CN116144720B - 一种酶法生产假尿苷的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种酶法生产假尿苷的方法，属于生物技术领域，所述的方法为以核糖核苷和/或核糖核苷单磷酸为底物，加入酶进行催化反应，再经过去磷酸化，得到假尿苷；所述的酶选自尿苷激酶、嘧啶/嘌呤核苷酸5'‑单磷酸核苷酶、尿苷磷酸化酶、磷酸戊糖变位酶、嘌呤核苷磷酸化酶、AMP核苷酶中的一种或多种，利用大肠杆菌自身本底表达的磷酸水解酶，即可进行假尿苷的生产，而无需进行异源酶的表达。采用本发明所述的反应路线可以高效生产假尿苷。反应利用大肠杆菌自身高表达的酶，克服了异源表达低酶活低表达量的困难，开发的多种反应路线为假尿苷大规模工业化生产提供了可能。

Description

一种酶法生产假尿苷的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酶法生产假尿苷的方法。
背景技术
假尿苷是由核糖体RNA(Ribosomal RNA，rRNA)和转运RNA(Transfer RNA，tRNA)中的一种尿嘧啶核苷的天然结构类似物的核糖与C5相连形成，也称为第五核苷。假尿苷是非编码RNA中含量最多的修饰核苷，通过稳定RNA结构来增强转移RNA和核糖体RNA的功能。随着测序技术的发展，发现mRNA上存在着在丰富的假尿苷修饰，该修饰不仅能够降低mRNA引发的免疫反应，还能够提高编码基因的翻译效率。另外，假尿苷还可以作为潜在的生物标志物，用于肾病与肿瘤的诊断、疗效监测，减少辐射引起的人类淋巴细胞染色体畸变。因此，市场上对假尿苷的需求越来越大，其合成方法也引起了广泛的关注。
目前多用化学合成方法来制备假尿苷，如通过D-核糖酸-1,4-内酯合成假尿苷，或者通过2,4:3,5-二-O-亚苄基-醛基-D-核糖水合物合成假尿苷。如中国专利CN114702481A中使用D-核糖和尿嘧啶，在有机溶剂中滴加乙酰溴和强路易斯碱消去活泼氢，分批加入(Boc)2O，再使用三氟乙酸脱去保护基，得到的中间体再加入乙酸酐，通过脂肪酶进行手性拆分，最后在碱性条件下脱去保护基得到最终产物假尿苷。这种化学合成方法存在反应步骤长、收率低，且用到的试剂易燃易爆，较不安全。中国专利CN114196715A中利用生物与化学相结合的方法来制备假尿苷，首先以AMP通过化学法水解得到核糖-5-磷酸，再以核糖-5-磷酸与尿嘧啶经假尿苷-5-磷酸糖苷酶突变体催化合成假尿苷单磷酸(ψMP)，最后将反应液加热变性、离心纳滤，加入乙醇、NaOH后去磷酸化得到假尿苷，相较于单一的化学合成方法，这样的制备方式涉及的有机溶剂较少，但是反应步骤仍然较为冗杂，收率低。中国专利CN112592880B中利用全细胞发酵法来制备假尿苷，在大肠杆菌中通过异源表达链霉菌Streptomyces sp.ID38640中的假尿苷合成酶编码基因pumH、pumJ和pumD，在发酵过程中加入底物尿苷来实现全细胞转化，虽然用发酵法制备假尿苷成本低廉，操作步骤简单，但是由于在大肠杆菌中表达异源合成酶存在表达量低，酶活不佳的问题，因此，亟需开发一种绿色、高效，步骤简单且副产物少的制备方法。
大肠杆菌中已发现有自身的假尿苷单磷酸糖苷酶，由yeiN基因编码，切割C5-C1'糖苷键，形成尿嘧啶和5'-磷酸核糖。该催化反应过程可逆。由于假尿苷单磷酸的降解平衡常数很低，约为2.3×10-4M，该催化反应有利于朝着合成假尿苷单磷酸的方向进行，而大肠杆菌中同时还含有多种水解磷酸基团的酶，如酸性磷酸酶UshA、SurE，碱性磷酸酶PhoA，磷酸转移酶AphA等，可以将生成的假尿苷单磷酸进一步去磷酸化得到产物假尿苷。
结合以上信息，本发明用全酶法体外制备假尿苷，利用多种核糖核苷或核糖核苷单磷酸为底物，大肠杆菌自身的核苷酶、核苷激酶、磷酸戊糖变位酶等进行催化获得假尿苷生产的前体底物5-磷酸核糖，再与尿嘧啶联合YeiN、磷酸水解酶共同作用制备假尿苷。
发明内容
