CN113106080A - 烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用 - Google Patents

烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用。本申请的第一方面，提供烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，该烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体包括如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列发生突变后的氨基酸序列，突变包括第202位缬氨酸突变为丙氨酸、第364位亮氨酸突变为脯氨酸中的至少一种。根据本申请实施例的烟酰胺磷酸核糖转移酶，至少具有如下有益效果：与现有烟酰胺磷酸核糖转移酶相比，本申请实施例所提供的烟酰胺磷酸核糖转移酶相比于常规野生型的烟酰胺磷酸核糖转移酶具有更高的酶活，能够高效催化转化含烟酰胺和5‑磷酸核糖‑1‑焦磷酸的底物为NMN。

Description

烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用
技术领域
本申请涉及酶工程技术领域，尤其是涉及烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用。
背景技术
烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide，NMN)是烟酰胺磷酸核糖转移酶与烟酰胺等反应的产物，同时是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adeninedinucleotide，NAD+)的关键前体之一。NMN在人体内通过转化为NAD+来发挥其生理功能，如激活NAD+底物依赖性酶Sirt1(组蛋白脱乙酰酶，又称沉默调节蛋白)、调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等。由于NAD+分子量过大，无法通过口服摄取至细胞内，主要依赖于体内细胞的合成，而且合成量很低。但随着对NAD+前体小分子物NMN的研究发现，食用NMN可以有效提升体内NAD+的含量，对心脑血管疾病、神经退行性病及老化退行性疾病等有较好的治疗和修复作用；另外，NMN还可通过参与和调节机体的内分泌，起到保护和修复胰岛功能，增加胰岛素的分泌，防治糖尿病和肥胖等代谢性疾病的作用。
随着对NMN的药用和保健作用研究的增加，对NMN的市场需求日益增长。目前NMN在欧、美、日等发达国家已批准作为保健食品原料，并以NMN为主要成份开发出多种保健品，如美国HERBALmax、基因港GeneHarbor NMN9000、日本MIRAI LAB NMN3000胶囊、澳大利亚synext等。NMN的体外制备方法目前以化学合成为主，比如，2002年，Tanimori等人用乙酰基保护的核糖与烟酰胺在三甲硅基三氟甲磺酸脂(TMSOTf)的催化下发生缩合反应；又比如2004年Palmarisa等人使用硅烷化试剂对烟酰胺进行硅烷化，然后与乙酰核糖在TMSOTf的催化下进行反应。这些化学合成方法存在杂质过多，分离纯化极其困难，成本高、收率低而且化学试剂污染严重等问题。
因此，生物转化制备NMN已经成为各大医药公司竞争的研究热点。以烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)催化转化包含烟酰胺核糖和5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)的底物为NMN是一种绿色环保的生物催化方法。然而，现有报道的野生型烟酰胺磷酸核糖转移酶的的酶活普遍较低，导致生产成本过高，市场竞争力较小，严重限制了该工艺的工业应用。
发明内容
本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种酶活更高的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用。
本申请的第一方面，提供烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，该烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体包括如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列发生突变后的氨基酸序列，突变包括第202位缬氨酸突变为丙氨酸、第364位亮氨酸突变为脯氨酸中的至少一种。
根据本申请实施例的烟酰胺磷酸核糖转移酶，至少具有如下有益效果：
与现有烟酰胺磷酸核糖转移酶相比，本申请实施例所提供的烟酰胺磷酸核糖转移酶相比于常规野生型的烟酰胺磷酸核糖转移酶具有更高的酶活，能够高效催化转化含烟酰胺和5-磷酸核糖-1-焦磷酸的底物为NMN。
其中，SEQ ID No.1所示的氨基酸序列第202位缬氨酸突变为丙氨酸后的氨基酸序列如下所示：
MNQNLLLMTDSYKASHWLQYPEGTTKIYSYIESRGGKYPETLFFGLQYLLRILEKGINEEDVWEADAFFEVHGVPFNLDGFLYIMNEHDGKLPVEIKAIAEGSVVPAHTPLLTIENTDPSCYWLTCYLETMLLRVWYPTTVATRSWYAKKIIKTYLDQTADDSEAELPSKLHDFGARGASSHESAAIGGMAHLVNFTGSDTAEGVILANKVYKCDMAAFSIPAAEHSTITAWGKENEVEAYRNMLKQFAKPNSLMAVVSDSYDIYNAVENIWGEELRQEVVDSGATIVIRPDSGHPPEIVSKVVKILDEKFGSTENSRGYRVLDNVRVIQGDGVDLDMIHEILDKLKNEGYSASNIAFGMGGYLLQKLNRDTQKFAMKCSYAKVNGKGRDVFKEPVTDKGKTSKRGRINNSLLETVFLDGEIVKEYTLDQVREKAARALE(SEQ IDNo.2)；
SEQ ID No.1所示的氨基酸序列第364位亮氨酸突变为脯氨酸后的氨基酸序列如下所示：
