CN116240249A - 一种生物酶法水解核苷的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种生物酶法水解核苷的方法，以嘌呤核苷或者嘧啶核苷为原料，在核苷水解酶的催化作用下发生反应，制得对应碱基，反应过程中的温度为20‑50℃，pH为3.0‑6.0，反应在CaCl2或Ca(HCO3)2存在的条件下进行，CaCl2或Ca(HCO3)2的浓度为5‑50mM，所述嘌呤核苷或者嘧啶核苷的浓度为100‑400mM。本发明实现了在酸性条件下完全水解嘌呤核苷转化为对应碱基，对嘧啶核苷的水解率也超过95％。本发明的生物酶法水解核苷可以缩短生产周期，仅需要6‑12h即可获得产物，可以避免产物浓度低，分离纯化难度大，生产周期长，产品纯度不高等问题。

Description

一种生物酶法水解核苷的方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种核苷，具体来说是一种生物酶法水解核苷的方法。
背景技术
核苷是一类由嘌呤碱基或嘧啶碱基、核糖或脱氧核糖组成的化合物。核苷的水解产物主要包括腺嘌呤，鸟嘌呤，次黄嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶等碱基，它们在食品、化妆品、医药等多个行业有着广泛的用途。例如鸟嘌呤可用于化妆品着色剂、颜色添加剂、遮光剂(Panush S,et al.Subtle patina metallic coatings contain guanine.EP439112)。次黄嘌呤具有降血压、平喘、治疗痛风等药理活性(宋艳等.兔心肌中次黄嘌呤纯化工艺的优化.中国生化药物杂志,2012.33(06))。在农业生产上，次黄嘌呤具有杀菌作用，可用作农药中间体。胞嘧啶可用于合成抗艾滋病药物及抗癌药物。由于嘌呤碱基和嘧啶碱基用途广泛，因而其生产研究越来越受到重视。
目前，嘌呤碱基和嘧啶碱基具有工业化前景的生产方法主要包括酶水解法和化学合成法。其中化学合成通常需要高温高压的环境，还会用到大量有毒害的试剂，更重要的是底物转化率不高，限制了此类物质的生产。酶水解法是以核苷水解酶为催化剂，以多种核苷为原料，经一步酶促反应切割核苷的糖苷键获得对应碱基。核苷水解酶根据偏好的底物可进行分类，常见的有胞苷-尿苷核苷水解酶、肌苷-腺苷-鸟苷核苷水解酶等。Maciej等人从黄羽扇豆种子中纯化出偏好鸟苷-肌苷的核苷水解酶，在添加二价阳离子情况下酶活性达到最大(Maciej,et al.Calcium-stimulated guanosine–inosine nucleosidase fromyellow lupin(Lupinus luteus).Phytochemistry.2006,67(14))。孟等鉴定了谷氨酸棒杆菌来源三种核苷水解酶的酶学性质，发现它们都能够水解腺苷、胞苷、鸟苷、肌苷和尿苷，但底物偏好性有差异(孟燕等.谷氨酸棒杆菌核苷水解酶的酶学性质研究.食品与发酵工业,2022)。但是，目前报道的核苷水解酶的最适工作pH都接近中性，这非常不利于底物溶解。此外，水解反应的转化率很难超过95％，增加了下游分离纯化的难度。
因此，研发一种能在酸性环境下生物酶法高效彻底水解核苷的方法是非常有必要的。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种生物酶法水解核苷的方法，所述的这种生物酶法水解核苷的方法要解决现有技术中水解核苷的转化率很难超过95％，增加了下游分离纯化难度的技术问题。
本发明提供了一种生物酶法水解核苷的方法，以嘌呤核苷或者嘧啶核苷为原料，在核苷水解酶的催化作用下发生反应，制得对应碱基，反应过程中的温度为20-50℃，pH为3.0-6.0，所述反应在CaCl2或Ca(HCO3)2存在的条件下进行，CaCl2或Ca(HCO3)2的浓度为5-50mM，所述嘌呤核苷或者嘧啶核苷的浓度为100-400mM；
所述核苷水解酶的基因序列为如下(1)—(3)任一所示：
(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(2)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
(3)与(1)或(2)限定的核苷酸序列至少具有80％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
本发明中所使用的各种酶的具体存在形式包括酶液、酶冻干粉、含酶细胞以及各种固定化酶和固定化酶细胞，可以是未经纯化的粗酶形式、也可以是经部分纯化或完全纯化的形式。
本发明核苷是指嘌呤核苷或嘧啶核苷，包含腺苷，鸟苷，肌苷，胞苷，尿苷。
