CN115058402B - 一种烟酰胺核糖激酶突变体及其编码基因和应用 - Google Patents

一种烟酰胺核糖激酶突变体及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明具体涉及一种烟酰胺核糖激酶突变体及其编码基因和应用。所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列与氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的烟酰胺核糖激酶突变体NrK15相比，在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第118位、第120位、第133位、第135位、第174位进行单突变、两两联合突变、三个联合突变或四个联合突变中的任意一种突变。该烟酰胺核糖激酶突变体与NrK15突变型相比，酶活得到进一步提升，解决了现有反应速率低、反应时间较长，难以实现工业化生产的问题，有利于实现烟酰胺单核苷酸生产成本下降及利润提高，提高市场竞争力。

Description

一种烟酰胺核糖激酶突变体及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及生物酶工程技术领域，具体涉及一种烟酰胺核糖激酶突变体及其编码基因和应用。
背景技术
β-烟酰胺单核苷酸(β-Nicotinamide mononuclotide，NMN，CAS号1094-61-7)是一种自然存在的生物活性核苷酸，β异构体是NMN的活性形式。因烟酰胺属于维生素B3，因此NMN属于维生素B族衍生物范畴，其广泛参与人体多项生化反应，与免疫、代谢息息相关。近年来《CELL》、《NATURE》、《SCIENCE》等权威国际期刊从多个角度证实了补充NMN可有效地增加和恢复体内辅酶I水平，大幅延缓衰老和防止老年痴呆症等多种神经元退化疾病，并由此从根本上调理和改善衰老的各种症状，表明补充NMN具有多方面的医疗和保健潜力。目前NMN在欧、美、日等发达国家已批准作为保健食品原料，并以NMN为主要成份开发出多种保健品，如美国HERBALmax、基因港GeneHarbor NMN9000、日本MIRAI LAB NMN3000胶囊等。
目前NMN的生产方法主要有三种：固态酵母发酵工艺、体外酶催化工艺和化学法合成工艺。其中，发酵工艺复杂，产量较低，因此产品价格高昂。而化学法以烟酰胺核糖为原料，用三氯氧磷进行磷酸化得到，虽然技术容易控制，但产品中杂质过多，分离纯化困难且总体收率很低；同时有机溶剂使用量大，对环境污染不可忽视。酶作为一类与化学合成互补的、高效的生物催化剂已被广泛应用于新药研发、食品、化工等领域。因此目前主流的NMN生产工艺都是采用安全绿色的体外酶催化工艺。
NMN的生物酶法制备主要有两条途径。第一条是以D-核糖和烟酰胺为起始原料，在核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶等的作用下，经过三步催化反应得到NMN。该条路线底物转化率不高，且中间产物较多，后续分离纯化较困难，因而总体收率偏低，导致生产成本高。第二条路线是以烟酰胺核糖(nicotinamide riboside，NR)为起始原料，在烟酰胺核糖激酶(NR kinase，NrK)和ATP的作用下，一步反应得到NMN，收率高，产品纯度高，未来将成为NMN的主流生产方法。
如中国专利CN112553178A公开了一种具有热稳定性和活性增强的烟酰胺核糖激酶突变体及其应用，该新型烟酰胺核糖激酶突变体NrK15具有酶成本低、酶活比较好、酶的热稳定性好、工艺操作简单等特点。通过定向突变方法，其酶活或许能进一步提高。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种烟酰胺核糖激酶突变体，是通过大分子建模技术以及实验数据验证，优化自由能计算公式，在热稳定性及酶活均有提升的突变型NrK15的基础上，继续叠加突变，使得酶活得到进一步提升，以解决现有反应速率低、反应时间较长，难以实现工业化生产的问题，这将有利于实现烟酰胺单核苷酸生产成本下降及利润提高，提高市场竞争力。
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
来源于中国专利CN112553178A的烟酰胺核糖激酶突变体NrK15的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
NrK15的基因序列通过常州基宇生物技术有限公司全基因合成所得，在编码区两端分别添加NdeI和HindIII限制性内切酶位点。目的基因片段通过限制性内切酶NdeI和HindIII酶切后，与经过同样双酶切的pET28a(+)载体(Novagen公司)进行连接、转化和筛选，筛选得到的阳性质粒NrK15-pET28a(+)转入BL21(DE3)宿主菌中，从而构建NrK15的体外异源表达体系。
NrK15突变体的构建，是通过定向进化的技术手段得到的。具体的为，本发明通过大分子建模技术来以及定点突变来降低蛋白整体结构的自由能，并根据实验数据验证来优化自由能计算公式，利用能量最低原理和分子对接技术预测出可能的与催化相关的一个或多个位点，然后对这些位点进行NrK15定点突变，从中筛选出活性有显著提高的突变体。
本发明通过蛋白结构自由能计算预测出了五个位点，可能与提高稳定性有关。具体位点为118、120、133、135和174。分别对这五个位点进行定点突变后，底物转化率都有所提高。更为具体的为，当位点118的亮氨酸(L)突变为缬氨酸(V)或者苯丙氨酸(F)时，突变体的催化活性相对于NrK15来说得到了提高。当位点120的异亮氨酸(I)突变为甲硫氨酸(M)或者缬氨酸(V)或者亮氨酸(L)时，突变体酶活相对于NrK15来说得到了提高。当位点133的缬氨酸(V)突变为天冬氨酸(D)或者谷氨酸(E)时，突变体酶活相对于NrK15来说得到了提高。当位点135的谷氨酰胺(Q)突变为谷氨酸(E)时，突变体酶活得到了显著提高。当位点174的谷氨酸(E)突变为苯丙氨酸(F)或者天冬氨酸(D)时，突变体酶活得到了显著提高。当将上述5个位点的突变，进行两两联合突变或三个联合突变或四个联合突变时，某些突变体的催化活性相对于单个突变体来说得到了更大的提高。
因此，一方面，本发明请求保护一种烟酰胺核糖激酶突变体，其氨基酸序列与氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的烟酰胺核糖激酶突变体NrK15相比，在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第118位、第120位、第133位、第135位、第174位进行单突变、两两联合突变、三个联合突变或四个联合突变中的任意一种突变。
具体地，所述的单突变为：
