CN113755416A - 具有新合成路径生产β-胸苷的重组微生物及生产β-胸苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种生产β‑胸苷的重组微生物，以及利用重组微生物通过新合成路径生产β‑胸苷。利用引入的外源基因，该合成路径从dCTP开始，通过脱氧胞苷三磷酸核苷酸酶产生dCMP，dCMP在脱氧胞苷一磷酸的催化下产生脱氧尿苷，后者经过重组微生物自身的磷酸激酶合成dUMP后参与到β‑胸苷的生产，开发了新的合成路径并提高胸苷产量，具有极大的创新性和市场应用前景。

Description

具有新合成路径生产β-胸苷的重组微生物及生产β-胸苷的 方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种生产β-胸苷的重组微生物，以及利用重组微生物通过新合成路径生产β-胸苷。

背景技术

胸苷，又名为β-胸苷、2’-脱氧胸苷或β-胸腺嘧啶核苷，分子式为C₁₀H₁₄N₂O₅，分子量为242.23。胸苷是白色针状结晶性粉末，溶于水、甲醇、热乙醇、热丙酮、热乙酸乙酯、吡啶和冰乙酸，微溶于热氯仿。

胸苷是抗艾滋病药物齐多夫定(zidovudine，AZT)、司他夫定(stavudine，d4T)的重要前体物质，在抗病毒、抗肿瘤方面起到了不可替代的作用。齐多夫定和司他夫定是目前抗艾滋药品中最基本的组合成份，也是国内外广泛使用的抗艾滋病药物之一，齐多夫定是一种核酸逆转录酶抑制剂，在体外对逆转病毒包括HIV人免疫缺陷病毒具有高度活性，可在受病毒感染的细胞内被磷酸化形成活性胸苷三磷酸，而后者对HIV逆转酶有高亲合力，能选择性抑制HIV逆转酶活性，导致HIV链合成终止从而阻止HIV的复制。

目前胸苷的生产方法主要有四种：化学合成法，DNA降解法，酶法和生物发酵法。利用化学合成法来合成胸苷有多种途径，如利用2’-脱氧尿苷、吡咯烷和甲醛回流得到一个Mannich碱，随后Mannich碱与4-甲基苯硫酚进行缩合，最后用Raney镍还原脱硫得到胸苷，专利CN1634959A中公开了以D-核糖为原料，先与胸腺嘧啶直接进行缩合，再与丙酰氯进行卤代-酰基化反应，经催化氢化还原与催化醇解反应转化为β-胸苷，但是利用化学合成法合成的胸苷其糖苷键缺乏立体专一性，原料不易得到，且胸苷收率非常低；DNA降解法主要是利用酶水解DNA，水解液中得到四种核苷酸，再脱磷得到核苷，最后通过色谱分离方法得到胸苷，但是这种方法得到的脱磷产物中不仅有目的产物胸苷，还有胞苷、腺苷、尿苷和肌苷，不仅得率低，而且后续分离成本昂贵；酶法是以胸腺嘧啶碱基和2’-脱氧核苷为原料，以菌体或酶为催化介质，催化得到胸苷，虽然酶法具有专一性强、原料易得、反应时间短等优点，但是同样存在产量低的问题。

生物发酵法生产胸苷，主要是利用微生物菌株的生物合成途径来生产胸苷，其优势在于以糖质为原料生产核苷酸类物质，符合食用习惯，生产成本低、效益高，特别是目前基因工程育种技术及高产优化控制技术的采用，使发酵法生产成本大大降低，利用代谢工程和基因工程方法改造菌株，使其生产对人类有利产品的技术越来越成熟，优势更为明显。

如专利US 5 213 972中公开了一种生产嘧啶脱氧核糖核苷(PdN)的方法，通过基因敲除手段去除了降解和利用胸苷的酶(胸苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶)的编码基因，同时表达来源芽孢杆菌噬菌体PBS1的脱氧胸苷酸磷酸水解酶(dTMPase)使得胸苷积累；专利EP1190064B1、US 6 777 209、US7387893中公开了在产胸苷的大肠杆菌宿主中表达T4噬菌体来源的核糖二磷酸还原酶(NrdA、NrdB)和硫氧还蛋白(NrdC)可以显著提高胸苷产量，这是由于大肠杆菌自身的核苷二磷酸还原酶对于UDP的Km高于CDP约10倍，而T4噬菌体来源的核苷二磷酸还原酶针对底物UDP和CDP的Km值仅两倍差异，这使得胸苷可以通过两条途径合成dUTP，继而提高产量；另外，专利中将T4噬菌体来源的nrdA基因编码蛋白中第79位点丙氨酸突变为异亮氨酸，显示胸苷产量可提高25％，同时过表达大肠杆菌自身的尿苷/胞苷激酶(Udk)、dCTP脱氨酶(Dcd)可以有效提高胸苷产量；专利CN 101379185A、US 8 263 384、US2009 0 081 735中公开了在大肠杆菌嘧啶合成代谢路径中，通过提高dUMP转化为dTMP所需单碳单位的供给，包括过表达T4噬菌体来源的二氢叶酸还原酶基因frd、丝氨酸羟甲基转移酶基因glyA、3-磷酸甘油酸脱氢酶基因serA和THF合酶基因ADE3，使胸苷生物合成途径以消耗UdR为代价优先地合成TdR，从而生产出高纯度低脱氧尿苷的胸苷产品；现有的专利中公开的生产β-胸苷的生物发酵法中，都是从两条路径对胸苷进行基因修饰改造达到提高产量的目的，第一条是由UDP经核苷二磷酸还原酶催化至dUDP，dUDP再被进一步磷酸化生成dUTP；第二条则是通过UDP转化到UTP、CTP、CDP后，再经核苷二磷酸还原酶催化CDP生成dCDP，经由核苷二磷酸激酶(Ndk/Adk)、dCTP脱氨酶(Dcd)共同作用转化至dUTP，dUTP最终由脱氧核苷酸三磷酸酶(Dut)磷酸化生成dUMP，进而合成胸苷。

