CN102245774A - 使用含有突变rxxd基序的二鸟苷酸环化酶酶促生产环二鸟苷单磷酸的方法 - Google Patents

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Abstract

公开了在不使用保护基的情况下通过酶促合成生产环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)的方法。该方法包括两个鸟苷三磷酸(GTP)分子的偶联，以形成c-di-GMP分子。这是在含有氨基酸序列V153M154G155G156的突变二鸟苷酸环化酶(DGC)的影响下进行的。已经发现了从包含体可获得该DGC，而且能够获得足够量以改进c-di-GMP合成。特别是，之后的合成可以以一罐方法来进行，从可购得的大量化学品开始，并且将规模扩大到商业生产规模。

Description

使用含有突变RXXD基序的二鸟苷酸环化酶酶促生产环二鸟苷单磷酸的方法
发明领域
本发明涉及在二鸟苷酸环化酶(DGC)的影响下通过两个鸟苷三磷酸(GTP)分子的偶联，环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)的酶促合成的领域。特别地，本发明涉及提供大规模来源的DGC。此外，本发明涉及工业规模的c-di-GMP的生产。
发明背景
环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)是细菌的第二信使，其参与生物膜形成、抗生素抗性和病原性细菌在其动物宿主体内的持久性。
因此，WO2005/030186涉及c-di-GMP在用于减弱微生物病原体的毒性或用于抑制或减少由微生物病原体的定居的方法中的用途。US2005/0203051涉及c-di-GMP用于抑制癌细胞增殖或增加癌细胞凋亡的用途。US2006/0040887涉及c-di-GMP用于刺激或增强病人的免疫或炎症反应，或者作为疫苗的佐剂以增强对疫苗的免疫反应的用途。此外，EP1782826涉及如c-di-GMP这样的化合物作为治疗性或预防性接种疫苗的佐剂的用途，及其在药物组合物(如疫苗)中的用途。进一步关注的是该化合物作为活性成分在多种传染性疾病、炎性疾病、自体免疫疾病、肿瘤、过敏和生育率控制中的用途。
对于这些用途，通过化学合成来生产c-di-GMP。所述合成的参考文献是Hayakawa等，Tetrahedron 59(2003)，6465-6471。该文献显示了各种合成步骤中的低产量，这也被另一篇参考文献中的作者证实：即Hyodo和Hayakawa，Bull.Chem.Soc.Jpn.，77，2089-2093(2004)。然而，尽管上述方法声称对之前方法的很低的总产量有了一定改进，但明确的是，其中的几个步骤仍然显示出产物的重大损失，并且总产量也并不使人印象深刻，即低于25％。由于c-di-GMP的合成涉及在整个分子中使用相对高数量的保护基这一事实，后一种方法将特别受到阻碍。其合成和全部去除呈现出困难。
希望能够不使用保护基而生产c-di-GMP，例如，通过酶促合成。这将解决由化学合成必然带来的一些缺陷，如多步骤合成带来的不是最满意的总产量。如M.Christen Mechanisms of c-di-GMP signaling(PhD Thesis 2007)，p135公开的：因为这两个结构单元的复杂合成，c-di-GMP的化学合成没有显著的商业价值。
然而，时至今日c-di-GMP的酶促合成仍然不适于实际的、商业规模的生产。其可以以实验室规模合成，产生分析量，可通过HPLC证明其存在，不过通过例如NMR的结构鉴定和产量没有被公开。虽然从HPLC获得化合物的技术本身没有阻止实际的、工业规模的生产，如通过制备性HPLC，但是目前c-di-GMP的酶促合成却不能扩大规模。