当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第135位由谷氨酰胺突变为谷氨酸，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第120位由异亮氨酸突变为缬氨酸，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第120位由异亮氨酸突变为甲硫氨酸，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第118位由亮氨酸突变为缬氨酸，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第133位由缬氨酸突变为天冬氨酸，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第133位由缬氨酸突变为谷氨酸，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第174位由谷氨酸突变为苯丙氨酸，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第174位由谷氨酸突变为天冬氨酸，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第118位由亮氨酸突变为苯丙氨酸，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
具体地，所述的两两联合突变为：
当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第133位由缬氨酸突变为谷氨酸，第118位由亮氨酸突变为苯丙氨酸，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第174位由谷氨酸突变为天冬氨酸，第133位由缬氨酸突变为谷氨酸，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第174位由谷氨酸突变为天冬氨酸，第118位由亮氨酸突变为苯丙氨酸，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示。
具体地，所述的四个联合突变为：
当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第174位由谷氨酸突变为天冬氨酸，第133位由缬氨酸突变为谷氨酸，第120位由异亮氨酸突变为亮氨酸，第118位由亮氨酸突变为苯丙氨酸，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示。
另一方面，本发明还请求保护上述烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因。
其中，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示。
据现有公共知识，任何基因经操作或者改造后连入各类表达载体，转化至合适宿主细胞，经适当条件诱导均能过量表达目的蛋白。
因此，本发明还请求保护含有上述编码基因的载体。
具体地，所述的载体可以为各种表达载体，包括但不限于pET表达载体、pCW表达载体、pUC表达载体或pPIC9k表达载体中的任意一种表达载体。
又一方面，本发明还请求保护含有上述编码基因的宿主细胞。
具体地，所述的宿主细胞可以为任一种合适的宿主细胞，包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌或毕赤酵母。
又一方面，本发明还请求保护上述烟酰胺核糖激酶突变体、编码基因、载体、宿主细胞在制备β-烟酰胺单核苷酸中的应用。
再一方面，本发明还提供了一种制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，包括以下步骤：
S1.配置反应体系，包含：0.5-10g/L上述的烟酰胺核糖激酶突变体，50mM pH6.0-8.0磷酸钠缓冲液，5mM ATP，10-50g/L烟酰胺核糖，50mM六偏磷酸钠，50mM七水硫酸镁，0.5-10g/L PPK2酶；控制反应体系温度在35-40℃，进行搅拌反应；
S2.反应3h后进行HPLC检测；经过纯化后得β-烟酰胺单核苷酸。
优选地，所述的方法包括以下步骤：
S1.配置反应体系，包含：0.5g/L上述的烟酰胺核糖激酶突变体，50mM pH6.5磷酸钠缓冲液，5mM ATP，10-50g/L烟酰胺核糖，50mM六偏磷酸钠，50mM七水硫酸镁，0.5g/L PPK2酶；控制反应体系温度在40℃，进行搅拌反应；
S2.反应3h后进行HPLC检测；经过纯化后得β-烟酰胺单核苷酸。
反应产物经HPLC检测，反应底物转化率＞99％。烟酰胺单核苷酸的生成率可达到95％。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明构建的烟酰胺核糖激酶突变体是在突变型NrK15的基础上，继续叠加突变，使得酶活得到进一步提升，以解决现有反应速率低、反应时间较长，难以实现工业化生产的问题，这将有利于实现烟酰胺单核苷酸生产成本下降及利润提高，提高市场竞争力。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础等译，第三版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行，或按照试剂盒生产商建议方法操作。
实施例一原核表达体系的构建
NrK15基因片段由常州基宇生物技术有限公司合成，并重组到PUC57载体上。经限制性内切酶NdeI和HindIII(购自New England Biolabs公司，NEB)在37℃双酶切4h后，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离并进行切胶回收(胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司)。随后与同样经过双酶切的表达载体pET28a(+)(Novagen公司)，在T4DNA连接酶(购自Takara公司)作用下置于低温连接仪里连接过夜。连接液转化DH5a感受态细胞，并进行菌落PCR筛选和测序验证，从而得到阳性重组质粒NrK15-pET28a(+)。
将阳性重组质粒NrK15-pET28a(+)转化表达宿主菌BL21(DE3)(购自天根生化科技(北京)有限公司)，得到原核表达菌株NrK15-pET28a(+)/BL21(DE3)，作为后续定向突变和发酵的原代菌株。
用于ATP再生的多聚磷酸激酶(PPK2，来源于E.coli)由常州基宇生物技术有限公司合成，后续重组表达质粒的构建同NrK15-pET28a(+)质粒的构建，转入BL21(DE3)中后得到表达菌株。
实施例二酶的摇瓶发酵制备酶冻干粉
上述构建的表达菌株NrK15-pET28a(+)/BL21(DE3)、PPK2-pET28a(+)/BL21(DE3)在加有终浓度为30μg/mL硫酸卡那霉素的5mL LB液体培养基【10g/L胰蛋白胨(OXIOD)，5g/L酵母粉(OXIOD)，10g/L氯化钠(国药试剂)】中，于37℃、200rpm振荡培养过夜后，按1％(V/V)比例接种于含有终浓度为30μg/mL硫酸卡那霉素的400mL LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养。待OD600在0.8-1.0之间时，加入终浓度为0.1mM的诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，并在30℃诱导过夜。菌体在4℃、8000rpm条件下离心收集，然后悬浮于50mMpH7.0磷酸钠缓冲液中，超声破碎(200W，3s/5s，30min)，4℃、12000rpm离心20min，取上清冷冻干燥，即得酶冻干粉。
