TWI323175B - - Google Patents

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1323175 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係相關於一種生產N_乙醯_D_神經糖胺酸 (N-acety卜D-neuraminic acid)的方法及其應用。 【先前技術】 N-乙醯-D·神經糖胺酸（NeuAc)大量存在於細胞表面醣 蛋白（glycoprotein)與醣脂類（giyc〇|丨pjd)的末端上，在細胞 間辨識（cell-cell recognition)、生物訊息傳遞（sjgna| transduction)及致病菌感染等層面扮演著非常重要的角 色。許多以NeuAc為基礎架構的藥物已被用來治療流行性感 冒、糖尿病二型及癌症等多種疾病，為非常重要且昂貴的原 料藥，目前Neu Ac的生產有下列四種方法： 1.自天然物抽取

NeuAc可由天然物抽取法生產’由脫脂蛋黃（egg_y〇|k) 中，經由加酸或蛋白酶（protease)水解及脫鹽，再用離子交 換樹脂純化。另一個原料為乳清（mjIk whey)，經由同樣的 方法來生產NeuAc。另外，也有從聚唾液酸（coiominic acjd) 經由水解及層析純化來生產Neu Ac。由於原料的來源充裕， 由天然物抽取為目前工業化生產NeuAc的主要方法。 2.酵素催化合成法（Enzymatic Process) 以酵素法合成NeuAc的製程為兩步生化法，其所需要 的生物觸媒分別是將A/-乙醯-D-葡萄糖胺（GIcNAc)轉換成 N-乙酿-D-甘露糖胺（A/-acety卜D-mannosamine; ManNAc) 的 N-乙醯-D-葡萄糖胺 2-表異構酶 (A/-acety卜D-glucosamine 2-epimerase ; AGE)，以及將 1323175

ManNAc與丙嗣酸縮合成NeuAc的N-乙醯-D-神經糖胺酸 解離酶（A/-acety卜D-neuraminic acid lyase ; NeuAc lyase)。Ghosh等人在1965年首度自豬腎皮質純化出 AGE(pAGE)，證明其可催化ManNAc與GIcNAc間的可逆 性表異構化（epimerizatj0n)反應，也有文獻證明此酵素在 ATP存在下，正逆反應速度皆可提升約2〇倍。£· co//· NeuAc 解離酶由Kim等人（1988)首度用於催化ManNAc與丙酮 酸來合成NeuAc。基於對pAGE與NeuAc解離酶的瞭解， 因此即有文獻提出表異構酶/解離酶（epjmerase/|yase)兩步 酵素法來合成NeuAc。利用基因選殖方式將pAGE與NeuAc 解離酶在Ε· co//·中大量表現，再以分離純化技術獲得酵 素’將pAGE及NeuAc解離酶同時固定於過濾膜上，製成

酵素膜反應器（enzyme membrane reactor; EMR)，在 ATP 存在下，以EMR為觸媒催化ManNAc與丙酮酸合成 NeuAc 。這是一個以膜結合酵素催化系統 (membrane-enclosed enzymatic catalysis; MEEC)的技 術，應用於酵素化生產NeuAc。另外，亦有文獻報告直接 用大量純化的pAGE及NeuAc解離酶為觸媒，以持續添加 大量丙酮酸的方式使反應朝向合成NeuAc，GIcNAc對 NeuAc轉換率高達77 %。此法被認為較化學合成法具有製 程簡單、產率高及污染低等優點。 3.化學暨酵素合成法 由於以酵素催化法合成NeuAc的缺點為需要昂貴的 ATP來活化pAGE，而且相對於pAGE，NeuAc解離酶重組 6 1323175 蛋白較容易大量取得。因此，英國葛蘭素藥廄藥物研發中 心 Dawson 等人提出了化學暨酵素合成法 (chemoenzymatic process)合成 NeuAc 的製程，先用驗將 GIcNAc進行表異構化作用成為ManNAc，再利用e. coli NeuAc解離酶催化ManNAc與丙酮酸縮合成NeuAc。他們 在ManNAc之溶解度與濃度、丙酮酸濃度、NeuAc濃度及 pH值等物化參數間找出NeuAc解離酶最適的反應條件，因 而決定了以NeuAc解離酶生產NeuAc的反應模式。然而 NeuAc解離酶反應平衡為傾向NeuAc分解的方向，要讓 NeuAc解離酶朝向NeuAc合成的方向，需高濃度的 ManNAc ’意味著需要高濃度的GIcNAc。但是高濃度的 GlcNAc會抑制NeuAc解離酶的活性，造成產程上的瓶頸。 因此Dawson等人再提出以ManNAc及GIcNAc在不同溶 液有不同溶解度之性質’降低GIcNAc濃度而提高ManNAc 濃度，再利用E. co//· NeuAc解離酶催化合成NeuAc。 Dawson等人就以此”鹼處理暨NeuAc解離酶催化”製程申 請PCT專利，其申請號為w〇 Patent: 94/29476。此外， 曰本Tsukada等人也發展出類似化學暨酵素法來合成 NeuAc ’ 在 pH 10-12 的條件下使 GIcNAc 轉成 ManNAc， 再用NeuAc解離酶催化生成NeuAc，此製程也取得美國專 利(U.S. Patent No. 5,472,860)。 4.全細胞（Whole cell)轉換合成法 有別於上述所提的三種方法，Tabata等人提出全細胞 酵素之NeuAc合成法。以大量表現 Synec/7〇cysi/_s sp. 1323175 PCC6803 AGE基因的e. co//·細胞為第一個生物性觸媒， 催化GIcNAc之表異構化作用成為ManNAc，再以表現£. co//· NeuAc 合成酶（synthetase)基因（ne/ιβ)的 E. co//細 胞為第二個生物性觸媒，催化ManNAc與磷酸烯醇丙酮酸 (phosphoenolpyruvate ; PEP)成 NeuAc，而 PEP 是由葡萄 糖或果糖經第三種微生物 Corynebacterium ammor?/agfe/?es發酵來提供。此全細胞合成法沒有上述三種 方法中需添加ATP或化學廢棄物需處理的缺點。

