CN105969754A - 改造的核苷酸环化酶及其应用 - Google Patents

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丛晓燕
王黎文
李桂华
赵学峰
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杜以军
陈蕾
孙文博
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王金宝
谷立川
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Jinan Haizhihua Feed Co ltd
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Abstract

本发明涉及基因工程与生物化学技术领域,具体涉及一种来源于霍乱弧菌的经过改造的二核苷酸环化酶，基因碱基序列如序列表中序列1所示。一种改造的核苷酸环化酶，氨基酸序列如序列表中序列2所示。改造的核苷酸环化酶基因或改造的核苷酸环化酶或载体或质粒在合成c‑di‑GMP、c‑di‑AMP中的应用。改造后的核苷酸环化酶，PET22b‑VC0179‑ΔLOOP比PET22b‑VC0179蛋白在酶的活性和产物生成效率方面都有很大的提高。提高GTP、ATP的利用率，减少酶的损耗，很大程度上降低了小分子的生产成本。酶的活性均有很大改善。而且纯化后的酶纯度较高，酶促反应效率很高，具有很好的开发应用价值。

Description

改造的核苷酸环化酶及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程与生物化学技术领域,具体涉及一种来源于霍乱弧菌的经过改造的二核苷酸环化酶,还涉及含有此二核苷酸环化酶的载体或质粒,还涉及此二核苷酸环化酶在合成c-di-GMP，c-di-AMP中的应用。
背景技术
环二核苷酸(Cyclic dinucleotides/CDNs)，如c-di-GMP(cyclic diguanylate,c-di-GMP)、和c-di-AMP(Cyclic 3’，5’-diadenosine monophosphate，c-di-AMP)是细菌中广泛存在的第二信使，对于细菌生物膜的形成，毒力的产生发挥重要作用。它们不存在于高等生物中，因此可以成为天然免疫系统识别的PAMP。当细胞内引入CDNs时，能通过STING产生I型干扰素。
目前的研究实验中c-di-GMP，c-di-AMP，3’-5’CGAMP的合成主要是由酶催化合成，就公布的专利：如国际专利WO2013/066264A1与国内专利201080019476.X等都是采用不同的酶催化合成。霍乱弧菌编码一种能够合成c-di-AMP，C-DI-GMP，3’-5’CGAMP三种不同环二核苷酸的核苷酸环化酶DncV(VC0179)，序列比对显示DncV类环化酶在肠道病原菌中广泛存在。VC0179作为环化酶可有效促进霍乱弧菌的肠道定殖，同时还可调节趋化性的细菌定殖。DncV全长由436个氨基酸组成。序列分析表明，它包含一个在核苷酸转移酶超家族中的保守基序[G[G/S]x9-13Dx[D/E]，天冬氨酸残基是激活(2’-5’)-ligoadenylate合成酶(OAS1)和poly(A)的核苷酸转移酶超家族聚合酶(NTS)的关键残基。但其合成效率不高。
发明内容
为了解决以上现有技术中核苷酸环化酶DncV(VC0179)在合成c-di-AMP，c-di-GMP，两种不同环二核苷酸时合成效率不高的问题，本发明提供了一种合成效率高的改造的核苷酸环化酶。
本发明还提供了改造的核苷酸环化酶在合成c-di-AMP，c-di-GMP中的应用。
本发明是通过以下步骤得到的：
一种改造的核苷酸环化酶基因，碱基序列如序列表中序列1所示。
一种改造的核苷酸环化酶，其特征在于氨基酸序列如序列表中序列2所示。
含有上述改造的核苷酸环化酶基因的载体或质粒。
