CN111549013A

CN111549013A - 一种atp依赖的甘露糖激酶及其在岩藻基乳糖合成中的应用

Info

Publication number: CN111549013A
Application number: CN202010517289.XA
Authority: CN
Inventors: 杨建刚; 孙媛霞; 田朝玉; 朱玥明; 陈朋
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2020-06-09
Filing date: 2020-06-09
Publication date: 2020-08-18

Abstract

本发明公开了一种ATP依赖的甘露糖激酶及其在岩藻基乳糖合成中的应用，选自如下(a)～(c)所述的多肽：(a)由SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.2或者SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)由(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有催化甘露糖6‑磷酸脱磷酸功能由(a)衍生的多肽：(c)与(a)中的氨基酸序列有同源性70％以上的氨基酸序列，且具有催化甘露糖转化为甘露糖1‑磷酸功能的多肽。本发明还公布了谷氨酸棒杆菌重组菌株构建方法及其在岩藻基乳糖生物合成中的应用，通过增强甘露糖激酶与甘露糖代谢合成岩藻糖途径相关酶、以及底物乳糖透过酶与产物岩藻基乳糖转运蛋白活性，获得谷氨酸棒杆菌重组菌株，以葡萄糖、甘露糖和乳糖为底物合成岩藻基乳糖。

Description

一种ATP依赖的甘露糖激酶及其在岩藻基乳糖合成中的应用

技术领域

本发明属于生物制造领域，具体涉及一种ATP依赖的甘露糖激酶及其在岩藻基乳糖合成中的应用。

背景技术

人乳寡糖(主要包含岩藻基寡糖和唾液酸基寡糖)具有促进双歧杆菌在肠道上皮增殖和定殖，抑制病原菌黏附，维持婴儿肠道菌群平衡、参加机体免疫、促进脑部发育等生理功能，已逐渐成为人们关注的热点。目前欧盟已批准若干种人乳低聚寡糖作为食品配料，应用于婴幼儿用奶粉、老人用健康功能食品原材料以及医药品原材料中，市场前景非常广阔。迄今为止已鉴定了约200种结构各异的HMO，含量最为丰富同时最重要的是岩藻糖基乳糖。

目前人乳低聚寡糖主要依赖于化学合成，然而化学合成过程复杂，需要多步保护和去保护步骤，造成低选择性、低得率、溶剂有毒不适合于食品应用，同时化学合成需要昂贵的岩藻糖或者唾液酸作为底物，造成生产成本高，所以如何降低人乳寡糖的生产成本，提高合成效率和食品安全性已经成为迫切需要解决的问题；酶法催化合成岩藻基乳糖，往往需要昂贵的前体GDP-岩藻糖，且前体来源有限，难以实现大规模生产。与化学合成和酶法催化方法相比，微生物发酵法生产岩藻基乳糖具有明显优势；目前已经报道了多个微生物重组菌株用于发酵合成岩藻基乳糖如CN201610562080.9；CN201811072267.6；CN201811516891.0；CN201910093684.7等，这些菌株大都以葡萄糖或者岩藻糖和乳糖为原料发酵合成岩藻基乳糖；相关研究发现以甘露糖为碳源进行发酵时，岩藻基乳糖合成前体GDP-甘露糖细胞内积累量更高，因此相关专利CN201910396709.0公布了以甘露糖为原料制备岩藻基乳糖方法。在该专利中，甘露糖通过葡萄糖激酶转化为甘露糖6-磷酸，后者经过甘露糖6-磷酸变位酶转化为甘露糖1-磷酸，进而进入岩藻基乳糖合成途径，由于甘露糖6-磷酸也可以异构为果糖6-磷酸，被细胞代谢，所以该专利中甘露糖转化率较低。甘露糖1-糖激酶催化甘露糖和ATP转化为甘露糖1-磷酸和ADP，所获得的甘露糖1-磷酸可进入岩藻糖合成途径用于合成岩藻基乳糖，与CN201910396709.0专利报道路径相比，含有甘露糖1-糖激酶的岩藻基乳糖合成途径具有反应步骤短、效率高、降低细胞生长代谢消耗等优势；因此，筛选效率高且催化甘露糖转化为甘露糖1-磷酸的糖激酶，对于提升甘露糖转化为岩藻基乳糖的合成效率至关重要。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种催化甘露糖磷酸化生成甘露糖1-磷酸的酶，在本发明中，这种具有催化甘露糖磷酸化生成甘露糖1-磷酸功能的酶命名为甘露糖激酶MK，选自如下(a)～(c)所述的多肽：

(a)由SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2,和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)由(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有催化甘露糖6-磷酸脱磷酸功能由(a)衍生的多肽；

在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。同时，在C末端或N末端添加一个或数个氨基酸，通常也不会改变蛋白质的功能。

(c)与(a)中的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列，且催化甘露糖磷酸化生成甘露糖1-磷酸功能的多肽。

另外还包括如(a)中所示氨基酸序列的多肽的基础上的活性片段、或其活性衍生物、类似物。所述“活性片段”、“活性衍生物”和“活性类似物”是指在基本上保持本发明M6PP多肽相同的生物学功能或活性的多肽。

本发明的目的之二在于提供一种多核苷酸：

(d)编码权利要求1中(a)～(c)所述多肽的多核苷酸。

(e)编码权利要求1中(a)～(c)所述多肽的片段、类似物或衍生物的多核苷酸；

(f)在严格条件下与(d)或(e)限定的多核苷酸序列杂交且编码具有催化甘露糖6-磷酸脱磷酸功能多肽的多核苷酸；

(h)与(d)或(e)或(f)限定的多核苷酸序列有70％同一性且编码具有催化甘露糖6-磷酸脱磷酸功能的蛋白质的多核苷酸。其中，与上述(d)或(e)或(f)限定的多核苷酸序列杂交的核酸片段，长度至少含10个核苷酸，优选地，20个核苷酸以上，更优选地，50个核苷酸以上，最佳为100个核苷酸以上。

进一步地，上述多核苷酸为DNA或RNA。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以单链的或者是双链的；DNA可以是编码链或非编码链。

本发明的目的之三在于提供一种含有编码甘露糖激酶MK多肽多核苷酸的重组载体。

所述重组载体指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、动物细胞病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体，如pET-21a等，只要能在宿主细胞内稳定复制和存在，任何载体都可以用于构建重组表达载体。

本发明的目的之四是提供用于发酵生产2'-岩藻糖基乳糖的谷氨酸棒杆菌重组菌株。

所述重组菌株通过强化表达乳糖透过酶、α-1,2-岩藻糖转移酶、磷酸甘露糖变位酶基因，甘露糖1-磷酸鸟苷转移酶基因，鸟苷二磷酸甘露糖4,6-脱水酶基因，鸟苷二磷酸岩藻糖合成酶基因，糖外排转运蛋白基因的表达；进一步强化糖激酶MK基因表达获得的。