MNQNLLLMTDSYKASHWLQYPEGTTKIYSYIESRGGKYPETLFFGLQYLLRILEKGINEEDVWEADAFFEVHGVPFNLDGFLYIMNEHDGKLPVEIKAIAEGSVVPAHTPLLTIENTDPSCYWLTCYLETMLLRVWYPTTVATRSWYAKKIIKTYLDQTADDSEAELPSKLHDFGARGASSHESAAIGGMAHLVNFTGSDTVEGVILANKVYKCDMAAFSIPAAEHSTITAWGKENEVEAYRNMLKQFAKPNSLMAVVSDSYDIYNAVENIWGEELRQEVVDSGATIVIRPDSGHPPEIVSKVVKILDEKFGSTENSRGYRVLDNVRVIQGDGVDLDMIHEILDKLKNEGYSASNIAFGMGGYPLQKLNRDTQKFAMKCSYAKVNGKGRDVFKEPVTDKGKTSKRGRINNSLLETVFLDGEIVKEYTLDQVREKAARALE(SEQ IDNo.3)；
SEQ ID No.1所示的氨基酸序列第202位缬氨酸突变为丙氨酸、第364位亮氨酸突变为脯氨酸后的氨基酸序列如下所示：
MNQNLLLMTDSYKASHWLQYPEGTTKIYSYIESRGGKYPETLFFGLQYLLRILEKGINEEDVWEADAFFEVHGVPFNLDGFLYIMNEHDGKLPVEIKAIAEGSVVPAHTPLLTIENTDPSCYWLTCYLETMLLRVWYPTTVATRSWYAKKIIKTYLDQTADDSEAELPSKLHDFGARGASSHESAAIGGMAHLVNFTGSDTAEGVILANKVYKCDMAAFSIPAAEHSTITAWGKENEVEAYRNMLKQFAKPNSLMAVVSDSYDIYNAVENIWGEELRQEVVDSGATIVIRPDSGHPPEIVSKVVKILDEKFGSTENSRGYRVLDNVRVIQGDGVDLDMIHEILDKLKNEGYSASNIAFGMGGYPLQKLNRDTQKFAMKCSYAKVNGKGRDVFKEPVTDKGKTSKRGRINNSLLETVFLDGEIVKEYTLDQVREKAARALE(SEQ IDNo.4)。
本申请的第二方面，提供分离的多核苷酸，该多核苷酸包括：
(A1)编码上述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的核苷酸序列；或
(A2)与(A1)的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
根据本申请的一些实施例，多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No.6～8所示：
atgaatcaaaatttgctactgatgactgacagctataaagcgtcacactggttgcaatatccagaggggaccacaaagatatattcttatatagaatctcgtggtggtaaatatccagaaacccttttctttggtttgcagtatttacttagaatattagagaagggaataaatgaagaagacgtttgggaagcagatgcattttttgaggtgcacggagtaccttttaatttagatgggttcctgtatatcatgaatgagcacgatggaaaacttcctgtggagatcaaggccattgcagagggtagtgtggttcctgcgcatactcctctgctaaccatagagaatacagatcccagttgttattggcttacctgttatctggagactatgctccttagggtctggtatcccacaacagtggccaccagaagctggtacgctaagaagataataaaaacatacttggaccaaacagcagatgactcagaagcagaactaccttccaaactccacgatttcggtgcaagaggcgcatccagccacgaatctgctgctattggtggcatggcacatctggtaaacttcacaggctcagatactgctgaaggtgtcatacttgcaaacaaagtatacaaatgtgatatggcggctttcagtattcctgctgcagagcacagcacaataactgcctggggaaaagaaaacgaagtcgaagcataccgaaatatgttaaaacagtttgcaaagccaaattctctgatggctgtagtatcagattcttacgacatctacaatgcagtagaaaatatctggggggaagaattacgtcaggaagtggtagacagcggtgcaaccatcgtaataagaccggacagtggacatcctcctgaaatagtgtccaaagtggtgaagatacttgacgagaaattcggcagcacagaaaactccagaggctacagggtgctcgataacgtccgtgtaatacagggagacggtgtcgacctggatatgatccatgaaatactggataaattaaaaaatgaaggttattcagccagcaacatagcatttggaatgggaggatatctactacaaaaattaaaccgggacacccaaaaattcgccatgaaatgcagttacgccaaggtaaatggcaaaggaagggatgtcttcaaagaaccagtaacagataaaggtaaaacctctaaaagaggtagaattaataattctttactggaaacagtgtttttagatggtgaaattgtgaaggagtataccttagatcaggtcagggagaaggctgctagagcactagag(SEQ ID No.6)；
atgaatcaaaatttgctactgatgactgacagctataaagcgtcacactggttgcaatatccagaggggaccacaaagatatattcttatatagaatctcgtggtggtaaatatccagaaacccttttctttggtttgcagtatttacttagaatattagagaagggaataaatgaagaagacgtttgggaagcagatgcattttttgaggtgcacggagtaccttttaatttagatgggttcctgtatatcatgaatgagcacgatggaaaacttcctgtggagatcaaggccattgcagagggtagtgtggttcctgcgcatactcctctgctaaccatagagaatacagatcccagttgttattggcttacctgttatctggagactatgctccttagggtctggtatcccacaacagtggccaccagaagctggtacgctaagaagataataaaaacatacttggaccaaacagcagatgactcagaagcagaactaccttccaaactccacgatttcggtgcaagaggcgcatccagccacgaatctgctgctattggtggcatggcacatctggtaaacttcacaggctcagatactgttgaaggtgtcatacttgcaaacaaagtatacaaatgtgatatggcggctttcagtattcctgctgcagagcacagcacaataactgcctggggaaaagaaaacgaagtcgaagcataccgaaatatgttaaaacagtttgcaaagccaaattctctgatggctgtagtatcagattcttacgacatctacaatgcagtagaaaatatctggggggaagaattacgtcaggaagtggtagacagcggtgcaaccatcgtaataagaccggacagtggacatcctcctgaaatagtgtccaaagtggtgaagatacttgacgagaaattcggcagcacagaaaactccagaggctacagggtgctcgataacgtccgtgtaatacagggagacggtgtcgacctggatatgatccatgaaatactggataaattaaaaaatgaaggttattcagccagcaacatagcatttggaatgggaggatatccactacaaaaattaaaccgggacacccaaaaattcgccatgaaatgcagttacgccaaggtaaatggcaaaggaagggatgtcttcaaagaaccagtaacagataaaggtaaaacctctaaaagaggtagaattaataattctttactggaaacagtgtttttagatggtgaaattgtgaaggagtataccttagatcaggtcagggagaaggctgctagagcactagag(SEQ ID No.7)；
atgaatcaaaatttgctactgatgactgacagctataaagcgtcacactggttgcaatatccagaggggaccacaaagatatattcttatatagaatctcgtggtggtaaatatccagaaacccttttctttggtttgcagtatttacttagaatattagagaagggaataaatgaagaagacgtttgggaagcagatgcattttttgaggtgcacggagtaccttttaatttagatgggttcctgtatatcatgaatgagcacgatggaaaacttcctgtggagatcaaggccattgcagagggtagtgtggttcctgcgcatactcctctgctaaccatagagaatacagatcccagttgttattggcttacctgttatctggagactatgctccttagggtctggtatcccacaacagtggccaccagaagctggtacgctaagaagataataaaaacatacttggaccaaacagcagatgactcagaagcagaactaccttccaaactccacgatttcggtgcaagaggcgcatccagccacgaatctgctgctattggtggcatggcacatctggtaaacttcacaggctcagatactgctgaaggtgtcatacttgcaaacaaagtatacaaatgtgatatggcggctttcagtattcctgctgcagagcacagcacaataactgcctggggaaaagaaaacgaagtcgaagcataccgaaatatgttaaaacagtttgcaaagccaaattctctgatggctgtagtatcagattcttacgacatctacaatgcagtagaaaatatctggggggaagaattacgtcaggaagtggtagacagcggtgcaaccatcgtaataagaccggacagtggacatcctcctgaaatagtgtccaaagtggtgaagatacttgacgagaaattcggcagcacagaaaactccagaggctacagggtgctcgataacgtccgtgtaatacagggagacggtgtcgacctggatatgatccatgaaatactggataaattaaaaaatgaaggttattcagccagcaacatagcatttggaatgggaggatatccactacaaaaattaaaccgggacacccaaaaattcgccatgaaatgcagttacgccaaggtaaatggcaaaggaagggatgtcttcaaagaaccagtaacagataaaggtaaaacctctaaaagaggtagaattaataattctttactggaaacagtgtttttagatggtgaaattgtgaaggagtataccttagatcaggtcagggagaaggctgctagagcactagag(SEQ ID No.8)。
本申请的第三方面，提供重组载体，该重组载体包括上述的多核苷酸。
根据本申请的一些实施例，所述重组载体为pET、pCW、pUC、pPIC9k中的任一种。
本申请的第四方面，提供宿主细胞，该宿主细胞包括上述重组载体，或上述多核苷酸。
根据本申请的一些实施例，该宿主细胞选自大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、链霉菌、枯草芽孢杆菌等本领域熟知的能够用于表达目的蛋白的真核或原核细胞。
本申请的第五方面，提供烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备方法，该制备方法包括以下步骤：培养上述的宿主细胞，获得培养物，从培养物中分离出烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体。
根据本申请的一些实施例，在分离出烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的粗酶液后，可以对其进行进一步的纯化以获得更高纯度的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体。
本申请的第七方面，提供烟酰胺单核苷酸的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
提供烟酰胺和5-磷酸核糖-1-焦磷酸作为第一底物；
将第一底物与上述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体接触，催化合成烟酰胺单核苷酸。
