KR101185788B1 - 락토-n-비오스i 또는 갈락토-n-비오스의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
저가이고 또 간편하게 락토-N-비오스 I 및 갈락토-N-비오스를 제조하는 방법을 제공한다.
N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민, 인산, 락토-N-비오스 포스포릴라아제 (EC 2.4.1.211) 및 UDP-글루코오스-4-에피머라아제 (EC 5.1.3.2)의 존재하에서 (i) 당질 원료와 상기 당질 원료를 가인산 분해하고 α-글루코오스-1-인산을 생성하는 효소의 조합;및 (ii) α-글루코오스-1-인산을 UDP-글루코오스로 변환시키는 효소 및 UDP 갈락토오스를 갈락토오스-1-인산으로 변환시키는 효소와 이들의 보조 인자의 조합, 및/또는 α-글루코오스-1-인산 및 UDP-갈락토오스를 각각 UDP-글루코오스 및 α-갈락토오스-1-인산으로 변환시키는 효소 (UDP-Gly 생성효소)와 그의 보조 인자의 조합을 작용시키는 것을 특징으로 하는, 락토-N-비오스 I 또는 갈락토-N-비오스의 제조방법.
아세틸글루코사민, 아세틸갈락토사민, 당질, 락토-N-비오스 I, 갈락토-N-비오스
Description
본 발명은 효소법을 이용하여 락토-N-비오스 I 및 갈락토-N-비오스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
β 1,3-갈락토시드인 락토-N-비오스 I (Galβ1-3GlcNAc) 및 갈락토-N-비오스 (Galβ1-3GalNAc)는 생리활성 당쇄 중에 흔히 보이는 구조이고, 기능성 당 등으로서의 식품산업 상의 이용 이외에, 효소, 렉틴의 기질이나 저해제, 생체구성당 등 의약품, 시약으로서 이용할 수 있다.
이들 화합물의 종래의 제조법으로서는, 예컨대 갈락토오스와 N-아세틸글루코사민을 함유하는 기질을 출발원료로 하여, 돼지 고환 기원의 β-갈락토시다아제와 바실루스 써큘란스(Bacillus circulans)가 생산하는 β-갈락토시다아제와 순차적으로 반응시키는 것을 특징으로 하는 락토-N-비오스 I의 제조법(특허문헌1) 및 당 뉴클레오티드와 복합 당질 전구물질로부터 복합 당질을 생산하는 능력을 갖는 미생물, 동물세포 또는 곤충세포를 이용한 복합 당질의 생산방법(특허문헌2)이 알려져 있다. 그러나, 전자는 반응 효율이 낮고, 후자는 발효법에 의해 이들 당을 제조하는 방법이기 때문에, 제조되는 화합물은 아무래도 비용이 높게 되므로, 모두 실용성을 결여하고 있었다.
특허문헌3에는 락토-N-비오스 포스포릴라아제의 역반응 촉매 활성을 이용하고, 갈락토오스-1-인산을 원료로 하여, 락토-N-비오스 유도체를 합성가능한 것이 시사되어 있다. 그러나, 갈락토오스-1-인산이 고가이기 때문에 실용적 가치는 없었다.
특허문헌1 일본국 특개평 6-253878
특허문헌2 일본국 특개 2003-189891
특허문헌3 일본국 특개 2005-341883
발명의 개시
따라서, 저가이고 또 간편하게 락토-N-비오스 I 및 갈락토-N-비오스를 제조하는 방법에 관한 필요성이 존재한다.
본 발명자들은 예의 연구를 거듭한 결과, 효소법에 의해 락토-N-비오스 I 및 갈락토-N-비오스를 제조하는 방법을 완성하였다.
즉, 본 발명은 이하를 포함한다.
(1) N-아세틸글루코사민, 인산, 락토-N-비오스 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 211; 1,3 β-갈락토실-N-아세틸헥소사민 포스포릴라아제) 및 UDP-글루코오스-4-에피머라아제 (EC 5. 1. 3. 2)의 존재하에서,
(i) 당질 원료와 상기 당질(carbohydrate) 원료를 가인산 분해하여 α-글루코오스-1-인산을 생성하는 효소 (GlP 생성효소)의 조합;및
(ii) α-글루코오스-1-인산을 UDP-글루코오스로 변환시키는 효소 및 UDP-갈락토오스를 α-갈락토오스-1-인산으로 변환시키는 효소와 이들의 보조인자의 조합, 및/또는 α-글루코오스-1-인산 및 UDP-갈락토오스를 각각 UDP-글루코오스 및 α-갈락토오스-1-인산으로 변환시키는 효소 (UDP-Gly 생성효소)와 그의 보조인자의 조합을 작용시키는 것을 특징으로 하는, 락토-N-비오스 I의 제조방법.
(2) (i)의 조합이, 수크로오스와 수크로오스 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 7)의 조합, 녹말 또는 덱스트린과 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 1)의 조합, 셀로비오스와 셀로비오스 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 20)의 조합, 셀로덱스트린과 셀로덱스트린 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 49) 및 셀로비오스 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 20)의 조합, 라미나리올리고당과 라미나리비오스 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 31) 및/또는 β-1,3 올리고글루칸 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 30) 의 조합, 및 트레할로오스와 트레할로오스 포스포릴라아제 (EC 2.4. 1. 231)의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 조합인, 상기 (1)에 기재된 방법.
(3) (ii)의 조합이, UDP-글루코오스-헥소오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 12)와 UDP-글루코오스, UDP-갈락토오스 또는 그의 혼합물의 조합; 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 9) 및 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 10)와 UTP의 조합; 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2.7. 7. 9) 및 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 10)와 UDP-글루코오스 및/또는 UDP-갈락토오스 및 피로인산의 조합; 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 9) 및 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 10)와 UTP 및 UDP-글루코오스 및/또는 UDP-갈락토오스 및 피로인산의 조합; 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제의 양쪽 활성을 갖는 효소와 UTP의 조합; 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제의 양쪽 활성을 갖는 효소와 UDP-글루코오스 및/또는 UDP-갈락토오스 및 피로인산의 조합; 및 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제의 양쪽 활성을 갖는 효소와 UTP 및 UDP-글루코오스 및/또는 UDP-갈락토오스 및 피로인산의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 조합인, 상기 (1)에 기재된 방법.