以上两条合成胸苷的路径中，80％经由第二条路径进行胸苷的合成，中间代谢产物dCTP流向单一，代谢速率慢，限制了上游代谢导致胸苷的合成受限。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种具有新合成路径生产β-胸苷的重组微生物，以及利用该重组微生物新的代谢路径用于合成胸苷的方法。

以大肠杆菌为例，首先，我们在胸苷的生产菌株中引入脱氧胞苷三磷酸(dCTP)核苷酸酶基因，例如人类来源的DCTPP1(Q9H773)、小鼠来源的RS21-C6(NW_011887301.1)可以水解脱氧胞苷三磷酸至脱氧胞苷一磷酸(dCMP)；进而，我们将T4噬菌体来源的dCMP脱氨酶(CD T4)基因应用到大肠杆菌中，从而激活dCMP脱氨酶，将代谢产生的dCMP直接经dCMP脱氨酶脱氨至脱氧尿苷一磷酸(dUMP)，缩短代谢流路，加快dUMP合成速率，推动整个代谢更多的合成胸苷；另外地路径，通过引入dCMP磷酸水解酶基因，如大肠杆菌来源的YfbR(ECK2285)、yfdR(EC 3.1.3.89)，它们可以水解dCMP至脱氧胞苷，从而推动整个代谢过程朝着利于胸苷合成的方向进行。

因此，本专利利用大肠杆菌作为基础菌株，在敲除了胸苷的降解基因后，过表达外源脱氧胞苷三磷酸核苷酸酶基因使得脱氧胞苷三磷酸(dCTP)去磷酸化生成脱氧胞苷一磷酸(dCMP)代替传统的单一生成脱氧尿苷三磷酸，增加dCTP的下游流路，在此基础上过表达dCMP磷酸水解酶基因以及T4噬菌体来源的dCMP脱氨酶(CD T4)基因，使脱氧胞苷一磷酸生成脱氧胞苷或者直接脱氨生成脱氧尿苷一磷酸。

与传统的生物发酵法生产胸苷比较，本发明在现有代谢路径的基础上，利用引入的外源基因，开发了新的合成路径，该合成路径从dCTP开始，通过脱氧胞苷三磷酸核苷酸酶产生dCMP，dCMP在脱氧胞苷一磷酸磷酸水解酶的催化下产生脱氧尿苷，后者经过重组微生物自身的磷酸激酶合成dUMP后参与到β-胸苷的生产，开发了新的合成路径，从而缩短了代谢通路并提高胸苷产量，具有极大的创新性和市场应用前景。

附图说明：

图1为大肠杆菌β-胸苷的代谢路径示意图；

图2β-胸苷及各类副产物检测的HPLC图谱；

图3为整合基因簇后的菌株验证；

图4为过表达pyrHm、dut效果比较；

图5为过表达CD T4效果；

其中：PyrE：乳清酸磷酸核糖转移酶；PyrHm：核苷磷酸激酶；NrdA、NrdB：核苷二磷酸还原酶；NrdC：硫氧还蛋白；PyrG：CTP合成酶；Cmk：胞苷酸激酶；Ndk/Adk：核苷二磷酸激酶；Dcd：dCTP脱氨酶；Udk：尿苷/胞苷激酶；Dut：脱氧核苷酸三磷酸酶；DCTPP1：脱氧胞苷三磷酸酶；YfbR、YfdR：dCMP磷酸水解酶；CD T4：dCMP脱氨酶；DeoA：胸苷磷酸化酶；Udp：尿苷磷酸化酶；Tdk：胸苷激酶；ThyA/T4 td：胸苷酸合成酶；Tmpase：胸苷酸5’-磷酸酶；RihC：核糖核酸水解酶；YdhP：β-胸苷转运蛋白；UMP：尿嘧啶核糖核苷酸；UDP：尿苷二磷酸；CMP：胞苷一磷酸；CDP：胞苷二磷酸；dUTP：脱氧尿苷三磷酸；dCTP：脱氧胞苷三磷酸；dCMP：脱氧胞苷一磷酸；dUMP：脱氧尿苷一磷酸；dUdR：脱氧尿苷；dTMP：脱氧胸苷一磷酸