其中，提供烟酰胺和5-磷酸核糖-1-焦磷酸作为底物是指直接提供烟酰胺和5-磷酸核糖-1-焦磷酸，或者从降低成本出发，选择提供烟酰胺和/或5-磷酸核糖-1-焦磷酸的前体物质和其它对应的原料，通过酶促反应等方式得到烟酰胺和/或5-磷酸核糖-1-焦磷酸，在此基础上进一步通过上述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的催化下得到烟酰胺单核苷酸。后者的非限制性实例包括：以焦磷酸或焦磷酸盐以及单磷酸腺苷作为反应前体，在腺嘌呤磷酸核糖转移酶的催化作用下形成5-磷酸核糖-1-焦磷酸，并进一步与烟酰胺、烟酰胺磷酸核糖转移酶催化反应得到烟酰胺单核苷酸；以木糖、三磷酸腺苷作为反应前体，在磷酸核糖焦磷酸激酶、核糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-3-磷酸异构酶、木酮糖激酶、木糖异构酶等酶的催化作用下形成5-磷酸核糖-1-焦磷酸，并进一步与烟酰胺、烟酰胺磷酸核糖转移酶催化反应得到烟酰胺单核苷酸。另外，催化合成过程中所需的其它反应助剂或反应条件可以根据反应过程相应的合成步骤中所使用的酶的最适反应温度等条件进行相应的调整。
根据本申请的一些实施例，5-磷酸核糖-1-焦磷酸的制备包括以下步骤：
提供核糖-5-磷酸、焦磷酸供体作为第二底物；
将第二底物与磷酸核糖焦磷酸化酶接触，催化合成5-磷酸核糖-1焦磷酸。
其中，焦磷酸供体是指能够提供焦磷酸基团的反应原料，并且该反应原料能够在磷酸核糖焦磷酸化酶的催化作用下将焦磷酸基团转移到核糖-5-磷酸，从而得到5-磷酸核糖-1焦磷酸。其非限制性实例包括三磷酸腺苷和单磷酸腺苷的组、或三磷酸胞苷和单磷酸胞苷的组、或其它本领域熟知的能够提供相应的焦磷酸基团的反应原料。
根据本申请的一些实施例，核糖-5-磷酸的制备方法包括以下步骤：
提供核糖和磷酸供体作为第三底物；
将第三底物与核糖激酶接触，催化合成核糖-5-磷酸。
其中，磷酸供体是指能够提供磷酸基团的反应原料，并且该反应原料能够在核糖激酶的催化作用下将磷酸基团转移到核糖，从而得到核糖-5-磷酸。其非限制性实例包括三磷酸腺苷、三磷酸胞苷等。
根据本申请的一些实施例，烟酰胺单核苷酸的制备方法包括以下步骤：
(a)向反应器中加入包含第一底物的溶液，调节溶液的pH至7.0～7.5；
(b)向溶液中加入酶，得到反应体系；
(c)控制体系温度约为37℃，保持反应体系的pH在7.0～8.0之间，进行催化反应；
(d)得到含烟酰胺单核苷酸的粗溶液；
(e)将粗溶液过滤、纯化、干燥，得到烟酰胺单核苷酸。
根据本申请的一些实施例，烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体以及其它一些反应过程中所需的酶，以酶溶液、酶冻干粉、含酶细胞、固定化酶或固定化酶的细胞等其中至少一种形式参与催化反应。
本申请的第八方面，提供上述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，或上述多核苷酸，或上述重组载体，或上述宿主细胞在制备烟酰胺单核苷酸中的应用。
本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。
具体实施方式
以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。
下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。
在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
本申请的描述中，除非另有明确的限定，设置、安装、连接等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本申请中的具体含义。
本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
实施例1
本实施例提供一种烟酰胺磷酸核糖转移酶，其制备方法如下：
1.重组质粒和重组菌的制备
本实施例所采用的亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶来自于Methanobacteriumsp.PtaU1.Bin097，其氨基酸序列如下所示(GenBank：OPY24542.1)：
MNQNLLLMTDSYKASHWLQYPEGTTKIYSYIESRGGKYPETLFFGLQYLLRILEKGINEEDVWEADAFFEVHGVPFNLDGFLYIMNEHDGKLPVEIKAIAEGSVVPAHTPLLTIENTDPSCYWLTCYLETMLLRVWYPTTVATRSWYAKKIIKTYLDQTADDSEAELPSKLHDFGARGASSHESAAIGGMAHLVNFTGSDTVEGVILANKVYKCDMAAFSIPAAEHSTITAWGKENEVEAYRNMLKQFAKPNSLMAVVSDSYDIYNAVENIWGEELRQEVVDSGATIVIRPDSGHPPEIVSKVVKILDEKFGSTENSRGYRVLDNVRVIQGDGVDLDMIHEILDKLKNEGYSASNIAFGMGGYLLQKLNRDTQKFAMKCSYAKVNGKGRDVFKEPVTDKGKTSKRGRINNSLLETVFLDGEIVKEYTLDQVREKAARALE(SEQ IDNo.1)。
编码该烟酰胺磷酸核糖转移酶的核苷酸序列如下所示：
atgaatcaaaatttgctactgatgactgacagctataaagcgtcacactggttgcaatatccagaggggaccacaaagatatattcttatatagaatctcgtggtggtaaatatccagaaacccttttctttggtttgcagtatttacttagaatattagagaagggaataaatgaagaagacgtttgggaagcagatgcattttttgaggtgcacggagtaccttttaatttagatgggttcctgtatatcatgaatgagcacgatggaaaacttcctgtggagatcaaggccattgcagagggtagtgtggttcctgcgcatactcctctgctaaccatagagaatacagatcccagttgttattggcttacctgttatctggagactatgctccttagggtctggtatcccacaacagtggccaccagaagctggtacgctaagaagataataaaaacatacttggaccaaacagcagatgactcagaagcagaactaccttccaaactccacgatttcggtgcaagaggcgcatccagccacgaatctgctgctattggtggcatggcacatctggtaaacttcacaggctcagatactgttgaaggtgtcatacttgcaaacaaagtatacaaatgtgatatggcggctttcagtattcctgctgcagagcacagcacaataactgcctggggaaaagaaaacgaagtcgaagcataccgaaatatgttaaaacagtttgcaaagccaaattctctgatggctgtagtatcagattcttacgacatctacaatgcagtagaaaatatctggggggaagaattacgtcaggaagtggtagacagcggtgcaaccatcgtaataagaccggacagtggacatcctcctgaaatagtgtccaaagtggtgaagatacttgacgagaaattcggcagcacagaaaactccagaggctacagggtgctcgataacgtccgtgtaatacagggagacggtgtcgacctggatatgatccatgaaatactggataaattaaaaaatgaaggttattcagccagcaacatagcatttggaatgggaggatatctactacaaaaattaaaccgggacacccaaaaattcgccatgaaatgcagttacgccaaggtaaatggcaaaggaagggatgtcttcaaagaaccagtaacagataaaggtaaaacctctaaaagaggtagaattaataattctttactggaaacagtgtttttagatggtgaaattgtgaaggagtataccttagatcaggtcagggagaaggctgctagagcactagag(SEQ ID No.5)。
亲本Nampt的基因由南京金斯瑞公司合成并重组到表达载体pET-22b(含酶切位点BamHI、HindⅢ)上。用限制性内切酶BamH I和Hind III(Invitrogen公司)对含亲本Nampt基因的表达载体pET-22b进行双酶切，同时，用限制性内切酶BamH I和Hind III对pET-28a(+)载体(Invitrogen公司)进行双酶切，使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4连接酶将上述两个酶切产物连接，将连接产物转化入E.coli DH5α感受态细胞中，提取质粒，酶切鉴定，PCR鉴定后送测序确定表达载体构建成功，命名为pET28a-Nampt。重组质粒转化至E.coli BL21，获得重组表达基因工程菌E.coli BL21-Nampt。
定点突变的引物采用Primer premier 5.0设计，引物设计的原则为：正反向扩增引物5′端包含15～21bp反向互补区域，各引物非互补区域长度至少为15bp，所需引入的突变包含在互补区域内。突变引物如下：
V202A-F：5′-CAGGCTCAGATACTGCTGAAGGTGTCATACTTGCA-3′(SEQ ID No.9)，
V202A-R：5′-AGTATGACACCTTCAGCAGTATCTGAGCCTGTGAA-3′(SEQ ID No.10)，L364P-F：5′-GAATGGGAGGATATCCACTACAAAAATTAAACCGG-3′(SEQ ID No.11)，L364P-R：5′-TTTAATTTTTGTAGTGGATATCCTCCCATTCCAAA-3′(SEQ ID No.12)。
定点突变以实施例1中的pET28a-Nampt重组质粒为模板，利用PrimerStar Mix(ABM公司)进行全质粒扩增，扩增产物经过DpnⅠ酶(ABM公司)消化去除PCR反应体系中的模板，然后在重组酶催化下将5′端和3′端进行同源重组，完成质粒的环化。定点突变体系如下：
表1.定点突变体系
重组质粒pET28a-Nampt 1μl
上游引物F 1μl
下游引物R 1μl
PrimerStar Mix 25μl
ddH<sub>2</sub>O 补充至50μl
PCR扩增程序：95℃预变性300s，98℃变性10s，66℃退火15s，72℃延伸300s，反应30个循环后，再72℃延伸5min，最后4℃保温。PCR反应结束后，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。然向每个PCR管中加入1μl Dpn I轻轻混匀后置37℃金属浴2h，之后将消化好的扩增产物进行重组反应。重组反应体系如下：
表2.重组反应体系
200ng线性质粒 5μl
5×Ligation Free Cloning(ABM公司) 4μl
ddH<sub>2</sub>O 补充至20μl
将环化的扩增产物转入E.coli DH5α感受态细胞中，并涂布在含卡那霉素的平板上，置于37℃培养箱中过夜培养。次日从平板中挑选含有不同突变质粒的E.coli DH5α菌株，用5mL含有相应抗性的液体LB培养后抽提质粒，送金斯瑞公司进行测序。最后将测序结果与野生型基因核苷酸序列进行比对，确定突变是否成功。
获得的Nampt突变体依据其突变位点分别命名为V202A和L364P，V202A的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；L364P的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示。
另外，突变体V202A/L364P的制备方法如下：
首先按照上述定点突变以及重组反应体系获得含单个突变位点的突变体V202A的重组质粒pET28a-V202A，然后以该重组质粒为模板二次设置定点突变以及重组反应获得双位点突变体V202A/L364P，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
2.酶的制备
将上述实施例中测序正确的突变重组质粒转化E.coli BL21菌株，获得含有不同突变位点的Nampt突变体重组基因工程菌株：E.coli BL21-V202A、E.coli BL21-L364P、E.coli BL21-V202A/L364P。再将含有野生型Nampt基因及其突变体基因的不同的基因工程菌分别接种到含有卡那霉素的5mL LB液体培养基(LB(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母提取物5)的50mL的摇管中，在摇床上37℃恒温培养8h，转速200rpm。再将培养菌液按2％接种量接入含有100mL诱导培养基TB中(TB(g/l)：酵母粉25，胰蛋白胨15，氯化钠10，葡萄糖2，乳糖3)的500mL摇瓶中，于200rpm，37℃培养2h，待OD600达到0.2左右时转16℃诱导24h离心收集菌体。超声破菌，离心取上清液为粗酶液，置于4℃冰箱，可用于后续酶活性测定和生物催化制备NMN。
实施例2
酶活测定
配制终浓度为60mM烟酰胺、25mM PRPP、18mMMgCl2、15mM KCl、100mM Tris缓冲液的反应液，调节pH至7.5。取4份反应溶液(每份900μl)，分别加入100μl蛋白浓度相同的亲本Nampt以及3种突变体Nampt的上清粗酶液，在37℃反应10min，然后加入100μl25％三氯乙酸终止反应，通过HPLC测定反应溶液中的NMN含量，并计算每种酶的具体活性。以亲本Nampt的酶活作为相对酶活100％，比较突变体Nampt的相对酶活，结果如下表所示：