具体的乳糖透过酶基因可选自来源于大肠杆菌(E.coli)，α-1,2-岩藻糖转移酶基因可选自幽门螺旋菌(Helicobacter pylori)或者E.coli，优选幽门螺旋菌，所述糖外排转运蛋白选自伯氏耶尔森氏菌(Yersinia bercovieri)；磷酸甘露糖变位酶、甘露糖1-磷酸鸟苷转移酶、鸟苷二磷酸甘露糖4,6-脱水酶、可选自来源于大肠杆菌，鸟苷二磷酸岩藻糖合成酶均选自来源于E.coli；甘露糖激酶可选自来源于长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)。

本发明目的之五在于提供所述的合成2'-岩藻糖基乳糖的谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建方法，具体包括以下步骤：

1)构建包含乳糖透过酶基因、α-1,2-岩藻糖转移酶基因、糖外排转运蛋白基因的重组表达载体pX1。

所述重组表达载体pX1的具体方法包括以下步骤：

PCR扩增来源于大肠杆菌的乳糖透过酶基因lacY(SEQ ID NO.4)，来源于幽门螺旋菌的α-1,2-岩藻糖转移酶基因futC(SEQ ID NO.5)，来源于伯氏耶尔森氏菌的糖外排转运蛋白基因yberc0001_9420(SEQ ID NO.6)；采用酶切连接方法将上述片段构建至表达载体pXMJ19(Jakoby,M.；Ngouoto-Nkili,C.-E.；Burkovski,A.Construction and applicationof new Corynebacterium glutamicum vectors.Biotechnol.Tech.1999,13,437-441.)中，获得重组表达载体pX1。

2)构建包含磷酸甘露糖变位酶基因，甘露糖1-磷酸鸟苷转移酶基因，鸟苷二磷酸甘露糖4,6-脱水酶基因，鸟苷二磷酸岩藻糖合成酶基因的重组表达载体pE1。

所述重组表达载体pE1的具体方法包括以下步骤：

PCR扩增来源于大肠杆菌的磷酸甘露糖变位酶基因(SEQ ID NO.7)，甘露糖1-磷酸鸟苷转移酶基因(SEQ ID NO.8)，鸟苷二磷酸甘露糖4,6-脱水酶基因(SEQ ID NO.9)，鸟苷二磷酸岩藻糖合成酶基因(SEQ ID NO.10)；采用酶切连接方法将上述片段构建至表达载体pEC-XK99E(Kirchner,O.；Tauch,A.Tools for genetic engineering in the aminoacid-producing bacterium Corynebacterium glutamicum.J.Biotechnol.2003,104,287-299)中，获得重组表达载体pE1。

4)将重组表达载体pX1和pE1电转化至谷氨酸棒杆菌13032中，获得重组菌株CglFL-1。

具体的，制备谷氨酸棒杆菌感受态，采用电转化方式，将重组表达载体pX1和pE1共转入野生型谷氨酸棒杆菌13032中，得到重组菌株CglFL-1。

5)构建包含甘露糖激酶，磷酸甘露糖变位酶基因，甘露糖1-磷酸鸟苷转移酶基因，鸟苷二磷酸甘露糖4,6-脱水酶基因，鸟苷二磷酸岩藻糖合成酶基因的重组表达载体pE2。

所述重组表达载体pE2的具体方法包括以下步骤：

PCR扩增来源于长双歧杆菌的甘露糖激酶基因(SEQ ID NO.11)；采用酶切连接方法将上述片段构建至重组表达载体pE1中，获得重组表达载体pE2。

6)将重组表达载体pX1和pE2电转化至谷氨酸棒杆菌13032中，获得重组菌株CglFL-2。

具体的，制备谷氨酸棒杆菌感受态，采用电转化方式，将重组表达载体pX1和pE2共转入野生型谷氨酸棒杆菌13032中，得到重组菌株CglFL-2。

本发明目的之六在于提供谷氨酸棒杆菌重组菌株CglFL-1和CglFL-2在2'-岩藻糖基乳糖合成方面的应用，其特征表现为，重组菌株CglFL-1和CglFL-2可以发酵甘露糖和乳糖合成2'-岩藻基乳糖。

在优选地实施方式中，所述的方法，其特征在于，发酵生产条件初始菌体密度菌体浓度(OD₆₀₀)为0.5-60；温度30-37℃；甘露糖为20-80g/L，乳糖浓度10-40g/L。

在更优选地实施方式中，所述的方法，其特征在于，初始菌体浓度(OD₆₀₀)为40，甘露糖为40g/L,乳糖浓度20g/L。

本发明的有益效果为所构建的含有甘露糖激酶的重组谷氨酸棒杆菌，以甘露糖为碳源进行发酵时，岩藻基乳糖产量明显高于以葡萄糖为碳源进行发酵，生产的岩藻基乳糖将在食品和医药行业具有广泛的应用前景。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

具体实施方式

以下结合实施例进一步详述本发明。

本发明及实施例中提到的百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

各实施例中所用相同名称的材料或试剂如无特别说明即为相同的。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为实施本发明时对生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

本发明中所用引物由江苏金唯智生物技术有限公司合成。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1甘露糖激酶MK基因的获得、载体构建

通过数据库挖掘获得来源于长双歧杆菌Bifidobacterium longum的多肽序列(SEQ ID NO.1)，来源于毛螺科菌Lachnospiraceae bacterium的多肽序列(SEQ ID NO.2)，来源于梭菌属Clostridiales bacterium的多肽序列(SEQ ID NO.3)在不改变该多肽氨基酸序列的前提下，将编码上述多肽的基因序列替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，经密码子优化后，其基因序列分别为SEQ ID NO.11；SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示。将基因序列直接合成在pET-21a载体上，位于酶切位点NdeI和XhoI之间，重组质粒分别命名为pET-21a-BlMK；pET-21a-LbMK；pET-21a-CbMK。

实施例2甘露糖激酶蛋白的表达和纯化

分别将重组质粒pET-21a-BlMK；pET-21a-LbMK；pET-21a-CbMK转入大肠杆菌中，进行外源表达及纯化。

(1)分别大肠杆菌表达型重组质粒pET-21a-BlMK；pET-21a-LbMK；pET-21a-CbMK转入E.coli BL21(DE3)中，获得重组菌。

(2)挑单克隆至5mL LB液体培养基中，37℃、220r/min培养至OD600为0.6-0.8。将5mL LB培养基中菌液转接至800mL 2YT培养基中，37℃、220rpm培养至OD600为0.6-0.8时，降温至16℃，加IPTG至终浓度0.5mM，诱导表达16h。

(3)将上述培养菌液收集到50mL离心管中，5500r/min离心15min；

(4)弃上清，用2mL三乙醇胺缓冲液，pH 7.5，重悬菌体。

(5)破菌：采用高压低温破碎仪，在压力1200bar，4℃条件下进行破菌2次。4℃、20000r/min离心45min。

(6)纯化：上清在70℃水浴下热处理20分钟，4℃、20000r/min离心45min，取上清即得纯蛋白。

实施例3甘露糖激酶MK的酶活性测定

建立反应体系，包括甘露糖50mM，ATP 50Mm，Mg²⁺1mM,磷酸盐缓冲液(pH7.5，50mM),将反应体系放置于30℃水浴中，反应30min，煮沸终止反应。对样品进行14000rmp离心20min，并用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液做高效液相分析。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，分析柱：Sugar-Pak，流动相：超纯水，流速：0.4mL/min，柱温：80℃，检测器：示差折光检测器,上样量为10μl。