具体实施方式

下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题，并不是一种限制。

本发明的技术方案可以应用大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌(Bacillus)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、沙门氏菌(salmonella)、酵母菌(Yeast)或者其他的微生物，下面以大肠杆菌为例，对技术方案进行进一步说明。

实施例1在大肠杆菌中基因敲除的方法

本发明采用Datsenko的方法在大肠杆菌中进行基因敲除，相应的基因敲除引物见Baba2006.Mol Syst Biol,2(1)0008。

实施例2摇瓶发酵验证重组菌株的方法

验证重组菌株在摇瓶发酵中生产β-胸苷的能力，具体成分为每升培养基中甘油30g，2N-5倍的盐溶液200ml，TM2溶液1ml，柠檬酸铁10mg，七水硫酸镁246mg，氯化钙111mg，硫胺素1ug，福鑫蛋白胨1g，安琪酵母粉0.5g，以无菌去离子水定容至1L。其中2N-5倍的盐溶液为十二水合磷酸氢二钠每升75.6g，磷酸二氢钾每升15g，氯化钠每升2.5g，氯化铵5g，以离子水定容至1L；TM2溶液为四水氯化锌2.0g，六水氯化钙2.0g，两水钼酸钠2.0g，五水硫酸铜1.9g，硼酸0.5g，盐酸100ml，去离子水定容至1L。上述溶液进行高压蒸汽灭菌，灭菌温度121℃，时间20-30min。

摇瓶发酵过程如下：首先接种重组菌株至含有抗生素的4mL的LB培养基中，置37℃摇床250rpm培养；取培养16小时后的种子200μl转移至2mL含有抗生素的LB液体培养基，于37℃摇床250rpm培养4h；随后将2ml二级种子全部转入装有18ml发酵培养基的摇瓶中，置37℃摇床中，250rpm培养3～4h，添加IPTG至终浓度1mM后，调节摇床温度至34℃，继续培养20h左右，取800ul发酵液加800ul甲醇，旋涡震荡5min，12000rpm离心2min，取上清液过0.22um有机滤膜，HPLC检测，检测方法见实施例3。

实施例3 HPLC测定发酵液中的β-胸苷和相关副产物

精密吸取800ul发酵液加800ul甲醇，旋涡震荡5min，12000rpm离心2min，取上清液过0.22um有机滤膜，HPLC检测。HPLC的参数如下：采用XBridge C18 4.6*150mm 5um，流动相为甲醇和10mM乙酸铵或PBS(pH4.0)，流动相比例0.01-4.5分钟甲醇比例为2％上升到20％，4.5-4.6分钟甲醇比例由20％下降到2％，4.6-8分钟甲醇比例维持2％，利用紫外检测器检测波长260nm；初始流动相的流速为1.0mL/min，发酵液的上样量2μL，柱温30℃。β-胸苷出峰时间为5.029分钟，乳清酸出峰时间为1.695分钟，脱氧尿苷出峰时间为3.747分钟，HPLC图谱如图2所示。

实施例4构建不能利用和降解β-胸苷的重组大肠杆菌

如图1所示，在大肠杆菌中β-胸苷的流向有两个：第一个β-胸苷被利用在回补途径，经胸苷激酶(Tdk)催化，将生成的胸苷再进一步回流至dTMP用于合成核苷酸供细胞生长；第二条路径是β-胸苷被胸苷磷酸化酶(DeoA)和尿苷磷酸化酶(Udp)催化，降解胸苷至胸腺嘧啶，这两种途径都是由嘧啶碱基通过核糖基化及磷酸化而合成的补救途径，因此，为了使细胞中更多地积累β-胸苷，需要敲除deoA、udp、tdk基因将补救途径进行截断。

本专利以大肠杆菌W3110(ATCC27325)为出发菌株，按照实施例1中的方法在W3110中敲除利用和降解β-胸苷的基因deoA、udp、tdk，构建菌株WT03(W3110ΔdeoAΔtdkΔudp)(表1)。

表1菌株改造

大肠杆菌W3110摇瓶发酵检测不到胸苷；敲除deoA、udp、tdk基因后的WT03菌株摇瓶发酵可以检测到极少量的β-胸苷20mg/L左右，但是绝大部分都是乳清酸(～250mg/L)，这是因为在大肠杆菌K-12菌中，乳清酸磷酸核糖转移酶(PyrE)上游rph基因的移码导致pyrE的表达不足，使得在嘧啶合成过程中会出现乳清酸的积累，致使不能被用于下游合成胸苷，而大肠杆菌嘌呤和嘧啶合成在一个动态水平波动，因此通过在质粒和基因组上对乳清酸磷酸核糖转移酶(PyrE)基因进行超量表达来解除上游rph基因移码突变导致的表达缺陷，减少乳清酸的积累；核糖核酸水解酶(RihC)降解尿苷生成尿嘧啶，如果阻断尿苷降解同时加强其转化成尿苷一磷酸(UMP)，从而能更多的积累产物胸苷，因此选择对rihC位点进行敲除同时整合pyrE，即构建菌株WT04(W3110ΔdeoAΔtdkΔudpΔrihC::pyrE)，发酵检测无乳清酸积累。WT04菌株构建具体过程如下：