目前已發表之酵素法合成NeuAc的製程為兩步生化

法’其所需要的生物觸媒分別是將GlcNAc轉換成ManNAc 的AGE，以及將ManNAc加上丙酮酸合成NeuAc的NeuAc 解離酶。在Kragl等人的酵素_膜反應器（EMr)製程中，需 添加5 mM ATP於反應液中，其NeuAc產率為4 5 g/Lh(1〇9 g/L-天）’ GlcN Ac及丙酮酸之轉換率為28 %及35 %。EM R 具有可重複使用性以及無副產物為此製程最大的優點。而 在Tsukada等人的游離酵素製程中，以持續添加丙酮酸的 策略來避免pAGE的抑制作用，因此獲得高達77 〇/〇的 GIcNAc轉換率，而NeuACi濃度達i53 g/L。然而，此製 程需添加9 mM的ATP ’且耗時250小時的反應時間導致 極低的產率（0.64 g NeuAc/L-h)。以上兩個以酵素法合成 NeuAc的製程最大的缺點為需添加Ατρ以提升pAQE的活 性，此依賴性質大大提升了 NeuAc的生產成本。以化學暨 酵素合成法為先用鹼將GIcNAc進行表異構化作用成為 ManNAc，再制Ξ 離酶魏與丙 1323175 較佳的是，該載體轉譯一種將N-乙醯-D-葡萄糖胺（问_ acetyl-D-g|UC0samine)轉換成 N-乙醯-D-甘露糖胺（N_ acetyl-D-manosamjne)的bAGE酵素；更較佳的是，該載 體所轉錄的酵素其分子量為44.7 kDa ;最佳的是，該載體 所轉錄的酵素包含SEQ ID NO. 4序列。 本發明另相關於一種生產將N-乙醯-D-葡萄糖胺（N_ acety卜D-g|UC0samine)轉換成N_乙醯甘露糖胺（n_ acetyl-D-manosamine)酵素之微生物，其中該微生物係包 含如申請專利範圍第1項所請的核酸序列。 較佳的是，該宿主細胞為原核細胞；更該原核細胞包 括co// ;最佳的是，係為寄存於財團法人食品工業發展 研究所之寄存編號BCRC94〇532的微生物。 本發明另相關於-種大量生產N_乙酿_D_葡萄糖胺2_ 表異構酶（/V-acety|-D-g|UC0samine 2_epjmerase; bAGy 酵素的方法，包括下列步驟： 將前述所請之微生物培養於培養液中；及自培養液_ 收取N-乙醯-〇·葡萄糖胺2_表異構酶酵素。 ::佳的是’回收方法係利用管柱層析進行;更佳的是， # 15萄糖胺2-表異構酶酵素之活性半衰其為48 , 時0 2表異構酶酵素其對 、Co2 +及Ni2♦不具抑 較佳的是，N-乙醯-D-葡萄糖胺 二價金屬離子 Mg2+、Mn2+、Zn2+、〇a 制或提昇其活性效果。 本發明另相關於一種生產 N-乙醯·D_神經糖胺酸⑺_ 1323175 acetyl_D-neu「aminic acid)的方法，其係包含： 將前述所生產之N-乙醯-D-葡萄糖胺2-表異構酶與N-乙酿-D-葡萄糖胺及丙酮酸共同反應，其中N_乙醯_D_葡萄 糖胺2-表異構酶與NeuAc解離酶以1 : 4〜1 : 24的比例共 同作用。 較佳的是’ N-乙醯-D-葡萄糖胺2-表異構酶與NeuAc 解離酶的比例係為，：16 ;更佳的是’ G|cNAc濃度為〇卜 1·5Μ，丙酮酸濃度為0.1-1.5M ;最佳的是，GIcNAc濃度 為0.8M，丙酮酸濃度為12M。 藉此’本發明可利用bAGE與NeuAc解離酶全細胞觸 媒之重複使用性’大幅提高生產NeuAc的產率與效率。 【實施方式】 在本發明所建立的全細胞生物催化系統中，表現bAQE 與NeuAc解離酶之全細胞觸媒可直接將基質G|cNAc及丙 酮I轉換σ成NeuAc。由於在胞外（/n wir〇)的分析證明 bAGE可以ATP、dATp及ADp均可作為活化劑 (activator) ’而且aTP在活化bAGE進行表異構化作用時 並不涉及ATP之能量消耗的水解作用。因此仏即可持續 的利用[灿菌體内的這些Ατρ作為活化劑。如此解決 了以酵素法合《NeuAc的製程中需添力口 Ατρ的缺點，而 大大降低了 NeuAc的生產成本。其次，嫌_ _的 非水解性活化作用使得全細胞生物觸媒具有可重複使用 性。本發明所建立的產程中，全細胞生物觸媒在重複使用 達8次時產率仍維#㈣以上。此外，以純化的酵素進行 1323175 活性分析顯示bAGE催化GIcNAc轉換為ManNAc之比活 性為124 u/mg ,比現有專利之豬腎N_乙醯葡萄糖胺表 異構酶（A/-acetyl-D-glucosamine 2-epimerase)高出 4 倍， 而且bAGE之/fcat值高達72x103 mirr1，顯示其高催化 效能。這些特點證明bAGE在工業化生產NeuAc的應用上 頗具競爭性。