实施例三突变体的构建和筛选
突变体的构建：采用大分子建模技术预测出可能有益的突变位点为第118、120、133、135、174位。随后以NrK15-pET28a(+)重组质粒为模板，对这五个位点分别进行了NrK15定点突变(具体突变操作参照stratagene公司的
Figure BDA0003682937590000061
Site-DirectedMutagenesis Kit操作说明)并测序验证突变情况。
其中：
第118位亮氨酸(L)突变为缬氨酸(V)
正向引物(SEQ ID NO:29)：5'CTATTTTGTGACCATTCCGTATGAAGAATGTAAAC 3'，
反向引物(SEQ ID NO:30)：5'ATGGTCACAAAATAGCTACGATTCCAAATATCA 3'；
第118位亮氨酸(L)突变为苯丙氨酸(F)
正向引物(SEQ ID NO:31)：5'CTATTTTTTTACCATTCCGTATGAAGAATGTAAAC 3'，
反向引物(SEQ ID NO:32)：5'ATGGTAAAAAAATAGCTACGATTCCAAATATCA 3'；
第120位异亮氨酸(I)突变为甲硫氨酸(M)
正向引物(SEQ ID NO:33)：5'TCTGACCATGCCGTATGAAGAATGTAAACGTCG 3'，
反向引物(SEQ ID NO:34)：5'TACGGCATGGTCAGAAAATAGCTACGATTCC 3'；
第120位异亮氨酸(I)突变为缬氨酸(V)
正向引物(SEQ ID NO:35)：5'TCTGACCGTGCCGTATGAAGAATGTAAACGTCG 3'，
反向引物(SEQ ID NO:36)：5'TACGGCACGGTCAGAAAATAGCTACGATTCC 3'；
第120位异亮氨酸(I)突变为亮氨酸(L)
正向引物(SEQ ID NO:37)：5'TCTGACCCTGCCGTATGAAGAATGTAAACGTCG 3'，
反向引物(SEQ ID NO:38)：5'TACGGCAGGGTCAGAAAATAGCTACGATTCC 3'；
第133位缬氨酸(V)突变为天冬氨酸(D)
正向引物(SEQ ID NO:39)：5'CACCCGTGATTATCAGCCGCCGGACCCTCC 3'，
反向引物(SEQ ID NO:40)：5'TGATAATCACGGGTGCTACGACGACG 3'；
第133位缬氨酸(V)突变为谷氨酸(E)
正向引物(SEQ ID NO:41)：5'CACCCGTGAATATCAGCCGCCGGACCCTCC 3'，
反向引物(SEQ ID NO:42)：5'TGATATTCACGGGTGCTACGACGACG 3'；
第135位谷氨酰胺(Q)突变为谷氨酸(E)
正向引物(SEQ ID NO:43)：5'TGTTTATGAACCGCCGGACCCTCCGGGTTATTTTG 3'，
反向引物(SEQ ID NO:44)：5'GGCGGTTCATAAACACGGGTGCTACGACGA 3'；
第174位谷氨酸(E)突变为苯丙氨酸(F)
正向引物(SEQ ID NO:45)：5'CAAAAGCTTTGAAGAACTGTTTAATCAGGTTTATG 3'，
反向引物(SEQ ID NO:46)：5'TCTTCAAAGCTTTTGGTACCATCCAGATAAAC 3'；
第174位谷氨酸(E)突变为天冬氨酸(D)
正向引物(SEQ ID NO:47)：5'CAAAAGCGATGAAGAACTGTTTAATCAGGTTTATG 3'，
反向引物(SEQ ID NO:48)：5'TCTTCATCGCTTTTGGTACCATCCAGATAAAC 3'。
突变体培养：将上述突变得到的质粒转化BL21(DE3)宿主菌后，涂布于含30μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜，随后从平板上挑取单克隆，置于含有30μg/mL硫酸卡那霉素的5mL LB液体培养基中进行培养。过夜培养的菌液再按1％(V/V)比例接种于含有30μg/mL硫酸卡那霉素的100mL LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养4h后加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，25℃培养过夜。4℃、8000rpm离心10min收集菌体，用50mMpH7.0磷酸钠缓冲液悬浮后超声破碎(200W，3s/5s，30min)，4℃、12000rpm离心20min，取上清进行单位酶活测定。
突变体的筛选：底物NR浓度10g/L，ATP 30mM，10mM七水硫酸镁，加入适量上述制备的上清液，用10mM pH7.0磷酸钠缓冲液补充体积至2mL，置于37℃恒温磁力搅拌器下搅拌反应。反应20min后取样进行HPLC检测。
突变体酶活得到显著提高的克隆中含有的突变位点如下：
位点118的亮氨酸(L)突变为缬氨酸(V)或者苯丙氨酸(F)；位点120的异亮氨酸(I)突变为甲硫氨酸(M)或者缬氨酸(V)或者亮氨酸(L)；位点133的缬氨酸(V)突变为天冬氨酸(D)或者谷氨酸(E)；位点135的谷氨酰胺(Q)突变为谷氨酸(E)；位点174的谷氨酸(E)突变为苯丙氨酸(F)或者天冬氨酸(D)。
随后对这五个位点进行两两联合突变、三个联合突变和四个联合突变，活性检测发现个别位点联合突变后催化活性相较于单点突变来说又得到了显著提高，具体酶活数值如下表1所示。
表1 NrK15和不同突变组合的酶活
氨基酸序列编号 突变体名称 单位酶活 提高倍数
SEQ ID NO:2 Nrk15 4.85U/mg --
SEQ ID NO:4 Q135E 8.5U/mg 1.75
SEQ ID NO:6 I120V 8.5U/mg 1.75
SEQ ID NO:8 I120M 8.6U/mg 1.77
SEQ ID NO:10 L118V 8.6U/mg 1.77
SEQ ID NO:12 V133D 8.8U/mg 1.81
SEQ ID NO:14 V133E 16.6U/mg 3.42
SEQ ID NO:16 E174F 11.6U/mg 2.39
SEQ ID NO:18 E174D 11.0U/mg 2.27
SEQ ID NO:20 L118F 15.9U/mg 3.28
SEQ ID NO:22 V133E/L118F 15.96U/mg 3.29
SEQ ID NO:24 E174D/V133E 12.6U/mg 2.60
SEQ ID NO:26 E174D/L118F 9.6U/mg 1.98
SEQ ID NO:28 E174D/V133E/I120L/L118F 20.1U/mg 4.14
*1U定义为单位时间内(1min)生产1μmol产物NMN所需的酶量。
因此，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第135位由谷氨酰胺突变为谷氨酸，烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQID NO:3所示。
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第120位由异亮氨酸突变为缬氨酸，烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示。