本发明核苷水解酶同源序列还包括与本发明所公开的基因序列有至少83％、91％、97％或98％序列相似性。其中，序列相似性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括Myers和Miller算法、Needleman-Wunsch全局比对法、Smith-Waterman局部比对法、Pearson和Lipman相似性搜索法、Karlin和Altschul的算法，这对于本领域技术人员来说是公知的。虽然并不是所有来源的核苷水解酶都具有本发明所主张的效果，但是来自Trypanosoma cruzi strain CL Brener和Trypanosoma conorhini的两个不同来源核苷水解酶都被证实具有效果，本领域技术人员可以知晓，本发明公开的SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列以及与(1)或(2)限定的核苷酸序列至少具有80％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子编码的蛋白质具有良好的催化效率。
本发明首次筛选到了具有优异水解转化率和催化活性的两种嗜酸核苷水解酶，分别来自Trypanosoma cruzi strain CL Brener和Trypanosoma conorhinia。发明人经过比较多种微生物来源的核苷水解酶的活性，证实与Trypanosoma conorhinia来源核苷水解酶具有75％以上氨基酸序列相似性的多种核苷水解酶均可以催化水解反应，只是水解转化率上有高低不同。
本发明所需核苷水解酶的一个实施例中制备方法如下：
(1)将SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列分别连接质粒中，得到重组质粒，然后转化至BL21(DE3)，得到重组菌；
(2)培养重组菌，诱导表达重组蛋白，利用高压匀浆机破碎收集菌体，通过镍离子亲和层析柱纯化蛋白。
本发明的一种实施方式中，重组菌以pET-28a(+)为表达载体。
本发明的一种实施方式中，重组菌以BL21或Rosetta为宿主菌。
本发明构建的方法实现了在酸性条件下完全水解嘌呤核苷转化为对应碱基，对嘧啶核苷的水解率也超过95％。
本发明的优点在于，本发明核苷水解酶可在酸性环境下彻底催化水解多种核苷形成相应碱基，酸性环境增大了底物的溶解度。对体系酶添加量、反应温度、pH和金属离子浓度进行优化，确立最佳反应条件，提高产量。本发明的生物酶法水解核苷可以缩短生产周期，仅需要6-12h即可获得产物，并且可以避免产物浓度低，分离纯化难度大，生产周期长，产品纯度不高等问题。
附图说明
图1为次黄嘌呤标准品液相图谱。
图2为鸟嘌呤标准品液相图谱。
图3为酶的表达纯化。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。下述实施例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
以下实施例中所用的两种核苷水解酶分别来自Trypanosoma cruzi strain CLBrener和Trypanosoma conorhinia(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)。将各自的基因分别连接至pET28a表达载体上，获得重组质粒pET28a-SEQ ID NO.1和pET28a-SEQ ID NO.2，将其分别转化至转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)，得到的阳性克隆，培养至OD600为0.6-0.8，加入终浓度为0.2mM的IPTG，18℃，220rpm诱导培养16h，获得重组菌pET28a-SEQ ID NO.1/BL21(DE3)和pET28a-SEQ ID NO.2/BL21(DE3)
实施例2
体外合成相关酶的纯化，具体步骤如下：
分别接两种实施例1的重组菌至50ml含有50mg/L卡那霉素的LB中，37℃，220rpm培养6-8h，随后按2％接种量接入100ml的LB中于37℃培养，待OD600达0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，18℃，220rpm诱导16-18h。离心收集菌体，弃去上清，加入适量的含有10mM咪唑，500mM NaCl的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)重悬菌体。将重悬后的菌体加入压力破碎机进行破碎，压力为700-800bar，直至菌液变澄清。收集破碎后的菌体，离心得到上清，将上清倒入镍柱中，使用含有不同浓度咪唑的Tris-HCl缓冲液洗脱，收集200mM咪唑浓度下的洗脱液。将洗脱液超滤浓缩，直至剩余体积达0.5ml左右，按体积比1:1加入50％的分子级甘油，混匀后分装，置于-80℃保存备用。对纯化得到的蛋白进行SDS-PAGE分析，结果如图3所示。其中1号泳道为protein marker；2号泳道为Trypanosoma cruzi strain CL Brener来源核苷水解酶；3号泳道为Trypanosoma conorhinia来源核苷水解酶。
