CN113373100A - 一种嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌及应用 - Google Patents

一种嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌及应用，将嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶基因导入宿主大肠杆菌中进行串联表达获得嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌，并将该嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌应用于核苷类似物的中试及规模化的绿色转化，采用本发明的嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶制备阿糖核苷类药物，底物广谱，底物转化率高，产物易于纯化，反应条件温和，产物成分较为单一，副产物较少。

Description

一种嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌及应用
技术领域
本发明属于生物医药工程技术领域，具体涉及一种嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌及应用。
背景技术
嘌呤核苷磷酸化酶（Purine nucleoside phosphorylase，简称PNPase）广泛存在于真核生物和原核生物中，是嘌呤补救合成途径的关键酶之一，能够可逆地催化嘌呤核苷（或脱氧核苷）发生磷酸化反应生成核糖（或脱氧核糖）-1-磷酸和对应的嘌呤碱基。细菌的PNPase作用底物广泛，己被用于合成阿糖腺苷，利巴韦林，5-甲基尿苷等一系列核苷类物质。
尿苷磷酸化酶（UPase）属于嘧啶磷酸化酶，能够可逆性地催化尿苷形成尿嘧啶。已被用于合成2´-氟尿苷，脱氧氟尿苷等，脱氧氟尿苷是一种良好的抗代谢类抗肿瘤药物，在肿瘤细胞内受肿瘤组织中嘧啶核苷磷酸化酶的作用而转化为真正起作用的5-氟尿嘧啶。
嘌呤核苷磷酸化酶单独作用时可合成腺苷、三氮唑核苷及其类似物；尿苷磷酸化酶单独作用时可以合成尿苷及其类似物，其中5-氟尿苷是重要的抗肿瘤药物。当嘌呤核苷与嘧啶核苷之间相互转化时，需要PNPase和UPase共同参与反应，可合成腺苷、肌苷、尿苷、鸟苷及其类似物等核苷类化合物，实现多种核苷类似物的定向酶促转化。例如以阿糖尿苷和腺嘌呤为底物合成阿糖腺苷，及以阿糖尿苷（ara-U）和2,6-二氨基嘌呤为底物合成阿糖2,6-二氨基嘌呤核苷（ara-DA）。阿糖腺苷是一种天然抗病毒化合物，具有广谱的抗疱疹和嗜肝DNA病毒活性，同时还有抑制乙肝病毒复制的作用。
磷酸化酶在野生菌株中含量较少或活性较低，现有技术中完成嘧啶或嘌呤核苷转化的一种方法是通过构建单一酶的过表达菌株，并结合工程菌自身本底表达的另一种磷酸化酶完成，但受本底表达的低活性酶限制而无法工程化应用；另一种方法是通过偶联两种工程菌株来完成，但涉及底物和中间代谢产物在菌株之间的传递，且需考察酶活性及菌种的比例协同，步骤繁琐，回收率低，成本较高。因此，该技术利用基因工程手段构建两种酶串联表达的工程菌株，利用两种酶的协同作用进行核苷类化合物的定向转化合成，突破单一酶催化的底物局限性和可逆性。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌，并将该嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌应用于核苷类似物的中试及规模化的绿色转化，采用本发明的嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶制备阿糖核苷类药物，底物广谱，底物转化率高，产物易于纯化，反应条件温和，产物成分较为单一，副产物较少。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌，其特征在于：将嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶基因导入宿主大肠杆菌中进行串联表达获得嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌，该嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌为U-P-P(BL21(DE3)-pETDuet-1-deoD-udp) Escherichia coli U-P-P(pETDuet-1-deoD-udp)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年9月10日，保藏编号为CCTCC NO：M 2019706。
进一步限定，所述嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶编码基因源于大肠杆菌，其表达载体包括但不局限于pACYCDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1或pRSFDuet-1，所述大肠杆菌为以下任意一种：DH5α、BL21(DE3)或MG1655。
本发明所述的嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌的构建方法，其特征在于：利用扩增或限制酶克隆或化学合成技术克隆PNPase和UPase基因，并将它们先后克隆到目标质粒中相应位点得到PNPase和UPase可共同高表达的表达载体，再将此表达载体转入大肠杆菌即构建嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌。
