CN116555378A - 制备核糖核苷或其衍生物的方法、生物酶制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了制备核糖核苷或其衍生物的方法、生物酶制剂及其应用。所述方法包括下列步骤:在生物酶制剂的存在下将一种或多种底物分别、依次或者同时进行酶促反应,其中所述底物包含一种或多种的具有氧化含氮芳香杂环基团的核糖核苷酸或其盐、以及生糖氨基酸或其盐。本发明能同时应用于以核糖核苷及其衍生物为原料和辅酶的各种酶促反应中进行从而成为更低成本和高效率的酶法技术平台。

Description

制备核糖核苷或其衍生物的方法、生物酶制剂及其应用
技术领域
本发明属于生物科技领域,具体而言,本发明涉及一种制备核糖核苷或其衍生物的方法、在该方法中使用的生物酶制剂及其应用,包括利用核糖核苷或其衍生物为底物进行磷酸化或磷酸转移,以生产各种蛋白、氨基酸、核酸、肽等。
背景技术
核糖核苷或其衍生物是存在于所有生物体内的重要物质,为生命的基础。核糖核苷或其衍生物可以为包含核糖、嘧啶或者嘌呤以任选的磷酸基团的任何物质,例如二磷酸腺苷、单磷酸腺苷和腺苷以及它们的盐。特别是,三磷酸腺苷(ATP)是细胞中最重要的辅酶,既是细胞的能量源,也是身体中多种酶不可缺少的辅酶和底物,提供磷酸基团和腺苷基团以维持新陈代谢和各器官的正常运作。
生物酶工程是现代化工业的重要一员,主要利用酶制剂所具有的生物催化和专一性等功能将底物转化合成相应的目标产物。酶工程主要用于医药工业和食品工业,相比传统化学工艺更为环保节能,符合现代化工业中需要秉承可持续发展的重要原则并同时创造生产低成本和安全食用的优点。根据市场统计,2019年生物酶工程全球总值约100亿美元,并以复合年均增长率7.1%的趋势持续发展,预期在2027年整个行业的总值超越150亿美元:因此,酶法生产工艺已被多个已发展和发展中国家视为重点的科技项目,投放大量资源进行相关研究。
酶促反应多需要使用辅酶:辅酶可以为有机小分子,协助酶制剂进行催化反应,同时辅酶亦可以成为该催化反应的底物以进行基团转移或还原氧化反应等;辅酶类中以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和三磷酸腺苷为最重要者:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸多参与还原氧化系的酶促反应,例如在人体中主要负责代谢酒精的乙醇脱氧酶和乙醛脱氧酶,都需要使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为底物,根据王骏教授在其著作“听骏一席话-健康长寿面面观”中,引用王教授在书中对上述两种酶的功能的详尽批注:“酒精在人体内的代谢(分解)经个两个步骤:第一,酒精(乙醇)进入血液后经乙醇脱氧酶转化为乙醛。乙醛是第一类强致癌物质,可引致肝癌和其他癌症。第二,乙醛在乙醛脱氢酶的作用下转化为乙酸。乙酸即醋酸,对人体无害。”王教授在该著作中亦深入浅出的讲解烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(又名:辅酶I、NAD+)和上述两种酶功能与健康的关键:”最新科研和实践证明,酒精代谢快慢的另一主因是体内辅酶I(NAD+)的多寡。NAD+是乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的辅助因子亦称辅酶。缺乏NAD+,这两个脱氢酶便无法降解酒。口服NMN(即烟酰胺单核苷酸,人体固有的NAD+的直接前体物质)可快速(15至30分钟)和有效地提升体内NAD+的含量。因此,饮酒前后口服NMN能够大幅提高酒精降解成乳酸的速度,消除宿醉,从而大大减少酒精和完全对健康造成的负面影响”。
另一常用的辅酶为三磷酸腺苷,存在于每个细胞之中的能量源,并以底物参与基团转移、磷酸化和多肽合成等重要生化反应;例如身体中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、辅酶A和谷胱苷肽的生成都需要三磷酸腺苷。辅酶既对生物的生存十分重要,同时在酶法生产工艺中举足轻重,当中三磷酸腺苷更是主要底物,在多项酶法生产工艺都需要使用。
核糖核苷或其衍生物(例如三磷酸腺苷)的需求与日俱增,导致其价格居高不下,而且供应量波动大,对依赖核糖核苷或其衍生物的酶法生产工艺带来不利因素,长远可能拖累酶工程行业的发展。因此,核糖核苷或其衍生物的供应是酶法生产工艺的核心问题,必需提出新的方案来解决当前的状况,进一步降低核糖核苷或其衍生物的应用成本,从而进一步扩大使用酶法生产工艺的经济成果以普及其使用为此,核糖核苷或其衍生物的制备方法和应用应进行改善以解决现时的各种问题。
发明内容
本发明提出了一种制备核糖核苷或其衍生物的方法和应用,以解决上述现有技术所提出的问题。
具体而言,本发明提供了:
1.一种制备核糖核苷或其衍生物的方法,包括下列步骤:在生物酶制剂的存在下将一种或多种底物分别、依次或者同时进行酶促反应,其中所述底物包含一种或多种的具有氧化含氮芳香杂环基团的核糖核苷酸或其盐、以及生糖氨基酸或其盐。
2.根据以上1所述的方法,其中
所述的核糖核苷或其衍生物选自磷酸化的核糖核苷或其盐,
任选地,所述磷酸化的核糖核苷或其盐选自单磷酸胞苷或其盐、二磷酸胞苷或其盐、三磷酸胞苷或其盐、单磷酸尿苷或其盐、二磷酸尿苷或其盐、三磷酸尿苷或其盐、单磷酸胸苷或其盐、二磷酸胸苷或其盐、三磷酸胸苷或其盐、单磷酸肌苷或其盐、二磷酸肌苷或其盐、三磷酸肌苷或其盐、单磷酸鸟苷或其盐、二磷酸鸟苷或其盐、三磷酸鸟苷或其盐、单磷酸腺苷或其盐、二磷酸腺苷或其盐、三磷酸腺苷或其盐的至少一者,优选为单磷酸肌苷或其盐、二磷酸肌苷或其盐、三磷酸肌苷或其盐、单磷酸鸟苷或其盐、二磷酸鸟苷或其盐、三磷酸鸟苷或其盐、单磷酸腺苷或其盐、二磷酸腺苷或其盐、三磷酸腺苷或其盐的至少一者,更优选为单磷酸腺苷或其盐、二磷酸腺苷或其盐、三磷酸腺苷或其盐的至少一者。
3.根据以上1-2中任意一项所述的方法和应用,其中所述的生物酶制剂为单一的生物酶制剂或者包含两种以上的生物酶的混合生物酶制剂;
任选地,所述生物酶制剂选自腺苷酸琥珀酸合酶(EC6.3.4.4)、腺苷酸琥珀酸裂解酶(EC4.3.2.2)、延胡索酸酶(EC4.2.1.2)、5’-核苷酸酶(EC3.1.3.5)、马来酸异构酶以及ATP生产酶中的至少一者;
任选地,所述ATP生产酶选自多聚磷酸激酶I(EC2.7.4.1)、多聚磷酸激酶類2(EC2.7.4.1)、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶(EC2.7.4.33)、腺苷酸激酶(EC2.7.4.3)中的至少一者;
4.根据以上1-3任意一项所述的方法,其中所述底物还包含磷酸供体,
任选地所述生糖氨基酸或其盐选自甘氨酸或其盐、丝氨酸或其盐、缬氨酸或其盐、组氨酸或其盐、精氨酸或其盐、丙氨酸或其盐、谷氨酸或其盐、谷氨酰胺或其盐、蛋氨酸或其盐、天冬氨酸或其盐、天冬酰胺或其盐、脯氨酸或其盐、羟脯氨酸或其盐、半胱氨酸或其盐的至少一者,优选为天冬氨酸或其盐、半胱氨酸或其盐和天冬酰胺或其盐的至少一者,更优选为天冬氨酸或其盐,
任选地,所述磷酸供体选自多聚磷酸或其盐等。
5.根据以上1-4中任意一项所述的应用,其中所述氧化含氮芳香杂环基团选自具有羰基的嘧啶基团或者具有羰基的嘌呤基团,任选地,所述具有氧化含氮芳香杂环基团的核糖核苷酸包含一个或多个磷酸基团、核糖基团以及嘌呤基团或者具有羰基的嘧啶基团;
任选地,所述底物还包含核糖核苷酸的琥珀酸衍生物,核糖核苷酸的琥珀酸衍生物包含一个或多个磷酸基团、核糖基团、嘌呤基团以及与嘌呤基团直接连接的琥珀酸基团,优选为腺苷酸琥珀酸;
任选地,所述具有羰基的嘧啶基团选自胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶中的至少一者;
任选地,所述嘌呤基团选自黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤中的至少一者;以及
优选地,所述一种或多种具有氧化含氮芳香杂环基团的核糖核苷酸或其盐选自呈味核苷酸或其盐、二磷酸腺苷或其盐、单磷酸腺苷或其盐、腺苷酸琥珀酸或其盐、三磷酸鸟苷或其盐、单磷酸肌苷酸或其盐、二磷酸鸟苷或其盐、单磷酸鸟苷或其盐中的至少一者。
6.根据以上1-6所述的方法,其中所述酶促反应包括使用腺苷酸激酶、多聚磷酸激酶类1和多聚磷酸激酶类2的至少一者以包含二磷酸腺苷或其盐和多聚磷酸或其盐的底物合成三磷酸腺苷或其盐。
7.根据以上1-6中任意一项所述的方法,其中所述酶促反应包括多个步骤或者单一步骤。
8.根据以上1-7中任意一项所述的方法,其中所述酶促反应包括下列中的至少一者:
(1)使用多聚磷酸激酶类2以包含单磷酸鸟苷或其盐和多聚磷酸或其盐的底物进行酶促反应;
(2)使用腺苷酸琥珀酸合酶以包含三磷酸鸟苷或其盐、单磷酸肌苷酸或其盐和天冬氨酸或其盐的底物进行酶促反应;
(3)使用腺苷酸琥珀酸裂解酶以包含腺苷酸琥珀酸或其盐的底物进行酶促反应;以及
(4)使用多聚磷酸-AMP磷酸转移酶、多聚磷酸激酶类1和多聚磷酸激酶類2的至少一者以包含单磷酸腺苷或其盐和多聚磷酸的底物进行酶促反应。
9.根据以上9所述的方法,其中所述酶促反应还包括下列中的至少一者:
(5)使用延胡索酸酶以包含延胡索酸的底物进行酶促反应;
(6)在酶促反应(4)后使用5’核苷酸酶以包含单磷酸腺苷的底物进行酶促反应。
10.根据以上9所述的方法,特征在于所述酶促反应包括依序进行酶促反应(1)、酶促反应(2)、酶促反应(3)和酶促反应(4),任选地在酶促反应(3)之前进行酶促反应(5)以及任选地在在酶促反应(4)之后进行酶促反应(5),
或者所述酶促反应包括同时进行酶促反应(1)、酶促反应(2)、酶促反应(3)、酶促反应(4)、任选的酶促反应(5)和任选的酶促反应(6)。
11.根据以上8所述的方法,特征在于所述方法包括依序进行下列步骤:
1)加入多聚磷酸激酶类2并加入单磷酸鸟苷或其盐和多聚磷酸或其盐为底物进行酶促反应将底物转化合成为二磷酸鸟苷或其盐和三磷酸鸟苷或其盐;
2)加入腺苷酸琥珀酸合酶,并加入单磷酸肌苷酸或其盐和天冬氨酸或其盐将三磷酸鸟苷或其盐转化为腺苷酸琥珀酸或其盐、二磷酸鸟苷或其盐和磷酸或其盐;
3)加入腺苷酸琥珀酸裂解酶将腺苷酸琥珀酸或其盐为底物转化为延胡索酸或其盐和单磷酸腺苷或其盐;
4)加入多聚磷酸-AMP磷酸转移酶和多聚磷酸或其盐进行酶促反应以将单磷酸腺苷或其盐转化为二磷酸腺苷或其盐和聚磷酸或其盐;
5)加入腺苷酸激酶将二磷酸腺苷或其盐转化合成为三磷酸腺苷或其盐和单磷酸腺苷或其盐。
12.根据以上11所述的方法,特征在于所述方法还包括依序进行下列步骤:
6)在步骤3)后加入多聚磷酸激酶類2并且与包含多聚磷酸的底物进行酶促反应将底物转化为三磷酸腺苷和二磷酸腺苷。
13.根据以上11所述的方法,特征在于所述方法还包括下列步骤:
7)在步骤3)后加入5’-核苷酸酶将单磷酸腺苷为底物在酶促反应中转化为腺苷。
14.根据以上7所述的方法,其中所述单一步骤包括使用包含腺苷酸激酶、多聚磷酸激酶和多聚磷酸-AMP磷酸转移酶中的至少一者、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、任选的胡索酸酶以及任选的5’-核苷酸酶的生物酶制剂将包含单磷酸鸟苷或其盐、磷酸供体、单磷酸肌苷酸或其盐和天冬氨酸或其盐的底物一步转化为三磷酸腺苷或其衍生物。
15.一种用于上述任意方法的生物酶制剂,包含:
腺苷酸激酶、多聚磷酸激酶类1、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、多聚磷酸激酶类2、胡索酸酶、马来酸异构酶和5’-核苷酸酶,其中腺苷酸激酶、多聚磷酸激酶类1、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、多聚磷酸激酶类2、胡索酸酶、马来酸异构酶和5’-核苷酸酶的摩尔比为(0.01-9):(0.01-9):(0.01-9):(0.01-9):(0.01-9):(0.01-9):(0-9):(0-9):(0-9);或者
腺苷酸激酶、多聚磷酸激酶类1、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、多聚磷酸激酶类2、胡索酸酶、马来酸异构酶和5’-核苷酸酶,
其中腺苷酸激酶、多聚磷酸激酶类1、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、多聚磷酸激酶类2、胡索酸酶、马来酸异构酶和5’-核苷酸酶的摩尔比为(0.01-8):(0.01-8):(0.01-8):(0.01-8):(0.01-8):(0-8):(0-8):(0-8);或者
多聚磷酸激酶类1、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、多聚磷酸激酶类2、胡索酸酶、马来酸异构酶和5’-核苷酸酶,其中多聚磷酸激酶类1、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、多聚磷酸激酶类2、胡索酸酶、马来酸异构酶和5’-核苷酸酶的摩尔比为(0.01-8):(0.01-8):(0.01-8):(0.01-8):(0.01-8):(0-8):(0-8):(0-8);或者
多聚磷酸激酶类2、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、胡索酸酶、马来酸异构酶和5’-核苷酸酶,其中分多聚磷酸激酶類2、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、胡索酸酶、马来酸异构酶和5’-核苷酸酶的摩尔比为(0.01-6):(0.01-6):(0.01-6):(0-6):(0-6):(0-6)。
16.一种利用核糖核苷或其衍生物为底物进行磷酸化或磷酸转移以制备生物产物的方法,包括进行以上1-14中任意一项的方法。
17.根据以上16的方法,其中
所述核糖核苷或其衍生物选自腺苷、单磷酸胞苷或其盐、二磷酸胞苷或其盐、三磷酸胞苷或其盐、单磷酸尿苷或其盐、二磷酸尿苷或其盐、三磷酸尿苷或其盐、单磷酸胸苷或其盐、二磷酸胸苷或其盐、三磷酸胸苷或其盐、单磷酸肌苷或其盐、二磷酸肌苷或其盐、三磷酸肌苷或其盐、单磷酸鸟苷或其盐、二磷酸鸟苷或其盐、三磷酸鸟苷或其盐、单磷酸腺苷或其盐、二磷酸腺苷或其盐、三磷酸腺苷或其盐的至少一者,优选为单磷酸肌苷或其盐、二磷酸肌苷或其盐、三磷酸肌苷或其盐、单磷酸鸟苷或其盐、二磷酸鸟苷或其盐、三磷酸鸟苷或其盐、单磷酸腺苷或其盐、二磷酸腺苷或其盐、三磷酸腺苷或其盐的至少一者,更优选为单磷酸腺苷或其盐、二磷酸腺苷或其盐、三磷酸腺苷或其盐以及腺苷的至少一者,
任选地,所述生物产物选自磷酸肌酸、谷胱甘肽、S-腺苷甲硫氨酸、辅酶A和β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中的至少一者。
18.根据以上16-17中任意一项所述的方法,其中还包括在所述生物酶制剂中加入S-腺苷甲硫氨酸合成酶、肌酸激酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的至少一者。
19.根据以上16所述的方法,其中所述酶促反应选自氧化还原酶系、荧光素酶系、固氮酶系、转移酶系、合酶系、激酶系、连接酶系、脱氧核糖核酸酶系、螯合酶系、羧化酶系、拓撲異構酶系、表异构酶系、消旋酶系、环化酶系、脱氨酶系、蛋白酶系和转运蛋白类中的至少一者。