NeuAc能促進藥物與體内酵素的接觸，提升藥效，也 能阻斷細胞表面上抗原的接觸’使藥物不會被免疫系統消 滅而造成排斥。NeuAc也是病菌、病毒感染或其毒素的結 合子（receptor)，可干擾病菌和病毒的感染，因此已被應用 在感冒藥、抗癌藥、心血管藥及人工合成神經節甘脂 (ganghoside)藥劑等。目前已有多種以NeUAc為基礎架構 之新藥獲得美國FDA允許上市，尤其是抑制流感病毒的藥 物’例如’吳國葛蘭素藥廠（Glaxo Wellcome and Biota Holding)用來抑制a型及B型流感病毒之神經胺酸 (neuraminidases)的 Zanamivir(商品名），此藥物即以

NeuAc為原料來合成’為目前所有抗流感藥物中抗藥性最 少的臨床用藥。因此，NeuAc為現今非常重要且昂貴的原 料藥 本發明係由藍綠藻^naibaena sp. CH1選殖出之age 基因（办叫e) ’將與£ co// NeUAc解離酶基因共同 或分別在c 〇//大量表現，首度以表現bAGE及NeuAc 解離酶之E. co//·細胞做為生物性觸媒催化gicnAc及丙酮 酸合成NeuAc。與現有之工業化產成比較，此全細胞的生 12 1323175 物催化系統具有高產率、高觸媒循環使用性以及不需添加 ATP等優點，尤具工業化利用的潛力。

NeuAc是唾液酸中最主要的一種基礎結構，存在於許 多分泌型或細胞表面醣蛋白與醣脂類的末端上，和細胞間 辨硪（ceH-cell recognition)、細胞附著（ce|| adhesion)、生 物訊息傳遞（signal transducti〇n)、發炎時白血球的滲出 (丨eucocyte diapedesis)以及B細胞的活化有相當大的關 聯，為生物體中非常重要的一種醣類。另外，NeuAc也與 致病菌感染有相當大的關聯，NeuAc是致病菌表面多醣類 中的成分，是病菌的毒性因子，提供病菌感染時的偽裝作 用而不被先天性免疫系統（jnnate jmmunjty)的補體所消 滅。相對的NeuAc可在細胞表面呈現出受體（recept〇「）的 特性，而被微生物、病毒、毒素、賀爾蒙以及免疫系統等 辨哉，包括某些致病函辨識細胞表面之N @ u A c得以與特定 的伯主細胞鍵結並侵入細胞。例如致病性微生物 He/Zcobacier Py/〇n·，專一性附著於胃黏膜細胞上的 NeuAc’而使宿主發生胃潰瘍。因此，NeuAc無論在人體 或微生物的生化功能上都扮演著非常重要的角色。 目前為止，在哺乳動物中已有人類、豬、老鼠及兔子 的age基因被選殖，在£· co//表現並進行酵素之生化性 質分析。然而，在已被發表的微生物基因體序列_，被發 現具有age基因的只有藍綠藻’包括如a/?ae/7a i/anajb///s ATCC 29314(序號（accession): NZ一ΑΑΕΑ00000000)、

Nostoc sp. pCC 7120(序號：Nc一〇〇3276)、

[SI 13 1323175 pt/nci/Yorme PCC 73102(序號：ΝΖ—ΑΑΑΥΟΟΟΟΟΟΟΟ)及 Sy/?ec/?ocysi/s sp. PCC6803(序號：NC_005232)等。其中

