태에 어떠한 제한도 없다.

게다가, 조성물 또는 즉시-방출 부분 또는 지속-방출 부분에서 약물의 봉입 상태에 대한 어떠한 특별한 제한도 없으며; 화합물은 조성물, 즉시 방출 부분 또는 지속 방출 부분에 균일하게 분산될 수 있거나, 또는 조성물의 단지 일부, 즉시-방출 부분 또는 지속-방출 부분에만 함유될 수 있으나, 농도 구배가 존재하도록 함유될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 지속-방출 부분은 약물 방출을 제어하기 위한 적어도 하나의 비-pH-의존성 중합체 물질 또는 pH-의존성 중합체 물질을 함유할 수 있다.

본원에 사용되는 비-pH-의존성 중합체 물질은 위장관에서 일반적으로 발견되는 pH 조건 하에, 구체적으로 pH 1 내지 pH 8에서 전하 상태가 거의 변화하지 않는 중합체 물질을 포함할 수 있다. 이는, 예를 들어, 아미노 기와 같은 염기성 관능기 또는 카르복실산 기와 같은 산성 관능기와 같은 pH에 따라 전하 상태가 변화하는 관능기를 갖지 않는 중합체 물질을 의미한다. 비-pH-의존성 중합체 물질은 본 발명에 따른 조성물에 지속-방출 기능을 제공하기 위해 포함될 수 있으나, 또 다른 목적을 위해 포함될 수도 있음을 주목한다. 게다가, 본 발명에서 사용되는 비-pH-의존성 중합체 물질은 수불용성일 수 있거나, 물에서 팽윤되거나 물에 용해되어 겔을 형성할 수 있다.

수불용성 비-pH-의존성 중합체 물질의 예는 셀룰로스 에테르, 셀룰로스 에스테르, 및 메타크릴산-아크릴산 공중합체 (상표명 유드라짓(Eudragit), 롬 게엠베하 운트 코. 카게(Rohm GmbH & Co. KG) (독일 다름슈타트)에 의해 제조됨)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예는, 셀룰로스 알킬 에테르 예컨대 에틸셀룰로스 (상표명 에토셀(Ethocel), 다우 케미칼 캄파니(Dow Chemical Company) (미국)에 의해 제조됨), 에틸 메틸셀룰로스, 에틸 프로필셀룰로스 또는 이소프로필셀룰로스, 및 부틸셀룰로스, 셀룰로스 아르알킬 에테르 예컨대 벤질 셀룰로스, 셀룰로스 시아노알킬 에테르 예컨대 시아노에틸셀룰로스, 셀룰로스 유기 산 에스테르 예컨대 셀룰로스 아세테이트 부티레이트, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 프로피오네이트 또는 셀룰로스 부티레이트, 및 셀룰로스 아세테이트 프로피오네이트, 에틸 아크릴레이트-메틸 메타크릴레이트 공중합체 (상표명 유드라짓 NE, 롬 게엠베하 운트 코. 카게 (독일 다름슈타트)에 의해 제조됨), 및 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 RS (상표명 유드라짓 RL, 유드라짓 RS)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서 사용되는 수불용성 중합체의 평균 입경에 대한 어떠한 특별한 제한도 없으나, 통상 이 평균 입경이 작을수록 성능이 더 양호해지며, 평균 입경은 바람직하게는 0.1 내지 100 μm, 보다 바람직하게는 1 내지 50 μm, 특히 바람직하게는 3 내지 15 μm, 가장 바람직하게는 5 내지 15 μm이다. 게다가, 수용성 또는 수-팽윤성 비-pH-의존성 중합체 물질의 예는 폴리에틸렌 옥시드 (상표명 폴리옥스(Polyox), 다우 케미칼 캄파니에 의해 제조됨, 분자량 100,000 내지 7,000,000), 저치환 히드록시프로필 셀룰로스 (상표명 L-HPC, 신-에쓰 케미칼(Shin-Etsu Chemical) (일본)에 의해 제조됨), 히드록시프로필 셀룰로스 (상표명 HPC, 닛폰 소다 가부시키가이샤 (Nippon Soda, Co., Ltd) (일본)에 의해 제조됨), 히드록시프로필 메틸셀룰로스 (상표명 메토로스(Metolose) 60SH, 65SH, 90SH, 신-에쓰 케미칼 (일본)에 의해 제조됨), 및 메틸셀룰로스 (상표명 메토로스 SM, 신-에쓰 케미칼 (일본)에 의해 제조됨)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

일부 실시양태에서 단일 비-pH-의존성 중합체 물질이 조성물에 함유될 수 있거나, 복수개의 비-pH-의존성 중합체 물질이 함유될 수 있다. 비-pH-의존성 중합체 물질은, 본원에 보고된 실시양태에서 사용되는 경우, 수불용성 중합체 물질, 보다 바람직하게는 에틸셀룰로스, 에틸 아크릴레이트-메틸 메타크릴레이트 공중합체 (상표명 유드라짓 NE), 또는 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 RS (상표명 유드라짓 RL, 유드라짓 RS)일 수 있다. 특히 바람직하게는 에틸셀룰로스 및 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체 RS 중 적어도 하나이다. 가장 바람직하게는 에틸셀룰로스이다. 조성물에 함유되는 비-pH-의존성 중합체 물질의 양에 대한 어떠한 특별한 제한도 없으며; 이 양은 예컨대 지속적인 약물 방출을 제어하는 목적에 따라 적절하게 조정될 수 있다.

본원에서 보고된 실시양태에서 사용될 수 있는 pH-의존성 중합체 물질은 위장관에서 일반적으로 발견되는 pH 조건 하에, 구체적으로 pH 1 내지 pH 8에서 전하 상태가 변화하는 중합체 물질일 수 있다. 이는, 예를 들어, 아미노 기와 같은 염기성 관능기 또는 카르복실산 기와 같은 산성 관능기와 같은 pH에 따라 전하 상태가 변화하는 관능기를 갖는 중합체 물질을 의미한다. pH-의존성 중합체 물질의 pH-의존성 관능기는 바람직하게는 산성 관능기이며, pH-의존성 중합체 물질은 가장 바람직하게는 카르복실산 기를 갖는다.

본 발명에서 사용되는 pH-의존성 중합체 물질은 수불용성일 수 있거나, 물에 팽윤하거나 물에 용해되어 겔을 형성할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 pH-의존성 중합체 물질의 예는 장용성 중합체 물질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 장용성 중합체 물질의 예는 메타크릴산-메틸 메타크릴레이트 공중합체 (유드라짓 L100, 유드라짓 S100, 롬 게엠베하 운트 코. 카게 (독일 다름슈타트)에 의해 제조됨), 메타크릴산-에틸 아크릴레이트 공중합체 (유드라짓 L100-55, 유드라짓 L30D-55, 롬 게엠베하 운트 코. 카게 (독일 다름슈타트)에 의해 제조됨), 히드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트 (HP-55, HP-50, 신-에쓰 케미칼 (일본)에 의해 제조됨), 히드록시프로필 메틸셀룰로스 아세테이트 숙시네이트 (AQOAT, 신-에쓰 케미칼 (일본)에 의해 제조됨), 카르복시메틸 에틸셀룰로스 (CMEC, 프로인트 코포레이션(Freund Corporation) (일본)에 의해 제조됨), 및 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

물에 팽윤하거나 물에 용해되어 겔을 형성하는 pH-의존성 중합체 물질의 예는, 알긴산, 펙틴, 카르복시비닐 중합체, 및 카르복시메틸 셀룰로스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서, 단일 pH-의존성 중합체 물질이 조성물에 함유될 수 있거나, 복수개의 pH-의존성 중합체 물질이 함유될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 pH-의존성 중합체 물질은 바람직하게는 장용성 중합체 물질, 보다 바람직하게는 메타크릴산-에틸 아크릴레이트 공중합체, 메타크릴산-메틸 메타크릴레이트 공중합체, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트, 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스 아세테이트 숙시네이트, 특히 바람직하게는 메타크릴산-에틸 아크릴레이트 공중합체이다.

본 발명에 따른 조성물의 제조 공정에서 pH-의존성 중합체 물질을 사용하는 경우, pH-의존성 중합체 물질이 미리 용매에 분산되어 있는 분말 유형 또는 과립 유형, 또는 현탁액형의 시판품을 그대로 사용할 수 있거나, 이러한 시판품을 물 또는 유기 용매에 분산시켜 사용할 수 있다. pH-의존성 중합체 물질의 입경이 작을수록 성능이 더 양호해지며, pH-의존성 중합체 물질은 바람직하게는 분말 유형이다. 메타크릴산-에틸 아크릴레이트 공중합체의 경우에, 예는 유드라짓 L100-55이다. 본 발명에서 사용되는 pH-의존성 중합체 물질의 평균 입경에 대한 어떠한 특별한 제한도 없으나, 평균 입경은 바람직하게는 0.05 내지 100 μm, 보다 바람직하게는 0.05 내지 70 μm, 가장 바람직하게는 0.05 내지 50 μm이다. 게다가, pH-의존성 중합체 물질의 양에 대한 어떠한 특별한 제한도 없으며, 예를 들어, 장용성 중합체 물질의 경우에, 양은 조성물의 100 중량부를 기준으로 하여, 일반적으로 0.1 내지 90 중량부, 바람직하게는 1 내지 70 중량부, 보다 바람직하게는 5 내지 60 중량부, 특히 바람직하게는 10 내지 50 중량부이다.

본원에 보고된 실시양태에 따른 요법은, 필요한 경우, 다양한 첨가제 중 어느 하나, 예컨대 다양한 제약상 허용되는 담체 중 어느 하나, 예컨대 희석제, 윤활제, 결합제 및 붕해제, 뿐만 아니라 보존제, 착색제, 감미제, 가소제, 필름 코팅제 등을 추가로 함유할 수 있다. 희석제의 예는, 락토스, 만니톨, 이염기성 인산칼슘, 전분, 예비젤라틴화 전분, 결정질 셀룰로스, 경질 규산 무수물, 합성 규산 알루미늄, 마그네슘 알루미네이트 메타실리케이트 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 윤활제의 예는 스테아르산마스네슘, 스테아르산칼슘, 활석, 소듐 스테아릴 푸마레이트 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 결합제의 예는, 히드록시프로필 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 붕해제의 예는, 카르복시메틸 셀룰로스, 칼슘 카르복시메틸 셀룰로스, 크로스카르멜로스 소듐, 소듐 카르복시메틸 전분, 저치환 히드록시프로필 셀룰로스 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 보존제의 예는, 파라옥시벤조산 에스테르, 클로로부탄올, 벤질 알콜, 펜에틸 알콜, 데히드로아세트산, 소르브산 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 착색제의 바람직한 예는, 수불용성 레이크 안료, 천연 안료 (예를 들어, .베타.-카로틴, 클로로필, 적색 산화제2철), 황색 산화제2철, 적색 산화제2철, 흑색 산화제2철 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 감미제의 바람직한 예는, 소듐 사카린, 디포타슘 글리시리제이트, 아스파르탐, 스테비아 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 가소제의 예는, 글리세롤 지방산 에스테르, 트리에틸 시트레이트, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 필름 코팅제의 예는, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

제조 방법

본원에 보고된 바와 같은 실시양태를 제조하기 위해, 단일의 통상적인 방법, 또는 통상적인 방법의 조합이 사용될 수 있다. 예를 들어, 지속-방출 부분 또는 즉시-방출 부분으로서 약물-함유 과립을 제조하는 경우에, 과립화가 주된 조작이나, 이는 다른 조작 예컨대 혼합, 건조, 체질, 및 분류와 조합될 수 있다. 과립화 방법으로서, 예를 들어, 분말에 결합제 및 용매를 첨가하고 과립화를 수행하는 습식 과립화 방법, 분말을 압축하고 과립화를 수행하는 건식 과립화 방법, 가열시에 용융하는 결합제를 첨가하고 가열 및 과립화를 수행하는 용융 과립화 방법 등을 사용할 수 있다.

게다가, 과립화 방법에 따라, 조작 방법 예컨대 플래너터리 믹서, 스크류 믹서 등을 사용하는 혼합 과립화 방법, 헨쉘 믹서, 슈퍼 믹서 등을 사용하는 고속 혼합 과립화 방법, 원통형 과립화기, 회전식 과립화기, 스크류 압출 과립화기, 펠릿 밀 유형 과립화기 등을 사용하는 압출 과립화 방법, 습식 고전단 과립화 방법, 유동층 과립화 방법, 압축 과립화 방법, 분쇄 과립화 방법, 또는 분무 과립화 방법을 사용할 수 있다. 과립화 후에, 건조기, 유동층 등을 사용하는 건조, 균열 및 체질을 수행하여 과립 또는 미세 과립을 수득하여 사용할 수 있다. 게다가, 과립화 용매는 본 발명에 따른 조성물을 제조할 때 사용될 수 있다. 이러한 과립화 용매에 대한 어떠한 특별한 제한도 없으며, 이는 물이거나 다양한 유기 용매, 예를 들어, 물, 저급 알콜 예컨대 메탄올 또는 에탄올, 케톤 예컨대 아세톤 또는 메틸 에틸 케톤, 메틸렌 클로라이드, 또는 그의 혼합물 중 어느 하나일 수 있다.

실시양태에 함유된 지속-방출 과립의 경우, 적어도 1종의 약물 및 비-pH-의존성 중합체 물질 및 pH-의존성 중합체 물질로부터 선택된 적어도 1종을 함께 혼합하고, 필요에 따라 희석제 및 결합제를 첨가하고, 과립화를 수행하여 입상물을 수득한다. 수득된 입상물을 트레이 건조기, 유동층 건조기 등을 사용하여 건조시키고, 밀 또는 오실레이터를 사용하여 체질을 수행함으로써, 지속-방출 과립을 수득할 수 있다. 대안적으로, 본 발명에서 지속-방출 과립을 제조하는 방법으로서, 적어도 1종의 약물, 비-pH-의존성 중합체 물질 및 pH-의존성 중합체 물질로부터 선택된 적어도 1종, 및 필요에 따라 희석제 및 결합제를 건식 콤팩터 예컨대 롤러 콤팩터 또는 슬러그 타정기를 사용하여 첨가하고, 혼합하면서 압축-성형을 수행한 다음, 적절한 크기로 분쇄함으로써 과립화를 수행하는 것이 가능하다. 이러한 과립화기를 사용하여 제조된 입상물은 본 발명에 따른 과립 또는 미세 과립으로서 그대로 사용할 수 있거나, 파워 밀, 롤 과립화기, 로터 스피드 밀 등을 사용하여 추가로 분쇄되고, 체질되어 지속-방출 과립을 수득할 수 있다. 즉시-방출 과립은 지속-방출 과립에 대해서도 또한 제조할 수 있음에 유의한다.

압축 성형품은 약물-함유 지속-방출 부분 또는 즉시-방출 부분으로서, 또는 단일의 통상적인 방법 또는 통상적인 방법의 조합을 사용하는 본원에 보고된 조성물로서 제조될 수 있다. 예를 들어, 적어도 1종의 약물, 비-pH-의존성 중합체 물질 및 pH-의존성 중합체 물질로부터 선택된 적어도 1종, 희석제 예컨대 만니톨 또는 락토스, 결합제 예컨대 폴리비닐피롤리돈 또는 결정질 셀룰로스, 붕해제 예컨대 카르멜로스 소듐 또는 크로스포비돈, 및 윤활제 예컨대 스테아르산마그네슘 또는 활석을 사용하고, 통상의 방법을 사용하여 타정을 수행함으로써, 압축 성형품을 수득할 수 있다. 이 경우에, 타정이 압축-성형품의 제조 방법에서의 주된 조작이나, 이는 다른 조작, 예컨대 혼합, 건조, 당 코팅 형성, 및 코팅과 조합될 수 있다.

타정 방법의 예는, 적어도 1종의 약물과 약리학상 허용되는 첨가제를 함께 혼합한 다음에, 혼합물을 타정기를 사용하여 정제를 직접 압축-성형하는 직접 압축 성형, 및 필요에 따라 윤활제 또는 붕해제를 첨가한 후 본 발명에 따른 지속-방출 과립 또는 즉시-방출 과립을 압축-성형에 적용하는 건식 과립 압축 또는 습식 과립 압축을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 압축 성형에 사용되는 타정기에 대한 어떠한 특별한 제한도 없으며; 예를 들어 단일-펀치 타정기, 회전식 타정기, 또는 프레스-코팅 타정기를 사용할 수 있다.