所述的改造的核苷酸环化酶基因或所述的改造的核苷酸环化酶或所述的载体或质粒在合成c-di-GMP、c-di-AMP中的应用。
所述的改造的核苷酸环化酶基因或所述的改造的核苷酸环化酶或所述的载体或质粒在合成c-di-gmp、c-di-amp中提高GTP和ATP酶的利用率,减少酶的损耗。
所述的改造的核苷酸环化酶基因或所述的改造的核苷酸环化酶或所述的载体或质粒在合成c-di-GMP、c-di-AMP中提高GTP和ATP酶的活性和c-di-GMP、c-di-AMP生成效率。
本发明在获得VC0179晶体结构的基础上，分析结构将核苷酸环化酶DncV(VC0179)剔除一个LOOP环,命名为VC0179-ΔLOOP，重组构建表达载体PET22b中，实现VC0179-ΔLOOP的活性可溶性表达。改造后的VC0179-ΔLOOP，在酶的活性和产物生成效率方面都有很大的提高。提高GTP、ATP的利用率，减少酶的损耗，很大程度上降低了小分子的生产成本。同时，一般实验室均可独立生产满足实验室需求。
第一、根据GENEBANK上公布的基因序列设计引物，采用PCR技术以霍乱弧菌基因组为模板扩增或全基因人工合成技术得到具有功能活性的VC0179基因(1-419位氨基酸)序列。
第二、将VC0179基因序列与PET22b质粒进行重组，构建PET22b-VC0179重组质粒载体；转化入大肠杆菌BL21中。
第三、设计引物，以前期构建的PET22b-VC0179重组质粒为模板，采用重叠PCR的方法敲除一段(203–238位氨基酸)LOOP基因，构建表达载体PET22b-VC0179-ΔLOOP，转化入大肠杆菌BL21中。
第四、分别低温诱导表达构建的PET22b-VC0179与PET22b-VC0179-ΔLOOP重组质粒。采用16℃，诱导表达过夜后，低温压力破碎大肠杆菌的方法，破碎诱导表达的细菌，超速离心，上清经镍柱纯化，SourceQ离子交换柱层析，分子筛三步法纯化。
第五，生成c-di-GMP、c-di-AMP小分子的50mL反应体系：终浓度为100mM Tris,pH 7.5100mMNaCl 10mM MgCl2,1mMGTP/ATP/GTP和ATP及VC0179蛋白约5～10mg,加入超纯水至50mL.缓慢摇摆，室温条件下反应过夜。将粗产物溶液煮沸5-10min，使酶失活，12000rpm离心5min,上清经0.22um滤膜过滤，收集滤液备用。
第六，半制备高效HPLC纯化c-di-GMP、c-di-AMP小分子
经半制备高效液相色谱HPLC，应用反相色谱柱为Agela VenusilMP C18 50mm*250mm，紫外检测器在256nm处，洗脱液A为PH4.8的10mM乙酸铵，洗脱液B为纯乙腈，流速为10mL/min.梯度洗脱运行时间为45min,洗脱液A从95％至70％，同时洗脱液B由5％逐渐升至30％。上样量为100uL～9mL,摸索最大上样量，根据前期确认好的出峰时间与位置，收集纯化的小分子。
本发明的有益效果：
改造后的核苷酸环化酶，PET22b-VC0179-ΔLOOP比PET22b-VC0179蛋白在酶的活性和产物生成效率方面都有很大的提高。提高GTP、ATP的利用率，减少酶的损耗，很大程度上降低了小分子的生产成本。同时，一般实验室均可独立生产满足实验室需求。总体而言，本发明生产工艺较为成熟，操作简单，改造后的VC0179稳定性，酶的活性均有很大改善。而且纯化后的酶纯度较高，酶促反应效率很高，具有很好的开发应用价值。
附图说明
图1为经分子筛纯化后的PET22b-VC0179蛋白，
图2为经分子筛纯化后的PET22b-VC0179蛋白的凝胶电泳图，
图3为经分子筛纯化后的PET22b-VC0179-ΔLOOP蛋白
图4为经分子筛纯化后的PET22b-VC0179-ΔLOOP蛋白的凝胶电泳图，
图5为SIGNA公司C-DI-GMP标准品HPLC对照，
图6为PET22b-VC0179-ΔLOOP生成c-di-GMP小分子的HPLC图，