表3.相对酶活检测结果
Figure BDA0003002291700000101
从上述结果可以看出，本申请实施例所提供的单一位点的突变体相对于野生型Nampt的酶活已有明显的提高，达到野生型的4～6倍左右，而其中L364P的相对酶活又比V202A的相对酶活更高；同时，双位点的突变体的相对酶活比任一单一突变体的酶活同样有较为明显的提高，约为野生型的7倍。可见，本申请实施例提供的Nampt突变体的这种高催化活性使其可以以粗酶的形式使用而不需要纯化，或者仅部分纯化之后就可以使用。因而可以大幅降低生产成本，从而适用于大规模工业化生产，更具有市场竞争力。
实施例3
烟酰胺单核苷酸的制备
向反应器中加入含有90mM烟酰胺、90mM核糖-5-磷酸、90mMATP、20mM MgCl2、100mMTris-HCl缓冲液的底物溶液，调节pH至7.0～7.5。然后加入催化酶，添加量分别为：8ml/L(粗酶液/底物溶液)的突变体V202A/L364P的上清粗酶液，20g/L(冻干粉酶/底物溶液)的磷酸核糖焦磷酸化酶，搅拌均匀后，在恒温水浴摇床中进行反应。摇床转速设置为50rpm，反应温度控制在30℃，pH保持在7.0～8.0。反应4小时后，得到含粗品的溶液，经过滤、纯化、干燥，得到终产物，氢谱、碳谱检验证实其为烟酰胺单核苷酸。
另外，结果显示，粗品溶液中NMN的浓度为72.5mM。
实施例4
本实施例提供一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，包括以下步骤：
(1)向反应器中加入含有1mM烟酰胺、1mM焦磷酸二钠、1mM的AMP、1mM的MgCl2、1mM的KCl、50mM Tris-HCl缓冲液的底物溶液，调节pH至6.5～7.0。然后加入催化酶，添加量分别为：8ml/L(粗酶液/底物溶液)的突变体V202A/L364P的上清粗酶液，20g/L(冻干粉酶/底物溶液)的腺嘌呤磷酸核糖转移酶，搅拌均匀后，在恒温水浴摇床中进行反应。摇床转速设置为50rpm，反应温度控制在30℃，pH保持在6.5～7.0。反应4小时后，得到含粗品NMN的溶液，经过滤、纯化、干燥，得到终产物NMN。
上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳希吉亚生物技术有限公司
<120> 烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用
<130> 1
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 440
<212> PRT
<213> Methanobacterium sp. PtaU1. Bin097
<400> 1
Met Asn Gln Asn Leu Leu Leu Met Thr Asp Ser Tyr Lys Ala Ser His
1 5 10 15
Trp Leu Gln Tyr Pro Glu Gly Thr Thr Lys Ile Tyr Ser Tyr Ile Glu
20 25 30
Ser Arg Gly Gly Lys Tyr Pro Glu Thr Leu Phe Phe Gly Leu Gln Tyr
35 40 45
Leu Leu Arg Ile Leu Glu Lys Gly Ile Asn Glu Glu Asp Val Trp Glu
50 55 60
Ala Asp Ala Phe Phe Glu Val His Gly Val Pro Phe Asn Leu Asp Gly
65 70 75 80
Phe Leu Tyr Ile Met Asn Glu His Asp Gly Lys Leu Pro Val Glu Ile
85 90 95
Lys Ala Ile Ala Glu Gly Ser Val Val Pro Ala His Thr Pro Leu Leu
100 105 110
Thr Ile Glu Asn Thr Asp Pro Ser Cys Tyr Trp Leu Thr Cys Tyr Leu
115 120 125
Glu Thr Met Leu Leu Arg Val Trp Tyr Pro Thr Thr Val Ala Thr Arg
130 135 140
Ser Trp Tyr Ala Lys Lys Ile Ile Lys Thr Tyr Leu Asp Gln Thr Ala
145 150 155 160
Asp Asp Ser Glu Ala Glu Leu Pro Ser Lys Leu His Asp Phe Gly Ala
165 170 175
Arg Gly Ala Ser Ser His Glu Ser Ala Ala Ile Gly Gly Met Ala His
180 185 190
Leu Val Asn Phe Thr Gly Ser Asp Thr Val Glu Gly Val Ile Leu Ala
195 200 205
Asn Lys Val Tyr Lys Cys Asp Met Ala Ala Phe Ser Ile Pro Ala Ala
210 215 220
Glu His Ser Thr Ile Thr Ala Trp Gly Lys Glu Asn Glu Val Glu Ala
225 230 235 240
Tyr Arg Asn Met Leu Lys Gln Phe Ala Lys Pro Asn Ser Leu Met Ala
245 250 255
Val Val Ser Asp Ser Tyr Asp Ile Tyr Asn Ala Val Glu Asn Ile Trp
260 265 270
Gly Glu Glu Leu Arg Gln Glu Val Val Asp Ser Gly Ala Thr Ile Val
275 280 285
Ile Arg Pro Asp Ser Gly His Pro Pro Glu Ile Val Ser Lys Val Val
290 295 300
Lys Ile Leu Asp Glu Lys Phe Gly Ser Thr Glu Asn Ser Arg Gly Tyr
305 310 315 320
Arg Val Leu Asp Asn Val Arg Val Ile Gln Gly Asp Gly Val Asp Leu
325 330 335
Asp Met Ile His Glu Ile Leu Asp Lys Leu Lys Asn Glu Gly Tyr Ser
340 345 350
Ala Ser Asn Ile Ala Phe Gly Met Gly Gly Tyr Leu Leu Gln Lys Leu
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370 375 380