分别以W3110基因组、pKD4为模板,用下表2引物pyrE-F/pyrE-R、K-F/K-R扩增含rihC位点50bp同源臂的pyrE、Kan-FRT片段，得到大小分别为740bp、1500bp的片段且电泳无杂带，直接进行过柱回收纯化(捷瑞胶回收纯化试剂盒)，得到的片段以纳摩尔比1:1进行overlap PCR，用表2中引物pyrE-F/K-R扩增敲除敲入片段，扩增得到大小为2240bp的无杂带的片段，直接进行过柱回收纯化，纯化后的片段加入约200ng于WT03/pKD46的电转化感受态细胞，混匀，转入0.1cm电击杯中，用电击仪作电转化。电击条件：200Ω，25μF，电击电压1.8kV，电击时间为5ms，电击后迅速加入800ul的LB，37℃，200rpm复苏培养1h，之后涂于含50ng/mL卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养。次日，将电转化得到的转化子以KanYZ-F/rihC-200R进行菌液PCR验证，确认WT04(WT03ΔrihC::pyrE)构建成功。

表2 WT04构建引物

实施例5过表达T4噬菌体来源的核苷二磷酸还原酶可提高胸苷的产量

如图1所示，从头合成途径是从氨甲酰磷酸与天冬氨酸合成氨甲酰磷酸天冬氨酸开始，经过一系列反应合成UMP，UMP是嘧啶核苷酸的共同前体，胸苷合成的前体物dUMP经由胸苷酸合成酶催化合成胸苷，而dUMP的量直接影响胸苷的合成，它的来源路径有两条，20％由UDP转化至dUDP再被进一步磷酸化生成dUTP；80％经CTP合成酶催化UTP生成CTP，CTP通过胞苷酸激酶生成CDP，再经过一系列反应生成dUMP，在这两种路径中均涉及到核苷二磷酸还原酶，它能促进二磷酸核苷(NDP)还原为脱氧核苷二磷酸(dNDP)，从而加快dUMP的合成。

进一步的，由于大肠自身的核苷二磷酸还原酶针对底物UDP的Km值是CDP的10倍，限制了UDP催化至dUDP的代谢路径。因此，我们通过表达T4噬菌体来源的核苷二磷酸还原酶来加快UDP代谢，该还原酶对底物UDP和CDP的Km值仅相差2倍，这使得胸苷的合成可以同时由两条路径提供；另外我们还使用同一个启动子联合表达大肠自身的尿苷激酶(Udk)、dCTP脱氨酶(Dcd)，可以进一步显著提高胸苷产量。

具体的：按照实施例4中的敲除整合方法，在WT04基因组上整合基因簇Ptrc-nrdBCA-udk-dcd，即构建菌株HT07、HT16、HT21(表1)。

以实施例2中的发酵培养基进行摇瓶发酵，验证整合不同拷贝基因簇后的胸苷产量，如图3所示，整合3个拷贝Ptrc-nrdBCA-udk-dcd的菌株HT21发酵后胸苷产量可达163mg/L，比WT04菌株的胸苷产量提高约130mg/L，表明整合基因簇可显著提高胸苷产量。

实施例6加强UDP转化dUMP提高胸苷产量

UMP磷酸化生成UDP是在pyrH基因编码的UMP激酶(PyrH)催化下进行的，但该酶受到其产物UTP、GTP的反馈抑制。通过对UMP激酶(PyrH)编码蛋白进行突变，使其第93位天冬氨酸突变为丙氨酸来获得不再受到UTP、GTP反馈抑制的PyrHm突变体；dUMP由dUTP经脱氧核苷酸三磷酸酶(Dut)催化而来，如图1所示，无论上游UDP被转化为dUDP还是UTP，最终都被一系列酶催化得到dUMP用于合成胸苷，所以加强上游UMP至UDP的反应以及下游dUTP至dUMP，都可以提高胸苷的最终产量。如本发明构建质粒pT36(pEZ07-dut)、pT37(pEZ07-pyrHm)、pT38(pEZ07-dut-pyrHm)(相关引物见表3)，转化到宿主菌HT16(见表1)中进行摇瓶验证，结果见图4，pyrHm、dut单表达都可以提高胸苷产量，串连表达后效果更好，可提高产量约50mg/L。其中，质粒构建过程如下：

