CN105377867B - I型干扰素的环状二核苷酸诱导 - Google Patents

I型干扰素的环状二核苷酸诱导 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于提高细胞中的I型干扰素(IFN)的产生的方法和组合物。所述方法的方面包括以足以提高细胞产生所述I型干扰素(IFN)的方式提高所述细胞中的包含2'‑5'磷酸二酯键的环状二核苷酸的水平。还提供了用于实施该方法的实施方案的组合物和药剂盒。

Description

I型干扰素的环状二核苷酸诱导
相关申请的交叉引用
在35 U.S.C.§119(e)下，本申请要求于2013年5月3日提交的美国临时专利申请序列号61/819,499的提交日期的优先权；该申请的公开内容通过引用并入本文。
政府权利
本发明在由美国国立卫生研究院资助的基金号AI063302、AI075038、AI080749、AI082357和OD008677下经政府支持下完成。政府在本发明中享有一些权利。
引言
干扰素(也称为“IFN”)是具有多种生物学活性的蛋白质，其中一些是抗病毒、免疫调节和抗增殖。它们相对较小的物种特异的单链多肽，由哺乳动物应答暴露于多种诱导物例如病毒、多肽、促分裂原等而产生。干扰素保护动物组织和细胞免受病毒攻击，并且是重要的宿主防御机制。在大多数情况下，与其他组织和细胞类型相比，干扰素提供了对产生它们的组织和细胞类型的更好的保护，这说明来源于人的干扰素可比来自其他物种的干扰素更有效地治疗人疾病。干扰素可分为I型干扰素、II型干扰素和III型干扰素。哺乳动物I型干扰素包括IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω和IFN-ζ(也称为限制素，limtin)。
诱导干扰素产生的试剂可用作疫苗佐剂，以及用于启动效应T细胞应答和记忆T细胞应答的制剂。有效的佐剂增强针对抗原的特异性免疫应答，同时最小化毒副作用，降低疫苗接种的次数和剂量，并且扩展免疫应答。仍然存在对这样的有效佐剂的需要，所述佐剂可与来源于细胞内病原体和癌细胞的抗原共配制以活化有效的细胞免疫应答和体液免疫应答，从而治疗细胞内病原体以及降低肿瘤负荷。干扰素蛋白的免疫调节活性和调控干扰素产生的信号通路作为用于设计新佐剂的标靶吸引了兴趣。
干扰素具有治疗很多人癌症的潜力，因为这些分子具有在多重水平起作用的抗癌活性。首先，干扰素蛋白可直接抑制人肿瘤细胞的增殖。该抗增殖活性还与多种批准的化疗剂协调，例如，顺铂、5FU和紫杉醇。其次，干扰素蛋白的免疫调节活性可导致诱导抗肿瘤免疫应答。该应答包括活化NK细胞、刺激巨噬细胞活性和诱导MHC I型表面表达，导致诱导抗肿瘤细胞毒性T淋巴细胞活性。此外，在免疫系统中干扰素起交叉呈递抗原的作用。此外，一些研究还显示，IFN-β蛋白可具有抗血管生成性活性。血管发生、新血管形成是固体肿瘤生长的临界点。有证据显示，IFN-β可通过抑制原血管生成性因子例如bFGF和VEGF的表达来抑制血管发生。最后，干扰素蛋白可通过调节在组织重塑方面重要的酶例如胶原酶和弹性酶的表达来抑制肿瘤侵袭性。
干扰素还表现出具有基于两种不同机制的抗病毒活性。例如，I型干扰素蛋白(α和β)可直接抑制人乙肝病毒(“HBV”)和丙肝病毒(“HCV”)的复制，并且还可刺激攻击被这些病毒感染的细胞的免疫应答。
概述
本发明提供了用于提高细胞中的I型干扰素(IFN)的产生的方法和组合物。所述方法的方面包括以足以提高细胞产生所述I型干扰素(IFN)的方式提高所述细胞中的包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸的水平。还提供了用于实施该主题方法的组合物和药剂盒。
在一个方面中，本文提供了一种用于提高细胞中I型干扰素(IFN)的产生的方法，这通过以足以提高细胞产生所述I型干扰素(IFN)的方式提高所述细胞中的包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸的水平来进行。
在某些实施方案中，所述方法包括使所述细胞与所述环状二核苷酸接触的步骤。在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有两个2'-5'磷酸二酯键。在另一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有2'-5'磷酸二酯键和3'-5'磷酸二酯键。
在某些实施方案中，所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含两个鸟苷。在某些实施方案中，所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含两个腺苷。在另一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸和鸟苷核苷酸。
在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：
其中X和Y分别是：
在一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：
在所述方法的某些实施方案中，通过提高所述细胞中的cGAMP合酶(cGAS)的活性来提高所述环状二核苷酸的水平。在一些实施方案中，通过增强编码cGAS的核酸的表达来提高所述cGAS的活性。在一些实施方案中，通过将编码cGAS的核酸引入所述细胞中来提高所述cGAS的活性。
在某些实施方案中，所述方法用于提高干扰素(IFN)α的产生。在另一些实施方案中，所述IFN是干扰素β。
在某些实施方案中，所述方法用于提高哺乳动物细胞中的I型干扰素(IFN)的产生。在一些具体实施方案中，哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞是体外的。在另一些实施方案中，所述细胞是体内的。
在另一个方面中，本文提供了用于提高受试者中I型干扰素(IFN)的产生方法，所述方法包括将有效提高所述受试者中的所述I型干扰素的产生的量的包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸活性剂施用至受试者的步骤。
所述活性剂可包括但不限于本文描述的任何包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸。在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有两个2'-5'磷酸二酯键。在另一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有2'-5'磷酸二酯键和3'-5'磷酸二酯键。
在一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。在某些实施方案中，所述环状二核苷酸包含两个鸟苷。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸。在一些具体实施方案中，所述环状二核苷酸包含两个腺苷。在另一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸和鸟苷核苷酸。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：
其中X和Y分别是：
在主题方法的一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：
在某些实施方案中，所述包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸活性剂是提高cGAMP合酶(cGAS)的细胞活性的药剂。在一些具体实施方案中，所述药剂包含编码所述cGAS的核酸。
在某些实施方案中，所述方法用于提高受试者中干扰素(IFN)α的产生。在另一些实施方案中，所述方法用于提高受试者中干扰素β的产生。
在某些实施方案中，所述对象患有病毒性感染。在某些实施方案中，所述对象患有细菌性感染。在另一些实施方案中，所述对象患有肿瘤性疾病。在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。
在另一个方面中，本文提供了一种用于提高受试者中干扰素基因(STING)的刺激物介导的应答的方法，所述方法包括将有效提高所述受试者中STING介导的应答的量的STING活性剂施用至所述受试者。在某些实施方案中，所述STING介导的应答是对具有两个3'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸无应答性。
所述STING活性剂可包括但不限于本文描述的任何包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸。在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有两个2'-5'磷酸二酯键。在另一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有2'-5'磷酸二酯键和3'-5'磷酸二酯键。
在一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。在某些实施方案中，所述环状二核苷酸包含两个鸟苷。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸。在一些具体实施方案中，所述环状二核苷酸包含两个腺苷。在另一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸和鸟苷核苷酸。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：
其中X和Y分别是：
在主题方法的一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：
在某些实施方案中，所述STING活性剂包含提高cGAMP合酶(cGAS)的细胞活性的药剂。在一些具体实施方案中，所述药剂包含编码所述cGAS的核酸。
在某些实施方案中，所述STING活性剂包含提高STING的细胞活性的药剂。在一些具体实施方案中，所述药剂包含编码所述STING的核酸。
在某些实施方案中，所述对象患有病毒性感染。在某些实施方案中，所述对象患有细菌性感染。在另一些实施方案中，所述对象患有肿瘤性疾病。在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。
在另一个方面中，本文提供了一种环状二核苷酸，其包含2'-5'磷酸二酯键。这样的环状二核苷酸可用于例如实施主题方法，包括但不限于用于提高细胞或受试者中I型干扰素的产生的方法。
在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有两个2'-5'磷酸二酯键。在另一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有2'-5'磷酸二酯键和3'-5'磷酸二酯键。
在某些实施方案中，所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含两个鸟苷。在某些实施方案中，所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含两个腺苷。在另一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸和鸟苷核苷酸。
在一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：
其中X和Y分别是：
在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：
在另一个方面中，本文提供了一种组合物，其包含包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸和药学上可接受的载体。
在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有两个2'-5'磷酸二酯键。在另一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有2'-5'磷酸二酯键和3'-5'磷酸二酯键。
在某些组合物的实施方案中，所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含两个鸟苷。在某些实施方案中，所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含两个腺苷。在另一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸和鸟苷核苷酸。
在主题组合物的某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：
其中X和Y分别是：
在主题组合物的某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：
附图简述
当结合附图来阅读时，本发明将从以下详细描述中得到最佳理解。强调的是，按照惯例，附图的多个特征不是按比例的。相反，为了清楚，任意扩展或缩小多个特征的尺寸。附图中包括以下图：
图1示出了人STING变体对映射至精氨酸232的环状二核苷酸的可变应答性。(A)用编码靶向STING的shRNA或对照shRNA的载体转导THP-1细胞。然后用环状二GMP(cdG)、dsDNA、环状二AMP(cdA)、多肌苷：胞嘧啶(pI:C)或仙台病毒刺激细胞，并通过定量逆转录酶PCR来评估人干扰素-βmRNA的诱导。(B)蛋白质印迹确认STING的敲除有效。(C)用指定量的多种小鼠(m)或人(h)STING表达质粒转染HEK293T细胞，然后在6小时后通过用合成的cdG(5μM)转染来刺激该细胞。GT表示来自Goldenticket(Gt)小鼠的Sting的空I199N等位基因。通过使用共转染的IFN荧光素酶报告子构建体来评估STING活化。(D)用编码所指定的STING等位基因的逆转录病毒载体转染Gt(空STING)巨噬细胞，然后在48小时后通过用cdG(5μM)或dsDNA 70聚体的寡核苷酸(0.5μg/mL)刺激该细胞。通过qRT-PCR测量IFN诱导。ND，未检出。(E)STING与32P-环状二GMP的结合测定。将STING蛋白表达于HEK293T细胞中，并使细胞裂解物经历与32P-cdG的UV交联，并通过SDS-PAGE解析。通过放射自显影来对结合进行定量。以抗STING多克隆抗体进行的对细胞裂解物的蛋白质印迹确认多种STING蛋白的相似表达。(F)mSTING对cGAMP的应答性受到R231突变的影响。如在C中那样测试所指定的突变体。
图2示出了hSTING变体的序列对齐。从THP-1细胞克隆hSTING，与参照STING等位基因(NCBI NP_938023.1)对比。
图3示出，环状二GMP的应答性需要人STING的R232，但环状二GMP的结合不需要。(A)用所指定小鼠(m)STING或人(h)STING等位基因转染293T细胞，然后用环状二GMP(cdG)刺激该细胞。通过诱导共转染的IFN-荧光素酶报告子构建体来检测STING活性，并将该活性表示为相对于未经刺激的细胞的荧光素酶活性的诱导倍数。(B)在α32P-环状二GMP的存在下对经转染的293T细胞的裂解物进行UV交联，通过SDS-PAGE进行解析，然后通过放射自显影来分析。还对裂解物进行针对STING和作为平行表达对照的ACTIN的蛋白质印迹。
图4示出，对环状二核苷酸的最优应答性需要G230A和H232R二者，但对环状二核苷酸的结合不需要。(A,B)用所指定小鼠(m)STING或人(h)STING的等位基因转染293T细胞，然后用环状二GMP(cdG)刺激该细胞。通过诱导共转染的IFN-荧光素酶报告子构建体来检测STING活性。