본원에 실시양태에 따른 약물-함유 지속-방출 과립 또는 즉시-방출 과립, 또는 압축-성형품은 조성물로서 과립 또는 정제의 형태로 그대로 사용할 수 있으나, 추가 가공에 또한 적용시켜 조성물을 제조할 수 있다. 예를 들어, 압축 성형품 또는 과립에 필름 기재 물질 예컨대 에틸셀룰로스, 카세인, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 메타크릴산 공중합체 L, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 셸락 등을 사용하여 필름 코팅이 제공될 수 있거나, 사카로스, 당 알콜, 아라비아 검 분말, 활석 등을 함유하는 당 코팅 액체를 사용하여 당 코팅이 제공될 수 있어, 필름-코팅 정제 또는 당-코팅 정제를 제조한다. 이 코팅 기술에서의 한 용매는 정제수일 수 있으나, 유기 용매 예컨대 알콜, 케톤, 에테르 또는 염소화 탄화수소, 또는 그의 혼합물을 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 에탄올, 아세톤, 메틸렌 클로라이드 등을 유기 용매로서 사용할 수 있다. 게다가, 코팅 장치로서, 의약을 제조하기 위한 코팅 기술에서 통상적으로 사용되는 장치를 사용할 수 있으며, 예는 코팅액 등을 분무함으로써 코팅이 수행되는 분무 코팅 장치, 및 층화용 로터 유동층 과립화기를 포함한다.

캡슐 제제를 제조하는 경우에, 캡슐 제제는 자동 캡슐 충전기를 사용하여 경질 젤라틴 캡슐 또는 HPMC 캡슐에 미니-정제, 또는 상기한 바와 같이 지속-방출 과립 또는 즉시-방출 과립을 충전함으로써 제조할 수 있다. 대안적으로, 복용시 물 등과 혼합되어 사용되는 건조 시럽 또는 튜브당 투여를 위한 제제의 경우에, 상기와 같은 지속-방출 과립 또는 즉시-방출 과립을 증점제 또는 분산제와 혼합시켜 이들 과립을 분산시키도록 할 수 있고, 그 다음에 혼합물을 과립 또는 정제로 만든다. 더욱이, 물, 및 분산제, 유화제, 증점제, 보존제, pH 조정제, 감미제, 향미제, 향료 등으로부터 선택된 물질을 사용하여 액체 또는 젤리를 제조할 수 있다. 그러나, 다른 제조 방법에 관해서, 상기에 어떠한 제한도 없다.

본원에 기재된 실시양태가 보다 완전하게 이해될 수 있도록, 하기 실시예가 제시된다. 이들 실시예는 단지 예시적 목적을 위한 것이고 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되는 것으로 이해되어야 한다.

실시예

하기 약어는 실시예 전반에 걸쳐 사용될 수 있다.

All: 알릴

DMT: 4,4'-디메톡시트리틸

(DMTO-:

)

Bz: 벤조일

휘니그 염기: i-Pr₂NEt (디이소프로필에틸아민)

AllylOH: 알릴 알콜

OAll: -OCH₂CHCH₂

ACN: 아세토니트릴

All: -CH₂CHCH₂

2-NitroBnBr: 2-니트로벤질 브로마이드

Bz: 벤조일

i-Pr: 이소프로필

CE: 시아노에틸

(-OCE:

)

DEAD: 디에틸 아조디카르복실레이트

DIAD: 디이소프로필 아조디카르복실레이트

DCM: 디클로로메탄

DDTT: N,N-디메틸-N'-(3-티옥소-3H-1,2,4-디티아졸-5-일)포름이미드아미드

DMOCP: 2-클로로-5,5-디메틸-1,3,2-디옥사포스피난 2-옥시드

TBS: t-부틸디메틸실릴

3H-벤조[c][1,2]디티올-3-온:

실시예 1 -- 화합물 1a의 합성

이 합성의 전체 반응식은 도 1에서 이용가능하다.

단계 A

THF (1.1L) 중 (2R,3R,4R,5R)-5-(6-벤즈아미도-9H-퓨린-9-일)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-4-플루오로테트라히드로푸란-3-일 (2-시아노에틸) 디이소프로필포스포르아미다이트 (화합물 100) (인 부분입체이성질체의 혼합물; 80.0 g, 91.332 mmol, 1 당량, 켐진스 코포레이션(ChemGenes Corporation) 카탈로그 # ANP-9151), 알릴 알콜 (9.63 ml, 142 mmol, 1.55 당량) 및 트리페닐포스핀 (38.3 g, 146 mmol, 1.60 당량)의 혼합물에 주위 온도에서 DEAD (톨루엔 중 40 wt% 용액; 54.2 ml, 137 mmol, 1.5 당량)을 첨가하였다. 교반을 주위 온도에서 계속하고, 반응을 LC/MS에 의해 모니터링하였다. 완결 시 (19 h), 혼합물을 진공 (35℃) 하에 농축시키고, 생성된 혼합물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (800 g x 2개의 칼럼, 0.5% 트리에틸아민에 의해 완충된 n-헵탄 중 40에서 60% EtOAc)에 의해 정제하여 화합물 101을 백색 발포체 (84.2 g, 정량적 수율, 인 부분입체이성질체의 혼합물)로서 수득하였다.

¹H NMR (인 부분입체이성질체의 3:2 혼합물, 400 MHz, CDCl₃) δ 1.14 - 1.21 (m, 12 H) 2.40 (t, J=6.2 Hz, 1.2 H) 2.59 (t, J=6.2 Hz, 0.8 H) 3.27 (d, J=8.6 Hz, 1 H) 3.52 - 3.66 (m, 5 H) 3.78 (s 2.4 H) 3.79 (s 3.6 H) 4.28 - 4.34 (m, 1 H) 4.84 - 4.96 (m, 0.4 H) 4.99 (d, J=5.5 Hz, 2 H) 4.95 - 5.10 (m, 0.6 H) 5.05 (d, J=10.9 Hz, 1 H) 5.22 (br d, J=17.6 Hz, 1 H) 5.64 (br d, J=53.2 Hz, 0.6 H) 5.70 (br d, J=51.6 Hz, 0.4 H) 5.96 - 6.75 (m, 1 H) 6.20 (d, J=16.0 Hz, 0.6 H) 6.24 (d, J=17.2Hz, 0.4 H) 6.74 - 6.79 (m, 4 H) 7.02 - 7.06 (m, 2H) 7.17 - 7.24 (m, 8 H) 7.32 - 7.34 (m, 2 H) 7.41 - 7.44 (m, 2 H) 8.11 (s, 1H) 8.52 (s, 0.4 H) 8.54 (s, 0.6 H).

단계 B

아세토니트릴 (30 ml) 중 화합물 101 (3.00 g, 3.28 mmol, 1 당량)의 용액에 물 (0.118 ml, 6.55 mmol, 2.0 당량) 및 피리딘 트리플루오로아세테이트 염 (0.759 g, 3.93 mmol, 1.2 당량)을 첨가하였다. 주위 온도에서 1분 동안 교반한 후, tert-부틸아민 (14.5 g, 21.0 ml, 0.20 mol, 60 당량)을 첨가하였다. 시아노에틸 기의 완전한 분해 시 (LC/MS에 의해 모니터링함), 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 아세토니트릴과 2회 공비혼합하였다. 조 혼합물을 DCM (45.0 ml) 중에 용해시키고, 주위 온도에서 물 (0.118 ml, 6.55 mmol, 2.0 당량) 및 NaHSO₄-SiO₂ (1.18 g, 6.55 mmol, 2 당량)로 처리하였다. DMT 기의 완전한 분해 시 (LC/MS에 의해 모니터링함, 대략 1시간), 반응 혼합물을 여과하고 DCM/MeOH (9/1, 20 ml)로 2회 세정하였다. 합한 여과물을 진공 하에 농축시키고, n-헵탄/톨루엔 (~30 ml)의 1:1 혼합물로 처리하였다. 상부 층을 경사분리에 의해 제거하였다. 동일한 작업을 n-헵탄/톨루엔 (1/1, 30 ml)을 사용하여 1회 더 반복하고, 하부 층을 아세토니트릴과 2회 공비혼합하여 화합물 102 (100% 이론적 수율이 가정됨)를 수득하였다. 생성물을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.

단계 C

아세토니트릴 (30 ml) 중 화합물 102 (1.56 g, 3.27 mmol, 1 당량) 및 화합물 101 (3.00 g, 3.28 mmol, 1 당량)의 혼합물에 피리딘 트리플루오로아세테이트 염 (피리딘과 공비 건조됨; 0.760 g, 3.94 mmol, 1.25 eq)을 첨가하였다. 5분 후, DDTT (0.840 g, 4.09 mmol, 1.30 당량, 켐진스 코포레이션(ChemGenes Corporation) 카탈로그 # RN-1588)을 첨가하고, 완전한 황화 시 (LC/MS에 의해 모니터링함), 반응 혼합물을 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 DCM (30 ml) 중에 용해시키고, DCM (30 ml) 중 물 (0.57 ml, 32 mmol, 10 당량) 및 6% 디클로로아세트산 (1.56 ml, 18.9 mmol, 6.0 당량)으로 처리하였다. 20분 후, 반응물을 피리딘 (20 ml)으로 켄칭하고, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 피리딘과 공비혼합하여 화합물 103 (3.22 g, 100% 이론적 수율이 가정됨)을 수득하였다. 생성물을 다음에 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.

단계 D

피리딘 (100 ml) 중 화합물 103 (3.22 g, 3.15 mmol, 1 당량)의 용액에 주위 온도에서 DMOCP (1.45 g, 7.88 mmol, 2.50 당량)를 첨가하였다. 완전한 마크로고리화 시 (LC/MS에 의해 모니터링함), 물 (1.7 ml, 94.5 mmol, DMOCP에 대해 x10배)을 첨가한 다음, 3H-벤조[c][1,2]디티올-3-온 (0.795 g, 4.73 mmol, 1.5 당량)을 첨가하였다. 완전한 황화 시 (대략 40분), 반응 혼합물을 진공 하에 대략 15 ml로 부분적으로 농축시키고, 포화 수성 NaHCO₃ (50 ml) 및 물의 혼합물 (30 ml)에 부었다. 주위 온도에서 10분 교반한 후, 혼합물을 EtOAc/MTBE (60 ml x 3회)의 1:1 혼합물로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 염수 (25 ml)로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (DCM 중 0-20% MeOH)에 의해 정제하여 화합물 104 (3.31 g, 3.20 mmol, 100% 이론적 수율이 가정됨)를 갈색 오일로서 수득하였다. 생성물을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.

단계 E

아세토니트릴 (66.2 ml) 중 화합물 104 (3.31 g, 3.20 mmol, 1 당량)의 용액에 2-니트로벤질 브로마이드 (2.42 g, 11.2 mmol, 3.50 당량) 및 트리에틸아민 (1.78 ml, 12.8 mmol, 4.00 당량)을 첨가하였다. 완전한 반응 시 (LC/MS에 의해 모니터링함, 주위 온도에서 대략 20시간 동안), 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (60% 에틸 아세테이트/n-헵탄에서 100% 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 0.568 g 생성물을 인 부분입체이성질체의 혼합물로서 수득하였다. 부분입체이성질체의 정제용 HPLC 분리에 의해 화합물 105 (SR 이성질체; 0.225 g, 0.180 mmol, 화합물 101로부터의 5.6% 총 수율) 및 화합물 106 (RR 이성질체; 0.187 g, 0.149 mmol, 화합물 1로부터의 4.7% 총 수율)을 수득하였다.

화합물 105 (SpRp)

¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) δ = 8.63 (s, 1H), δ = 8.61 (s, 1H), 8.04 - 8.00 (m, 2H), 7.99 (s, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.65 - 7.44 (m, 8H), 7.40 - 7.31 (m, 4H), 7.25 - 7.21 (m, 4H), 6.15 - 5.89 (m, 5H), 5.61 (dd, J = 52.0, 5.1 Hz, 1H), 5.55 (ddd, J = 51.2, 4.7, 2.7 Hz, 1H) 5.51 - 5.42 (m, 1H), 5.31 - 5.22 (m, 2H), 5.11 (dd, J = 3.9, 9.8 Hz, 2H), 5.04 - 4.95 (m, 4H), 4.55 - 4.37 (m, 7H), 4.29 - 4.12 (m, 3H)

화합물 106 (RpRp)

¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) δ = 8.65 (s, 2H), 8.06 (dd, J = 1.4, 8.0 Hz, 2H), 7.98 (s, 2H), 7.57 - 7.52 (m, 6H), 7.47 - 7.32 (m, 6H), 7.25 - 7.21 (m, 4H), 6.15 (d, J = 18.7 Hz, 2H), 6.09 - 5.99 (m, 2H), 5.82-5.76 (m, 2H), 5.60 (dd, J = 51.8, 4.9 Hz, 2H), 5.27 (dd, J = 1.2, 17.2 Hz, 2H), 5.12 (dd, J = 1.0, 10.4 Hz, 2H), 5.06 - 4.96 (m, 4H), 4.55 - 4.40 (m, 4H), 4.36 - 4.24 (m, 4H), 4.21 - 4.02 (m, 2H)

정제용 HPLC 조건:

단계 F

톨루엔 (519 ml) 중 화합물 105 (519 mg, 0.414 mmol, 1 당량)의 가열된 (90℃) 용액에 호베이다-그럽스 촉매™ 2 세대 ((1,3-비스-(2,4,6-트리메틸페닐)-2-이미다졸리디닐리덴)디클로로(o-이소프로폭시페닐메틸렌)루테늄; 시그마-알드리치(SIGMA-ALDRITCH)® 카탈로그 번호 569755에서 입수가능함; CAS 301224-40-8; 91 mg, 0.15 mmol, 0.35 당량) 및 퀴논 (0.102 ml, 1.243 mmol, 3.0 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 환류 하에 가열하고, 반응 진전을 LC/MS에 의해 모니터링하였다. 3시간 후, 추가의 촉매를 첨가 (91 mg, 0.15 mmol, 0.35 당량)하고, 반응물을 추가로 3시간 동안 계속하였다. 냉각시킨 후, 혼합물을 DMSO (0.59 ml, 8.3 mmol, 20 당량)에 의해 주위 온도에서 15시간 동안 처리하고, 진공 하에 농축시키고, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (SiO₂ 25g, n-헵탄 중 66% 에틸 아세테이트에서 100% 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 화합물 107 (200 mg, 0.163 mmol, 39% 수율)을 갈색 건조 발포체로서 수득하였다.

¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) δ = 8.19 (s, 1H), 8.12 (dd, J = 7.8 Hz, 1.9 Hz, 1H), 8.10 (s, 1H), 8.02 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.63 (br d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.53 - 7.41 (m, 10H), 7.35 - 7.30 (m, 2H), 7.25 - 7.20 (m, 4H), 6.23 (d, J = 17.6 Hz, 1H), 6.14 (d, J = 18.8 Hz, 1H), 5.86 - 5.75 (m, 1H), 5.75 (dt, J = 15.3, 5.0 Hz, 1H), 5.67 (dt, J = 15.3, 4.7 Hz, 1H), 5.60 (dd, J = 52.0, 3.9 Hz. 1H), 5.48 (dd, J = 50.4, 3.9 Hz. 1H)₅.50 - 5.39 (m, 1H), 4.91 - 4.64 (m, 4H), 4.57 - 4.25 (m, 9H), 4.15 (d, J = 7.03 Hz, 1H), 4.11 (d, J = 7.03 Hz, 1H).

단계 G

1,4-디옥산 (1.76 ml) 중 화합물 107 (88 mg, 0.072 mmol, 1당량)의 용액에 티오페놀 (0.88 mL, 8.55 mmol, 119 당량) 및 트리에틸아민 (0.88 mL, 6.31 mmol, 88 당량)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 주위 온도에서 교반하였다. 완전한 반응 시 (LC/MS에 의해 모니터링함, 13시간), 메탄올 (5.28 ml) 및 28% 수산화암모늄 (3.52 ml)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 50℃로 가열하였다. 완전한 반응 시 (LC/MS에 의해 모니터링함, 5시간), 혼합물을 주위 온도로 냉각시키고, 생성된 갈색빛 슬러리를 여과하고, 물 (15 ml)로 세정하였다. 여과물을 다시 여과하여 추가의 고체를 제거하였다. 최종 여과물을 톨루엔 및 헵탄 (30 ml)의 1:1 혼합물로 2회 추출하였다. 수성 층을 진공 하에 농축시킨 다음, 물 (6 ml) 중에 재현탁시켰다. 생성된 고체를 여과하고, 여과물을 정제용 HPLC로 처리하여 화합물 1 디암모늄 염 (화합물 1a로도 지칭됨) (39 mg, 0.050 mmol, 70% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.