HPLC结果显示上述三种MK均可催化甘露糖磷酸化生成甘露糖1-磷酸，其中来源于毛螺科菌的甘露糖激酶酶活性为0.17U/mg，来源于梭菌属的甘露糖激酶酶活性为0.21U/mg，来源于长双歧杆菌的甘露糖激酶活性最高，达到4U/mg。

实施例4、构建谷氨酸棒杆菌重组菌株CglFL-1

1.1、根据Genbank中来源于大肠埃希氏菌MG1655的乳糖透过酶基因(SEQ IDNO.4)，来源于幽门螺旋菌的α-1,2-岩藻糖转移酶基因(SEQ ID NO.5)，来源于伯氏耶尔森氏菌的糖外排转运蛋白基因(SEQ ID NO.6)；设计引物,以基因组DNA为模板，扩增乳糖透过酶基因lacY，α-1,2-岩藻糖转移酶基因futC，糖外排转运蛋白基因yberc0001_9420，采用融合PCR方法获得融合片段“RBS-lacY-RBS-futC-RBS-yberc0001_9420”，融合片段经酶切后，分别与表达载体pXMJ19连接，经PCR验证后，获得重组表达载体，命名为pX1。

1.2、根据Genbank中来源于大肠埃希氏菌MG1655的磷酸甘露糖变位酶基因(SEQID NO.7)，甘露糖1-磷酸鸟苷转移酶基因(SEQ ID NO.8)，鸟苷二磷酸甘露糖4,6-脱水酶基因(SEQ ID NO.9)，鸟苷二磷酸岩藻糖合成酶基因(SEQ ID NO.10)；设计引物,以基因组DNA为模板，扩增磷酸甘露糖变位酶基因manB，甘露糖1-磷酸鸟苷转移酶基因manC，鸟苷二磷酸甘露糖4,6-脱水酶基因gmD，鸟苷二磷酸岩藻糖合成酶基因WcaG，采用融合PCR方法获得融合片段“RBS-manB-RBS-manC”和“RBS-gmD-RBS-WcaG”，融合片段经酶切后，分别与表达载体pEC-XK99E连接，经PCR验证后，获得携带有磷酸甘露糖变位酶基因manB，甘露糖1-磷酸鸟苷转移酶基因manC，鸟苷二磷酸甘露糖4,6-脱水酶基因gmD，鸟苷二磷酸岩藻糖合成酶基因WcaG的表达载体，命名为pE1。

1.3、将构建好的重组表达载体pE1和pX1电转化谷氨酸棒杆菌13032的感受态细胞，涂布终浓度为50μg/mL卡那霉素和20μg/mL氯霉素抗性的LB平板，30℃好氧培养24h，挑选单克隆若干。

1.4、菌落PCR验证确认磷酸甘露糖变位酶基因manB，甘露糖1-磷酸鸟苷转移酶基因manC，鸟苷二磷酸甘露糖4,6-脱水酶基因gmD，鸟苷二磷酸岩藻糖合成酶基因WcaG，乳糖透过酶基因lacY，α-1,2-岩藻糖转移酶基因futC，糖外排转运蛋白基因yberc0001_9420转移至谷氨酸棒杆菌细胞内，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株CglFL-1。

实施例5、构建谷氨酸棒杆菌重组菌株CglFL-2

1.1、根据Genbank中来源于长双歧杆菌的甘露糖激酶基因(SEQ ID NO.11)，设计引物,以基因组DNA为模板，扩增甘露糖激酶基因MK，PCR片段经酶切后，与重组表达载体pE1连接，经PCR验证后，获得携带有甘露糖激酶基因manK，磷酸甘露糖变位酶基因manB，甘露糖1-磷酸鸟苷转移酶基因manC，鸟苷二磷酸甘露糖4,6-脱水酶基因gmD，鸟苷二磷酸岩藻糖合成酶基因WcaG的表达载体，命名为pE2。

1.2、将构建好的重组表达载体pE2和pX1电转化谷氨酸棒杆菌13032的感受态细胞，涂布含有卡那霉素和氯霉素抗性的LB平板，进行培养。

1.3、菌落PCR验证确认甘露糖激酶基因manK,磷酸甘露糖变位酶基因manB，甘露糖1-磷酸鸟苷转移酶基因manC，鸟苷二磷酸甘露糖4,6-脱水酶基因gmD，鸟苷二磷酸岩藻糖合成酶基因WcaG，乳糖透过酶基因lacY，α-1,2-岩藻糖转移酶基因futC，糖外排转运蛋白基因yberc0001_9420转移至谷氨酸棒杆菌细胞内，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株CglFL-2。

实施例6、谷氨酸棒杆菌重组菌株CglFL-1在2'-岩藻基乳糖合成中的应用

1、谷氨酸棒杆菌重组菌株CglFL-1培养

选用丰富培养基BHI(内含脑心浸粉37g/L)在30℃、200rmp条件下对谷氨酸棒杆菌工程菌株CglFL-1进行培养约24h，将得到的菌株CglFL-1菌液，离心收集菌体，用丰富培养基BHI重悬。

2、岩藻基乳糖的发酵生产

取10mL谷氨酸棒杆菌重组菌株CglFL-1的浓缩菌液，加入终浓度为4％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的葡萄糖或者甘露糖和2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的乳糖进行发酵，发酵条件为：温度30℃，pH 7.0，发酵48h。

发酵结束后，发酵结束后，对样品进行14000rmp离心20min，并用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液做高效液相分析。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，分析柱：Sugar-Pak，流动相：超纯水，流速：0.4mL/min，柱温：80℃，检测器：示差折光检测器,上样量为10μl。

发酵48小时后，重组菌株CglFL-1实现以葡萄糖为碳源时，合成岩藻基乳糖，产量为0.8g/L；重组菌株CglFL-1以甘露糖为碳源时，岩藻基乳糖产量达到3.6g/L，是葡萄糖发酵产量的4倍(表1)。

表1谷氨酸棒杆菌重组菌株发酵合成岩藻基乳糖

实施例7、谷氨酸棒杆菌重组菌株CglFL-2在2'-岩藻基乳糖合成中的应用

1、谷氨酸棒杆菌重组菌株CglFL-2培养和发酵方法如实施例6所述。

2、样品处理和液相检测方法如上述实施例6所述。

发酵结果显示谷氨酸棒杆菌重组菌株CglFL-2以甘露糖和乳糖为原料时，2'-岩藻基乳糖产量为5.2g/L，产量是重组菌株CglFL-1的1.44倍，从而证实在重组菌株中增强基因甘露糖激酶的表达水平有助于提升岩藻基乳糖的合成能力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种ATP依赖的甘露糖激酶及其在岩藻基乳糖合成中的应用

<130> 2020

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 359

<212> PRT

<213> 长双歧杆菌()