目前的酶促合成，类似于c-di-GMP的天然合成，包括在二鸟苷酸环化酶(DGC)的影响下，两个鸟苷三磷酸(GTP)分子的偶联。这个过程受到产物反馈抑制的阻碍。据认为di-c-GMP的变构结合位点负责DGC的非竞争性产品抑制。鉴于此，M.Christen(2007)研究了不同的DGC突变体，帮助解释c-di-GMP信号机制。
鉴定了DGC突变体，其中被发现是核心c-di-GMP结合位点的RXXD基序得以改变，例如在新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)DgcA(CC3285)蛋白中，从R153E154S155D156变为V153M154G155G156。在此，根据氨基酸的国际单字母命名法，R表示精氨酸，E表示谷氨酸，S表示丝氨酸，D表示天冬氨酸，V表示缬氨酸，M表示蛋氨酸，以及G表示甘氨酸。因而，通过防止反馈抑制，可以获得一些产量的提高，所公开的合成通常导致毫克级的实验室规模的生产，而且没有使得可以以实际的、工业规模来生产c-di-GMP。
因此，期望提供一种改进的c-di-GMP酶促合成，特别是可以以适用于商业生产的实际的、工业规模来进行，并且更特别地，以高产量和高纯度来进行的酶促合成。
发明概述
为了更好地解决一个或多个前述的期望，在一个实施方案中，本发明呈现了含有修饰的RXXD基序的突变二鸟苷酸环化酶(DGC)，例如新月柄杆菌DgcA(CC3285)氨基酸序列V153M154G155G156，其中以包含体的形式提供DGC。
在另一个实施方案中，本发明呈现了一罐合成，其中通过鸟苷单磷酸(GMP)的转化来形成GTP，包括将(a)GMP，(b)磷酸酐供体，(c)鸟苷酸激酶(GMPK)，(d)核苷二磷酸激酶(NdK)和(e)含有修饰的RXXD基序的突变二鸟苷酸环化酶(DGC)，例如新月柄杆菌DgcA(CC3285)氨基酸序列V153M154G155G156，加入到合适的反应介质中，混合，培养反应混合物，以形成c-di-GMP。
在另一个实施方案中，本发明涉及通过酶促合成的环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)的生产方法，所述方法包括在含有修饰的RXXD基序的突变二鸟苷酸环化酶(DGC)的影响下，两个鸟苷三磷酸(GTP)分子的偶联，以形成c-di-GMP分子，所述基序例如为新月柄杆菌DgcA(CC3285)氨基酸序列V153M154G155G156，其中DGC是从包含体可获得的重折叠DGC。
在另一个实施方案中，本发明提供了以足够高的量获得DGC的方法，使得以商业规模进行前述反应，该方法包括在合适的宿主细胞中过表达合适的DGC基因，并从由此获得的包含体收集DGC。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过在离子交换材料上的洗脱从酶反应混合物分离纯c-di-GMP的方法，其中选择洗脱剂，以获得作为最终洗脱成分的c-di-GMP。
发明详述
在以下的描述中，术语“DGC”指代含有修饰的RXXD基序的突变二鸟苷酸环化酶(DGC)。对于二鸟苷酸环化酶中c-di-GMP的变构结合位点上的这个RXXD基序，可参考Christen等，J.Biol.Chem.，Vol.281，Issue 42，32015-32024，2006年10月20日。DGC优选地含有在氨基酸153-156上的修饰RXXD基序，所述基序选自GMGG、VMGG、GGVA、GRDC、GVGD、MEGD、GGNH、RESE、RNRD、RVDS、RAGG和RGQD(所有字母都是按照上述的单字母命名法)。优选地，DGC是含有氨基酸序列V153M154G155G156的新月柄杆菌突变二鸟苷酸环化酶DgcA(CC3285)。
广义上，本发明通过实质性地增加GTP至c-di-GMP的酶偶联中的DGC量使用下述方法，据发现所述方法相对大规模地获得DGC。