针对单一的化学合成方法中存在的反应步骤长、收率低，且用到的试剂易燃易爆等问题，本发明提供了多种全酶法生产假尿苷的方法，利用多种底物加入酶进行反应，为假尿苷的工业化生产提供了可能，达到绿色环保低成本的假尿苷生产。
本发明的术语解释和声明：
1、术语“ψ”：如无特殊说明，本发明中的英文简称“ψ”指假尿苷，其分子式为C9H12N2O6。
2、术语“ψMP”：如无特殊说明，本发明中的英文简称“ψMP”指假尿苷单磷酸，其分子式为C9H13N2O9P。
3、术语“R5P”：如无特殊说明，本发明中的英文简称“R5P”指5-磷酸核糖。
4、术语“重组微生物”：是指经过人为处理后的微生物；所述的人为处理包括但不限于：基因敲除、基因抑制、基因沉默、基因插入、基因突变、外源表达或过表达基因等本领域所有可以实现基因操作的技术手段。
5、术语“宿主菌”：是指待进行人为处理的微生物。
6、术语“外源表达或过表达”：在相对于本发明使用时应被广义地认为包括在相同条件下与亲本微生物的一或多种蛋白质(包括编码一或多种蛋白质的一或多种核酸)表达水平相比所述蛋白质表达(包括核酸表达)的任何增加。不应被认为意指所述蛋白质(或核酸)以任何具体水平表达。
7、术语“载体”：应被广义地认为包括适合用作媒介将遗传物质转移到细胞中的任何核酸(包括DNA和RNA)，包括质粒、病毒(包括噬菌体)、粘粒和人工染色体。载体可以包括一或多种调节元件、复制起点、多克隆位点和/或可选择标记物。
8、关于蛋白和基因名称的声明：本发明中涉及的英文蛋白名称均为大写正体；本发明中涉及的英文基因名称均为小写斜体。
9、ψMP glycosylase：假尿苷单磷酸糖苷酶；phosphatase：磷酸水解酶；Pseudouridine synthetase：假尿苷合成酶；PpnN：嘧啶/嘌呤核苷酸5'-单磷酸核苷酶；Udk：尿苷激酶；UdP：尿苷磷酸化酶；DeoD：嘌呤核苷磷酸化酶；DeoB：磷酸戊糖变位酶；YeiN：假尿苷-5'-磷酸糖苷酶；Uracil：尿嘧啶；UdR：尿苷；CdR：胞苷；Ado：腺苷；Guo：鸟苷；Ino：肌苷；Xao：黄嘌呤核苷；CMP：胞嘧啶单磷酸核苷；UMP：尿嘧啶单磷酸核苷；AMP：腺嘌呤单磷酸核苷；IMP：次黄嘌呤单磷酸核苷；GMP：鸟嘌呤单磷酸核苷；Amn：AMP核苷酶。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种酶法生产假尿苷的方法，所述的方法为以核糖核苷和/或核糖核苷单磷酸为底物，加入酶进行催化反应，生成5-磷酸核糖，5-磷酸核糖与尿嘧啶进行反应，再经过去磷酸化，得到假尿苷；
优选地，所述的酶选自尿苷激酶、嘧啶/嘌呤核苷酸5'-单磷酸核苷酶、尿苷磷酸化酶、磷酸戊糖变位酶、嘌呤核苷磷酸化酶、AMP核苷酶中的一种或多种。
优选地，所述的5-磷酸核糖与尿嘧啶进行反应，再经过去磷酸化，得到假尿苷的反应路线如下所示：
具体地，所述的核糖核苷选自尿苷、胞苷、腺苷、鸟苷、肌苷、黄嘌呤核苷中的一种或多种。
具体地，所述的核糖核苷单磷酸选自胞嘧啶单磷酸核苷、尿嘧啶单磷酸核苷、腺嘌呤单磷酸核苷、次黄嘌呤单磷酸核苷、鸟嘌呤单磷酸核苷中的一种或多种。
在本发明的实施例中，以核糖核苷单磷酸为底物，所述的核糖核苷单磷酸选自胞嘧啶单磷酸核苷、尿嘧啶单磷酸核苷、腺嘌呤单磷酸核苷、次黄嘌呤单磷酸核苷、鸟嘌呤单磷酸核苷中的一种或多种，加入嘧啶/嘌呤核苷酸5'-单磷酸核苷酶进行催化反应，生成5-磷酸核糖，5-磷酸核糖与尿嘧啶进行反应，再经过去磷酸化，得假尿苷。
以核糖核苷单磷酸为底物，所述的核糖核苷单磷酸为腺嘌呤单磷酸核苷，加入AMP核苷酶进行催化反应，生成5-磷酸核糖，5-磷酸核糖与尿嘧啶进行反应，再经过去磷酸化，得假尿苷。
在本发明的实施例中，以核糖核苷为底物，所述的核糖核苷为尿苷和/或胞苷，加入尿苷激酶和嘧啶/嘌呤核苷酸5'-单磷酸核苷酶进行催化反应，生成5-磷酸核糖，5-磷酸核糖与尿嘧啶进行反应，再经过去磷酸化，得假尿苷。
具体地，提高假尿苷产量的方法包括提高尿苷激酶的含量或活性，和/或，编码所述尿苷激酶的基因过表达和/或整合多个拷贝至基因组。