화합물 1a (SpRp, 트랜스)

¹H NMR(400 MHz, CD₃OD) δ = 9.05 (s, 1H), 8.33 (s, 1H), 8.25 (s, 1H), 8.12 (s, 1H), 6.34 (br s, 2H), 5.88 (br s, 2H), 5.66 (br d, J = 51.6 Hz, 1H), 5.59 (br d, J = 52.2 Hz, 1H) 5.01 (br s, 2H), 4.68 - 4.34 (m, 6H), 4.07 - 3.82 (m, 2H), 3.79 - 3.55 (m, 2H);

³¹P NMR (162 MHz, CD₃OD) δ = 55.48 (s, 1P), 55.16 (s, 1P).

화합물 1a 정제용 HPLC 조건:

화합물 1a에 대한 실시예 1.1 -- 대안적 합성

화합물 1a에 대한 대안적 합성 경로는 도 2a 및 도 2b에, 뿐만 아니라 도 2c에 제시되고, 하기 보고된다.

단계 1

화합물 129 (570 g, 1.53 mol, 1 wt, 1 vol, 1 당량)를 피리딘 (2.85 L, 35.2 mol, 4.89 wt, 5.0 vols, 23 당량) 중에 용해시켰다. 혼합물을 2.6℃로 냉각시키고, 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드 (DMTCl; 543 g, 1.60 mol, 0.953 wt, 1.05 당량)로 처리하였다. 혼합물을 0 내지 5℃에서 2시간 동안 교반한 다음, 주위 온도로 가온되도록 하였다. 반응을 LC/MS에 의해 모니터링하고, 완전한 전환을 밤새 교반 후에 확인하였다. 반응 혼합물을 5℃ 미만으로 냉각시키고, 15분에 동안 MeOH (124 ml, 3.05 mol, 0.172 wt, 0.217 vol, 2.0 당량)로 처리하여 켄칭하였다. 혼합물을 진공 하에 톨루엔 (2.00 L, 3.04 wt, 3.51 vol)으로 공증발시킨 다음, EtOAc (2.850 L, 4.5 wt, 5.0 vol) 및 n-헵탄 (2.85 L, 3.42 wt, 5.0 vol)의 혼합물로 희석하였다. 유기 층을 포화 NaHCO₃ (물 중 9 wt% 용액; 2.0 L, 3.5 vol)로 세척하였다. 추가의 EtOAc (2.85 L, 4.5 wt, 5.0 vol)를 첨가하여 조 생성물을 완전히 용해시켰다. 5분 동안 교반한 후, 2개의 층을 분리하였다. 유기 층을 물 (2.0 L, 3.5 wt, 3.5 vol)로 세척하였다. 고체를 유기 층으로부터 천천히 침전시키기 시작하였다. 수층을 분리하였다. 이어서, 유기 층을 대략 1 vol으로 농축시켰다. 조 생성물을 n-헵탄 (2.00 L, 2.40 wt, 3.51 vol) 및 톨루엔 (0.50 L, 0.76 wt, 0.88 vol)의 혼합물로 슬러리로 만들었다. 15분 동안 교반한 후, 연황색 고체를 진공 여과에 의해 수집하였다. 필터 케이크를 순차적으로 하기와 같이 세척하였다: (1) n-헵탄 (0.60 L, 0.72 wt, 1.05 vol) 및 톨루엔 (0.30 L, 0.46 wt, 0.53 vol)의 혼합물에 이어서 (2) n-헵탄 (3.00 L, 3.6 wt, 5.26 vol). 고체의 혼합물을 열 없이 30분 동안 건조시킨 다음, 트레이로 옮겨 진공 오븐에서 50℃에서 밤새 건조시켜 화합물 130 (996.7 g, 1.47 mol, 1.75 wt, 97% 수율)을 연황색 고체로서 수득하였다.

¹H NMR(400 MHz, 클로로포름-d) δ = 8.99 (s, 1H), 8.76 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 8.04 - 8.00 (m, 2H), 7.64 - 7.59 (m, 1H), 7.57 - 7.50 (m, 2H), 7.41 - 7.36 (m, 2H), 7.32 - 7.15 (m, 7H), 6.83 - 6.76 (m, 4H), 6.31 (dd, J = 2.5, 17.0 Hz, 1H), 5.68 (ddd, J = 2.3, 4.7, 52.7 Hz, 1H), 4.88 - 4.77 (m, 1H), 4.26 - 4.21 (m, 1H), 3.77 (s, 6H), 3.57 (dd, J = 3.1, 10.9 Hz, 1H), 3.43 (dd, J = 4.1, 10.7 Hz, 1H), 2.60 (br s, 1H)

단계 1'

화합물 129 (430 g, 1.15 mol, 1 wt, 1 vol, 1 당량) 및 이미다졸 (118 g, 1.73 mol, 0.274 wt, 1.50 당량)을 DMF (1.72 L, 3.78 wt, 4.0 vol) 중에 용해시키고, 생성된 혼합물을 5℃로 냉각시켰다. TBS-Cl (191 g, 1.27 mol, 0.444 wt, 1.10 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 0 내지 11℃에서 2시간 동안 교반하고, 천천히 주위 온도로 가온되도록 하였다 (진전은 LCMS에 의해 모니터링함). 반응을 TBS-Cl 첨가 후 6시간에 완결하고, 여전히 주위 온도에서 추가로 20시간 동안 교반되도록 하였다. 혼합물을 2℃로 냉각시키고, 메탄올 (93 ml, 74 g, 2.3 mol, 0.17 wt, 0.22 wt, 2.0 당량)로 10분 동안 처리하였다. 반응 혼합물을 MTBE (1.72 L, 1.23 kg, 2.96 wt, 4.0 vol) 및 EtOAc (1.72 L, 1.55 kg, 3.60 wt, 4.0 vol)의 혼합물로 희석한 다음, 포화 NH₄Cl (물 중 28 wt% 용액; 2.15 L, 5.0 vol)으로 희석하였다. 고체가 용액으로부터 천천히 침전하기 시작하였다. 혼합물을 24℃로 가온되도록 하고, 물 (1.08 L, 1.08 kg, 2.5 wt, 2.5 vol)을 첨가하였다 (T-내부 = 22℃). 추가의 고체가 혼합물로부터 침전하기 시작하였다. 추가의 물 (1.08 L, 1.08 kg, 2.5 wt, 2.5 vol) 및 MTBE (1.40 L, 1.04 kg, 2.4 wt, 3.3 vol)를 혼합물에 첨가하였다. 회백색 고체를 진공 여과에 의해 수집하였다. 반응기를 물 (320 ml, 0.74 vol)에 이어서 MTBE (1.80 L, 1.33 kg, 3.10 wt, 4.19 vol)로 세정하여 임의의 나머지 고체를 필터에 옮겼다. 필터 케이크를 순차적으로 하기와 같이 세정하였다: (1) 물 (1.80 L, 1.80 kg, 4.2 wt, 4.2 vol), (2) 물 (1.80 L, 1.80 kg, 4.2 wt, 4.2 vol), (3) MTBE (0.90 L, 0.67 kg, 1.5 wt, 2.1 vol) 및 n-헵탄 (0.90 L, 0.62 kg, 1.4 wt, 2.1 vol)의 혼합물, (4) MTBE (0.90 L, 0.67 kg, 1.5 wt, 2.1 vol) 및 n-헵탄 (0.90 L, 0.62 kg, 1.4 wt, 2.1 vol)의 혼합물. 회수된 고체를 진공 하에 40℃에서 2일에 걸쳐 건조시켜 화합물 133을 백색 고체 (483 g, 0.991 mol, 1.12 wt, 86% 수율)로서 수득하였다.

¹H NMR(400 MHz, 클로로포름-d) δ = 8.97 (s, 1H), 8.82 (s, 1H), 8.36 (s, 1H), 8.04 - 8.00 (m, 2H), 7.64 - 7.58 (m, 1H), 7.56 - 7.51 (m, 2H), 6.40 (dd, J = 2.3, 16.0 Hz, 1H), 5.45 (ddd, J = 2.7, 4.3, 53.1 Hz, 1H), 4.75 - 4.66 (m, 1H), 4.22 - 4.17 (m, 1H), 4.07 (dd, J = 2.3, 11.7 Hz, 1H), 3.91 (dd, J = 2.7, 11.7 Hz, 1H), 2.38 (dd, J = 2.7, 7.0 Hz, 1H), 0.92 (s, 9H), 0.11 (s, 3H), 0.11 (s, 3H).

단계 2

화합물 130 (993 g, 1.47 mol, 1 wt, 1 vol, 1 당량) 및 이미다졸 (150 g, 2.20 mol, 0.151 wt, 1.5 당량)을 DMF (3.48 L, 3.28 kg, 3.3 wt, 3.5 vol) 중에 용해시키고, 혼합물을 5℃로 냉각시켰다. TBS-Cl (244 g, 1.62 mol, 0.245 wt, 1.10 당량)을 첨가하였다. 반응물을 0 내지 5℃에서 2시간 동안 교반하고, 천천히 주위 온도로 가온시키고, LCMS에 의해 모니터링하였다. 17시간 후, 추가의 이미다졸 (100 g, 1.47 mol, 0.10 wt, 1.0 당량) 및 TBS-Cl (111 g, 735 mmol, 0.112 wt, 0.50 당량)을 첨가하고, 교반을 주위 온도에서 2시간 동안 및 35℃에서 2시간 동안 계속하였다. 생성된 혼합물을 13.6℃로 냉각시키고, MeOH (119 ml, 2.94 mol, 2 당량)로 10분 동안 처리하였다. 개별 반응기에서, 얼음 (5 kg, 물 중 5 wt; 5.0 L, 5 vol) 및 포화 NH₄Cl (28 wt% 용액)을 첨가하였다. 반응 혼합물은 얼음/NH₄Cl 혼합물에 첨가하였다. 회백색 고체가 용액으로부터 즉시 침전하기 시작하였다. 추가의 2kg의 얼음 (2 kg, 2 wt) 및 물 (3.0 L, 3 vol)을 혼합물에 첨가하였다. 반응 플라스크를 물 (0.50 L, 0.5 vol)로 세정하고, 세정액을 혼합물에 첨가하였다. n-헵탄 (2.00 L, 2 vol)을 혼합물에 첨가하고, 교반을 10분 동안 계속하였다. 회백색 고체를 진공 여과에 의해 수집하였다. 필터 케이크를 하기로 세정하였다: (1) 물 (4.0 L, 4.0 vol), (2) 물 (4.0 L, 4.0 vol), (3) n-헵탄 (4.0 L, 4.0 vol), (4) n-헵탄 (4.0 L, 4.0 vol). 회수된 고체를 진공 하에 45℃에서 4일 동안 건조시켜 화합물 131을 회백색 고체 (1.095 kg, 1.39 mol, 1.10 wt, 94% 수율)로서 수득하였다.

¹H NMR(400 MHz, 클로로포름-d) δ = 9.09 (s, 1H), 8.78 (s, 1H), 8.28 (s, 1H), 8.02 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.63 - 7.59 (m, 1H), 7.55 - 7.50 (m, 2H), 7.37 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 7.29 - 7.17 (m, 7H), 6.79 (d, J = 7.9 Hz, 4H), 6.29 (dd, J = 2.9, 16.2 Hz, 1H), 5.60 (ddd, J = 2.7, 3.9, 53.1 Hz, 1H), 4.78 (ddd, J = 4. 7, 6.4, 15.8 Hz, 1H), 4.26 - 4.22 (m, 1H), 3.77 (s, 6H), 3.58 (dd, J = 3.1, 10.9 Hz, 1H), 3.26 (dd, J = 3.7, 10.7 Hz, 1H), 0.85 (s, 9H), 0.10 (s, 3H), 0.02 (s, 3H)

단계 3

화합물 131 (1000 g, 1.27 mol, 1 wt, 1 vol, 1 당량) 및 트랜스-2-부텐-1,4-디올 (¹H NMR에 의해 올레핀 기하구조를 확인함; 335 g, 3.80 mol. 0.335 wt, 3.0 eq)을 THF (3.0 L, 3.0 vol)와 2회 공비혼합하였다. 잔류물을 THF (10 L, 10 vol) 및 톨루엔 (15 L, 15 vol)의 혼합물 중에 용해시켰다. 트리페닐포스핀 (432 g, 1.65 mol, 0.432 wt, 1.3 당량)을 첨가한 다음, 반응 혼합물을 -5℃로 냉각시켰다. DIAD (0.320 L, 1.65 mol, 333 g, 0.333 wt, 0.320 vol, 1.3 당량)를 20분에 걸쳐 천천히 첨가하며, 5℃ 미만의 T-내부로 유지하였다. 반응물을 0 - 5℃에서 1시간 동안 교반하고, LCMS에 의해 모니터링하였다. 빙조를 제거하고, 혼합물을 실온으로 가온되도록 하였다. 밤새 교반한 후 (17시간), 트리페닐포스핀 (83 g, 0.32 mol, 0.083 wt, 0.25 당량) 및 DIAD (62 ml, 0.32 mol, 64 g, 0.064 wt, 0.062 vol, 0.25 당량)를 첨가하였다. 추가로 1시간 후, 실온에서, 반응 혼합물을 MTBE (10 L, 10 vol)로 희석하고, 반포화 NaCl (물 중 18 wt% 용액; 2 x 4L)로 2회 세척하고, 진공 하에 농축시켜 농후한 오일을 수득하였다. 혼합물을 MTBE (4.00 L, 4 vol) 및 n-헵탄 (0.50 L, 0.5 vol)의 혼합물 중에 재용해시킨 다음, 0℃로 냉각시켰다. 트리페닐포스핀 옥시드의 시드 결정을 용액에 첨가하였다. 고체가 용액으로부터 천천히 침전하기 시작하고, 밤새 교반하였다. 백색 고체를 진공 여과에 의해 수집하고, MTBE (2 L, 2 vol)로 세정하여 트리페닐포스핀 옥시드 540 g을 단리하였다. 여과물을 농축시키고, 바이오타지 150L KP-Sil (SiO₂ 5 kg; Hep/EtOAc 중 1% TEA로 전처리함; 용리액: 헵탄/EtOAc (1% TEA를 갖는 33% EtOAc 48 L, 1% TEA를 갖는 50% EtOAc 24 L, 1% TEA를 갖는 66% EtOAc 24 L) → 1% TEA를 갖는 100% EtOAc)에 의해 정제하였다. 칼럼을 TLC (2:1 EtOAc/n-헵탄)에 의해 모니터링하였다. 깨끗한 생성물 분획을 합하고, 진공 하에 농축시켜 화합물 132를 연백색 발포체 고체 (634 g, 14 wt% DIAD 유도된 공-생성물이 함유됨, 순수 545 g, 0.63 mol, 50% 조정된 수율)로서 수득하였다. 혼합물 분획을 합하고, 진공 하에 농축시켜 연황색 발포체 고체 (750 g)를 수득하였으며, 이를 바이오타지 150M HP-스피어 (2.5 kg SiO₂; Hep/EtOAc 중 1% TEA로 전처리함; 톨루엔 용리액으로 로딩한 샘플: Hep/EtOAc/1%TEA (1% TEA를 갖는 50% EtOAc 12 L, 1% TEA를 갖는 66% EtOAc 16L) → 1% TEA를 갖는 EtOAc)에 적용하였다. 칼럼을 TLC (2/1/0.03 EtOAc/n-hep/TEA)에 의해 모니터링하였다. 깨끗한 생성물 분획을 합하고, 진공 하에 농축시켜 추가의 화합물 132를 연백색 발포체 고체 (206 g, 0.24 mol, 18% 수율)로서 수득하였다.

¹H NMR(400 MHz, 클로로포름-d) δ = 8.58 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.43 - 7.37 (m, 2H), 7.32 - 7.28 (m, 2H), 7.24 - 7.15 (m, 8H), 7.03 - 6.98 (m, 2H), 6.78 - 6.73 (m, 4H), 6.18 (dd, J = 2.7, 17.2 Hz, 1H), 5.88 (td, J = 5.5, 15.6 Hz, 1H), 5.77 (td, J = 5.1, 15.6 Hz, 1H), 5.60 (ddd, J = 2.7, 4.3, 53.1 Hz, 1H), 5.03 - 4.96 (m, 2H), 4.91 (ddd, J = 4.5, 6.6, 16.6 Hz, 1H), 4.18 - 4.14 (m, 1H), 3.88 - 3.82 (m, 2H), 3.78 (s, 6H), 3.52 (dd, J = 2.7, 10.9 Hz, 1H), 3.14 (dd, J = 3.5, 10.9 Hz, 1H), 0.85 (s, 9H), 0.10 (s, 3H), 0.01 (s, 3H).