本发明所述的嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶的表达方法，其特征在于：将重组嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌种子培养物按接种量1wt%-5wt%转接到液体LB(Amp+)培养基中，于37 ºC培养至对数期，再加入IPTG或乳糖至终浓度为0.01-0.5 mM，诱导5-10 h得到嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶。
本发明所述的嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶催化核苷类化合物合成阿糖核苷类化合物的应用，其中核苷类化合物包括但不限于胞苷、腺苷、鸟苷或尿苷中的一种或多种。
本发明所述的嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶催化核苷类化合物合成阿糖核苷类化合物的应用，其特征在于具体过程为：在反应体系中，嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶用量为1wt%-10wt%，反应底物浓度为20-100 mM，反应条件为pH 3.0-9.0，温度30-70 ℃，反应时间2 h。
进一步限定，所述嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶包括纯酶、粗酶液、悬浮细胞或固定化细胞中的一种或多种。
进一步限定，所述反应条件通过缓冲溶液调节反应体系的pH 3.0-9.0，该缓冲溶液包括但不限于磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液或MOPS缓冲液中的一种或多种。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：本发明在宿主大肠杆菌中串联表达内源的PNPase和UPase编码基因，获得两种磷酸化酶串联高表达工程菌株为U-P-P(BL21(DE3)-pETDuet-1-deoD-udp) Escherichia coli U-P-P(pETDuet-1-deoD-udp)（菌株保藏号：CCTCC NO: M 2019706），利用该嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌实现多种脱氧核苷和阿拉伯糖核苷类似物的催化转化，转化率均超过90%。
附图说明
图1为PCR扩增得到目的基因条带图。
图2为空载、E. coli (deoD)质粒、E. coli (deoD-udp)质粒用限制性内切酶BamH I和KpnI进行双酶切后酶切结果。M为DNA marker10000，M’为DNA marker2000，1为空载，2为E. coli (deoD)质粒，3为E. coli (deoD-udp)质粒。
图3为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图。M为双色预染蛋白Marker，1为E. coli诱导后粗酶液，2为E. coli（空载）诱导后粗酶液，3为E. coli（udp）诱导后粗酶液，4为E. coli(deoD) 诱导后粗酶液，5为E. coli (deoD-udp) 诱导后粗酶液。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
构建嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联高表达工程菌
包括下列步骤：
步骤S1：提取细菌基因组
接种大肠杆菌于LB液体培养基，37 ℃过夜活化。对大肠杆菌进行基因组提取，步骤参照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒进行。
步骤S2：目的基因的扩增
根据Genbank中已有的deoD和udp基因设计引物，根据质粒pMD18-T和目标质粒的图谱设计酶切位点，以提取的基因组为模板，扩增目的片段。
50 μL扩增体系是：LA Taq酶0.5 μL、10×PCR缓冲液5 μL、dNTP 8 μL、基因DNA 1μL、引物各1 μL、ddH2O补充至50 μL。
扩增条件为：95 ℃预变性5 min，然后以下步骤进行31个的循环：95 ℃变性30 s，55 ℃退火1min，72 ℃延伸1.5 min；最后一个循环结束后，72 ℃再延伸10 min，保证PCR产物的完整性。因为deoD基因长度为720 bp，udp基因长度为765 bp，两基因长度大致相同，所以将两基因在同一条件下扩增。
通过扩增的产物，经琼脂糖电泳检测显示，存在目的片段，结果见图1。
步骤S3：克隆质粒制备与细菌转化
用琼脂糖凝胶电泳将目的基因分离后，采用TaKaRa mini BEST Agarose Gel DNAExtraction Kit Ver.4.0试剂盒对目的条带进行回收纯化。
根据纯化后的DNA浓度计算体积，将目的基因与质粒pMD18-T进行16 ℃过夜连接，连接体系如下。
总体积10 μL：deoD/udp片段1.5 μL，pMD18-T 1 μL，Solution I 5 μL，ddH2O 3 μL。
将连接体系转化进感受态细胞DH5α中，具体步骤如下：
（1）将连接体系10 μL加入感受态细胞中。
（2）冰上放置15 min，42 ℃热激90 s，热激后立即放置冰上5 min，加入LB液体培养基800 μL，37 ℃摇床培养50 min，使菌体复苏。
（3）取200 μL菌液涂布LB（Amp+）平板，平板已提前涂布好40 μL的X-Gal，7 μL的IPTG，37 ℃过夜培养，进行蓝白斑筛选。
步骤S4：目标质粒-deoD制备与转化