根据本发明，通过例如在大肠杆菌中超表达时作为包含体收集来获得DGC。包含体主要包含以胞内聚集体积聚的无活性变性蛋白。这些通常由大肠杆菌内的重组蛋白的高水平表达生成。可参照Krueger等，“Inclusion bodies from proteins produced at high levelsin Escherichia coli”(来自大肠杆菌中以高水平产生的蛋白的包含体)，见Protein Folding(蛋白折叠)，L.M.Gierasch and P.King(编辑)Am.Ass.Adv.Sci.，136-142(1990)；Marston，Biochem.J.，240：1-12(1986)；Mitraki等，Bio/Technol.7：800-807(1989)；Schein，Bio/Technol.7：1141-1147(1989)；Taylor等，Bio/Technol.4：553-557(1986)。包含体是密集的聚合体，其直径为2-3μM并且主要由重组蛋白组成，其可以在细胞裂解后通过低速离心与可溶性的细菌蛋白分离(Schoner等，Biotechnology 3：151-154(1985))。
如本领域技术人员将会理解的，作为包含体表达的DGC将会变性，而且必须在用于酶促合成之前重折叠成它的天然构象。重折叠蛋白包含体的技术是本领域技术人员已知的。可以以本领域已知的方式来进行重折叠蛋白的分离和纯化。重折叠蛋白也可以不经过纯化而直接使用。
一般而言，通常不会迫使生物化学家来生产作为包含体的酶活性蛋白，特别是考虑到需要重折叠蛋白和恢复活性。然而，在本发明中，在包含体中表达DGC为c-di-GMP的生产带来了相当大的优势。
这首先基于根据本发明的确认，DGC的可获得性(其在前述的Christen(2007)参考文献中是非常低的)是扩大c-di-GMP生产规模的限制因素。换言之，根据本发明可获得的DGC纯粹量使得可以以工业规模进行的生产方法成为可能。
此外，在本发明的方法中，DGC作为包含体的真正存在带来了能适合大规模生产的改进，而不是传统的缺陷。酶活性DGC蛋白的大规模表达对于蛋白生产细胞是有毒的。因此，大规模生产c-di-GMP需要的DGC量不能通过天然蛋白表达的程序来适度地产生。本发明提供了大规模DgcA生产的可能性，其是作为dgcA表达构建体和允许无酶活性包含体的高水平表达的表达条件的鉴定的结果。由于对大肠杆菌细胞的毒性，DgcA蛋白的无活性是酶大规模生产中的必要优势。而且，当c-di-GMP的生产方法依赖于DGC供应时，不仅大量生产DGC是重要的，而且能够贮藏并且在需要时以需要的量使用也是重要的。收集作为包含体的DGC提供了固有稳定的，因此易于贮藏的蛋白形式。从这种形式，即变性DGC，该蛋白可以重折叠并在需要时以所需的量来使用。通常以至少0.1μM-10μM，且优选1-2μM的量来使用DGC。
可以以本领域的公知方式来进行DGC的过表达，以生产包含体。
通常，可以使用公知技术(如，电穿孔和转化)将用于表达靶蛋白的重组构建体引入宿主细胞中。该载体可以是，例如，质粒。
编码靶蛋白的多核苷酸可以与含有用于宿主体内增殖的选择标记的载体连接。优选的是含有目标多核苷酸的顺式作用控制区域的载体。合适的反式作用因子可以由宿主提供，由互补载体提供或由导入宿主体内时载体自身提供。
提供特异性表达的载体，包括可以被诱导的那些。这些载体中特别优选的是通过易于操作的环境因素诱导的那些，所述环境因素例如为温度和营养添加剂。
用于表达靶蛋白的表达载体包括，例如，源自细菌质粒的载体。
含有靶蛋白基因的DNA插入片段应当可操作地连接到合适的启动子，如噬菌体T7上。其它合适的启动子是本领域技术人员已知的。表达构建体将进一步含有转录启动位点、终止位点，以及在转录区域中，用于翻译的核糖体结合位点。通过构建体表达的靶转录物的编码部分将优选地包括起始位置的翻译起始密码子和大约位于待翻译的多肽末端的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。