以pT36为例，以W3110基因组为模板，分别以引物pT36-F/pT36-R(见下表3)扩增dut片段，得到的PCR产物大小为454bp，且电泳检测无杂带，直接进行过柱回收纯化(捷瑞胶回收纯化试剂盒)，得到的纯化片段与NcoI/KpnI酶切回收的pEZ07载体片段以纳摩尔比3:1进行EZ克隆构建(苏州神洲基因GBclonart无缝克隆试剂盒)，重组克隆反应液于45度水浴锅温浴30min，然后转移到冰上放置5min，转入TG1化转感受态细胞，42度热击2min，冰浴2min后加入800ul复苏培养基LB，复苏培养1h后离心涂布含100mg/L壮观酶素抗性的LB平板，次日挑取克隆培养过夜，提取质粒进行酶切验证，最终构建得到质粒pT36。

表3 pT36-pT38构建引物

实施例7开发由dCTP转化为dUdR的路径

在生物代谢过程中，胸苷的合成由前体物UMP经过一系列的生物转化而来，80％通过UMP转化到UDP后经UTP、CTP、CDP，再经核苷二磷酸还原酶催化CDP生成dCDP，经由核苷二磷酸激酶(Ndk/Adk)、dCTP脱氨酶(Dcd)共同作用转化至dUTP，在这一代谢过程中，尝试开发新的路径加速中间代谢物dCTP的代谢，解除上游反馈抑制，促进UDP生成dCDP的代谢，更多更快的用于合成胸苷。

我们通过表达人类来源的脱氧胞苷三磷酸核苷酸酶(DCTPP1:Q9H773)，其能水解dNTP至dNMP，且优先水解dCTP。此外，我们还通过表达基因yfbR(SEQ ID NO3)、yfdR(SEQ IDNO4)编码的蛋白，其属于5’核苷磷酸酶，也可作为dCMP磷酸水解酶，在补救路径中合成dUMP，同时对dTMP、dUMP也具有一定活性，可协同加强β-胸苷的合成速率。

具体的：合成基因DCTPP1(苏州金唯智)，并将大肠杆菌来源的yfbR、yfdR基因过表达，即分别在质粒pEZ07和pT38(pEZ07-dut-pyrHm)上连接基因DCTPP1(SEQ ID NO1)、yfbR(SEQ ID NO3)、yfdR(SEQ ID NO4)，构建质粒pT61(pT38-DCTPP1)、pT62(pT38-DCTPP1-yfbR)、pT63(pT38-DCTPP1-yfdR)、pT65(pEZ07-DCTPP1)、pT66(pEZ07-DCTPP1-yfbR)、pT67(pEZ07-DCTPP1-yfdR)，相关引物见表4。其中pT61-pT63转化到宿主菌HT21中，pT65-pT67转化到WT04菌株中，以实施例2中的发酵培养基进行摇瓶发酵，结果见表5，无论在WT04还是HT21宿主中表达DCTPP1、yfbR、yfdR均可以提高胸苷产量，协同表达效果优于单独表达DCTPP1，其中pT62表达效果最好，在仅仅发酵21h,胸苷产量达480mg/L，大大提高了生产的效率。表明新路径转化dCTP至dCMP，再由磷酸水解酶催化生成dCdR是可行的，这一代谢路径的开发加快了dCTP的利用，推动了整个代谢流的合成速率。

重组菌株HT21/pEZ07-dut-pyrHm-DCTPP1-yfbR简写为菌株HT21/pT62，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli.)，该菌株已于2020年03月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.19442。

表4 pT61-pT63构建引物

表5表达DCTPP1、yfbR、yfdR效果对比

实施例8过表达dCMP脱氨酶提高胸苷产量

T4噬菌体来源的dCMP脱氨酶(CDT4，SEQ ID NO7)在有dCTP存在的情况下，可将该脱氨酶激活，从而催化dCMP直接脱氨形成dUMP。因此，尝试开发另一条路径先将dCTP经DCTPP1催化生成dCMP，再经dCMP脱氨酶直接脱氨基至脱氧尿苷一磷酸(dUMP)，缩短代谢流路，加快dUMP合成速率，推动整个代谢更多的合成胸苷。

合成基因CDT4，与实施例6中的DCTPP1串联表达，即构建质粒pT64(pT61-CD T4)、pT68(pT65-CD T4)，相关引物见表6。构建的质粒分别转化宿主HT21、WT04，以实施例2中的发酵培养基进行摇瓶发酵，结果见图5，即在WT04和HT21宿主中表达DCTPP1、CDT4后均可以提高胸苷产量，表明这一路径也可用于生产胸苷。

表6 pT64构建引物

以上所述仅是发明的几个实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护。

序列表

<110> 苏州华赛生物工程技术有限公司

<120> 具有新合成路径生产β-胸苷的重组微生物及生产β-胸苷的方法

<130> 2020.4.17

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 513

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atgagtgtgg caggcggtga aatccgcggt gataccggcg gcgaagatac agcggcgcct 60

ggccgcttta gcttttctcc agaacctacc ttagaagata ttcgtcgctt acatgccgaa 120

tttgctgctg aacgtgattg ggaacagttt catcagcctc gtaatctgtt actggcctta 180

gtgggcgaag ttggtgaatt agcggaactg tttcagtgga aaacggatgg tgaaccaggt 240

ccacagggtt ggagtccacg cgaacgtgca gccttacaag aagaattaag cgatgtgtta 300

atctatttag ttgcattagc agctcgttgt cgcgttgatt taccactggc tgttctgagc 360

aaaatggaca taaatcgtcg ccgttatcct gcgcatctgg cacgctctag tagccgtaaa 420

tatacggaat tacctcatgg tgccatctct gaagatcagg ctgtgggtcc tgccgatata 480

ccttgcgata gtacgggtca gacaagcaca taa 513

<210> 2

<211> 170

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Met Ser Val Ala Gly Gly Glu Ile Arg Gly Asp Thr Gly Gly Glu Asp