图5示出，STING变体对cGAS有应答。(A)用所指定的STING等位基因以及用所指定的人cGAS和小鼠cGAS(wt和GS>AA突变体)转染HEK293T细胞。通过共转染的IFN荧光素酶报告子构建体来评估STING活化。(B)用所指定的STING等位基因以及用编码来自霍乱弧菌(V.cholerae)的cGAMP合酶(DncV)的哺乳动物表达载体转染HEK293T细胞。如A中一样评估STING活化。(C)将rWspR、rDncV和rcGAS的体外酶促生成的产物转染至经毛地黄皂苷通透的表达所指定的小鼠STING蛋白和人STING蛋白的HEK293T细胞中。包括作为对照的化学合成的环状二GMP(cdG)和cGAMP。如A和B中一样评估STING活化。
图6示出，cGAS产生包含2'-5'磷酸二酯键的非标准环状二核苷酸。(A)将纯化的重组WspR、DncV和cGAS与α32P-GTP或α32P-ATP和所指定的未经标记的核苷酸混合。将反应物与TLC电泳缓冲剂混合，并在PEI-纤维素TLC板上解析核酸物质。(B)用核酸酶P1和蛇毒磷酸二酯酶消化经α32P-GTP标记的WspR、DncV和cGAS产物，并且在PEI-纤维素TLC板上解析核酸物质。(C)在600MHz和50℃下得到HPLC纯化的cGAS产物的1H-31P HMBC。指定了磷酸二酯键的通过-结合的关键相关性。还示出了cGAS产物的NMR显示的结构。
图7提供了对cGAS产物的附加NMR分析。所有数据采集都在D2O中和50℃下进行。(A,B)900MHz场中的多重性编辑的1H-13C HSQC实验。与次甲基和甲基质子对应的正相信号以绿色示出，与亚甲基质子对应的负相信号以蓝色示出。(C)600MHz场中的1H-1H COSY实验。(D)900MHz场中的1H-1H NOESY实验。
详述
本发明提供了用于提高细胞中的I型干扰素(IFN)的产生的方法和组合物。所述方法的方面包括以足以提高细胞产生所述I型干扰素(IFN)的方式提高所述细胞中的包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸的水平。还提供了用于实施该主题方法的实施方案的组合物和药剂盒。
在更详细描述本发明之前，应理解，本发明不限于所描述的特定实施方案，因为这些当然是可变化的。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定的实施方案，并非旨在限制，因为本发明的范围将仅受所附权利要求书的限制。
在提供值的范围的情况下，应理解，除非上下文清楚地另有说明，否则该范围上限与下限的每个中间值以及指定范围中的任何其他指定值或中间值，直至下限的十分之一单位，都涵盖与本发明内。较小的范围中可独立地包括这些较小范围的上限和下限，并且这些上限和下限将涵盖于本发明内，受到所陈述范围中的任何具体排除的限值。在所陈述的范围包括一个或两个该限值的情况下，本发明中包括排除所包括的限值之一或这二者的范围。
在本文中某些范围是以在数值前加术语“约”来呈示的。本文中使用术语“约”以提供对其后面的精确数字以及其后面的数字的附近或近似该数字的数字提供字面支持。在确定数字是否在具体列举的数字附近或近似该数字中，接近或近似的所列举的数字可为在示出其的上下文中提供具体列举的数字的基本等价物的数字。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语都具有与由本发明所属领域的技术人员所通常理解相同的含义。虽然与本文描述的方法和材料相似或等价的任何方法和材料都可用于本发明的实施或测试中，但是现在描述代表性的示例性方法和材料。
本说明书中引用的所有出版物和专利都通过引用并入本文，就如将每个单独的出版物或专利特别地和单独地指定为通过引用并入一样，并且所有出版物和专利都通过引用并入本文以结合所引用的出版物来公开和描述方法和/或材料。对任何出版物的引用都是针对其在提交日期之前的公开内容，并且其不应解释为承认由于在先发明而使本发明不享有先于该出版物的权利。此外，提供的出版物的日期可能与实际的公开日期不同，这可需要进行单独地确认。
应注意，除非上下文另有清楚指明，否则本文以及所附权利要求中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物。还应注意，可撰写权利要求书来排除任何可选要素。同样地，该陈述旨在用作与权利要求要素的列举联合使用此类排他性术语如“单独”、“仅仅”等、或使用“否定”限制的在线基础。
在阅读本公开后，对本领域技术人员应显而易见的是，本文描述和示出的每一个单独的实施方案具有单独的组分和特征，该组分和特征可与任何其他一些实施方案的特征分离或组合，而不脱离本发明的范围和精神。任何列举的方法可按所列举的事件的顺序或以逻辑可行的任何其他顺序进行。
方法
如上文所概括，提供了提高细胞中I型干扰素(IFN)的产生(例如在体外或体内)的方法。提高I型干扰素的产生是指，与对照相比，主题方法提高了细胞中I型干扰素的产生。该提高的量级可变化，并且在一些例子中为，与合适的对照相比，2倍或更大，例如5倍或更大，包括10倍或更大。同样，在一些例子中，所述方法是与合适的对照相比，将细胞中I型干扰素的产生提高2倍或更大的量级，例如5倍或更大，包括10倍或更大。在实施所述方法之前检测不到干扰素的产生的一些实施方案中，该提高可导致可检测的量的干扰素产生。可通过使用任何合适的方法来测量干扰素产生，包括但不限于，水疱性口炎病毒(VSV)激发生物测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、基于复制子的生物测定或通过使用在I型干扰素信号通路的调控下克隆的报告基因(例如，荧光素酶)。参见例如Meager J.Immunol.Methods 261:21-36(2002)；Vrolijk等C.J.Virol.Methods 110:201-209(2003)；和Francois等Antimicrob Agents Chemother 49(9):3770-3775(2005)。
所述方法可用于提高任何I型干扰素的产生，包含但不限于：IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω和IFN-ζ(也称为限制素，limtin)。在一些实施方案中，所述方法是用来提高IFN-α的产生。在一些实施方案中，所述方法是用来提高IFN-β。
所述方法的方面包括以足以提高细胞产生所述I型干扰素的方式提高所述细胞中的包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸的水平。提高包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸是指，与对照相比，主题方法提高了包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸的量。如在下面的实验部分中示出，包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸可提高I型干扰素产生的水平。该提高的量级可变化，并且在一些例子中为，与合适的对照相比，2倍或更大，例如5倍或更大，包括10倍或更大、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍或100倍。
可使用多种不同的方法来实现提高包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸的水平。在一些例子中，所述方法包括提供具有提高靶细胞中包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸水平的环状二核苷酸活性剂的靶细胞。环状二核苷酸活性剂可变化，并包括但不限于：小分子、核酸、蛋白质和肽试剂。
在一些实施方案中，与没有与所述环状二核苷酸活性剂接触的对照相比，所述环状二核苷酸活性剂提高细胞或受试者中的IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω和IFN-ζ(也称为限制素，limtin)。在一些这样的实施方案中，所述提高为1.5倍提高至50倍提高或更高，包括2倍提高至45倍提高、5倍提高至40倍提高、10倍提高至35倍提高、15倍提高至30倍提高、20倍提高至30倍提高等。
在一些例子中，所述环状二核苷酸活性剂是包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸或其功能类似物。包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸包括但不限于本文描述的那些包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸。
本文所用的“环状二核苷酸”是指包含两个核酸的化合物(即，第一核苷酸和第二核苷酸)，其中每个核苷酸的2'碳或3'碳通过磷酸二酯键与另一核苷酸的5'碳连接。因此，包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸是指这样的环状二核苷酸，其中至少第一核苷酸或第二核苷酸的2'碳与另一核苷酸的5'碳连接。下文中更详细地描述了包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸。
包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸的功能类似物是表现出相似的功能活性(例如，提高I型IFN的产生)的那些化合物，并且可具有与包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸相似的结构。在一些例子中，所述功能类似物是小分子试剂。所关注的天然存在的或合成的小分子化合物包括许多化学种类，例如有机分子，包括具有大于50道尔顿并且小于约2,500道尔顿的分子量的小有机化合物。候选试剂包含对与蛋白质的结构相互作用、特别是氢键合所必需的官能团，并且通常包含至少胺、羰基、羟基或羧基，优选这些官能性化学基团中的至少两种。候选试剂还可包含由上述官能团中的一种或多种取代的环碳结构或杂环结构和/或芳族结构或多芳族结构。还发现候选试剂包括肽、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、结构类似物或组合等生物学分子。可通过使用合适的筛选方案等其他方式来鉴定这样的分子。
在一些例子中，所述环状二核苷酸活性剂是提高环GMP-AMP合酶(cGAS)的细胞活性的试剂。如在下文的实验部分中所述，提高cGMP合酶(cGAS)水平可提高细胞中环状二核苷酸的产生和/或活性。同样地，可以以足以提高细胞中的I型干扰素的产生的方式使靶细胞与提高cGMP合酶产生和/或细胞活性的试剂接触。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸活性剂是编码cGAS的核酸。编码多种cGAS酶的核酸包括但不限于在Sun等Science 339(6121):786-91中描述的那些，以及在GENBANK中保藏并分配有以下保藏号的那些：NM_138441.2和NP_612450.2(人)；NM_173386.4和NP_775562.2(小家鼠，mus musculus)。
在某些实施方案中，所述编码cGAS的核酸具有以下序列：
在一些实施方案中，所述编码cGAS的核酸是与野生型cGAS核酸序列具有40％至99％、45％至99％、50％至99％、55％至99％、60％至99％、65％至99％、70％至99％、75％至99％、80％至99％、85％至99％、90％至99％或95％至99％序列同一性的核酸。在一些实施方案中，所述编码cGAS的核酸是与野生型cGAS核酸序列具有40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％或90％至99％序列同一性的核酸。在一些实施方案中，所述编码cGAS的核酸是与野生型cGAS核酸序列具有40％或更高、45％或更高、50％或更高、55％或更高、60％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高或者99％或更高序列同一性的核酸。
在一些例子中，所述环状二核苷酸活性剂是包含编码cGAS的核酸的载体。可将载体直接提供至受试者细胞。换言之，使细胞与具有编码环状二核苷酸活性剂的核酸(例如，编码cGAS的核酸)的载体接触，以使所述细胞摄取所述载体。用于使细胞与作为质粒的核酸载体接触的方法，例如电穿孔、氯化钙转染和脂质体转染，是本领域公知的。对于病毒载体递送，使细胞与包含编码环状二核苷酸试剂的核酸的病毒颗粒接触。逆转录病毒，例如慢病毒，特别适于本发明的方法。常用的逆转录病毒载体是“有缺陷的”，即，不能产生用于生产性感染所需的病毒蛋白质。相反，该载体的复制需要生长于包装细胞系中。为了生成包含所关注的核酸的病毒颗粒，通过包装细胞系将包含该核酸的逆转录病毒核酸包装至病毒衣壳中。不同的包装细胞系提供了将并入衣壳中的不同外膜蛋白(亲嗜性、兼嗜性或异嗜性)，该外膜蛋白确定病毒颗粒对细胞的特异性(对鼠科动物和大鼠的亲嗜性；对大多数哺乳动物细胞类型(包括人、狗和小鼠)的兼嗜性；以及对除了鼠科细胞外的大多数哺乳动物细胞类型的异嗜性)。该合适的包装细胞系可用于确保细胞被包装的病毒颗粒所靶向。将包含编码重编程的因子的核酸的逆转录病毒载体引入包装细胞系中的方法以及收集由该包装细胞系生成的病毒颗粒的方法是本领域公知的。
用于将编码环状二核苷酸活性活性剂的核酸提供至受试者细胞的载体可包含用于驱动所关注的核酸表达(即，转录活化)的核酸的启动子。换言之，所关注的核酸将可操作地连接至启动子。这可包括遍在(ubiquitously)作用启动子，例如，CMV-β-肌动蛋白启动子，或可诱导启动子，例如在特定的细胞群体中活性的或响应药物例如四环素的存在活化的启动子。通过转录活化，预期转录将相对于靶细胞中的基线水平提高至10倍或更多、100倍或更多、1000倍或更多。此外，用于提供环状二核苷酸活性剂至受试者细胞的载体可包含编码靶细胞中的可选择标志物的核酸序列，以鉴定已经摄入了环状二核苷酸活性活性剂的细胞。
环状二核苷酸活性剂还可作为多肽提供至细胞。例如，在一些例子中，所述环状二核苷酸活性剂是cGAS多肽。多种cGAS酶的氨基酸序列包括但不限于在Sun等Science339(6121):786-91中描述的那些，以及在GENBANK中保藏并分配有以下保藏号的那些：NM_138441.2和NP_612450.2(人)；NM_173386.4和NP_775562.2(小家鼠)。
在某些实施方案中，所述cGAS多肽具有以下序列：
在一些实施方案中，所述cGAS多肽是与野生型cGAS氨基酸序列具有40％至99％、45％至99％、50％至99％、55％至99％、60％至99％、65％至99％、70％至99％、75％至99％、80％至99％、85％至99％、90％至99％或95％至99％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述cGAS多肽是与野生型cGAS氨基酸序列具有40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％或90％至99％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述cGAS多肽是与野生型cGAS氨基酸序列具有40％或更高、45％或更高、50％或更高、55％或更高、60％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高或者99％或更高序列同一性的多肽。
可任选使这样的多肽与提高产物的溶解度的多肽结构域融合。可通过限制性蛋白酶切割位点例如由TEV蛋白酶切割的TEV序列将该结构域与多肽连接。所述接头可包含一种或多种柔性序列，例如，1至10个甘氨酸残基。在一些实施方案中，融合蛋白的切割在维持该产物的溶解度的缓冲剂中进行，例如在存在0.5M至2M脲下，在存在提高溶解度的多肽和/或多核苷酸等下。所关注的结构域包括内体裂解结构域，例如流感HA域；以及协助产生的其他多肽，例如，IF2结构域、GST结构域、GRPE结构域等。可配制所述多肽以改进稳定性。例如，可使所述肽PEG化，其中聚乙烯基氧基提供了增强的在血流中的寿命。