20.根据上述任意的方法,该方法还包括以下步骤中至少一个:
1)加入多聚磷酸激酶类2、单磷酸鸟苷或其盐和多聚磷酸混合,使其反应生产二磷酸鸟苷、三磷酸鸟苷和聚磷酸□生物;
2)当所述的单磷酸鸟苷或其盐的量下降至步骤1)所述的反应初始时的20-100%以下时并在三磷酸鸟苷在反应中产生时,加入腺苷酸琥珀酸合酶、单磷酸肌苷酸或其盐和天冬氨酸或其盐混合,使其反应生产腺苷酸琥珀酸或其盐、二磷酸鸟苷或其盐、三磷酸鸟苷或其盐和磷酸盐。
3)当所述的三磷酸鸟苷或其盐、单磷酸肌苷酸或其盐的和天冬氨酸或其盐的总量下降至步骤2)所述的反应初始时的20-100%以下时并在腺苷酸琥珀酸或其盐在反应当中产生时,加入腺苷酸琥珀酸裂解酶混合,使其反应生产延胡索酸或其盐和单磷酸腺苷或其盐;反应中可以加入延胡索酸酶和马来酸异构酶的至少一者以使用上述反应中生产生的延胡索酸催化至苹果酸。
4)当所述的腺苷酸琥珀酸或其盐的量下降至步骤3)所述的反应初始时的20-100%以下时并在单磷酸腺苷或其盐在反应当中产生时,加入多聚磷酸-AMP磷酸转移酶和多聚磷酸或其盐混合,使其反应生产二磷酸腺苷或其盐和聚磷酸衍生物。
5)当所述的腺苷酸琥珀酸或其盐的量下降至步骤3)所述的反应初始时的20-100%以下时并在单磷酸腺或其盐苷在反应当中产生时,加入5’-核苷酸酶混合,使其反应生产腺苷和磷酸盐。
6)当所述的单磷酸腺苷或其盐的量下降至步骤4)所述的反应初始时的20-100%以下时并在二磷酸腺苷或其盐在反应当中产生时,加入腺苷酸激酶混合,使其反应生产三磷酸腺苷或其盐和单磷酸腺苷或其盐。
7)当所述的腺苷酸琥珀酸或其盐的量下降至步骤3)所述的反应初始时的20-100%以下时并在单磷酸腺苷或其盐在反应当中产生时,加入多聚磷酸激酶类1和多聚磷酸激酶类2之至少一者和多聚磷酸混合,使其反应生产二磷酸腺苷或其盐、三磷酸腺苷或其盐和聚磷酸衍生物。
21.根据上述的任意制备方法,其中所述的方法可以为使用上述的生物酶制剂所组成的酶组中至少一者和底物至少一者进行酶促反应制备三磷酸腺苷及其衍生物的至少一者。
22.根据上述的任意制备方法,其中所述的方法还包括在使用三磷酸腺苷及其衍生物的至少一者为底物和辅酶的酶促反应中,加入以上上述的生物酶制剂和底物至少一者作为该酶促反应中三磷酸腺苷及其衍生物的供应源在酶促反应中单独或共同进行。
23.根据上述的任意方法,其中所述的方法在25-65摄氏度进行,优选为28-50摄氏度进行,更优选为30-40摄氏度进行;所述的方法在pH 5-10进行,优选为pH5.5-9进行,更优选为pH 6-8.5进行。
24.根据上述的任意方法,其中所述的方法包括使用辅助离子,辅助离子包含氯离子、金属离子、钾离子、钠离子、锌离子、镁离子、钙离子、氟离子、硫离子、碳酸根类离子、亚硫酸根类离子以及含磷类离子中的至少一者,优选钠离子、镁离子、钾离子、碳酸根类离子、亚硫酸根类离子和含磷类离子中的至少一者;所述的方法可以同时包括使用酸度缓冲剂,缓冲剂包含磷酸盐类、硼酸盐类、三羟甲基氨基甲烷、氨基酸盐类等,优选为三羟甲基氨基甲烷,磷酸盐类和硼酸盐类,更优选为三羟甲基氨基甲烷和磷酸盐类中的磷酸钠和磷酸钾。
25.根据上述的任意方法,其中所述的生物酶制剂是利用生物工程法通过微生物发酵所进行表达,生物酶制剂可以按照液酶的方式如细胞破碎液和上清液在酶促反应中使用,亦可以利用各种的固定化方式将各生物酶制剂分别或混合的形式固定于任何一种的物料上在酶促反应中使用。
26.根据上述的任意方法,其可以在制备三磷酸腺苷及其衍生物的生产上应用,同时亦可用于在各种依赖三磷酸腺苷及其衍生物为底物的酶促反应中,酶促反应特别包括使用三磷酸腺苷为底物的氧化还原酶系、荧光素酶系、固氮酶系、转移酶系、合酶系、激酶系、连接酶系、脱氧核糖核酸酶系、螯合酶系、羧化酶系、拓扑异构酶系、表异构酶系、消旋酶系、环化酶系、脱氨酶系、蛋白酶系和转运蛋白类等。
27.一种制备核糖核苷或其衍生物的方法,包括下列步骤:在生物酶制剂的存在下将一种或多种底物分别、依次或者同时进行酶促反应,其中所述底物包含一种或多种的核糖核苷酸的琥珀酸衍生物、任选的一种或多种具有氧化含氮芳香杂环基团的核糖核苷酸或其盐、任选的生糖氨基酸或其盐以及任选的磷酸供体。
本发明具有以下优点和积极效果:
1.本发明的生物酶制剂以及方法可以应用于使用核糖核苷或其衍生物(例如,三磷酸腺苷或者其盐)的酶促反应中,特别是在应用于使用三磷酸腺苷为底物的酶促反应时并同时使用三磷酸腺苷再生工艺时而不需要预先投入三磷酸腺苷或其盐,为该行业技术领域中的突破。
2.本发明的方法可以使用价格低廉的核糖核苷酸或其衍生物(例如,单磷酸鸟苷或其盐、单磷酸肌苷或其盐、呈味核苷酸或其盐)、生糖氨基酸或其盐和任选的磷酸供体(例如聚磷酸类)为底物配合酶组进合酶化反应催化合成得到核糖核苷或其衍生物,采用的底物皆为廉价的常见食品类添加剂,供应和价格长期稳定,易于采购,有利于稳定核糖核苷或其衍生物的价格和满足未来日益增长的需求量。
3.相比使用核糖核苷酸或其衍生物再生工艺时核糖核苷酸或其衍生物的总量不会增加,本发明的方法在应用时其核糖核苷酸或其衍生物的总量会增加,更有利酶促反应的进行,同时提高其反应效能和转化率,创造在降低既有成本的前提下并且提升产能的有利条件。
4.本发明方法和生物酶制剂的使用要求相比核糖核苷酸或其衍生物再生工艺更低,所取用的酶制剂即使在杂酶留存在酶促反应系统的情况下仍能有效运作,无需采用成本高昂的酶纯化工艺才能应用,创造易于使用和低成本的优点,有利将本发明应用工业化。
5.本发明的方法和生物酶制剂既可应用于核糖核苷酸或其衍生物的生产,亦可作为其他使用核糖核苷酸或其衍生物为底物酶促反应的协同系统,其应用性比只能以辅助性质为首的核糖核苷酸或其衍生物再生工艺更加多元化。
6.本发明更可应用于使用核糖核苷酸或其衍生物作为核糖核苷(例如腺苷)供应源的酶促反应之中,同样地,在该酶促反应中不需要投入核糖核苷酸或其衍生物(例如三磷酸腺苷ATP),打破该类酶促反应不能使用核糖核苷酸或其衍生物再生工艺或其他方案以降低成本的做法,为该类酶法的首创工艺。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明,但这并非是对本发明的限制,本领域技术人员根据本发明的基本思想,可以做出各种修改或改进,但是只要不脱离本发明的基本思想,均在本发明的范围之内。
核糖核苷酸或其衍生物,特别是三磷酸腺苷,是酶法工艺中不可或缺的辅酶,为数众多的酶促反应皆依赖其作为底物,因此在生物科技行业中有着举足轻重的地位,但三磷酸腺苷等核糖核苷或其衍生物的价格长期居高不下、供应量大幅波动等不利因素都成为工业中采用酶法工艺为的忧虑,在可预见的将来这些问题终成为普及酶法工艺发展的绊脚石,科研人员需要在核糖核苷或其衍生物的制备和应用上及时研发新的对策以应付行业急促发展所衍生的供应压力并为此创造新的机遇,巩固行业的根基,生物科技方能在工业上逐渐普及,以高质量、高效能、高增值的利好条件,以可持续性的发展方向惠泽全人类。
本发明人意识到核糖核苷或其衍生物对生物科技的重要性,认为应审视现有应用于该领域的技术以解决当前的处境。本发明人发现核糖核苷或其衍生物再生工艺的应用是目前在使用核糖核苷或其衍生物的酶促反应类中相对可行的解决方案,因为使用聚磷酸类为底物再生核糖核苷或其衍生物比大量投入核糖核苷或其衍生物便宜,可是该工艺同时存在缺点,总的来说核糖核苷或其衍生物再生工艺并不能满足酶法工艺的需求,该领域需要新的方案以突破当前的困局。
为了解决上述存在的问题,本发明人进行了大量深入的理论研究和实验摸索,提供了一种核糖核苷或其衍生物的制备和应用方法,该方法的特点是使用价格低廉的底物,在该酶法的反应条件中将底物转化合成为核糖核苷或其衍生物,同样地,该方法可以配合使用核糖核苷或其衍生物的酶促反应中共同使用。由于本发明的方法能使用所提出的底物和生物酶制剂(包括酶组)转化合成核糖核苷或其衍生物,因此在配合使用核糖核苷或其衍生物的酶促反应时有别于过往所广范采用的核糖核苷或其衍生物再生工艺,在酶促反应或者方法中不需要投入核糖核苷或其衍生物,而且在整个酶促反应中的核糖核苷或其衍生物的总量可以增加。此外,本发明的方法和生物酶制剂可以使用在以核糖核苷或其衍生物为腺苷基团转移类的酶促反应中,为当前核糖核苷或其衍生物(例如ATP)再生工艺的无法实现,开启了特别是甲基类和氧化还原类辅酶类低成本生产的契机,实现该类辅酶在工业生产上使用的前景,进一步推动酶法工艺的应用,这些有利条件都是可以透过本发明实践并通过其特点引伸一连串密不可分的连锁经济效益,彻底解决酶工艺在工业应用上的基础问题。发明人认为本发明对整体行业定作出根深谛固的贡献,将在来年迅速发展的生物科技行业上占一重要席位。
在一个方面中,提出了一种制备核糖核苷或其衍生物的方法。该方法包括下列步骤:在生物酶制剂的存在下将一种或多种底物分别、依次或者同时进行酶促反应,其中所述底物包含包含一种或多种的具有氧化含氮芳香杂环基团的核糖核苷酸或其盐、以及生糖氨基酸或其盐。
核糖核苷或其衍生物选自磷酸化的核糖核苷或其盐。任选地,磷酸化的核糖核苷或其盐可以选自单磷酸胞苷或其盐、二磷酸胞苷或其盐、三磷酸胞苷或其盐、单磷酸尿苷或其盐、二磷酸尿苷或其盐、三磷酸尿苷或其盐、单磷酸胸苷或其盐、二磷酸胸苷或其盐、三磷酸胸苷或其盐、单磷酸肌苷或其盐、二磷酸肌苷或其盐、三磷酸肌苷或其盐、单磷酸鸟苷或其盐、二磷酸鸟苷或其盐、三磷酸鸟苷或其盐、单磷酸腺苷或其盐、二磷酸腺苷或其盐、三磷酸腺苷或其盐的至少一者,优选为单磷酸肌苷或其盐、二磷酸肌苷或其盐、三磷酸肌苷或其盐、单磷酸鸟苷或其盐、二磷酸鸟苷或其盐、三磷酸鸟苷或其盐、单磷酸腺苷或其盐、二磷酸腺苷或其盐、三磷酸腺苷或其盐的至少一者,更优选为单磷酸腺苷或其盐、二磷酸腺苷或其盐、三磷酸腺苷或其盐的至少一者。。
优选地,底物还可以包含磷酸供体。磷酸供体是指为酶促反应提供磷酸基团以进行磷酸转移的物质。其例子可以包括多聚磷酸或其盐等,例如,多聚磷酸钠、三聚磷酸钠、偏聚磷酸钠等
优选地,生糖氨基酸或其盐可以选自甘氨酸或其盐、丝氨酸或其盐、缬氨酸或其盐、组氨酸或其盐、精氨酸或其盐、丙氨酸或其盐、谷氨酸或其盐、谷氨酰胺或其盐、蛋氨酸或其盐、天冬氨酸或其盐、天冬酰胺或其盐、脯氨酸或其盐、羟脯氨酸或其盐、半胱氨酸或其盐的至少一者,优选为天冬氨酸或其盐、半胱氨酸或其盐和天冬酰胺或其盐的至少一者,更优选为天冬氨酸或其盐。
在本文中,氧化含氮芳香杂环基团是指至少一个成环原子被氧化的含氮杂环芳香基。含氮杂环芳香可以基包括异唑基、异噻唑基、吡唑基、吡啶基、恶唑基、噻唑、咪唑、三唑、四唑、呋喃基、三嗪基、噻吩、嘧啶、哒嗪、吡嗪、嘌呤等。含氮杂环芳香基的成环原子可以任选地被一个或多个基团取代。这些取代基包括氨基(-NH2)、羟基、烷基等。
优选的氧化含氮芳香杂环基团包括嘧啶酮基团或者嘌呤酮基团。
具有氧化含氮芳香杂环基团的核糖核苷酸可以包含一个或多个磷酸基团、核糖基团以及嘌呤基团或者嘧啶酮基团。
任选地,用于酶促反应的底物还可以包含核糖核苷酸的琥珀酸衍生物,核糖核苷酸的琥珀酸衍生物包含一个或多个磷酸基团、核糖基团、嘌呤基团以及与嘌呤基团直接连接的琥珀酸基团,优选为腺苷酸琥珀酸。
任选地,嘧啶酮基团可以选自胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶中的至少一者。
任选地,嘌呤基团可以选自黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤中的至少一者。
优选地,一种或多种具有氧化含氮芳香杂环基团的核糖核苷酸或其盐可以选自呈味核苷酸或其盐、二磷酸腺苷或其盐、单磷酸腺苷或其盐、腺苷酸琥珀酸或其盐、三磷酸鸟苷或其盐、单磷酸肌苷酸或其盐、二磷酸鸟苷或其盐、单磷酸鸟苷或其盐中的至少一者。
酶促反应是指借助于生物酶制剂催化的任何反应。在一个实施方案中,酶促反应可以包括使用腺苷酸激酶、多聚磷酸激酶I、多聚磷酸激酶类1和多聚磷酸激酶类2的至少一者以包含二磷酸腺苷或其盐和多聚磷酸或其盐的底物合成三磷酸腺苷或其盐。
优选地,酶促反应可以包括下列中的至少一者:
(1)使用多聚磷酸激酶以包含单磷酸鸟苷或其盐和多聚磷酸或其盐的底物进行酶促反应;
(2)使用腺苷酸琥珀酸合酶以包含三磷酸鸟苷或其盐、单磷酸肌苷酸或其盐和天冬氨酸或其盐的底物进行酶促反应;
(3)使用腺苷酸琥珀酸裂解酶以包含腺苷酸琥珀酸或其盐的底物进行酶促反应;以及
(4)使用多聚磷酸-AMP磷酸转移酶或多聚磷酸激酶I、多聚磷酸激酶類1和多聚磷酸激酶類2的至少一者以包含单磷酸腺苷或其盐和多聚磷酸的底物进行酶促反应。
所述酶促反应还可以包括下列中的至少一者:
(5)使用延胡索酸酶以包含延胡索酸的底物进行酶促反应;
(6)在酶促反应(4)后使用5’核苷酸酶以包含单磷酸腺苷的底物进行酶促反应。
在一个实施方案中,酶促反应包括依序进行酶促反应(1)、酶促反应(2)、酶促反应(3)和酶促反应(4),任选地在酶促反应(3)之前进行酶促反应(5)以及任选地在在酶促反应(4)之后进行酶促反应(5)。
在另一个实施方案中,酶促反应可以包括同时进行酶促反应(1)、酶促反应(2)、酶促反应(3)、酶促反应(4)、任选的酶促反应(5)和任选的酶促反应(6)。
在一个实施方案中,制备核糖核苷或其衍生物的方法可以包括依序进行下列步骤:
1)加入多聚磷酸激酶并加入单磷酸鸟苷或其盐和多聚磷酸或其盐为底物进行酶促反应将底物转化合成为二磷酸鸟苷或其盐和三磷酸鸟苷或其盐;
2)加入腺苷酸琥珀酸合酶,并加入单磷酸肌苷酸或其盐和天冬氨酸或其盐将三磷酸鸟苷或其盐转化为腺苷酸琥珀酸或其盐、二磷酸鸟苷或其盐和磷酸或其盐;
3)加入腺苷酸琥珀酸裂解酶将腺苷酸琥珀酸或其盐为底物转化为延胡索酸或其盐和单磷酸腺苷或其盐;
4)加入多聚磷酸-AMP磷酸转移酶和多聚磷酸或其盐进行酶促反应以将单磷酸腺苷或其盐转化为二磷酸腺苷或其盐和聚磷酸或其盐;
5)加入腺苷酸激酶将二磷酸腺苷或其盐转化合成为三磷酸腺苷或其盐和单磷酸腺苷或其盐。
在步骤3)后可以加入多聚磷酸激酶類2并且与包含多聚磷酸的底物进行酶促反应将底物转化为三磷酸腺苷和二磷酸腺苷。
或者,在步骤3)后可以加入5’-核苷酸酶将单磷酸腺苷为底物在酶促反应中转化为腺苷。
具体而言,制备核糖核苷或其衍生物的方法可以包括下列步骤或者酶促反应:
i)加入多聚磷酸激酶、单磷酸鸟苷及其盐和多聚磷酸混合,使其反应生产二磷酸鸟苷、三磷酸鸟苷和聚磷酸衍生物;
ii)当三磷酸鸟苷在反应中产生时,加入腺苷酸琥珀酸合酶、单磷酸肌苷酸或其盐和天冬氨酸或其盐混合,使其反应生产腺苷酸琥珀酸、二磷酸鸟苷和磷酸盐:
iii)当腺苷酸琥珀酸在反应当中产生时,加入腺苷酸琥珀酸裂解酶混合,使其反应生产延胡索酸和单磷酸腺苷;任选地,反应中可以加入延胡索酸酶和马来酸异构酶的至少一者以使用上述反应中生产生的延胡索酸催化产生苹果酸;
iv)当单磷酸腺苷在反应中产生时,加入多聚磷酸-AMP磷酸转移酶和多聚磷酸或其盐混合,使其反应生产二磷酸腺苷和聚磷酸衍生物;
v)当二磷酸腺苷在反应中产生时,加入腺苷酸激酶混合,使其反应生产三磷酸腺苷和单磷酸腺苷;
vi)当步骤iii)中单磷酸腺苷在反应中产生时,加入多聚磷酸激酶和多聚磷酸或其盐混合,使其反应生产二磷酸腺苷、三磷酸腺苷和聚磷酸衍生物;
当目标反应产物为腺苷时,本发明的方法还可以包括下列步骤或者酶促反应
vii)当步骤iii)单磷酸腺苷在反应中产生时,加入5’-核苷酸酶混合,使其反应生产腺苷和磷酸盐;
根据一个实施方案,酶促反应的底物还可以包含辅助离子。辅助离子可以选自氯离子、镁离子、钠离子、钾离子、钙离子和锰离子中的至少一者,更优选为镁离子、钾离子和锰离子中至少一者。辅助离子可为其无机盐或有机盐的状态,优选为碳酸钾、六水氯化镁、氯化钠、氯化锰、硫酸镁和中的至少一者,更优选为六水氯化镁、氯化钠和氯化锰中的至少一者。