1 5 10 15

Thr Ala Ala Pro Gly Arg Phe Ser Phe Ser Pro Glu Pro Thr Leu Glu

20 25 30

Asp Ile Arg Arg Leu His Ala Glu Phe Ala Ala Glu Arg Asp Trp Glu

35 40 45

Gln Phe His Gln Pro Arg Asn Leu Leu Leu Ala Leu Val Gly Glu Val

50 55 60

Gly Glu Leu Ala Glu Leu Phe Gln Trp Lys Thr Asp Gly Glu Pro Gly

65 70 75 80

Pro Gln Gly Trp Ser Pro Arg Glu Arg Ala Ala Leu Gln Glu Glu Leu

85 90 95

Ser Asp Val Leu Ile Tyr Leu Val Ala Leu Ala Ala Arg Cys Arg Val

100 105 110

Asp Leu Pro Leu Ala Val Leu Ser Lys Met Asp Ile Asn Arg Arg Arg

115 120 125

Tyr Pro Ala His Leu Ala Arg Ser Ser Ser Arg Lys Tyr Thr Glu Leu

130 135 140

Pro His Gly Ala Ile Ser Glu Asp Gln Ala Val Gly Pro Ala Asp Ile

145 150 155 160

Pro Cys Asp Ser Thr Gly Gln Thr Ser Thr

165 170

<210> 3

<211> 600

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atgaaacaga gccatttttt tgcccatctc tcccgcctga aactcattaa ccgctggccg 60