(4) 효소가 담체에 고정화되어 있는, 상기 (1) ~ (3) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(5) N-아세틸갈락토사민, 인산, 락토-N-비오스 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 211) 및 UDP-글루코오스-4-에피머라아제 (EC 5. 1. 3. 2)의 존재하에서,
(i) 당질 원료와 상기 당질 원료를 가인산 분해하여 α-글루코오스-1-인산을 생성하는 효소 (GlP 생성효소)의 조합; 및
(ii) α-글루코오스-1-인산을 UDP-글루코오스로 변환시키는 효소 및 UDP-갈락토오스를 α-갈락토오스-1-인산으로 변환시키는 효소와 이들의 보조인자의 조합, 및/또는 α-글루코오스-1-인산 및 UDP-갈락토오스를 각각 UDP-글루코오스 및 α-갈락토오스-1-인산으로 변환시키는 효소 (UDP-Gly 생성효소)와 그의 보조인자의 조합을 작용시키는 것을 특징으로 하는, 갈락토-N-비오스의 제조방법.
(6)(i)의 조합이, 수크로오스와 수크로오스 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 7)의 조합, 녹말 또는 덱스트린과 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 1)의 조합, 셀로비오스와 셀로비오스 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 20)의 조합, 셀로덱스트린과 셀로덱스트린 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 49) 및 셀로비오스 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 20)의 조합, 라미나리올리고당과 라미나리비오스 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 31) 및/또는 β-1,3 올리고글루칸 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 30)의 조합, 및 트레할로오스와 트레할로오스 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 231)의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 조합인, 상기 (5)에 기재된 방법.
(7) (ii)의 조합이, UDP-글루코오스-헥소오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 12)와 UDP-글루코오스, UDP-갈락토오스 또는 그의 혼합물의 조합; 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 9) 및 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 10)와 UTP의 조합; 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 9) 및 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 10)와 UDP-글루코오스 및/또는 UDP-갈락토오스 및 피로인산의 조합; 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 9) 및 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 10)와 UTP 및 UDP-글루코오스 및/또는 UDP-갈락토오스 및 피로인산의 조합; 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제의 양쪽 활성을 갖는 효소와 UTP의 조합; 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제의 양쪽 활성을 갖는 효소와, UDP-글루코오스 및/또는 UDP-갈락토오스 및 피로인산의 조합; 및 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제의 양쪽 활성을 갖는 효소와, UTP 및 UDP-글루코오스 및/또는 UDP-갈락토오스 및 피로인산의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 조합인, 상기 (5)에 기재된 방법.
(8) 효소가 담체에 고정화되어 있는, 상기 (5) ~ (7) 중 어느 하나에 기재된 방법.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본국 특허출원 2006-346470호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명은, 효소법에 의한, 락토-N-비오스 I 또는 갈락토-N-비오스의 제조방법에 관한 것이다.
도 3에 본 발명의 효소법의 반응 경로의 개략도를 도시한다. 도 3에 나타내는 것과 같이, 본 발명의 효소법은 주로 이하의 3개의 효소반응으로 이루어진다: (1) 당질 원료의 가인산 분해반응;(2) 글루코오스-1-인산의 갈락토오스-1-인산으로의 변환 반응, (3) N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민으로부터의 락토-N-비오스 I 또는 갈락토-N-비오스의 합성반응.
(1)의 반응은, 상기 요소 (i)로서 포함되는 당질 원료와 상기 당질 원료를 가인산 분해하여 α-글루코오스-1-인산을 생성하는 효소 (GlP 생성효소)의 조합이, 인산의 존재하에서 반응하여 글루코오스-1-인산 및 환원성 말단(reducing terminal) 당이 생기는 반응이다. 상기 요소 (i)로서 사용되는 당질 원료와 관련 효소의 조합은, 여기에 한정되는 것은 아니지만, 수크로오스와 수크로오스 포스포릴라아제의 조합, 녹말 또는 덱스트린과 포스포릴라아제의 조합, 셀로비오스와 셀로비오스 포스포릴라아제의 조합, 셀로덱스트린과 셀로덱스트린 포스포릴라아제 및 셀로비오스 포스포릴라아제의 조합, 라미나리올리고당과 라미나리비오스 포스포릴라아제의 조합, 트레할로오스와 트레할로오스 포스포릴라아제의 조합 중 어느 하나, 또는 이들의 조합을 포함한다. 더욱 바람직한 조합은 수크로오스와 수크로오스 포스포릴라아제의 조합, 셀로비오스와 셀로비오스 포스포릴라아제의 조합, 셀로덱스트린과 셀로덱스트린 포스포릴라아제 및 셀로비오스 포스포릴라아제의 조합, 녹말 또는 덱스트린과 포스포릴라아제의 조합 중 어느 하나, 또는 이들의 조합이고, 가장 바람직한 조합은, 수크로오스와 수크로오스 포스포릴라아제의 조합이다. 당질 원료의 사용 농도는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 약 1 ~ 약 1000 g/L이고, 더욱 바람직하게는 약 10 ~ 약 1000 g/L 이다. G1P 생성효소의 사용형태는 특별히 한정되지 않고, 균체 추출액, 정제효소, 고정화 효소 등 여러 가지의 것을 이용할 수 있고, 그 사용량도 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 당질 원료 1 g 당 약 0.1 유닛 ~ 약 100 유닛으로 사용할 수 있다.
또 이 반응에 관련되는 인산은 어떠한 기원의 것이어도 좋다. 반응액에 가해지는 인산 농도는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 약 0.1 mM ~ 약 1000 mM, 더욱 바람직하게는 약 1mM ~ 약 100 mM 정도이다.