具体地，提高假尿苷产量的方法包括提高所述嘧啶/嘌呤核苷酸5'-单磷酸核苷酶的含量或活性，和/或，编码所述嘧啶/嘌呤核苷酸5'-单磷酸核苷酶的基因过表达和/或整合多个拷贝至基因组。
优选地，将基因udk、ppnN串联构建至载体pET28a，获得质粒并将质粒转化宿主BL21(DE3)构建重组微生物，用新表达的酶液进行反应。
优选地，在上述的三种实施例中，所述的催化反应体系中还包括缓冲液，所述的缓冲液选自HEPES、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、MES缓冲液、硼砂缓冲液、MOPS缓冲液中的至少一种；进一步优选地，所述的缓冲液为HEPES缓冲液。
再进一步优选地，所述的缓冲液的浓度为20-30mM，pH为6.0-8.0；
更进一步优选地，所述的缓冲液的浓度为25mM，pH为7.0。
在本发明的实施例中，以核糖核苷为底物，所述的核糖核苷为尿苷，加入尿苷磷酸化酶和磷酸戊糖变位酶进行催化反应，生成5-磷酸核糖，5-磷酸核糖与尿嘧啶进行反应，再经过去磷酸化，得假尿苷。
具体地，提高假尿苷产量的方法包括提高尿苷磷酸化酶的含量或活性，和/或，编码所述尿苷磷酸化酶的基因过表达和/或整合多个拷贝至基因组。
具体地，提高假尿苷产量的方法包括提高所述磷酸戊糖变位酶的含量或活性，和/或，编码所述磷酸戊糖变位酶的基因过表达和/或整合多个拷贝至基因组。
在本发明的一些实施例中，以核糖核苷为底物，所述的核糖核苷为腺苷、鸟苷、肌苷、黄嘌呤核苷中的一种或多种，加入酶进行催化反应，生成5-磷酸核糖，5-磷酸核糖与尿嘧啶进行反应，再经过去磷酸化，得假尿苷。
优选地，所述的酶选自嘌呤核苷磷酸化酶、磷酸戊糖变位酶中的一种或多种；
进一步优选地，所述的酶为嘌呤核苷磷酸化酶和磷酸戊糖变位酶组合。
具体地，提高假尿苷产量的方法包括提高嘌呤核苷磷酸化酶的含量或活性，和/或，编码所述嘌呤核苷磷酸化酶的基因过表达和/或整合多个拷贝至基因组。
优选地，在上述的两种实施例中，所述的催化反应体系中的缓冲液选自HEPES、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、MES缓冲液、硼砂缓冲液、MOPS缓冲液中的至少一种；进一步优选地，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液。
再进一步优选地，所述的磷酸盐缓冲液选自磷酸钾盐缓冲液、磷酸钠盐缓冲液中的至少一种。
更进一步优选地，所述的磷酸盐缓冲液为磷酸钾盐缓冲液。
优选地，所述的缓冲液的浓度为20-30mM，pH为6.0-8.0；
更进一步优选地，所述的缓冲液的浓度为25mM，pH为7.8。
优选地，上述的催化反应体系中包括MgCl2、MnSO4、二硫苏糖醇和KCl；
进一步优选地，所述的MgCl2、MnSO4、二硫苏糖醇和KCl的终浓度均为0.1-0.5mM；
再进一步优选地，所述的MgCl2、MnSO4、二硫苏糖醇和KCl的终浓度均为0.3mM。
优选地，上述的催化反应体系中包括假尿苷单磷酸糖苷酶和/或磷酸水解酶。
具体地，提高假尿苷的产量包括提高所述的假尿苷单磷酸糖苷酶的含量或活性，和/或，编码所述假尿苷单磷酸糖苷酶的基因过表达和/或整合多个拷贝至基因组。
具体地，提高假尿苷的产量包括提高所述磷酸水解酶的含量或活性，和/或，所述的磷酸水解酶为大肠杆菌自身表达酶。
优选地，将上述的催化反应体系置于37℃的水浴锅中进行反应，所述的反应时间为20-30h，反应过程中不断搅拌；进一步优选地，所述的反应时间为24h。
优选地，上述的酶的编码基因在宿主细胞中进行转录表达，转录表达使用的培养基选自LB培养基、TB培养基、SOB培养基中的至少一种；
进一步优选地，所述的转录表达使用的培养基为LB培养基。
优选地，所述酶的表达包括以下步骤：
(1)活化种子，从划线平板挑取单克隆至摇管中，37℃过夜培养；
(2)接种至装有LB培养基的摇瓶，37℃培养；
(3)在摇瓶中加入的异丙基硫代半乳糖苷，调整温度至34℃，250rpm培养；
(4)次日收集菌体，离心，弃上清，菌体沉淀用PBS缓冲液重悬，超声，进行细胞破碎，超声后的破碎液离心收集上清，即为粗酶液。