Synec/?ocys〖/s sp· PCC6803之AGE已被當做生物催化劑 用於合成NeuAc，唯其產率只有〇 6 g NeuAc/L_h。為得 到具高催化活性之AG E，俾用於建立一個全細胞生物轉換 法來合成NeuAc，本發明自A/iabaerja sp. CH1選殖其/bage 基因並在E. co//中表現，對酵素進行活性分析及生化性質 探討。以表現bage及E. co//* NeuAc解離酶之£· co//細 胞做為生物性觸媒’催化GlcN Ac及丙酮酸成為重要的原 料藥NeuAc。 本發明將以下述實施例進一步說明本發明之技術内 容，然而所列之實施例僅作說明之用，而無意於限定本發 明之範圍。任何習知該項技術人士，皆可根據本發明及具 體貫施例所述，在不偏離本發明精神及範圍下，作任意修 飾及更改，惟仍應涵括於本發明之範圍内。 實施例1.酵素基因的選殖、表現、純化與分析 A.基因的選殖 根據已發表之 A/0Sf0C sp. PCC 7120(序號： NC一003276)agie基因序列，設計兩條含有不同限制酶切位 的專一性引子’引子序列分別為eP5 : 5，-

C〇AIAIiIGGGAAAAACTTACAAGC-3· (Λ/de I 切位）（SEQ ID N〇. 2);及 EP3 : s'- CCT^iLACIACTCAAGGCCTCGAATTGTTG-S'iX/jo | 切 位）（SEQ ID NO. 3)。利用聚合酶連鎖反應（p〇|ymerase 1323175 chain reaction，PCR) ’ 將 bage 基因由 /A/iaibae/ia sp. CH1 染色體上大量複製出來’經限制酶剪切後，選殖入pET_32a 表現載體上’成為pET-fc»agfe。另外，根據已發表之£ c〇// 之(NeuAc lyase)基因序列，設計兩條專一性引子， 引子序 列 分 別 為 Ald5 : 5'-

C^AXAIiI<3CAACGAATTTACGTG-3’ （Λ/de 丨切位）及 Ald3 5，-CC-TC〇AGCCCGCGCTCTTGCATCAAC-3, ( Xho I 切位）。利用PCR的方法將目標基因由E c〇//染色體上 大量複製出來，經限制酶剪切後選殖入pET_32a表現載 體上’成為 pET-nan/\。將 pET-/3age 及 pET-nan/\ 分別轉 形入E. co// BL21 (DE3)中’挑選帶有構築目標基因的表

現載體之co// BL21 (DE3)單一菌落，接種入10 m| LB 培養基（含有100 "g/m丨安培西林）。置於37艺恆溫培養 I目中培養12〜16小時後，各取出5 m丨抽取質體DNA進行 基因疋序分析。結果顯示基因長1,167 bp (SEQ ID NO. 1) ’轉譯出來的蛋白質序列為SEQ ID NO. 4，分子詈之舛 算值為44.7kDa。 4 另外，取出1 m丨培養12〜16小時之菌液，接種入1〇〇 ml LB培養基（含1〇〇 "g安培西林），培養約4〜6小時至 〇D600約等於，，隨後加入|pTG(終濃度為〇 5 mM)，置於 28 °C值溫培養箱中以誘導蛋白質表現。利用Nj-NTA樹脂 (Qiagen)親合層析方法，由誘導過後之菌體粗抽液純化出 重組蛋白，以SDS-PAGE分析蛋白質的表現與純度。顯示 之刀子里約為4 5 k D a，其可溶性佔全部可溶性蛋白 15 1323175 的比例約為20%。 B ·酵素活性分析 1 · bAGE及NeuAc解離酶之活性分析 bAGE之活性測定是以GIcNAc為受質，分析其轉換 成ManNAc之活性。反應混合液（0.2 ml)中，含1〇〇 Mm Tris-HCI、pH 8.0、50 mM GIcNAc、1 mM ATP 及適量之 酵素液，於3 7 °C中反應3 0分鐘，反應後加入2贡丨之1 〇 〇/〇 S D S，再以1 〇 〇 c彿水煮1分鐘以終止反應。置於冰上冷 卻後，於4 °C下12,000 rpm離心5分鐘，上清液以〇 45 # m過濾膜過濾後進行ΗPLC分析。NeuAc解離酶之活性 測定是以ManNAc及丙酮酸為受質，分析其合成NeuAc 之活性。反應混合液（0.2 ml)中，含100 mM Tris-HCI、pH 8_0、50 mM ManNAc、0_5 Μ丙酮酸及適量之酵素液，反 應條件及分析方法與AGE相同。HPLC分析條件：採用有 基酸分析管枉（Aminex HPX-87H Ion Exclusion column 300 mm χ 7.8 mm，Bio-Rad)，在 65°C 加熱下，以 〇.〇55〇/0 H2S〇4為移動相，分析ManNAc'GluNAc'丙酮酸及NeuAc 之濃度。以純化之酵素分析其比活性，在1 mM ATP存在 下’測量bAGE對GIcNAc轉換為ManNAc之比活性 (specific activity);同時分析 NeuAc 解離酶催化 ManNAc 與丙酮酸合成NeuAc之比活性^ 1單位（u)之酵素活性定 義為：每分鐘催化1贡巾0丨e ManNAc生成所需之酵素量。 結果顯示bAGE之比活性為124 U/mg ; /ccat為7·2χι〇3 (min 1)。在沒有ATP存在下，bAGE之比活性約為8 U/mg。 ί S1 16 1323175 C之比活性為132 U/mg。分 之活化作用，顯示在ATP濃 而活性。