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第120位由异亮氨酸突变为甲硫氨酸，烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQID NO:7所示。
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第118位由亮氨酸突变为缬氨酸，烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:9所示。
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第133位由缬氨酸突变为天冬氨酸，烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:11所示。
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第133位由缬氨酸突变为谷氨酸，烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:13所示。
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第174位由谷氨酸突变为苯丙氨酸，烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:15所示。
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第174位由谷氨酸突变为天冬氨酸，烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:17所示。
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第118位由亮氨酸突变为苯丙氨酸，烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:19所示。
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第133位由缬氨酸突变为谷氨酸，第118位由亮氨酸突变为苯丙氨酸，烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示。
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第174位由谷氨酸突变为天冬氨酸，第133位由缬氨酸突变为谷氨酸，烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示。
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第174位由谷氨酸突变为天冬氨酸，第118位由亮氨酸突变为苯丙氨酸，烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示。
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第174位由谷氨酸突变为天冬氨酸，第133位由缬氨酸突变为谷氨酸，第120位由异亮氨酸突变为亮氨酸，第118位由亮氨酸突变为苯丙氨酸，烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示。
实施例四突变体的生物催化
将160mg底物NR溶解于1.6mL 50mM pH6.5磷酸钠缓冲液中，待底物完全溶解后加入50mM六偏磷酸钠、5mM ATP、50mM七水硫酸镁、烟酰胺核糖激酶突变体(E174D/V133E/I120L/L118F)和PPK2酶量分别是0.5g/L和0.5g/L，在40℃恒温磁力搅拌器下搅拌反应，反应3h后进行HPLC检测；经过纯化后得β-烟酰胺单核苷酸。底物转化率大于99％，β-烟酰胺单核苷酸的生成率可达到95％。
不同突变体的底物转化率和产物生成率见下表2。
表2 Nrk15与不同突变体的底物转化率和产物生成率
氨基酸序列编号 突变体名称 底物转化率(％) 产物生成率(％)
SEQ ID NO:2 Nrk15 80％ 75％
SEQ ID NO:4 Q135E 83％ 80％
SEQ ID NO:6 I120V 84％ 81％
SEQ ID NO:8 I120M 85％ 80％
SEQ ID NO:10 L118V 85％ 79％
SEQ ID NO:12 V133D 85％ 81％
SEQ ID NO:14 V133E 95％ 91％
SEQ ID NO:16 E174F 89％ 85％
SEQ ID NO:18 E174D 89％ 84％
SEQ ID NO:20 L118F 93％ 90％
SEQ ID NO:22 V133E/L118F 92％ 88％
SEQ ID NO:24 E174D/V133E 90％ 86％
SEQ ID NO:26 E174D/L118F 86％ 82％
SEQ ID NO:28 E174D/V133E/I120L/L118F 99％ 95％
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 中山俊凯生物技术开发有限公司
<120> 一种烟酰胺核糖激酶突变体及其编码基因和应用
<160> 48
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaaaacct ttatcatcgg tattagcggc gttaccaata gcggtaaaac aaccctggca 60
aaaaatctgc agaaacatct gccgaattgt tgtgttatta gccaggatga tttttttaaa 120
ccggaaagcg aaattgaaac cgatgaaaat ggttttctgc agtatgatgt tctggatgca 180
ctggatatgg ataaaatgat gagcaccatt cagtgttgga tggaaaatgc acgtcatagc 240
gttgttagca ccgatcagga aagcgcagaa gaaattccga ttctgattat tgaaggtttt 300
ctgctgttta attataaacc gctgaatgat atttggaatc gtagctattt tctgaccatt 360
ccgtatgaag aatgtaaacg tcgtcgtagc acccgtgttt atcagccgcc ggaccctccg 420
ggttattttg atggtcatgt ttggccgatg tatctgaaat atcgtcagga aatggaagat 480
attacctggg aagttgttta tctggatggt accaaaagcg aagaagaact gtttaatcag 540
gtttatgaag atctgcagca ggaactggca aaacagaaat gtctgcaggt taccgcataa 600
<210> 2
<211> 199
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Lys Thr Phe Ile Ile Gly Ile Ser Gly Val Thr Asn Ser Gly Lys
1 5 10 15