实施例3
生物酶法水解肌苷，具体如下：
反应体系及反应条件：反应体系包括5mM CaCl2,400mM肌苷，Trypanosoma cruzistrain CL Brener来源核苷水解酶浓度为0.3-0.5g/L，总体积20mL，30-40℃，pH 4.0，反应时间为6h，得到产物次黄嘌呤。
按实施例2的体系，用高效液相色谱检测次黄嘌呤的含量，最终产量为399mM，水解转化率为99.8％。(结果如图1所示。)
实施例4
生物酶法水解鸟苷，具体如下：
反应体系及反应条件：反应体系包括5mM CaCl2,200mM鸟苷，Trypanosomaconorhinia来源核苷水解酶0.5-1.0g/L，总体积20mL，40-50℃，pH 5.0，反应时间为12h，得到产物鸟嘌呤。
按实施例3的体系，用高效液相色谱检测鸟嘌呤的含量，最终产量为199mM，水解转化率为99.5％。(结果如图2所示。)
实施例5
粗酶水解肌苷，具体如下：
反应体系及反应条件：反应体系包括200mM肌苷，20OD破碎后的表达Trypanosomacruzi strain CL Brener来源核苷水解酶的大肠杆菌菌体，总体积50mL，30-40℃，pH 4.0，反应时间为6h，得到产物次黄嘌呤。
按实施例4的体系，用高效液相色谱检测次黄嘌呤的含量，最终产量为197mM，水解转化率为98.5％。
实施例6
粗酶水解鸟苷，具体如下：
反应体系及反应条件：反应体系包括200mM鸟苷，20OD破碎后的表达Trypanosomaconorhinia来源核苷水解酶的大肠杆菌菌体，总体积50mL，40-50℃，pH 5.0，反应时间为6h，得到产物鸟嘌呤。
按实施例5的体系，用高效液相色谱检测鸟嘌呤的含量，最终产量为199mM，水解转化率为99.5％。
实施例7
多种嘌呤碱基和嘧啶碱基的生物酶法水解制备，具体如下表：
Figure SMS_1
Figure SMS_2
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>上海瑞苷生物科技有限公司、华东理工大学
<120>一种生物酶法水解核苷的方法
<130>2022.11.13
<160>2
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>981
<212>DNa
<213>人工序列
<400>1
atgccgaaag cggttatcct ggatcaggat ggtaaccacg atgatatcat cagcctggcg 60
ctgctgctgg cgtggccgga aaaagttagc gtgatcggtt gcatctgcac cgacgcggat 120
tgcttcgttg cagatgcgtt caacatcacc ggtaaactga tgtgcctgct gaacaaacgt 180
gcgaaccgtc cgctgttccc gatcggcatc tcttctttcc acggcgttaa cccgttcccg 240
atggaatggc gttgcagcgc gaaaaacatg gatgatctgc cgagcctgaa catcccggaa 300
cacaccgaaa tgtgggaaaa actgaaaccg gaatacgaaa aactggtggg tgaagaactg 360
ctggcggatc tggttatgaa ctctccggaa aaagttacca tctgcgtgac cggcccgctg 420
agcaacgttg cgtggtgcat cgaaaaatac ggtcgtcgtt tcaccgacaa agttgaagaa 480
tgcgttatca tgggtggtgc agttgatgtt ggtggtaacg ttttcctgcc gggtaccgat 540
ggcaccgcgg aatggaacat ctactgggac ccgccggcgg cgaaaaccgt tctggaatgc 600
ccgcacatcc gtaacgttct gttcagcctg aacagcacca acaccgttcc ggtttgcagc 660