NeuAc解離酶催化合成NeuA 析不同濃度之ATP對bAGE 度為20 μΜ時，bAGE已達最

2. bAGE之最適反應pH m /、’皿度以及金屬離子依賴

性以pH 3〜10之條件下分析bA ^ t之活性，顯示在pH 8 〇 時bAGE有最大活性，在pH 7〜q ς μπ ’ 9.5之間可維持9〇 %以上 之相對活性（請參閱第一圖所示）。

J 另外’分別於25〜6CTC 反應溫度下，以GIcNAc為受皙八把kA^ ~又買勿析bAGE之活性，結果 顯示在4 5 °C時有最大的活性，而. 而在35〜50C之間仍維持 80 %以上之相對活性（請參閱第_ 阅弟一圖所不）。熱穩定性分析 顯示bAGE於45〇C之活性半衰期约盘，士 丁衣朗約為48小時。分析二價

金屬離子 Mg2+、MP、Zr、Ca2+、c〇2jNi2+(1MmmbAGE 活性之影響，發現所有金屬離子對bAGE活性皆無提升或 抑制的效果》 3·核普酸對bAGE之活化作用 分析各種核苷酸對bAGE活化作用之方法，為在上述 活性分析時以各種核苷酸取代ATp進行。由表一的結果發 現AMPPNP與dATp對bAGE具有與Ατρ相近之酵素活 化作用，而ADP則具有約90 %的活化能力，其他核苷酸 並不具有活化作用。由於AMPPNP是一種不會被水解的 ATP類似物，並具有與ατρ相同的活化作用，而且 仍具有相近的活化能力，顯示bAGE與ATP結合而促進酵 素反應的過裎，並不牽涉ATP水解的能量消耗作用。 17 1323175

100 8.5 3.7 5.3 101 90.5 9.3 95 4.6 6.7 5.4

ATP

GTP

CTP

UTP

AMPPNP

ADP

AMP

dATP

dGTP

dCTP

dTTP C.全細胞生物觸媒之活性分析 將丨PTG誘導bAGE與NeuAc解離酶表現之菌體離心 收集，以0.1 M Tris-HCI (pH 8.0)緩衝液清洗三次，秤重 後以緩衝液懸浮成0.2 g/ml之濃度，配成全細胞酵素液。 反應混合液（10 ml)中，含 0.1 M Tris-HCI (pH 8_0)、0.5 Μ GIcNAc、及2 %之bAGE或pAGE全細胞酵素液，於37 °c 中振蕩反應6小時。反應後取〇. 5 m丨反應液於小試管 (eppendoff)中，以12,000 rpm離心10分鐘，將上清液以 0,1 M Tris-HC丨（pH 8.0)緩衝液稀釋10倍，再以0.45 y m 18 1323175 的過濾膜過濾後進行HPLC分析。表現NeuAc解離酶之全 細胞酵素活性分析，除了以〇 5 M ManNAc及1 Μ丙綱酸 取代GIcNAc為受質之外，與分析bAGE全細胞酵素活性 之條件相同。 分析經 IPTG 誘導的 ε· co// BL21 (DE3) (pET-jbage)轉 型株對轉換GIcNAc成為ManNAc之活性，結果顯示在不 需添加ATP的條件下，表現bAGE之全細胞觸媒比活性為 32 U/g cel卜另外’分析 £ co// BL21 (DE3) (pET-naM) 對催化M a η N Ac與丙酮酸合成NeuAc之活性，測得此全細 胞觸媒比活性為1 32 U/g細胞。表示本發明所構築的基因 重組細胞皆可作為生物觸媒，進而可用於建立全細胞生物 觸媒來合成NeuAc的製程中。 D_全細胞生物觸媒合成NeuAc之分析 挑選帶有質體 pET-jbage 及 pET-nan>A 的 £. co//· BL21 (DE3)轉型株，培養於500 ml的LB培養液（含有1〇〇 "g安 培西林/ml) ’以37。(：恆溫培養，直至〇D600約等於1。隨 後加入IPTG(終濃度為0.5 mM)，於17°C恆溫培養箱中， 震盪培養10小時以誘導基因表現。將誘導過後之菌液，於 4 °C下以8,000 rpm離心1 5分鐘以回收菌體，加入0.1 Μ T「is-HCI (ρΗ8_0)緩衝液50 mh劇烈震盪清洗菌體，重複 清洗二次。秤量菌體濕重後以0.1 M Tris-HCI (pH 8.0)緩 衝液懸浮成0.2 g/ml之濃度，置於4 t備用。 全細胞觸媒合成NeuAc時，將1 00 ml含有已配製好 的受質溶液及全細胞生物觸媒之反應液置入250 ml之玻璃 1323175 管（giass vesse丨）水浴槽以磁石㈣進行合成及 應，並利用pH調控反應器（pH/〇Rp c〇nt_er pe3iQ， SUnteX’TaiWan)以1N HCI及1N Na0H來控制並穩定反 應期間的pH值於8_〇β每隔一段時間取樣，㈨，經離心、 過濾及稀釋後以HPLC分析轉換之結果。 結果： 1.全細胞觸媒之最適比率