此外,酶促反应的底物还可以包含其他用于酶促反应的添加剂,例如,pH调节剂,如缓冲液/盐,优选为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液、碳酸钠缓冲液和碳酸氢钠缓冲液,更优选为磷酸钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液。pH调节剂的浓度可以为0.001M-2M,优选为0.01M-1M,更优选为0.05M-0.2M。
如上所述,制备核糖核苷或其衍生物的方法可以包括在生物酶制剂的存在下将一种或多种底物分别、依次或者同时进行酶促反应。
关于生物酶制剂,其可以为单一的生物酶制剂或者包含两种以上的生物酶的混合生物酶制剂。
任选地,生物酶制剂可以选自腺苷酸琥珀酸合酶(EC 6.3.4.4)、腺苷酸琥珀酸裂解酶(EC 4.3.2.2)、延胡索酸酶(EC 4.2.1.2)、5’-核苷酸酶(EC 3.1.3.5)、马来酸异构酶以及ATP生产酶中的至少一者。
ATP生产酶可以选自多聚磷酸激酶、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶(EC 2.7.4.33)、腺苷酸激酶(EC 2.7.4.3)中的至少一者。多聚磷酸激酶可以包含多聚磷酸激酶類1(EC2.7.4.1)、多聚磷酸激酶類2(EC 2.7.4.1)中的至少一者。
因此,在另一个方面中,本发明还提供了用于上述方法的生物酶制剂。生物酶制剂可以包含:
腺苷酸激酶、多聚磷酸激酶類1、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、多聚磷酸激酶類2、胡索酸酶、马来酸异构酶和5’-核苷酸酶,其中腺苷酸激酶、多聚磷酸激酶類1、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、多聚磷酸激酶類2、胡索酸酶、马来酸异构酶和5’-核苷酸酶的摩尔比为(0.01-9):(0.01-9):(0.01-9):(0.01-9):(0.01-9):(0.01-9):(0-9):(0-9):(0-9);或者
腺苷酸激酶、多聚磷酸激酶類1、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、多聚磷酸激酶類2、胡索酸酶、马来酸异构酶和5’-核苷酸酶,其中腺苷酸激酶、多聚磷酸激酶類1、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、多聚磷酸激酶類2、胡索酸酶、马来酸异构酶和5’-核苷酸酶的摩尔比为(0.01-8):(0.01-8):(0.01-8):(0.01-8):(0.01-8):(0-8):(0-8):(0-8);或者
多聚磷酸激酶類1、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、多聚磷酸激酶類2、胡索酸酶、马来酸异构酶和5’-核苷酸酶,其中多聚磷酸激酶類1、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、多聚磷酸激酶類2、胡索酸酶、马来酸异构酶和5’-核苷酸酶的摩尔比为(0.01-8):(0.01-8):(0.01-8):(0.01-8):(0.01-8):(0-8):(0-8):(0-8);或者
多聚磷酸激酶類2、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、胡索酸酶、马来酸异构酶和5’-核苷酸酶,其中分多聚磷酸激酶類2、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、胡索酸酶、马来酸异构酶和5’-核苷酸酶的摩尔比为(0.01-6):(0.01-6):(0.01-6):(0-6):(0-6):(0-6)。
在本发明的一些具体实施方案中,生物酶制剂可以包含腺苷酸激酶、多聚磷酸激酶类1、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶和多聚磷酸激酶类2。
在上述的具体实施方案中,优选地,酶促反应中的底物可以包含单磷酸鸟苷二钠、单磷酸肌苷二钠、天冬氨酸和多聚磷酸,生物酶制剂为液酶,反应条件为pH6.5-8,使用0.1M三羟甲基氨基甲烷缓冲液为pH调控方法,温度控制为摄氏30-37度,酶促反应中还包含了使用六水氯化镁中的镁离子和/或氯化锰中的锰离子作为辅助离子,使用上述的底物以单步骤形式进行酶促反应生产三磷酸腺苷、二磷酸腺苷和单磷酸腺苷。
在另一个具体实施方案中,生物酶制剂包含多聚磷酸激酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶和腺苷酸琥珀酸合酶并使用反应底物5’-呈味核苷酸二钠、天冬氨酸和多聚磷酸,生物酶制剂为液酶,反应条件为pH6.5-8,使用0.1M三羟甲基氨基甲烷缓冲液为pH调控方法,温度控制为摄氏30-37度,酶促反应中还包含了使用六水氯化镁中的镁离子和/或氯化锰中的锰离子作为辅助离子。使用上述的底物以多种酶混合的形式同步进行酶促反应生产三磷酸腺苷、二磷酸腺苷和单磷酸腺苷。
同样地,在另一个具体实施方案中,生物酶制剂包括多聚磷酸激酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶和腺苷酸琥珀酸合酶和5’-核苷酸酶,使用底物5’-呈味核苷酸二钠、天冬氨酸和多聚磷酸,生物酶制剂为液酶,反应条件为pH6.5-8,使用0.1M三羟甲基氨基甲烷缓冲液为pH调控方法,温度控制为摄氏30-37度,酶促反应中还包含了使用六水氯化镁中的镁离子和/或氯化锰中的锰离子作为辅助离子,使用上述的底物以多种酶混合的形式同步进行酶促反应生产腺苷。
在一个方面中,用于制备核糖核苷或其衍生物的方法和应用中使用的生物酶制剂包含腺苷酸琥珀酸合酶(EC 6.3.4.4)、腺苷酸琥珀酸裂解酶(EC 4.3.2.2)、多聚磷酸激酶I(EC 2.7.4.1)、多聚磷酸激酶類1(EC 2.7.4.1)、多聚磷酸激酶類2(EC 2.7.4.1)、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶(EC 2.7.4.33)、腺苷酸激酶(EC 2.7.4.3)中的至少一者。生物酶制剂还可以包含延胡索酸酶(EC 4.2.1.2)、马来酸异构酶(EC 5.2.1.1)、5’-核苷酸酶(EC3.1.3.5)、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶和多聚磷酸激酶的至少一者。本发明还提出了该酶制剂同时使用的底物,其中可以包括二磷酸腺苷或其盐、单磷酸腺苷或其盐、腺苷酸琥珀酸或其盐、三磷酸鸟苷或其盐、单磷酸肌苷酸或其盐、单磷酸鸟苷或其盐、呈味核苷酸或其鹽、天冬氨酸或其盐和多聚磷酸或其盐的至少一者。
在第三方面中,本发明还提供了一种使用核糖核苷或其衍生物为底物进行磷酸化或磷酸转移以制备生物产物的方法,包上述任意一项的方法。
生物产物可以选自磷酸肌酸、谷胱甘肽、S-腺苷甲硫氨酸、辅酶A和β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中的至少一者。
所述方法还可以包括在所述生物酶制剂中加入S-腺苷甲硫氨酸合成酶、肌酸激酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶、脱磷酸辅酶A激酶中的至少一者。
目前,使用三磷酸腺苷的酶法工艺中普遍会同时利用三磷酸腺苷再生技术,即以三磷酸腺苷再生酶组结合以聚磷酸类化合物为底物,当酶促反应中使用三磷酸腺苷的磷酸基团作反应而失去其β和γ磷酸基团时,聚磷酸在三磷酸腺苷再生酶组的催化反应下作为磷酸基团的供应源,当三磷酸腺苷在酶促反应中提供其磷酸基团而转化合成为二磷酸腺苷或单磷酸腺苷等副产物时便再生成为三磷酸腺苷,由于聚磷酸类化合物比三磷酸腺苷的价格相宜,因此采用三磷酸腺苷再生工艺是现时可取的方法。然而,该工艺存在技术限制:首先,使用三磷酸腺苷再生工艺必须要先加入三磷酸腺苷于反应中;由于三磷酸腺苷的价格昂贵,在维持生产成本的前提下只能少量加入,而三磷酸腺苷再生工艺中只会再生三磷酸腺苷的磷酸基团而无法增加三磷酸腺苷在反应体系中的量;再者,三磷酸腺苷再生工艺对体系中的酶纯化度有高要求。以大肠杆菌或酵母等作为表达酶的宿主时,除了表达目标酶之外还会同时表达其他杂酶,其中常见的有以降解三磷酸腺苷的磷酸酶类,该酶类能水解催化三磷酸腺苷的磷酸基團,促使酶促反應中的三磷酸腺苷降解至腺苷,导致三磷酸腺苷再生工艺在酶法反应中不能发挥其作用,解决方案只能使用酶纯化工艺去除杂酶。纯化工艺过程繁复而且成本高昂,此外,当使用腺苷转移酶类作酶法生产时,由于该酶类以三磷酸腺苷中的腺苷基团为主要底物,在反应过程中腺苷被转移至产物的应用如使用甲硫氨酸腺苷转移酶以三磷酸腺苷和蛋胺酸转化合成的S-腺苷甲硫氨酸,是身体内最重要甲基供体并在商业上广范应用于保养肝脏、改善情绪和关节的保健品中。该酶法工艺还包括重要的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(又名烟酸单核苷酸腺苷转移酶),其使用烟酰胺单核苷酸/烟酸单核苷酸和三磷酸腺苷为底物转化合成至烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或盐酸腺嘌呤二核苷酸,是体内生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的最重要酶,同时烟酰胺腺嘌呤二核苷酸是酶工业中最常用的辅酶,数以千计的酶促反应都需要依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,因此其价格的波动能牵连整个行业。由于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的化学合成复杂,需要进行多步反应以致回收率低,提取法则因为生物中的含量极微,工艺昂贵并且纯度低,近年的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸已被酶法所取代。三磷酸腺苷再生工艺不能使用于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的生产工艺中是该产物长期价格居高不下的主因。
与此对比的是,利用本发明的制备核糖核苷或其衍生物的方法能够生产或者再生或者增加核糖核苷或其衍生物的量,从而以更大的成本有益制备各种生物产物。换言之,可以将本发明提出的制备核糖核苷或其衍生物的方法用于使用核糖核苷或其衍生物的酶法工艺中。例如,利用三磷酸腺苷(ATP)为底物进行磷酸化或磷酸转移以生产磷酸肌酸、谷胱甘肽、S-腺苷甲硫氨酸、辅酶A和β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中的至少一者。
在一个具体实施方案中,本发明提供了制备磷酸肌酸的方法,包括在使用肌酸激酶以三磷酸腺苷和肌酸酶法生产磷酸肌酸的同时使用本发明的生物酶制剂和底物进行酶促反应。生物酶制剂包括多聚磷酸激酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶和腺苷酸琥珀酸合酶并使用反应底物5’-呈味核苷酸二钠、天冬氨酸和多聚磷酸或其盐,反应条件为pH8.2-8.5;使用0.05M三羟甲基氨基甲烷缓冲液为pH调控方法,温度控制为摄氏35-37度,酶促反应中还包含了使用一水氯化锰中的锰离子和其他離子作为辅助离子,使用上述的底物以多种酶混合的形式同步进行酶促反应生产磷酸肌酸。由于肌酸激酶酶法生产工艺上同时使用了本发明,因此无需在反应中添加三磷酸腺苷,实现在没有使用三磷酸腺苷的情况下生产磷酸肌酸。
在另一个具体实施方案中,本发明还提供了制备s-腺苷甲硫氨酸的方法,包括在使用s-腺苷甲硫氨酸合成酶以三磷酸腺苷和DL-蛋氨酸酶法生产s-腺苷甲硫氨酸的同时使用本发明的生物酶制剂和底物进行酶促反应。生物酶制剂包括多聚磷酸激酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶和腺苷酸琥珀酸合酶并使用反应底物5’-呈味核苷酸二钠、天冬氨酸和多聚磷酸或其盐,反应条件为pH6.2-7.7,使用0.05M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液为pH调控方法,温度控制为摄氏32-37度,酶促反应中还包含了使用一水氯化锰中的锰离子作为辅助离子,使用上述的底物以多种酶混合的形式同步进行酶促反应生产s-腺苷甲硫氨酸。由于s-腺苷甲硫氨酸酶法生产工艺上同时使用了本发明的方法,因此无需在反应中添加三磷酸腺苷,实现在没有使用三磷酸腺苷的情况下生产s-腺苷甲硫氨酸。
同样地,在另一个具体实施方案中,本发明提供了使用酶法生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法,包括同时加入本发明的酶生物制剂和底物。生物酶制剂包括了生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶以及多聚磷酸激酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶和腺苷酸琥珀酸合酶,并同时使用了该两组合所需要的反应底物,包括烟酰胺单核苷酸、5’-呈味核苷酸二钠、天冬氨酸和多聚磷酸。由于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸酶法生产工艺上同时使用了本发明,因此无需在反应中添加该工艺所必须使用的底物三磷酸腺苷亦能进行反应生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
优选地,为了进行所述的酶促反应,在一些具体实施例子中将所述的固定化细胞和固定化酶置于固定化反应装置中,以进行固定化反应。
本发明的方法可以用于各种酶促反应种,例如,所述酶促反应可以选自氧化还原酶系、荧光素酶系、固氮酶系、转移酶系、合酶系、激酶系、连接酶系、脱氧核糖核酸酶系、螯合酶系、羧化酶系、拓撲異構酶系、表异构酶系、消旋酶系、环化酶系、脱氨酶系、蛋白酶系和转运蛋白类中的至少一者。
以下通过一些例子去解释或说明本专利发明的内容,但这些例子不应被理解为本专利发明保护范围的限制。
以下例子中未注明具体条件的,均按常规条件或制造商建议的条件进行。除非特别说明,否则所述百分比为重量百分比。
下列例子中所用材料和设备的描述如下:
反应调控罐:来自基因港(香港)生物科技有限公司,BR-1L;
可调节流量式吸水泵:购自SURGEFLO公司,FL-32;
酸碱度调控装置:来自基因港(香港)生物科技有限公司,AR-1;
LB培养基:购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;
IPTG:购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;
烟酰胺单核苷酸:来自基因港(香港)生物科技有限公司;
天冬氨酸:天硕(山东)食品配料有限公司;
5’-鸟苷酸二钠:购自江苏伯荣生物科枝有限公司;
5’-肌苷酸二钠:购自江苏伯荣生物科枝有限公司;
5’-呈味核苷酸二钠:购自山东盛源食品配料有限公司;
一水肌酸:购自江苏燕科生物工程有限公司;
DL-蛋氨酸:购自淅江盛通生物科技有限公司;