优选地，所述的步骤(2)中接种量为1-3％；进一步优选地，所述的接种量为1％。
优选地，所述的步骤(2)的培养是培养至OD600为0.6-0.8；所述的培养的时间为2.5-3h。
优选地，所述的步骤(3)的异丙基硫代半乳糖苷的浓度为200mM，摇瓶中异丙基硫代半乳糖苷的终浓度为0.3-0.5mM；进一步优选地，所述的异丙基硫代半乳糖苷的终浓度为0.4mM。
优选地，所述的步骤(3)的培养时间为18-24h；进一步优选地，所述的步骤(3)的培养时间为20h。
优选地，所述的步骤(4)中收集菌体后离心的转速为7000-8000rpm，离心的时间为8-15min。
进一步优选地，所述的步骤(4)中收集菌体后离心的转速为7800rpm，离心的时间为10min。
优选地，所述的步骤(4)中PBS缓冲液的浓度为2mM，pH为7.0。
优选地，所述步骤(4)中超声的功率为40％，超声的时间为5-10min；进一步优选地，所述的超声的时间为6min；所述超声为超声2s暂停4s。
优选地，所述的步骤(4)的破碎液离心的转速为7000-8000rpm，离心的时间为8-15min；进一步优选地，所述的转速为7800rpm，离心的时间为10min。
优选地，上述的假尿苷的检测方法为高效液相色谱法，所述的HPLC的参数如下：
采用XBridge Amide 4.6×150mm 5um色谱柱；流动相为纯水：乙腈＝10：90；流速1.0mL/min；利用紫外检测器检测波长260nm；上样量5μL；柱温25℃。
所述的高效液相色谱法包括以下步骤：吸取反应液加甲酸溶液，旋涡振荡，离心，取上清液过滤，HPLC检测。
进一步优选地，所述的甲酸溶液的浓度为0.1-1％；再进一步优选地，所述的甲酸溶液的浓度为0.2％。
进一步优选地，所述的涡旋振荡的时间为5-10min；再进一步优选地，所述的涡旋振荡的时间为5min。
进一步优选地，所述离心的转速为10000-15000rpm，离心的时间为30s-90s；
再进一步优选地，所述离心的转速为12000rpm，离心的时间为60s。
进一步优选地，所述的过滤是过0.22μm水相过滤膜。
本发明的有益效果：
本发明的全酶法制备假尿苷无需在大肠杆菌中表达异源酶，避免低表达低酶活带来的困扰，同时采用多酶法进行制备，反应步骤简单，条件温和，副产物少，易于纯化并且去磷酸化过程可通过本底表达的酶自发进行，无需额外添加，简化了反应流程，开发的多种生产方法为假尿苷的大规模生产提供了可能。
附图说明
图1为酶法合成假尿苷的反应过程图。
图2为假尿苷的分子结构式。
图3为尿嘧啶的分子结构式。
图4为假尿苷检测的HPLC图谱。
图5为PpnN催化NMP水解生产R5P的反应式。
图6为AMP核苷酶催化AMP水解生产R5P的反应式。
图7为UdK和PpnN催化尿苷/胞苷水解生产R5P的反应式。
图8为Udp和DeoB催化尿苷水解生产R5P的反应式。
图9为DeoD和DeoB催化Ado、Guo、Ino、Xao水解生产R5P的反应式。
图10为Amn和YeiN催化AMP水解生产假尿苷的反应式。
图11为以Amn酶液进行ψ生产的反应进程图。
图12为以PpnN和YeiN进行ψ生产的反应进程图。
图13为以CMP、UMP、AMP、IMP、GMP进行ψ生产的反应进程图。
图14为添加不同量的Uracil时，产生假尿苷的情况。
图15为以Udk、PpnN和YeiN进行ψ生产的反应进程图。
图16为以Udp、DeoB和YeiN进行ψ生产的反应进程图。
图17为以DeoB、DeoD和YeiN进行ψ生产的反应进程图。
图18为利用磷酸戊糖变位酶进行以核苷为底物的ψ生产反应进程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
原理说明：假尿苷制备的反应机理说明