搭配兩全細胞觸媒，α G丨cNAc &丙嗣酸為受質來合 成NeuAc a寺，首先分析最適個別全細胞觸媒之添加量。表 二為以不同比率的兩全細胞觸媒，在5小時的反應中合成 NeuAc之結果。固定bAGE全細胞觸媒的添加量於〔μ X 102 U/L，搭配4〜24倍於bAGE的NeuAc解離酶全細胞觸 媒，以0.8 Μ之GlcNAc #1.2M丙鋼酸為受質合成。 發現隨著NeuAc解離酶全細胞觸媒濃度增加，G|cNAc之 轉換率（conversion yie 丨 du NeuAc 之產率（pr〇ductjvity)也 跟著增加，t bAGE肖NeuAc解離酶全細胞觸媒活性比為 1: 16時’GIcNAc之轉換率為15%而產率達到7 4 g/L-h的最高值（濃度為0.12M)，此1:祕之活性比對應於 重量濃度（W/V)為2 %: 8 t NeuAc解離酶全細胞觸媒 超過16倍時，轉換率及產率皆無明顯增加。另外，在各種 比率之下’中間產㉗ManNAc的累積量約為〇 13m至〇 18 Μ。依據此結|，在本研究所建立的全細胞生物觸媒合成 NeuAc的製程中，兩全細胞生物觸媒之活性添加量即定為 1 : 16(6.25x1〇2 U/L : 1X10< (J/L)。 20 1323175 表二、全細胞觸媒之比率對合成NeuAc之產率及轉換 率的影響 U 10‘ UI-1)細胞 酵素活性 bAGE NeuAc 解離酶 NeuAc 解離酶 與 bAGE 的比率 GIcNAc之考 換率（％) 25 4 6.3±0.7 6.25 50 8 7 · 5± 1 · 1 6.25 75 12 1 0·0士 1 .5 6.25 1 00 16 1 5.0±2.8 6.25 125 20 1 6.0±3.0 6.25 150 24 1 5.0±2.5 (M) (M)

(gi'V 0.18 0.18 0.16 0.13 0.14 0.14 0.05 0.06 0.08 0.12 0.13 1.12 3.1 3.7 4.9 7.4 8.0 4 2·最佳受質濃度 為達到最大的GIcNAc轉換率及NeuAc產率，以活性 比為1 : 16之兩全細胞生物為觸媒，在不同的g|cNAC與 丙酮酸濃度下，分析GIcNAc的轉換率及NeuAc產率《由 表三的數值可發現，在12小時的反應中，當GIcNAc為0.4M 時，隨著丙酮酸增加’ GIcNAc之轉換率及NeuAc之產率 也跟著增加’在丙酮酸為1.6 Μ時，GIcNAc之轉換率達50 %之最高值’ NeuAc之產率為g/L_h，此時NeuAc的 濃度為0_2 M(61.4 g/L)。請參閱第三圖所示，第三圖係為 以1.2 Μ之GIcNAc與1.2 Μ之丙酮酸進行反應之濃度變 化圖，在6小時之内GIcNAc與丙酮酸皆迅速的消耗，而6 小時之後消耗速度趨緩。NeuAc在2小時後開始產生並持 續累積’在1 〇小時達到最高值，到12小時並未持續增加， 顯示反應已達平衡。至於ManNAc則在第一小時即產生， 21 約4小時後即—直維持在0.12〜0.14 M之間β Ε_全細胞生物觸媒之重複使用性分析 針對bAGE與NeuAc解離酶全細胞觸媒之重複使用性 進行分析。當第一個12，丨、時的反應達平衡後，將細胞觸媒 離〜回收’以〇·1 M Tris-HCI緩衝液（pH 8.0)清洗三次，隨 即進行第二個循環。第四圖顯*在8個循環的反應中， G|CNAC之轉換率可維持在第一個循環之80 %以上，且

NeuAc之產率均大於8 g/L_h，顯示利用bAGE與NeuAc 解離酶全細胞觸媒合成NeuAc具有可重複使用性。 以上所述，僅是本發明的較佳實施例，並非對本發明 作任何形式上的限制，任何所屬技術領域中具有通常知識 者’若在不脫離本發明所提技術特徵的範圍内，利用本發 明所揭示技術内容所作出局部更動或修飾的等效實施例， 並且未脫離本發明的技術特徵内容，均仍屬於本發明技術 特徵的範圍内。 【圖式簡單說明】 第一圖係為分析bAG E在不同ρ η值之活性。 第二圖係為分析bAGE在不同溫度之活性。 第二圖係為以1.2 Μ之G IcNAc與1.2 Μ之丙嗣酸進 行反應之濃度變化圖。 第四圖係為利用bAGE與NeuAc解離酶全細胞觸媒合 成NeuAc具有可重複使用性之表示圖。 【主要元件符號說明】 無 22 1323175 序列表 <11〇>許文輝 李晏忠 <120〉生產N-乙醯-D·神經糖胺酸(N-acetyl-D-neuraminic acid)的方法及其應用 <130> <160〉 4 <170> Patentln version 3.4 <210> 1 <211> 1167