六水氯化镁:购自Merck,USA;
一水氯化锰:购自Merck,USA;
多聚磷酸纳:购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;
三羟甲基氨基甲烷:购自Merck,USA;
三磷酸腺苷二钠盐:购自Merck,USA;
一水肌酸:购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
制备例1:制备腺苷酸激酶(EC 2.7.4.3)
基于金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)基因组中的编码腺苷酸激酶(ADK)的DNA序列(SEQ ID No.3)的设计PCR引物,具体为
上游引物ADK-1:
5’-CTGACCGGATCCATGAATATCATTTTGATGGGTTTA-3’(SEQ ID No.1)
下游引物ADK-2:
5’-TATGCGGAATTCTTACAAATGATCTAAAATATCAAT-3’(SEQ ID No.2)
以金黄色金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的DNA为底物,以上述引物进行PCR扩增得腺苷酸激酶基因,利用限制性内切酶BamH I和EcoRI处理PCR产物并将其连接至pET-21a中,得到pET-ADK。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中,得到腺苷酸激酶重组表达菌株。
将上述菌株挑选单一种落接种到4mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素),在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子,完成后按1%接种比例接到100mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素),在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子,完成后按1%接种比例接到60L LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM,发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟,得到含腺苷酸激酶的大肠杆菌细胞1.33kg。将所得含腺苷酸激酶的大肠杆菌细胞配制成上清液。上清液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS 100mM pH 7.5)打浆后,使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10,000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液,每1ml上清液中含0.2g细胞。
根据其酶促反应对细胞进行酶活力检测,该方法为在1ml的反应溶液(200mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液pH 7.5,10mM二磷酸腺苷二钠盐,5mM六水氯化镁)中加入含有1mg总蛋白量的酶液,在37摄氏度的温控下进行5分钟反应,完成后对样本中在酶反应中所产生的进行三磷酸腺苷含量分析,根据上述方法本酶液的酶活约为0.08umol/min/mg。
制备例2:制备多聚磷酸:AMP转移酶(EC 2.7.4.33)
基于绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)基因组中的编码多聚磷酸:AMP转移酶(PAP)的DNA序列(SEQ ID No.6)设计PCR引物,具体为
上游引物PAP-1:
5’-CTGACCGGATCCATGTTCGAATCCGCGGAAGTTGGC-3’(SEQ ID No.4)
下游引物PAP-2:
5’-TATGCGGAATTCTCACTTGTCCTTCTTGTACGCCGC-3’(SEQ ID No.5)
以绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的DNA为底物,以上述引物进行PCR扩增得多聚磷酸:AMP转移酶基因,利用限制性内切酶BamH I和EcoRI处理PCR产物并将其连接至pET-21a中,得到pET-PAP。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中,得到多聚磷酸:AMP转移酶重组表达菌株。
将上述菌株挑选单一种落接种到4mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素),在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子,完成后按1%接种比例接到100mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素),在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子,完成后按1%接种比例接到60L LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM,发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟,得到含多聚磷酸:AMP转移酶的大肠杆菌细胞1.37kg。将所得含多聚磷酸:AMP转移酶的大肠杆菌细胞配制成上清液:上清液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS 100mM pH 7.5)打浆后,使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10,000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液,每1ml上清液中含0.2g细胞。
根据其酶促反应对细胞进行酶活力检测,该方法为在1ml的反应溶液(100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液pH 7.5,5mM单磷酸腺苷钠盐,5mM多聚磷酸盐,8mM六水氯化镁)中加入含有1mg总蛋白量的上清液,在37摄氏度的温控下进行5分钟反应,完成后对样本中在酶反应中所产生的进行二磷酸腺苷含量分析。根据上述方法本上清液的酶活为约1.12umol/min/mg。
制备例3:制备多聚磷酸激酶类1(EC 2.7.4.1)
基于绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)基因组中的编码多聚磷酸激酶类1(PPK2)的DNA序列(SEQ ID No.9)设计PCR引物,具体为
上游引物PPK2-1:
5’-CTGACCGGATCCATGGCCCTGCAGGTCGCCAGCGCG-3’(SEQ ID No.7)
下游引物PPK2-2:
5’-TATGCGGAATTCTCAGGCCGGGATATCCAGGTTCGC-3’(SEQ ID No.8)
以绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的DNA为底物,以上述引物进行PCR扩增得多聚磷酸激酶基因,利用限制性内切酶BamH I和EcoRI处理PCR产物并将其连接至pET-21a中,得到pET-PPK1。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中,得到多聚磷酸激酶重组表达菌株。
将上述菌株挑选单一种落接种到4mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素),在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子,完成后按1%接种比例接到100mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素),在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子,完成后按1%接种比例接到60L LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM,发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟,得到含多聚磷酸激酶的大肠杆菌细胞1.11kg。将所得含多聚磷酸激酶的大肠杆菌细胞配制成上清液:上清液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS 100mM pH 7.5)打浆后,使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10,000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液,每1ml上清液中含0.2g细胞。
根据其酶促反应对细胞进行酶活力检测,该方法为在1ml的反应溶液(100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液pH 7.5,10mM二磷酸腺苷钠盐,5mM多聚磷酸盐,8mM一水氯化锰)中加入含有1mg总蛋白量的上清液,在摄氏37度的温控下进行5分钟反应,完成后对样本中在酶反应中所产生的进行三磷酸腺苷含量分析。根据上述方法本上清液的酶活为约0.08nmol/min/mg。
制备4:制备多聚磷酸激酶类2(EC 2.7.4.1)
基于基因组Westiellopsis prolifica IICB1中的编码多聚磷酸激酶类2(PPK3)的DNA序列(SEQ ID No.12)设计PCR引物,具体为
上游引物PPK3-1:
5’-CTGACCGGATCCATGAATTACGCGGACTTCCTAACT-3’(SEQ ID No.10)
下游引物PPK3-2:
5’-TATGCGGAATTCTTACTCCTCTGTTTCGAGGATTTC-3’(SEQ ID No.11)
以Westiellopsis prolifica IICB1的DNA为底物,以上述引物进行PCR扩增得多聚磷酸激酶类2基因,利用限制性内切酶BamH I和EcoRI处理PCR产物并将其连接至pET-21a中,得到pET-PPK3。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中,得到多聚磷酸激酶类2重组表达菌株。
将上述菌株挑选单一种落接种到4mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素),在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子,完成后按1%接种比例接到100mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素),在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子,完成后按1%接种比例接到60L LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM,发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟,得到含多聚磷酸激酶類2的大肠杆菌细胞1.17kg。将所得含多聚磷酸激酶類2的大肠杆菌细胞配制成上清液:上清液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS100mM pH 7.5)打浆后,使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10,000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液,每1ml上清液中含0.2g细胞。
根据其酶促反应对细胞进行酶活力检测,该方法为在1ml的反应溶液(100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液pH 7.5,5mM 5’-鸟苷酸二鈉,10mM多聚磷酸盐,10mM一水氯化锰)中加入含有1mg总蛋白量的上清液,在37摄氏度的温控下进行5分钟反应,完成后以附件1的高效液相色谱对样本中在酶反应中所产生的多聚磷酸激酶類2的含量分析。根据上述方法本上清液的酶活为约0.23umol/min/mg。
制备例5:制备腺苷酸琥珀酸合酶(EC 6.3.4.4)
基于金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)基因组中的编码腺苷酸琥珀酸合酶(ADS)的DNA序列(SEQ ID No.15)设计PCR引物,具体为
上游引物ADS-1:
5’-CTGACCGGATCCATGTCATCAATCGTAGTAGTTGGG-3’(SEQ ID No.13)
下游引物ADS-2:
5’-TATGCGGAATTCCTACCACAATTCTTTTAATAGGTT-3’(SEQ ID No.14)
以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的DNA为底物,以上述引物进行PCR扩增得腺苷酸琥珀酸合酶基因,利用限制性内切酶BamH I和EcoRI处理PCR产物并将其连接至pET-21a中,得到pET-ADS。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中,得到腺苷酸琥珀酸合酶重组表达菌株。
将上述菌株挑选单一种落接种到4mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素),在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子,完成后按1%接种比例接到100mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素),在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子,完成后按1%接种比例接到60L LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM,发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟,含腺苷酸琥珀酸合酶的大肠杆菌细胞0.87kg。将所得含腺苷酸琥珀酸合酶的大肠杆菌细胞配制成上清液:上清液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS 100mM pH 7.5)打浆后,使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10,000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液,每1ml上清液中含0.2g细胞。