此外或可选地，可将所述环状二核苷酸活性剂与促进由细胞摄取的多肽渗透结构域融合。一些渗透性结构域是本领域已知的，且可用于本发明的非整合性多肽，包括肽、模拟肽和非肽载剂。例如，渗透性肽可衍生自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的被称为渗透素(penetratin)的转录因子Antennapaedia的第三α螺旋，其包括氨基酸序列RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:03)。作为另一个例子，所述渗透性肽包含HIV-1tat基础区氨基酸序列(其可包含例如天然存在的tat蛋白的氨基酸49至57)。其他渗透性结构域包括聚精氨酸基序，例如，HIV-1rev蛋白的氨基酸34至56的区域、九-精氨酸、八-精氨酸等。(参见例如，Futaki等Curr Protein Pept Sci.4(2):87-96(2003)；和Wender等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 97(24):13003-8(2000)；出版的美国专利申请20030220334；20030083256；20030032593；和20030022831，通过引用明确并入本文用于关于易位肽和拟肽的教导)。九-精氨酸(R9)序列已经表征了的更高效的PTD中的一种(Wender等2000；Uemura等2002)。可选择形成融合的位点以优化生物学活性、多肽的分泌特性或结合特性。将通过例行实验来确定最优位点。
在实施本文提供的方法的实施方案中，将有效量的活性剂，即，环状二核苷酸活性剂(例如上文所述的)，提供于一种或多种靶细胞中。本文所用的“有效量”或“有效的量”是指，当与细胞接触(例如通过在体外引入细胞、通过施用至受试者等)时，足以导致细胞中环状二核苷酸的水平升高的活性剂的量。“有效量”将根据细胞和/或生物和/或化合物和/或期望的结果的性质和/或疾病及其严重程度和待治疗的受试者的年龄、体重等而变化。
在一些例子中，通过使细胞与活性剂接触来将有效量的活性剂提供于细胞中。细胞与活性剂的接触可使用任何方便的方案来进行。该方案可根据靶细胞的定位使活性剂在体外或体内与靶细胞接触。例如，在靶细胞是分离的细胞的情况下，例如体外细胞(即，在培养物中)或离体细胞(“离体”是指在体外修饰的细胞或器官，其中这样的细胞或器官通常回到活体)，可在允许靶细胞的活力的细胞培养条件下将活性剂直接引入细胞中。这样的技术包括不必要地限于：病毒性感染、转染、缀合、原生质体融合、电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、病毒载体递送等。方法的选择一般取决于将接触的细胞类型和活性剂的性质，以及进行转化的环境(例如，体外、离体或体内)。这些方法的一般性描述可在Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology,第3版，Wiley&Sons,1995中找到。作为另一个例子，其中一种或多种靶细胞是多细胞生物体的部分，可以以使活性剂能够接触靶细胞的方式，例如，通过体内方案，将活性剂施用至生物体或受试者。“体内”的意思是，将靶构建体施用至动物活体。
在一些实施方案中，采用所述环状二核苷酸活性剂来调节体外或离体的有丝分裂细胞或有丝分裂后细胞中的环状二AMP活性，即，产生可重新引入个体的修饰细胞。在这些实施方案中，所关注的有丝分裂细胞和有丝分裂后包括任何真核细胞，例如，多能干细胞，例如，ES细胞、iPS细胞和胚胎种系细胞；体细胞，例如，造血细胞、成纤维细胞、神经元、肌肉细胞、骨细胞、血管内皮细胞、肠细胞等，及其谱系限制的祖细胞和前体细胞；以及肿瘤细胞或癌细胞，即，显示一种或多种与癌细胞性能相关的细胞，所述癌细胞性能例如，高增殖、接触抑制、侵入其他组织的能力等。在某些实施方案中，所述真核细胞是癌细胞。在某些实施方案中，所述真核细胞是造血细胞，例如，巨噬细胞、NK细胞等。细胞可来自任何哺乳动物物种，例如，鼠科动物、啮齿类动物、犬科动物、猫科动物、马科动物、牛科动物、羊科动物、灵长类动物、人等。细胞可来自任何建立的细胞系，或者它们可为原代细胞，其中“原代细胞”、“原代细胞系”和“原代培养物”在本文中可互换使用，表示来源于受试者并且使其在体外生长有限的培养传代(即，分裂)数的细胞或细胞培养物。例如，原代培养物是可能已经传代0次、1次、2次、4次、5次、10次或15次但不够通过危机阶段的次数的培养物。通常来说，本发明的原代细胞系在体外维持少于10代。
如果细胞是原代细胞，则可通过任何方便的方法从个体收集它们。例如，血细胞例如白细胞，如巨噬细胞，可通过单成分采血(apheresis)、白细胞单成分采血、密度梯度分离等来收集，而来自组织例如皮肤、肌肉、骨髓、脾、肝、胰、肺、肠、胃等组织的细胞可通过组织活检来收集。可使用合适的溶液来分散或混悬所收集的细胞。这样的溶液一般为平衡的盐溶液，例如，标准盐水、PBS、Hank's平衡盐溶液等，适当补充有胎牛血清或其他天然存在的因子，结合一般为5-25mM的低浓度的可接受缓冲剂。方便的缓冲剂包括HEPES、磷酸盐缓冲剂、乳酸盐缓冲剂等。可直接施用这些细胞，或者可将它们储存、冷冻长时间，融化并能够重新使用。在这样的情况下，可将细胞冷冻于10％DMSO、50％血清、40％缓冲介质中，或者本领域常用的另一些这样的溶液中，以将细胞保存于这样的冷冻温度下，并以本领域已知的用于融化冷冻的培养细胞的方式来融化。
所述环状二核苷酸活性剂可由真核细胞或由原核细胞产生，可通过解折叠例如热变性、DTT还原等来对其进一步处理，并且可使用本领域已知的方法进一步重折叠。
不改变一级序列的所关注的修饰包括多肽的化学衍生，例如，酰化、乙酰化、羧化、酰胺化等。还包括糖基化修饰，例如，通过在其合成和处理期间或在进一步处理的步骤中修饰多肽的糖基化模式来进行；例如，通过将多肽暴露于影响糖基化的酶来进行，所述酶例如，哺乳动物糖基化酶或去糖基化酶。还包括的是具有磷酸化氨基酸残基例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或或磷酸苏氨酸的序列。
还包括于主题发明中的是，已经使用普通的分子生物学技术和合成化学进行修饰以改进它们对蛋白质降解的抗性或优化溶解度或使它们更适于作为治疗剂的环状二核苷酸活性剂多肽(例如，cGAS多肽)。这样的多肽类似物包括包含除了天然存在的L-氨基酸以外的多肽，例如，包含D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸的多肽。可将D-氨基酸替换成一些或所有氨基酸残基。
可使用任何合适的方法通过体外合成来制备所述环状二核苷酸活性剂。可得到多种市售的合成装置，例如，Applied Biosystems,Inc.,Beckman市售的自动合成仪等。通过使用合成仪，可用非天然氨基酸替换天然存在的氨基酸。可根据方便、经济、需要的纯度等来确定具体序列和制备方式。
如果期望，可在合成期间或在表达期间将多种基团引入肽中，使其与其他分子或与表面连接。因此，可使用半胱氨酸来制备硫醚，使用组氨酸来与金属离子复合物连接，使用羧基来形成酰胺或酯，使用氨基来形成酰胺，等。
还可根据常规的重组合成方法来分离和纯化所述环状二核苷酸活性剂。可制备表达宿主的裂解物，并使用HPLC、排除色谱、凝胶电泳、亲和色谱或其他纯化技术来纯化裂解物。大多数情况下，相对于与产物的制备及其纯化的方法有关的污染物(其中，百分率可基于总蛋白质)，所使用的组合物将包含按重量计20％或更多的期望产物，例如按重量计75％或更多的期望产物，包含按重量计95％或更多的期望产物，并且出于治疗目的，可为按重量计99.5％或更多。
为了调节环状二核苷酸的活性和/或产生，可将所述环状二核苷酸活性剂--如果它们是编码环状二核苷酸活性剂多肽(例如，cGAS)的小分子(例如，包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸)多肽或核酸——提供于细胞，保持充分的时间段，例如，30分钟至24小时，例如，1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、12小时、16小时、18小时、20小时，或30分钟至24小时之间的任何其他时间，该过程可以以每天至每4天的频率来重复，例如，每1.5天、每2天、每3天，或者约每天至约每四天之间的任何其他频率。可将该试剂提供至受试者细胞一次或多次，例如，一次、两次、三次或多于三次，并且在每次接触事件后使细胞与该试剂孵育一定量的时间，例如，16小时至24小时，在该时间后用新鲜培养基更换培养基，并进一步培养细胞。
在某些实施方案中，以足以提高细胞产生I型干扰素的方式将两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种或十种或更多种不同的环状二核苷酸活性剂提供至细胞。在一些例子中，所述活性剂包含两个或更多种不同的包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸。在某些实施方案中，所述活性剂包括包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸和编码cGAS或cGAS多肽的核酸。在将两种或更多种不同的环状二核苷酸活性剂(即，环状二核苷酸活性剂混合物)提供至细胞的例子中，可同时提供所述环状二核苷酸活性剂，例如，作为同时递送的两种环状二核苷酸，或者作为同时递送的环状二核苷酸和包含编码cGAS的核酸的载体。可选地，可连续提供它们，例如，首先提供第一环状二核苷酸活性剂，接着提供所述环状二核苷酸活性剂等，或反之亦然。
将有效量的环状二核苷酸活性剂提供至细胞，以导致环状二核苷酸水平的变化。有效量的环状二核苷酸活性剂是相对于阴性对照(例如与空载体或不相关多肽接触的细胞)观察到导致环状二核苷酸产生的量提高至2倍或更多的量。也就是说，有效量或有效剂量的环状二核苷酸活性剂将导致观察到的环状二核苷酸的量提高至2倍、提高至3倍、提高至4倍或更多，在一些例子中，观察到的活性的量提高至5倍、提高至6倍或更多，有时提高至7倍或提高至8倍或更多，例如，提高至10倍、50倍或100倍或更多，在一些例子中，观察到的活性的量提高至200倍、500倍、700倍或1000倍或更多。可通过合适的方法测量活性的量。例如，可在使细胞与环状二核苷酸活性剂接触后，例如，在与环状二核苷酸活性剂接触后2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、36小时、48小时、72小时处，评估该细胞产生的干扰素的量。
可在任何培养基以及在任何促使细胞存活的条件下进行细胞与环状二核苷酸活性剂的接触。例如，可将细胞混悬于任何合适的方便的营养介质中，例如，补充有胎牛血清或热失活的山羊血清(约5％-10％)、L谷氨酰胺、硫醇(特别是2-巯基乙醇)，以及抗生素例如青霉素和链霉素的Iscove's改良的DMEM或RPMI 1640。培养物可包含该细胞为应答性的生长因子。如本文所定义，生长因子是能够通过对跨膜受体的特定作用来促使处于培养物中或处于完整组织中的细胞存活、生长和/或分化的分子。生长因子包括多肽和非多肽因子。
按照以上描述的方法，可将细胞离体修饰成在环状二核苷酸水平上有提高。在一些实施方案中，可以期望选择经修饰细胞，例如，以制造经修饰细胞的富集群体。可使用对细胞的任何方便的修饰将细胞标记成经环状二核苷酸活性剂修饰的。例如，可将可选择标志物插入到细胞的基因组，以使可通过从其余群体分离基因标记的细胞来富集包含该基因修饰的细胞群体。可通过适于所使用的可选择标志物的任何方便的分离技术来进行分离。例如，如果已经插入荧光标志物，则可通过荧光活化的细胞分选来分离细胞，而如果已经插入细胞表面标志物，则可通过亲和分离技术来从异质群体中分离细胞，所述亲和分离技术例如，磁分离、亲和色谱、用附接至固体基质的亲和试剂进行“淘选”或其他方便的技术。通过精确分离的技术包括荧光活化的细胞分选仪，其可具有不同的复杂程度，例如多重颜色通道、低角度和钝的光散射检测通道、阻抗通道等。可通过使用与死细胞相关的染料(例如，碘化丙啶)来针对死细胞选择细胞。可使用不过度损害基因修饰的细胞的活力的任何技术。
以该方式实现了针对包含环状二核苷酸活性剂的细胞高度富集的细胞组合物。“高度富集”意思是基因修饰的细胞将为所述细胞组合物的70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多，例如，所述细胞组合物的约95％或更多，或者98％或更多。换言之，所述组合物可为基本纯的包含环状二核苷酸活性剂的细胞组合物。
可立即使用由本文描述方法产生的包含环状二核苷酸活性剂的细胞。可选地，可将细胞冷冻于液氮温度下，并储存长时间，融合并能够重新使用。在这样的情况下，可将细胞冷冻于10％DMSO、50％血清、40％缓冲介质中，或者本领域常用的另一些这样的溶液中，以将细胞保存于这样的冷冻温度下，并以本领域已知的用于融化培养的细胞的方式来融化。
可在多种培养条件下体外培养包含环状二核苷酸活性剂的细胞。可在培养中扩增细胞，即，使细胞在促使其增殖的条件下生长。培养基可为液体或半固体，例如包括琼脂、甲基纤维素等。可将细胞群体混悬于合适营养素介质中，例如，通常补充有胎牛血清(约5％至10％)、L谷氨酰胺、硫醇(特别是2-巯基乙醇)，以及抗生素例如青霉素和链霉素的Iscove's改良的DMEM或RPMI 1640。培养物可包含调控性T细胞应答性的生长因子。如本文所定义，生长因子是能够通过对跨膜受体的特定作用来促使处于培养物中或处于完整组织中的细胞存活、生长和/或分化的分子。生长因子包括多肽和非多肽因子。
将用环状二核苷酸活性剂修饰的细胞移植至受试者，以治疗疾病或作为抗病毒治疗剂、抗病原体治疗剂或抗癌治疗剂或用于生物学研究。所述受试者可为新生儿、少儿或成年人。特别关注的是哺乳动物受试者。可用本方法治疗的哺乳动物物种包括犬科动物和猫科动物；马科动物；牛科动物；羊科动物；等，以及灵长类动物，特别是人。动物模型，特别是小哺乳动物，例如，鼠科动物、兔形目等可用于实验研究。
可将细胞单独或与合适的基底或基质(例如，以支持它们在它们所移植到的组织中的生长和/或组织)一起提供至受试者。在一些例子中，将施用至少1×103细胞，例如，5×103细胞、1×104细胞、5×104细胞、1×105细胞、1×106细胞或更多。可通过以下路线将所述细胞引入受试者：肠胃外、皮下、静脉内、颅内、脊柱内、眼内，或引入至脊液中。可通过注射、导管等来引入所述细胞。用于局部递送(即，递送至损伤位点)的方法的例子包括例如，通过Ommaya储库，例如，用于鞘内递送(参见例如，美国专利号5,222,982和5385582，通过引用并入本文)；通过推注(例如通过注射器)例如至关节中；通过用对流的持续灌注(例如通过套管)(参见例如，美国申请号20070254842，通过引用并入本文)；或通过埋植已经将细胞可逆地附于其上的设备(参见例如，美国申请号20080081064和20090196903，通过引用并入本文)。
在本发明的另一些方面中，使用所述环状二核苷酸活性剂以提高I型干扰素的体内产生。在这些体内实施方案中，直接将所述环状二核苷酸活性剂施用至个体。在一些实施方案中，施用至受试者的环状二核苷酸活性剂包含具有2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸。
可通过用于施用肽、小分子和核酸的任何合适方法将环状二核苷酸活性剂施用至受试者。可将所述环状二核苷酸活性剂并入多种制剂中。更具体地，可通过与合适的药学上可接受的载剂或稀释剂组合来将本发明的环状二核苷酸活性剂配制成药物组合物。以下描述了可用于实施主题方法的药物组合物。