如所示的，表达载体将优选地包括至少一种选择标记。所述标记包括用于在大肠杆菌和其它细菌体内培养的四环素、卡那霉素、氯霉素或氨苄青霉素的抗性基因。合适宿主的代表性实例包括，但不限于，细菌细胞，如大肠杆菌。上述宿主细胞的合适培养基和培养条件是本领域已知的。
在载体中，优选用于靶蛋白的细菌表达的包括可从Novagen获得的pET载体。其它合适的载体将是本领域技术人员显而易见的。
在本发明特别优选的实施方案中，在一罐反应中生产c-di-GMP。在此，GTP是通过鸟苷单磷酸(GMP)的转化形成的，包括将(a)GMP，(b)磷酸酐供体，(c)鸟苷酸激酶(GMPK)，(d)核苷二磷酸激酶(NdK)，和(e)DGC加入到合适的反应介质中，混合，然后培养，以形成c-di-GMP。
本领域技术人员将清楚很大程度上优选一罐合成。通常，一罐合成可避免通常在分离和纯化反应中间产物时造成的产物损失。此外，在目前的情况下，从CMP而不是GTP开始的可能性可给商业生产带来更多益处，因为GTP是稀有且昂贵的，由此可形成工业化扩大规模的另一个限制性因素。
在下面的流程图中描绘了一罐合成。
Figure BDA0000066708420000071
在此，ATP是腺苷三磷酸，ADP是腺苷二磷酸，其它的缩写在前文中已经给出。
DGC的可获得性是一罐方法的关键，因为直至形成GTP的步骤顺序是可逆的。因此，由于全部反应物存在于单独的反应介质中，必须除去GTP，以使反应朝向c-di-GMP的形成。本发明通过其自身转化(即，偶联)成c-di-GMP，使除去GTP成为可能。前面所述的大量DGC的可获得性是该反应的关键工具。这允许在合成过程中补充DGC，即提供DGC的连续供应，以驱动使GTP偶联以形成c-di-GMP并除去GTP的反应。
一罐合成的反应条件可以由本领域技术人员来充分确定。合适的反应介质是，例如，含有Tris(三(羟基甲基)氨基甲烷)作为缓冲剂的弱碱性pH的缓冲水溶液。其它缓冲剂是已知的。反应物和酶的典型用量范围为：对于NdK和GMPK，0.01-1U/ml，对于DgcA，0.1-10μM；作为反应物，0.1-20mM GMP和0.2-50mM ATP。合适的磷酸酐供体是已知的，最为人知和优选的实例是ATP(腺苷三磷酸)。可以使用源自不同物种的任何NdK和GMPK酶，尽管大肠杆菌酶是得到最佳表征的。
除了可以根据本发明获得的DGC以外，酶促合成中使用的原料是可购得的或可以用本领域本身已知的方法来制备和分离。
可以以本领域公知的方式来进行根据本发明获得的c-di-GMP的分离和纯化。这些方式通常包括通过离子交换材料的洗脱，通常是通过离子交换柱洗脱。在这点上，本发明提供了另外的有利实施方案。令人惊讶的是，从之前所述的酶一罐方法生成的混合物，可以在c-di-GMP洗脱之前洗脱全部其它成分(通过洗脱剂的明智选择)。典型的洗脱剂是含有氯酸锂的低浓度HCl。通过用水、醋酸铵、含有20mMHCl和40mL LiCl的水溶液洗涤，从c-di-GMP中洗脱出全部试剂和副产物。产物最终通过20mM HCl/500mM LiCl从柱上以高浓缩级分洗脱出来。通过将c-di-GMP水溶液在丙酮：EtOH或其它有机物/水混溶溶剂体系中沉淀来进行最终的纯化。氨的加入提供c-di-GMP的二铵盐。
虽然仅仅作为能以包含体的方式获得大量的DGC的结果使得一罐酶促合成成为可能，但应当明白如果能从其它来源获得足够的DGC，也可以利用与一罐合成本身有关的优势。
优选地，用于一罐合成的DGC实际上是从上述包含体中可获得的重折叠DGC。
本发明的c-di-GMP酶促合成实际上能以商业的工业规模来生产。术语“商业规模”和“工业规模”用来区分通常见于实验室中的生产规模(前述的出版物中所述的)。后者通常涉及至多不超过10mg的生产规模。商业规模将涉及数十至数百克，直到千克级规模。在本发明中，生产是以至少1g，优选数十克的规模，优选至少数百克，最优选至少1kg的规模进行。
因为根据本发明已经解决了限制DGC的可获得性，扩大规模本身可以以本领域中的标准方式来进行。