ctcatgcgca acgtgcggac ggaaaatgtg tccgaacaca gtttgcaggt agcgatggtc 120

gcccatgcgc tggcagctat caaaaatcga aaatttggcg gtaatgtcaa cgccgaacgt 180

atcgctttac tggcgatgta ccacgatgcc tcagaagtgc tcaccggcga tctccctact 240

ccggtgaaat acttcaattc gcaaatcgct caggagtaca aggctattga aaaaatcgct 300

cagcaaaaac tggtcgatat ggttccggaa gagctgcggg atatctttgc gccgttaatt 360

gacgagcatg catatagcga tgaagaaaaa tcgctggtga aacaggcaga tgcactgtgt 420

gcatatctga aatgtctgga agaactcgcg gccggaaata atgaattctt gctggcaaaa 480

acgcgactgg aagcgacgct tgaagcgcgt cgcagccagg agatggacta cttcatggaa 540

atatttgttc ccagcttcca tctttcgctc gatgagatta gccaggattc accgctgtaa 600

<210> 4

<211> 537

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

atgtcattta ttaaaacttt ttccgggaag catttttatt atgacaagat aaataaagac 60

gacatcgtga ttaacgatat cgcggtttcc ctttcaaata tctgccgctt tgccggtcat 120

ctttctcact tctacagtgt cgcccaacat gcggtgcttt gcagccagct ggtgccgcag 180

gaatttgctt ttgaagcatt aatgcatgat gcaacagaag cgtattgcca ggacatcccc 240

gcaccactga aacgccttct tcctgactat aaacggatgg aagaaaaaat agatgcagta 300

atccgtgaga aatacgggtt acctcctgtt atgagcacgc cagtgaaata tgccgatctc 360

attatgctgg caaccgaacg ccgtgatctc gggcttgatg atggctcttt ctggcctgta 420

ctggaaggca tcccggcaac agagatgttc aacgtgattc cactggcacc gggtcatgcc 480

tacgggatgt ttatggaacg ttttaacgat ttatcggagt tacgcaaatg cgcatga 537

<210> 5

<211> 199

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 5

Met Lys Gln Ser His Phe Phe Ala His Leu Ser Arg Leu Lys Leu Ile

1 5 10 15

Asn Arg Trp Pro Leu Met Arg Asn Val Arg Thr Glu Asn Val Ser Glu

20 25 30

His Ser Leu Gln Val Ala Met Val Ala His Ala Leu Ala Ala Ile Lys

35 40 45

Asn Arg Lys Phe Gly Gly Asn Val Asn Ala Glu Arg Ile Ala Leu Leu

50 55 60

Ala Met Tyr His Asp Ala Ser Glu Val Leu Thr Gly Asp Leu Pro Thr

65 70 75 80

Pro Val Lys Tyr Phe Asn Ser Gln Ile Ala Gln Glu Tyr Lys Ala Ile

85 90 95

Glu Lys Ile Ala Gln Gln Lys Leu Val Asp Met Val Pro Glu Glu Leu

100 105 110

Arg Asp Ile Phe Ala Pro Leu Ile Asp Glu His Ala Tyr Ser Asp Glu

115 120 125

Glu Lys Ser Leu Val Lys Gln Ala Asp Ala Leu Cys Ala Tyr Leu Lys

130 135 140

Cys Leu Glu Glu Leu Ala Ala Gly Asn Asn Glu Phe Leu Leu Ala Lys

145 150 155 160

Thr Arg Leu Glu Ala Thr Leu Glu Ala Arg Arg Ser Gln Glu Met Asp

165 170 175

Tyr Phe Met Glu Ile Phe Val Pro Ser Phe His Leu Ser Leu Asp Glu

180 185 190

Ile Ser Gln Asp Ser Pro Leu

195

<210> 6

<211> 178

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 6

Met Ser Phe Ile Lys Thr Phe Ser Gly Lys His Phe Tyr Tyr Asp Lys

1 5 10 15

Ile Asn Lys Asp Asp Ile Val Ile Asn Asp Ile Ala Val Ser Leu Ser

20 25 30

Asn Ile Cys Arg Phe Ala Gly His Leu Ser His Phe Tyr Ser Val Ala

35 40 45

Gln His Ala Val Leu Cys Ser Gln Leu Val Pro Gln Glu Phe Ala Phe

50 55 60

Glu Ala Leu Met His Asp Ala Thr Glu Ala Tyr Cys Gln Asp Ile Pro

65 70 75 80

Ala Pro Leu Lys Arg Leu Leu Pro Asp Tyr Lys Arg Met Glu Glu Lys

85 90 95

Ile Asp Ala Val Ile Arg Glu Lys Tyr Gly Leu Pro Pro Val Met Ser

100 105 110

Thr Pro Val Lys Tyr Ala Asp Leu Ile Met Leu Ala Thr Glu Arg Arg

115 120 125

Asp Leu Gly Leu Asp Asp Gly Ser Phe Trp Pro Val Leu Glu Gly Ile

130 135 140

Pro Ala Thr Glu Met Phe Asn Val Ile Pro Leu Ala Pro Gly His Ala

145 150 155 160

Tyr Gly Met Phe Met Glu Arg Phe Asn Asp Leu Ser Glu Leu Arg Lys

165 170 175

Cys Ala

<210> 7

<211> 582

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

atgaaagcga gtacagtact tcaaattgca tatttagtat cgcaggaatc aaaatgttgc 60

tcctggaagg taggagcagt aattgaaaag aatggacgta ttatttctac tgggtataat 120

ggttcacccg cagggggtgt gaactgttgt gattatgctg ctgagcaagg atggttgttg 180

aataagccta aacatgctat cattcaaggt cataagcctg aatgcgtatc atttggttca 240

actgatcgtt ttgttttggc gaaagaacat cgtagtgctc actcggaatg gtcatctaaa 300

aatgaaattc atgctgaact aaatgcaatt ttgtttgctg cacgaaatgg ttcttctatt 360

gaaggtgcta ctatgtatgt aacactttct ccttgtccag attgcgcaaa agcgatagct 420

caatctggta ttaaaaagct ggtttattgt gaaacatacg acaaaaataa acccggttgg 480

gatgatattc tgcgaaatgc aggtattgaa gtgtttaatg ttcctaagaa aaacttgaat 540

aagttaaact gggaaaatat caacgaattc tgtggtgaat aa 582

<210> 8

<211> 193

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 8

Met Lys Ala Ser Thr Val Leu Gln Ile Ala Tyr Leu Val Ser Gln Glu

1 5 10 15

Ser Lys Cys Cys Ser Trp Lys Val Gly Ala Val Ile Glu Lys Asn Gly

20 25 30

Arg Ile Ile Ser Thr Gly Tyr Asn Gly Ser Pro Ala Gly Gly Val Asn

35 40 45

Cys Cys Asp Tyr Ala Ala Glu Gln Gly Trp Leu Leu Asn Lys Pro Lys