图7为PET22b-VC0179生成c-di-GMP小分子的HPLC，
图8为SIGNA公司C-DI-AMP标准品HPLC对照，
图9为PET22b-VC0179生成c-di-AMP小分子的HPLC，
图10为PET22b-VC0179-ΔLOOP生成c-di-AMP小分子的HPLC图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：
实施例1
1.1、根据GENEBANK上公布的基因序列设计引物，采用PCR技术以霍乱弧菌基因为模板扩增得到具有功能活性的VC0179基因(1-419位氨基酸)序列。根据霍乱弧菌基因的序列以及PET22b质粒的结构特点，加入限制性内切酶NdeI和XhoI两个酶切位点，设计上下游引物。
引物序列如下：
VC1079F-NdeI:GGAATTCCATATGATGAGAATGACTTGGAACT
VC1079-R-XhoI:GTTCTCGAGTTCTTGAGCGAAAGCCGGTA
PCR反应体系：
PCR反应设置如下：
PCR反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测并分离PCR片段，并根据胶回收试剂盒供货商说明书将PCR片段进行回收。
1.2、将VC0179基因序列与PET22b质粒进行重组，构建PET22b-VC0179重组质粒载体；转化入大肠杆菌BL21中，标记为菌种PET22b-VC0179-80℃保存。
1.2.1用限制性内切酶NdeI和XhoI对载体质粒pET-22b进行切割，对PCR产物回收片段进行双酶切反应。反应温度为37℃，载体酶切6h，PCR片段酶切3h。并用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物。
酶切体系
1.2.2酶切后的片段和相应载体的连接
连接反应体系：
充分混匀,24℃,3h。
1.2.3片段连接后的转化
将15μL PCR连接产物全部加入到100μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞中并轻轻混匀，冰浴30min，期间不要摇动，42℃热激90sec，然后冰上孵育1-2min，加入200μL无抗液体LB培养基，放置到摇床上120rpm,45-60min复苏，均匀涂布于含有氨苄青霉素(Amp)固体LB培养基上，培养皿先37℃正面培养30min，再倒置培养12-16h。调取阳性菌落，扩增测序，将测序正确的菌株-80℃保存。命名为PET22b-VC0179。
1.3设计引物，以前期构建的PET22b-VC0179重组质粒为模板，采用重叠PCR的方法敲除一段(203–238位氨基酸)LOOP基因，构建表达载体PET22b-VC0179-ΔLOOP，转化入大肠杆菌BL21中。具体操作：
引物设计如下：
Primer-f 1：VC1079F-NdeI:GGAATTCCATATGATGAGAATGACTTGGAACT
Primer-r1:VC1079R1:TACGTTTTCTGAATCTAATTCATCTTTAGGGATTGCATACAT
Primer-f 2：VC1079F2:CCTAAAGATGAATTAGATTCAGAAAACGTAAACCTTGCTCTT
Primer-r2:VC1079-R-XhoI:GTTCTCGAGTTCTTGAGCGAAAGCCGGTA
1.3.1PCR反应体系：
PCR反应设置如下：
PCR反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测并分离PCR片段，并根据胶回收试剂盒供货商说明书将PCR片段进行回收。回收产物标记为模板1.
1.3.2PCR反应体系：
PCR反应设置如下：
PCR反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测并分离PCR片段，并根据胶回收试剂盒供货商说明书将PCR片段进行回收。回收产物标记为模板2.