Thr Thr Leu Ala Lys Asn Leu Gln Lys His Leu Pro Asn Cys Cys Val
20 25 30
Ile Ser Gln Asp Asp Phe Phe Lys Pro Glu Ser Glu Ile Glu Thr Asp
35 40 45
Glu Asn Gly Phe Leu Gln Tyr Asp Val Leu Asp Ala Leu Asp Met Asp
50 55 60
Lys Met Met Ser Thr Ile Gln Cys Trp Met Glu Asn Ala Arg His Ser
65 70 75 80
Val Val Ser Thr Asp Gln Glu Ser Ala Glu Glu Ile Pro Ile Leu Ile
85 90 95
Ile Glu Gly Phe Leu Leu Phe Asn Tyr Lys Pro Leu Asn Asp Ile Trp
100 105 110
Asn Arg Ser Tyr Phe Leu Thr Ile Pro Tyr Glu Glu Cys Lys Arg Arg
115 120 125
Arg Ser Thr Arg Val Tyr Gln Pro Pro Asp Pro Pro Gly Tyr Phe Asp
130 135 140
Gly His Val Trp Pro Met Tyr Leu Lys Tyr Arg Gln Glu Met Glu Asp
145 150 155 160
Ile Thr Trp Glu Val Val Tyr Leu Asp Gly Thr Lys Ser Glu Glu Glu
165 170 175
Leu Phe Asn Gln Val Tyr Glu Asp Leu Gln Gln Glu Leu Ala Lys Gln
180 185 190
Lys Cys Leu Gln Val Thr Ala
195
<210> 3
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaaaatctgc agaaacatct gccgaattgt tgtgttatta gccaggatga tttttttaaa 120
ccggaaagcg aaattgaaac cgatgaaaat ggttttctgc agtatgatgt tctggatgca 180
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gttgttagca ccgatcagga aagcgcagaa gaaattccga ttctgattat tgaaggtttt 300
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ccgtatgaag aatgtaaacg tcgtcgtagc acccgtgttt atgaaccgcc ggaccctccg 420
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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Thr Thr Leu Ala Lys Asn Leu Gln Lys His Leu Pro Asn Cys Cys Val
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65 70 75 80
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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Thr Thr Leu Ala Lys Asn Leu Gln Lys His Leu Pro Asn Cys Cys Val
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Ile Thr Trp Glu Val Val Tyr Leu Asp Gly Thr Lys Ser Glu Glu Glu
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<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atgaaaacct ttatcatcgg tattagcggc gttaccaata gcggtaaaac aaccctggca 60
aaaaatctgc agaaacatct gccgaattgt tgtgttatta gccaggatga tttttttaaa 120
ccggaaagcg aaattgaaac cgatgaaaat ggttttctgc agtatgatgt tctggatgca 180
ctggatatgg ataaaatgat gagcaccatt cagtgttgga tggaaaatgc acgtcatagc 240
gttgttagca ccgatcagga aagcgcagaa gaaattccga ttctgattat tgaaggtttt 300
ctgctgttta attataaacc gctgaatgat atttggaatc gtagctattt tctgaccatt 360
ccgtatgaag aatgtaaacg tcgtcgtagc acccgtgaat atcagccgcc ggaccctccg 420
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<210> 14
<211> 199
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Met Lys Thr Phe Ile Ile Gly Ile Ser Gly Val Thr Asn Ser Gly Lys
1 5 10 15
Thr Thr Leu Ala Lys Asn Leu Gln Lys His Leu Pro Asn Cys Cys Val
20 25 30
Ile Ser Gln Asp Asp Phe Phe Lys Pro Glu Ser Glu Ile Glu Thr Asp
35 40 45
Glu Asn Gly Phe Leu Gln Tyr Asp Val Leu Asp Ala Leu Asp Met Asp
50 55 60
Lys Met Met Ser Thr Ile Gln Cys Trp Met Glu Asn Ala Arg His Ser
65 70 75 80
Val Val Ser Thr Asp Gln Glu Ser Ala Glu Glu Ile Pro Ile Leu Ile
85 90 95
Ile Glu Gly Phe Leu Leu Phe Asn Tyr Lys Pro Leu Asn Asp Ile Trp
100 105 110
Asn Arg Ser Tyr Phe Leu Thr Ile Pro Tyr Glu Glu Cys Lys Arg Arg
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Arg Ser Thr Arg Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Pro Pro Gly Tyr Phe Asp