단계 4

화합물 132 (800 g, 0.930 mol, 1 wt, 1 vol, 1 당량) 및 화합물 133 (522 g, 1.07 mol, 0.652 wt, 1.15 당량)을 THF (2 x 3 L, 2 x 3.8 vol)로 공비 건조시키고, 실온에서 THF (9.60 L, 8.45 kg, 12.0 vol) 중에 재용해시켰다. 트리페닐포스핀 (317 g, 1.21 mol, 0.396 wt, 1.30 당량)을 첨가하고, 혼합물을 - 5℃ 미만으로 냉각시켰다. DIAD (226 ml, 1.16 mol, 235 g, 0.294 wt, 0.283 vol, 1.25 당량)를 7℃ 미만의 T-내부에서 첨가하였다. 반응물을 실온으로 천천히 가온되도록 하였다. 반응물을 LCMS에 의해 모니터링하였다. 21시간 후, 반응 혼합물을 진공 하에 농후한 오일로 농축시키고, n-헵탄 (2.00, 1.37 kg, 1.71 wt, 2.50 vol)과 공비혼합한 다음, MTBE (2.40 L, 1.78 kg, 2.2 wt, 3.0 vol) 및 n-헵탄 (800 ml, 547 g, 0.68 wt, 1.0 vol)의 혼합물 중에 재용해시켰다. 용액을 트리페닐포스핀 옥시드로 시딩하고, 5℃로 냉각시키고, n-헵탄 (400 ml, 274 g, 0.34 wt, 0.50 vol)으로 희석하고, 5℃에서 30분 동안 교반하였다. 백색 고체가 침전물을 진공 여과에 의해 수집하고, MTBE 및 n-헵탄 (1.8 L)의 2:1 (v/v) 혼합물로 세정하여 트리페닐포스핀 옥시드 (455 g)를 수득하였다. 여과물을 진공 하에 농축시키고, 바이오타지 150 L KP-Sil (SiO₂ 5 kg; 1% TEA로 전처리함; 톨루엔 용리액 중에 용해시킴으로써 로딩된 샘플: 9:1 헵탄/EtOAc (16 L) 및 15 TEA, 3.6:1 (46 L), 2:1 (20 L) 및 1% TEA, 1:1 (30 L) 및 1% TEA, 및 100% EtOAc (16 L) 및 1% TEA)을 통해 정제하였다. 합한 깨끗한 생성물 분획을 진공 하에 농축시켜 화합물 134를 회백색 고체 발포체 (662.2 g)로서 수득하였다. 혼합물 분획을 합하고, 진공 하에 농축시켰다 (480 g). 바이오타지 150L 상에 로딩하기 전에 톨루엔 (300 ml)으로 희석하여 형성된 백색 불용성 고체를 진공 여과에 의해 제거하였다. 톨루엔 중 가용성인 이 물질을 바이오타지 150M HP-스피어 (SiO₂ 2.5 kg (1% TEA로 전처리함); 톨루엔으로 로딩한 샘플; 용리액: 2:1 헵탄/EtOAc (26 L) w/ 1% TEA, 1:1 (25 L) w/ 1% TEA, 1:4 (34 L) w/ 1% TEA)를 통해 정제하였다. 칼럼을 TLC (1:1 헵탄/EtOAc)에 의해 모니터링하였다. 합한 깨끗한 생성물 분획을 진공 하에 농축시켜 추가의 화합물 134를 회백색 고체 발포체 (165.5 g. 총 662.2+165.5 g = 827.7 g, 930 mmol, 1.03 wt, 67% 수율)로서 수득하였다.

¹H NMR(400 MHz, 클로로포름-d) δ = 8.47 (s, 1H), 8.39 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.38 - 7.31 (m, 5H), 7.27 - 7.19 (m, 6H), 7.14 - 7.06 (m, 3H), 6.93 - 6.87 (m, 2H), 6.76 (d, J = 8.6 Hz, 4H), 6.26 (dd, J = 2.0, 16.0 Hz, 1H), 6.15 (dd, J = 2.7, 17.2 Hz, 1H), 5.86 (dd, J = 4.7, 15.2 Hz, 1H), 5.80 (dd, J = 4.7, 15.2 Hz, 1H), 5.51 (ddd, J = 2.7, 4.3, 52.8 Hz, 1H), 5.31 (ddd, J = 2.0, 4.3, 52.8 Hz, 1H), 4.87 (d, J = 4.7 Hz, 2H), 4.85 - 4.81 (m, 1H), 4.79 (d, J = 4.3 Hz, 2H), 4.71 - 4.59 (m, 1H), 4.20 - 4.13 (m, 2H), 4.06 (dd, J = 2.7, 11.3 Hz, 1H), 3.90 (dd, J = 2.7, 11.7 Hz, 1H), 3.77 (s, 6H), 3.52 (dd, J = 3.1, 10.9 Hz, 1H), 3.18 (dd, J = 3.9, 10.9 Hz, 1H), 0.92 (s, 9H), 0.84 (s, 9H), 0.10 (s, 3H), 0.09 (s, 6H), 0.07 (s, 3H)

단계 5-6

피리딘 (1.23 L, 1.21 kg, 15.2 mol, 2.9 wt, 3.0 vol, 49 당량) 중 화합물 134 (410.7 g, 309 mmol, 1 wt, 1 vol, 1 당량)의 용액에 디페닐 아인산염 (90 ml, 109 g, 0.46 mol, 0.26 wt, 0.22 vol, 1.5 당량)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 교반하고, LCMS에 의해 모니터링하였다. 2시간 후 (80% 전환율), 추가의 디페닐 아인산염 (29.9 ml, 36.2 g, 155 mmol, 0.088 wt, 0.073 vol, 0.50 당량)을 첨가하였다. 추가로 1시간 후, 추가의 디페닐 아인산염 (6.0 ml, 7.2 g, 31 mmol, 0.018 wt, 0.015 vol, 0.10 당량)을 첨가하고, 반응물을 추가로 0.5시간 동안 계속하였다 (98% 전환율). 반응 혼합물을 포화 NaHCO₃ (물 중 9 wt% 용액; 2.1 L, 5 vol) 및 물 (1.0 L ml, 2.5 vol)의 혼합물에 첨가하며, T-내부 4.7 내지 12℃로 유지하였다. 반응기를 소량의 EtOAc로 세정하였다. 교반을 실온에서 30분 동안 계속하고, 반응을 LCMS에 의해 모니터링하였다 (100% 전환율). 반응 혼합물을 EtOAc 및 MTBE (2 x 8.2 L, 2 x 20 vol)의 1:1 혼합물로 2회 추출하였다. 합한 유기 층을 물 (4.1 L, 10 vol)로 세척하고, 진공 하에 농축하고, 피리딘을 제거하기 위해 톨루엔 (3 x 4.1 L, 3 x 10 vol; 연속식 공급)과 공비혼합하여 화합물 135 (0.55 당량 피리딘 잔류)를 수득하였다.

단계 6 - 조 화합물 135를 주위 온도에서 디클로로메탄 (3.08 L, 4.07 kg, 9.9 wt, 7.5 vol) 중에 용해시켰다. 물 (55.7 ml, 0.136 vol, 10 당량)을 첨가하고, 이어서 DCM (3.08 L, 7.5 vol) 중 디클로로아세트산 (77 ml, 120 g, 0.93 mol, 0.29 wt, 0.19 vol, 3.0 당량)의 용액을 첨가하며, 25℃ 미만의 내부 T를 유지하였다. (오렌지색 용액으로 변함). 30분 후, 트리에틸실란 (Et₃SiH; 494 ml, 359 g, 3.09 mol, 0.875 wt, 1.20 vol, 10.0 당량)을 첨가하고 (T-내부는 18.2℃로부터 17℃까지 진행함), 교반을 20분 동안 계속하였다. 트리에틸아민 (431 ml, 313 g, 3.09 mol, 0.762 wt, 1.05 vol, 10.0 당량)을 첨가하였다 (T-내부는 17.8℃에서 22℃까지 진행함). 혼합물을 1.55 kg (3.8 wt)로 농축시키고, EtOAc (6.2L, 5.5 kg, 14 wt, 15 vol)에 재용해시키고, 순차적으로 하기로 세척하였다: (1) 물 (1.0 L, 2.5 vol) 및 포화 NaHCO₃ (물 중 9 wt% 용액; 0.82 L, 2.0 vol). 조 생성물 EtOAc 용액을 -20℃에서 밤새 저장하고, 다음 날, 용액을 진공 하에 25℃에서 농축시켰다. 이어서 수득한 조 혼합물 (654 g)을 하기로 연화처리하였다: (1) n-헵탄 (3.01 L, 7.5 vol), (2) n-헵탄 (2.46 L, 6.0 vol) 및 톨루엔 (0.82 L, 2.0 vol)의 혼합물. 용액 부분 (상청액)을 가만히 따르고, 바닥에 남은 고체를 아세토니트릴 (4.1 L, 10 vol) 중에 용해시켰다. 혼합물을 진공 하에 25℃에서 농축시키고, 아세토니트릴과 2회 공비혼합하여 화합물 136을 수득하였다. 생성물을 후속 단계에 정제 없이 사용하였다 (이론적 100% 수율이 가정됨).

단계 7

단계 7a 화합물 136 (337 g, 309 mmol, 1 wt, 1 vol, 1 당량)을 실온에서 무수 피리딘 (13.5 L, 13.2 kg, 39 wt, 40 vol) 중에 용해시켰다. 트리에틸아민 (129 ml, 927 mmol, 94 g, 0.28 wt, 0.38 vol, 3.0 당량)을 첨가하고, 이어서 2-클로로-5,5-디메틸-1,3,2-디옥사포스피난 2-옥시드 (DMOCP; 103 g, 556 mmol, 0.31 wt, 1.80 당량)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 주위 온도에서 30분 동안 교반하고, LCMS (100% 전환율)에 의해 모니터링하여 화합물 137을 수득하였다.

단계 7b TEA (129 ml, 927 mmol, 94 g, 0.28 wt, 0.38 vol, 3.0 당량), 물 (100 ml, 5.56 mol, 0.30 wt, 0.30 wt, 18 당량) 및 황 (34.7 g, 1.08 mol, 0.10 wt, 3.5 당량)을 화합물 137의 상기 혼합물에 첨가하였다. 90분 후 (100% 전환율), NaHCO₃ (물 중 9 wt% 용액; 3.37 L, 10 vol)을 첨가하며, 30℃ 미만 (16.6℃ 내지 27℃)으로 T-내부를 유지하였다. 생성된 혼합물을 염의 제거를 위해 여과하였다. 여과물을 진공 하에 혼합물로 농축시키고, MTBE (5.1 L, 15 vol)로 희석하고, NaCl (물 중 30 wt% 용액; 2 x 1.35 L, 2 x 4 vol)로 2회 세척하였다. 불용성 고형물을 여과하고, 여과물을 진공 하에 농축시키고, 톨루엔 (4.0 L, 12 vol)과 공비혼합하였다. 생성된 고체를 여과에 의해 제거하고, 조 혼합물을 톨루엔 중에 용해시키고, 바이오타지 150L KP-Sil (SiO₂ 5 kg; Hep/EtOAc/TEA (1.5/1.5/0.03 CV)로 전처리함; EtOAc/TEA (3/0.03 CV), EtOAc/MeOH/TEA (4/0.2/0.04 CV), EtOAc/MeOH/TEA (2/0.2/0.02CV)로 용리시킴)을 통해 정제하였다. 칼럼을 TLC (EtOAc/MeOH/TEA=9/1/0.1)에 의해 모니터링하였다. Sp 이성질체를 함유하는 분획을 합하고, 진공 하에 농축시켜 화합물 138을 담분홍색 발포체 고체 (Sp 이성질체; 154 g, 128 mmol, 0.46 wt, 41.3% 수율)로서 수득하였다. Rp 이성질체를 함유하는 분획을 합하고, 진공 하에 농축시켜 화합물 240을 담분홍색 발포체 고체 (Rp 이성질체; 64 g, 53 mmol, 0.19 wt, 17% 수율)로서 수득하였다.

화합물 138 (Sp 이성질체):

¹H NMR(400 MHz, 클로로포름-d) δ = 8.51 (s, 1H), 8.50 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.49 - 7.44 (m, 2H), 7.38 - 7.27 (m, 4H), 7.25 - 7.21 (m, 2H), 7.14 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 6.44 (dd, J = 2.5, 13.9 Hz, 1H), 6.18 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 5.78 (td, J = 6.3, 15.6 Hz, 1H), 5.69 (td, J = 4.7, 15.6 Hz, 1H), 5.56 (dd, J = 3.9, 50.8 Hz, 1H), 5.20 - 5.06 (m, 1H), 4.95 - 4.79 (m, 4H), 4.69 (dd, J = 4.3, 16.0 Hz, 1H), 4.54 - 4.38 (m, 3H), 4.35 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 4.32 - 4.29 (m, 1H), 4.05 (dd, J = 1.6, 11.7 Hz, 1H), 3.91 (dd, J = 3.1, 11.7 Hz, 1H), 3.14 - 3.06 (m, 6H), 1.30 (t, J = 7.4 Hz, 9H), 0.91 (s, 9H), 0.90 (s, 9H), 0.12 (s, 3H), 0.08 (s, 3H), 0.06 (s, 3H), 0.05 (s, 3H)

화합물 240 (Rp 이성질체):

¹H NMR(400 MHz, 클로로포름-d) δ = 8.54 (s, 1H), 8.38 (s, 1H), 8.33 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.39 - 7.09 (m, 10H), 6.39 (dd, J = 2.3, 14.1 Hz, 1H), 6.13 (d, J = 17.2 Hz, 1H), 5.72 (d, J = 3.1 Hz, 2H), 5.68 (dd, J = 4.3, 51.2 Hz, 1H), 5.43 - 5.29 (m, 1H), 5.10 - 4.96 (m, 3H), 4.90 - 4.83 (m, 2H), 4.78 - 4.72 (m, 1H), 4.52 (ddd, J = 3.9, 6.6, 17.2 Hz, 1H), 4.44 - 4.35 (m, 2H), 4.31 - 4.26 (m, 1H), 4.20 - 4.12 (m, 2H), 3.87 (dd, J = 3.5, 11.7 Hz, 1H), 3.79 - 3.77 (m, 1H), 3.15 - 3.09 (m, 6H), 1.33 (t, J = 7.4 Hz, 9H), 0.94 (s, 9H), 0.89 (s, 9H), 0.13 (s, 3H), 0.12 (s, 3H), 0.10 (s, 3H), 0.09 (s, 3H)

단계 8

화합물 138 (221 g, 183 mmol, 1 wt, 1 vol, 1 당량)을 피리딘 (530 ml, 6.56 mol, 519 g, 2.3 wt, 2.4 vol) 및 TEA (2.65 L, 19.0 mol, 1.93 kg, 8.7 wt, 12 vol, 104 당량)의 혼합물 중에 용해시켰다. 트리에틸아민 트리히드로플루오라이드 (1.62 mol, 262 g, 1.2 wt, 1.2 vol, 착물로서의 8.9 당량, 27 당량 HF 264 ml)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 교반하면서, 전환율을 LCMS에 의해 모니터링하였다. 3시간 후 (97% 전환율), 메톡시트리메틸실란 (TMSOMe; 1.40 L, 10.2 mol, 1.06 kg, 4.8 wt, 6.3 vol, 55 당량)을 첨가하고, 교반을 30분 동안 계속하였다. 점착성 고체를 반응기에 코팅하였다. 용액 부분 (상청액)을 가만히 따랐다. 고체를 톨루엔 (2 x 2.2 L, 2 x 10 vol; 상청액을 가만히 따름)으로 2회 연화처리하였다. 반응기에 남아있는 조 고체를 디클로로메탄 (2.2 L, 10 vol) 중에 용해시키고, NH₄Cl (물 중 28 wt% 용액; 2.2 L, 10 vol)로 세척하였다. 수성 층을 디클로로메탄 (2.2 L, 10 vol)으로 역추출하였다. 합한 유기 층을 NaCl (물 중 36 wt% 용액; 1.1 L, 5 vol) 및 물 (1.1 L, 5 vol)의 혼합물로 세척한 다음, 진공 하에 농축시켜 화합물 139를 황갈색 건조 발포체 (152 g, 155 mmol, 0.70 wt, 85% 수율)로서 수득하였다. 조 생성물을 후속 단계에 정제 없이 사용하였다.