<212〉DNA <213> Anabaena sp.CH 1

<400> 1 atggggaaaa acttacaagc actggcgcaa ctttacaaaa atgccctcct caacgacgta 60 ctcccgtttt gggaaaacca ctccctggat agtgaaggcg gttactttac ttgtctcgat 120 cgccagggta aggtgtatga cacagataaa tttatttggt tgcaaaatcg ccaagtctgg 180 actttttcta tgctgtgtaa ccagctagaa aaacgggaaa actggctcaa aattgctagg 240 aatggcgcta aatttcttgc ccaacatggt agagatgacg agggtaactg gtattttgcc 300 ctcacccgtg gaggcgaacc attagtacag ccttacaata tcttttctga ttgctttgcg 360 gcgatggctt ttagtcaata cgctctcgcc tctggtgaag agtgggcaaa agatgtggca 420 atgcaagcat ataacaatgt tttgcgtcgt aaagataacc ccaaaggcaa atataccaaa 480

acctatcccg gcacacgccc catgaaagcc ctagctgtgc cgatgatttt agccaacctc 540 actctagaaa tggaatggtt gcttccccag gagactctag agaacgtctt ggctgcaacc 600 gttcaggaag ttatgggtga ctttctcgac caagaacaag gattgatgta tgaaaatgtt 660 gcccctgatg gttcccacat cgattgtttt gaaggtcggc tgattaaccc tggtcacggt 720 attgaagcga tgtggtttat tatggacatc gcccgacgga aaaacgacag caagactatt 780 aaccaggcag ttgatgtggt gttaaatatc ctcaatttcg cctgggataa cgagtatggc 840 ggcttgtatt actttatgga tgcagcaggt catcctccac aacaattgga atgggatcaa 900 aaattgtggt gggtgcattt agaatctttg gtggctttgg cgatgggtta tcgtttgact 960 ggtcgtgatg cctgttgggc atggtatcaa aaaatgcacg attattcctg gcagcatttt 1020 gctgacccag aatatggtga gtggtttggc tacttaaatc gtcgtgggga agtgttgtta 1080 aatctcaaag gtggtaaatg gaagggatgt tttcatgtac cccgtgccat gtatctgtgt 1140 tggcaacaat tcgaggcctt gagttaa 1167 <210> 2 <211> 24 1 1323175 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>合成序列 <400> 2 ccatatgggg aaaaacttac aagc <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213>人工序列 <220>

<223>合成序列 <400〉 3 cctcgagact caaggcctcg aattgttg <210〉 4 <21 卜 388 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>合成序列 <400> 4

Met Gly Lys Asn Leu Gin Ala Leu Ala Gin Leu Tyr Lys Asn Ala Leu 1 5 10

Leu Asn Asp Val Leu Pro Phe Trp Glu Asn His Ser Leu Asp Ser Glu 20 25 30

Gly Gly Tyr Phe Thr Cys Leu Asp Axg Gin Gly Lys Val Tyr Asp Thr 35 40 45

Asp Lys Phe lie Trp Leu Gin Asn Arg Gin Val Trp Thr Phe Ser Met 50 55 60

Leu Cys Asn Gin Leu Glu Lys Arg Glu Asn Trp Leu Lys lie Ala Arg 65 70 75

Asn Gly Ala Lys Phe Leu Ala Gin His Gly Arg Asp Asp Glu Gly Asn 85 90

Trp Tyr Phe Ala Leu Thr Arg Gly Gly Glu Pro Leu Val Gin Pro Tyr 100 105 110

Asn lie Phe Ser Asp Cys Phe Ala Ala Met Ala Phe Ser Gin Tyr Ala 1601323175 115 120 125

Leu Ala Ser Gly Glu Glu Trp Ala Lys Asp Val Ala Met Gin Ala Tyr 130 135 140

Asn Asn Val Leu Arg Arg Lys Asp Asn Pro Lys Gly Lys Tyr Thr Lys 145 150 155

Thr Tyr Pro Gly Thr Arg Pro Met Lys Ala Leu Ala Val Pro Met lie 165 170 175

Leu Ala Asn Leu Thr Leu Glu Met Glu Tip Leu Leu Pro Gin Glu Thr 180 185 190

Leu Glu Asn Val Leu Ala Ala Thr Val Gin Glu Val Met Gly Asp Phe 195 200 205

Leu Asp Gin Glu Gin Gly Leu Met Tyr Glu Asn Val Ala Pro Asp Gly 210 215 220 240

Ser His lie Asp Cys Phe Glu Gly Arg Leu lie Asn Pro Gly His Gly 225 230 235 lie Glu Ala Met Trp Phe lie Met Asp lie Ala Arg Arg Lys Asn Asp 245 250 255