制备假尿苷的反应过程如图1所示，假尿苷由R5P和尿嘧啶经过假尿苷单磷酸糖苷酶的作用生成假尿苷单磷酸，再经去磷酸化进而产生假尿苷，其中，假尿苷的结构式如图2所示，尿嘧啶的结构式如图3所示。R5P是假尿苷生产中的重要底物。R5P是一种磷酸化糖，在所有生物体中，由磷酸戊糖途径(磷酸己糖，PPP)的第五步形成，是细胞中核苷酸合成所必需的。在工业上，R5P的合成由ATP、GTP经酸催化得到，或用D-核糖酶促磷酸化，或用5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)为起始原料，通过酸催化水解来获取R5P，但是生产的R5P得率较低，为50％-70％。
本发明开发了一种酶法生产假尿苷的方法，以含有5’-磷酸核糖基的核糖核苷单磷酸或者含有核糖基的核糖核苷为底物，经一步或多步催化得到5’-磷酸核糖，过程中无需单独纯化5’-磷酸核糖，它在反应体系中生成与利用同时进行，因此有利于反应向右进行。
实验方法1：酶液摇瓶表达及收集
1、试剂：
酶的编码基因在宿主细胞中的转录表达使用LB培养基，每升培养基中含酵母粉5g，氯化钠10g，蛋白胨10g，去离子水定容至1L。
上述溶液进行高压蒸汽灭菌，灭菌温度121℃，时间20-30min。
2、仪器：恒温摇床培养箱。
3、方法：
具体表达过程如下：
(1)活化种子，从划线平板挑取单克隆至装有4mL LB的摇管中，37℃过夜培养；
(2)以接种量1％接种至装有50mL LB培养基的250mL摇瓶，37℃培养2.5-3h至OD600为0.6-0.8；
(3)在摇瓶中加入100μL 200mM的IPTG，使终浓度为0.4mM，调整温度至34℃，250rpm培养20h；
(4)次日收集菌体，7800rpm*10min，弃上清，称取菌体沉淀0.1g用2mL 2mM PBS(pH7.0)的缓冲液重悬，40％功率超声6min(超声2s*暂停4s)进行细胞破碎，超声后的破碎液7800rpm*10min离心收集上清，即为粗酶液。
实验方法2：HPLC测定反应液中的ψ和相关副产物
精密吸取200μL反应液加600μL0.2％甲酸溶液，旋涡震荡5min，12000rpm离心1min，取上清液过0.22μm水相过滤膜，HPLC检测。
HPLC的参数如下：
采用XBridge Amide 4.6×150mm 5um色谱柱；
流动相为纯水：乙腈＝10：90，流速1.0mL/min；
利用紫外检测器检测波长260nm；
发酵液的上样量5μL，柱温25℃。
假尿苷出峰时间为10.622分钟，尿嘧啶出峰时间为3.347分钟，各核苷类和核苷单磷酸类底物出峰时间均不与它们重合。HPLC图谱如图4。
实施例1：酶表达质粒的构建
由于核糖核苷单磷酸中含有5’-磷酸核糖基，若能将5’-磷酸核糖基水解下来，即可得到ψ生产所需的底物R5P。已知大肠杆菌中嘧啶/嘌呤核苷酸5'-单磷酸核苷酶(PpnN)能够催化各种嘧啶和嘌呤核苷酸5'-单磷酸的N-糖苷键水解，从而形成5-磷酸核糖和相应的游离碱，可使用AMP、GMP、IMP、CMP和UMP作为底物，PpnN催化NMP水解的反应式如图5所示。AMP核苷酶(Amn)能够催化AMP的N-糖苷键水解，形成腺嘌呤和5-磷酸核糖，反应式如图6所示。
分别将大肠杆菌中嘧啶/嘌呤核苷酸5'-单磷酸核苷酶编码基因ppnN和AMP核苷酶编码基因amn构建至pET28a(武汉淼灵生物科技有限公司，货号P0023)，获得表达质粒pHJ20、pHJ21。
核糖核苷类产品中由于含有核糖基团，使用酶将其转化为NMP可以生产R5P。已知大肠杆菌的尿苷激酶(UdK)可催化尿苷(UdR)和胞苷(CdR)与腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)反应生成相应的UMP、CMP，从而用于与PpnN进一步水解生产R5P，反应式如图7所示。将大肠杆菌中的尿苷激酶编码基因udK构建至pET28a，构建的表达质粒为pHJ23。
核糖核苷类产品经磷酸化酶加磷酸水解产生1-磷酸核糖，而大肠杆菌中含有的磷酸戊糖变位酶(DeoB)可以将戊糖的C1和C5碳原子之间的磷转移从而形成5-磷酸核糖，反应式如图8-9所示。本发明同时构建了作用于UdR磷酸化的UdP表达质粒pHJ22、作用于Ado、Guo、Ino、Xao磷酸化的DeoD表达质粒pHJ24，以及磷酸戊糖变位酶表达质粒pHJ25。