단계 9

화합물 139 (150 g, 153 mmol, 1 wt, 1 vol, 1 당량)를 아세토니트릴 (4 L, 27 vol)과 공비혼합한 다음, 아세토니트릴 (1.05 L, 0.83 kg, 5.5 wt, 7.0 vol)을 실온에서 재용해시켰다. 2-니트로벤질 브로마이드 (44.4 g, 205 mmol, 0.30 wt, 1.34 당량)를 실온에서 첨가하고, 반응물을 LCMS에 의해 모니터링하였다. 23시간 후 (100% 전환율), EtOAc (1.50 L, 10 vol), NH₄Cl (물 중 28 wt% 용액; 300 ml, 2 vol) 및 물 (300 ml, 2 vol)을 첨가 (pH = 6)하고, 생성된 혼합물을 진공 하에 25℃에서 1.11 kg의 중량으로 부분적으로 농축시켰다. EtOAc (2.25 L, 15 vol)를 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 2개의 층을 분리하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트 (750 ml, 5 vol)로 추출하였다. 합한 유기 층을 순차적으로 하기로 세척하였다: (1) NaCl (물 중 36 wt% 용액; 300 ml, 2 vol) 및 물 (300 ml, 2 vol)의 혼합물 및 (2) 물 (600 ml, 4 vol). 유기 층을 진공 하에 농축시키고, n-헵탄 (1.50 L, 10 vol)과 공비혼합하였다. MTBE (0.95 L, 6.3 vol)를 조 고체에 첨가하고, 혼합물을 40℃에서 가열하였다. 혼합물을 EtOAc (300 ml, 2 vol)로 희석하고, 천천히 0℃로 냉각시켰다. 치밀한 고체를 침강되도록 하고, 상청액을 필터 프릿 튜브을 통해 펌핑하였다. 고체를 MTBE (2 x 300 ml, 2 x 2 vol; 상청액을 각 횟수마다에 필터 프릿 튜브를 통해 펌핑함)로 2회 세정하고, 40℃에서 밤새 건조시켜 화합물 140을 연황색 고체 (156 g)로서 수득하였다. 여과물을 진공 하에 농축시켜 갈색 오일 (17.8 g)을 수득하였으며, 이를 바이오타지 스냅-울트라 340 g (EtOAc 중 용리액: 0 내지 5% MeOH)을 통해 정제에 적용하여 추가의 화합물 140을 연황색 고체 (5.8 g)로서 수득하였다. 총 156 g + 5.8 g = 161.8 g (순수 152 mmol, 95% 순도, 99% 수율)

¹H NMR(400 MHz, 클로로포름-d) δ = 8.46 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 8.09 - 8.06 (m, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.54 - 7.51 (m, 1H), 7.49 - 7.45 (m, 4H), 7.37 - 7.28 (m, 3H), 7.24 - 7.19 (m, 3H), 7.16 - 7.11 (m, 2H), 6.22 (d, J = 16.8 Hz, 1H), 6.14 (dd, J = 2.7, 17.2 Hz, 1H), 5.83 - 5.61 (m, 3H), 5.60 - 5.48 (m, 1H), 5.07 (dd, J = 3.5, 51.6 Hz, 1H), 5.06 - 4.96 (m, 1H), 4.79 (dd, J = 4.9, 15.8 Hz, 1H), 4.69 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 4.67 - 4.56 (m, 1H), 4.48 - 4.40 (m, 3H), 4.37 - 4.30 (m, 1H), 4.27 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 4.19 - 4.13 (m, 1H), 3.93 - 3.85 (m, 1H), 3.85 - 3.78 (m, 1H)

단계 10-11

단계 10 화합물 140 (95% 순도, 순수 73.2 g, 72.3 mmol, 1 wt, 1 vol, 1 당량) 및 2-시아노에틸 N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트 (25.3 ml, 79.5 mmol, 0.33 wt, 0.35 vol, 1.10 당량)를 무수 아세토니트릴 (3 x 2 L)과 3회 공비혼합하고, 디클로로메탄 (0.73 L, 10 vol) 중에 재용해시키고, 0-5℃로 냉각시켰다. 디이소프로필암모늄 테트라졸리드 (6.19 g, 36.1 mmol, 0.085 wt, 0.50 당량)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 0℃에서 10시간 동안 교반하고, 10℃로 2시간에 걸쳐 가온하고, 10℃에서 10시간 동안 유지하고, 실온으로 2시간에 걸쳐 가온하였다. 반응물을 LCMS 및 TLC (0.5% TEA를 갖는 EtOAc)에 의해 모니터링하였다. 18시간 후, 무수 아세토니트릴 (0.73 L, 10 vol)을 첨가하고, 혼합물을 -20℃에서 3일에 걸쳐 저장하였다.

단계 11a 단계 10으로부터의 혼합물을 주위 온도로 가온하고, 적하 깔때기를 통해 여러 부분으로 (매 30분에 100 mL, 9시간에 걸침) 피리딘 트리플루오로아세테이트 염 (미리 피리딘과 2회 공비혼합함; 41.9 g, 217 mmol, 0.57 wt, 3.0 당량) 및 아세토니트릴 (5.85 L, 80 vol)의 혼합물을 첨가하였다. 반응물을 LCMS에 의해 모니터링하였다. 13시간 후, 아세토니트릴 (24 mL) 중 2-시아노에틸 N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트(5.8 mL, 18 mmol, 0.25 당량)의 용액을 4시간에 걸쳐 첨가하였다. 추가의 시약의 양을 나머지 화합물 140 (LCMS를 기반으로 ~30%)을 기반으로 결정하였다. 디올의 추가의 전환율을 6시간 후에 관찰하였다.

단계 11b ((디메틸아미노메틸리덴)아미노)-3H-1,2,4-디티아졸린-3-티온 (DDTT; 20.8 g, 101 mmol, 0.28 wt, 1.4 당량)을 첨가하고, 교반을 1시간 동안 계속하였다. 반응 혼합물을 ~800 mL로 부분적으로 농축시키고, MTBE (1.46 L, 20 vol), NaHCO₃ (물 중 9 wt% 용액; 1.1 L, 15 vol), 및 물 (0.37 L, 5 vol)로 희석하였다. pH= 8. 층을 분리하고, 수성 층을 MTBE (1.46 L, 20 vol) 및 EtOAc (1.10 L, 15 vol)의 혼합물로 추출하였다. 합한 유기 층을 30% 수성 NaCl (2 x 0.73 L, 2 x 10 vol)로 2회 세척하고, 진공 하에 35℃에서 농축시키고, 톨루엔 (1.46 L, 20 vol)과 공비혼합하였다. LCMS 및 TLC (EtOAc)은 화합물 143 (SpRp, 목적)을 지시하였다: 화합물 241 (SpSp) = 5: 1

조 생성물을 바이오타지 150M KP-Sil, (SiO₂ 2.5 kg; 용리액: EtOAc/Hep: 2:1 (4 CV), 3:1 (2.5 CV), 4:1 (2.5 CV), 100% EA (3 CV), EA 4 CV 중 5-10% MeOH)을 통해 정제하여 화합물 143 (36 g, 31.5 mmol, 44% 수율)을 수득하였다.

화합물 143 (SpRp):

¹H NMR(400 MHz, 클로로포름-d) δ = 8.59 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 8.03 - 7.99 (m, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.56 - 7.53 (m, 2H), 7.49 - 7.40 (m, 5H), 7.35 - 7.28 (m, 2H), 7.24 - 7.16 (m, 4H), 6.92 (s, 1H), 6.29 (d, J = 14.9 Hz, 1H), 6.08 (d, J = 20.7 Hz, 1H), 5.97 - 5.83 (m, 1H), 5.76 (td, J = 4.7, 15.6 Hz, 1H), 5.61 - 5.51 (m, 2H), 5.40 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 5.29 - 5.17 (m, 1H), 4.91 (dd, J = 7.4, 14.9 Hz, 1H), 4.86 - 4.75 (m, 3H), 4.63 (dd, J = 3.7, 9.2 Hz, 1H), 4.58 - 4.43 (m, 5H), 4.34 - 4.19 (m, 4H), 2.79 (td, J = 5.9, 16.8 Hz, 1H), 2.66 (td, J = 6.3, 16.8 Hz, 1H).

화합물 241 (SpSp)

¹H NMR(400 MHz, 클로로포름-d) δ = 8.11 (s, 1H), 8.03 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.56 - 7.40 (m, 7H), 7.33 - 7.28 (m, 2H), 7.23 - 7.17 (m, 4H), 6.22 (d, J = 17.6 Hz, 1H), 6.15 (d, J = 18.8 Hz, 1H), 5.85 (dd, J = 3.5, 51.2 Hz, 1H), 5.75 - 5.45 (m, 5H), 4.95 - 4.23 (m, 14H), 2.82 (t, J = 6.1 Hz, 2H).

단계 12

화합물 143 (71.6 g, 62.6mmol, 1 wt, 1 vol, 1 당량)을 1,4-디옥산 (0.43 L, 6 vol) 중에 용해시켰다. 티오페놀 (215 ml, 2.09 mol, 230 g, 3.2 wt, 3 vol, >30 당량)을 첨가하고, 이어서 트리에틸아민 (215 ml, 1.54 mol, 156 g, 2.2 wt, 3 vol)을 첨가하였다. 약간의 발열을 관찰하고 (T-내부는 ~7℃까지 증가함), 따라서, 수/빙조를 사용하여 냉각시키고, T-내부를 27℃ 미만으로 제어하였다. 반응물을 LCMS에 의해 모니터링하였다. 2시간 후, MeOH (0.57 L, 8 vol) 및 NH₄OH (28 wt%; 15 mol, 0.57 L, 8 vol, >200 당량)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 50℃에서 5시간 동안 가열하고, 실온으로 냉각시키고, 밤새 교반하였다. 14시간 후, 물 (0.72 L, 10 vol)을 첨가하고 (어떠한 고체도 관찰되지 않음), 혼합물을 n-헵탄 및 톨루엔 (3 x 0.86 L, 3 x 12 vol)의 1:1 (v/v) 혼합물로 3회 추출한 다음, 톨루엔 (0.57 L, 8 vol)으로 추출하였다. 수성 층을 진공 하에 40-50℃에서 농축시키고, 물 (1.07 L, 15 vol)로 희석하였다. 생성된 슬러리를 실온에서 밤새 유지하였다. 생성된 고체를 여과하고, 물 (0.36 L, 5 vol)로 세정하였다. 여과물은 여전히 탁하고, 셀라이트 및 쿠노 필터를 통해 여과하였다. 탁함이 여전히 존재하였다. HCl (물 중 1.0 M 용액; 132 ml, 132 mmol, 2.1 당량)을 1시간에 걸쳐 첨가하고, pH를 체크하였다 (pH <2). 교반을 실온에서 1시간 동안 계속하고, 혼합물을 여과하였다. 필터 케이크를 물 (8 x 0.20 L)로 세정하고, 진공 오븐 중에서 35℃에서 2일 동안 건조시키고, 1일 동안 어떠한 열도 가하지 않아 화합물 1을 연오렌지색 고체 (44.88 g, 60.1 mmol, 0.63 wt, 96% 수율)로서 수득하였다.

단계 13

유리 산 화합물 1 (22.42 g, 30.03 mmol, 1 wt, 1 vol, 1 당량)에 암모니아 (MeOH 중 2.0M 용액; 220 ml, 440 mmol, 10 vol, 15 당량)을 첨가하였다. EtOH (55 ml, 2.5 vol)를 첨가하고, 생성된 용액을 쿠노 필터 (0.45 마이크로미터; PTFE)를 통해 여과하고, MeOH 및 EtOH의 1:1 (v/v) 혼합물 (90 mL, 4 vol)로 세정하였다. 여과물을 진공 하에 30℃에서 농축시켜 회백색 고체를 수득하였으며, 이를 실온에서 밤새 건조시키고, 스패튤라로 그라인딩하고 (파쇄하기 용이함), 추가로 진공 하에 실온에서 건조시켰다. 이어서, 단리된 고체를 톨루엔 (250 ml) 중에 현탁시키고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, 고체를 진공 여과에 의해 수집하고, 톨루엔 2회 (2 x 50 ml)로 세정하였다. 이어서, 고체를 진공 오븐 중 진공 하에 건조시켜 화합물 1a (화합물 1의 디-암모늄 염) 22.4 g을 수득하였다.

재결정화: 화합물 1a (22.14 g, 28.36 mmol, 1 wt, 1 vol, 1 당량)를 물 (664 ml, 30 vol) 및 수산화암모늄의 혼합물 (28 wt%; 2.5 ml, 18 mmol, 0.63 당량) (pH = 9-10) 중에 용해시키고, 톨루엔 3회 (3 x 300 ml, 3 x14 vol), EtOAc 3회 (3 x 200 ml, 3 x 9 vol) 및 톨루엔 3회 (3 x 300 ml, 3 x 14 vol)로 추출하였다. 생성된 수성 층을 HCl (물 중 1.0 M 용액; 90 ml, 90 mmol, 3.2 당량)로 3.5시간의 기간에 걸쳐 처리하였다 (pH ≤2). 혼합물을 30분 동안 교반한 다음, 고체 침전물을 진공 여과에 의해 수집하였다. 필터 케이크를 물 (3 x 200 ml, 3 x 9 vol)로 3회 세척하고, 진공 하에 밤새 건조시켰다. 암모니아 (MeOH 중 2.0 M 용액; 250 ml, 500 mmol, 17.6 당량) 및 에탄올 (100 ml)을 고체에 첨가하고, 생성된 혼합물을 결정이 나타날 때까지 진공 하에 농축시키고 (~100 ml), 이때 농축을 멈추고, 혼합물을 20분 동안 교반하였다. 에탄올 (45 mL)을 첨가하고, 혼합물을 부분적으로 농축시켰다 (45 mL 제거함). 동일한 작업을 2회 초과 반복한 다음, 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 3.5시간 동안 교반하였다. 백색 고체를 진공 여과에 의해 수집하고, 차가운 에탄올 (20 ml)에 이어서 에틸 아세테이트 (2 x 50 mL)로 세척하였다. 백색 고체를 진공 하에 실온에서 3일 동안 건조시켜 화합물 1a를 백색 고체 (16.6 g, 21.3 mmol, 0.75 wt, 75% 수율)로서 수득하였다. 여과물을 진공 하에 농축시키고, 진공 하에 실온에서 3일 동안 건조시켜 화합물 1a를 회백색 고체 (4.16 g, 5.3 mmol, 18% 수율)로서 수득하였다.

실시예 1.2 - 화합물 1의 ¹H NMR 분석

화합물 1a의 ¹H NMR 스펙트로그래프를 도 3에 도시하였다. 생성된 스펙트럼은 하기이다:

¹H NMR스펙트럼 (400MHz, DMSO-d6, δH 2.49 ppm, 80℃)

δ(ppm):3.05-3.13(4H, m), 3.70(1H, dd, J=13, 5 Hz), 3.78(1H, dd, J=12, 4Hz), 4.21-4.24(2H, m), 4.28(1H, m), 4.38(1H, m), 4.53-4.68(2H, m), 5.22(1H, m), 5.76(2H, s), 5.78(1H, m), 6.26(1H, m), 6.29(1H, m), 8.13(1H, s), 8.14(1H, s), 8.36(1H, brs), 8.59(1H, brs).

실시예 1.3 - 화합물 1의 X선 분석

화합물 1 약 2 mg을 물 600 uL에 용해시켰다. 이 용액 120 uL를 또 다른 유리 바이알에 넣은 다음, 이 바이알을 실온에서 1주 동안 MeCN 3 mL를 갖는 고정 용기에 저장하였다. 이는 샘플 제조의 H₂O/MeCN 증기 확산 방법이다.