Ser Lys Thr lie Asn Gin Ala Val Asp Val Val Leu Asn lie Leu Asn 260 265 270

Phe Ala Trp Asp Asn Glu Tyr Gly Gly Leu Tyr Tyr Phe Met Asp Ala 275 280 285

Ala Gly His Pro Pro Gin Gin Leu Glu Trp Asp Gin Lys Leu Trp Trp 290 295 300 320

Val His Leu Glu Ser Leu Val Ala Leu Ala Met Gly Tyr Arg Leu Thr 305 310 315

Gly Arg Asp Ala Cys Trp Ala Trp Tyr Gin Lys Met His Asp Tyr Ser 325 330 335

Trp Gin His Phe Ala Asp Pro Glu Tyr Gly Glu Trp Phe Gly Tyr Leu 340 345 350

Asn Arg Arg Gly Glu Val Leu Leu Asn Leu Lys Gly Gly Lys Trp Lys 355 360 365

Gly Cys Phe His Val Pro Arg Ala Met Tyr Leu Cys Trp Gin Gin Phe 370 375 380

Glu Ala Leu Ser 385 3

Claims (1)

1323175 十、申請專利範圍： 1 · 一種經分離之核酸分子，其係包含SEQ ID NO. 1， 且編碼出一種將Ν·乙醯-D·葡萄糖胺（N_acety|_D_ glucosamine)轉換成 N-乙醯-D-甘露糖胺（N-acetyhD-manosamine)的酵素。 2 · 一種重組載體，其係為寄存於財團法人食品工業 發展研究所之寄存編號BCRC940532的重組載體。 3 ·如申請專利範圍第2項所述之重組載體，其中該 載體包含具有S E Q | D N 0. 1所示序列之核酸分子，利用 Nde丨以及Xh〇丨分別為5’以及3’切位接入pET32a表現 載體中而得。 4 ·如申請專利範圍第3項所述之重組載體，其中該 載體轉譯一種將N_乙醯-D_葡萄糖胺 glucosamine)轉換成 Ν-乙醯-D·甘露糖胺（N-acetyND- manosamine)的酵素。 5 ·如申請專利範圍第4項所述之重組載體，其中該 載體所轉錄的酵素其分子量為44.7 k Da。 6 ·如申請專利範圍第4或5項所述之重組載體，其 中該載體所轉錄的酵素包含SEQ ID NO. 4序列。 7 種生產將N -乙酿-D-葡萄糖胺（GicNAc)與丙酮 酸（pyruvate)直接催化合成N-乙醯-D-神經糖胺酸（NeuAc) 之酵素的微生物，其中該微生物係為具有N_乙醯_D_神經 糖胺酸解離酶之原核細胞，並且包含如SEQ ID N〇:彳所 不的核酸分子。 1323175 8 .如申請專利範圍第7項所述之微生物，其中該原 核細胞包括E. co//·。 9 .如申請專利範圍第8項所請之微生物，其係為寄 存於財團法人食品工業發展研究所之寄存編號 BCRC940532的微生物。 】 1 0 . —種大量生產N-乙醯-D-葡萄糖胺2-表異構酶 (A/-acety卜D-glucosamine 2-epimerase; bAGE)酵素的方 法，包括下列步驟： 將申請專利範圍第9項所請之微生物培養於培養液 中；及自培養液中收取具有N-乙醯_D_葡萄糖胺2_表異構 酶酵素活性之菌體。 1 1 .如申請專利範圍第i 〇項所述之方法，其中菌 體濃縮方法係利用離心或過滤的方法。 1 2 , —種生產N-乙醯_D-神經糖胺酸（N_acety|_D_ neuraminic acid)的方法，其係包含： 將申請專利範圍第1 〇至i i項任一項所生產之1乙 醯葡萄糖胺2_表異構酶與N_乙醯_D_葡萄糖胺及丙綱酸 共同反應，其中N-乙醯-D-葡萄糖胺2-表異構酶與NeuAc 解離酶可以各種比例共同作用；及 收集上述作用後所產生的N_乙醯_D_神經糖胺酸。 1 3 .如巾請專利範圍第i 2項所述之方法，其中N_ 乙酿葡萄糖胺2-表異構酶基因與NeuAc解離酶基因以 共同存在-制體巾或分料在二個㈣的方式表現。 1 4 ·如申請專利範圍第i 2項所述之方法，其令 1323175 GIcNAc 濃度為 〇 ι·15μ， 内酮酸濃度為η d ^ 1 5 .如申請專利&如 .-1 · 5 Μ， 其中 月專利1已圍第1 3項所土十、 GIcNAc濃度為m 5M， 汀述之方法 内_酸濃度為〇 其中 16.如申請專利範圍第15項所述之方： _紅濃度為_，兩明酸濃度為H 法 1 7 .如申請專利範圍第1 6項所述之方* 乙酿-D-葡萄糖胺2·表異構酶與解離酶係以其中N 24的比例共同作用。 ' · 4~1 : 1 8 .如申請專利範圍第i 7項所述之方法，其中 乙醯-D-葡萄糖胺2-表異構酶與NeuAc解離酶係以^ . N 的比例共同作用。 1 9 .如申請專利範圍第1 8項所述之方法，其中 GlcN Ac濃度為〇.ι_15Μ，丙酮酸濃度為0.1-1.5|\/|。 2 ◦.如申請專利範圍第1 9項所述之方法，其中 GIcNAc濃度為〇·8Μ，丙_酸濃度為1.2Μ。 十一、圖式： 如次頁 3