挑取LB（Amp+）平板的白色单菌落进行LB（Amp+）液体培养，一部分菌液进行测序（测序由通用生物系统有限公司完成，下同），一部分菌液采用TIAN pure Mini Plasmid Kit试剂盒进行质粒提取。
对pMD18-T-deoD、目标质粒进行DNA双酶切，使得目的片段deoD与目标质粒具有相同的黏性末端，双酶切体系如下：QCut Buffer 5 μL、EcoR I 2 μL、Hind III 2 μL、质粒41μL。
混合体系分别于37 ℃反应3 h后，进行琼脂糖凝胶电泳，对目的片段进行切胶回收。
分别将已纯化的DNA片段deoD与目标质粒进行连接与转化，连接体系如下：T4DNA连接酶 1μL、10×T4DNA连接酶缓冲液2 μL、deoD 3 μL、目标质粒14 μL（deoD与目标质粒体积可根据浓度做相应调整）。将连接体系于16 ℃过夜连接。
取反应后的连接体系10 μL转化进感受态细胞中，涂布LB（Amp+）平板。
随机挑选LB（Amp+）平板的单菌落接种LB（Amp+）液体，于37 ℃培养后，一部分菌液送往通用生物系统（安徽）有限公司进行测序，一部分菌液进行质粒提取。
步骤S5：目标质粒-deoD -udp制备与转化
对目标质粒-deoD、pMD18-T-udp进行DNA双酶切，使得目的片段udp与目标质粒具有相同的黏性末端，双酶切体系如下：QCut Buffer 5 μL、Kpn I 2 μL、NdeⅠ2 μL、质粒41 μL。混合体系于37 ℃反应3 h后，进行琼脂糖凝胶电泳，对目的片段进行切胶回收。
将回收后的DNA片段目标质粒-deoD和udp进行16 ℃过夜连接，连接产物转化进感受态细胞中，涂布LB（Amp+）平板。
随机挑选LB（Amp+）平板的单菌落接种LB（Amp+）液体，于37 ℃培养后，一部分菌液进行测序，一部分菌液进行质粒提取。分别对目标质粒、目标质粒-deoD、目标质粒-deoD - udp用限制性内切酶BamH I和Kpn I进行双酶切，酶切结果用琼脂糖凝胶电泳进行验证，结果见图2。工程菌株保藏于武汉大学菌种保藏中心（保藏号：CCTCC NO: M 2019706）
实施例2
蛋白表达
具体步骤如下：
步骤S1：工程菌的诱导
将工程菌E. coli (deoD)、E. coli (udp)、E. coli (deoD-udp)接种于LB（Amp+）液体，于37 ºC培养，同时接种原始菌株和含空载的原始菌株作为对照。
对五株菌以1wt%接种量接种LB或者LB（Amp+）液体，于37 ℃培养，待菌液长到对数前期时，加入IPTG或乳糖至终浓度为0.01-0.5 mM，25-40 ℃诱导5-10 h。
步骤S2：粗酶液的制备
将诱导的菌液用50 mL离心管以6000 rpm离心5 min，弃上清，收集菌体，用pH7.5的50 mM Tris-HCl 缓冲液清洗2-3遍。
称取0.1 g湿菌体于离心管中，加入1 mL Tris-HCl 缓冲液重悬菌液，用超声波细胞破碎仪破碎菌体，待菌液澄清后，12000 rpm离心2 min后收集上清，加入纯甘油至终浓度为10wt%于-80 ℃保存。
步骤S3：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
首先制备12wt%分离胶，待胶凝固后，灌注5wt%浓缩胶，并插上梳子，待胶凝固。将16 μL粗酶液与4 μL 5×上样缓冲液混合后，沸水浴5 min，取10 μL混合液上样。电泳结果如图3。
实施例3
酶活检测
步骤S1：PNPase酶活检测
反应体系如下：2.5 mL反应液（20 mM肌苷、100 mM磷酸二氢钾，pH 7.0，10wt%粗酶液），60 ℃反应10 min，加入2 mL 4 ℃预冷的1 M氢氧化钠终止反应。
反应结果用HPLC检测产物次黄嘌呤，色谱条件如下：Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相是KH2PO4缓冲液（pH 4.0 50 mM）：甲醇=92:8，流速：1.0 ml/ min；柱温：20 ℃；检测波长：259 nm；进样量：20 μL。分别制备浓度梯度为5 mM、10mM、15 mM、20 mM、25 mM的次黄嘌呤标品溶液，检测不同浓度对应的峰面积，建立浓度与峰面积的线性回归方程。根据回归方程建立酶活力计算公式。该酶活力定义为上文所述反应条件下，将每分钟生产1 μmol次黄嘌呤所需的酶量定义为一个酶活单位。
Figure RE-892891DEST_PATH_IMAGE001
其中：
S：产物峰面积；
V：反应液体积(mL)；
t：反应时间(min)；
m：菌体质量或酶的体积(mg或mL)。
步骤S2：UPase酶活检测
反应体系如下：2.5 mL反应体系（20 mM尿苷、100 mM KH2PO4，pH7.0，10wt%粗酶液），60 ℃反应10 min，加入2 mL 4 ℃预冷的1 M氢氧化钠终止反应。
酶活单位U定义为：在上述条件下，每分钟酶液在290 nm处吸光值上升0.001定义为酶的一个活力单位。
Figure RE-672628DEST_PATH_IMAGE002
ΔOD290：为样品OD290数值与空白对照的差值；
K：在比色皿中菌液的稀释倍数；
V：反应液体积；
T：测定酶活反应的反应时间。
步骤S3：ara-U转化率检测
反应体系如下：2.5 mL反应液（20-100 mM ara-U、20-100 mM 2,6-二氨基嘌呤、60mM磷酸二氢钾，pH 7.0），1wt% -10wt%的菌种量于30-70 ℃反应2 h，加入2 mL 4 ℃预冷的1 M氢氧化钠终止反应。反应结果用HPLC检测，色谱条件如下：Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相是KH2PO4缓冲液（pH 4.0 50 mM）：甲醇=92:8，流速：1.0 ml/ min；柱温：20 ℃；检测波长：259 nm；进样量：20 μL。