根据其酶促反应对细胞进行酶活力检测,该方法为在1ml的反应溶液(100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液pH 7.5,10mM三磷酸鸟苷钠盐,8mM天冬氨酸,5mM 5’-肌苷酸二钠、10mM一水氯化锰)中加入含有1mg总蛋白量的上清液,在摄氏37度的温控下进行30分钟反应,完成后对样本中在酶反应中所产生的进行腺苷酸琥珀酸含量分析。根据上述方法本上清液的酶活为约0.035umol/min/mg。
制备例6:制备腺苷酸琥珀酸裂解酶(EC4.3.2.2)
基于肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)基因组中的编码腺苷酸琥珀酸裂解酶(ADL)的DNA序列(SEQ ID No.18)设计PCR引物,具体为
上游引物ADL-1:
5’-CTGACCGGATCCATGGAATTATCCTCACTGACCGCC-3’(SEQ ID No.16)
下游引物ADL-2:
5’-TATGCGGAATTCTTATTTAAGTTCGTCGACCAGAGT-3’(SEQ ID No.17)
以肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)的DNA为底物,以上述引物进行PCR扩增得腺苷酸琥珀酸裂解酶基因,利用限制性内切酶BamH I和EcoRI处理PCR产物并将其连接至pET-21a中,得到pET-ADL。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中,得到腺苷酸琥珀酸裂解酶重组表达菌株。
将上述菌株挑选单一种落接种到4mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素),在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子,完成后按1%接种比例接到100mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素),在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子,完成后按1%接种比例接到60L LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM,发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟,得到含腺苷酸琥珀酸裂解酶的大肠杆菌细胞1.02kg。将所得含腺苷酸琥珀酸裂解酶的大肠杆菌细胞配制成上清液:上清液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS100mM pH 7.5)打浆后,使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10,000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液。
根据其酶促反应对细胞进行酶活力检测,该方法为在1ml的反应溶液(100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液pH 7.5,5mM腺苷酸琥珀酸,10mM一水氯化锰)中加入含有1mg总蛋白量的上清液,在摄氏37度的温控下进行60分钟反应,完成后对样本中在酶反应中所产生的进行单磷酸腺苷含量分析。根据上述方法本上清液的酶活约为0.062umol/min/mg。
制备例7:制备延胡索酸酶(EC 4.2.1.2)
基于幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)基因组中的编码延胡索酸酶(FUM)的DNA序列(SEQ ID No.21)设计PCR引物,具体为
上游引物FUM-1:
5’-CTGACCGGATCCATGCAATTTAGAATCGAACATGAC-3’(SEQ ID No.19)
下游引物FUM-2:
5’-TATGCGGAATTCTCAAGCCTTAGGCCCGATCATCTT-3’(SEQ ID No.20)
以幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的DNA为底物,以上述引物进行PCR扩增得延胡索酸酶基因,利用限制性内切酶BamH I和EcoRI处理PCR产物并将其连接至pET-21a中,得到pET-FUM。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中,得到延胡索酸酶重组表达菌株。
将上述菌株挑选单一种落接种到4mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素),在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子,完成后按1%接种比例接到100mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素),在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子,完成后按1%接种比例接到60L LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM,发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟,得到含延胡索酸酶的大肠杆菌细胞1.14kg。将所得含延胡索酸酶的大肠杆菌细胞配制成上清液:上清液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS 100mM pH 7.5)打浆后,使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10,000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液,每1ml上清液中含0.2g细胞。
根据其酶促反应对细胞进行酶活力检测,该方法为在1ml的反应溶液(100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液pH 7.5,3mM,5mM延胡索酸,10mM一水氯化锰)中加入含有1mg总蛋白量的上清液,在摄氏37度的温控下进行20分钟反应,完成后对样本中在酶反应中所产生的进行苹果酸含量分析。根据上述方法本上清液的酶活为约0.18umol/min/mg。
制备例8:制备5’-核苷酸酶(EC 3.1.3.5)
基于蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)基因组中的编码5’-核苷酸酶(NUCL)的DNA序列(SEQ ID No.24)设计PCR引物,具体为
上游引物NUCL-1:
5’-CTGACCGGATCCATGGATCGTTTTCATAGTATTTCG-3’(SEQ ID No.22)
下游引物NUCL-2:
5’-TATGCGGAATTCCTATAGTTTAACGGAAGATTTATA-3’(SEQ ID No.23)
以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的DNA为底物,以上述引物进行PCR扩增得5’-核苷酸酶基因,利用限制性内切酶BamH I和EcoRI处理PCR产物并将其连接至pET-21a中,得到pET-NUCL。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中,得到5’-核苷酸酶重组表达菌株。
将上述菌株挑选单一种落接种到4mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素),在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子,完成后按1%接种比例接到100mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素),在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子,完成后按1%接种比例接到60L LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM,发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟,得到含5’-核苷酸酶的大肠杆菌细胞1.02kg。将所得含5’-核苷酸酶的大肠杆菌细胞配制成上清液:上清液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS 100mM pH 7.5)打浆后,使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10,000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液,每1ml上清液中含0.2g细胞。
根据其酶促反应对细胞进行酶活力检测,该方法为在1ml的反应溶液(100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液pH 7.5,5mM单磷酸腺苷钠盐,20mM六水氯化镁)中加入含有1mg总蛋白量的上清液,在摄氏37度的温控下进行30分钟反应,完成后对样本中在酶法反应中所产生的进行腺苷含量分析。根据上述方法本上清液的酶活为约0.004nmol/min/mg。
实施例1:使用5’-鸟苷酸、5’-肌苷酸和天冬氨酸以有序实施的方式运用酶组中腺苷酸激酶、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、多聚磷酸激酶类1和多聚磷酸激酶类2的酶上清液制备三磷酸腺苷和二磷酸腺苷
按上述的制备例制备腺苷酸激酶、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、多聚磷酸激酶类1和多聚磷酸激酶类2所属的酶上清液各100ml备用。配制1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液备用;配制方法为称重121g三羟甲基氨基甲烷并加入800ml纯水搅拌直至完全溶解,以滴加的方式使用4M盐酸调节pH至7.5后加入纯水定容到1L备用。
在1L实验室烧瓶中,加入3.25g 5’-鸟苷酸、1.08g六水氯化镁、1.44g一水氯化锰和3.06g多聚磷酸纳,加入400ml纯水并搅拌至完全溶解后,加入50ml的1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液并使用1M盐酸调节溶液当中的pH至7.5,最后加入纯水定容到500ml已完成反应溶液的配置。将载有反应溶液的烧瓶置于恒温水窝中,保持当中反应溶液温度为30-34摄氏度,同时在烧瓶的上方装有搅拌装置,反应溶液在50-100rpm的转速中旋转搅拌。首先进行第一步酶促反应,在该反应溶液中加入10ml多聚磷酸激酶类2上清液并推持在30-34摄氏度、pH 6.5和50-100rpm旋转搅拌的环境中进行120min的反应。当反应时间结束,以滴加的方式使用4M盐酸调节溶液pH至4.0停止此步酶促反应,维持搅拌15min后取样进行三磷酸鸟苷和二磷酸鸟苷的含量分析,结果如表1所示。
表1
从烧瓶中倒出反应溶液,使用0.22um滤膜过滤后倒入另一个1L烧瓶准备第二步酶促反应,加入1.34g 5’-肌苷酸和0.4g天冬氨酸,搅拌直至完全溶解后以4M NaOH溶液调节pH至6.5,维持该反应溶液在摄氏30-34度和50-100rpm下旋转搅拌,加入25ml腺苷酸琥珀酸合酶进行90min反应。当反应时间结束,以滴加的方式使用4M盐酸调节溶液pH至4.0停止此步酶促反应,维持搅拌15min后取样进行腺苷酸琥珀酸的含量分析,结果如表2所示。
表2
从烧瓶中倒出反应溶液,使用0.22um滤膜过滤后倒入另一个1L烧瓶准备第三步酶促反应,先以4M NaOH溶液调节pH至6.5,维持该反应溶液在摄氏30-34度和50-100rpm下旋转搅拌,加入15ml腺苷酸琥珀酸裂解酶进行60min反应。当反应时间结束,以滴加的方式使用4M盐酸调节溶液pH至4.0,维持搅拌15min后取样进行单磷酸腺苷的含量分析,结果如表3所示。
表3
从烧瓶中倒出反应溶液,使用0.22um滤膜过滤后倒入另一个1L烧瓶准备第四步酶促反应,先以4M NaOH溶液调节pH至6.5,维持该反应溶液在摄氏30-34度和50-100rpm下旋转搅拌,加入5ml多聚磷酸-AMP磷酸转移酶进行30min反应。当反应时间结束,以滴加的方式使用4M盐酸调节溶液pH至4.0,维持搅拌15min后取样进行二磷酸腺苷的含量分析,结果如表4所示。
表4
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从烧瓶中倒出反应溶液,使用0.22um滤膜过滤后倒入另一个1L烧瓶准备第五步酶促反应,先以4M NaOH溶液调节pH至6.5,维持该反应溶液在摄氏30-34度和50-100rpm下旋转搅拌,加入20ml腺苷酸激酶进行20min反应。当反应时间结束,以滴加的方式使用4M盐酸调节溶液pH至4.0,维持搅拌15min后取样进行三磷酸腺苷的含量分析,结果如表5所示。
表5
从烧瓶中倒出反应溶液,使用0.22um滤膜过滤后倒入另一个1L烧瓶准备第五步酶促反应,先以4M NaOH溶液调节pH至6.5,维持该反应溶液在摄氏30-34度和50-100rpm下旋转搅拌,加入20ml腺苷酸激酶和20ml多聚磷酸激酶类1进行20min反应。当反应时间结束,以滴加的方式使用4M盐酸调节溶液pH至4.0,维持搅拌15min后取样进行三磷酸腺苷的含量分析,结果如表6所示。
表6
酶促反应完成,反应溶液中得40.5mg三磷酸腺苷和34.4mg二磷酸腺苷。
实施例2:使用5’-鸟苷酸、5’-肌苷酸和天冬氨酸以有序实施的方式采用酶组中延胡索酸酶、腺苷酸激酶、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶和多聚磷酸激酶類2的酶上清液制备三磷酸腺苷和二磷酸腺苷
按上述的制备例获得腺苷酸激酶、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶和多聚磷酸激酶类2所属的酶上清液各100ml备用。配制1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液备用;配制方法为称重121g三羟甲基氨基甲烷并加入800ml纯水搅拌直至完全溶解,以滴加的方式使用4M盐酸调节pH至7.5后加入纯水定容到1L备用。
在1L实验室烧瓶中,加入3.25g 5’-鸟苷酸、1.08g六水氯化镁、1.44g一水氯化锰和6.12g多聚磷酸纳,加入400ml纯水并搅拌至完全溶解后,加入50ml的1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液并使用1M盐酸调节溶液当中的pH至6.5,最后加入纯水定容到500ml已完成反应溶液的配置。将载有反应溶液的烧瓶置于恒温水窝中,保持当中反应溶液温度为30-34摄氏度,同时在烧瓶的上方装有搅拌装置,反应溶液在50-100rpm的转速下旋转搅拌。首先进行第一步酶促反应,在该反应溶液中加入10ml多聚磷酸激酶类2上清液并推持在30-34摄氏度、pH 6.5和50-100rpm旋转搅拌的环境中进行120min的反应。当反应时间结束,以滴加的方式使用4M盐酸调节溶液pH至4.0停止此步酶促反应,维持搅拌15min后取样进行三磷酸鸟苷和二磷酸鸟苷的含量分析,结果如表7所示。