상기 (2)의 반응은, UDP-글루코오스-4-에피머라아제의 존재하, 상기 요소 (ii)로서 포함되는 효소 및 그의 보조 인자의 조합에 의해, 상기 (1)의 반응에서 생긴 글루코오스-1-인산을 UDP-Glc로 변환시키고 또 UDP-Gal을 갈락토오스-1-인산으로 변환시키는 반응이다.
요소(ii)로서 사용하는 효소는, α-글루코오스-1-인산을 UDP-글루코오스로 변환시키는 효소 및 UDP 갈락토오스를 갈락토오스-1-인산으로 변환시키는 효소의 조합, 또는 α-글루코오스-1-인산 및 UDP-갈락토오스를 각각 UDP-글루코오스 및 α-갈락토오스-1-인산으로 변환시키는 효소 (UDP-Gly 생성효소) 중 어느 하나, 또는 그의 조합을 포함한다. 즉, 요소(ii)로서 포함되는 효소 또는 효소의 조합은, 상기 효소 또는 효소의 조합에 의한 반응을 진행시키기 위한 보조인자, 및 UDP-글루코오스-4-에피머라아제의 존재하에서, α-글루코오스-1-인산을 α-갈락토오스-1-인산으로 변환시키는 상기 (2)의 변환반응을 진행시킨다.
따라서, 본 발명에서 의도하는 상기 요소 (ii)의 조합은, 이하의 조합: UDP-글루코오스-헥소오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 12)와 UDP-글루코오스, UDP-갈락토오스 또는 그의 혼합물과의 조합; 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 9) 및 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 10)와 UTP의 조합;글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7.9) 및 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 10)와 UDP-글루코오스 및/또는 UDP-갈락토오스 및 피로인산의 조합;글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 9) 및 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 10)와 UTP 및 UDP-글루코오스 및/또는 UDP-갈락토오스 및 피로인산의 조합;글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제의 양쪽 활성을 갖는 효소 (EC 2. 7. 7.9 및 EC 2. 7. 7. 10의 각 효소에는 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제와갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제의 양쪽 활성을 갖는 것도 존재함)와 UTP의 조합; 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제의 양쪽 활성을 갖는 효소와 UDP-글루코오스 및/또는 UDP-갈락토오스 및 피로인산의 조합;및 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제의 양쪽 활성을 갖는 효소와, UTP 및 UDP-글루코오스 및/또는 UDP-갈락토오스 및 피로인산의 조합을 포함한다. 상기 요소 (ii)의 조합이, UDP-글루코오스-헥소오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 12 )와 UDP-글루코오스 또는 UDP-갈락토오스 또는 그 양자의 조합;글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제의 양쪽 활성을 갖는 효소와 UTP의 조합; 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제의 양쪽 활성을 갖는 효소와 UDP-글루코오스 및/또는 UDP-갈락토오스 및 피로인산의 조합; 또는 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제의 양쪽 활성을 갖는 효소와 UTP 및 UDP-글루코오스 및/또는 UDP-갈락토오스 및 피로인산의 조합인 것이 바람직하다. 관련 요소(ii)의 조합은 각 조합을 단독으로 사용하여도 좋고, 조합하여 사용하여도 좋다.
이들 효소는 특별히 한정되지 않고 어떠한 기원의 효소를 사용하는 것도 가능하다. 이 효소의 사용형태는 특별히 한정되지 않고, 균체 추출액, 정제효소, 고정화 효소 등 여러 가지의 것을 사용할 수 있고, 그 효소의 사용량도 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 당질 원료1g 당 약 1유닛 ~ 약 1000 유닛으로 사용할 수 있다. 보조 인자의 사용 농도는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 약 0.01 mM ~ 약 100 mM, 더욱 바람직하게는 약 0.02 mM ~ 약 10 mM이다.
UDP-글루코오스-4-에피머라아제는 특별히 한정되지 않고 어떠한 기원의 효소를 사용하는 것도 가능하다. UDP-글루코오스-4-에피머라아제의 사용 형태는 특별히 한정되지 않고, 균체 추출액, 정제효소, 고정화 효소 등 여러 가지의 것을 사 용할 수 있고, 그 사용량도 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 당질 원료 1g 당 약 0.1 유닛 ~ 약 100 유닛으로 사용할 수 있다.
상기 (3)의 반응은, 락토-N-비오스 포스포릴라아제의 존재하, N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민을 출발원료로 하여, 상기 반응(2)에 의해 생긴 갈락토오스-1-인산으로부터 락토-N-비오스 I 또는 갈락토-N-비오스를 합성하는 반응이다. 출발원료로서 사용되는 N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 약 10 mM ~ 약 2M, 더욱 바람직하게는 약 100 mM ~ 약 1M이다. 락토-N-비오스 포스포릴라아제의 기원은 어떠한 것을 이용하여도 지장이 없지만, 바람직하게는 비피도박테륨(Bifidobacterium) 속 세균 유래의 효소(예컨대 특개 2005-341883)를 이용한다. 락토-N-비오스 포스포릴라아제의 사용형태는 특별히 한정되지 않고, 균체 추출액, 정제효소, 고정화 효소 등 여러 가지의 것을 사용할 수 있다. 락토-N-비오스 포스포릴라아제의 사용량도 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 당질 원료 1 g 당 약 0.1 유닛 ~ 약 100 유닛으로 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 상기 효소의 양은 이하와 같이 정의된다:락토-N-비오스 포스포릴라아제는, 0.1M MOPS 완충액 (pH 7.5), 10 mM 갈락토오스-1-인산,1MN-아세틸글루코사민으로 이루어진 반응액에서 1분간에 1마이크로몰의 인산을 유리하는 효소량을 1유닛으로 한다; UDP-글루코오스-헥소오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제는, 0.1M MOPS 완충액 (pH 7.5), 10 mM 갈락토오스-1-인산, 10 mM UDP-글루코오스, 10 mM 염화마그네슘으로 이루어진 반응액에서 1분간에 1마이크로몰의 글루코오스-1-인산을 생성하는 효소량을 1유닛으로 한다; UDP-글루코오스-4-에피머라아제는, 0.1M MOPS 완충액 (pH 7.5), 5mM UDP-갈락토오스으로 이루어진 반응액에서 1분간에 1마이크로몰의 UDP-글루코오스를 생성하는 효소량을 1유닛으로 한다; 수크로오스 포스포릴라아제 등의 포스포릴라아제 효소는 0.1 MMOPS 완충액 (pH 7.5), 10 mM 수크로오스 등의 기질(당질 원료), 10 mM 인산수소나트륨으로 이루어진 반응액에서 1분간에 1마이크로몰의 글루코오스-1-인산을 생성하는 효소량을 1유닛으로 한다; 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제의 양쪽 활성을 갖는 효소는, 0.1 M MOPS 완충액 (pH 7.5), 10 mM 피로인산, 10 mM UDP-글루코오스, 10 mM 염화마그네슘으로 이루어진 반응액에서 1분간에 1마이크로몰의 글루코오스-1-인산을 생성하는 효소량을 1유닛으로 한다.