在这样的例子中，可将有效量的环状二核苷酸活性剂施用至受试者。所述环状二核苷酸活性剂的“有效量”或“治疗有效量”意指降低疾病的严重程度、持续时间和/或病况所需的量。在一些实施方案中，如本文所提供的，包含环状二核苷酸活性剂的药物组合物的有效量介于0.025mg/kg和1000mg/kg人受试者体重之间。在某些实施方案中，施用至人受试者的所述药物组合物的量为1000mg/kg体重或更小、950mg/kg体重或更小、900mg/kg体重或更小、850mg/kg体重或更小、800mg/kg体重或更小、750mg/kg体重或更小、700mg/kg体重或更小、650mg/kg体重或更小、600mg/kg体重或更小、550mg/kg体重或更小、500mg/kg体重或更小、450mg/kg体重或更小、400mg/kg体重或更小、350mg/kg体重或更小、300mg/kg体重或更小、250mg/kg体重或更小、200mg/kg体重或更小、150mg/kg体重或更小、100mg/kg体重或更小、95mg/kg体重或更小、90mg/kg体重或更小、85mg/kg体重或更小、80mg/kg体重或更小、75mg/kg体重或更小、70mg/kg体重或更小，或者65mg/kg体重或更小。
在另一个方面中，本文提供了一种用于提高受试者中干扰素基因(STING)介导的应答(例如，STING介导的免疫应答)的刺激物的方法。在某些实施方案中，所述方法包括将有效提高所述受试者中STING介导的应答的量的STING活性剂施用至所述受试者的步骤。“STING”介导的应答是指由STING介导的任何应答，包含但不限于对细菌病原体、病毒病原体和真核病原体的免疫应答。参见例如，Ishikawa等人Immunity 29:538-550(2008)；Ishikawa等Nature 461:788-792(2009)；和Sharma等Immunity 35:194-207(2011)。STING还在因自体DNA的不适当识别起始的某些自体免疫疾病(参见例如，Gall等Immunity 36:120-131(2012))中以及在应答DNA疫苗的适应性免疫诱导(参见例如，Ishikawa等Nature461:788-792(2009))中发挥功能。提高受试者中STING介导的应答是指与对照受试者(例如，未施用STING活性剂的受试者)相比，受试者中STING介导的应答的提高。在某些实施方案中，所述方法用于提高受试者中干扰素基因(STING)介导的应答的刺激物，其中STING介导的应答对具有两个3'-5'磷酸二酯键(即，典型的环状二核苷酸)是非应答性的。
如在以下的实验部分中描述的，具有2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸已经示出活化STING信号转导。此外，已经示出这样的具有2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸刺激对具有两个磷酸二酯键的环状二核苷酸非应答性的STING等位基因。同样地，在一些实施方案中，所述STING活性剂是本文描述的环状二核苷酸活性剂(例如，环状二核苷酸、编码cGAS的核酸)。
在另一些实施方案中，所述STING活性剂是编码STING的核酸或STING多肽。编码多种STING的核酸包括但不限于在以下文献中描述的那些：Nitta等Hepatology57(1):46-58(2013)和Jin等J.Immunol.190(6):2835-2843(2013)，以及在GENBANK保藏的分配有以下保藏号的那些：NM_198282.2和NP_938023.1(人)；NM_028261.1和NP_082537.1(小家鼠)；和NM_057386.4和NP_476734.1(黑腹果蝇)。
在某些实施方案中，所述编码STING的核酸具有以下序列：
在一些实施方案中，所述编码STING的核酸是与野生型STING核酸序列具有40％至99％、45％至99％、50％至99％、55％至99％、60％至99％、65％至99％、70％至99％、75％至99％、80％至99％、85％至99％、90％至99％或95％至99％序列同一性的核酸。在一些实施方案中，所述编码STING的核酸是与野生型STING核酸序列具有40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％或90％至99％序列同一性的核酸。在一些实施方案中，所述编码STING的核酸是与野生型STING核酸序列具有40％或更高、45％或更高、50％或更高、55％或更高、60％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高或者99％或更高序列同一性的核酸。
STING的氨基酸序列包括但不限于在以下文献中描述的那些：Nitta等Hepatology57(1):46-58(2013)和Jin等J.Immunol.190(6):2835-2843(2013)，以及在GENBANK保藏的分配有以下保藏号的那些：NM_198282.2和NP_938023.1(人)；NM_028261.1和NP_082537.1(小家鼠)；和NM_057386.4和NP_476734.1(黑腹果蝇)。
在某些实施方案中，所述STING多肽具有以下序列：
在另一些实施方案中，所述STING多肽具有以下序列：
在一些实施方案中，所述STING多肽是与野生型STING氨基酸序列具有40％至99％、45％至99％、50％至99％、55％至99％、60％至99％、65％至99％、70％至99％、75％至99％、80％至99％、85％至99％、90％至99％或95％至99％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述cGAS多肽是与野生型STING氨基酸序列具有40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％或90％至99％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述STING多肽是与野生型STING氨基酸序列具有40％或更高、45％或更高、50％或更高、55％或更高、60％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高或者99％或更高序列同一性的多肽。
以上方法可用于多种不同的应用中。现在，在以下的效用部分概述了某些应用。效用
本文提供的方法和组合物可用于多种应用，其中，这样的应用包括提高受试者中I型干扰素(例如，干扰素-β)是期望的。此外，本文提供的方法和组合物可用于多种应用，其中，这样的应用包括提高受试者中STING介导的应答是期望的。所关注的具体应用包括通过给受试者提供治疗有效量的环状二核苷酸活性剂对受试者治疗受益于I型干扰素提高的疾病病况的那些。在一些例子中，可期望的是，提高健康个体中的I型干扰素或STING介导的应答，例如，用于预防疾病或病症。同样地，在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物可用于产生对疫苗的“佐剂”影响，以预防感染或其他疾病，其中所述活性剂刺激免疫记忆，以保护免于受到未来的疾病或感染。
在一些实施方案中，适于用本文描述的方法治疗的受试者包括患有免疫性或炎性疾病或病症的个体，所述免疫性或炎性疾病或病症包括但不限于，癌症、自体免疫疾病或病症、过敏反应、慢性传染病和免疫缺陷疾病或疾病。
在一些实施方案中，适于用本发明的方法治疗的受试者包括患有细胞增殖性疾病的个体，例如肿瘤性疾病(例如，癌症)。细胞增殖性疾病的特征是不期望的细胞增殖，包含但不限于，肿瘤性病症病况，例如，癌症。
细胞增殖性疾病的例子包括但不限于，内皮细胞的异常刺激(例如，动脉粥样硬化)、固体肿瘤和肿瘤转移、良性肿瘤，例如血管瘤、听神经瘤、纤维神经瘤、沙眼(trachomas)和生脓性肉芽瘤、血管功能障碍、伤口愈合异常、炎性和免疫病症、白塞病、痛风或痛风性关节炎、伴随性血管发生异常，例如，类风湿性关节炎、银屑病、糖尿病视网膜病变、其他眼部血管生成性疾病，例如早产儿视网膜病(晶状体纤维化)、黄斑变性、角膜移植物排斥、神经血管青光眼和Oster Webber综合征、银屑病、再狭窄、真菌性、寄生性和病毒性感染，例如巨细胞病毒感染。将根据本发明的方法治疗的受试者包括患有任何以上提及的疾病的任何个体。
在另一些实施方案中，适于用主题方法治疗的受试者包括已经被临床诊断为受病毒感染的个体。在一些实施方案中，所述病毒是肝炎病毒(例如，HAV、HBV、HCV、δ等)，特别地，HCV适于用本发明的方法处理。受HCV感染的个体被鉴定为他们的血液中具有HCV RNA，和/或他们的血清中具有抗HCV抗体。这样的个体包括初治个体(例如，以前没有针对HCV治疗的个体，特别是以前没有接收IFN-α基或基于利巴韦林的治疗的个体)，以及以前针对HCV治疗失效的个体。
在一些实施方案中，适于用本文提供的方法治疗的受试者包括患有神经退行性疾病或病症的个体，包括但不限于，帕金森病、阿尔兹海默病、亨廷顿病和肌萎缩性侧索硬化(ALS)。
在另一些实施方案中，适于用本发明的方法治疗的受试者包括患有多发性硬化症的个体。多发性硬化症是指自体免疫神经退行性疾病，其标志是中枢神经系统内的炎症伴有淋巴细胞攻击少突胶质细胞产生的髓磷脂、空斑形成和脱髓鞘伴有脑和脊索中的轴突髓磷脂鞘的破坏，随着时间的推移导致神经失能。通常来说，在开始时，本来健康的人出现神经症状学的急性或亚急性发作(攻击)，表现为单侧视力损失、眩晕、共济失调、运动不协调、步履困难、具有以下特征的感知受损：感觉异常、感觉迟钝、感觉缺失、小便失调直至失禁、复视、构音障碍或不同程度的肌无力直至麻痹。所述症状可为无痛的，保持数天或数周，并且然后部分或完全恢复。在一段时间后，将发生第二攻击。在第一攻击后的这段期间，患者被定义为罹患可能的MS。可能的MS患者可在数年内为未确诊的。当第二攻击发生时，临床确证的MS(CDMS)诊断形成(Poser criteria 1983；C.M.Poser等，Ann.Neurol.1983；13,227)。
术语“受试者”和“患者”意为可能需要本文描述的药物方法、组合物和治疗的任何哺乳动物或非哺乳动物物种的一个或多个成员。因此，受试者和患者包括但不限于，灵长类(包含人)、犬科、猫科、有蹄类(例如，马科、牛科、猪科(例如，猪))、鸟类和其他受试者。人和具有商业价值的非人动物(例如，家畜和驯养动物)是特别关注的。
“哺乳动物”意为任何哺乳动物物种的一个或多个成员，并且以示例的方式包括，犬科动物；猫科动物；马科动物；牛科动物；羊科动物；啮齿类动物等，以及灵长类动物，特别是人。非人动物模型，特别是哺乳动物，例如，灵长类动物，鼠科动物、兔形目等可用于实验研究。
对病况或疾病的“治疗”包括：(1)预防至少病况的至少一种症状，即，使得在暴露于或易患疾病但尚未经历或展现该疾病的症状的哺乳动物不显著发展出临床临床症状，(2)抑制疾病，即，使疾病或其症状的发展停滞或减慢，或(3)减轻疾病，即，使疾病或其临床症状退化。因此，使用本文所用的术语“治疗”来表示预防疾病和治疗之前存在的病况二者。例如，在施用环状二核苷酸活性剂的情况下，可通过在发展出明显疾病之前施用主题化合物来实现细胞增殖的预防，例如，以预防肿瘤的再生长、预防转移性生长等。可选地，可使用化合物通过稳定或改善患者的临床症状来治疗进行中的疾病。
组合治疗
在主题方法的使用中，本文描述的环状二核苷酸活性剂可与其他药物活性剂组合使用，包括治疗潜在病况或病况的症状的其他药剂。本文所用的“组合”是指这样的使用，其中，例如，在第二化合物的整个施用路线中施用第一化合物；其中施用第一化合物，持续一段时间与第二化合物的施用重叠，例如，其中在施用第二化合物之前开始施用第一化合物，并且在第二化合物的施用结束之前结束第一化合物的施用；其中在施用第一化合物之前开始施用第二化合物，并且在第一化合物的施用结束之前结束第二化合物的施用；其中在开始施用第二化合物之前开始施用第一化合物，并且在第一化合物的施用结束之前结束第二化合物的施用；其中在开始施用第一化合物之前开始施用第二化合物，并且在第一化合物的施用结束之前结束第二化合物的施用。同样地，“组合”还可指涉及两种或更多种化合物的施用的方案。本文所用的“组合”还指可通过相同或不同路线，并且在相同或不同剂型类型中，在相同或不同制剂中施用的两种或更多种化合物的施用。
用于肿瘤性疾病组合治疗的其他药剂的例子包括但不限于，沙利度胺、马立马司他、COL-3、BMS-275291、角鲨胺、2-ME、SU6668、neovastat、Medi-522、EMD121974、CAI、塞来昔布、白细胞介素-12、IM862、TNP470、阿瓦斯汀、格列卫、赫赛汀及其混合物。用于组合治疗的化疗剂的例子包括但不限于，柔红霉素、道诺霉素、更生霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、伊索比星、博来霉素、马磷酰胺、异环磷酰胺、阿糖胞苷、双-氯乙基硝基脲、白消安、丝裂霉素C、放线菌素D、光辉霉素、泼尼松、羟基孕酮、睾酮、他莫昔芬、达卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲基三聚氰胺、五甲基三聚氰胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基环己基硝基脲、氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氮杂胞苷、羟基脲、脱氧助间型霉素、4-羟基过氧基环磷-酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脱氧尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MTX)、秋水仙碱、紫杉醇、长春新碱、长春碱、依托泊苷(VP-16)、曲麦克特、伊立替康、拓扑替康、吉西他滨、替尼泊苷、顺铂和己烯雌酚(DES)。
在本发明的治疗方法中还可递送其他抗病毒剂。例如，抑制肌苷单磷酸脱氢酶(IMPDH)的化合物可潜在地发挥直接抗病毒活性，并且如本文所述，这样的化合物可与突变型李斯特菌属(Listeria)组合施用。如本文所述，作为丙型肝炎NS3蛋白酶的有效抑制剂的药物可与突变型李斯特菌属组合施用。丙型肝炎NS3蛋白酶抑制剂抑制病毒复制。其他药剂例如HCV NS3螺旋酶的抑制剂也是用于组合治疗的有吸引力的药物，并且被设想用于本文所述的组合治疗。核酶例如HeptazymeTM以及与HCV蛋白序列互补并且抑制病毒核心蛋白表达的硫代磷酸寡核苷酸也适用于本文描述的组合治疗。用于组合治疗多发性硬化症的其他药剂的例子包括但不限于：格拉默；皮质激素类；肌肉松弛剂，例如替扎尼定(Zanaflex)和巴氯芬(力奥来素)；降疲劳药物，例如金刚烷胺(Symmetrel)或莫达非尼(Provigil)；以及可用于可与MS相关的抑郁症、疼痛和膀胱或肠控制问题的其他药物。
在组合治疗的上下文中，可通过与施用环状二核苷酸活性剂相同的施用路线(例如，肺内、经口、肠内等)来施用组合治疗化合物。在可选方案中，用于与所述环状二核苷酸活性剂组合治疗的化合物可通过不同的施用路线来施用。
佐剂
在某些实施方案中，当与治疗或预防疾病或病况(包含但不限于本文提供的那些疾病或病况)的药物或疫苗一起施用时，所述环状二核苷酸活性剂充当佐剂。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸活性剂与疫苗一起施用。这样的与疫苗一起施用的活性剂可充当佐剂以增强由疫苗引发的免疫应答，包括刺激免疫记忆，以保护免受未来的疾病和/或感染。
在某些实施方案中，作为用于疫苗的佐剂施用的所述环状二核苷酸或STING活性剂可通过例如提高较弱抗原的免疫原性、降低引发免疫应答所需要的抗原量、降低维持保护性免疫所需要的免疫频率、增强疫苗在免疫功能低下的个体或具有降低的免疫应答的其他个体中的效力和/或提高靶组织中的免疫例如黏膜免疫来增强疫苗的有效性。在这样的实施方案中，当与一种或多种抗原共施用时，所述环状二核苷酸活性剂可诱导特定的细胞因子谱，以促使针对抗原的细胞免疫和体液免疫，并提高接种的有效性。
用于制备疫苗的抗原可来源于多种微生物(例如，包含在身体中通常不存在的物质的病毒、细菌和寄生虫)以及肿瘤细胞。这些物质可用作产生免疫应答的抗原，以毁坏抗原和包含该抗原的细胞，例如细菌细胞或癌细胞。在某些例子中，分离的或粗制的微生物病原体抗原可用于治疗感染性疾病的疫苗中；分离的或粗制的肿瘤细胞抗原可用于治疗癌症的疫苗中；已知与病理学异常的细胞的分离的或粗制的抗原可用于治疗其中有益于靶向特定细胞以进行毁坏的多种疾病。