130 135 140
Gly His Val Trp Pro Met Tyr Leu Lys Tyr Arg Gln Glu Met Glu Asp
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Ile Thr Trp Glu Val Val Tyr Leu Asp Gly Thr Lys Ser Glu Glu Glu
165 170 175
Leu Phe Asn Gln Val Tyr Glu Asp Leu Gln Gln Glu Leu Ala Lys Gln
180 185 190
Lys Cys Leu Gln Val Thr Ala
195
<210> 15
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atgaaaacct ttatcatcgg tattagcggc gttaccaata gcggtaaaac aaccctggca 60
aaaaatctgc agaaacatct gccgaattgt tgtgttatta gccaggatga tttttttaaa 120
ccggaaagcg aaattgaaac cgatgaaaat ggttttctgc agtatgatgt tctggatgca 180
ctggatatgg ataaaatgat gagcaccatt cagtgttgga tggaaaatgc acgtcatagc 240
gttgttagca ccgatcagga aagcgcagaa gaaattccga ttctgattat tgaaggtttt 300
ctgctgttta attataaacc gctgaatgat atttggaatc gtagctattt tctgaccatt 360
ccgtatgaag aatgtaaacg tcgtcgtagc acccgtgttt atcagccgcc ggaccctccg 420
ggttattttg atggtcatgt ttggccgatg tatctgaaat atcgtcagga aatggaagat 480
attacctggg aagttgttta tctggatggt accaaaagct ttgaagaact gtttaatcag 540
gtttatgaag atctgcagca ggaactggca aaacagaaat gtctgcaggt taccgcataa 600
<210> 16
<211> 199
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Met Lys Thr Phe Ile Ile Gly Ile Ser Gly Val Thr Asn Ser Gly Lys
1 5 10 15
Thr Thr Leu Ala Lys Asn Leu Gln Lys His Leu Pro Asn Cys Cys Val
20 25 30
Ile Ser Gln Asp Asp Phe Phe Lys Pro Glu Ser Glu Ile Glu Thr Asp
35 40 45
Glu Asn Gly Phe Leu Gln Tyr Asp Val Leu Asp Ala Leu Asp Met Asp
50 55 60
Lys Met Met Ser Thr Ile Gln Cys Trp Met Glu Asn Ala Arg His Ser
65 70 75 80
Val Val Ser Thr Asp Gln Glu Ser Ala Glu Glu Ile Pro Ile Leu Ile
85 90 95
Ile Glu Gly Phe Leu Leu Phe Asn Tyr Lys Pro Leu Asn Asp Ile Trp
100 105 110
Asn Arg Ser Tyr Phe Leu Thr Ile Pro Tyr Glu Glu Cys Lys Arg Arg
115 120 125
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130 135 140
Gly His Val Trp Pro Met Tyr Leu Lys Tyr Arg Gln Glu Met Glu Asp
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
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ctggatatgg ataaaatgat gagcaccatt cagtgttgga tggaaaatgc acgtcatagc 240
gttgttagca ccgatcagga aagcgcagaa gaaattccga ttctgattat tgaaggtttt 300
ctgctgttta attataaacc gctgaatgat atttggaatc gtagctattt tctgaccatt 360
ccgtatgaag aatgtaaacg tcgtcgtagc acccgtgttt atcagccgcc ggaccctccg 420
ggttattttg atggtcatgt ttggccgatg tatctgaaat atcgtcagga aatggaagat 480
attacctggg aagttgttta tctggatggt accaaaagcg atgaagaact gtttaatcag 540
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Met Lys Thr Phe Ile Ile Gly Ile Ser Gly Val Thr Asn Ser Gly Lys
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctggatatgg ataaaatgat gagcaccatt cagtgttgga tggaaaatgc acgtcatagc 240
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 199
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
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1 5 10 15
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195
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
atgaaaacct ttatcatcgg tattagcggc gttaccaata gcggtaaaac aaccctggca 60
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<211> 199
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Met Lys Thr Phe Ile Ile Gly Ile Ser Gly Val Thr Asn Ser Gly Lys