R5P与尿嘧啶(Uracil)通过假尿苷-5'-磷酸糖苷酶的作用生成ψ，本发明构建的表达质粒pHJ26选自大肠杆菌自身的假尿苷-5'-磷酸糖苷酶编码基因yeiN。各表达质粒的信息具体如下表1所示。
表1质粒信息
质粒/菌株 详细信息
pHJ20 pET28a-amn
pHJ21 pET28a-ppnN
pHJ22 pET28a-udP
pHJ23 pET28a-udK
pHJ24 pET28a-deoD
pHJ25 pET28a-deoB
pHJ26 pET28a-yeiN
pHJ27 pET28a-udP-deoB
pHJ28 pET28a-deoD-deoB
pHJ29 pET28a-udK-ppnN
质粒构建具体过程如下：以pHJ20为例，以大肠杆菌W3110(ATCC27325)为模板，分别以引物pHJ20-F/pHJ20-R扩增amn片段，引物序列如表2所示，得到的PCR产物大小为1455bp，且电泳检测无杂带，直接进行过柱回收纯化(捷瑞胶回收纯化试剂盒)，得到的纯化片段与NcoI/HindIII酶切回收的pET28a载体片段以纳摩尔比3:1进行无缝克隆构建(苏州神洲基因GBclonart无缝克隆试剂盒)，重组克隆反应液于45℃水浴锅温浴30min，然后转移到冰上放置5min，转入TG1化转感受态细胞，42℃热击2min，冰浴2min后加入800μL复苏培养基LB，复苏培养1h后离心涂布含50mg/L卡那霉素抗性的LB平板，次日挑取克隆培养过夜，提取质粒进行酶切验证，最终构建得到质粒pHJ20。将构建的所有表达质粒转化至宿主BL21(DE3)中用于酶表达。
表2质粒构建引物序列
实施例2：用Amn酶液进行以AMP为底物的ψ生产
按照实验方法一的描述将带有不同质粒的重组菌株进行过表达，获得Amn、YeiN酶液。以AMP和Uracil为底物，进行反应，具体如图10所示。其催化反应体系为：在3mL反应液中加入底物AMP水合物，使其终浓度为2g/L，加入Uracil 1g/L，并加入Amn酶液100μL，YeiN酶液300uL，同时加入终浓度0.3mM MgCl2、MnSO4、二硫苏糖醇(DTT)、KCl，缓冲液25mM pH7.0的HEPES，于37℃水浴锅中搅拌反应24h，按照实验方法2所述的制样方法，取不同时间点的反应液检测是否有ψ生成，检测结果见图11，以AMP水合物为底物，利用Amn和YeiN进行一锅法反应可以生成产物ψ，反应24h可以产生260mg/L的ψ。
实施例3：用PpnN酶液进行以各类核糖核苷单磷酸为底物的ψ生产
由于嘧啶/嘌呤核苷酸5'-单磷酸核苷酶PpnN能够催化各种嘧啶和嘌呤核苷酸5'-单磷酸的N-糖苷键水解，从而形成核糖5-磷酸和相应的游离碱，因此本发明选用PpnN与YeiN进行反应，比较催化不同核糖核苷单磷酸的效果。
实验步骤：
按照实验方法一的描述将带有ppnN表达质粒的重组菌株进行过表达，获得PpnN酶液。分别以AMP、UMP、CMP、IMP、GMP和Uracil为底物，进行反应，具体过程如图12所示，其中，UMP催化产物中有Uracil，反应体系中没有外源加入Uracil。
催化反应体系为：在3mL反应液中加入底物AMP水合物，使其终浓度为2g/L，加入Uracil 1g/L，并加入Amn酶液100μL，YeiN酶液300uL，同时加入终浓度0.3mM MgCl2、MnSO4、二硫苏糖醇(DTT)、KCl，缓冲液25mM pH7.0的HEPES，于37℃水浴锅中搅拌反应24h，按照实验方法2所述的制样方法，取不同时间点的反应液检测是否有ψ生成。
实验结果：
检测结果见图13，以不同的核糖核苷单磷酸为底物，PpnN都能催化产生R5P，进而与Uracil反应最终产生ψ，但是以UMP产生的ψ量最多，过夜检测积累ψ约350mg/L，其次为CMP反应体系，IMP为底物的反应体系中产生的ψ最少，这可能是一方面PpnN酶液对不同核糖核苷单磷酸的催化活性不同，另一方面，由于宿主菌BL21(DE3)中并没有敲除相关底物的降解基因，使得底物在反应过程中有降解。