agcctggtta aacgtttcgg tgcgcagaac gaatacctgc tgtctcagtt cgttggtagc 720
acctgggcaa tgtgcaccca ccacgttctg ctgcgtccgg gtgatggtta ctacgcgtgg 780
gatagcctga ccgcggcgta cgttatcgac aacaacctgg cggatctgga accgatggcg 840
ctggaagttg aaatcaacaa aaccaaagat gaaggccgta ccttccgttc tacccagggt 900
cgtacctgca cctacgttgc gaaaaacacc aacgcggaac tgttctacga tatggttctg 960
tctagcatgc gtatctgcta a 981
<210>2
<211>978
<212>DNa
<213>人工序列
<400>2
atgccgtctt ctgttatcct ggaccacgac ggtggtcacg acgacctgct ggcgctggcg 60
ctgctgctgg cgcacccgga aaaagttcgt ctgatcggtt gcatctgcac cgacgcggac 120
tgcttcgttg acgacgcgtt ctctgttacc ggtaaagtta tgtctctggt tcacacccgt 180
gcgaaagttc cgctgttccc gatcggtgtt tcttctttcc gtggtgttaa cccgttcccg 240
tctctgtggc gttctcacgc gaaaaacatg gacgacctgc cgtgcctgaa cctgccggaa 300
cacgttgcgc tgtgggacaa agttaaagcg gaaaaccgta aactggttgg tgaacagctg 360
ctggcggacc tggttatgaa ctctccggaa aaagttacca tctgcgttac cggtccgctg 420
tctaacgttg cgtggtgcat cgaaaaatac ggttctaaat tcaccgacaa agttaaagaa 480
tgcgttatca tgggtggtgc ggttgacgtt ggtggtaacg ttttcgaatc tacctctgac 540
ggtaccgcgg aatggaacat ctactgggac ccgccggcgg cgaaagttgt tctggcgtgc 600
ccgcacatgc gttctgttct gttctctctg gactctacca accacgttcc ggttacctct 660
tctctggttc agcgtttcgg ttctcagaac gaatgcctgc tgtctcagtt cgcgggttct 720
gcgtgggcga tgtgcaccca ctacgaactg atccgtccgg gtgacggtta ctacgcgtgg 780
gacgttctga ccgcggcgta cgttctggac cacaacctgg cggaagttga accgatcgcg 840
ctggaagttg aaaccaacaa aaccaaatct gaaggtcgta ccttccgttc tacccagggt 900
ggtccgtgca cctacgttgc gaaacacgtt aaagcggaca tgttctacga catggttctg 960
tcttctatgc gttgctgc 978。

Claims (1)

1.一种生物酶法水解核苷的方法，其特征在于，以嘌呤核苷或者嘧啶核苷为原料，在核苷水解酶的催化作用下发生反应，制得对应碱基，反应过程中的温度为20-50℃，pH为3.0-6.0，所述反应在CaCl2或Ca(HCO3)2存在的条件下进行，CaCl2或Ca(HCO3)2的浓度为5-50mM，所述嘌呤核苷或者嘧啶核苷的浓度为100-400mM；
所述核苷水解酶的基因序列为如下(1)—(3)任一所示：
(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(2)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
(3)与(1)或(2)限定的核苷酸序列至少具有80％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
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