<400> 1

Met Asn Asn Thr Asn Glu Ala Leu Phe Asp Val Ala Ser His Phe Ala

1 5 10 15

Leu Glu Gly Thr Val Asp Ser Ile Glu Pro Tyr Gly Asp Gly His Ile

20 25 30

Asn Thr Thr Tyr Leu Val Thr Thr Asp Gly Pro Arg Tyr Ile Leu Gln

35 40 45

Arg Met Asn Thr Gly Ile Phe Pro Asp Thr Val Asn Leu Met Arg Asn

50 55 60

Val Glu Leu Val Thr Ser Thr Leu Lys Ala Gln Gly Lys Glu Thr Leu

65 70 75 80

Asp Ile Val Arg Thr Thr Ser Gly Asp Thr Trp Ala Glu Ile Asp Gly

85 90 95

Gly Ala Trp Arg Val Tyr Lys Phe Ile Glu His Thr Met Ser Tyr Asn

100 105 110

Leu Val Pro Asn Pro Asp Val Phe Arg Glu Ala Gly Arg Ala Phe Gly

115 120 125

Asp Phe Gln Asn Phe Leu Ser Gly Phe Asp Ala Asn Gln Leu Thr Glu

130 135 140

Thr Ile Ala His Phe His Asp Thr Pro His Arg Phe Glu Asp Phe Lys

145 150 155 160

Lys Ala Leu Ala Ala Asp Glu Leu Gly Arg Ala Ala Gly Cys Gly Pro

165 170 175

Glu Ile Glu Phe Tyr Leu Ser His Ala Asp Gln Tyr Ala Val Val Met

180 185 190

Asp Gly Leu Arg Asp Gly Ser Ile Pro Leu Arg Val Thr His Asn Asp

195 200 205

Thr Lys Leu Asn Asn Ile Leu Met Asp Ala Thr Thr Gly Lys Ala Arg

210 215 220

Ala Ile Ile Asp Leu Asp Thr Ile Met Pro Gly Ser Met Leu Phe Asp

225 230 235 240

Phe Gly Asp Ser Ile Arg Phe Gly Ala Ser Thr Ala Leu Glu Asp Glu

245 250 255

Arg Asp Leu Asp Lys Val His Phe Ser Thr Glu Leu Phe Arg Ala Tyr

260 265 270

Thr Glu Gly Phe Val Gly Glu Leu Arg Asp Ser Ile Thr Ala Arg Glu

275 280 285

Ala Glu Leu Leu Pro Phe Ser Gly Asn Leu Leu Thr Met Glu Cys Gly

290 295 300

Met Arg Phe Leu Ala Asp Tyr Leu Glu Gly Asp Val Tyr Phe Ala Thr

305 310 315 320

Lys Tyr Pro Glu His Asn Leu Val Arg Ser Arg Thr Gln Ile Lys Leu

325 330 335

Val Arg Glu Met Glu Gln Arg Ala Asp Glu Thr Arg Ala Ile Val Ala

340 345 350

Asp Val Met Glu Thr Thr Lys

355

<210> 2

<211> 372

<212> PRT

<213> 毛螺科菌()

<400> 2

Met Thr Glu Glu Asn Leu Asn Tyr Pro Gly Ala Glu Glu Ala Leu Arg

1 5 10 15

Gln Phe Ala Val Glu Gly Cys Leu Lys Glu Ile Arg Pro Tyr Gly Asn

20 25 30

Gly His Ile Asn Asp Thr Tyr Leu Ala Val Phe Arg Thr Lys Asn Gly

35 40 45

Glu Glu Lys Arg Tyr Ile Leu Gln Arg Met Asn His Asn Ile Phe Lys

50 55 60

Asn Pro Pro Leu Leu Met Glu Asn Val Val Gly Val Thr Asp Tyr Leu

65 70 75 80

Arg Lys Met Leu Gln Ala Gln Gly Gly Asp Pro Ala Arg Glu Thr Leu

85 90 95

Asn Val Val Arg Thr Val Gly Gly Ala Ser Tyr Tyr Glu Asp Ala Gly

100 105 110

His Asn Phe Trp Arg Val Phe Leu Phe Val Glu Gly Thr Arg Cys Leu

115 120 125

Glu Lys Val Glu Ser Ala Arg Asp Phe Arg Asp Gly Gly Ala Ala Phe

130 135 140

Gly Asn Phe Gln Lys Met Leu Ala Glu Phe Pro Ala Lys Gln Leu His

145 150 155 160

Glu Thr Ile Pro Asn Phe His Asn Thr Pro Ser Arg Phe Arg Asp Phe

165 170 175

Arg Lys Ala Val Glu Glu Asp Arg Val Gly Arg Ala Ala Leu Ala Gly

180 185 190

Pro Glu Ile Gln Phe Ala Leu Ala Arg Glu Ala Glu Ala Ala Thr Leu

195 200 205

Thr Asp Leu Leu Asp Arg Gly Glu Leu Pro Leu Arg Val Thr His Asn

210 215 220

Asp Thr Lys Leu Asn Asn Ile Leu Phe Asp Gln Thr Thr Gly Arg Ala

225 230 235 240

Leu Cys Ile Ile Asp Leu Asp Thr Val Met Pro Gly Leu Ser Leu Tyr

245 250 255

Asp Phe Gly Asp Ser Ile Arg Phe Gly Ala Asn Thr Gly Ala Glu Asp

260 265 270

Glu Arg Asp Leu Ser Arg Val Glu Leu Asp Leu Asp Leu Phe Asp Ala

275 280 285

Phe Thr Glu Gly Phe Leu Lys Gly Cys Gly Gly Lys Leu Thr Gln Arg

290 295 300

Glu Val Glu Met Leu Pro Met Gly Ala Lys Leu Met Thr Tyr Glu Cys

305 310 315 320

Gly Leu Arg Phe Leu Ala Asp Phe Leu Glu Gly Asp Val Tyr Phe Lys

325 330 335

Val His Arg Glu Asn His Asn Leu Asp Arg Ala Arg Thr Gln Phe Lys

340 345 350

Leu Val Ala Asp Met Glu Lys Lys Trp Ala Gln Met Ala Ser Ile Val

355 360 365

Glu Lys His Cys

370

<210> 3

<211> 367

<212> PRT

<213> 梭菌属()