상술한 본 발명의 효소는 임의 기원의 것이어도 좋고, 예컨대 세균 등의 원핵생물, 효모, 균류, 동물 등의 진핵생물 유래의 어느 것의 효소이어도 좋으며, 또는 재조합 효소이어도 좋다. 그와 같은 효소는 시판되는 것을 사용할 수 있거나, 또는 당업자에게 주지된 방법, 예컨대 천연으로부터 정제되어도 좋고, 또는 유전자 재조합법에 의해 얻을 수 있다. 예컨대, 유전자 재조합에 의한 방법으로는, 본 발명의 효소는, 문헌에 기재되어 있거나 또는 공지의 핵산 또는 단백질 서열 데이터 베이스에 등록되어 있는 상기 효소 유전자의 염기서열을 기초로 제작한 프라이머를 사용한 PCR에 의해 적당한 라이브러리 중의 상기 효소 유전자에 대응하는 mRNA로부터 제작한 cDNA를 증폭한 후에, 상기 cDNA를 시판하는 유전자 발현 벡터에 혼입(incorporate)하고, 상기 발현 벡터로 대장균 등의 균체를 형질변환하는 것에 의해, 균체 중에서 생성된다. 생성된 효소는, 황산 암모늄 분별분류(fractionation) 등의 조(crude) 분별분류 또는 각종의 칼럼 크로마토그래피 등, 당업자에게 주지된 단백질 정제법에 의해 정제될 수 있다. 또한, 효소를 GST나 His-tag와의 융합 단백질로서 발현시키는 것에 의해, 그 후의 정제를 용이하게 할 수 있다.
핵산 또는 단백질 서열 데이터 베이스는, 예컨대 GenBank, UniGene, EMBL 등 에 기재된 서열을 이용할 수 있다. 서열 검색 프로그램으로서 사용가능한 것은, BLAST, FASTA 등의 프로그램이다.
프라이머는 통상 17 ~ 30 염기, 바람직하게는 19 ~ 25 염기 길이를 갖는다. 목적하는 효소 유전자 또는 대응 cDNA를 주형으로 하고, 그의 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 상기 길이의 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머를 자동 DNA 합성장치에 의해 합성하고, 이것을 이용하여 PCR을 실시할 수 있다. PCR은, 목적하는 주형 DNA 및 프라이머 및 4종의 염기 (dNTP) 및 내열성 DNA 중합효소의 존재하에서, 변성, 어닐링 및 신장을 1 사이클로 하여, 통상 20 ~ 40 사이클을 실시하는 것을 포함한다. 변성은 이중가닥 DNA를 단일가닥으로 해리하기 위한 처리이고, 통상 94℃, 15초 ~ 5 분간의 처리를 실시한다. 어닐링은 단일가닥의 주형 DNA에, 그것에 상보적인 프라이머를 어닐링하는 처리이고, 통상 55~60℃, 30초 ~ 2 분간의 처리를 실시한다. 신장 반응은, 주형 DNA를 따라서 프라이머를 신장하는 반응이고, 통상 72℃에서 30초 ~ 10분간의 처리를 실시한다.
형질전환(transformation)은, 예컨대 Sambrook 등, Molecular Cloning,A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press 에 기재된 바와 같은 기술을 이용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 효소는 또한 상기의 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포로부터 직접 정제하여도 좋고, 세포 파괴액을 제조하고, 원심분리, 황산 암모늄 분별분류, 투석, 각종 크로마토그래피 (예컨대 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등), 전기영동, 한외여과, 결정화 등의 효소 정제를 위한 일반적인 기술을 적절히 조합하여, 목적하는 효소를 정제할 수 있다. 본 발명에 사용가능한 효소의 형태는 정제 효소 이외에, 조제(crude) 효소 (예컨대 균체 추출액, 동결건조체 등)이어도 좋다. 조제 효소를 사용하는 경우에는, 본 발명의 상기 반응을 방해하는 인자를 포함해서는 안된다.