建立ara-DA标曲，根据标曲计算ara-DA生成量，建立转化率计算方程：
ara-DA标曲: 峰面积 = 90.881×浓度-158.11 （R2 = 0.9981）
ara-U转化率（%）=ara-DA摩尔浓度（mM）/ara-U初始摩尔浓度（mM）×100%
酶活性测定显示E.coli(deoD-udp)菌株的UP酶活是原始菌株的7.73倍，PNP酶活是原始菌株的10.30倍。另外U-P-P菌株在生成氟腺苷的反应中对底物转化率达到66.33%，是原始菌株的7.08倍。
实施例4
利用悬浮细胞催化合成ara-DA
具体步骤如下：
反应体系：50 L反应釜（1 -12 M ara-U、1-30 mM 2,6-二氨基嘌呤、60 mM磷酸二氢钾，pH 7.0，补充纯水至50 L）；湿菌体10%；反应温度：30-70 ºC；搅拌速率：100-300 rpm。
分别在反应2 h、4 h、8 h和12 h取样检测的ara-U和ara-DA含量。结果显示，嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶共表达工程菌株对ara-U的转化率在12 h时达到最高，为95%。
以上实施例描述了本发明的主要特征及应用，但本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，包括嘌呤核苷及类似物和嘌呤碱基、嘧啶碱基之间，嘧啶核苷及类似物和嘌呤碱基、嘧啶碱基之间的酶催化转化，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

Claims (8)

1.一种嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌，其特征在于：将嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶基因导入宿主大肠杆菌中进行串联表达获得嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌，该嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌为U-P-P(BL21(DE3)-pETDuet-1-deoD-udp)Escherichia coli U-P-P(pETDuet-1-deoD-udp)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年9月10日，保藏编号为CCTCC NO：M 2019706。
2.根据权利要求1所述的嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌，其特征在于：所述嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶编码基因源于大肠杆菌，其表达载体包括但不局限于pACYCDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1或pRSFDuet-1，所述大肠杆菌为以下任意一种：DH5α、BL21(DE3)或MG1655。
3.一种权利要求1或2所述的嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌的构建方法，其特征在于：利用扩增或限制酶克隆或化学合成技术克隆PNPase和UPase基因，并将它们先后克隆到目标质粒中相应位点得到PNPase和UPase可共同高表达的表达载体，再将此表达载体转入大肠杆菌即构建嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌。
4.一种权利要求1或2所述的嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶的表达方法，其特征在于：将重组嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌种子培养物按接种量1wt%-5wt%转接到液体LB(Amp+)培养基中，于37 ºC培养至对数期，再加入IPTG或乳糖至终浓度为0.01-0.5 mM，诱导5-10 h得到嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶。
5.权利要求4所述的嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶催化核苷类化合物合成阿糖核苷类化合物的应用，其中核苷类化合物包括但不限于胞苷、腺苷、鸟苷或尿苷中的一种或多种。
6.权利要求4所述的嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶催化核苷类化合物合成阿糖核苷类化合物的应用，其特征在于具体过程为：在反应体系中，嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶用量为1wt%-10wt%，反应底物浓度为20-100 mM，反应条件为pH 3.0-9.0，温度30-70 ℃，反应时间2 h。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶包括纯酶、粗酶液、悬浮细胞或固定化细胞中的一种或多种。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述反应条件通过缓冲溶液调节反应体系的pH 3.0-9.0，该缓冲溶液包括但不限于磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液或MOPS缓冲液中的一种或多种。
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