결정화 용액에서 확인된 무색 블록 단결정 (0.1 x 0.1 x 0.1 mm)을 액체 파라바 10312에 분산시키고, 듀얼-씩니스 마이크로마운츠(Dual-Thickness MicroMounts)™ (마이테젠(MiTeGen)) 상에 장착하였다. 회절 데이터를 다층 거울 단색화 구리-Kα 방사선을 사용하여 ω 축 진동 방법에 의해 XtaLAB 프로 P200 MM007HF (리가쿠(Rigaku)) 상에서 -160℃에서 수집하였다.

도 4a는 수많은 무질서한 물 분자와 함께, 비대칭 단위 중 화합물 1 분자의 ORTEP 도면을 도시한다. 도 4b는 도 4a로부터 화합물 1 분자 중 하나의 결정 구조를 도시한다. 도 4c는 도 4a에 도시된 화합물 1의 다른 분자의 결정 구조를 도시한다.

화합물 1의 결정 구조를 0.1354의 최종 R-인자로 해석하였다. 플랙 파라미터는 거의 0 (0.083(17))이었고, 이는 화합물 1의 절대 배위가 (R, S)인 것을 나타낸다. 결정 구조 분석은 또한 많은 물 분자가 화합물 1의 큰 채널에 존재하는 것을 나타내며, 이는 물 분자가 채널로부터 용이하게 이탈할 수 있음을 나타냈다. 분석은 또한 비대칭 단위의 결정학적으로 독립적인 분자 둘 다의 입체형태가 거의 동일함을 확인하였다.

X선 분석의 추가적 파라미터는 하기 제시된다:

실시예 2 - WT STING와의 복합체를 확인하는 X선 구조

신규 화합물의 표적-결합 메카니즘을 더욱 이해하기 위해, 화합물과의 복합체로서 WT STING의 X선 결정 구조를 결정하였다.

A. WT STING C-말단 도메인 (잔기 155-341)의 발현 및 정제

아미노산 155 내지 341의 인간 WT STING 단백질 (서열식별번호: 4)을 코딩하는 DNA 서열을 pET21b 벡터로 그의 N-말단에서 His-TEV-Sumo 태그 다음에 클로닝하였다 (서열식별번호: 5). pET21b의 서열을 애드진에 수탁하였고 이는 addgene.org/vector-database/2550/에서 이용가능하며, 해당 서열은 본원에 참조로 포함된다.

이. 콜라이 BL21 (DE3) 코돈 플러스 세포를 상기 플라스미드에 의해 형질전환하고 재조합 단백질의 발현을 0.1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)에 의해 유도하였다. 단백질은 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 용해물의 가용성 분획으로부터 정제하였다. His-TEV-Sumo 태그는 스모 프로테아제에 의해 제거하고, 제2 Ni-NTA 친화성 칼럼을 사용하여 태그-무함유 WT STING 155-341로부터 분리하였다. 단백질은 추가로 음이온-교환 및 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제하고, 35 mg/ml 농도에서 20 mM Tris·HCl pH 7.5, 및 150 mM NaCl을 함유하는 완충제 중에 저장하였다.

B. 화합물 1과의 복합체로서의 WT STING C-말단 도메인의 결정화 및 구조 결정

화합물 1과 WT STING 155-341을 공결정화하기 위해, WT STING 단백질을 저장 완충제 (20 mM Tris·HCl pH 7.5, 및 150 mM NaCl)를 사용하여 10 mg/ml로 희석하고 화합물 1 (DMSO 중 100 mM 스톡)과 몰비 1:5로 혼합하였다. 혼합물을 4℃에서 4시간 동안 인큐베이션하고, 20분 동안 13,000 rpm에서 원심분리한 후에 결정화하였다. 결정화 스크린 트레이는 18℃에서 행잉-드롭 증기 확산 방법을 사용하여 설치하였다. 결정은 WT STING/화합물 1 용액 1 μL와 100 mM HEPES pH 7.5, 200 mM CaCl₂ 및 15% (wt/vol) PEG 8000 함유 웰 용액 동등 부피를 혼합함으로써 성장시켰다. 20% (wt/vol) PEG 400은 결정을 액체 질소 중에서 플래쉬-동결하였을 때 동결보호제 시약으로서 사용하였다. 회절 데이터세트는 SSRF BL19U1 빔라인에 필라투스(Pilatus) 검출기로 수집하여 CCP4 소프트웨어 슈트에서의 HKL3000 및 프로그램 SCALEPACK2MTZ에 의해 가공하였다.

화합물 1과 결합된 WT STING 155-341의 구조는 분자 대체에 의해, PDB ID 4F9E를 초기 검색 모델로 하면서 프로그램 페이저(PHASER) (최대 가능도 분자 대체)를 사용하여 결정하였다. WT STING의 이량체 계면 사이에서의 화합물 1의 존재는 모델 상에 대해서 계산된 Fo-Fc 차이 지도에서 확인되었다. 모델을 구축하고 Coot 프로그램으로 수동으로 완료하고 CCP4 소프트웨어 슈트에서의 Refmac5 프로그램을 사용하여 정밀화하였다. 최종 정밀화된 구조는 a=33.820, b=78.110, c=132.212, α=90.00, β=90.00, γ=90.00에서 측정된 단위 셀을 갖는 공간군 P212121에서 2.38 Å의 해상능으로 보고되었다. WT STING 155-341의 2개 카피가 이량체 계면에서 화합물 1의 1개의 분자에 결합한 각각의 비대칭 단위로 확인되었다.

C. X선 결정 구조에서 관찰된 WT STING과 화합물 1의 상호작용

도 5는 화합물 1과의 복합체로서의 인간 WT STING의 X선 결정 구조의 도면을 보여준다. 본 발명자들은 화합물 1a의 샘플로부터 공결정화된 화합물 1과의 복합체로서의 인간 WT STING의 X선 결정 구조를 검사했다. 화합물은 WT STING 단백질의 이량체에 의해 형성된 계면 포켓에서 결합한다. 화합물의 아데닌 염기의 양면이 각각 Tyr240 및 Arg238의 구아니딘 기와의 π-π 적층 상호작용을 형성한다. 트랜스 올레핀 링커는 Arg 238의 측쇄의 지방족 부분과의 반 데르 발스 상호작용을 형성한다. Thr263, Pro264 및 Tyr163에 의해 규정된 소수성 홀 내에 화합물의 리보스 기의 C2' 위치에서의 플루오린 치환기가 배치된다. 화합물의 음으로 하전된 티오포스페이트 기는 각각 Arg238와의 염 가교 및 Ser162 및 Thr267과의 H-결합 상호작용을 형성한다. 게다가 티오포스페이트 기는 또한 Arg 232의 구아니딘 기와 정전기적 상호작용을 형성한다. 잔기 226 내지 243으로 이루어지는 WT STING의 LID 루프 영역이 2개의 염기 기 및 트랜스 올레핀 링커 주위를 감싼다.

실시예 3 - 화합물 1과의 복합체로서의 REF STING의 X선 결정 구조의 결정.

A. REF STING C-말단 도메인 (잔기 155-341, 서열식별번호: 6)의 발현 및 정제

아미노산 155 내지 341로부터의 인간 REF STING 단백질 (서열식별번호: 6)을 코딩하는 DNA 서열을 pET21b 벡터로 그의 N-말단에서 His-TEV-Sumo 태그 다음에 클로닝하였다 (서열식별번호: 7). pET21b의 서열을 애드진에 수탁하였고 이는 addgene.org/vector-database/2550/에서 이용가능하며, 해당 서열은 본원에 참조로 포함된다.

이. 콜라이 BL21 (DE3) 코돈 플러스 세포를 상기 플라스미드에 의해 형질전환하고 재조합 단백질의 발현을 0.1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)에 의해 유도하였다. 단백질은 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 용해물의 가용성 분획으로부터 정제하였다. His-TEV-Sumo 태그는 스모 프로테아제에 의해 제거하고, 제2 Ni-NTA 친화성 칼럼을 사용하여 태그-무함유 REF STING_155-341로부터 분리하였다. 단백질은 추가로 음이온-교환 및 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제하고, 24 mg/ml 농도에서 20 mM Tris·HCl pH 7.5, 및 150 mM NaCl을 함유하는 완충제 중에 저장하였다.

B. 화합물 1과의 복합체로서의 REF STING C-말단 도메인의 결정화 및 구조 결정

화합물 1과 REF STING_155-341을 공결정화하기 위해, REF STING 단백질을 저장 완충제 (20 mM Tris·HCl pH 7.5, 및 150 mM NaCl)를 사용하여 10 mg/ml로 희석하고 화합물 1 (DMSO 중 100 mM 스톡)과 몰비 1:5로 혼합하였다. 혼합물을 4℃에서 4시간 동안 인큐베이션하고, 20분 동안 13,000 rpm에서 원심분리한 후에 결정화하였다. 결정화 스크린 트레이는 18℃에서 행잉-드롭 증기 확산 방법을 사용하여 설치하였다. 결정은 REF STING/화합물 1 용액 1 μL와 100 mM HEPES pH 7.5, 200 mM CaCl₂ 및 15% (wt/vol) PEG 8000 함유 웰 용액 동등 부피를 혼합함으로써 성장시켰다. 20% (wt/vol) PEG 400은 결정을 액체 질소 중에서 플래쉬-동결하였을 때 동결보호제 시약으로서 사용하였다. 회절 데이터세트는 SSRF BL18U1 빔라인에 필라투스 검출기로 수집하여 CCP4 소프트웨어 슈트에서의 HKL3000 및 프로그램 SCALEPACK2MTZ에 의해 가공하였다. 이 구조는 도 6에 제시되어 있다.

화합물 1과 결합된 REF STING_155-341의 구조는 분자 대체에 의해, 초기 검색 모델로서 앞서 결정된 WT STING 155-341 구조 (상기 기재됨)를 사용하여, 프로그램 페이저 (최대 가능도 분자 대체)를 사용하여 결정하였다. REF STING의 이량체 계면 사이에서의 화합물 1의 존재는 모델 상에 대해서 계산된 Fo-Fc 차이 지도에서 확인되었다. 모델을 구축하고 Coot 프로그램으로 수동으로 완료하고 CCP4 소프트웨어 슈트에서의 Refmac5 프로그램으로 정밀화하였다. 최종 정밀화된 구조는 a = 33.733, b=77.831, c=131.689, α=90.00, β=90.00, γ=90.00에서 측정된 단위 셀을 갖는 공간군 P212121에서 2.76 Å의 해상능으로 보고되었다. REF STING 155-341의 2개 카피가 이량체 계면에서 화합물 1의 1개의 분자에 결합한 각각 비대칭 단위로 확인되었다.

C. X선 결정 구조에서 관찰된 REF STING과 화합물 1의 상호작용

도 6은 화합물 1a의 샘플로부터 공결정화된 화합물 1과의 복합체로서의 인간 REF STING의 X선 결정 구조를 보여준다. 화합물은 STING 단백질의 이량체에 의해 형성된 계면 포켓에서 결합한다. 화합물의 아데닌 염기의 양면이 각각 Tyr240 및 Arg238의 구아니딘 기와의 π-π 적층 상호작용을 형성한다. 트랜스 올레핀 링커는 Arg238의 측쇄의 지방족 부분과의 반 데르 발스 상호작용을 형성하는 한편 Arg238의 측쇄의 구아니딘 부분은 외부로부터의 His232의 측쇄의 이미다졸 기와 π-π 적층 상호작용을 형성한다. 올레핀 링커는 Arg238 및 His232의 측쇄들의 상호작용 쌍과 접촉된다. Thr263, Pro264 및 Tyr163에 의해 규정된 소수성 홀 내에 화합물의 리보스 기의 C2' 위치에서의 플루오린 치환기가 배치된다. 화합물의 음으로 하전된 티오포스페이트 기는 각각 Arg238와의 염 가교 및 Ser162 및 Thr267과의 H-결합 상호작용을 형성한다. 잔기 226 내지 243으로 이루어지는 REF STING의 LID 루프 영역이 2개의 염기 기 및 트랜스 올레핀 링커 주위를 감싼다.

실시예 4 - 소포내 투여 경로를 사용하는 뮤린 방광암 모델에서의 화합물 1a의 생체내 평가

MBT-2 뮤린 방광암 동소 모델은 2012년 리(Lee) 등 ("Tumor Establishment Features of Orthotopic Murine Bladder Cancer Models," Urological Oncology 2012;53: 396-400)에 의해 확립되고 특징화되었고, 인간 방광암과 유사한 조직학을 나타냈다. 따라서, 이 모델을 선택하여 화합물 1의 항-방광암 활성을 평가하였다. 리 등에 의해 기재된 HCl 예비-처리 절차를 갖는 프로토콜을 적용하여 모델을 확립하였다. 간략하게, 30 μL 0.1 N HCl 용액을 카테터를 통해 마우스 방광에 도입하고, HCl 용액을 15초 동안 방광에 잔류되도록 하였다. 이어서, HCl 용액을 30 μL 0.1N NaOH 용액으로 대체한 다음, 이어서 1 X PBS (pH7.4)에 의한 1회의 플러싱 단계를 행하였다. 이어진 종양 세포 이식 절차는 원래 문헌으로부터 변형하였다. 간략하게, 플러싱 단계 후에, MBT-2 종양 세포 (50 μL RPMI1640 배지 중 2 x10⁶개의 세포)를 방광으로 주입하고, 45분 동안 잔류되도록 하였다. 이 45분 기간의 종료시, 방광을 비웠다.

종양 세포 이식 3일 후에, 마우스를 표 1에 요약된 스케줄에 따라 다양한 용량의 화합물 1a, BCG (온코TICE(OncoTICE)®, 머크 캐나다 인크.(Merck Canada Inc.), 항-마우스 PD-1 항체 (클론 # RMP1-14, 바이오엑셀(Bioxcell)), 및 화합물 1a 및 PD-1 항체의 조합으로 처리하였다. 화합물 1a 및 BCG는 둘 다 소포내 경로를 통해 투여한 반면, PD1 항체는 복강내 주사를 통해 투여하였다.

각 투여일에, BCG를 NaCl 0.9% (라브아지에(Lavoisier), 프랑스)로 희석하여 투여를 위한 16.875 mg/mL의 최종 농도를 달성하였다. 임의의 나머지 투여 용액은 사용 후에 버렸다. 항-PD-1 항체의 경우, 1 x PBS (론자(Lonza), 프랑스)를 원액을 희석하는데 사용하여 투여용 1 mg/ml 작업 용액을 제조하였다. 화합물 1a의 경우, 건조된 분말을 1 x PBS에 용해시킴으로써 10 mg/ml 원액을 우선 제조하였다. 이어서, 5 mg/mL (400 μg/마우스 군), 2.5 mg/mL (200 μg/마우스 군) 및 1.25 mg/mL(100 μg/마우스 군)를 포함하는 다양한 농도의 화합물 1a를, 원액을 1 x PBS로 추가로 희석하여 제조하였다.

표 1. 치료제 및 투여 스케줄 계획

1. IVe, 방광내 설치

2. IP, 복강내 주사

제20 - 21일로부터, 방광 내의 종양 성장을 MRI (자기 공명 영상화)에 의해 정량화하고, 모든 마우스의 종양 크기를 도 7에 도시된 바와 같이 그래프화하였다. 도 7은 모든 연구 동물의 제20-21일로부터의 MRI에 의한 종양 부피 정량화를 나타냈다. 도 7에 도시된 바와 같이, 모든 화합물 1a 처리군 (군 4 내지 7)은 비히클 군 (군 1), BCG 군 (군 2) 및 PD1 항체 군 (군 3)보다 훨씬 작은 종양 부피를 나타냈다.

화합물 1a는 도 8에 도시된 바와 같이 비히클 처리된 동물에 비해 통계적으로 유의한 생존 이익을 또한 나타냈다.

BCG 및 항-PD1 항체 둘 다는 이 동소 마우스 방광암 모델에서 유의한 항암 활성을 나타내지 않았고, 이는 사용된 모델이 BCG/PD1 항체 저항성/불응성 모델임을 시사하였다.

실시예 103 - HAQ STING 효능제 활성 리포터 검정

THP1-듀얼(Dual)™ 세포 (인비보젠(InvivoGen), Cat# thpd-nfis)를 EC₅₀ 결정에 응용하였다. THP1 듀얼™ 세포는 판매업체 인비보젠에서 HAQ STING 유전자형을 보유하도록 특징화시켰다 (인사이트(Insight) 201402-1). 세포는 제조업체의 권고에 따른 조건 하에 성장 및 유지시켰다. EC₅₀ 결정을 위해 제조업체의 매뉴얼에서 기재된 인터페론 조절 인자 (IRF) 경로 유도를 따랐다. 간략하게, 세포를 시딩하고 37℃, 5% CO₂에서 인큐베이션하면서 20시간 동안 다양한 농도의 화합물로 처리하였다. 세포를 재현탁시키고 QUANTI-Luc™ 용액 (Cat. # : rep-qlc1)을 첨가하였다. 생성된 발광을 발광측정기 (엔비전(Envision), 퍼킨 엘머(Perkin Elmer))에 의해 측정하였다. 획득한 신호를 플로팅하여 EC₅₀을 그래프패드 프리즘(Prism)7 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.