可为抗原来源的微生物包括临床相关的微生物，例如细菌，包括病源细菌；病毒(例如，流感病毒、麻疹病毒、冠状病毒)；寄生虫(例如，锥虫、疟原虫、利什曼虫)；真菌(例如，曲霉属(Aspergillus)、假丝酵母属(Candida)、球孢子菌病属(Coccidioides)、隐球菌属(Cryptococcus))；等。例如，所述抗原可来自细菌，特别是病源细菌，例如以下疾病的致病剂：炭疽(炭疽杆菌(Bacillus anthracis))、鼠疫(鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis))、结核病(结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis))、沙门氏菌病(肠道沙门氏菌(Salmonella enterica))、胃癌(幽门螺杆菌(Helicobacter pylori))、性传播疾病(沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)或淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhea))，等。其他代表性的例子包括来自某些病毒的抗原，例如流感病毒、诺瓦克病毒、天花病毒、西尼罗河病毒、SARS病毒、MERS病毒、呼吸道合胞体病毒、麻疹病毒等。所关注的真菌包括但不限于白色念珠菌(Candida albicans)或曲霉属某种(Aspergillus spp.)，并且所关注的寄生虫包括以下疾病的致病剂：锥虫病、利士曼原虫病、肺鼠疫和莱姆病(博氏疏螺旋体(Borrellia burgdorferi))。
将用于疫苗的病理学异常的细胞可得自任何来源，例如，具有病理病况的一个或多个个体，或者得自一个或多个这样的个体的离体或体外培养的细胞，所述个体包括将用所得的疫苗治疗的特定个体。
用于与包含环状二核苷酸活性剂的佐剂一起使用的疫苗制剂可包括例如，来自受感染患者或繁殖的培养物的减毒或失活的病毒或细胞病原体、纯化的大分子、多糖、类毒素、重组抗原、包含来自病原体的外源基因的生物体、合成的肽、多聚核酸、抗体和肿瘤细胞。
可例如通过使用本领域公知的重组方法分离和克隆例如细菌、酵母菌、昆虫、爬行动物或哺乳动物细胞中的编码任何免疫原性多肽的基因来得到重组抗原，并且在例如以下文献中有描述：Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,New York(1992)，以及Ansubel等，Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1998)。来自病毒、细菌和原生动物病原体的一些编码表面抗原的基因已经被成功克隆、表达并用作疫苗开发的抗原。例如，乙肝病毒的主要表面抗原HbsAg、霍乱毒素的b亚基、大肠杆菌的肠毒素、疟原虫的环子孢子蛋白和来自埃巴氏病毒的糖蛋白膜抗原，以及肿瘤细胞抗原，已经表达于多种公知的载体/宿主系统中，纯化并用于疫苗。
包含环状二核苷酸或STING活性剂的疫苗制剂可有利地包含其他疫苗佐剂和载剂。这些载剂和佐剂包括但不限于，离子交换树脂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白，例如人血清白蛋白、缓冲剂物质例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和蔬菜脂肪酸的部分的甘油酯混合物、磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂(例如，油/水乳剂)、盐或电解质例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质和聚乙二醇。
可使用用于确定疫苗化合物或制剂是否诱导先天免疫应答、体液免疫应答、细胞介导免疫应答或这些类型的免疫应答的任何组合的方便的方法。例如，疫苗化合物或制剂通过STING诱导先天免疫应答的能力可通过使用本文描述的方法以及其他方法来确定。这样的用检测先天免疫应答的方法可一般在施用疫苗的数小时内进行。疫苗化合物或制剂诱导体液免疫应答的能力可通过测量用该疫苗引发并用该抗原加强的动物中抗原特异性抗体的滴度来确定，或通过由ELISA。蛋白质印迹或其他公知的方法确定抗体与抗原的交叉反应的存在来确定。可例如通过使用多种方法(例如，FACS分选和本领域公知的其他方法)来测量对抗原的细胞毒性T细胞应答来确定细胞免疫应答。检测体液免疫应答和细胞免疫应答的方法一般可在疫苗施用后的数天或数周处内进行。
环状二核苷酸
在另一个方面中，本文提供了包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸。本文所用的“环状二核苷酸”是指包含两个核酸的化合物(即，第一核苷酸和第二核苷酸)，其中每个核苷酸的2'碳或3'碳通过磷酸二酯键与另一核苷酸的5'碳连接。因此，包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸是指这样的环状二核苷酸，其中至少一个所述核苷酸中的2'碳与另一核苷酸的5'碳连接。如本文所述，包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸可用于实施本文描述的方法，以提高细胞或受试者中I型干扰素的产生。如本文所用，“环状二核苷酸”还包括本文描述的环状二核苷酸的所有空间异构形式。
如本文所用，“核苷酸”是指包含共价附接至糖(例如，核糖或脱氧核糖)或其类似物的含氮碱基的组合物。核苷酸的例子包括但不限于胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、胸苷和肌苷。在一些实施方案中，所述核苷酸包含脱氧核糖。核苷酸的类似物包括但不限于，脱氧腺苷类似物(例如，地达诺新和阿糖腺苷)；脱氧胞苷类似物(例如，阿糖胞苷、恩曲他滨(Ematricitabine)、拉米夫定和扎西他滨)；脱氧尿苷类似物(阿巴卡韦和恩替卡韦)(脱氧-)胸苷类似物(例如，司他夫定、替比夫定和齐多夫定)；和脱氧尿苷(例如，碘尿苷和三氟尿苷)。
不受任何特定的操作理论的约束，并且如以下的例子所示，环状二核苷酸可提高细胞中I型IFN的产生。在某些实施方案中，环状二核苷酸通过涉及干扰素基因的刺激物(STING)的机制来提高I型IFN的产生。
环状二核苷酸包括本文具体描述的环状二核苷酸以及本文具体描述的环状二核苷酸的可用于实施主题方法的亚型(例如，互变异构体)。可使用任何合适的方法来得到环状二核苷酸。例如，可使用核苷酸衍生物作为起始材料通过化学合成来制成环状二核苷酸。如在以下的实验部分所述，环状二核苷酸还可使用重组纯化的cGAMP合酶(cGAS)通过体外合成来产生。此外，可使用NMR分析来确认这样的环状二核苷酸的结构。
本文提供的环状二核苷酸可由以下命名法来描述，环状[X1(A-5')pX2(B-5')p]，其中X1和X2是第一核苷酸和第二核苷酸，A是经磷酸二酯键连接至第二核苷酸的5'碳的第一核苷酸的碳(例如，2'位或3'位)，并且B是由磷酸二酯键连接至第一核苷酸的5'碳的第二核苷酸的碳(例如，2'位或3'位)。例如，基于该命名法，环状[G(2'-5')pA(3'-5')p]具有以下式：
在某些实施方案中，所述环状二核苷酸包含2'-5'磷酸二酯键。在一些具体实施方案中，所述环状二核苷酸还包含3'-5'磷酸二酯键(例如，环状[X1(2'-5')pX2(3'-5')p]或环状[X1(3'-5')pX2(2'-5')p])。在另一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含两个2'-5'磷酸二酯键(环状[X1(2'-5')pX2(2'-5')p])。
在某些实施方案中，所述环状二核苷酸是：环状[A(2'-5')pA2'-5')p]；环状[T(2'-5')pT(2'-5')p]；环状[G(2'-5')pG(2'-5')p]；环状[C(2'-5')pC(2'-5')p]；或环状[U(2'-5')pU(2'-5')p]。在某些实施方案中，所述环状二核苷酸是：环状[A(2'-5')pA(3'-5')p]；环状[T(2'-5')pT(3'-5')p]；环状[G(2'-5')pG(3'-5')p]；环状[C(2'-5')pC(3'-5')p]；环状[U(2'-5')pU(3'-5')p]；环状[A(2'-5')pT(3'-5')p]；环状[T(2'-5')pA(3'-5')p]；环状[A(2'-5')pG(3'-5')p]；环状[G(2'-5')pA(3'-5')p]；环状[A(2'-5')pC(3'-5')p]；环状[C(2'-5')pA(3'-5')p]；环状[A(2'-5')pU(3'-5’)p]；环状[U(2'-5')pA(3'-5')p]；环状[T(2'-5')pG(3'-5')p]；环状[G(2'-5')pT(3'-5')p]；环状[T2'-5')pC(3'-5')p]；环状[C(2'-5')pT(3'-5')p]；环状[T(2'-5')pU(3'-5')p]；环状[U(2'-5')pT(3'-5')p]；环状[G(2'-5')pC(3'-5')p]；环状[C2’-5')pG(3'-5')p]；环状[G(2'-5')pU(3'-5')p]；环状[U(2'-5')pG(3'-5')p]；环状[C(2'-5')pU(3'-5')p]；或环状[U(2'-5')pC(3'-5')p]。
在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：
其中X和Y可为任何包含含氮碱基的有机分子。如本文所用，“含氮碱基”是指具有碱的化学性能的含氮分子，包括但不限于，嘧啶衍生物(例如，胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶)和嘌呤衍生物(例如，腺嘌呤和鸟嘌呤)，以及经取代的嘧啶衍生物和嘌呤衍生物、嘧啶类似物和嘌呤类似物，以及它们的互变异构体。在某些实施方案中，X和Y分别是以下中的一种：
在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有下式(环状[G(2’5’)pA(3’5’)p])：
在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有下式(环状[G(3’5’)pA(2’5’)p])：
在另一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有下式环状[G(2’5’)pA(2’5’)p]：
在另一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有下式环状[A(2’5’)pA(3’5’)p]：
在另一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有下式环状[G(2’5’)pG(3’5’)p]：
在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有下式环状[A(2’5’)pA(2’5’)p]：
在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有下式环状[G(2’5’)pG(2’5’)p]：
在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式中的一种：
其中R为任何氨基酸侧链。
药物组合物
在另一个方面中，本文提供了包含本文提供的任何环状二核苷酸活性剂和药学上可接受的载剂的药物组合物。在所述药物组合物的某些实施方案中，所述环状二核苷酸活性剂是一种或多种环状二核苷酸。
术语“药学上可接受的”意为由联邦政府或州政府的监管机构批准或列于美国药典或其他一般认可的外国药典中，用于动物并且更特别地用于人。术语“载剂”是指与线粒体运输蛋白抑制剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。这样的药用载剂可为例如，无菌液体，例如在水中的盐水溶液，以及油，包括石油、动物油、植物油或合成起源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当通过静脉内施用所述药物组合物时，盐水溶液是优选的载剂。盐水溶液和葡萄糖溶液以及甘油溶液也可用作液体载剂，特别是可注射溶液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙二醇、水、乙醇等。所述组合物还可按需要包含少量的润湿剂和乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、缓释制剂等形式。所述组合物可与传统的粘合剂和载剂例如甘油三酯一起配制为栓剂。所述抑制剂可配制为中性形式或盐形式。药学上可接受的盐包括与自由氨基形成的盐，例如衍生自氯化氢、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，以及与自由羧基形成的盐，例如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。合适药用载剂的实例在由E.W.Martin所著的“Remington'sPharmaceutical Sciences”中有描述，通过引用以其整体并入本文。这样的组合物将包含治疗有效量的线粒体运输蛋白(例如，Miro蛋白、TRAK蛋白或Khc)抑制剂(优选以纯化形式)，连同合适的量的载剂，以提供适当施用至患者的形式。所述制剂应当适合施用模式。
所述药物组合物还可包含任何多种稳定剂，例如抗氧化剂。当所述药物组合物包含多肽时，所述多肽可与多种公知的增强所述多肽的体内稳定性或以其他方式增强其药物性能(例如，延长所述多肽的半衰期、降低其毒性、增强溶解度或摄入)的化合物复合。这样的修饰剂或复合剂的的例子包含硫酸盐、葡糖酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐。组合物的多肽还可与增强其体内属性的分子复合。这样的分子包含例如，碳水化合物、多胺、氨基酸、其他肽、离子(例如，钠、钾、钙、镁、锰)，和脂质。
关于适于多种施用类型的制剂的另一些指南可在Remington's PharmaceuticalSciences,Mace Publishing Company,Philadelphia,Pa.,第17版(1985)中找到。对于药物递送方法的简述，参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)。
用于配制所述药物组合物的组分优选是高纯度的，并且基本不含潜在的有害污染物(例如，至少为国家食品(NF)级的，一般至少分析级的，并且更通常至少药物级的)。此外，预期体内使用的组合物可为无菌的。就必须在使用前合成给定的化合物而言，所得的产物通常基本不含任何潜在有毒的试剂，特别是任何内毒素，而在合成或纯化方法期间，这些潜在有毒试剂可能存在。用于肠胃外施用的组合物也是无菌的，基本等渗的，并且在GMP条件下制成。
所述药物组合物可配制用于静脉内施用、经口施用、经埋植剂施用、经粘膜施用、经皮施用、肌内施用、鞘内施用或皮下施用。在一些实施方案中，所述药物组合物配制用于静脉内施用。在另一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于皮下施用。以下递送系统使用一些常用的药用载剂，它们仅仅是设想用于施用本发明组合物的许多实施方案的代表。
可注射药物递送系统包括溶液剂、混悬剂、凝胶剂、微球剂和聚合物可注射物，并且可包含赋形剂，例如溶解度改变剂(例如，乙醇、丙二醇和蔗糖)和聚合物(例如，聚辛酰基丙酮和PLGA)。可埋植系统包括杆和盘，并且可包含赋形剂例如PLGA和聚辛酰基丙酮。还可将骨桥蛋白或本发明的核酸附接至颗粒上使用基因枪来施用。
经口递送系统包括片剂和胶囊剂。这些可包含赋形剂，例如粘合剂(例如，羟丙甲基纤维素、聚乙烯吡咯酮、其他纤维素材料和淀粉)、稀释剂(例如，乳糖和其他糖、淀粉、磷酸二钙和纤维素材料)、崩解剂(例如，淀粉聚合物和纤维素材料)和润滑剂(例如，硬脂酸盐和滑石)。
经粘膜递送系统包括，贴剂、片剂、栓剂、阴道剂、凝胶剂和霜剂，并且可包含赋形剂，例如增溶剂和增强剂(例如，丙二醇、胆汁盐和氨基酸)，以及其他媒介物(例如，聚乙二醇、脂肪酸酯和衍生物，以及亲水性聚合物，例如羟丙甲基纤维素和透明质酸)。