本发明还涉及以至少10g，优选至少100g，更优选至少1kg的批量形式，通过根据之前所述方法的酶促合成可获得的纯度大于95％(根据HPLC分析)，优选纯度为100％(根据HPLC分析)的c-di-GMP制品。通过NMR分析定量分析c-di-GMP(通过上述方法方法合成)揭示了纯度范围在80-90％(w/w)。可以通过加入氨(通常加入量是5％(w/w))、水(通常加入量是5-15％(w/w))和余量的阴离子和阳离子盐(如Li+，Na+，PO4 2-，Cl-)来完成质量平衡。
本发明的c-di-GMP可以以其通常的方式付诸使用，仍然具有商业规模生产的益处，同时具有与酶促合成相关的高纯度。通过本发明可获得的大量c-di-GMP使得在人和动物健康的感染和其他疾病的治疗中使用c-di-GMP成为可能。大规模合成还使得半合成生产c-di-GMP衍生物成为可能，例如，硫代磷酸酯、磷酸酯、乙酰化或烷基化的c-di-GMP衍生物的生产可通过c-di-GMP的化学转化来实现。
下文将参照下列非限制性实施例和附图来进一步阐述本发明。
实施例1
该实施例描述了来自大肠杆菌的鸟苷酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因克隆、过表达、纯化和表征。
a)大肠杆菌gmpk和大肠杆菌ndk的基因克隆
基于大肠杆菌GmpK(M84400)和大肠杆菌NdK(X57555)的基因数据库DNA序列，设计了用于各个基因的PCR扩增的引物：
Ec-gmpK-正向 GGGATCCATGGCTCAAGGCACGCTTTATATTGTTTCTG
Ec-gmpK-反向 GAAGCTTCAGTCTGCCAACAATTTGCTG
Ec-ndk-正向GGGATCCATGGCTATTGAACGTACTTTTTCCATC
Ec-ndk-反向 GAAGCTTAACGGGTGCGCGGGCACACTTC
下划线部分是引入的克隆位点。基因的起始和终止密码子用粗体表示。
通过标准方法(Joseph Sambrook和David W.Russell.MolecularCloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)从大肠杆菌JM109中分离出基因组DNA。使用4ng/ml基因组DNA模板和0.5M每种引物，在标准PCR(30个循环，30秒延伸时间，退火温度分别是57℃和62℃)中进行了PCR。在1％TAE琼脂糖凝胶电泳后，观察到预期的代表gmpK和ndK基因的DNA条带。
切除各个PCR条带，用GeneCleanR纯化DNA片段，并连接至pCR2.1-Topo中。分别对于GmpK和NdK，分离出两个独立的质粒克隆，并对该DNA插入片段测序。所有质粒克隆插入片段的推定蛋白序列与各自的数据库蛋白序列相同。
b)GmpK和NdK在大肠杆菌中的过表达实验
为了过表达实验，通过引入的侧翼BamHI和HindIII位点将大肠杆菌gmpk和大肠杆菌ndk的开放阅读框亚克隆至BamHI/HindIII-cutpQE30中。
然后将所得到的质粒引入大肠杆菌M15中。通过标准实验方案(简而言之，将过夜LB-Amp-Kan培养物1+9在新鲜LB-Amp-Kan中稀释，在37℃生长2小时，加入1mM IPTG，在37℃再生长4.5小时，收集)进行了表达实验。
纯化GmpK和NdK的程序：
将收集的1升IPTG诱导的培养物的细胞沉淀物在-20℃冷冻，直至进一步的处理：将冷冻的沉淀物完全重悬浮于40ml溶解缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mM咪唑、pH8.0/NaOH)中，该缓冲液还补充有：0.5％曲通X100、1mg/ml溶菌酶、25U/ml苯并核酸酶。将悬浮液在冰上孵育1小时(→裂解产物；Lys)，然后在2500g下离心1小时。沉淀用10ml含有补充物的裂解缓冲液清洗一次，并离心。将洗过的沉淀重悬浮于50ml的2％SDS中，用于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析(→沉淀；Pe)。