화합물 1a에 대한 인간 STING EC₅₀ (μM) 값은 하기 표 2에 보고된다.

실시예 104 - STING 변이체 특이적 리포터 검정

인간 STING은 WT, HAQ, REF, 및 AQ 변이체를 비롯한 4종의 주요 변이체를 갖는다. R232H로도 언급되는 REF-STING은 예를 들면, 인간 인구의 약 14%에서 발생한다. 야생형 대립유전자와 비교하여, R232H는 박테리아 및 후생동물 시클릭 디뉴클레오티드에 대한 반응이 감소하였다. 이들 4종의 주요 변이체뿐만 아니라 다른 희귀 변이체의 상세사항은 문헌 [Yi G, et al., "Single nucleotide polymorphisms of human STING can affect innate immune response to cyclic dinucleotides" PLoS One 2013; 8:e77846]에 의해 보고되어 있다. STING 변이체 특이적 리포터 세포주는 THP1-듀얼™ KO-STING 세포 (인비보젠, Cat# thpd-kostg) 및 3종의 STING 변이체 단백질 발현 벡터를 사용하여 확립하였다. WT STING에 대한 발현 벡터 지도는 도 9에 제시되어 있다. 다른 2종의 발현 벡터의 경우, WT STING을 적절한 뉴클레오티드 서열로 대체하여, 상이한 STING 변이체 서열을 해당 벡터에 사용하였다.

WT-STING, REF-STING, 및 AQ-STING에 대한 STING 변이체-발현 벡터를 제조하고 이를 각각 WT-STING, REF-STING 및 AQ-STING에 대한 STING 변이체-특이적 리포터 검정을 준비하기 위해 THP1-듀얼™ KO-STING 세포에 안정하게 형질감염시켰다. EC₅₀ 값은 HAQ STING 효능제 활성 리포터 검정을 위한 실시예 103에 상기 기재한 바와 같이 결정하였다. 이하, 결과는 하기 표 2에 제시된다. 이들 STING 변이체에 사용된 DNA 서열은 서열식별번호: 1 (WT 인간 STING의 뉴클레오티드 서열), 서열식별번호: 2 (REF 인간 STING의 뉴클레오티드 서열) 및 서열식별번호: 3 (AQ 인간 STING의 뉴클레오티드 서열)에 제시된다.

실시예 105 -- 마우스 STING 효능제 활성 리포터 검정

RAW-루시아(Lucia)™ ISG 세포 (인비보젠, Cat# rawl-isg)를 마우스 STING 효능제 리포터 검정에 사용하였다. EC₅₀ 값은 HAQ STING 효능제 활성 리포터 검정을 위한 실시예 103에 상기 기재한 바와 같이 결정하였다. 결과는 하기 표 2에 제시된다.

실시예 106 -- 시차 주사 형광측정법 (DSF) 검정

화합물과 재조합 STING 단백질 사이의 물리적 상호작용을 측정하는데 DSF 검정을 사용하였다. 말단절단된 재조합 STING 단백질 (a.a.155-341) (서열식별번호: 4)은 하기 기재된 바와 같이 이. 콜라이에서 발현시켜 검정을 위해 단리하였다. 검정 매트릭스를 384-웰 플레이트에서 1 μM 재조합 STING 단백질 (a.a. 155-341) (서열식별번호: 4), 100 mM KCl이 보충된 100 mM PBS pH 7.4, 5X SYPRO 오렌지색 염료 및 50 μM 화합물 (최종 DMSO 농도 0-1%)로 이루어진 웰당 10 μL의 최종 부피로 제조하였다. 검정은 각각 470 및 586 nm에서의 여기 및 방출 필터 및 0.05℃/분의 속도로 25℃에서 95℃까지의 온도 구배를 사용하는 퀀트스튜디오(QuantStudio) 12K 플렉스 실시간 PCR 시스템에서 수행하였다. 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)® 프로테인 써말 시프트 소프트웨어 (알고리즘 버전 1.3.)에 의해 할당된 형광 도함수 곡선에 따라, 비결합 및 리간드 결합 재조합 STING 단백질의 열 융점 (Tm) 및 열 융점의 차 (dTm D)를 계산하였다.

일반적으로, 0보다 큰 ΔTm 값을 갖는 화합물은 시험 단백질과의 물리적 상호작용을 갖는 것으로 간주되며 ΔTm의 값은 화합물 결합 친화도와 양의 연관을 나타낸다. 여기서, 화합물 1a는 17.6의 ΔTm (표 2)을 나타냈으며, 이는 STING 단백질과의 물리적 상호작용을 의미한다.

표 2 화합물 1a 시험관내 특징화

실시예 107 -- 생체외 인간 PBMC 자극 검정

5명의 건강한 공여자로부터의 인간 혈액을 10.0 mL BD 바큐테이너 나트륨 헤파린 튜브 (cat# 367874)를 사용하여 수집하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 단리는 제조업체가 제공한 프로토콜을 사용하여 시그마 아큐스핀(SIGMA ACCUSPIN) 50ml 튜브 (cat# A2055) 및 시그마 아큐스핀 시스템-히스토파크(HISTOPAQUE)-1077 (cat# A7054) 사용하여 수행하였다. PBMC 층을 수거하고 시그마에 의해 제안된 바대로 1x 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 세척하였다. PBMC를 계수하고 최종적으로 10% 태아 소 혈청 (FBS) (깁코 cat# 20140.79)이 보충된 RPMI (코닝(corning) cat# 10-041-CV) 중에 1x10e6/ml로 현탁하였다. 1ml의 세포 (1x10e6)를 팔콘(Falcon) 5mL 둥근 바닥 폴리프로필렌 시험 튜브 (cat#352063)로 옮기고 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 서로 다른 농도 (0, 0.1, 1, 10 uM)에 의해 자극하였다.

24시간의 인큐베이션 후에 튜브를 5분 동안 1400rpm에서 원심분리하고 상청액을 수거하였다. 상청액은 후속 IFNβ 측정을 위해 -80℃에서 저장하였다. IFNβ 측정은 인간 IFN-β 베이스 키트 (메소 스케일 디아그노스틱스(Meso Scale Diagnostics) cat# K151ADA)를 사용하여 수행하고 제조업체에서 제공한 프로토콜을 사용하였다. IFN-베타 추정은 메소 섹터 이미저(MESO SECTOR Imager) 2400에서 검정 플레이트를 판독하고 MSD 디스커버리 워크벤치(Discovery Workbench) 4.0 프로그램을 사용하여 수행하였다. 24시간후 IFNβ 단백질을 분석하였다. 결과는 화합물 1a가 1차 인간 PBMC IFNβ 단백질 생산을 용량-의존성 방식으로 유도할 수 있다는 것을 제시하였다.

표 3에 제시된 결과는 5명의 상이한 공여자를 사용하여 수행된 측정의 평균을 반영한다.

표 3 생체외 인간 PBMC 자극 검정

IFNβ mRNA 정량화를 위해, 제조업체의 프로토콜에 따라 총 RNA를 RN이지 소형 키트 (퀴아젠, 독일)를 사용하여 단리하였다. IFNβ mRNA는 qPCR 검정에 의해 정량화하였다. 간략하게, 총 RNA (400 ng 내지 1000 ng)를 슈퍼스크립 VILO 매스터믹스(SuperScript VILO MasterMix) (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국)를 사용하여 60-μl 반응 부피에서 cDNA로 전환하였다. 획득한 cDNA (10 ng)를 IFNB1 (Hs01077958_s1) 및 GAPDH (Hs99999905_m1)을 위한 RNA-특이적 프라이머를 사용하는 어플라이드 바이오시스템즈 택맨 발현 검정을 사용하여 후속적으로 증폭시켰다. qPCR 분석은 50℃에서의 초기 2-분 단계에 이어서 2초 동안 95℃ 및 1초 동안 95℃와 20초 동안 60℃의 40회 사이클에 의해, 어플라이드 바이오시스템즈 퀀트스튜디오 12K 플렉스 실시간 PCR 시스템 상에서 택맨 패스트 어드밴스드 마스터 믹스(TaqMan Fast Advanced Master Mix) (라이프 테크놀로지스, 미국)를 사용하여 수행하였다. 상대 유전자 발현은 2-ΔΔCT 방법을 사용하여 참조 유전자 GAPDH에 대한 정규화 후에 계산하였다. 계산은 어플라이드 바이오시스템즈 퀀트스튜디오 12K 플렉스 소프트웨어 v1.2.2를 사용하여 수행하였다. 비히클 처리 샘플 대비 IFNβ mRNA 배수 변화는 표 4에 요약된다. 결과는 화합물 1a가 1차 PBMC에서 IFNβ mRNA를 용량- 및 시간-의존성 방식으로 유도할 수 있다는 것을 제시하였다. 표 4는 5명의 서로 다른 공여자로부터 계산된 평균을 제시한다.

표 4 -- 생체외 인간 PBMC 3-hr & 24-hr 자극 검정 (mRNA)

실시예 108 -- CT26 이중 종양 모델에 대한 화합물 1a의 항암 효과

화합물 1a를 마우스 결장암 모델인 CT26 이중 종양 모델에서의 그의 항암 활성에 대하여 시험하였다. 암컷 5-6 주령 Balb/cJ 마우스 (잭슨 랩스(Jackson Labs), 메인주 바 하버)에게 각 동물의 양측부 상에 각각의 측부에 10⁵개 세포씩 CT26 종양 세포를 피하로 주입하였다. 연구 A의 경우, 평균 종양이 대략 100 mm³에 도달했을 때, 종양 이식 5일 후에 처리 (1.25 mg/kg, 2.5 mg/kg 및 5 mg/kg)를 시작하였다. 연구 B의 경우, 평균 종양이 대략 120 mm³에 도달했을 때, 종양 이식 8일 후에 처리 (0.6 mg/kg 및 10 mg/kg)를 시작하였다. 처리 계획은 표 5 및 표 6에 기재되어 있다.

표 5 연구 A를 위한 투여 계획

*I.T.는 종양내이다.

표 6 연구 B를 위한 투여 계획

*I.T.는 종양내이다.

연구에서의 모든 마우스는 두 개의 피하 CT26 종양을 갖는다. "처리 종양"은 화합물이 직접 투여된 종양을 가리키고, 반면에 "비처리 종양"은 직접적 화합물 투여가 없는 종양을 가리킨다. 종양 부피는 실험 전반에 걸쳐 추적하였다. 종양 부피는 처리 시작 후에 매주 2회 측정한다. 종양 부담은 캘리퍼 측정으로부터 장구형 타원체의 부피에 대한 식 (LxW²)/2에 의해 계산되며, 여기서 L 및 W는 각각 직교 길이 및 폭 측정값 (mm)이다.

화합물 1a는 CT26 이중 종양 모델에서 강력하고 치유력이 있는 활성을 제시하였다 (도 10 및 도 11). 처리 종양의 경우, 20%의 치유율이 심지어 연구에서 시험된 최저 용량 (도 8, 0.6 mg/kg 용량)에서도 검출되었다. 동시에, 가장 높은 용량 (10 mg/kg)은 연구의 종료시에 해당 종양의 동물을 100% 치유하였다. 비처리 종양의 경우, 용량-의존성 항종양 효과가 또한 분명했다. 상위 용량군 (10 mg/kg)은 80% 치유적 효과를 제시하였고; 모든 낮은 용량도 또한 종양 성장 억제 활성을 제시하였다. 따라서, 화합물 1a의 0.6 mg/kg 내지 10 mg/kg의 치료 범위가 관찰되었으며, 주입되지 않은 원위 종양 부위에서의 효과에 기반하여 항종양 활성은 단지 국부뿐만 아니라 전신적으로 나타났다. 결론적으로, 이들 결과는 화합물 1a의 국부 투여가 국부 및 전신 (미주입부) 항암 활성 둘 다를 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 109 -- CT26 간 전이성 모델에 대한 화합물 1a의 항암 효과

화합물 1a를 CT26 간 전이성 모델에서의 그의 항암 활성에 대하여 시험하였다. 마취된 암컷 5-6 주령 BALB/cJ 마우스 (잭슨 랩스, 메인주 바 하버)에게 루시페라제-발현 CT26 종양 세포 (마우스당 5 x 10⁵개 세포)를 비장내 이식하였다. 후속 10분 대기 기간을 통해 종양 세포가 동물의 간으로 순환하게 했다. 이어서, 비장을 제거하고 동물은 봉합하여 회복되도록 하였다. 3일 후에, CT26 종양 세포 (마우스당 10⁵개 세포)를 이번에는, 화합물 투여를 위한 종양 덩이의 발생이 가능하도록 우측 앞다리 부분 아래에 피하로 (sc) 다시 이식하였다. 비장내 이식한지 9일 후에, 화합물 (10 mg/kg)을 sc 종양내로 1회 종양내 투여하였다.

화합물의 국부 항암 효과는 sc 종양에 대한 그의 효과를 통해 측정하였고, 한편 화합물의 미주입부 효과(abscopal effect)는 각각 마우스 간 내의 성장하는 종양 덩이의 유해한 효과에 기반하여, 비히클 처리 대조군 마우스와 비교한 처리 마우스의 전체 생존에 의해 평가하였다. 화합물 1a는 국부 sc 종양에 대한 강력한 활성 및 10마리의 처리된 동물 중 9마리에서의 또한 치유적 전신 활성 둘 다를 제시하였다 (도 12). 이들 결과는 화합물 1a의 국부 투여가 간에서와 같은 심부 병변을 비롯한 국부 및 전신 (미주입부) 항암 활성 둘 다를 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 110 -- GL261 뇌 동소 모델에 대한 화합물 1a의 항암 효과

화합물 1a를 GL261 뇌 동소 모델에서의 그의 항암 활성에 대하여 시험하였다. GL261은 뮤린 신경교종 세포주이다. 루시페라제 발현 GL261 마우스 신경교종 세포 (2x10⁴개 세포/마우스)를 암컷 5-6주령 B6 알비노 마우스 (잭슨 랩스, 메인주 바 하버)에게 두개내로 이식하였다. 3 내지 4일 후에, GL261 세포를 화합물 투여를 위한 종양 덩이의 발생이 가능하도록 우측 앞다리 부분 아래 피하로 (10⁶개 세포/마우스) 이식하였다. 두개내 종양 세포 이식한지 10일 후에, 화합물 (10 mg/kg)을 sc 종양 내로 1회 종양내 투여하였다. 화합물의 국부 항암 효과는 sc 종양에 대한 그의 효과를 통해 측정하였고, 한편 화합물의 미주입부 효과는 각각 마우스 뇌 내의 성장하는 종양 덩이의 유해한 효과에 기반하여, 비히클 처리 대조군 마우스와 비교한 처리된 마우스의 전체 생존에 의해 평가하였다. 화합물 1a는 국부 sc 종양에 대한 강력한 활성 및 8마리의 처리된 동물 중 5마리에서의 치유적 전신 활성 둘 다를 제시하였다 (도 13). 이들 결과는 화합물 1a의 국부 투여가 뇌에서와 같은 심부 병변을 비롯한 국부 및 전신 (미주입부) 항암 활성 둘 다를 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 111 - 비교

본원에 참조로 포함되는 문헌 [Corrales, et al., "Direct Activation of STING in the Tumor Microenvironment Leads to Potent and Systemic Tumor Regression and Immunity," Cell Reports (2015) 11:1018-1030]에 보고된 바와 같이, 본 개시내용의 화합물 1a, 천연 STING 리간드 (2'3' cGAMP), 및 추정 STING 효능제 ML RR-S2 CDA를 사용한 헤드-투-헤드 비교로 WT STING, HAQ STING, AQ STING, 및 REF STING의 인간 STING 검정에서의 EC₅₀ 값을 계산하였다. 검정은 상기 제시된 실시예에 기재된 대로 수행하였다. 표 7에서의 보고된 검정 값은 헤드-투-헤드 비교에서 수행된 검정에 국한되며 상기 등에 보고된 바의 더 큰 시험 수에 걸쳐 결정된 평균 값을 반영하지 못할 수 있다는 것에 유의한다. "2'3' cGAMP"는 문헌 [Cell Reports] 간행물에 보고된 바의 "ML cGAMP"와 동일하다는 것에 또한 유의한다.