真皮递送系统包括例如，水性凝胶剂和非水性凝胶剂、霜剂、多重乳剂、微乳剂、脂质体剂、软膏剂、水性溶液剂和非水性溶液剂、洗剂、气溶胶、烃类基剂(hydrocarbonbases)和粉剂，并且可包含赋形剂，例如增溶剂、渗透增强剂(例如，脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)，和亲水性聚合物(例如，聚卡波非和聚乙烯比咯烷酮)。在一个实施方案中，所述药学上可接受的载剂是脂质体或经皮增强剂。
在某些实施方案中，包含环状二核苷酸的所述药物组合物被配制成穿过血脑屏障(BBB)。一种用于药物递送通过血脑屏障(BBB)的策略需要破坏BBB，通过渗透工具例如甘露醇或白三烯，或通过生物化学方式使用血管活性物质例如缓激肽来破坏。当所述组合物通过血管内注射来施用时，BBB破坏剂可与所述治疗性组合物共施用。通过BBB的其他策略需要使用内源运输系统，包括caveoil-1介导的转胞作用、载剂介导的运输子例如葡萄糖载剂和氨基酸载剂、用于胰岛素或转铁蛋白的受体介导的转胞作用，以及活性溢出转运子，例如p-糖蛋白。可将活性运输部分缀合至用于本发明用途的治疗性化合物，以有助于跨血管内皮壁的运输。可选地，在BBB后的ND药物组合物的药物递送可通过局部递送，例如通过鞘内递送来进行，例如通过Ommaya储库(参见例如，美国专利号5,222,982和5385582，通过引用并入本文)；通过推注，例如通过注射器，例如，玻璃体内或颅内；通过用对流的持续灌注(例如通过套管)(参见例如，美国申请号20070254842，通过引用并入本文)；或通过埋植已经将抑制剂药物组合物可逆地附于其上的设备(参见例如，美国申请号20080081064和20090196903，通过引用并入本文)。
在某些实施方案中，包含环状二核苷酸或STING活性剂的所述药物组合物被配制于递送媒介物中，例如以增强胞浆运输。可使用任何方便方案以促进所述环状二核苷酸活性剂穿过细胞的质膜并进入胞浆中。在某些实施方案中，可将所述环状二核苷酸或STING活性剂以及有效用于疫苗的抗原配制在一起，以由所述药物组合物中的相同递送媒介物递送。
在一些例子中，可将所述环状二核苷酸或STING活性剂封装于所述药物组合物中的包含脂质体的递送媒介物中。使用脂质体来进行药物递送和其他治疗性用途的方法是本领域已知。参见例如，美国专利号8329213、US6465008、US5013556、美国申请号20070110798，以及Andrews等，Mol Pharm 2012 9:1118，这些文献通过引用并入本文。可通过添加聚乙二醇(“PEG化”)至双层来修饰脂质体以使它们的表面更亲水，从而提高它们在血流中的循环时间。这些被称为“潜伏”脂质体，并且特别可用作用于亲水性(水溶性)分子(例如所述环状二核苷酸活性剂)的载剂。
在某些实施方案中，由生物可降解材料例如聚(乳酸)、聚(γ-谷氨酸)、聚(羟基乙酸)、聚乳酸-co-羟基乙酸制成纳米颗粒或微颗粒。可使用聚乙烯亚胺或藻酸微颗粒以及阳离子微颗粒(包括树状聚物(dedrimer)，例如环糊精)作为环状二核苷酸或STING活性剂的递送载剂，以促进细胞摄入。参见例如，美国专利号8187571，Krishnamachari等Adv DrugDeliv Rev 2009 61:205，Garzon等，2005Vaccine 23:1384，通过引用并入本文。
在另一个实施方案中，可使用光化学内化来增强环状二核苷酸或STING活性剂的胞浆摄入。参见例如，美国申请号20120226217，通过引用并入本文。在这样的实施方案中，可将所述环状二核苷酸或STING活性剂与光敏化试剂共施用。然后，将靶细胞暴露于特定波长的光，触发所述环状二核苷酸或STING活性剂的内化。
在某些实施方案中，用于递送所述环状二核苷酸或STING活性剂的递送媒介物还可为靶向递送媒介物，例如，包含处于脂质体表面上的一种或多种靶向部分或生物分布修饰剂的脂质体。靶向部分可为能够与期望的标靶特异性结合或相互作用的任何试剂。
所述特异性结合剂可为特异性结合所靶向的蛋白质、肽、生物大分子、细胞、组织等(例如，其中所述环状二核苷酸或STING活性剂发挥其期望的影响的蛋白质肽、生物大分子、细胞、组织等)的任何分子。根据靶位点的性质，所述特异性结合剂可为但是限于，针对肽分析物的表位的抗体，或任何识别分子，例如特异性结合对的成员。例如，合适的特异性结合对包括但不限于：受体/配体对成员；受体的配体-结合部分；抗体/抗原对的成员；抗体的抗原结合片段；半抗原；凝集素/碳水化合物对的成员；酶/底物对的成员；生物素/抗生物素蛋白；生物素/链霉亲和素；地高辛/抗地高辛；肽适体结合对的成员；等。
在某些实施方案中，所述特异性结合部分包括抗体。如此处定义的抗体可包括保留对抗原的特异性结合的抗体片段，包括但不限于Fab、Fv、scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体，和包含抗体的抗原结合部分的融合蛋白质，以及非抗体蛋白质。所述抗体还可包括Fab'、Fv、F(ab')2，和/或保留对抗原的特异性结合的其他抗体片段。
在某些实施方案中，所述靶向部分是与肿瘤细胞或免疫细胞上表达的分子(例如，CD4、CD8、CD69、CD62L等)特异性相互作用的粘结剂，以使将包含所述环状二核苷酸或STING活性剂的靶向递送媒介物递送至肿瘤位点或特定的免疫细胞。
在期望的情况下，可有利地使用上文所列的递送媒介物的任何组合，以所述增强环状二核苷酸或STING活性剂至靶细胞的递送。
所述药物组合物的组分可分开提供或在单元剂型(例如作为冻干粉末或不含水的浓缩物)中混合一起。在通过输注施用所述组合物的情况下，可使用装有无菌药物级水或盐水的输注瓶来分散所述组合物。在通过注射来施用组合物的情况下，可提供一安瓿的注射用无菌水或盐水，从而可在施用前混合成分。
在一些实施方案中，将所述药物组合物提供为干燥无菌的冻干粉末，其能够重构至合适的浓度以用于施用至受试者。在一些实施方案中，所述药物组合物提供为不含水的浓缩物。在一些实施方案中，所述药物组合物提供为以下单位剂量的干燥无菌冻干粉末：至少0.5mg、至少1mg、至少2mg、至少3mg、至少5mg、至少1 0mg、至少15mg、至少25mg、至少30mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg、至少60mg或至少75mg。
用于可重构递送系统的溶液剂、混悬剂和粉剂包含媒介物，例如，助悬剂(例如，树胶、黄原胶、纤维素和糖)、湿润剂(例如，山梨醇)、增溶剂(例如，乙醇、水、PEG和丙二醇)、表面活性剂(例如，月桂基硫酸钠、司班(Span)、吐温和十六烷基吡啶)、保存剂和抗氧化剂(例如，对羟基苯甲酸酯、维生素E和C，以及抗坏血酸)、防裂剂、涂层剂和螯合剂(例如，EDTA)。
在一些实施方案中，所述药物组合物配制为盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的盐，例如衍生自氯化氢、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，以及与阳离子形成的盐，例如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。
在某些实施方案中，所述药物组合物包含任何本文提供的环状二核苷酸或STING活性剂的前药衍生物。随后这样的前药可在被施用所述药物组合物的受试者的身体中转化成环状二核苷酸或STING活性剂的活性形式。
药剂盒
提供了具有例如呈经口剂量或可注射剂量的单元剂量的所述主题环状二核苷酸活性剂(例如一种或多种环状二核苷酸)的单元剂量。在所述主题药剂盒中，如可方便的或期望的，一种或多种组分存在于同一容器或不同容器。
除了含有单元剂量的容器外，还将存在描述所述环状二核苷酸在治疗所关注的病理学病况中的用途和伴随的益处的说明。可以以多种不同格式来提供说明。在某些实施方案中，所述说明可为用于实施主题方法的完整方案，或用于得到所述方案的工具(例如，将用户引导至提供说明的网页的网站URL)，其中可将这些说明印刷于基材上，其中所述基材可为以下中的一种或多种：包装插入物、包装物、试剂容器等。
以下实施例的陈述是为了为本领域普通技术人员提供如何实现和使用本发明的完全的公开内容以及描述，而不是意图限制发明人所认定的发明范围，也不是意图表示以下的实验是所进行的所有实验或仅有的实验。已经做出了努力以确保关于所用数字(例如，量、温度等)的精确性，但是应当考虑一些实验误差和偏离。除非另有指明，否则份是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度计的，并且压力为大气压或近似大气压。
实验
I.结果和讨论
识别来源于病原体的核酸是哺乳动物中起始先天免疫应答的主要机制(Barbalat等，Annu Rev Immunol(2011)29:185)。已经描述了一些编码核酸传感器的种系家族，包括toll样受体(TLR)和RIG-I样受体(RLR)(Palm等，Immunol Rev(2009)227:221；Takeuchi等Cell(2010)140:805)。在结合核酸后，这些传感器起始信号转导级联反应，导致产生细胞因子和提供宿主防御的其他免疫效应蛋白。
外源双链(ds)DNA的胞浆存在触发通过产生I型干扰素(IFN)来控制的强效抗病毒应答(Ishii等，Nat.Immunol.(2006)7:40；Stetson等，Immunity(2006)24:93)。但是，将dsDNA与干扰素产生连接的分子机制尚未良好表征(Burdette&Vance,Nat.Immunol.(2013)14:19)。宿主蛋白质STING被鉴定，并且示出为对胞浆dsDNA的IFN应答所需(Ishikawa&Barber,Nature(2008)455:674；Ishikawa等，Nature(2009)461:788；Sun等，Proc NatlAcad Sci U S A(2009)106:8653；和Zhong等，Immunity(2008)29:538)。STING还示出为对称为环状二核苷酸(CDN)的细菌衍生的第二信使的干扰素应答所需(Jin等，J Immunol(2011)187:2595；和Sauer等，Infect Immun(2011)79:688)。CDN被某些细菌病原体分泌或释放至胞浆中(Woodward等，Science(2010)328:1703)并直接与STING结合(Burdette等，Nature(2011)478:515)。但是，有趣的是，小鼠STING的突变体(R231A)等位基因被鉴定为去除了对CDN的应答性，但是没有明显影响干扰素对胞浆DNA(Id)的应答。相比之下，表达野生型小鼠STING的293T细胞对CDN有应答性，但是对dsDNA没有。因此，虽然IFN对胞浆CDN和dsDNA二者的应答都需要STING，但是对这些化学不同的配体的应答可为在基因上非偶联的。
基于两个研究(Sun等，Science(2013)339:786；和Wu等，Science(2013)339:826)，提出dsDNA的胞浆存在导致通过被称为cGAMP合酶(cGAS)的DNA依赖性传感器产生CDN环状GMP-AMP(cGAMP)。cGAMP示出结合并活化STING。但是，尽管缺乏对CDN的反应性，STINGR231A突变体如何仍然起始对dsDNA的应答，这尚不清楚。因此，对cGAS活化STING的机制进行研究。
以前的研究(Sauer等，Burdette等)主要集中于小鼠STING，并且不清楚人STING是否可应答CDN(Conlon等，J Immunol,(2013)190:5216)。如以前所报道的(Sun等，Wu等)，发现，人THP-1细胞系以依赖于STING的方式强力地应答CDN(图1的A、B)。从THP-1细胞克隆hSTING，并将hSTING的氨基酸序列与以前广泛研究的参照等位基因(NP_938023.1，这里称为hSTINGREF)(7)进行比较(图2)。发现，hSTINGREF和hSTINGTHP-1在四个氨基酸位置上有差异。显然，hSTINGREF编码氨基酸位置232上的组氨酸(H)，而hSTINGTHP-1编码该位置上的精氨酸(R)，对应于mSTING中的对CDN的应答性十分重要的R231。因此，通过在没有内源STING的293T细胞中表达这些等位基因来测试hSTING等位基因的功能(Burdette等)。如以前观察到的(Burdette等)，mSTING在293T细胞中的过表达足以诱导不依赖于配体的IFN-荧光素酶报告子构建体的活化；但是用更低量的mSTING对293T细胞的转染使细胞对CDN有应答性。类似地，表达hSTINGTHP-1的293T细胞对CDN刺激有应答性。相比之下，表达hSTINGREF的细胞应答性差或无应答性(图1的C)。有趣的是，观察到，结合环状二GMP的STING的三种最新晶体结构是应答性差的hSTINGREF蛋白(Huang等，Nature Struct.&Mol.Biol.(2012)19:728；Ouyang等，Immunity(2012)36:1073；Yin等，Mol Cell(2012)46:735)。
293T细胞对dsDNA的刺激无应答性，可能是由缺乏cGAS(Sun等)的表达或可能其他DNA传感器所致。因此，为了测试hSTING变体是否可应答DNA刺激，空STING(“金票(goldenticket)”)(Sauer等)，但(cGAS+)的巨噬细胞用hSTING表达载体转导。有趣的是，即使对CDN无应答性的hSTINGREF变体亦赋予对dsDNA的应答性(图1的D)。因此，hSTINGREF模拟小鼠STING的R231A突变体的表型，如前文所述，该R231A突变体解偶联对CDN和dsDNA的应答性(Burdette等)。像mSTINGR231A变体一样，hSTINGREF仍然与CDN结合(图1的E)(Huang等，Ouyang等和Yin等)，说明该等位基因在CDN结合的下游步骤处受损。
与以上用hSTING等位基因的结果一致，mSTING的R231H突变体对CDN具有差的应答性，如hSTINGTHP的R232A变体或R232H变体一样(图3的A)。因此推断，精氨酸231/232对针对小鼠/人STING中的CDN的应答性十分重要。但是，在hSTINGREF中引入H232R突变不足以恢复对CDN的应答性；事实上，观察到还需要第二替换(G230A)(图4)。再次，测试结合环状二GMP的所有变体STING等位基因在这样的事实上都一致，即，残基230和232定位于覆盖但不形成CDN结合袋的环中(图3的B)(Burdette&Vance)。
重要的是，mSTINGR231A还对化学合成的cGAMP无应答性(图1的F)(Kellenberger等，J Am Chem Soc.(2013).135:4906)。这产生的问题是，STING的R231A/R232H变体是否将对被认为经cGAMP产生来活化STING的cGAS酶有应答性。发现，人或小鼠cGAS表达足以强健地活化hSTINGREF和mSTINGR231A变体，甚至在非常低的cGAS表达水平下亦如此(图5的A)。针对该结果考虑了一些解释。一种解释是，简单地由于哺乳动物细胞中的合酶的过表达所致；然而，产生cGAMP的细菌酶(来自霍乱弧菌的DncV)的过表达(Davies,Cell(2012)149:358)不活化hSTINGREF或mSTINGR231A，但是活化野生型mSTING和hSTINGTHP-1(图5的B)。一个可选假说是，cGAS可能以物理的方式与STING相互作用，从而以独立于cGAMP产生的方式来活化STING。然而，该解释似乎不对。如以前所示(Sun等)，催化死亡的人或小鼠cGAS的过表达未能活化STING(GS>AA；图5的A)，表明cGAS信号转导取决于第二信使的产生而非取决于与STING的直接物理相互作用。为了确认该解释，通过提供ATP、GTP和dsDNA至体外的重组cGAS，以产生cGAS的酶促产物。作为阴性对照，从平行反应中去掉dsDNA(刺激cGAS活性所需)。然后纯化所得的cGAS产物，并将其转染至表达STING变体的293T细胞中。与合成的cGAMP不同，所述cGAS产物能够活化hSTINGREF和mSTINGR231A(图5的C)。该实验排除了其中cGAS通过直接的物理相互作用来活化hSTINGREF的模型。