实施例4：Uracil过量添加推动反应向右进行
实施例3中以UMP为反应底物，不外源添加Uracil也可以产生最多的ψ，而假尿苷单磷酸糖苷酶YeiN的催化反应是双向的，假尿苷单磷酸的降解平衡常数很低，约为2.3×10- 4M，如果R5P和Uracil的底物足够，则更有利于合成反应。
本专利在实施例3的UMP反应体系中，外源分别加入了500mg/L、1g/L、1.5g/L、2g/L的Uracil，分析Uracil的含量对催化反应的影响。
检测结果见图14，在UMP的反应体系中，外源添加过量的Uracil有利于反应向右进行，2g/L的底物添加1.5g/L Uracil产生的ψ最多，高达800mg/L，即UMP与Uracil的最佳摩尔添加比例为1:2.2。
实施例5：以UdR、CdR进行反应
已知大肠杆菌的尿苷激酶(UdK)可催化UdR和CdR与ATP反应生成相应的UMP、CMP，可以用于与PpnN进一步水解生产R5P，反应路线如图15所示。
按照实验方法一的方法将带有udk，ppnN表达质粒的重组菌株进行过表达，获得UdK、PpnN酶液。
分别以UdR、CdR为底物，其催化反应体系为：在3mL反应液中加入8mM底物UdR/CdR，加入ATP、Uracil，使其终浓度为10mM，并加入UdK酶液100μL，PpnN酶液100uL，YeiN酶液300uL，同时加入终浓度0.3mM MgCl2、MnSO4、二硫苏糖醇(DTT)、KCl，缓冲液25mM pH7.0的HEPES，于37℃水浴锅中搅拌反应24h，进行反应，按照实验方法2所述的制样方法，取不同时间点的反应液进行HPLC检测。
结果见表3(UdK+PpnN+YeiN)，UdR的反应体系中24h可以产生约700mg/Lψ，CdR体系中也有500mg/L产物积累，表明该方法可以制备ψ，设计的反应路线可行。
近一步地，为了方便反应进行，按照实施例1的方法将基因udk、ppnN串联构建至载体pET28a，获得质粒pHJ29，如表1中所示，并将质粒转化宿主BL21(DE3)构建重组微生物，用新表达的酶液(UdK-PpnN+YeiN)进行反应可以达到同等效果，实验结果如下表3所示。
表3三酶与双酶反应比较
实施例6：利用磷酸戊糖变位酶进行ψ生产
已知大肠杆菌中含有的磷酸戊糖变位酶(DeoB)可以将戊糖的C1和C5碳原子之间的磷转移从而形成5-磷酸核糖，据此，通过外源加入磷酸供体，经由磷酸化酶加磷酸水解产生1-磷酸核糖，再变位形成R5P。本专利开发的生产路线如图16-17所示。
按照实施例1的方法分别构建了特异性作用于UdR的磷酸化酶(UdP)表达质粒pHJ22，能够作用嘌呤核苷的磷酸化酶(DeoD)表达质粒pHJ24，以及催化R1P转化为R5P的变位酶(DeoB)表达质粒pHJ25，质粒转化宿主BL21(DE3)，表达的相关酶液进行反应验证。
UdP酶液的反应体系中，以终浓度5mM的UdR为底物，缓冲液为25mM pH7.8的磷酸钾盐，外源加入终浓度为11mM的Uracil作为辅底物，并加入UdP酶液100uL，DeoB酶液150uL，YeiN酶液300uL，同时加入终浓度0.3mM MgCl2、MnSO4、二硫苏糖醇(DTT)、KCl，于37℃水浴锅中搅拌反应24h，按照实验方法2进行HPLC检测。
结果如图18所示，5mM UdR反应过夜基本实现完全转化，产生1.16g/L的ψ，得率为95％，结果表明，用磷酸戊糖变位酶进行R5P的生产方法可行。
DeoD酶可作用于各类嘌呤核苷，因此分别以终浓度5mM的Ado、Guo、Ino、Xao为底物进行反应，缓冲液为25mM pH7.8的磷酸钾盐，外源加入终浓度为11mM的Uracil作为辅底物，加入DeoD酶液100uL，DeoB酶液150uL，YeiN酶液300uL，同时加入终浓度0.3mM MgCl2、MnSO4、二硫苏糖醇(DTT)、KCl，于37℃水浴锅中搅拌反应24h，按照实验方法2进行HPLC检测。