또한 본 발명에서 상기 효소는 담체에 고정화하여 사용할 수 있다. 본 발명에 사용할 수 있는 고정화 효소의 제조 방법으로는 담체 결합법 (물리적 흡착법, 이온 결합법, 공유결합법, 생화학적 특이 결합법 등), 가교법 및 포괄법(entrapment) 등의 당업자에게 공지된 방법이 포함된다. 담체 결합법은, 효소를 불용성 담체에 결합시키는 방법이고, 이 경우, 셀룰로오스, 덱스트란, 아가로오스 등의 다당류의 유도체,폴리아크릴아미드 겔, 폴리스티렌 수지, 이온 교환 수지 등의 합성 고분자, 다공성 유리, 금속 산화물 등의 무기 물질 등을 담체로서 사용할 수 있다. 가교법은 관능기를 2개 이상 가진 시약과 효소를 반응시켜, 효소 사이에서 가교화를 행하는 것으로 고정화하는 방법이고, 가교 시약으로서, 글루타르알데히드, 이소시안산 유도체, N,N-에틸렌비스말레이미드, 비스디아조벤지딘, N,N-폴리메틸렌비스요오도아세트아미드 등이 사용될 수 있다. 포괄법은 천연 고분자나 합성 고분자의 겔 매트릭스 중에 효소를 포획(entrap)하는 격자형 등을 포함하며, 그때 사용되는 고분자 화합물로서, 폴리아크릴아미드 겔, 폴리비닐 알코올, 광경화성 수지, 녹말, 곤약 가루, 젤라틴, 알긴산, 카라기난 등이 포함된다.
본 발명의 적합한 실시형태에 의하면, 상기 반응에 관한 전체 효소를 고정화한 바이오리액터 칼럼을 이용하여, 고정화효소 리액터로서 반응을 실시하는 것도 가능하다. 이 경우, 원료나 보조 인자를 포함하는 수용액을, 예컨대 체류 시간 0.01 시간 ~ 300 시간의 유속으로 칼럼을 연속적으로 통과시키는 것에 의해 락토-N-비오스 I 및 갈락토-N-비오스의 제조를 실시할 수 있다.
반응 형태는 특별히 한정되지 않지만, 통상은 수용액 또는 완충액 중에서 실시된다. 반응액의 pH는 바람직하게는 5~9이다. 반응 온도는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 5℃~ 80℃, 더욱 바람직하게는 20℃~60℃이다. 또한 반응 시간은 특별히 한정되지 않지만, 0.1~3000 시간인 것이 바람직하다.
본 발명의 1개의 이점은 전체의 효소반응을, 1 용기 중에서 또는 바이오리액터를 이용하여 간편하고 또 용이하게 실시할 수 있는 점에 있다. 또한 상기 (1)~(3)의 반응은, 그 반응에 관한 효소의 성질을 기초로 하여 가역적일 수 있기 때문에, 전체로서 단순한 평형 반응으로 할 수 있고, 상기 반응(3)에서 생기는 인산, 및 상기 반응(2)에서 생기는 UDP-글루코오스 및/또는 UDP-갈락토오스를 리사이클할 수 있다. 따라서, 이들 물질은 촉매량으로 존재시키는 것만으로도 좋고, 비용 효과도 높다.
본 발명에 의해 얻을 수 있는 락토-N-비오스 I 및 갈락토-N-비오스는 임의의 방법으로 정제할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 의해 얻을 수 있는 락토-N-비오스 I 및 갈락토-N-비오스는, 칼럼 크로마토그래피나 결정화에 의해 단리하는 것이 가능하다. 칼럼 크로마토그래피로서, 여기에 한정되는 것은 아니지만, 크기 배제 크로마토그래피, 실리카겔 칼럼 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 한외여과 막분리, 역삼투막분리가 포함된다. 결정화 방법으로서는, 여기에 한정되는 것은 아니지만, 농축, 온도저하, 용매첨가 (에탄올, 메탄올, 아세톤 등)가 포함된다.
이하의 실시예에서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명의 범위는 여기에 한정되지 않는다.
도 1은, 도시된 당질 원료 및 이것을 가인산 분해하는 효소로부터, 본 발명의 방법에 의해, 락토-N-비오스 I가 제조될 수 있는 것을 나타내는 박층 크로마토 그래피의 결과이다.
도 2는, 수크로오스를 당질 원료로 하는 본 발명의 락토-N-비오스 I의 제조방법에서 수크로오스와 락토-N-비오스 I의 농도의 경시 변화를 도시한다.
도 3은, 본 발명의 효소법의 반응 경로의 개략도를 도시한다.
실시예 1.효소의 제조
본 발명자들은 수크로오스를 당질 원료로 한 때의 락토-N-비오스 I 합성에 관하여, 락토-N-비오스 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, UDP-글루코오스-4-에피머라아제, UDP-글루코오스-헥소오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제, 및글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제의 양쪽 활성을 갖는 효소를 얻기 위하여, 비피도박테륨 롱굼(Bifidobacterium longum) JCM 1217주(strain) 게놈 DNA로부터 상기 효소 유전자의 단리를 실시하였다. 락토-N-비오스 포스포릴라아제 유전자는 일본국 특개 2005-341883에 기재된 방법으로 얻었다. 수크로오스 포스포릴라아제 (BL 0536; 서열번호: 1), UDP-글루코오스-4-에피머라아제(BL1644;서열 번호: 2), UDP-글루코오스-헥소오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (BL1211;서열 번호: 3), 및 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제의 양쪽 활성을 갖는 효소(BL0739;서열 번호: 4)의 각 유전자는, 비피도박테륨 롱굼(Bifidobacterium longum) NCC 2705주 게놈 데이터 베이스에 등록되어 있는 상기 효소 유전자의 염기 서열을 기초로 하여 프라이머를 제조하였다(서열번호: 5 ~ 20; 표 1 참조).