<400> 3

Met Glu Asn Ile Asn Val Ile Leu Glu Asn Phe Lys Phe Lys Gly Asp

1 5 10 15

Leu Ile Asp Cys Ser Val Tyr Gly Ser Gly His Ile Asn Val Thr Tyr

20 25 30

Leu Ala Val Tyr Asn Asn Asn Gly Lys Glu Glu Lys Tyr Ile Val Gln

35 40 45

Lys Ile Asn Pro Asn Val Phe Lys Asn Ile Glu Lys Leu Met Asp Asn

50 55 60

Ile Phe Ala Val Thr Ser Tyr Leu Arg Glu Glu Ile Arg Lys Ala Gly

65 70 75 80

Gly Asp Glu Asn Arg Glu Thr Leu His Phe Ile Lys Thr Val Asn Gly

85 90 95

Asp Lys Phe Tyr Val Ser Glu Asp Gly Ser Cys Tyr Arg Ala Tyr Ile

100 105 110

Phe Val Ser Asp Ser Val Ser Tyr Asn Ser Val Asp Asn Ala Glu Leu

115 120 125

Phe Lys Gln Ser Gly Val Ala Phe Gly Lys Phe Gln Arg Ile Leu Ala

130 135 140

Asp Phe Pro Ala Asp Thr Leu Tyr Glu Thr Leu Pro Glu Phe His Asn

145 150 155 160

Thr Lys His Arg Phe Asp Thr Glu Phe Ile Pro Ala Val Asn Asn Asn

165 170 175

Leu Ser Gly Arg Lys Glu Thr Cys Lys Ala Glu Ile Asp Phe Val Thr

180 185 190

Asp Arg Lys Ala Tyr Cys Ser Arg Leu Val Asp Leu Ile Asn Glu Gly

195 200 205

Lys Leu Pro Leu Arg Val Thr His Asn Asp Thr Lys Leu Asn Asn Val

210 215 220

Ile Phe Asp Lys Glu Ser Asp Gln Ala Ile Cys Val Ile Asp Leu Asp

225 230 235 240

Thr Val Met Pro Gly Leu Ala Leu Tyr Asp Phe Gly Asp Ser Ile Arg

245 250 255

Phe Gly Ala Asn Thr Ala Val Glu Asp Glu Lys Asp Leu Ser Lys Val

260 265 270

Ser Ile Asn Leu Asp Tyr Phe Lys Ala Tyr Ala Asp Gly Phe Leu Ser

275 280 285

Gln Ala Gly Glu Ser Leu Asn Gln Tyr Glu Ile Asp Asn Leu Ala Phe

290 295 300

Ala Ser Leu Leu Met Thr Phe Glu Cys Gly Met Arg Phe Leu Thr Asp

305 310 315 320

Tyr Leu Asn Gly Asp Thr Tyr Phe Lys Thr Ala Tyr Pro Glu His Asn

325 330 335

Leu Val Arg Ala Lys Asp Gln Phe Ala Leu Val Ala Asp Met Glu Lys

340 345 350

His Met Asp Glu Met Lys Asp Ile Ile Ser Ala Leu Val Val Lys

355 360 365

<210> 4

<211> 1254

<212> DNA

<213> 大肠杆菌()

<400> 4

atgtactatt taaaaaacac aaacttttgg atgttcggtt tattcttttt cttttacttt 60

tttatcatgg gagcctactt cccgtttttc ccgatttggc tacatgacat caaccatatc 120

agcaaaagtg atacgggtat tatttttgcc gctatttctc tgttctcgct attattccaa 180

ccgctgtttg gtctgctttc tgacaaactc gggctgcgca aatacctgct gtggattatt 240

accggcatgt tagtgatgtt tgcgccgttc tttattttta tcttcgggcc actgttacaa 300

tacaacattt tagtaggatc gattgttggt ggtatttatc taggcttttg ttttaacgcc 360

ggtgcgccag cagtagaggc atttattgag aaagtcagcc gtcgcagtaa tttcgaattt 420

ggtcgcgcgc ggatgtttgg ctgtgttggc tgggcgctgt gtgcctcgat tgtcggcatc 480

atgttcacca tcaataatca gtttgttttc tggctgggct ctggctgtgc actcatcctc 540

gccgttttac tctttttcgc caaaacggat gcgccctctt ctgccacggt tgccaatgcg 600

gtaggtgcca accattcggc atttagcctt aagctggcac tggaactgtt cagacagcca 660

aaactgtggt ttttgtcact gtatgttatt ggcgtttcct gcacctacga tgtttttgac 720

caacagtttg ctaatttctt tacttcgttc tttgctaccg gtgaacaggg tacgcgggta 780

tttggctacg taacgacaat gggcgaatta cttaacgcct cgattatgtt ctttgcgcca 840

ctgatcatta atcgcatcgg tgggaaaaac gccctgctgc tggctggcac tattatgtct 900

gtacgtatta ttggctcatc gttcgccacc tcagcgctgg aagtggttat tctgaaaacg 960

ctgcatatgt ttgaagtacc gttcctgctg gtgggctgct ttaaatatat taccagccag 1020

tttgaagtgc gtttttcagc gacgatttat ctggtctgtt tctgcttctt taagcaactg 1080

gcgatgattt ttatgtctgt actggcgggc aatatgtatg aaagcatcgg tttccagggc 1140

gcttatctgg tgctgggtct ggtggcgctg ggcttcacct taatttccgt gttcacgctt 1200

agcggccccg gcccgctttc cctgctgcgt cgtcaggtga atgaagtcgc ttaa 1254

<210> 5

<211> 897

<212> DNA

<213> 幽门螺旋菌()

<400> 5

atggctttca aagttgttca gatctgcggt ggtctgggta accagatgtt ccagtacgct 60

ttcgctaaat ctctgcagaa acacctgaac accccggttc tgctggacat cacctctttc 120

gactggtcta accgtaaaat gcagctggaa ctgttcccga tcgacctgcc gtacgcttct 180

gctaaagaaa tcgctatcgc taaaatgcag cacctgccga aactggttcg tgacaccctg 240

aaatgcatgg gtttcgaccg tgtttctcag gaaatcgttt tcgaatacga accgggtctg 300

ctgaaaccgt ctcgtctgac ctacttctac ggttacttcc aggacccgcg ttacttcgac 360

gctatctctc cgctgatcaa acagaccttc accctgccgc cgccggaaaa cggtaacaac 420

aaaaaaaaag aagaagaata ccaccgtaaa ctggctctga tcctggctgc taaaaactct 480

gttttcgttc acgttcgtcg tggtgactac gttggtatcg gttgccagct gggtatcgac 540

taccagaaaa aagctctgga atacatcgct aaacgtgttc cgaacatgga actgttcgtt 600

ttctgcgaag acctgaaatt cacccagaac ctggacctgg gttacccgtt catggacatg 660

accacccgtg acaaagaaga agaagcttac tgggacatgc tgctgatgca gtcttgcaaa 720

cacggtatca tcgctaactc tacctactct tggtgggctg cttacctgat caacaacccg 780

gaaaaaatca tcatcggtcc gaaacactgg ctgttcggtc acgaaaacat cctgtgcaaa 840

gaatgggtta aaatcgaatc tcacttcgaa gttaaatcta aaaaatacaa cgcttaa 897

<210> 6

<211> 1182

<212> DNA

<213> 伯氏耶尔森氏菌()