1.3.3PCR反应体系：
PCR反应设置如下：
PCR反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测并分离PCR片段，并根据胶回收试剂盒
供货商说明书将PCR片段进行回收。回收产物标记为VC0179-Δloop。
1.4.将VC0179-Δloop基因序列与PET22b质粒进行重组，构建PET22b-VC0179-Δloop重组质粒载体；转化入大肠杆菌BL21中。
1.4.1用限制性内切酶NdeI和XhoI对载体质粒pET-22b进行切割，对PCR产物回收片段进行双酶切反应。反应温度为37℃，载体酶切6h，PCR片段酶切3h。并用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物。
酶切体系
1.4.2酶切后的片段和相应载体的连接
连接反应体系：
充分混匀,24℃,3h。
1.4.3片段连接后的转化
将15μL PCR连接产物全部加入到100μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞中并轻轻混匀，冰浴30min，期间不要摇动，42℃热激90sec，然后冰上孵育1-2min，加入200μL无抗液体LB培养基，放置到摇床上120rpm,45-60min复苏，均匀涂布于含有氨苄青霉素(Amp)固体LB培养基上，培养皿先37℃正面培养30min，再倒置培养12-16h。调取阳性菌落，扩增测序，将测序正确的菌株-80℃保存，命名为PET22b-VC0179-Δloop。
1.5重组蛋白的表达与纯化
(1)活化菌体：分别挑取-80℃保存的PET22b-VC0179与PET22b-VC0179-ΔLOOP菌种，于5mL含有Amp+抗性的LB培养基中，37℃200rpm过夜培养。
(2)菌体扩大培养：将过夜摇好的菌液接入1L含有Amp+抗性的LB培养基中，37℃200rpm培养至OD600约为0.8时，降温至16℃，一小时后加入1mL IPTG(24mg/mL)，诱导过夜。
(3)收集菌体：4200rpm，4℃离心15min，弃上清，加40mL Resuscitation buffer重新悬起菌体，按照1:100加PMSF(蛋白酶抑制剂)，混匀。
(4)采用低温压力破碎大肠杆菌的方法，破碎诱导表达的细菌。
(5)超速离心：将超声后的菌液14000rpm，4℃离心50min，收集上清。
(6)Ni-NTA亲和层析：将离心后的上清倒入处理过的Ni-NTA柱中，上清流完后，用Resuscitation buffer重新2个柱体积，以去除杂蛋白，然后用Elution buffer 10mL洗脱目的蛋白，收集于预冷的小烧杯中，使用SDS-PAGE检测蛋白是否为所需蛋白。
(7)将上一步洗脱下来目的蛋白用平衡液buffer A(25mM Tris-HCl pH 8.0)稀释3倍后上样到平衡好的Source Q强阴离子交换柱上，上完样后用洗脱液buffer B(25mM Tris-HCl pH8.0，1M NaCl)线性梯度洗脱；
(8)对有紫外吸收峰的蛋白组分取样进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色，根据紫外吸收峰形和电泳染色结果对收集的蛋白进行浓缩，浓缩到2mL以内；
(9)在过分子筛之前将上一步浓缩的蛋白12000rpm离心10min，将样品上样到已平衡好的分子筛24mL Superdex-200柱子上，用分子筛buffer(10mM Tris-HCl pH8.0，100mM NaCl或者10mM Tris-HCl pH 8.0，300mM NaCl)进行洗脱，结果分别见图1、图3。取样进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色，结果见图2、图4。
所有的蛋白纯化步骤均在4℃进行。
实施例2
2.1生成c-di-GMP、c-di-AMP小分子的50mL反应体系：终浓度为100mM Tris,pH 7.5100mMNaCl 10mM MgCl2,1mMGTP/ATP/GTP和ATP及VC0179蛋白约5～10mg,加入超纯水至50mL.缓慢摇摆，室温条件下反应过夜。将粗产物溶液煮沸5-10min，使酶失活，12000rpm离心5min,上清经0.22um滤膜过滤，收集滤液备用。
2.2半制备高效HPLC纯化c-di-GMP、c-di-AMP小分子
经半制备高效液相色谱HPLC，应用反相色谱柱为Agela VenusilMP C18 50mm*250mm，紫外检测器在256nm处，洗脱液A为PH4.8的10mM乙酸铵，洗脱液B为纯乙腈，流速为10mL/min.梯度洗脱运行时间为45min,洗脱液A从95％至70％，同时洗脱液B由5％逐渐升至30％。上样量为100uL～9mL,摸索最大上样量，根据前期确认好的出峰时间与位置，收集纯化的小分子。
改造后的VC0179-ΔLOOP，从图6和7、图9和10的对比中明显能看出PET22b-VC0179-ΔLOOP比PET22b-VC0179蛋白在酶的活性和产物生成效率方面都有很大的提高。即在相同的反应体系、相同的反应条件、相同的上样量的情况下，图6中可以明显看出剩余的GTP的量远小于图7中GTP的量，同时c-di-GMP的产量显著高于图7。同样可以明显看出图9、图10的对比差异。PET22b-VC0179-ΔLOOP表达的核苷酸环化酶提高GTP、ATP的利用率，减少酶的损耗，很大程度上降低了小分子的生产成本。同时，一般实验室均可独立生产满足实验室需求。总体而言，本发明生产工艺较为成熟，操作简单，改造后的VC0179稳定性，酶的活性均有很大改善。而且纯化后的酶纯度较高，酶促反应效率很高，具有很好的开发应用价值。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110>改造的核苷酸环化酶及其应用