然后将合并的离心上清液(Sn)施加于4ml Ni2+-NTA琼脂糖(Qiagen)柱上，该柱用不含有补充物的裂解缓冲液预平衡。收集流过液(Ft)并且用5倍柱体积的洗涤缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mM咪唑、pH8.0/NaOH)清洗柱。用洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、250mM咪唑、pH8.0/NaOH)进行洗脱，并收集5ml的级分(Elu 1-5)。通过12％SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色来分析裂解产物处理的全部级分和Ni2+-NTA琼脂糖柱洗出液。
实施例2
a)新月柄杆菌dgcA的基因克隆
基于新月柄杆菌dgcA(cc_3285；ACCESSION AE005673)的基因数据库DNA序列，设计了用于各个基因的PCR扩增的引物：
Cacr-002 CAGAAGCGTTGTCGTGCCCATGGTTG
Cacr-004 TTGCAGGCCAATGTGGTCATGGGCGGCATCGTCGGCCGCATGGG
Cacr-010 GGTCTAGAATGAAAATCTCAGGCGCCCGGACC
Cacr-011 CAGGATCCCGATCAAGCGCTCCTG
Cacr-014 GGTCTAGACATATGAAAATCTCAGGCGCCCGGA
下划线部分是引入的克隆位点。dgcA的起始密码子用粗体表示。
使用4ng/ml新月柄杆菌CB15模板的基因组DNA和1.0μM引物Cacr-002/Cacr-004在标准PCR(35个循环，30秒延伸时间，退火温度55℃)中进行了PCR。1％TBE琼脂糖凝胶电泳后观察到预期的DNA条带，该条带代表包括R153V-E154M-S155G-D155G突变的dgcA基因的3’-末端。切除各个PCR条带，通过QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)来纯化DNA片段，并与引物1.0μM Cacr-010引物和4ng/ml新月柄杆菌CB15模板的基因组DNA结合用作下一个PCR反应中的大引物。在1％TBE琼脂糖凝胶电泳后，观察到预期的DNA条带，该条带代表包括R153V-E154M-S155G-D155G突变的完整dgcA基因。切除各个PCR条带，通过QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)来纯化DNA片段，然后连接至pCR-II TOPO中，形成pCacr-003b。对于DgcAVMGG，分离出两个独立质粒克隆，并对该DNA插入片段测序。所有质粒克隆插入片段的推定蛋白序列与各自的数据库蛋白序列相同，而不携带R153V-E154M-S155G-D155G突变。
使用1ng/ml pCacr-003b模板和1.0μM的引物Cacr-011/Cacr-014在标准PCR(35个循环，30秒延伸时间，退火温度55℃)中进行了另一个PCR。1％TBE琼脂糖凝胶电泳后，观察到预期的DNA条带，该条带代表包括R153V-E154M-S155G-D155G突变的dgcAVMGG基因。切除各个PCR条带，通过QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)来纯化DNA片段，然后连接至pCR-II TOPO中，以形成pCacr-018a。对于DgcAVMGG，分离出两个独立质粒克隆，并且对该DNA插入片段测序。所有质粒克隆插入片段的推定蛋白序列与各自的数据库蛋白序列相同，而不携带R153V-E154M-S155G-D155G突变。
b)本实施例说明了从新月柄杆菌获得DgcA