<400> 6

atgaaatctg ctctgacctt ctctcgtcgt atcaacccgg ttttcctggc tttcttcgtt 60

gttgctttcc tgtctggtat cgctggtgct ctgcaggctc cgaccctgtc tctgttcctg 120

tctaccgaag ttaaagttcg tccgctgtgg gttggtctgt tctacaccgt taacgctatc 180

gctggtatca ccgtttcttt catcctggct aaacgttctg actctcgtgg tgaccgtcgt 240

aaactgatca tggtttgcta cctgatggct gttggtaact gcctgctgtt cgctttcaac 300

cgtgactacc tgaccctgat caccgctggt gttctgctgg cttctgttgc taacaccgct 360

atgccgcaga tcttcgctct ggctcgtgaa tacgctgact cttctgctcg tgaagttgtt 420

atgttctctt ctatcatgcg tgctcagctg tctctggctt gggttatcgg tccgccgctg 480

tctttcatgc tggctctgaa ctacggtttc accctgatgt tctctatcgc tgctggtatc 540

ttcgttctgt ctgctctggt tgtttggttc atcctgccgt ctgttccgcg tgctgaaccg 600

gttgttgacg ctccggttgt tgttcagggt tctctgttcg ctgacaaaaa cgttctgctg 660

ctgttcatcg cttctatgct gatgtggacc tgcaacacca tgtacatcat cgacatgccg 720

ctgtacatca ccgcttctct gggtctgccg gaacgtctgg ctggtctgct gatgggtacc 780

gctgctggtc tggaaatccc gatcatgctg ctggctggtt actctgttcg ttacttcggt 840

aaacgtaaaa tcatgctgtt cgctgttctg gctggtgttc tgttctacac cggtctggtt 900

ctgttcaaat tcaaaaccgc tctgatgctg ctgcagatct tcaacgctat cttcatcggt 960

atcgttgctg gtatcggtat gctgtacttc caggacctga tgccgggtcg tgctggtgct 1020

gctaccaccc tgttcaccaa ctctatctct accggtgtta tcctggctgg tgttctgcag 1080

ggtggtctga ccgaaacctg gggtcacgac tctgtttacg ttatggctat ggttctgtct 1140

atcctggctc tgatcatctg cgctcgtgtt cgtgaagctt aa 1182

<210> 7

<211> 1377

<212> DNA

<213> 大肠杆菌()

<400> 7

atgcgtaccc gtgaatctgt cacagctgta attaaggcgt atgacgtccg tggtgttgtt 60

ggtgtcgata ttgatgctga tttcatttct gagactggcg ctgcctttgg tcggctcatg 120

cgtagtgagg gtgaaaccac cgttgctatt ggccatgaca tgcgtgattc ctcccctgaa 180

ttggccaagg cgtttgccga tggcgtgact gcacagggtt tggatgttgt tcatttggga 240

ctgacttcta ctgatgagct gtactttgcg tccggaacct tgaagtgtgc tggtgcgatg 300

tttactgcgt cgcataaccc cgctgagtac aacggcatca agttgtgtcg tgcgggtgct 360

cgtccggtcg gtcaggattc tggtttggcc aacatcattg atgatctggt tgagggtgtt 420

ccagcgtttg atggtgagtc aggttcggtt tctgagcagg atttgctgag cgcatatgcc 480

gagtacctca atgagcttgt tgatctgaag aacatccgcc cgttgaaggt tgctgtggat 540

gcggcaaacg gcatgggtgg gttcactgtc cctgaggtat tcaagggtct gccacttgat 600

gttgcgccac tgtattttga gcttgacggc aatttcccca accatgaggc caatcctctg 660

gagcctgcca acctggttga tttgcagaag tttaccgtag agaccggatc tgatatcggt 720

ttggcgttcg acggcgatgc ggatcgttgc ttcgtggtcg atgagaaggg ccagccagtc 780

agcccttcgg cgatctgtgc gatcgtagcg gagcgttact tggagaagct tccgggttcc 840

accatcatcc acaacctgat tacctctaag gctgtgcctg aggtgattgc tgaaaacggt 900

ggcactgcgg tgcgtactcg cgtgggtcac tccttcatca aggcgaagat ggcagagacc 960

ggtgcggcct ttggtggcga gcactctgcg cactactact tcactgagtt cttcaatgcg 1020

gactccggca ttttggctgc gatgcacgtg ctggctgcgc tgggaagcca ggaccagcca 1080

ctcagtgaga tgatggctag gtataaccgg tacgttgctt caggcgagtt gaactcccgt 1140

ttggctaatg cagaggcgca gcaagagcgc acccaggctg tgctcgatgc gttcgctgat 1200

cgcaccgagt ccgtggacac ccttgacggc gtgactgtgg aactcaagga cacctccgcg 1260

tggttcaacg tgcgtgcgtc caacaccgag ccgctgcttc gcctcaatgt tgaagctgca 1320

tcgaaggaag aagtcgatgc gttggtagcg gagattctag ggattatccg cgcataa 1377

<210> 8

<211> 1089

<212> DNA

<213> 大肠杆菌()

<400> 8

atgactttaa ctgacaacag caaaaacgtt gatgctgtca tcttggtcgg tggcaaaggt 60

acccgactgc gccccctgac cgtcaatact ccaaagccaa tgctgccaac tgctggccac 120

ccattcttga cccacctttt ggcccgcatc aaggccgcag gcatcacaca cgtcgtgctg 180

ggaacgtcat tcaaagctga agtcttcgag gaatacttcg gagatggctc cgaaatgggc 240

ttggaaattg aatatgtcgt cgaggatcag cctttgggca ctggtggtgg catccgaaac 300

gtctacgaca agctgcgtca cgatactgcg attgtgttca acggcgatgt gctctccggt 360

gcggatctca acagcattct ggacacccac cgcgaaaagg acgcagatct gaccatgcat 420

ctcgtgcgcg tagctaaccc tcgtgcgttt ggttgcgtcc ccaccgatga ggatggtcgc 480

gtcagcgaat tccttgaaaa gaccgaagat ccaccaaccg atcagatcaa cgccggctgc 540

tacgtgttca agaaggaact catcgagcag atcccggcag gccgagcagt ttccgtcgag 600

cgcgaaacct tccctcagct gttggaagaa ggcaagcgag tcttcggcca cgtcgacgct 660

tcctactggc gcgacatggg caccccaagc gacttcgtcc gcggctcggc tgacctggtc 720

cgcggcattg cgtactcccc attgctcgaa ggcaaaacag gagagtcgct tgtcgacgcc 780

tccgccggcg ttcgcgacgg cgtcctgctg ctcggcggaa ccgtagtcgg ccgcggcact 840

gagatcggtg ccggctgccg cgttgacaac actgttattt tcgacggcgt caccattgaa 900

ccaggtgcgg tcattgaaaa ttccatcatt tcctcgggag cacgcatcgg tgctaatgcg 960

cacatctccg gttgcatcat tggcgagggc gcacaggttg gtgctcggtg tgaactcaac 1020

gcagggatgc gcgtcttccc aggcgttgtg atcccagaca gcggaattcg tttttcgtct 1080

gatcagtag 1089

<210> 9

<211> 1122

<212> DNA

<213> 大肠杆菌()