因此假设，cGAS的实际产物可能不是向以前提出的那样的典型CDN(Sun等，Wu等)。假设，cGAS可产生包含2'-5'磷酸二酯键的新CDN，其将能够刺激变体STING等位基因。重要的是，这样的非典型CDN将具有与典型的3'-5'磷酸二酯连接的CDN一样的质量，并且因此，这两个产物将也不容易通过已公布的对cGAS产物进行质谱分析来鉴别(Sun等，Wu等)。为了测试该假设，将放射性标记的α32P-GTP或α32P-ATP提供至重组纯化的cGAS或霍乱弧菌DncV，并通过薄层色谱来分析产物。如以前所报道的，如果仅提供ATP，则DncV产生一些环状二AMP，并且如果仅通过GTP则产生一些环状二GMP，但是当提供ATP和GTP二者时，优选制成cGAMP(Davies等，Cell(2012)149:358)。(图6的A)。有趣的是，cGAS需要ATP底物和GTP底物二者，并且所得的产物明显与由DncV产生的任何典型的CDN不同，这表明，cGAS产生新的非典型CDN(图6的A)。
通过特异性核酸酶消化来分析cGAS和DncV产物。cGAS产物将被核酸酶P1部分切割，该酶选择性地消化3'-5'磷酸二酯键，表明cGAS产物包含至少一个3'-5'磷酸二酯键(图6的B)。但是，与用切割2'-5'磷酸二酯键和3'-5'磷酸二酯键二者的蛇毒磷酸二酯酶cGAS处理cGAS产物相比，核酸酶P1消化是不完全的，因为它不导致生成GMP(图3的B)。这表明，所述cGAS产物包含2'-5'磷酸二酯键。
已经提出，CDN可用作疫苗佐剂或免疫治疗剂(Chen等，Vaccine(2010)28:3080)。已经在人临床试验中测试了合成的STING活化剂DMXAA作为新化疗剂。不幸的是，未发现DMXAA在人中有用，这很可能是因为其不能刺激hSTING(Conlon等)。在该上下文中，我们的结果是意义重大的，因为它们显示，非典型的2'-5'连接的CDN充当多样的STING变体的强效泛激动剂，所述变体包括对典型的CDN或DMXAA仅具有差应答性的那些变体。
II.材料与方法：
A.小鼠和细胞系
使THP-1细胞在添加有10％FBS、青霉素-链霉素和L-谷氨酰胺的RPMI 1640中生长。使HEK293T细胞在添加有10％FBS、青霉素-链霉素和L-谷氨酰胺的DMEM中生长。将包装Gp2逆转录病毒的细胞系维持于添加有10％FBS、青霉素-链霉素和L-谷氨酰胺的DMEM中。动物方案得到了加州大学实验动物管理和施用委员会(University of California,Berkeley Animal Care and Use Committee)的批准。
B.STING敲除
使用pLKO.1(The RNAi Consortium)来实现人STING(克隆IDNM_198282.1-901s1c1)的敲除。用于敲除人STING的序列是5’-GCA GAG CTA TTT CCT TCC ACA(SEQ IDNO:07)，其对应于5’-CCG GGC AGA GCT ATT TCC TTC CAC ACT CGA GTG TGG AAG GAA ATAGCT CTG CTT TTT G(SEQ ID NO:08)正向寡聚物和5’-AAT TCA AAA AGC AGA GCT ATT TCCTTC CAC ACT CGA GTG TGG AAG GAA ATA GCT CTG C(SEQ ID NO:09)反向寡聚物。使寡聚物退火，并克隆至AgeI和EcoRI消化的pLKO.1(Addgene)，通过逆转录病毒转导至THP-1细胞中，以混杂shRNA对照构建体为平行。使用嘌呤霉素选择稳定的细胞系。用1μg/mL PMA分化THP-1细胞24小时。使细胞静止24小时，然后用所指定的配体重新刺激6小时。如下文所述，通过qRT-PCR测量IFN诱导。
C.细胞刺激和试剂
使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)刺激骨髓巨噬细胞和HEK293T细胞。除非另有说明，否则如以前的描述(Burdette等)来制备环状二GMP、环状二AMP、polyI:C和牛痘病毒70聚体DNA，并在相似的浓度下使用。仙台病毒购自Charles River Laboratories。如以前的描述(Kellenberger等)来合成cGAMP。
D.克隆、诱变和质粒
使用5'hSTING HindIII(5'-ATCGAA GCT TCC ACC ATG CCC CAC TCC AGC CTG)(SEQ ID NO:10)和3'hSTING NotI(5'-ATC GGC GGC CGC TCA GGC ATA GTC AGG CAC GTCATA AGG ATA AGA GAA ATC CGT GCG GAG AG)(SEQ ID NO:11)从cDNA扩增THP-1STING等位基因。使用HindIII/NotI消化，将所导致的PCR产物克隆至pCDNA3中。使用上述的3'引物和5'hSTING XhoI(5'-ATC GCT CGA GCC ACC ATG CCC CAC TCC AGC CTG)(SEQ ID NO:12)以及XhoI/NotI消化，来扩增THP-1STING并克隆至MSCV2.2中。如以前的描述(Burdette等)使用IFN-荧光素酶、TK-海肾属和小鼠STING质粒。使用Quikchange定点诱变试剂盒(Stratagene)将突变引入人STING。从Open Biosystems和对应于之前描述的那些(Sun等，Wu等)得到与小鼠cGAS和人cGAS对应的cDNA克隆(MGC全测序人MB21D1 cDNA，登录号：BC108714.1，克隆ID：6015929；EST全测序小鼠E330016A19Rik cDNA，登录号：BC145653.1，克隆ID：40130956)。用正向寡聚物5'-mcGAS-KpnI(5'-ATC GGG TAC CCC ACC ATG GAT TACAAG GAT GAC GAT GAC AAG GAA GAT CCG CGT AGA AGG)(SEQ ID NO:13)和反向寡聚物3’-mcGAS-NotI(5’-ATC GGC GGC CGC TCA AAG CTT GTC AAA AAT TGG)(SEQ ID NO:14)从具有N端flag标签的cDNA克隆扩增小鼠cGAS。类似地，用正向寡聚物5'-hcGAS-flag-KpnI(5'-ATC GGG TAC CCC ACC ATG GAT TAC AAG GAT GAC GAT GAC AAG CAG CCT TGG CAC GGAAAG G)(SEQ ID NO:15)和反向3'-hcGAS-NotI(5’ATC GGC GGC CGC TCA AAA TTC ATC AAAAAC TGG AAA C)(SEQ ID NO:16)扩增hcGAS。将这两种PCR产物都克隆至pcDNA3中的KpnI和NotI限制性内切酶位点处。使用DncV fwd BamHI(5’-GCA TGG ATC CGC CAC CAT GAC TTGGAA CTT TCA CCA G)(SEQ ID NO:17)和DncV rev NotI(5’-GCA TGC GGC CGC TCA GCCACT TAC CAT TGT GCT GC)(SEQ ID NO:18)扩增DncV，并使用BamHI和NotI将其克隆至pCDNA3中。为了克隆至MSCV2.2中，使用DncV fwd XhoI(5’-GCATCT CGA GCC ACC ATG ACTTGG AAC TTT CAC CAG)(SEQ ID NO:19)和DncV rev NotI扩增DncV。将所得的DNA克隆至用XhoI/NotI消化的MSCV 2.2中。按如下构建用于细菌mcGAS过表达的构建体。使用His6 SUMONco(5’-TAA TAA GGA GAT ATA CCA TGG GCA GCA GCC)(SEQ ID NO:20)和His6 SUMO Sal(5’-GAA TTC GTC GAC ACC AAT CTG TTC TCT GTG AGC)(SEQ ID NO:21)从pCDF-Duet2模板(来自M.Rape lab,UC-Berkeley的礼物)通过PCR扩增N端His6-SUMO标签，并使用NcoI和SalI将其克隆至pET28a中，以制成pET28a-H6SUMO。使用mcGAS fwd Sal(5’-GAT GTC GACATG GAA GAT CCG CGT AGA AGG ACG)(SEQ ID NO:22)和mcGAS rev Xho(5’-ATC CTC GAGTCA AAG CTT GTC AAA AAT TGG AAA CC)(SEQ ID NO:23)从上文描述的小鼠cDNA克隆扩增全长mcGAS，并使用SalI和XhoI将其克隆至pET28a-H6SUMO中，以制成表达与N端His6 SUMO标签融合的全长mcGAS的pET28a-H6SUMO-mcGAS。
E.蛋白质纯化
WspR构建体(pQE-WspR*)是来自Steve Lory(Harvard)的慷慨的礼物。如以前的描述(Merighi等，Mol Microbiol(2007)65:876)进行WspR纯化和环状二GMP合成反应。DncV和突变体DncV的过表达株和质粒由J.Mekalanos提供。如以前的描述(Davies等)过表达和纯化DncV蛋白。简略而言，在对数中期，以1mM IPTG于37℃下诱导DncV蛋白产生3小时。裂解细胞，并在变性的条件下纯化DncV蛋白。将澄清的裂解物与Ni-NTA孵育，并在尿素洗脱缓冲剂(2M尿素，10mM Tris pH＝8.0，150mM NaCl，250mM咪唑)中洗脱。将洗脱的蛋白质透析至25mM Tris-Cl，pH＝7.5，300mM NaCl，5mM Mg(OAc)2，10％甘油，2mM DTT。通过用0.5mMIPTG在18℃下诱导过夜，在Rosetta(DE3)pLysS细胞中表达H6SUMO-mcGAS。用French Press将细胞裂解至50mM Tris-Cl，pH＝8，300mM NaCl，20mM咪唑，5mM BME和0.2mM PMSF中。用Ni-NTA孵育澄清的裂解物，并用20mM Tris-Cl，pH＝7.4，150mM NaCl，300mM咪唑洗脱结合的蛋白质。将洗脱物透析至20mM Tris-Cl，pH＝7.4，150mM NaCl，5mMβ-巯基乙醇以及10％甘油。将蛋白质迅速冷冻，并储存于-80℃。
F.cGAS产物纯化和结构表征
使用反相HPLC在配备有Agilent Polaris C18-A柱(5μm,250mm×10mm,)的Agilent 1260 Infinity HPLC上纯化cGAS产物。纯化条件包括于50℃和5mL/分钟的流量下在20分钟内，100％至0％梯度的溶剂A，其中溶剂A是100mM在水中的乙酸铵并且溶剂B是乙腈。将纯化的洗脱级分蒸发多次，以除去过量的氨。使用COSY、1H-13C HSQC、NOESY、1H-13CHMBC和1H-31P HMBC来完成共振分配。cGAS产物的表征：1H NMR(900MHz,D2O,50℃,δ):8.44(1H,s),8.42(1H,s),8.03(1H,s),6.31(1H,s),6.09(1H,J＝8Hz,d),5.75(1H,m),5.18(1H,m),4.93(1H,s),4.74,4.62,4.59(1H,J＝12Hz,d),4.55(1H,s),4.38(1H,m),4.33(1H,J＝12Hz,d),4.28(1H,J＝12Hz,d)；31P{1H解偶联}NMR(600MHz,D2O,50℃,δ):(所有共振都是单峰)-0.96,-1.86；HRMS(m/z):[M-H]-C20H24N10O13P2的单一同位素质量计算值为673.0927；实测值为673.0909.[M+Na2H]-C20H24N10O13P2的单一同位素质量计算值为695.0752；实测值为695.0728。
G.荧光素酶测定
以0.5％°—％106％细胞％ml-1将HEK293T细胞涂布于TC处理的96孔板上。第二天，用所指定的构建体与IFN-β-萤火虫荧光素酶和TK海肾属荧光素酶报告子构建体一起转染细胞。在用所指定的配体刺激6％小时后，在被动裂解缓冲剂在25℃下裂解细胞5％分钟。用萤火虫荧光素酶底物(Biosynth)和海肾属荧光素酶底物腔肠素(Biotium)孵育细胞裂解物，并在SpectraMax L微板读数器(Molecular Devices)上测量发光。将相对Ifnb表达计算为相对于海肾属发光的萤火虫发光。
H.体外环状二核苷酸合成
体外DncV反应在20mM Tris-Cl，pH＝8，20Mg(OAc)2，10％甘油和1mM DTT，0.1mg/mL BSA中进行。如图所示，反应物包含250μM GTP，250μM ATP或125μM GTP和125μM ATP。此外，在指定的情况下将33nMα32P-GTP(3000Ci/mmol，Perkin-Elmer)或33nMα32P-ATP(3000Ci/mmol，Perkin-Elmer)并入反应中。通过添加1μM纯化的DncV蛋白来起始反应。体外cGAS反应在40mM Tris-Cl，pH＝7.5，100mM NaCl，10mM MgCl2中进行。冷核苷酸和α标记的GTP的浓度与DncV反应中相同。通过添加200nM纯化的cGAS起始反应。在指定的情况下，以0.1mg/mL的终浓度将鲱鱼睾丸DNA(Sigma)添加至反应物。WspR反应如以前的描述(14)进行。将反应物在37℃下孵育1小时，在95℃下煮沸5分钟，并在13,000rpm下旋转10分钟。移除反应物，并以1:5与TLC运行缓冲剂(1:1.5(v/v)饱和的NH4SO4和1.5M KH2PO4，pH 3.6)混合，并在PEI纤维素TLC板(Sigma)进行点样。在溶剂迁移后，使TLC板暴露于磷屏成像仪，并使用Typhoon扫描仪成像。对于体外产物转染至293T细胞中，按比例放大反应，去掉放射性标记的核苷酸，并将ATP和GTP的浓度提高至2mM。
I.核酸酶消耗
来自橘青霉(Penicillium citrinum)核酸酶P1和来自菱背响尾蛇(Crotalusadamanteus)的蛇毒磷酸二酯酶I购自Sigma。将来自用α32P-GTP标记的体外环状二核苷酸合成的反应以1:5稀释于P1缓冲剂(40mM Tris-Cl，pH＝6，2mM ZnCl2)中或SVPD缓冲剂(40mM Tris-Cl，pH＝8，10mM MgCl2)中，然后分别用2.5mU的核酸酶P1或SVPD消化。消化物于37℃下孵育45分钟，并通过TLC解析核苷酸产品。
J.NMR数据
在图6的C中示出了1H-31P HMBC谱中，磷核P-11与鸟苷的2'核糖质子(H-12)以及腺苷的5'核糖亚甲基质子(H-10)和4'核糖质子(H-9)相关。另一个磷核(P-22)与腺苷的3'核糖质子(H-8)以及鸟苷的5'核糖亚甲基质子(H-21)和4'核糖质子(H-20)相关。因此，磷酸二酯键的区域化学被确定为环状[G(2'-5')pA(3'-5')p]。为了指定上述峰，精确鉴定分别与鸟苷和腺苷相应的核糖自旋系统是十分重要的。基于用于单个核碱基的参照谱1H-13CHMBC和1H-13C HSQC NMR分配与腺嘌呤核碱基(H-2,H-5)和鸟嘌呤核碱基(H-17)相关的质子(图7的A和B)。1H-1H NOESY实验示出了腺嘌呤质子H-5与3'核糖质子(H-8)之间的通过-空间的相互作用以及鸟嘌呤质子H-17与1'核糖质子(H-18)之间的通过-空间的相互作用(图7的D)。通过1H-1H COSY(图7的C)和多重性编辑的1H-13CHSQC(其特别地区分5'亚甲基质子(H-10和H-21))(图7的A和B)鉴定了相应核糖自旋系统中剩余的质子。
K.RNA、cDNA合成和定量RT-PCR
使用Trizol试剂(Invitrogen)或RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)提取哺乳动物细胞系的RNA。用不含RQ1RNA酶的DNA酶(Promega)处理RNA。用Superscript III(Invitrogen)反转录RNA。相对于以前描述的小鼠rps17(Woodward等)，对小鼠ifnB进行定量。相对于以前描述的人S9(Wu等)，对人ifnB进行定量。