表7
从烧瓶中倒出反应溶液,使用0.22um滤膜过滤后倒入另一个1L烧瓶准备第二步酶促反应,加入1.34g 5’-肌苷酸和0.4g天冬氨酸,搅拌直至完全溶解后以4M NaOH溶液调节pH至6.5,维持该反应溶液在30-34摄氏度和50-100rpm旋转搅拌,加入25ml腺苷酸琥珀酸合酶进行90min反应。当反应时间结束,以滴加的方式使用4M盐酸调节溶液pH至4.0停止此步酶促反应,维持搅拌15min后取样进行腺苷酸琥珀酸的含量分析,结果如表8所示。
表8
从烧瓶中倒出反应溶液,使用0.22um滤膜过滤后倒入另一个1L烧瓶准备第三步酶促反应,先以4M NaOH溶液调节pH至6.5,维持该反应溶液在30-34摄氏度和50-100rpm旋转搅拌,分别加入15ml腺苷酸琥珀酸裂解酶和延胡索酸酶的上清液进行60min反应。当反应时间结束,以滴加的方式使用4M盐酸调节溶液pH至4.0,维持搅拌15min后取样进行单磷酸腺苷的含量分析,结果如表9所示。
表9
从烧瓶中倒出反应溶液,使用0.22um滤膜过滤后倒入另一个1L烧瓶准备第四步酶促反应,先以4M NaOH溶液调节pH至6.5,维持该反应溶液在30-34摄氏度和50-100rpm旋转搅拌,加入5ml多聚磷酸-AMP磷酸转移酶上清液进行30min反应。当反应时间结束,以滴加的方式使用4M盐酸调节溶液pH至4.0,维持搅拌15min后取样进行二磷酸腺苷的含量分析,结果如表10所示。
表10
从烧瓶中倒出反应溶液,使用0.22um滤膜过滤后倒入另一个1L烧瓶准备第五步酶促反应,先以4M NaOH溶液调节pH至6.5,维持该反应溶液在30-34摄氏度和50-100rpm旋转搅拌,加入20ml腺苷酸激酶进20min反应。当反应时间结束,以滴加的方式使用4M盐酸调节溶液pH至4.0,维持搅拌15min后取样进行三磷酸腺苷的含量分析,结果如表11所示。
表11
酶促反应完成,反应溶液中得74.1mg三磷酸腺苷和52mg二磷酸腺苷。由于该实施例的酶组中加入了延胡索酸酶,在第三步酶促反应中当腺苷酸琥珀酸裂解酶将腺苷酸琥珀酸转化合成到单磷酸腺苷和延胡索酸时,延胡索酸酶同时间使酶反应中的副产物延胡索酸转化合成至苹果酸,避免了副产物的含量在反应过程中的增生而所产生的产物抑制,促使酶促反应持续从而增加反应溶液中单磷酸腺苷的总量,从而相比实施例1进一步提升了三磷酸腺苷和二磷酸腺苷的总量。
实施例3:使用5’-鸟苷酸、5’-肌苷酸和天冬氨酸以有序实施的方式采用酶组中5’-核苷酸酶、延胡索酸酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶和多聚磷酸激酶类2的酶上清液制备腺苷
按上述的制备例分别获得5’-核苷酸酶、延胡索酸酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶和多聚磷酸激酶类2所属的酶上清液各100ml备用。配制1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液备用;配制方法为称重121g三羟甲基氨基甲烷并加入800ml纯水搅拌直至完全溶解,以滴加的方式使用4M盐酸调节pH至7.5后加入纯水定容到1L备用。
在1L实验室烧瓶中,加入3.25g 5’-鸟苷酸二钠、1.08g六水氯化镁、1.44g一水氯化锰和6.12g多聚磷酸纳,加入400ml纯水并搅拌至完全溶解后,加入50ml的1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液并使用1M盐酸调节溶液当中的pH至6.5,最后加入纯水定容到500ml已完成反应溶液的配置。将载有反应溶液的烧瓶置于恒温水窝中,保持当中反应溶液温度为30-34摄氏度,同时在烧瓶的上方装有搅拌装置,反应溶液在50-100rpm的转速中旋转搅拌。首先进行第一步酶促反应,在该反应溶液中加入10ml多聚磷酸激酶类2上清液并推持在30-34摄氏度、pH 6.5和50-100rpm旋转搅拌的环境中进行120min的反应。当反应时间结束,以滴加的方式使用4M盐酸调节溶液pH至4.0停止此步酶促反应,维持搅拌15min后取样进行三磷酸鸟苷和二磷酸鸟苷的含量分析,结果如表12所示。
表12
从烧瓶中倒出反应溶液,使用0.22um滤膜过滤后倒入另一个1L烧瓶准备第二步酶促反应,加入1.34g 5’-肌苷酸二钠和0.4g天冬氨酸,搅拌直至完全溶解后以4M NaOH溶液调节pH至6.5,维持该反应溶液在30-34摄氏度和50-100rpm旋转搅拌,加入25ml腺苷酸琥珀酸合酶进行90min反应。当反应时间结束,以滴加的方式使用4M盐酸调节溶液pH至4.0停止此步酶促反应,维持搅拌15min后取样进行腺苷酸琥珀酸的含量分析,结果如表13所示。
表13
从烧瓶中倒出反应溶液,使用0.22um滤膜过滤后倒入另一个1L烧瓶准备第三步酶促反应,先以4M NaOH溶液调节pH至6.5,维持该反应溶液在摄氏30-34度和50-100rpm旋转搅拌,分别加入15ml腺苷酸琥珀酸裂解酶和延胡索酸酶的上清液进行60min反应。当反应时间结束,以滴加的方式使用4M盐酸调节溶液pH至4.0,维持搅拌15min后取样进行单磷酸腺苷的含量分析,结果如表14所示。
表14
从烧瓶中倒出反应溶液,使用0.22um滤膜过滤后倒入另一个1L烧瓶准备第四步酶促反应,先以4M NaOH溶液调节pH至6.5,维持该反应溶液在30-34摄氏度和50-100rpm旋转搅拌,加入20ml 5'-核苷酸酶进行60min反应。当反应时间结束,以滴加的方式使用4M盐酸调节溶液pH至4.0,维持搅拌15min后取样进行腺苷的含量分析,结果如表15所示。
表15
酶促反应完成,反应溶液中得55.8mg腺苷。
实施例4:使用5’呈味核苷酸二钠和天冬氨酸以混合方式采用酶组中延胡索酸酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶和多聚磷酸激酶类2的酶上清液制备三磷酸腺苷和二磷酸腺苷
按上述的制备例分别获得延胡索酸酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶和多聚磷酸激酶类2所属的酶上清液各100ml备用并按下表16所示配制总容量100ml的混合酶组上清溶液。
表16
配制1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液备用;配制方法为称重121g三羟甲基氨基甲烷并加入800ml纯水搅拌直至完全溶解,以滴加的方式使用4M盐酸调节pH至6.5后加入纯水定容到1L备用。
在1L实验室烧瓶中,加入10g 5'味核苷酸二钠(包含5g 5’-鸟苷酸二钠和5g 5’-肌苷酸二钠)、1.08g六水氯化镁、1.44g一水氯化锰和6.12g多聚磷酸纳,加入400ml纯水并搅拌至完全溶解后,加入50ml的1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液并使用1M盐酸调节溶液当中的pH至7.5,最后加入纯水定容到500ml已完成反应溶液的配置。将载有反应溶液的烧瓶置于恒温水窝中,保持当中反应溶液温度为30-34摄氏度,同时在烧瓶的上方装有搅拌装置,反应溶液在50-100rpm的转速中旋转搅拌并加入100ml混合酶上清液进行反应,每30min取样进行三磷酸鸟苷和二磷酸鸟苷的含量分析直至120min时结束反应。当反应时间结束,滴加的方式使用4M盐酸调节溶液pH至4.0停止此步酶促反应。酶反应完成,共得145mg二磷酸腺苷和474mg三磷酸腺苷,如表17所示。
表17
以混合酶组中各种上清液的方式综合各步骤进行单步酶促反应在转化率和产能上比分别进行各步骤的方法更好。
实施例5:使用5’呈味核苷酸二钠和天冬氨酸以混合方式采用酶组中延胡索酸酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶和多聚磷酸激酶类2的固定化酶在固定化酶反应装置中制备二磷酸腺苷和三磷酸腺苷
按上述的制备例分别获得延胡索酸酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶和多聚磷酸激酶类2所属的酶上清液各400ml备用并按下表18所示配制总容量200ml的混合酶组上清溶液。根据中国专利No.CN1982445B的实施例3的方法,在固相载体上使用混合上清液制备混合固定化酶;载体的形状皆为条形:长32cm、宽5cm、厚5mm,下表为各固定化酶成品的重量为34.8g。
表18
将上述制得的固定化酶载体安装于固定化酶反应器中。该反应器为有机玻璃制成的圆柱体,高7cm、半径4.5cm。用刀将上述载体头尾端约3cm以斜度45°整齐削去,紧握卷成高5cm、半径4.5cm的均质圆柱体,重量为9.3g。将该圆柱体插入反应器中,使其松紧程度符合中国发明专利申请公开CN106032520A中松紧程度符合表1中所述的3级标准,并且使其侧壁与反应器的内壁之间不留空隙。完成安装后,按CN106032520A图1进行其它配备装置的安装程序,其中反应调控罐容量为2L;高流量水泵是可调节流量式吸水泵,流速为0.4L/分钟;酸碱度调控装置采用0.2M盐酸/氢氧化钠溶液进行pH调控,其加液流量为1ml/min。
在反应调控罐中按下述的次序加入10g 5’呈味核苷酸二钠(包含5g 5’-鸟苷酸二钠和5g 5’-肌苷酸二钠)、1.44g一水氯化锰和6.12g多聚磷酸纳,加入400ml纯水并搅拌至完全溶解后,加入50ml的1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液并使用1M盐酸调节溶液当中的pH至7.5,最后加入纯水定容到500ml已完成反应溶液的配置。反应溶液在反应调控罐中升温至35-37摄氏度后启动连接反应调控罐的高流量水泵,反应溶液以每1分钟一个柱体积的流速经过反应器与固定化酶进行酶促反应,每30min取样一次分析当中二磷酸腺苷和三磷酸腺苷的含量变化,经60min的反应后反应结束,反应溶液由反应调控罐排出即终止反应。重复上述步骤始进行第二批次反应,共进行三个批次反应。各批次如下表19所示。
表19
由于固定化酶中的酶量相比使用混合上清液为多,酶促反应的速度提升因而所需的反应时间有所减少,同样地,固定化酶组可以重复使用,降低了制备酶制剂在整项生产工艺中的成本,上述的优势都有利于酶组应用在酶法工业生产上。
实施例6:使用一水肌酸、5’呈味核苷酸二钠和天冬氨酸以混合方式采用肌酸激酶和酶组中延胡索酸酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶和多聚磷酸激酶类2的固定化酶在固定化酶反应装置中制备磷酸肌酸
肌酸激酶PCR引物序列设计根据中国专利申请公开号CN102808006所述的方法,提取小鼠骨骼肌总RNA,反转录制备cDNA,以小鼠骨骼肌cDNA为范本,以上述引物PCR扩增得到肌酸激酶基因,并连接至pGEX-2T(购自GE Healthcare,USA),得到pGEX-2T(+)-CK,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),获得肌酸激酶重组表达菌株。
将上述菌株挑选单一种落接种到4mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素),在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子,完成后按1%接种比例接到100mL LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素),在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子,完成后按1%接种比例接到60L LB培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM,发酵20小时结束。发酵液以12,500rpm离心10分钟,得到含肌酸激酶的大肠杆菌细胞1.41kg。将所得含肌酸激酶的大肠杆菌细胞配制成上清液,上清液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS100mM pH 7.5)打浆后,使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10,000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液,每1ml上清液中含0.2g细胞。根据中国专利申请公开号CN102808006的磷酸肌酸含量测定法对细胞进行酶活力检测,酶活性为约4.8umol/min/mg,使用上述方法制备400ml的肌酸激酶上清液。
与此同时,按上述的制备例分别获得延胡索酸酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶和多聚磷酸激酶类2所属的酶上清液各400ml备用并根据中国专利CN1982445B的实施例3的方法,在固相载体上按下表20的各组合中的上清液用量比例制备混合固定化酶;载体的形状皆为条形:长32cm、宽5cm、厚5mm,下表为各固定化酶成品的重量为34.8g。
表20
将上述制得的固定化酶载体安装于固定化酶反应器中。该反应器为有机玻璃制成的圆柱体,高7cm、半径4.5cm。用刀将上述载体头尾端约3cm以斜度45°整齐削去,紧握卷成高5cm、半径4.5cm的均质圆柱体,重量为9.35g。将该圆柱体插入反应器中,使其松紧程度符合中国发明专利申请公开CN106032520A中松紧程度符合其中所述的3级标准,并且使其侧壁与反应器的内壁之间不留空隙。完成安装后,按CN106032520A图1进行其它配备装置的安装程序,其中反应调控罐容量为2L;高流量水泵是可调节流量式吸水泵,流速为0.5L/分钟;酸碱度调控装置采用0.1M盐酸/氢氧化钠溶液进行pH调控,其加液泵的流量为每分钟1ml。
在反应调控罐中按下述的次序加入3g一水肌酸、10g 5'呈味核苷酸二钠(包含5g5’-鸟苷酸二钠和5g 5’-肌苷酸二钠)、1.44g一水氯化锰和6.12g多聚磷酸纳,并加入400ml纯水,启动外置搅拌装置至所有原材料完全溶解,加入50ml的1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液并使用1M盐酸调节溶液当中的pH至8.2-8.4,最后加入纯水定容至500ml已完成反应溶液的配置。反应溶液在反应调控罐中升温至35-37摄氏度后启动连接反应调控罐的高流量水泵,反应溶液以每1分钟一个柱体积的流速经过反应器与固定化酶进行酶促反应,每30min取样一次分析当中磷酸肌酸的含量,经60min的反应后反应结束,反应溶液由反应调控罐排出即终止反应。重复上述步骤始进行第二批次反应,共进行三个批次反应。各批次如表21所示。
表21