<400> 9

atgtcaaaag tcgctctcat caccggtgta accggacaag acggttctta cctggcagag 60

tttctgctgg aaaaaggtta cgaggtgcat ggtattaagc gtcgcgcatc gtcattcaac 120

accgagcgcg tggatcacat ttatcaggat ccgcacacct gcaacccgaa attccatctg 180

cattatggcg acctgagtga tacctctaac ctgacgcgca ttttgcgtga agtacagccg 240

gatgaagtgt acaacctggg cgcaatgagc cacgttgcgg tctcttttga gtcaccagaa 300

tataccgctg acgtcgacgc gatgggtacg ctgcgcctgc tggaggcgat ccgcttcctc 360

ggtctggaaa agaaaactcg tttctatcag gcttccacct ctgaactgta tggtctggtg 420

caggaaattc cgcagaaaga gaccacgccg ttctacccgc gatctccgta tgcggtcgcc 480

aaactgtacg cctactggat caccgttaac taccgtgaat cctacggcat gtacgcctgt 540

aacggaattc tcttcaacca tgaatccccg cgccgcggcg aaaccttcgt tacccgcaaa 600

atcacccgcg caatcgccaa catcgcccag gggctggagt cgtgcctgta cctcggcaat 660

atggattccc tgcgtgactg gggccacgcc aaagactacg taaaaatgca gtggatgatg 720

ctgcagcagg aacagccgga agatttcgtt atcgcgaccg gcgttcagta ctccgtgcgt 780

cagttcgtgg aaatggcggc agcacagctg ggcatcaaac tgcgctttga aggcacgggc 840

gttgaagaga agggcattgt ggtttccgtc accgggcatg acgcgccggg cgttaaaccg 900

ggtgatgtga ttatcgctgt tgacccgcgt tacttccgtc cggctgaagt tgaaacgctg 960

ctcggcgacc cgaccaaagc gcacgaaaaa ctgggctgga aaccggaaat caccctcaga 1020

gagatggtgt ctgaaatggt ggctaatgac ctcgaagcgg cgaaaaaaca ctctctgctg 1080

aaatctcacg gctacgacgt ggcgatcgcg ctggagtcat aa 1122

<210> 10

<211> 966

<212> DNA

<213> 大肠杆菌()

<400> 10

atgagtaaac aacgagtttt tattgctggt catcgcggga tggtcggttc cgccatcagg 60

cggcagctcg aacagcgcgg tgatgtggaa ctggtattac gcacccgcga cgagctgaac 120

ctgctggaca gccgcgccgt gcatgatttc tttgccagcg aacgtattga ccaggtctat 180

ctggcggcgg cgaaagtggg cggcattgtt gccaacaaca cctatccggc ggatttcatc 240

taccagaaca tgatgattga gagcaacatc attcacgccg cgcatcagaa cgacgtgaac 300

aaactgctgt ttctcggatc gtcctgcatc tacccgaaac tggcaaaaca gccgatggca 360

gaaagcgagt tgttgcaggg cacgctggag ccgactaacg agccttatgc tattgccaaa 420

atcgccggga tcaaactgtg cgaatcatac aaccgccagt acggacgcga ttaccgctca 480

gtcatgccga ccaacctgta cgggccacac gacaacttcc acccgagtaa ttcgcatgtg 540

atcccagcat tgctgcgtcg cttccacgag gcgacggcac agaatgcgcc ggacgtggtg 600

gtatggggca gcggtacacc gatgcgcgaa tttctgcacg tcgatgatat ggcggcggcg 660

agcattcatg tcatggagct ggcgcatgaa gtctggctgg agaacaccca gccgatgttg 720

tcgcacatta acgtcggcac gggcgttgac tgcactatcc gcgagctggc gcaaaccatc 780

gccaaagtgg tgggttacaa aggccgggtg gtttttgatg ccagcaaacc ggatggcacg 840

ccgcgcaaac tgctggatgt gacgcgcctg catcagcttg gctggtatca cgaaatctca 900

ctggaagcgg ggcttgccag cacttaccag tggttccttg agaatcaaga ccgctttcgg 960

gggtaa 966

<210> 11

<211> 1080

<212> DNA

<213> 长双歧杆菌()

<400> 11

atgaacaaca ccaacgaagc gctgtttgac gtggcgagcc acttcgcgct ggagggtacc 60

gttgacagca tcgaaccgta cggtgatggc cacattaaca ccacctatct ggtgaccacc 120

gacggtccgc gttacatcct gcagcgtatg aacaccggca ttttcccgga taccgttaac 180

ctgatgcgta acgtggaact ggttaccagc accctgaagg cgcagggtaa agagaccctg 240

gacattgtgc gtaccaccag cggtgacacc tgggcggaaa tcgatggtgg cgcgtggcgt 300

gtttataagt ttattgagca caccatgagc tacaacctgg tgccgaaccc ggatgttttc 360

cgtgaagcgg gtcgtgcgtt cggcgacttt cagaacttcc tgagcggttt tgatgcgaac 420

caactgaccg agaccatcgc gcacttccac gacaccccgc accgttttga ggatttcaag 480

aaagcgctgg cggcggatga actgggtcgt gcggcgggtt gcggcccgga gattgaattt 540

tacctgagcc acgcggatca gtatgcggtg gttatggacg gtctgcgtga tggcagcatc 600

ccgctgcgtg tgacccacaa cgacaccaag ctgaacaaca ttctgatgga tgcgaccacc 660

ggtaaagcgc gtgcgatcat tgacctggat accatcatgc cgggcagcat gctgttcgac 720

tttggtgata gcattcgttt tggtgcgagc accgcgctgg aggatgaacg tgacctggat 780

aaggtgcact ttagcaccga gctgttccgt gcgtataccg agggttttgt tggcgaactg 840

cgtgatagca tcaccgcgcg tgaggcggaa ctgctgccgt tcagcggtaa cctgctgacc 900

atggagtgcg gcatgcgttt tctggcggac tacctggaag gtgatgttta cttcgcgacc 960

aagtatccgg agcacaacct ggtgcgtagc cgtacccaga tcaaactggt tcgtgagatg 1020

gaacaacgtg cggacgagac ccgtgcgatt gtggcggatg ttatggaaac caccaaataa 1080

<210> 12

<211> 1119

<212> DNA

<213> 毛螺科菌()