1 5 10 15
Thr Thr Leu Ala Lys Asn Leu Gln Lys His Leu Pro Asn Cys Cys Val
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Ile Ser Gln Asp Asp Phe Phe Lys Pro Glu Ser Glu Ile Glu Thr Asp
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65 70 75 80
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195
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 199
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Met Lys Thr Phe Ile Ile Gly Ile Ser Gly Val Thr Asn Ser Gly Lys
1 5 10 15
Thr Thr Leu Ala Lys Asn Leu Gln Lys His Leu Pro Asn Cys Cys Val
20 25 30
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35 40 45
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195
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgctgttta attataaacc gctgaatgat atttggaatc gtagctattt ttttaccctg 360
ccgtatgaag aatgtaaacg tcgtcgtagc acccgtgaat atcagccgcc ggaccctccg 420
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gtttatgaag atctgcagca ggaactggca aaacagaaat gtctgcaggt taccgcataa 600
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<211> 199
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
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1 5 10 15
Thr Thr Leu Ala Lys Asn Leu Gln Lys His Leu Pro Asn Cys Cys Val
20 25 30
Ile Ser Gln Asp Asp Phe Phe Lys Pro Glu Ser Glu Ile Glu Thr Asp
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Glu Asn Gly Phe Leu Gln Tyr Asp Val Leu Asp Ala Leu Asp Met Asp
50 55 60
Lys Met Met Ser Thr Ile Gln Cys Trp Met Glu Asn Ala Arg His Ser
65 70 75 80
Val Val Ser Thr Asp Gln Glu Ser Ala Glu Glu Ile Pro Ile Leu Ile
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Arg Ser Thr Arg Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Pro Pro Gly Tyr Phe Asp
130 135 140
Gly His Val Trp Pro Met Tyr Leu Lys Tyr Arg Gln Glu Met Glu Asp
145 150 155 160
Ile Thr Trp Glu Val Val Tyr Leu Asp Gly Thr Lys Ser Asp Glu Glu
165 170 175
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Lys Cys Leu Gln Val Thr Ala
195
<210> 29
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ctattttgtg accattccgt atgaagaatg taaac 35
<210> 30
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
atggtcacaa aatagctacg attccaaata tca 33
<210> 31
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ctattttttt accattccgt atgaagaatg taaac 35
<210> 32
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
atggtaaaaa aatagctacg attccaaata tca 33
<210> 33
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tctgaccatg ccgtatgaag aatgtaaacg tcg 33
<210> 34
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tacggcatgg tcagaaaata gctacgattc c 31
<210> 35
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tacggcatgg tcagaaaata gctacgattc c 31
<210> 36
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tacggcacgg tcagaaaata gctacgattc c 31
<210> 37
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tctgaccctg ccgtatgaag aatgtaaacg tcg 33
<210> 38
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
tacggcaggg tcagaaaata gctacgattc c 31
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
cacccgtgat tatcagccgc cggaccctcc 30
<210> 40
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tgataatcac gggtgctacg acgacg 26