肌酸激酶是通过使用肌酸和三磷酸腺苷为反应底物,在辅助离子如镁、锰的帮助下,转化合成至磷酸肌酸和二磷酸腺苷。当肌酸激酶酶促反应中配合本发明的生物酶制剂同时使用时,由于本生物酶制剂在反应过程中由底物转化合成至三磷酸腺苷,加上生物酶制剂并同时将肌酸激酶的副产物二磷酸腺苷再生成三磷酸腺苷,因此酶促反应无需先投入三磷酸腺苷并同时提升产能。
实施例7:使用DL-蛋氨酸、5’呈味核苷酸二钠和天冬氨酸以混合方式采用S-腺苷甲硫氨酸合成酶和酶组中延胡索酸酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶和多聚磷酸激酶类2的固定化酶在固定化酶反应装置中制备S-腺苷甲硫氨酸
S-腺苷甲硫氨酸PCR引物序列设计根据中国专利申请公开号CN101134948B所述,以M.Jannaschii ATCC 43067(ATCC,USA)DNA为底物进行PCR,利用限制性内切酶PacI和AscI处理PCR产物并将其连接至pGEMT-EASY(Promega,USA)中,得到pGEMT-SAM。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中,得到表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶的菌株。将含pGEMT-SAM的菌株接种于5ml LB培养基(含50mg/L氨芐青霉素)中培养16小时作为初级种子液,完成后按1%的数量比接种至100ml LB培养基(含50mg/L氨芐青霉素)中作为二级种子。在37℃、200rpm的条件下培养10小时,最后,二级种子再以1%的量接种至含60L LB培养基(含100ug/ml氨芐青霉素)的100L发酵罐中。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7、发酵40小时。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟,得到表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶的大肠杆菌细胞共1.28kg。将所得含S-腺苷甲硫氨酸合成酶的大肠杆菌细胞配制成上清液,上清液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS 100mM pH 7.5)打浆后,使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10,000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液,每1ml上清液中含0.2g细胞。根据中国专利申请公开号CN101134948B的S-腺苷甲硫氨酸含量测定法对细胞进行酶活力检测,酶活性为约6.3umol/min/mg,使用上述方法制备400ml的S-腺苷甲硫氨酸合成酶上清液。同时按制备例制备延胡索酸酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶和多聚磷酸激酶類2所属的酶上清液各400ml备用并根据中国专利CN1982445B的实施例3的方法,在固相载体上按下表22的各组合中的上清液用量比例制备混合固定化酶;载体的形状皆为条形:长32cm、宽5cm、厚5mm,下表为各固定化酶成品的重量为37.2g。
表22
在反应调控罐中按下述的次序加入3.7g蛋氨酸、20g 5'呈味核苷酸二钠(包含10g5’-鸟苷酸二钠和10g 5’-肌苷酸二钠)、2.88g一水氯化锰和12.24g多聚磷酸纳,并加入400ml纯水,启动外置搅拌装置至所有原材料完全溶解,加入50ml的1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液并使用1M盐酸调节溶液当中的pH至6.5-7.2,最后加入纯水定容到500ml已完成反应溶液的配置。反应溶液在反应调控罐中升温至35-37摄氏度后启动连接反应调控罐的高流量水泵,反应溶液以每1分钟一个柱体积的流速经过反应器与固定化酶进行酶促反应,每30min取样一次分析当中S-腺苷甲硫氨的含量,经120min的反应后反应结束,反应溶液由反应调控罐排出即终止反应。重复上述步骤始进行第二批次反应,共进行三个批次反应。各批次反应如表23所示。
表23
S-腺苷甲硫氨酸合成酶的酶促反应是通过使用DL-蛋氨酸和三磷酸腺苷为底物,在辅助离子的帮助下,三磷酸腺苷和蛋氨酸转化合成为S-腺苷甲硫氨酸。当S-腺苷甲硫氨酸合成酶酶促反应中配合本发明的生物酶制剂同时使用时,由于本生物酶制剂在反应过程中由底物转化合成至三磷酸腺苷,因此酶促反应在没有投入三磷酸腺苷下仍能生产S-腺苷甲硫氨酸。
实施例8:使用烟酰胺单核苷酸、5’呈味核苷酸二钠和天冬氨酸以混合方式采用烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和酶组中延胡索酸酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶和多聚磷酸激酶类2的固定化酶在固定化酶反应装置中制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
根据中国专利CN101134948B所述,以M.Jannaschii ATCC 43067(ATCC,USA)DNA为底物进行PCR,利用限制性内切酶PacI和AscI处理PCR产物并将其连接至pGEMT-EASY(Promega,USA)中,得到pGEMT-NMNAT。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中,得到表达烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的菌株。将含有pGEMT-NMNAT的菌株接种于5ml LB培养基(含50mg/L氨芐青霉素)中培养16小时作为初级种子液,完成后按1%的数量比接种至100ml LB培养基(含50mg/L氨芐青霉素)中作为二级种子。在37℃、200rpm的条件下培养10小时,最后,二级种子再以1%的量接种至含60L LB培养基(含100ug/ml氨芐青霉素)的100L发酵罐中。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7、发酵40小时。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟,得到表达烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的大肠杆菌细胞共1.42kg。将所得含烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的大肠杆菌细胞配制成上清液,上清液的配制方法为每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS100mM pH 7.5)打浆后,使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液并以管式离心机在10,000rpm和100L/hr的设定下进行离心取上清液,每1ml上清液中含0.2g细胞。根据其酶促反应对细胞进行酶活力检测,该方法为在1ml的反应溶液(100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液pH 7.5,10mM烟酰胺单核苷酸,5mM三磷酸腺苷二钠盐,20mM六水氯化镁)中加入含有1mg总蛋白量的上清液,在37摄氏度的温控下进行5分钟反应,完成后以附件4的高效液相色谱对样本中在酶促反应中所产生的进行烟酰胺腺嘌呤二核苷酸含量分析。根据上述方法本上清液的酶活为约1.57umol/min/mg,使用上述方法制备400ml的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶上清液。同时按上述的制备例分别获得延胡索酸酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶和多聚磷酸激酶类2所属的酶上清液各400ml备用并根据中国专利CN1982445B的实施例3的方法,在固相载体上按下表24的各组合中的上清液用量比例制备混合固定化酶;载体的形状皆为条形:长36cm、宽5cm、厚5mm,下表为各固定化酶成品的重量为42.2g。
表24
在反应调控罐中按下述的次序加入3.3g烟酰胺单核苷酸、20g 5'呈味核苷酸二钠(当中包含10g 5’鸟苷酸二钠和10g 5’-肌苷酸二钠)、2.88g一水氯化锰和12.24g多聚磷酸纳,并加入400ml纯水,启动外置搅拌装置至所有原材料完全溶解,加入50ml的1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液并使用1M盐酸调节溶液当中的pH至6.5-7.2,最后加入纯水定容到500ml已完成反应溶液的配置。反应溶液在反应调控罐中升温至30-34摄氏度后启动连接反应调控罐的高流量水泵,反应溶液以每1分钟一个柱体积的流速经过反应器与固定化酶进行酶促反应,每30min取样一次分析当中S-腺苷甲硫氨的含量,经120min的反应后反应结束,反应溶液由反应调控罐排出即终止反应。重复上述步骤始进行第二批次反应,共进行三个批次反应。各批次反应如下表25所示。
表25
烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的酶促反应是通过使用β-烟酰胺单核苷酸和三磷酸腺苷为底物,在辅助离子的帮助下,β-烟酰胺单核苷酸和三磷酸腺苷转化合成为β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。当烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶酶促反应中配合本发明的生物酶制剂同时使用时,由于生物酶制剂在反应过程中由底物转化合成至三磷酸腺苷,因此酶促反应在没有投入三磷酸腺苷下仍能生产β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
对比例1:使用DL-蛋氨酸和三磷酸腺苷以混合方式采用S-腺苷甲硫氨酸合成酶和ATP再生酶组的固定化酶在固定化酶反应装置中制备S-腺苷甲硫氨酸
按实施例7的方法制备400ml S-腺苷甲硫氨酸合成酶酶上清液,并按制备例1-3的方法制备各400ml的腺苷酸激酶、多聚磷酸激酶和多聚磷酸:AMP转移酶,并根据中国专利CN1982445B的实施例3的方法,在固相载体上按下表26的各组合中的上清液用量比例制备混合固定化酶;载体的形状皆为条形:长42cm、宽5cm、厚5mm,下表为各固定化酶成品的重量为45.7g。
表26
在反应调控罐中按下述的次序加入0.31g三磷酸腺苷二钠、3.7g DL-蛋氨酸、2.88g一水氯化锰和12.24g多聚磷酸纳,并加入400ml纯水,启动外置搅拌装置至所有原材料完全溶解,加入50ml的1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液并使用1M盐酸调节溶液当中的pH至7.5-8,最后加入纯水定容到500ml已完成反应溶液的配置。反应溶液在反应调控罐中升温至摄氏30-34度后启动连接反应调控罐的高流量水泵,反应溶液以每1分钟一个柱体积的流速经过反应器与固定化酶进行酶促反应,每30min取样一次分析当中S-腺苷甲硫氨的含量,经120min的反应后反应结束,反应溶液由反应调控罐排出即终止反应。重复上述步骤始进行第二批次反应,共进行三个批次反应。各批次反应如下表27所示。
表27
由于S-腺苷甲硫氨酸合成酶的酶促反应中的反应副产物为二磷酸和单磷酸,在缺乏了AMP和/或ADP的情况下ATP酶再生组合无法运作,因此在使用S-腺苷甲硫氨酸合成酶为酶促反应制备S-腺苷甲硫氨酸上会受到了基础性限制,即S-腺苷甲硫氨酸的生产摩尔量绝不能超越所投入三磷酸腺苷的底物摩尔量,亦因此S-腺苷甲硫氨酸酶促反应在缺少了本发明的生物酶制剂下,S-腺苷甲硫氨酸的产量只能依附在三磷酸腺苷的投放量上,而且在没有投入三磷酸腺苷的情况下,S-腺苷甲硫氨酸酶促反应是无法启动。
对比例2:使用DL-蛋氨酸以混合方式运用S-腺苷甲硫氨酸合成酶、腺苷激酶和ATP再生酶组的固定化酶在固定化酶反应装置中制备S-腺苷甲硫氨酸
按中国发明专利申请公开号CN109136311A实施例1制备腺苷激酶(AK),由于实施例1说明该酶可以商购获得,或者是经过人工改造获得的具有同样催化功能的酶,因此腺苷激酶的制备方法根据国际专利申请号WO2020248855A1中例3的方法进行制备得400mL腺苷酸激酶上清液。按实施例7的方法制备400ml S-腺苷甲硫氨酸合成酶酶上清液,并按制备例1-3的方法获得各400ml的腺苷酸激酶、多聚磷酸激酶和多聚磷酸:AMP转移酶,并根据中国专利CN1982445B的实施例3的方法,在固相载体上按下表28的各组合中的上清液用量比例制备混合固定化酶;载体的形状皆为条形:长48cm、宽5cm、厚5mm,下表为各固定化酶成品的重量为49.2g。
表28
按中国发明专利申请号CN109136311A实施例3中的制备方法进行酶促反应,底物的投放量根据总容量500mL按比例调整,在反应罐中加入物12.5g DL-蛋氨酸、17.5g腺苷、12.5g多聚磷酸纳、1.85g氯化钾、5g六水氯化镁、1.5g一水氯化锰和2.15g磷酸氢二钠的溶液,并加入400ml纯水,启动外置搅拌装置至所有原材料完全溶解,按中国发明专利申请号CN109136311A实施例3中的反应条件使用1M盐酸调节溶液当中的pH至8,最后加入纯水定容到500ml已完成反应溶液的配置。反应溶液在反应调控罐中升温至37摄氏度后启动连接反应调控罐的高流量水泵,反应溶液以每1分钟一个柱体积的流速经过反应器与固定化酶进行酶促反应,每30min取样一次分析当中S-腺苷甲硫氨的含量,经120min的反应后反应结束。结果如表29所示
表29
由于反应底物中缺少了三磷酸腺苷,酶促反应无法启动;排出反应溶液,并按上述的制备反应方法重配一次并添加0.31g三磷酸腺苷二钠,按上述的反应条件进行反应。结果如表30所示。
表30
加入三磷酸腺苷二钠以后,S-腺苷甲硫氨酸的酶促反应开始启动,同时反应溶液中的AMP含量在提升,可是由于S-腺苷甲硫氨酸合成酶的反应副产物为二磷酸和单磷酸而非AMP或ADP,ATP再生酶组合仍然无法运作,虽然一部分的ATP生成来自腺苷酸激酶所转化合成的AMP途径而催生,但当ATP被S-腺苷甲硫氨酸合成酶用作为底物时便不能再重用,在这情况为前提下,酶促反应中的ATP总量会逐步下降,在缺乏ATP的情况下,S-腺苷甲硫氨酸合成酶、腺苷酸激酶和ATP再生组合都同时无法运作,导致整个反应体系无法有效地生产S-腺苷甲硫氨酸,更未能实现使用腺苷激酶和腺苷酸激酶的作用。
由于S-腺苷甲硫氨酸合成酶的酶促反应中的反应副产物为二磷酸和单磷酸,在缺乏了AMP和/或ADP的情况下酶组合中的ATP再生酶组合无法运作,因此在使用S-腺苷甲硫氨酸合成酶为酶促反应制备S-腺苷甲硫氨酸上会受到了基础性限制,即S-腺苷甲硫氨酸的生产摩尔量绝不能超越所投入三磷酸腺苷的底物摩尔量,亦因此S-腺苷甲硫氨酸酶促反应在缺少了本专利发明所提出的酶法组合下,S-腺苷甲硫氨酸的产量只能依附在三磷酸腺苷的投放量上,而且在没有投入三磷酸腺苷的情况下,S-腺苷甲硫氨酸酶促反应是无法启动。
序列表
<110> 百瑞全球有限公司(BioRight Worldwide Company Limited)