표 1
이들을 이용하여, 비피도박테륨 롱굼(Bifidobacterium longum) JCM1217 주로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여 실시한 중합효소 연쇄 반응법 (PCR)에 의해 DNA 염기서열을 갖는 1346, 1238, 1820, 2053 bp의 명료한 밴드를 얻었다. 얻어진 밴드 (PCR 산물)를 DNA 시퀀서(Sequencer)로 분석하여 DNA 염기서열을 해독하였다 (서열표의 서열 번호: 1~4 참조). 이 DNA 염기서열을 아미노산으로 번역해보니, 각각 비피도박테륨 롱굼(Bifidobacterium longum) NCC2705주 유래 유전자와 상동성이 높은 1251, 1023, 1627, 1530 bp의 오픈 리딩 프레임(ORF)이 인식되었다. 이들 ORF가 상기 효소 유전자인 것을 실증하기 위하여, ORF의 5’말단 및 3’말단으로 제조한 프라이머(표 1 참조)를 이용하여 ORF 전장(full length)을 PCR에 의해 증폭하고, 도입된 제한효소 부위를 이용하여 시판되는 유전자 발현용 pET30 플라스미드에 연결하였다. 이 플라스미드를 이용하여, 상법에 의해 대장균을 형질전환하여, 형질전환체를 얻었다. 얻어진 형질전환체를 30℃에서 배양하고, 상기 유전자 발현 유도 후의 균체로부터 재조합 효소의 정제를 실시하였다. 정제는 각 효소의 C 말단에 부가된 히스티딘 태그 서열을 이용하고, 니켈 칼럼을 이용하여 실시하였다. 1L의 배양액으로부터 정제되는 효소량은 각각 표 1에 도시된 바와 같다. 생산된 재조합 효소가 각 효소 활성을 갖고 있는 점에서 클로닝된 각 유전자가 상기 효소 유전자인 것이 확인되었다. 각 효소의 활성은 이하와 같이 정의하였다. 또한 반응 온도는 전체 30℃로 하였다. 락토-N-비오스 포스포릴라아제는 0.1M MOPS 완충액 (pH 7.5), 10 mM갈락토오스-1-인산, 1M N-아세틸글루코사민으로 이루어지는 반응액에서 1분간에 1마이크로몰의 인산을 유리하는 효소량을 1 유닛으로 하 였다. UDP-글루코오스-헥소오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제는 0.1M MOPS 완충액 (pH 7.5), 10 mM갈락토오스-1-인산, 10 mM UDP-글루코오스, 10 mM 염화마그네슘으로 이루어지는 반응액에서 1분간에 1마이크로몰의 글루코오스1인산을 생성하는 효소량을 1 유닛으로 하였다. UDP-글루코오스-4-에피머라아제는 0.1M MOPS 완충액 (pH 7.5), 5 mM UDP-갈락토오스로 이루어지는 반응액에서 1분간에 1마이크로몰의 UDP-글루코오스를 생성하는 효소량을 1 유닛으로 하였다. 수크로오스 포스포릴라아제는 0.1M MOPS 완충액 (pH 7.5), 10 mM 수크로오스, 10 mM 인산수소나트륨으로 이루어지는 반응액에서 1분간에 1마이크로몰의 글루코오스-1-인산을 생성하는 효소량을 1 유닛으로 하였다. 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제의 양쪽 활성을 갖는 효소는, 0.1M MOPS 완충액 (pH 7.5), 10 mM 피로인산, 10 mM UDP-글루코오스, 10 mM 염화마그네슘으로 이루어지는 반응액에서 1분간에 1마이크로몰의 글루코오스-1-인산을 생성하는 효소량을 1 유닛으로 하였다.
셀로비오스 포스포릴라아제 (Acta Cryst., D60, 1877-1878 (2004)), 라미나리비오스 포스포릴라아제(Arch. Biochem. Biophys., 304 (2), 508-514 (1993))은 각각 괄호 내의 문헌에 기재된 방법으로 제조하였다. 포스포릴라아제는 Sigma-Aldorich 사로부터 토끼 근육 유래의 효소를 구입하였다.
실시예 2.수크로오스의 락토-N-비오스 I로의 변환(conversion)
수크로오스를 당질 원료로 하여 락토-N-비오스 I으로의 변환 반응을 실시하였다. 반응액 양은 1밀리리터로 하고, 최종 농도 0.24M 수크로오스, 0.24M N- 아세틸글루코사민, 10 mM 염화마그네슘, 30 mM 인산-나트륨 완충액 (pH 7.0),1 mM UDP-글루코오스로 이루어지는 기질 용액을 제조하고, 거기에 락토-N-비오스 포스포릴라아제, UDP-글루코오스-4-에피머라아제, UDP-글루코오스-헥소오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제, 수크로오스 포스포릴라아제를 각각 1 밀리리터 당 2U, 20U, 2.6U, 2U 부가하고, 30℃에서 90 시간 반응을 실시하였다. 반응을 10분간 비등 정지 후 반응액의 pH를 4.5로 조정하고, 인버타아제 처리를 실시하는 것에 의해 잔존 수크로오스를 분해하였다. 반응액을 TLC(용매 아세토니트릴 - 물 75: 25,담체 실리카겔 60)으로 분석한 결과, 락토-N-비오스 I 농도는 200 mM이었다. (도 1, 레인 2, 3)
실시예 3.셀로비오스의 락토-N-비오스 I으로의 변환
셀로비오스를 당질 원료로 하여 락토-N-비오스 I으로의 변환 반응을 실시하였다. 반응액 양은 1밀리리터로 하고, 최종 농도 0.24M 셀로비오스, 0.24M N-아세틸글루코사민, 10 mM 염화마그네슘, 30 mM 인산-나트륨 완충액 (pH 7.0), 1mM UDP-글루코오스로 이루어지는 기질 용액을 제조하고, 거기에 락토-N-비오스 포스포릴라아제, UDP-글루코오스-4-에피머라아제, UDP-글루코오스-헥소오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제, 셀로비오스 포스포릴라아제를 각각 1 밀리리터 당 2U, 20U, 2.6U, 10U 부가하고, 30℃에서 90 시간 반응을 실시하였다. 반응을 10분간 비등 정지 후, 반응액의 pH를 5로 조정하고, β 글루코시다아제 처리를 실시하는 것에 의해 잔존 수크로오스를 분해하였다. 반응액을 TLC(용매 아세토니트릴 - 물 75: 25, 담체 실리카겔 60)로 분석한 결과, 락토-N-비오스 I 농도는 80 mM이었 다. (도 1, 레인 4, 5)