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
cacccgtgaa tatcagccgc cggaccctcc 30
<210> 42
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tgatattcac gggtgctacg acgacg 26
<210> 43
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
tgtttatgaa ccgccggacc ctccgggtta ttttg 35
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
ggcggttcat aaacacgggt gctacgacga 30
<210> 45
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
caaaagcttt gaagaactgt ttaatcaggt ttatg 35
<210> 46
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tcttcaaagc ttttggtacc atccagataa ac 32
<210> 47
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
caaaagcgat gaagaactgt ttaatcaggt ttatg 35
<210> 48
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
tcttcatcgc ttttggtacc atccagataa ac 32

Claims (7)

1.一种烟酰胺核糖激酶突变体，其特征在于，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列与氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的烟酰胺核糖激酶突变体NrK15相比，在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第118位、第120位、第133位、第135位、第174位进行单突变、两两联合突变或四个联合突变；
所述的单突变为：
当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第135位由谷氨酰胺突变为谷氨酸，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第120位由异亮氨酸突变为缬氨酸，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第120位由异亮氨酸突变为甲硫氨酸，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第118位由亮氨酸突变为缬氨酸，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第133位由缬氨酸突变为天冬氨酸，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第133位由缬氨酸突变为谷氨酸，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第174位由谷氨酸突变为苯丙氨酸，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第174位由谷氨酸突变为天冬氨酸，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第118位由亮氨酸突变为苯丙氨酸，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示；
所述的两两联合突变为：
当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第133位由缬氨酸突变为谷氨酸，第118位由亮氨酸突变为苯丙氨酸，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第174位由谷氨酸突变为天冬氨酸，第133位由缬氨酸突变为谷氨酸，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第174位由谷氨酸突变为天冬氨酸，第118位由亮氨酸突变为苯丙氨酸，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示；
所述的四个联合突变为：
当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第174位由谷氨酸突变为天冬氨酸，第133位由缬氨酸突变为谷氨酸，第120位由异亮氨酸突变为亮氨酸，第118位由亮氨酸突变为苯丙氨酸，所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示。
2.权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示的烟酰胺核糖激酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示。
3.含有权利要求2所述的编码基因的载体，其特征在于，所述的载体为pET 表达载体、pCW表达载体、pUC表达载体或pPIC9k表达载体。
4.含有权利要求2所述的编码基因的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌或毕赤酵母。
5.权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶突变体、权利要求2所述的编码基因、权利要求3所述的载体、权利要求4所述的宿主细胞在制备β-烟酰胺单核苷酸中的应用。
6.一种制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
S1.配置反应体系，包含：0.5-10g/L权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶突变体，50mMpH6.0-8.0 磷酸钠缓冲液，5mM ATP，10-50g/L烟酰胺核糖，50mM六偏磷酸钠，50mM七水硫酸镁，0.5-10g/L PPK2酶；控制反应体系温度在35-40℃，进行搅拌反应；
S2.反应3h后进行HPLC检测；经过纯化后得β-烟酰胺单核苷酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
S1.配置反应体系，包含：0.5g/L权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶突变体，50mM pH6.5磷酸钠缓冲液，5mM ATP，10-50g/L烟酰胺核糖，50mM六偏磷酸钠，50mM七水硫酸镁，0.5g/LPPK2酶；控制反应体系温度在40℃，进行搅拌反应；
S2.反应3h后进行HPLC检测；经过纯化后得β-烟酰胺单核苷酸。
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