为了过表达实验，经由侧翼BamHI和NdeI位点，将来自质粒pCacr-18a的新月柄杆菌dgcAVMGG的开放阅读框亚克隆至BamHI/NdeI-cut pET-15b中。然后将所得到的质粒pCacr-20引入大肠杆菌BL21(DE3)中。
将携带表达质粒pCacr-20的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中在37℃下生长，通过在A600 0.4下添加异丙基1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷至1mM的终浓度来诱导表达。诱导后，将细胞在37℃再培养4小时。通过离心收集后，将细胞重悬浮于含有50mM Tris-HCl，pH8.0，50mM NaCl，0.5mM EDTA，5％甘油，20μl/g细胞沉淀溶解酶(Novagen)的缓冲液中，在室温下孵育15分钟，然后通过弗氏细胞压碎器来裂解。加入3-(1-吡啶)-1-丙烷磺酸盐(NDSB-201)至125mM的终浓度，将混合物在室温下再孵育15分钟。通过在8000×g下离心15分钟来分离可溶性和不溶性蛋白级分。用洗涤缓冲液(10ml/g细胞球沉淀)将含有包含体的沉淀清洗一次，洗涤缓冲溶液含有50mM Tris-HCl，pH8.0，50mM NaCl，0.5mMEDTA，5％甘油，1mM tris(2-羧基乙基)膦(TCEP)和125mM NDSB-201，并在8000×g下离心15分钟。将包含体用重悬浮缓冲液(10ml/g细胞球)清洗两次，重悬浮缓冲溶液中含有50mM Tris-HCl，pH8.0，50mMNaCl，0.5mM EDTA，5％甘油，1mM TCEP，并在8000×g下离心15分钟。将纯化的包含体贮藏在-80℃或通过在室温下搅拌60分钟重悬浮于缓冲液中，所述缓冲液含有50mM Tris-HCl，pH8.0，200mM NaCl，2mM EDTA，7M氢氯化胍和10mM TCEP。通过在25,000×g和4℃下离心15分钟来分离可溶性和不溶性蛋白级分。将含有变性DgcA的上清液通过0.45μM滤器过滤来灭菌，然后贮藏在-80℃直至使用。为了重折叠，将变性DgcA(5mg/ml)加入到25体积的缓冲液中并且在4℃搅拌孵育18小时，所述缓冲液含有500mM L-精氨酸，50mM HEPES，pH7.5。
实施例3
本实施例说明了从GMP生产c-di-GMP。
将1250ml新鲜重折叠的DgcA，5000U NdK(50％甘油中2.8U/μl)，5000U GmpK(50％甘油中3.6U/μl)，鸟苷5’-单磷酸(GMP，4g，11mmol)，13.75g腺苷5’三磷酸二钠盐(ATP)和3750ml反应缓冲液混合并以80rpm轻微振荡，在30℃下孵育16小时，所述缓冲液含有50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，0.5mM EDTA和50mM NaCl。
纯化
将粗制反应混合物(4800ml)通过纤维素过滤，并添加至阴离子交换柱(Dowex 1×2，400ml Pharmacia XK26，2.5cm内径，大约70cm长；Cl-型，用0.5％乙酸彻底洗涤，用水(2000ml)平衡；流速10ml/分钟)上。
用水(2000ml，10ml/分钟)，2M NH4OAc(2000ml，10ml/分钟)，水(1500ml，10ml/分钟)，10mM HCl/50mM LiCl(1000ml，10ml/分钟)清洗柱子。
通过10mM HCl/500mM LiCl(2000ml，10ml/分钟)从阴离子交换柱洗脱产物。
通过加入氨(1.5ml，32％w/w)，将含有产物的离子交换色谱的含水洗脱液(大约800ml)调节至碱性pH。将溶剂减压蒸发，获得高粘性的悬浮液。通过加入EtOH：丙酮(1∶1(v∶v)；300ml)将产物沉淀，并在室温下搅拌15分钟。通过过滤(pore3)分离固体，溶解于5％NH3(25ml)中，并通过加入EtOH：丙酮(1∶1；(v∶v)；300ml)再次沉淀。将溶解/沉淀程序重复一次。将所获得的固体溶解于1％NH3(20ml)中，过滤(0.45μM孔径；PET滤器)，并冻干过夜。