结果如图18，用DeoD、DeoB、YeiN三种酶进行反应也可以生产ψ，其中DeoD催化底物Ado的活性最高，24h可以积累888mg/L的ψ，得率72％。
实施例7：deoD、udP与deoB串表达
为了简化反应体系，按照实施例1的方法将基因deoD、deoB串联构建至载体pET28a，获得质粒pHJ27，如表1所示，将基因udP、deoB串联构建至载体pET28a，获得质粒pHJ28，如表1所示，并将质粒转化宿主BL21(DE3)构建重组微生物，用新表达的酶液进行实施例6中的反应验证。
检测结果如下表4所示，udp-deoB串表达(UdP-DeoB+YeiN)后的反应效果与同时加入UdP酶、DeoB酶和YeiN酶(UdP+DeoB+YeiN)的反应效果相当，而deoD-deoB串表达的酶液反应效果低于同时加入DeoD酶、DeoB酶和YeiN酶(DeoD+DeoB+YeiN)的反应效果，可能是deoD的表达不高影响了下游deoB基因的表达。
表4DeoB单表达和串表达酶液反应比较
对比例1
专利CN112592880B中使用的是全细胞生物转化法，和本专利的酶催化不同，是在发酵培养基中加入尿苷作为单一底物转化。
与实施例6(最佳实施例)的区别在于，酶不同，具体为加入PumH酶液100uL，PumJ酶液150uL，其余皆相同。
实验结果：10g/L初始UdR发酵96h转化产生7g/L的ψ，得率为70％。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种酶法生产假尿苷的方法，其特征在于，所述的方法为以核糖核苷为底物，加入酶进行催化反应，生成5-磷酸核糖，5-磷酸核糖与尿嘧啶进行反应，再经过去磷酸化，得到假尿苷；所述的酶包括磷酸化酶和磷酸戊糖变位酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的底物还包括核糖核苷单磷酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酶还选自尿苷激酶、嘧啶/嘌呤核苷酸5'-单磷酸核苷酶、磷酸戊糖变位酶、嘌呤核苷磷酸化酶、AMP核苷酶中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的5-磷酸核糖与尿嘧啶进行反应，再经过去磷酸化，得到假尿苷的反应路线如下所示：
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的核糖核苷选自尿苷、胞苷、腺苷、鸟苷、肌苷、黄嘌呤核苷中的一种或多种。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，以核糖核苷单磷酸为底物，所述的核糖核苷单磷酸选自胞嘧啶单磷酸核苷、尿嘧啶单磷酸核苷、腺嘌呤单磷酸核苷、次黄嘌呤单磷酸核苷、鸟嘌呤单磷酸核苷中的一种或多种，加入嘧啶/嘌呤核苷酸5'-单磷酸核苷酶进行催化反应，得假尿苷。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，以核糖核苷单磷酸为底物，所述的核糖核苷单磷酸为腺嘌呤单磷酸核苷，加入AMP核苷酶进行催化反应，得假尿苷。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以核糖核苷为底物，所述的核糖核苷为尿苷和/或胞苷，加入尿苷激酶和嘧啶/嘌呤核苷酸5'-单磷酸核苷酶进行催化反应，得假尿苷。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以核糖核苷为底物，所述的核糖核苷为尿苷，加入尿苷磷酸化酶和磷酸戊糖变位酶进行催化反应，得假尿苷。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以核糖核苷为底物，所述的核糖核苷为腺苷、鸟苷、肌苷、黄嘌呤核苷中的一种或多种，加入嘌呤核苷磷酸化酶和磷酸戊糖变位酶进行催化反应，得假尿苷。
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