<120> 制备核糖核苷或其衍生物的方法、生物酶制剂及其应用
<130> FI-216024-59:53
<160> 24
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tttttatttc tgcgtaaacc cccagaaggg ctagggaaac aaaagctacc ttcctttcca 480
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atagacagag tgaacatctg tacagcttgt gaattagacg gtaaagaaat tactgagtac 1080
ccagcaaact tagatcaatt aaaacgttgt aaaccaatct tggaagagat gtcatgttgt 1140
acagaaaacg taacaaatgt gcgtacttta gaagaattac ctgaaaatgc acgtaaatat 1200
ttagagcgta tttcagaatt atgtaatgta caaatttcta tcttctcagt tggtccagat 1260
agagaacaaa caaacctatt aaaagaattg tggtaggaat tccgcata 1308
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ctgaccggat ccatggaatt atcctcactg accgcc 36
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accgcgcgcg atgaagtgat cctgccttac tggcgtcaga tgattaacgc ggttaaagat 480
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cagctcaacc aggtggagat cctcggtaat attaacggcg ccgttggcaa ctataacgcg 660
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ctggccgacg caaccgtcgt gcgtgacctg ggtgtcggca tcggctatgc gcttatcgct 1080
tatcagtcca ccctgaaggg cgtcagcaag ctggaagtaa accgcgatca tctgcttgac 1140
gaactggatc acaattgtga tgttttatcc gaaccgatcc agaccgtcat gcgccgctat 1200
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gaaggaatga tacagtttat tgatagtctg gccctgccgc aagcagacac aacgcgcctt 1320
aaagccatga cgccggcaaa ttatatcggt cgcgctgtga ctctggtcga cgaacttaaa 1380
taagaattcc gcata 1395
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aaactatagg aattccgcat a 1281

Claims (20)

1.一种制备核糖核苷或其衍生物的方法,其特征在于包括下列步骤:在生物酶制剂的存在下将一种或多种底物分别、依次或者同时进行酶促反应,其中所述底物包含一种或多种的具有氧化含氮芳香杂环基团的核糖核苷酸或其盐、以及生糖氨基酸或其盐。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述的核糖核苷或其衍生物选自磷酸化的核糖核苷或其盐,
任选地,所述磷酸化的核糖核苷或其盐选自单磷酸胞苷或其盐、二磷酸胞苷或其盐、三磷酸胞苷或其盐、单磷酸尿苷或其盐、二磷酸尿苷或其盐、三磷酸尿苷或其盐、单磷酸胸苷或其盐、二磷酸胸苷或其盐、三磷酸胸苷或其盐、单磷酸肌苷或其盐、二磷酸肌苷或其盐、三磷酸肌苷或其盐、单磷酸鸟苷或其盐、二磷酸鸟苷或其盐、三磷酸鸟苷或其盐、单磷酸腺苷或其盐、二磷酸腺苷或其盐、三磷酸腺苷或其盐的至少一者,优选为单磷酸肌苷或其盐、二磷酸肌苷或其盐、三磷酸肌苷或其盐、单磷酸鸟苷或其盐、二磷酸鸟苷或其盐、三磷酸鸟苷或其盐、单磷酸腺苷或其盐、二磷酸腺苷或其盐、三磷酸腺苷或其盐的至少一者,更优选为单磷酸腺苷或其盐、二磷酸腺苷或其盐、三磷酸腺苷或其盐的至少一者。
3.根据权利要求1-2中任意一项所述的方法和应用,其中所述的生物酶制剂为单一的生物酶制剂或者包含两种以上的生物酶的混合生物酶制剂;
任选地,所述生物酶制剂选自腺苷酸琥珀酸合酶(EC6.3.4.4)、腺苷酸琥珀酸裂解酶(EC4.3.2.2)、延胡索酸酶(EC 4.2.1.2)、5’-核苷酸酶(EC 3.1.3.5)、马来酸异构酶以及ATP生产酶中的至少一者;
任选地,所述ATP生产酶选自多聚磷酸激酶、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶(EC 2.7.4.33)、腺苷酸激酶(EC 2.7.4.3)中的至少一者;以及
任选地,所述多聚磷酸激酶包含多聚磷酸激酶类1(EC 2.7.4.1)和多聚磷酸激酶类2(EC 2.7.4.1)中的至少一者。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法,其特征在于所述底物还包含磷酸供体,
任选地,所述生糖氨基酸或其盐选自甘氨酸或其盐、丝氨酸或其盐、缬氨酸或其盐、组氨酸或其盐、精氨酸或其盐、丙氨酸或其盐、谷氨酸或其盐、谷氨酰胺或其盐、蛋氨酸或其盐、天冬氨酸或其盐、天冬酰胺或其盐、脯氨酸或其盐、羟脯氨酸或其盐、半胱氨酸或其盐的至少一者,优选为天冬氨酸或其盐、半胱氨酸或其盐和天冬酰胺或其盐的至少一者,更优选为天冬氨酸或其盐,
任选地,所述磷酸供体选自多聚磷酸或其盐。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法,其特征在于
所述氧化含氮芳香杂环基团选自嘧啶酮基团或者嘌呤酮基团,
任选地,所述具有氧化含氮芳香杂环基团的核糖核苷酸包含一个或多个磷酸基团、核糖基团以及嘌呤酮基团或者嘧啶酮基团;
任选地,所述底物还包含核糖核苷酸的琥珀酸衍生物,核糖核苷酸的琥珀酸衍生物包含一个或多个磷酸基团、核糖基团、嘌呤基团以及与嘌呤基团直接连接的琥珀酸基团,优选为腺苷酸琥珀酸;
任选地,所述嘧啶酮基团选自胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶中的至少一者;
任选地,所述嘌呤酮基团选自黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤中的至少一者;以及
优选地,所述一种或多种具有氧化含氮芳香杂环基团的核糖核苷酸或其盐选自呈味核苷酸或其盐、二磷酸腺苷或其盐、单磷酸腺苷或其盐、腺苷酸琥珀酸或其盐、三磷酸鸟苷或其盐、单磷酸肌苷酸或其盐、二磷酸鸟苷或其盐、单磷酸鸟苷或其盐中的至少一者。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法,其特征在于所述酶促反应包括使用腺苷酸激酶、多聚磷酸激酶类1和多聚磷酸激酶类2的至少一者以包含二磷酸腺苷或其盐和多聚磷酸或其盐的底物合成三磷酸腺苷或其盐。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法,其特征在于所述酶促反应包括多个步骤或者单一步骤。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法,其特征在于所述酶促反应包括下列中的至少一者:
(1)使用多聚磷酸激酶以包含单磷酸鸟苷或其盐和多聚磷酸或其盐的底物进行酶促反应;
(2)使用腺苷酸琥珀酸合酶以包含三磷酸鸟苷或其盐、单磷酸肌苷酸或其盐和天冬氨酸或其盐的底物进行酶促反应;
(3)使用腺苷酸琥珀酸裂解酶以包含腺苷酸琥珀酸或其盐的底物进行酶促反应;以及
(4)使用多聚磷酸-AMP磷酸转移酶、多聚磷酸激酶类1和多聚磷酸激酶类2的至少一者以包含单磷酸腺苷或其盐和多聚磷酸的底物进行酶促反应。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于所述酶促反应还包括下列中的至少一者:
(5)使用延胡索酸酶以包含延胡索酸的底物进行酶促反应;
(6)在酶促反应(4)后使用5’核苷酸酶以包含单磷酸腺苷的底物进行酶促反应。
10.根据权利要求9所述的方法,特征在于所述酶促反应包括依序进行酶促反应(1)、酶促反应(2)、酶促反应(3)和酶促反应(4),任选地在酶促反应(3)之前进行酶促反应(5)以及任选地在在酶促反应(4)之后进行酶促反应(5),
或者所述酶促反应包括同时进行酶促反应(1)、酶促反应(2)、酶促反应(3)、酶促反应(4)、任选的酶促反应(5)和任选的酶促反应(6)。
11.根据权利要求8所述的方法,特征在于所述方法包括依序进行下列步骤:
1)加入多聚磷酸激酶类2并加入单磷酸鸟苷或其盐和多聚磷酸或其盐为底物进行酶促反应将底物转化合成为二磷酸鸟苷或其盐和三磷酸鸟苷或其盐;
2)加入腺苷酸琥珀酸合酶,并加入单磷酸肌苷酸或其盐和天冬氨酸或其盐将三磷酸鸟苷或其盐转化为腺苷酸琥珀酸或其盐、二磷酸鸟苷或其盐和磷酸或其盐;
3)加入腺苷酸琥珀酸裂解酶将腺苷酸琥珀酸或其盐为底物转化为延胡索酸或其盐和单磷酸腺苷或其盐;
4)加入多聚磷酸-AMP磷酸转移酶和多聚磷酸或其盐进行酶促反应以将单磷酸腺苷或其盐转化为二磷酸腺苷或其盐和聚磷酸或其盐;
5)加入腺苷酸激酶,多聚磷酸激酶类1和多聚磷酸激酶类2的至少一者将二磷酸腺苷或其盐转化合成为三磷酸腺苷或其盐、二磷酸腺苷或其盐和单磷酸腺苷或其盐。
12.根据权利要求11所述的方法,特征在于所述方法还包括进行下列步骤:
6)在步骤3)后加入多聚磷酸激酶类2并且与包含多聚磷酸的底物进行酶促反应将底物转化为三磷酸腺苷和二磷酸腺苷。
13.根据权利要求11所述的方法,特征在于所述方法还包括下列步骤:
7)在步骤3)后加入5’-核苷酸酶将单磷酸腺苷为底物在酶促反应中转化为腺苷。
14.根据权利要求7所述的方法,其特征在于所述单一步骤包括使用包含腺苷酸激酶、多聚磷酸激酶类1、多聚磷酸激酶类2和多聚磷酸-AMP磷酸转移酶中的至少一者、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、任选的胡索酸酶以及任选的5’-核苷酸酶的生物酶制剂将包含单磷酸鸟苷或其盐、磷酸供体、单磷酸肌苷酸或其盐和天冬氨酸或其盐的底物一步转化为三磷酸腺苷或其衍生物。
15.一种用于权利要求1到14中任意一项方法的生物酶制剂,包含:
腺苷酸激酶、多聚磷酸激酶类1、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、多聚磷酸激酶类2、胡索酸酶、马来酸异构酶和5’-核苷酸酶,其中腺苷酸激酶、多聚磷酸激酶類1、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、多聚磷酸激酶類2、胡索酸酶、马来酸异构酶和5’-核苷酸酶的摩尔比为:(0.01-9):(0.01-9):(0.01-9):(0.01-9):(0.01-9):(0.01-9):(0-9):(0-9):(0-9);或者
腺苷酸激酶、多聚磷酸激酶类1、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、多聚磷酸激酶类2、胡索酸酶、马来酸异构酶和5’-核苷酸酶,其中腺苷酸激酶、多聚磷酸激酶类1、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、多聚磷酸激酶類2、胡索酸酶、马来酸异构酶和5’-核苷酸酶的摩尔比为(0.01-8):(0.01-8):(0.01-8):(0.01-8):(0.01-8):(0-8):(0-8):(0-8);或者
多聚磷酸激酶类1、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、多聚磷酸激酶类2、胡索酸酶、马来酸异构酶和5’-核苷酸酶,其中多聚磷酸激酶类1、多聚磷酸-AMP磷酸转移酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、多聚磷酸激酶类2、胡索酸酶、马来酸异构酶和5’-核苷酸酶的摩尔比为(0.01-8):(0.01-8):(0.01-8):(0.01-8):(0.01-8):(0-8):(0-8):(0-8);或者
多聚磷酸激酶类2、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、胡索酸酶、马来酸异构酶和5’-核苷酸酶,其中多聚磷酸激酶类2、腺苷酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸合酶、胡索酸酶、马来酸异构酶和5’-核苷酸酶的摩尔比为(0.01-6):(0.01-6):(0.01-6):(0-6):(0-6):(0-6)。
16.一种使用核糖核苷或其衍生物为底物进行磷酸化或磷酸转移以制备生物产物的方法,包括进行权利要求1-14中任意一项的方法。
17.根据权利要求16的方法,其特征在于所述核糖核苷或其衍生物选自腺苷、单磷酸胞苷或其盐、二磷酸胞苷或其盐、三磷酸胞苷或其盐、单磷酸尿苷或其盐、二磷酸尿苷或其盐、三磷酸尿苷或其盐、单磷酸胸苷或其盐、二磷酸胸苷或其盐、三磷酸胸苷或其盐、单磷酸肌苷或其盐、二磷酸肌苷或其盐、三磷酸肌苷或其盐、单磷酸鸟苷或其盐、二磷酸鸟苷或其盐、三磷酸鸟苷或其盐、单磷酸腺苷或其盐、二磷酸腺苷或其盐、三磷酸腺苷或其盐的至少一者,优选为单磷酸肌苷或其盐、二磷酸肌苷或其盐、三磷酸肌苷或其盐、单磷酸鸟苷或其盐、二磷酸鸟苷或其盐、三磷酸鸟苷或其盐、单磷酸腺苷或其盐、二磷酸腺苷或其盐、三磷酸腺苷或其盐的至少一者,更优选为单磷酸腺苷或其盐、二磷酸腺苷或其盐、三磷酸腺苷或其盐以及腺苷的至少一者,
任选地,所述生物产物选自磷酸肌酸、谷胱甘肽、S-腺苷甲硫氨酸、辅酶A和β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中的至少一者。
18.根据权利要求16-17中任意一项所述的方法,其特征在于还包括在所述生物酶制剂中加入S-腺苷甲硫氨酸合成酶、肌酸激酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶、脱磷酸辅酶A激酶中的至少一者。
19.根据权利要求16所述的方法,其特征在于所述酶促反应选自氧化还原酶系、荧光素酶系、固氮酶系、转移酶系、合酶系、激酶系、连接酶系、脱氧核糖核酸酶系、螯合酶系、羧化酶系、拓撲異構酶系、表异构酶系、消旋酶系、环化酶系、脱氨酶系、蛋白酶系和转运蛋白类中的至少一者。
20.一种制备核糖核苷或其衍生物的方法,其特征在于包括下列步骤:在生物酶制剂的存在下将一种或多种底物分别、依次或者同时进行酶促反应,其中所述底物包含一种或多种的核糖核苷酸的琥珀酸衍生物、任选的一种或多种具有氧化含氮芳香杂环基团的核糖核苷酸或其盐、任选的生糖氨基酸或其盐、以及任选的磷酸供体。
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