获得灰白色固体的产物c-di-GMP×2NH3(1.79g，2.5mmol)，总收率45％(基于原料GMP计算的)。
产物表征
借助NMR和LCMS，通过将数据与化学合成的c-di-GMP比较证实了通过酶产生的c-di-GMP的性质。由LCMS和NMR没有检测出杂质。
1H-NMR：s(8.0，2H)，s(6.0，2H)，m(5.0，2H)，m(4.8，2H+H2O信号)，m(4.4，4H)，m(4.1，2H)；HPLC-MS：3，36分钟(在210和254nm处纯度为100％)；[M+1]＝691(th.691)。HPLC：Atlantis-HPLC-柱，4.6*50mm，dC18，3μM；溶剂系统：水(+0.1％蚁酸)＝溶剂A；乙腈(+0.1％蚁酸)＝溶剂B；方法：0-10％B(＝100-90％A)，5分钟；10％B，1分钟；总运行时间：8分钟。定量NMR分析确定了高c-di-GMP纯度(w/w％＝82.1％)。离子色谱确定了钠(w/w％＝0.4％)、铵(w/w％＝5.3％)和锂(w/w％＝0.04％)阳离子以及小量的磷酸根(w/w％＝0.15％)和氯(w/w％＝0.7％)阴离子的存在。使用卡尔-费休滴定来确定水的量。在MeOH悬浮液中进行了测量(由于c-di-GMP在非水性溶剂体系中的不溶解性)。将确定的水的量(w/w％＝约10％)用作粗略的估算。

Claims (12)

1.含有修饰的RXXD基序的突变二鸟苷酸环化酶(DGC)，其中DGC以包含体的形式提供。
2.根据权利要求1的突变DGC，在氨基酸153-156上含有修饰的RXXD基序，所述基序选自GMGG，VMGG，GGVA，GRDC，GVGD，MEGD，GGNH，RESE，RNRD，RVDS，RAGG和RGQD。
3.根据权利要求2的突变DGC，具有新月柄杆菌(C.crescentus)DgcA(CC3285)氨基酸序列V153M154G155G156。
4.生产根据权利要求1-3任一项的重组DGC的方法，包括在合适的宿主细胞中过表达合适的DGC基因，并从由此获得的包含体中收集DGC。
5.通过酶促合成生产环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)的方法，包括在含有修饰的RXXD基序的突变二鸟苷酸环化酶(DGC)的影响下，两个鸟苷三磷酸(GTP)分子的偶联，以形成c-di-GMP分子，在一罐反应中进行，其中通过鸟苷单磷酸(GMP)的转化形成GTP，包括将(a)GMP，(b)磷酸酐供体，(c)鸟苷酸激酶(GmpK)，(d)核苷-二磷酸激酶(NdK)和(e)DGC加入到合适的反应介质中，混合，并孵育反应混合物，以形成c-di-GMP。
6.根据权利要求5的方法，其中DGC是从权利要求1-3任一项中所述的包含体可获得的，或者通过权利要求4的方法制得的重折叠DGC。
7.根据权利要求5或6的方法，其中DGC的用量是0.1μM-10μM。
8.根据权利要求7的方法，其中DGC的用量是1-2μM。
9.通过酶促合成生产环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)的方法，包括在根据权利要求1-3任一项的，或通过权利要求4的方法制得的突变二鸟苷酸环化酶(DGC)的影响下，两个鸟苷三磷酸(GTP)分子的偶联，以形成c-di-GMP分子。
10.根据权利要求5-9任一项的方法，其中在合成过程中补充DGC。
11.纯度超过99％的至少10g的c-di-GMP批量产物，通过根据权利要求5-10任一项的方法可获得。
12.根据权利要求11的批量产物，具有至少100g的大小。
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