실시예 4.라미나리비오스의 락토-N-비오스 I로의 변환
라미나리비오스를 당질 원료로 하여 락토-N-비오스 I으로의 변환 반응을 실시하였다. 반응액 양은 1밀리리터로 하고, 최종 농도 0.24M 라미나리비오스, 0.24M N-아세틸글루코사민, 10 mM 염화마그네슘, 30 mM 인산-나트륨 완충액 (pH 7.0), 1mM UDP-글루코오스로 이루어진 기질 용액을 제조하고, 거기에 락토-N-비오스 포스포릴라아제, UDP-글루코오스-4-에피머라아제, UDP-글루코오스-헥소오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제, 라미나리비오스 포스포릴라아제를 각각 1 밀리리터 당 2U, 20U, 2.6U,5U 가하고, 30℃에서 90 시간 반응을 실시하였다. 반응을 10분간 비등 정지 후, 반응액의 pH를 5로 조정하고, β 글루코시다아제 처리를 실시하는 것에 의해 잔존 수크로오스를 분해하였다. 반응액을 TLC(용매 아세토니트릴 - 물 75: 25, 담체 실리카겔 60)로 분석한 결과, 락토-N-비오스 I 농도는 80 mM이었다. (도 1, 레인 6, 7)
실시예 5.말토헵타오스의 락토-N-비오스 I로의 변환
말토헵타오스를 당질 원료로 하여 락토-N-비오스 I으로의 변환 반응을 실시하였다. 반응액 양은 1밀리리터로 하고, 최종 농도 0.24M 말토헵타오스, 0.24M N-아세틸글루코사민, 10 mM 염화마그네슘, 30 mM 인산-나트륨 완충액 (pH 7.0), 1mM UDP-글루코오스로 이루어지는 기질 용액을 제조하고, 거기에 락토-N-비오스 포스포릴라아제, UDP-글루코오스-4-에피머라아제, UDP-글루코오스-헥소오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제, 포스포릴라아제를 각각 1 밀리리터 당 2U, 20U, 2.6U, 7U 부가하고, 30℃에서 90시간 반응을 실시하였다. 반응액을 TLC(용매 아세토니트릴 - 물 75: 25, 담체 실리카겔 60)로 분석한 결과, 락토-N-비오스 I농도는 100mM이었다. (도 1, 레인 8,9)
실시예 6.수크로오스로부터 락토-N-비오스 I의 제조
락토-N-비오스 I의 합성은 이하와 같이 실시하였다. 반응액 양은 10 밀리리터로 하고, 최종 농도 0.66 M 수크로오스, 0.60 M N-아세틸글루코사민, 10 mM염화마그네슘, 30 mM 인산-나트륨 완충액 (pH 7.0), 1mM UDP-글루코오스로 이루어진 기질 용액을 제조하고, 거기에 락토-N-비오스 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, UDP-글루코오스-4-에피머라아제, UDP-글루코오스-헥소오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제를 각각 1 밀리리터 당 0.25U, 0.08U, 2.50U, 0.33U 부가하고, 30℃에서 500 시간 반응을 실시하였다. 반응액 중의 락토-N-비오스 I 농도는 약 0.52 M이고, 당질 원료의 약 80%가 락토-N-비오스 I로 변환되어 있었다. 반응액 중의 미반응 수크로오스를 분해하기 위하여, 반응액의 pH를 염산으로 4.5로 조정하고, Sigma 사로부터 구입한 인버타아제 3mg을 부가하고, 37℃에서 15 시간 처리하였다. 처리 후의 반응액을 TOYOPEARL HW40F칼럼에 공급하고, 겔 여과에 의해 락토-N-비오스 I 분획을 단리, 회수하였다. 회수한 분획을 증발기로 농축하고, 동결건조에 의해 락토-N-비오스 I 생성물 0.95 g(단리 수율 41%)을 얻었다.
실시예 7.수크로오스로부터 갈락토-N-비오스의 제조
갈락토-N-비오스의 합성은 이하와 같이 실시하였다. 반응액 양은 10 밀리리 터로 하고, 최종 농도 0.66 M 수크로오스, 0.60 M N-아세틸갈락토사민, 10 mM 염화마그네슘, 30 mM 인산-나트륨 완충액 (pH 7.0), 1mM UDP-글루코오스로 이루어진 기질 용액을 제조하고, 거기에 락토-N-비오스 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, UDP-글루코오스-4-에피머라아제, UDP-글루코오스-헥소오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제를 각각 1 밀리리터 당 0.25U, 0.08U, 2.50U, 0.33U 부가하고, 30℃에서 500 시간 반응을 실시하였다. 반응액 중의 갈락토-N-비오스 농도는 약 0.40 M이고, 당질 원료의 약 60%가 갈락토-N-비오스로 변환되어 있었다. 반응액 중의 미반응 수크로오스를 분해하기 위하여, 반응액의 pH를 염산으로 4.5로 조정하고, Sigma 사로부터 구입한 인버타아제 3mg을 부가하고, 37℃에서 15 시간 처리하였다. 처리 후의 반응액을 TOYOPEARL HW40F 칼럼에 공급하고, 겔 여과에 의해 갈락토-N-비오스 분획을 단리, 회수하였다. 회수한 분획을 증발기로 농축하고, 동결건조에 의해 갈락토-N-비오스 생성물 0.78 g(단리 수율 34%)을 얻었다.