尽管具有所附的条目，本公开还由以下条目定义：
1.一种用于提高细胞中I型干扰素(IFN)的产生的方法，所述方法包括：
以足以提高所述细胞产生所述I型干扰素(IFN)的方式提高所述细胞中的包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸的水平。
2.如条款1所述的方法，其中所述方法包括使所述细胞与所述环状二核苷酸接触。
3.如条款2所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含两个2'-5'磷酸二酯键。
4.如条款3所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含2'5'磷酸二酯键和3'-5'磷酸二酯键。
5.如条款1所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。
6.如条款5所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含两个鸟苷核苷酸。
7.如条款1所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸。
8.如条款7所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含两个腺苷核苷酸。
9.如条款1所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸和鸟苷核苷酸。
10.如条款1所述的方法，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
其中X和Y分别是：
11.如条款10所述的方法，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
12.如条款1所述的方法，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
其中X和Y分别是：
13.如条款1所述的方法，其中通过提高所述细胞中的cGAMP合酶(cGAS)的活性来提高所述环状二核苷酸的水平。
14.如条款13所述的方法，其中通过增强编码cGAS的核酸的表达来提高所述cGAS的活性。
15.如条款13所述的方法，其中通过将编码cGAS的核酸引入所述细胞中来提高所述cGAS的活性。
16.如条款1所述的方法，其中所述IFN是干扰素α。
17.如条款1所述的方法，其中所述IFN是干扰素β。
18.如条款1所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
19.如条款18所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
20.如条款1所述的方法，其中所述细胞在体外。
21.如条款1所述的方法，其中所述细胞在体内。
22.一种用于提高受试者中I型干扰素(IFN)的产生的方法，所述方法包括：
将有效提高所述受试者中I型干扰素的产生的量的包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸活性剂施用至所述受试者。
23.如条款22所述的方法，其中所述包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸活性剂包含包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸。
24.如条款23所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含两个2'-5'磷酸二酯键。
25.如条款23所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含2'-5'磷酸二酯键和3'-5'磷酸二酯键。
26.如条款23所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。
27.如条款26所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含两个鸟苷核苷酸。
28.如条款23所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸。
29.如条款28所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含两个腺苷核苷酸。
30.如条款23所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸和鸟苷核苷酸。
31.如条款23所述的方法，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
其中X和Y分别是：
32.如条款31所述的方法，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
33.如条款23所述的方法，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
其中X和Y分别是：
34.如条款22所述的方法，其中所述包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸活性剂是提高cGAMP合酶(cGAS)的细胞活性的药剂。
35.如条款34所述的方法，其中所述药剂包含编码所述cGAS的核酸。
36.如条款22所述的方法，其中所述IFN是干扰素α。
37.如条款22所述的方法，其中所述IFN是干扰素β。
38.如条款22所述的方法，其中所述受试者患有病毒性感染。
39.如条款22所述的方法，其中所述受试者患有细菌性感染。
40.如条款22所述的方法，其中所述受试者患有肿瘤性疾病。
41.如条款22所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
42.如条款41所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
43.一种环状二核苷酸，其包含2'-5'磷酸二酯键。
44.如条款43所述的环状二核苷酸，其中所述环状二核苷酸包含两个2'-5'磷酸二酯键。
45.如条款43所述的环状二核苷酸，其中所述环状二核苷酸包含2'-5'磷酸二酯键和3'-5'磷酸二酯键。
46.如条款43所述的环状二核苷酸，其中所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。
47.如条款46所述的环状二核苷酸，其中所述环状二核苷酸包含两个鸟苷核苷酸。
48.如条款43所述的环状二核苷酸，其中所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸。
49.如条款48所述的环状二核苷酸，其中所述环状二核苷酸包含两个腺苷核苷酸。
50.如条款43所述的环状二核苷酸，其中所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸和鸟苷核苷酸。
51.如条款43所述的环状二核苷酸，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
其中X和Y分别是：
52.如条款51所述的环状二核苷酸，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
53.如条款43所述的环状二核苷酸，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
其中X和Y分别是：
54.一种组合物，其包含包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸和药学上可接受的载体。
55.如条款54所述的组合物，其中所述环状二核苷酸包含两个2'-5'磷酸二酯键。
56.如条款54所述的组合物，其中所述环状二核苷酸还包含2'-5'磷酸二酯键和3'-5'磷酸二酯键。
57.如条款54所述的组合物，其中所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。
58.如条款57所述的组合物，其中所述环状二核苷酸包含两个鸟苷核苷酸。
59.如条款54所述的组合物，其中所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸。
60.如条款59所述的组合物，其中所述环状二核苷酸包含两个腺苷核苷酸。
61.如条款54所述的组合物，其中所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸和鸟苷核苷酸。
62.如条款54所述的组合物，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
其中X和Y分别是：
63.如条款62所述的组合物，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
64.如条款54所述的组合物，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
其中X和Y分别是：
65.一种用于提高受试者中干扰素基因(STING)介导的应答的刺激物的方法，所述方法包括：
将有效提高所述受试者中STING介导的应答的量的STING活性剂施用至所述受试者。
66.如条款65所述的方法，其中所述STING活性剂包含包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸。
67.如条款66所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含两个2'-5'磷酸二酯键。
68.如条款67所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含2'-5'磷酸二酯键和3'-5'磷酸二酯键。
69.如条款66所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。
70.如条款69所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含两个鸟苷核苷酸。
71.如条款66所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸。
72.如条款71所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含两个腺苷核苷酸。
73.如条款66所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸和鸟苷核苷酸。
74.如条款66所述的方法，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
其中X和Y分别是：
75.如条款74所述的方法，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
76.如条款66所述的方法，其中所述环状二核苷酸由下式描述：
其中X和Y分别是：
77.如条款65所述的方法，其中所述STING活性剂包含提高cGAMP合酶(cGAS)的细胞活性的药剂。
78.如条款77所述的方法，其中所述药剂包含编码所述cGAS的核酸。
79.如条款65所述的方法，其中所述STING活性剂包含提高干扰素基因(STING)的刺激物的细胞活性的药剂。
80.如条款77所述的方法，其中所述药剂包含编码所述STING的核酸。
81.如条款65所述的方法，其中所述STING介导的应答是对具有两个3'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸无应答性。
82.如条款65所述的方法，其中所述受试者患有病毒性感染。
83.如条款65所述的方法，其中所述受试者患有细菌性感染。
84.如条款65所述的方法，其中所述受试者患有肿瘤性疾病。
85.如条款65所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
86.如条款85所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
前述内容仅仅是对本发明的原理的举例说明。应理解，本领域技术人员将能够设计出多种布置，尽管这些布置没有在本文中确切地描述或示出，但是体现了本发明的原理，并且落在本发明的精神和范围内。此外，本文列举的所有例子和条件性语句都主要旨在帮助理解本发明的原理以及由发明人为深化本领域而贡献的概念，并且应将这样的具体列举的例子和条件解释为非限制性的。此外，本文的陈述本发明的原理、方面和实施方案及其特定例子的所有描述都旨在涵盖其结构等同物和功能等同物二者。此外，预期这样的等同物包括当前已知的等同物和未来开发的等同物二者，即，所开发的执行相同功能的任何元件，无论其结构如何。因此，不旨在将本发明的范围限制于本文示出和描述的示例性实施方案中。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求书体现。
本说明书中引用的所有出版物和专利申请都通过引用并入本文，就如特别和单独地指定每个独立的出版物或专利申请通过引用并入一样。对任何出版物的引用都是针对其在提交日期之前的公开内容，并且其不应解释为承认由于在先发明而使本发明不享有先于该出版物的权利。

Claims (18)

1.环状二核苷酸在用于制备通过提高人类受试者中I型干扰素IFN的产生而治疗细胞增殖性疾病的药物中的用途，所述药物的使用包括：
将有效提高所述受试者的细胞中I型干扰素的产生的量的环状二核苷酸施用至所述受试者，
其中，所述环状二核苷酸包含2'-5'磷酸二酯键和3'-5'磷酸二酯键，并且所述环状二核苷酸的核苷各自独立地选自鸟苷和腺苷。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述使用包括使所述细胞与所述环状二核苷酸接触。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述环状二核苷酸包含鸟苷。
4.如权利要求3所述的用途，其中所述环状二核苷酸是环状[G(2’5’)pG(3’5’)p]。
5.如权利要求1所述的用途，其中所述环状二核苷酸包含腺苷。
6.如权利要求5所述的用途，其中所述环状二核苷酸是环状[A(2’5’)pA(3’5’)p]。
7.如权利要求1所述的用途，其中所述环状二核苷酸包含腺苷和鸟苷。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述环状二核苷酸是环状[A(2’5’)pG(3’5’)p]。
9.如权利要求7所述的用途，其中所述环状二核苷酸是环状[G(2’5’)pA(3’5’)p]。
10.如权利要求1所述的用途，其中通过提高所述细胞中的cGAMP合酶cGAS的活性来提高所述环状二核苷酸的水平。
11.如权利要求1-10中任一项所述的用途，其中所述IFN是干扰素α或干扰素β。
12.如权利要求1-10中任一项所述的用途，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
14.一种组合物，其包含含有2'-5'磷酸二酯键和3'-5'磷酸二酯键环状二核苷酸和药学上可接受的载体，其中所述环状二核苷酸的核苷各自独立地选自鸟苷和腺苷并且包含至少一种鸟苷。
15.如权利要求14所述的组合物，其中所述环状二核苷酸是环状[G(2’5’)pG(3’5’)p]。
16.如权利要求14所述的组合物，其中所述环状二核苷酸包含腺苷和鸟苷。
17.如权利要求16所述的组合物，其中所述环状二核苷酸是环状[A(2’5’)pG(3’5’)p]。
18.如权利要求16所述的组合物，其中所述环状二核苷酸是环状[G(2’5’)pA(3’5’)p]。
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