표 7

표 7은 또한 등온 적정 열량측정법 (ITC)에 의해 측정된 바의 시험된 3가지 화합물 각각에의 인간 WT STING의 결합에 대한 해리 결합 상수 (Kd)를 보고한다. ITC는 분자간 상호작용과 연관된 열역학 특성을 측정하는 마이크로열량 적정 기술이다. 이들 시험에 기반하여, 화합물 1a는 시험된 화합물 중 WT STING과 가장 강한 결합을 형성하는 것으로 보인다.

물질

재조합 인간 야생형 STING (aa, 139-379, H232R) 단백질은 아미노산 139-379를 포함하는 인간 WT STING의 시토졸 도메인을 코딩하는 구축물을 이. 콜라이에서 발현시킴으로써 생성하였다.

시약

본 연구에 사용된 시약의 공급업체는 하기 제시된다:

단백질 완충제 제조

STING 단백질을 각각 5% 글리세롤 함유 PBS, pH 7.5 중 3.0 mg/ml 및 20 mg/mL의 농도에서의 90 μL 및 100 μL 분취물로 -60℃에서 저장하였다. 분석일에, 단백질의 분취물을 해동하고, 400 uL로 희석하고 에펜도르프 마이크로원심분리기로 적어도 4회 10분 14000 x g 원심분리하면서 아미콘 울트라(Amicon Ultra) 원심분리 필터 유닛 (10k MW 컷오프, 0.5 mL)를 사용하여 PBS 내로 완충제-교환한 다음, 최종적으로 1X PBS로 20 μM 내지 30 μM (실험-의존성)로 희석하였다. 단백질 농도는 나노드롭 2000 분광광도계 및 22140 (M^-1cm^-1)의 단백질 흡광 계수를 사용하여 결정하였다.

샘플 제조

화합물 1a, 2'3' cGAMP 및 ML RR-S2CDA의 1 mM 원액 200 μL를 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 의해 공급하였다. 각각의 실험전에, 샘플을 200 uM 내지 500 uM (실험-의존성)의 농도로 희석하였다.

방법

ITC 클리닝 액세서리 (TA 인스트루먼츠 no. 601800.901)를 구비한 친화도 ITC 유닛 (TA 인스트루먼츠 no 609003.901)에서 검정을 수행하였다. 20 μM 내지 30 μM STING 단백질을 함유하는 STING 단백질 용액 대략 400 μL를 약간의 허용되는 오버로드를 허락하는 185 μL 열량계 셀에 피펫팅하였다. 참조 셀은 밀리-Q 워터 등가량을 함유했다. 100 μM 내지 300 μM 화합물을 20 x 2.5 μL 주입하면서 25℃에서 인큐베이션을 수행했다. 제어 소프트웨어는 ITC 런 Ver. 3.3.0.0 (TA 인스트루먼츠)였고, 이를 사용하여 각 주입에서의 발열률을 나타내는 미가공 열 (μcal/sec)의 다중 피크로 이루어지는 온도기록도를 얻었다. 분석 소프트웨어 나노 분석 Ver. 3.70 (TA 인스트루먼츠)을 사용하여 블랭크 또는 샘플 희석열 (포화시에)에 대해 보정하는 기준선-보정하고 발열률 피크를 적분하여 그래프로 나타낸 "Q" 값을 생성하였다. 생성된 등온선은 열역학 파라미터를 도출하는 독립적 모델로 핏팅하였다.

Kd 및 n 값 (곡선 변곡점에서의 몰비)을 도출하고 보고하였다. 단백질 및 리간드의 농도에 대한 최적 조건은 예비 실험으로부터 도출하였다.

결과

재조합 인간 야생형 STING (aa, 139-379, H232R)에의 시험 화합물의 결합에 대한 발열률 온도기록도 및 그의 생성된 등온선을 결정하였다. STING에의 각각 화합물의 결합은 음의 발열률과 발열 (양의 방향) 희석열 (화합물이 단백질 포화를 달성한 후에 관찰됨)에 의해 나타나는 바와 같이 흡열성이었다. 2', 3' cGAMP가 다양한 STING 변이체에 대해 유사한 흡열 반응을 일으키는 것으로 나타났다. 화합물 1a는 0.04 μM의 최하위 Kd를 제공하였고, 0.07 μM의 Kd를 갖는 2'3' cGAMP 및 이어서 0.40 μM의 Kd를 갖는 ML RR-S2 CDA가 이어졌다. 모든 화합물은 0.5에 근접한 n 값을 제공하였으며, 이는 STING 단백질이 이량체로서 존재하고 STING 2 mol 당 화합물 1 mol이 결합한다는 것을 시사한다.

실시예 112 - 잠재적 대사물의 확인

주요 대사물의 형성을 평가하기 위해, 화합물 1a를 CD-1 마우스, 스프라그 돌리 래트, 비글 개, 시노몰구스 원숭이 및 인간의 간세포 중에서 인큐베이션하였다.

물질

저온 보존된 풀링된 간세포는 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific) (매사추세츠주 월섬), 제노테크(Xenotech), LLC (캔자스주 캔자스 시티) 및 인 비트로 ADMET 래보러토리즈 (In Vitro ADMET Laboratories) (메릴랜드주 콜럼비아)으로부터 구입하였고 적절한 배지는 인 비트로 ADMET 래보러토리즈 (메릴랜드주 콜럼비아) 및 라이프 테크놀로지스 (캘리포니아주 칼스배드)로부터 구입하였다. AOPI 스테이닝 용액 및 포스페이트 완충제는 각각 코닝 라이프 사이언시스 (매사추세츠주 트윅스버리) 및 넥스셀롬 바이오사이언스(Nexcelom Bioscience) (매사추세츠주 로렌스)로부터 구입하였다. 분석에 사용되는 모든 화학물질, 시약 및 용매는 각각 분석 또는 HPLC 등급의 것이었다.

실험 설계 및 절차

간세포 인큐베이션

화합물 1a를 칭량하고 1020 mmol/L을 만들기 위해 0.12% 포름산 PBS 함유 HPLC-물 중에 용해시켰다. 용액은 이어서, 0.1% 인간 혈청 알부민 및 2 mmol/L L-글루타민 함유 윌리암스 E 배지로 4 mmol/L까지 개별적으로 2.5배 희석한 다음 추가로 21000배 희석하여 20 μmol/L의 농도를 갖는 작업 스톡 용액을 만들었다.

인큐베이션전에, 동결보존된 간세포를 37℃의 수조에서 해동하였다. 동결보존된 간세포의 1개 튜브를 인 비트로 ADMET 래보러토리즈 (메릴랜드주 콜럼비아)로부터 입수한 동결보존된 간세포 회복 배지 (UCRM)의 각각 50-mL 원추형 튜브에 첨가하였다. 세포를 실온 4℃에서 10분 동안 740 rpm으로 GH 3.8 로터에 의해 베크만(Beckman) 원심분리기 (캘리포니아주 브레아)에서 회전시켰다. 상청액을 제거하고 세포는 계수를 위한 플레이팅 배지 중에 재현탁하였다. 세포를 플레이팅 배지 중에 재현탁한 후, 재현탁액 20 μL를 옮겨 AOPI 스테이닝 용액 20 μL와 혼합하였다. 용액은 완만하게 혼합하고 세포를 셀로미터(Cellometer) (넥스셀롬, 매사추세츠주 로렌스)를 사용하여 계수하였다. 계수한 후, 이어서 세포를 2 mmol/L L-글루타민 함유 윌리암스 E 배지 (pH 7.4) 중에 1 또는 2백만개의 생존 세포/ml로 재현탁하였다.

간세포 현탁액 (50 μL/웰)을 48-웰 플레이트에 첨가하였다. 화합물 1a (20 μmol/L) 함유 작업 스톡 용액 50 마이크로리터를 첨가하여 반응을 시작하였다. 플레이트를 조직 배양 인큐베이터 (5% CO₂/95% 공기 가습 분위기 및 37℃)에 배치하고 반응을 2010 ng/mL 푸로세미드 및 0.2 μmol/L (R)-프로프라놀롤 함유 100%메탄올/아세토니트릴 (1/1, v/v)로 이루어진 200 μL의 정지 용액으로 5, 30, 60, 120, 180 및 240분에 정지시켰다. 혼합물을 원심분리하고 여과하고 상청액은 분석을 위해 수집하였다. 동결보존된 간세포의 최종 농도는 1 x 10⁶개 세포/mL이었다. 화합물 1a의 최종 인큐베이션 농도는 10 μmol/L였다.

대사물 확인을 위한 LC-MS/MS 조건

LC-MS/MS 시스템은 시마즈(Shimadzu) HPLC 및 에이비 사이엑스 트리플(AB-SCIEX Triple)TOF 5600 하이브리드 사중극자 및 TOF 질량 분광계 (매사추세츠주 프레이밍햄)으로 구성하였다. 시마즈 HPLC (교토, 일본)는 통신 버스 모듈 (CBM-20A), 부착된 랙 체인저 (랙 체인저 II) 2개 펌프(LC-30AD)가 구비된 자동 샘플러 (SIL-30AC) 및 칼럼 오븐 (CTO-30A)으로 이루어졌다. 질량 분광계는 음성 및 양성 보정 용액 (매사추세츠주 프레이밍햄) 둘 다에서 에이비 사이엑스 APCI를 사용하여 보정하였다. 간세포와의 인큐베이션으로부터 획득된 샘플은 둘 다의 음성 및 양성 스캔 모드 하에 분석하였다. 기초적 분석 방법 및 기기 조건은 아래 요약된다. 분광계 셋팅의 변형은 분석물의 필요성에 의존한다.

LC-MS/MS 조건:

활성 데이터의 데이터 분석

질량 분광측정법 데이터는 에이비 사이엑스 애널리스트 TF (버전 1.5.1; 매사추세츠주 프레이밍햄)를 사용하여 획득하였다. 크로마토그램 및 스펙트럼은 에이비 사이엑스 피크뷰(PeakView) (버전 2.2.0.1; 매사추세츠주 프레이밍햄)를 사용하여 획득하였다. 추출된 이온 크로마토그램에 대한 상대 피크 면적의 비교는 각각 관심 분석물에 대해 예상된 정확한 질량 대 전하 비 (m/z)의 ± 0.0002 Da를 기초로 하였다.

결과

대사물은 간세포와의 인큐베이션에서 검출되지 않았다. 본 분석 조건 하에, 화합물 1a는 대략 7.8분의 체류 시간을 나타냈다. 음성 스캔 모드 하에, 화합물 1a는 탈양성자화 분자 이온 m/z 745 (C₂₄H₂₅F₂N₁₀O₈P₂S₂ ^-) 및 2중 탈양성자화 분자 이온 m/z 372 (C₂₄H₂₄F₂N₁₀O₈P₂S₂ ^2-)를 나타냈다. m/z 533 (C₁₉H₁₉FN₁₀O₄PS^-) 및 m/z 186 (C₉H₈N₅ ^-)을 갖는 주요 MS/MS 생성물 이온이 관찰되었다. 양성 스캔 모드 하에, 화합물 1a는 양성자화 분자 이온 m/z 747 (C₂₄H₂₇F₂N₁₀O₈P₂S₂ ⁺) 및 주요 MS/MS 생성물 이온 m/z 651 (C₂₄H₂₆F₂N₁₀O₆PS⁺), m/z 252 (C₁₀H₁₁FN₅O₂ ⁺) 및 m/z 188 (C₉H₁₀N₅ ⁺)을 나타냈다. MS 및 MS/MS 데이터는 화합물 1a의 구조를 확인하였다.

화합물 1a는 마우스, 래트, 개, 원숭이 및 인간의 간세포와의 인큐베이션에서 안정성이었다. 화합물 1a의 어떤 분명한 대사물도 이 연구에서 확인되지 않았다. 간세포와의 인큐베이션으로부터 획득된 샘플에서, 오로지 화합물 1a 그 자체를 탠덤 질량 분광측정법 (MS/MS)의 단편에 의해 검출 및 확인할 수 있었다.

본 개시내용에 참조된 모든 문헌은 참조로 본원에 포함되며, 어느 포함된 문헌이 기재된 본 명세서와 상충되는 경우에 기재된 본 명세서가 우선할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다양한 변화 및 변형이 본원에 제공된 자료에 대해 이루어질 수 있으며 그러한 자료는 본 개시내용의 범주 및 취지 내에 있다는 것을 인지할 것이다.

서열 목록

SEQUENCE LISTING <110> Eisai R&D Management Co., Ltd. Kim, Dae-Shik <120> Methods for the Treatment of Bladder Cancer <130> 0080171-000500 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1140 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgccccact ccagcctgca tccatccatc ccgtgtccca ggggtcacgg ggcccagaag 60 gcagccttgg ttctgctgag tgcctgcctg gtgacccttt gggggctagg agagccacca 120 gagcacactc tccggtacct ggtgctccac ctagcctccc tgcagctggg actgctgtta 180 aacggggtct gcagcctggc tgaggagctg cgccacatcc actccaggta ccggggcagc 240 tactggagga ctgtgcgggc ctgcctgggc tgccccctcc gccgtggggc cctgttgctg 300 ctgtccatct atttctacta ctccctccca aatgcggtcg gcccgccctt cacttggatg 360 cttgccctcc tgggcctctc gcaggcactg aacatcctcc tgggcctcaa gggcctggcc 420 ccagctgaga tctctgcagt gtgtgaaaaa gggaatttca acgtggccca tgggctggca 480 tggtcatatt acatcggata tctgcggctg atcctgccag agctccaggc ccggattcga 540 acttacaatc agcattacaa caacctgcta cggggtgcag tgagccagcg gctgtatatt 600 ctcctcccat tggactgtgg ggtgcctgat aacctgagta tggctgaccc caacattcgc 660 ttcctggata aactgcccca gcagaccggt gaccgggctg gcatcaagga 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Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu 245 250 255 Gln Ala Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala 260 265 270 Pro Glu Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala 275 280 285 Asp Asp Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg 290 295 300 Gln Glu Glu Lys Glu Glu Val 305 310

Claims (15)

1. 방광염의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 방광암을 치료하는 방법.
   

   
2. 제1항에 있어서, 상기 제약상 허용되는 염이 디암모늄 염인 방법.
3. 방광암의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 방광암을 치료하는 방법.
   

   
4. 방광암을 치료하기 위한 제약 조성물을 제조하기 위한 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도.
   

   
5. 방광암의 치료에서의 화합물 1, 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물의 용도.
   

   
6. 화합물 1, 화합물 1의 제약상 허용되는 염 또는 화합물 1 또는 화합물 1의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물에 의해 치료가능한 방광암을 갖는 개체를 확인하는 것; 및
   방광암이 치료가능한 것으로 확인된 상기 개체에게 유효량의 화합물, 제약상 허용되는 염 또는 제약 조성물을 투여하는 것
   을 포함하는, 방광암을 치료하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 개체가 환자에서 REF STING 변이체 대립유전자의 존재에 의해 화합물 1, 화합물 1의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 1 또는 화합물 1의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물에 의해 치료가능한 방광암을 갖는 것으로 확인되는 것인 방법.
8. REF STING 대립유전자를 갖는 환자에게 화합물 1, 화합물 1의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 1 또는 화합물 1의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 방광암을 치료하는 방법.
9. WT STING 대립유전자를 갖는 환자에게 화합물 1, 화합물 1의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 1 또는 화합물 1의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 방광암을 치료하는 방법.
10. AQ STING 대립유전자를 갖는 환자에게 화합물 1, 화합물 1의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 1 또는 화합물 1의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 방광암을 치료하는 방법.
11. HAQ STING 대립유전자를 갖는 환자에게 화합물 1, 화합물 1의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 1 또는 화합물 1의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 방광암을 치료하는 방법.
12. 방광암의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 STING 효능제를 투여하는 것을 포함하는, 방광암을 치료하는 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물 1, 화합물 1의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 1 또는 화합물 1의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물의 투여를 소포내로 수행하는 것인 방법 또는 용도.
14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 방광암이 비-근육 침습성 방광암인 방법 또는 용도.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물 1, 화합물 1의 제약상 허용되는 염, 또는 상기한 것들 중 어느 하나를 포함하는 제약 조성물의 투여가 소포내 투여에 의한 것인 방법.

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