<400> 12

atgaccgaag aaaacctgaa ctacccgggt gctgaagaag ctctgcgtca gttcgctgtt 60

gaaggttgcc tgaaagaaat ccgtccgtac ggtaacggtc acatcaacga cacctacctg 120

gctgttttcc gtaccaaaaa cggtgaagaa aaacgttaca tcctgcagcg tatgaaccac 180

aacatcttca aaaacccgcc gctgctgatg gaaaacgttg ttggtgttac cgactacctg 240

cgtaaaatgc tgcaggctca gggtggtgac ccggctcgtg aaaccctgaa cgttgttcgt 300

accgttggtg gtgcttctta ctacgaagac gctggtcaca acttctggcg tgttttcctg 360

ttcgttgaag gtacccgttg cctggaaaaa gttgaatctg ctcgtgactt ccgtgacggt 420

ggtgctgctt tcggtaactt ccagaaaatg ctggctgaat tcccggctaa acagctgcac 480

gaaaccatcc cgaacttcca caacaccccg tctcgtttcc gtgacttccg taaagctgtt 540

gaagaagacc gtgttggtcg tgctgctctg gctggtccgg aaatccagtt cgctctggct 600

cgtgaagctg aagctgctac cctgaccgac ctgctggacc gtggtgaact gccgctgcgt 660

gttacccaca acgacaccaa actgaacaac atcctgttcg accagaccac cggtcgtgct 720

ctgtgcatca tcgacctgga caccgttatg ccgggtctgt ctctgtacga cttcggtgac 780

tctatccgtt tcggtgctaa caccggtgct gaagacgaac gtgacctgtc tcgtgttgaa 840

ctggacctgg acctgttcga cgctttcacc gaaggtttcc tgaaaggttg cggtggtaaa 900

ctgacccagc gtgaagttga aatgctgccg atgggtgcta aactgatgac ctacgaatgc 960

ggtctgcgtt tcctggctga cttcctggaa ggtgacgttt acttcaaagt tcaccgtgaa 1020

aaccacaacc tggaccgtgc tcgtacccag ttcaaactgg ttgctgacat ggaaaaaaaa 1080

tgggctcaga tggcttctat cgttgaaaaa cactgctaa 1119

<210> 13

<211> 1104

<212> DNA

<213> 梭菌属()

<400> 13

atggaaaaca tcaacgttat cctggaaaac ttcaaattca aaggtgacct gatcgactgc 60

tctgtttacg gttctggtca catcaacgtt acctacctgg ctgtttacaa caacaacggt 120

aaagaagaaa aatacatcgt tcagaaaatc aacccgaacg ttttcaaaaa catcgaaaaa 180

ctgatggaca acatcttcgc tgttacctct tacctgcgtg aagaaatccg taaagctggt 240

ggtgacgaaa accgtgaaac cctgcacttc atcaaaaccg ttaacggtga caaattctac 300

gtttctgaag acggttcttg ctaccgtgct tacatcttcg tttctgactc tgtttcttac 360

aactctgttg acaacgctga actgttcaaa cagtctggtg ttgctttcgg taaattccag 420

cgtatcctgg ctgacttccc ggctgacacc ctgtacgaaa ccctgccgga attccacaac 480

accaaacacc gtttcgacac cgaattcatc ccggctgtta acaacaacct gtctggtcgt 540

aaagaaacct gcaaagctga aatcgacttc gttaccgacc gtaaagctta ctgctctcgt 600

ctggttgacc tgatcaacga aggtaaactg ccgctgcgtg ttacccacaa cgacaccaaa 660

ctgaacaacg ttatcttcga caaagaatct gaccaggcta tctgcgttat cgacctggac 720

accgttatgc cgggtctggc tctgtacgac ttcggtgact ctatccgttt cggtgctaac 780

accgctgttg aagacgaaaa agacctgtct aaagtttcta tcaacctgga ctacttcaaa 840

gcttacgctg acggtttcct gtctcaggct ggtgaatctc tgaaccagta cgaaatcgac 900

aacctggctt tcgcttctct gctgatgacc ttcgaatgcg gtatgcgttt cctgaccgac 960

tacctgaacg gtgacaccta cttcaaaacc gcttacccgg aacacaacct ggttcgtgct 1020

aaagaccagt tcgctctggt tgctgacatg gaaaaacaca tggacgaaat gaaagacatc 1080

atctctgctc tggttgttaa ataa 1104

Claims

1.一种具有催化甘露糖磷酸化生成甘露糖1-磷酸功能的酶，其特征在于，选自如下(a)～(c)所述的多肽：

(a)由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)由(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有催化甘露糖磷酸化生成甘露糖1-磷酸功能由(a)衍生的多肽；

(c)与(a)中的氨基酸序列有70％以上同源性的氨基酸序列，且具有催化甘露糖磷酸化生成甘露糖1-磷酸功能的多肽。

2.一种多核苷酸，其特征在于，选自如下(d)～(f):

(d)编码权利要求1中(a)～(c)所述多肽的多核苷酸；

(f)在严格条件下与(d)或(e)限定的多核苷酸序列杂交且编码具有催化甘露糖磷酸化生成甘露糖1-磷酸功能多肽的多核苷酸；

(g)与(d)或(e)或(f)或(g)限定的多核苷酸序列有70％同一性且编码具有催化甘露糖磷酸化生成甘露糖1-磷酸功能多肽的多核苷酸。

3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，为(d)编码的多核苷酸，其基因序列为SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13中所示序列，所述多核苷酸为DNA或RNA。

4.一种重组载体，其特征在于：含有权利要求2或3所述的多核苷酸。

5.一种重组宿主细胞，其特征在于：转入了权利要求5所述的重组载体。所述的宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞，或这些宿主细胞的后代。

6.提供用于发酵生产2'-岩藻糖基乳糖的谷氨酸棒杆菌重组菌株，其特征在于，所述重组菌株通过强化表达乳糖透过酶、α-1,2-岩藻糖转移酶、以及糖外排转运蛋白基因表达，在此基础上，强化磷酸甘露糖变位酶基因，甘露糖1-磷酸鸟苷转移酶基因，鸟苷二磷酸甘露糖4,6-脱水酶基因，鸟苷二磷酸岩藻糖合成酶基因表达；进一步强化甘露糖激酶基因表达获得的。

优选地，乳糖透过酶基因来源于大肠杆菌，α-1,2-岩藻糖转移酶基因来源于幽门螺旋菌或者大肠杆菌，优选幽门螺旋菌；所述糖外排转运蛋白可选自伯氏耶尔森氏菌；磷酸甘露糖变位酶可选自来源于大肠杆菌，甘露糖1-磷酸鸟苷转移酶可选自来源于大肠杆菌，鸟苷二磷酸甘露糖4,6-脱水酶可选自来源于大肠杆菌，鸟苷二磷酸岩藻糖合成酶可选自来源于大肠杆菌；甘露糖激酶可选自来源于长双歧杆菌。

7.根据权利要求6所述的合成2'-岩藻糖基乳糖的谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建方法，其构建方法包括以下步骤：

3)构建包含甘露糖激酶，磷酸甘露糖变位酶基因，甘露糖1-磷酸鸟苷转移酶基因，鸟苷二磷酸甘露糖4,6-脱水酶基因，鸟苷二磷酸岩藻糖合成酶基因的重组表达载体pE2。

5)将重组表达载体pX1和pE2电转化至谷氨酸棒杆菌13032中，获得重组菌株CglFL-2。

8.根据权利要求7所述谷氨酸棒杆菌重组菌株CglFL-1和CglFL-2在2'-岩藻糖基乳糖合成方面的应用，其特征表现为，重组菌株CglFL-1和CglFL-2可以发酵葡萄糖或甘露糖和乳糖合成2'-岩藻基乳糖。

在优选地实施方式中，所述的方法，其特征在于，发酵生产条件初始菌体密度菌体浓度(OD₆₀₀)为0.5-50；温度30-37℃；甘露糖为20-100g/L，乳糖浓度10-50g/L。

9.根据权利要求8所述的甘露糖原料，可以是甘露糖纯品也可以是采用酸解或者酶转化方法转化魔芋、淀粉、纤维素、蔗糖、麦芽糖、果糖、葡萄糖、甘露醇等原料获得的甘露糖。