50 55 60

His Ala Ile Ile Gln Gly His Lys Pro Glu Cys Val Ser Phe Gly Ser

65 70 75 80

Thr Asp Arg Phe Val Leu Ala Lys Glu His Arg Ser Ala His Ser Glu

85 90 95

Trp Ser Ser Lys Asn Glu Ile His Ala Glu Leu Asn Ala Ile Leu Phe

100 105 110

Ala Ala Arg Asn Gly Ser Ser Ile Glu Gly Ala Thr Met Tyr Val Thr

115 120 125

Leu Ser Pro Cys Pro Asp Cys Ala Lys Ala Ile Ala Gln Ser Gly Ile

130 135 140

Lys Lys Leu Val Tyr Cys Glu Thr Tyr Asp Lys Asn Lys Pro Gly Trp

145 150 155 160

Asp Asp Ile Leu Arg Asn Ala Gly Ile Glu Val Phe Asn Val Pro Lys

165 170 175

Lys Asn Leu Asn Lys Leu Asn Trp Glu Asn Ile Asn Glu Phe Cys Gly

180 185 190

Glu

<210> 9

<211> 68

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

tatgcgaaaa tgccggtctt gttaccggca ttttttatgg agaaaacatg aaaccatatc 60

agcgccag 68

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

gaagcagctc cagcctacac ttaaacgcca aactcttcgc g 41

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

gtgtaggctg gagctgcttc 20

<210> 12

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

atgactgcat gccaataaca tgtgacaggt tacgacgcca gagccagcac atgggaatta 60

gccatggtcc 70

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 13

cggtgccctg aatgaactgc 20

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 14

gtaaagaaga tccttcacgc tcc 23

<210> 15

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 15

gtatcgatta aataaggagg aataaaccat gaaaaaaatc gacgttaaga ttctg 55

<210> 16

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 16

cttcgaattc ccatatggta ccttactgac gaccagagtg accaaag 47

<210> 17

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 17

gtatcgatta aataaggagg aataaaccat ggctaccaat gcaaaaccc 49

<210> 18

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 18

cttcgaattc ccatatggta ccttattccg tgattaaagt cccttctttt tc 52

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 19

ggcaatgcgt gcagcactgc ac 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 20

gtgcagtgct gcacgcattg cc 22

<210> 21

<211> 71

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 21

ctttggtcac tctggtcgtc agtaactaag gaaataatag gagattgaaa atggctacca 60

atgcaaaacc c 71

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 22

ttactgacga ccagagtgac caaag 25

<210> 23

<211> 65

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 23

gactttaatc acggaataag gctttagcgt taagaaggag atatatatga gtgtggcagg 60

cggtg 65

<210> 24

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 24

gcttcgaatt cccatatggt accttatgtg cttgtctgac ccgtac 46

<210> 25

<211> 76

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 25

gtacgggtca gacaagcaca taagcttcta aggaaataat aggagattga aaatgaaaca 60

gagccatttt tttgcc 76

<210> 26

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 26

gcttcgaatt cccatatggt accttacagc ggtgaatcct ggc 43

<210> 27

<211> 79

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 27

gtacgggtca gacaagcaca taagcttcta aggaaataat aggagattga aaatgtcatt 60

tattaaaact ttttccggg 79

<210> 28

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 28

gcttcgaatt cccatatggt acctcatgcg catttgcgta actc 44

<210> 29

<211> 80

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 29

gtacgggtca gacaagcaca taagcttcta aggaaataat aggagattga aaatgaaagc 60

gagtacagta cttcaaattg 80

<210> 30

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 30

gcttcgaatt cccatatggt accttattca ccacagaatt cgttgatatt ttc 53

Claims (8)

1.一种具有新合成路径生产β-胸苷的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物具有如下代谢过程：脱氧胞苷三磷酸核苷酸酶催化脱氧胞苷三磷酸生成脱氧胞苷一磷酸。

2.根据权利要求1所述的具有新合成路径生产β-胸苷的重组微生物，其特征在于：所述脱氧胞苷一磷酸再经dCMP脱氨酶水解生成脱氧尿苷一磷酸。

3.根据权利要求1或2所述的具有新合成路径生产β-胸苷的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物过表达促进合成β-胸苷的关键酶。

4.根据权利要求3所述的具有新合成路径生产β-胸苷的重组微生物，其特征在于：所述关键酶包括如下至少一种：脱氧胞苷三磷酸核苷酸酶、脱氧胞苷一磷酸（dCMP）磷酸水解酶、dCMP脱氨酶。

5.根据权利要求4所述的具有新合成路径生产β-胸苷的重组微生物，其特征在于：所述脱氧胞苷三磷酸核苷酸酶具有至少一个如下特征：

1）所述脱氧胞苷三磷酸核苷酸酶的基因序列是SEQ ID NO1或其突变体；

2）所述脱氧胞苷三磷酸核苷酸酶的氨基酸序列是SEQ ID NO2或同SEQ ID No 2具有75%以上的同源性。

6.根据权利要求4所述的具有新合成路径生产β-胸苷的重组微生物，其特征在于：所述dCMP磷酸水解酶具有至少一个如下特征：

1）所述dCMP磷酸水解酶的基因序列是SEQ ID NO3或SEQ ID NO3的突变体；

2）所述dCMP磷酸水解酶的氨基酸序列是SEQ ID NO5或同SEQ ID NO5具有75%以上的同源性。

7.根据权利要求4所述的具有新合成路径生产β-胸苷的重组微生物，其特征在于：所述dCMP磷酸水解酶具有至少一个如下特征：

1）所述dCMP磷酸水解酶的基因序列是SEQ ID NO4或SEQ ID NO4的突变体；

2）所述dCMP磷酸水解酶的氨基酸序列是SEQ ID NO6或同SEQ ID NO6具有75%以上的同源性。

8.一种利用新合成路径生产β-胸苷的方法，其特征在于：利用权利要求1-7任一项所述的重组微生物生产β-胸苷。

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