Asn Gly Lys Gly Arg Asp Val Phe Lys Glu Pro Val Thr Asp Lys Gly
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Lys Thr Ser Lys Arg Gly Arg Ile Asn Asn Ser Leu Leu Glu Thr Val
405 410 415
Phe Leu Asp Gly Glu Ile Val Lys Glu Tyr Thr Leu Asp Gln Val Arg
420 425 430
Glu Lys Ala Ala Arg Ala Leu Glu
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Trp Leu Gln Tyr Pro Glu Gly Thr Thr Lys Ile Tyr Ser Tyr Ile Glu
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Ser Arg Gly Gly Lys Tyr Pro Glu Thr Leu Phe Phe Gly Leu Gln Tyr
35 40 45
Leu Leu Arg Ile Leu Glu Lys Gly Ile Asn Glu Glu Asp Val Trp Glu
50 55 60
Ala Asp Ala Phe Phe Glu Val His Gly Val Pro Phe Asn Leu Asp Gly
65 70 75 80
Phe Leu Tyr Ile Met Asn Glu His Asp Gly Lys Leu Pro Val Glu Ile
85 90 95
Lys Ala Ile Ala Glu Gly Ser Val Val Pro Ala His Thr Pro Leu Leu
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Thr Ile Glu Asn Thr Asp Pro Ser Cys Tyr Trp Leu Thr Cys Tyr Leu
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Ser Trp Tyr Ala Lys Lys Ile Ile Lys Thr Tyr Leu Asp Gln Thr Ala
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Asp Asp Ser Glu Ala Glu Leu Pro Ser Lys Leu His Asp Phe Gly Ala
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Arg Gly Ala Ser Ser His Glu Ser Ala Ala Ile Gly Gly Met Ala His
180 185 190
Leu Val Asn Phe Thr Gly Ser Asp Thr Ala Glu Gly Val Ile Leu Ala
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Asn Lys Val Tyr Lys Cys Asp Met Ala Ala Phe Ser Ile Pro Ala Ala
210 215 220
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245 250 255
Val Val Ser Asp Ser Tyr Asp Ile Tyr Asn Ala Val Glu Asn Ile Trp
260 265 270
Gly Glu Glu Leu Arg Gln Glu Val Val Asp Ser Gly Ala Thr Ile Val
275 280 285
Ile Arg Pro Asp Ser Gly His Pro Pro Glu Ile Val Ser Lys Val Val
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Lys Ile Leu Asp Glu Lys Phe Gly Ser Thr Glu Asn Ser Arg Gly Tyr
305 310 315 320
Arg Val Leu Asp Asn Val Arg Val Ile Gln Gly Asp Gly Val Asp Leu
325 330 335
Asp Met Ile His Glu Ile Leu Asp Lys Leu Lys Asn Glu Gly Tyr Ser
340 345 350
Ala Ser Asn Ile Ala Phe Gly Met Gly Gly Tyr Leu Leu Gln Lys Leu
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Asn Arg Asp Thr Gln Lys Phe Ala Met Lys Cys Ser Tyr Ala Lys Val
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Leu Leu Arg Ile Leu Glu Lys Gly Ile Asn Glu Glu Asp Val Trp Glu
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ggaggatatc cactacaaaa attaaaccgg gacacccaaa aattcgccat gaaatgcagt 1140
tacgccaagg taaatggcaa aggaagggat gtcttcaaag aaccagtaac agataaaggt 1200
aaaacctcta aaagaggtag aattaataat tctttactgg aaacagtgtt tttagatggt 1260
gaaattgtga aggagtatac cttagatcag gtcagggaga aggctgctag agcactagag 1320
<210> 8
<211> 1320
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atgaatcaaa atttgctact gatgactgac agctataaag cgtcacactg gttgcaatat 60
ccagagggga ccacaaagat atattcttat atagaatctc gtggtggtaa atatccagaa 120