<120>山东省农业科学院畜牧兽医研究所, 济南海之华饲料有限公司
<160> 8
<210> 1
<211> 1149
<212> DNA
<213>霍乱弧菌（Vibrio cholerae）
<400> 1
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gctcttacgt ttgaaattat tcaggaaaag gtgtcaacga cccaaattaa gcacctttct 240
gacagcgaac aacgagaagt ggctaagctt atttacgaga tggatgatga tgctcgtgat 300
gagtttttgg gattgacacc tcgcttttgg actcagggaa gctttcagta tgacacgctg 360
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<213>PRT
<400> 2
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Ala Thr Val Asn Ile Leu Asp Ser Val Ala His Asp Ala Ser Asp
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Phe Ala Arg Gly Val Glu Ser Pro Asp Ser Thr Asp Glu Lys Pro
305 310 315
Leu Phe Pro Pro Ser Tyr Lys His Gly Pro Arg Glu Met Asp Ile
320 325 330
Met Ser Lys Leu Glu Arg Leu Pro Glu Ile Leu Ser Ser Ala Glu
335 340 345
Ser Ala Asp Ser Lys Ser Glu Ala Leu Lys Lys Ile Asn Met Ala
350 355 360
Phe Gly Asn Arg Val Thr Asn Ser Glu Leu Ile Val Leu Ala Lys
365 370 375
Ala Leu Pro Ala Phe Ala Gln Glu Pro Ser Ser Ala Ser Lys Pro
380 385 390
Glu Lys Ile Ser Ser Thr Met Val Ser Gly Leu
395 400 401
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 3
GGAATTCCAT ATGATGAGAA TGACTTGGAA CT 32
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 4
GTTCTCGAGT TCTTGAGCGA AAGCCGGTA 29
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 5
GGAATTCCAT ATGATGAGAA TGACTTGGAA CT 32
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 6
TACGTTTTCT GAATCTAATT CATCTTTAGG GATTGCATAC AT 42
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 7
CCTAAAGATG AATTAGATTC AGAAAACGTA AACCTTGCTC TT 42
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 8
GTTCTCGAGT TCTTGAGCGA AAGCCGGTA 29

Claims (6)

1.一种改造的核苷酸环化酶基因，其特征在于碱基序列如序列表中序列1所示。
2.一种改造的核苷酸环化酶，其特征在于氨基酸序列如序列表中序列2所示。
3.含有上述改造的核苷酸环化酶基因的载体或质粒。
4.一种权利要求1所述的改造的核苷酸环化酶基因或权利要求2所述的改造的核苷酸环化酶或权利要求3所述的载体或质粒在合成c-di-GMP、c-di-AMP中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于权利要求1所述的改造的核苷酸环化酶基因或权利要求2所述的改造的核苷酸环化酶或权利要求3所述的载体或质粒在合成c-di-gmp、c-di-amp中提高GTP和ATP的利用率,减少酶的损耗。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于权利要求1所述的改造的核苷酸环化酶基因或权利要求2所述的改造的核苷酸环化酶或权利要求3所述的载体或质粒在合成c-di-GMP、c-di-AMP中提高酶的活性和c-di-GMP、c-di-AMP生成效率。
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