acccttttct ttggtttgca gtatttactt agaatattag agaagggaat aaatgaagaa 180
gacgtttggg aagcagatgc attttttgag gtgcacggag taccttttaa tttagatggg 240
ttcctgtata tcatgaatga gcacgatgga aaacttcctg tggagatcaa ggccattgca 300
gagggtagtg tggttcctgc gcatactcct ctgctaacca tagagaatac agatcccagt 360
tgttattggc ttacctgtta tctggagact atgctcctta gggtctggta tcccacaaca 420
gtggccacca gaagctggta cgctaagaag ataataaaaa catacttgga ccaaacagca 480
gatgactcag aagcagaact accttccaaa ctccacgatt tcggtgcaag aggcgcatcc 540
agccacgaat ctgctgctat tggtggcatg gcacatctgg taaacttcac aggctcagat 600
actgctgaag gtgtcatact tgcaaacaaa gtatacaaat gtgatatggc ggctttcagt 660
attcctgctg cagagcacag cacaataact gcctggggaa aagaaaacga agtcgaagca 720
taccgaaata tgttaaaaca gtttgcaaag ccaaattctc tgatggctgt agtatcagat 780
tcttacgaca tctacaatgc agtagaaaat atctgggggg aagaattacg tcaggaagtg 840
gtagacagcg gtgcaaccat cgtaataaga ccggacagtg gacatcctcc tgaaatagtg 900
tccaaagtgg tgaagatact tgacgagaaa ttcggcagca cagaaaactc cagaggctac 960
agggtgctcg ataacgtccg tgtaatacag ggagacggtg tcgacctgga tatgatccat 1020
gaaatactgg ataaattaaa aaatgaaggt tattcagcca gcaacatagc atttggaatg 1080
ggaggatatc cactacaaaa attaaaccgg gacacccaaa aattcgccat gaaatgcagt 1140
tacgccaagg taaatggcaa aggaagggat gtcttcaaag aaccagtaac agataaaggt 1200
aaaacctcta aaagaggtag aattaataat tctttactgg aaacagtgtt tttagatggt 1260
gaaattgtga aggagtatac cttagatcag gtcagggaga aggctgctag agcactagag 1320
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
caggctcaga tactgctgaa ggtgtcatac ttgca 35
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
agtatgacac cttcagcagt atctgagcct gtgaa 35
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gaatgggagg atatccacta caaaaattaa accgg 35
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tttaattttt gtagtggata tcctcccatt ccaaa 35

Claims (10)

1.烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，其特征在于，包括如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列发生突变后的氨基酸序列，所述突变包括第202位缬氨酸突变为丙氨酸、第364位亮氨酸突变为脯氨酸中的至少一种。
2.分离的多核苷酸，其特征在于，包括：
(A1)编码权利要求1所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的核苷酸序列；或
(A2)与(A1)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNo.6～8任一项所示。
4.重组载体，其特征在于，包括权利要求2至3任一项所述的多核苷酸。
5.宿主细胞，其特征在于，包括权利要求4所述重组载体，或包括权利要求2至3任一项所述的多核苷酸。
6.烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：培养权利要求5所述的宿主细胞，获得培养物，从所述培养物中分离出所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体。
7.烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供烟酰胺和5-磷酸核糖-1-焦磷酸作为第一底物；
将所述第一底物与权利要求1所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体接触，催化合成所述烟酰胺单核苷酸。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述5-磷酸核糖-1焦磷酸的制备方法包括以下步骤：
提供核糖-5-磷酸、焦磷酸供体作为第二底物；
将所述第二底物与磷酸核糖焦磷酸化酶接触，催化合成所述5-磷酸核糖-1焦磷酸。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述核糖-5-磷酸的制备方法包括以下步骤：
提供核糖和磷酸供体作为第三底物；
将所述第三底物与核糖激酶接触，催化合成所述核糖-5-磷酸。
10.权利要求1所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，或权利要求2至3任一项所述的多核苷酸，或权利要求4所述的重组载体，或权利要求5所述的宿主细胞在制备烟酰胺单核苷酸中的应用。
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