실시예 8.락토-N-비오스 I의 대량 제조
락토-N-비오스 I의 대량 제조는 이하와 같이 실시하였다. 반응액 양은 1리터로 하고, 최종 농도 0.66 M 수크로오스, 0.60 M N-아세틸글루코사민, 10 mM 염화마그네슘, 30 mM 인산-나트륨 완충액 (pH 7.0), 1mM UDP-글루코오스로 이루어진 기질 용액을 제조하고, 거기에 락토-N-비오스 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, UDP-글루코오스-4-에피머라아제, UDP-글루코오스-헥소오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제를 각각 1 밀리리터 당 2U, 0.3U, 20U, 2.6U 부가하 고, 30℃에서 135 시간 반응을 실시하였다. 이때의 수크로오스 농도 및 락토-N-비오스 I 농도의 경시 변화를 도 2에 도시한다. 반응 수율은 87%이었다. 반응 종료 후의 반응액에 25mM 인산 완충액 (pH 7.0)으로 평형화한 DEAE-TOYOPEARL 650 M 160 mL 부가하고, 1시간 교반하는 것에 의해 효소를 흡착시킨 후, 여과에 의해 상청액을 분리하였다. 이 상청액에 드라이 이스트(니신 카멜리아) 20 그램을 부가하고, 30℃에서 18시간 교반하며, 효모 처리를 실시하였다. 처리 후, 원심분리 및 셀라이트를 이용한 여과에 의해 효모를 제거한 상청액을 얻었다. 얻어진 상청액을 증발기로 농축시킨 후, 실온에 정치하여 두는 것으로 결정을 얻었기 때문에 이 결정을 여과에 의해 분리하고, 진공건조에 의해 생성물을 얻었다. 또한 결정을 분리한 모액에 관해서도 다시 결정화를 실시하여 회수율의 향상을 실시하였다. 이것에 의해 순도 97%의 락토-N-비오스 I 130 그램(수율 55%), 순도 85%의 락토-N-비오스 I 65 그램(수율 24%, 합계 수율 79%)을 얻었다.
실시예 9. 락토-N-비오스 I의 바이오리액터에 의한 제조
실시예 8에서 제조한 효소의 흡착된 DEAE-TOYOPEARL 650 M160 mL부분을 직경 2.6 cm의 유리제 칼럼에 채워서 바이오리액터 칼럼(φ 2.6 cm x 30 cm)을 제조하였다. 상기 칼럼에는 락토-N-비오스 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, UDP-글루코오스-4-에피머라아제, UDP-글루코오스-헥소오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제가 각각 약 2000U, 300U, 200000U, 2600U 흡착되어 있었다. 이 칼럼에 30℃, 유속 0.1 ml 부분(체류 시간 27시간)의 조건에서 500 ml의 기질 용액(최종 농도 0.66 M 수크로오스, 0.60 M N-아세틸글루코사민, 10 mM 염화마그네슘, 30 mM 인산-나트륨 완충액 (pH 7.0), 1mM UDP-글루코오스)를 제공하고, 순환시켰다. 1회 칼럼 순환 후의 기질 용액 중의 락토-N-비오스 I농도는 약 0.3 M, 2회 칼럼 순환 후에는 0.4M, 3회 칼럼 순환 후에서는 0.5M이었다.
실시예 10.글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7.9)와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 10)의 양쪽 활성을 갖는 효소를 사용한 락토-N-비오스 I의 제조
락토-N-비오스 I의 합성은 이하와 같이 실시하였다. 반응액 양은 1밀리리터로 하고, 최종 농도 0.66 M 수크로오스, 0.60 M N-아세틸글루코사민, 10 mM 염화마그네슘, 30 mM 인산 완충액 (pH 7.0), 1mM UTP로 이루어진 기질 용액을 제조하고, 거기에 락토-N-비오스 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, UDP-글루코오스-4-에피머라아제,글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7.9)와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 10)의양쪽 활성을 갖는 효소를 각각 1 밀리리터 당 0.25U, 0.08U, 2.5U, 5.0U 부가하고, 30℃에서 60시간 반응을 실시하였다. 60시간 후의 반응액 중의 락토-N-비오스 I 농도는 50 mM이었다.
실시예 11. 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7.9)와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 10)의 양쪽 활성을 갖는 효소를 사용한 락토-N-비오스 I의 제조
락토-N-비오스 I의 합성은 이하와 같이 실시하였다. 반응액 양은 1밀리리터 로 하고, 최종 농도 0.66 M 수크로오스, 0.60 M N-아세틸글루코사민, 10 mM 염화마그네슘, 30 mM 인산 완충액 (pH 7.0), 1mM UDP-글루코오스, 1mM 피로인산나트륨으로 이루어진 기질 용액을 제조하고, 거기에 락토-N-비오스 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, UDP-글루코오스-4-에피머라아제, 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7.9)와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 10)의 양쪽 활성을 갖는 효소를 각각 1 밀리리터 당 0.25U, 0.08U, 2.5U, 5.0U 부가하고, 30℃에서 60시간 반응을 실시하였다. 60시간 후의 반응액 중의 락토-N-비오스 I 농도는 모두 50 mM이었다.
본 발명에 의하면, 저가이고 또 간편하게 락토-N-비오스 I 및 갈락토-N-비오스를 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명에 의해 제조가능한 락토-N-비오스 I 및 갈락토-N-비오스는 식품첨가물, 기능성 식품, 의약품의 벌크 또는 원료 성분으로서 그 유효 이용이 기대된다. 본 명세서에서 인용한 전체 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고하여 본 명세서에 포함시키는 것으로 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Incorporated Administrative Agency National Agriculture and Food Research Organization
<120> Methods for producing lacto-N-biose I and galacto-N-biose
<130> PH-3349-PCT
<150> JP 2006-346470
<151> 2006-12-22
<160> 20
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 1820
<212> DNA
<213> Bifidobacterium longum
<400> 1
ggttcgatac atacgtgagt atgcaaatac gtaaacaaca aacaggcaga tgcgcacgca 60
aattgcaccc gcgcccatga gccaagggag gtcccatgaa aaacaaagtg caactcatca 120
catacgccga tcgtctcggc gatggcactc ttagctcgat gaccgacatc ctgcgcaccc 180
gcttcgacgg cgtgtatgac ggcgtgcata tcctgccgtt cttcactccg ttcgatggtg 240
cggatgcagg cttcgacccg atcgaccata ccaaagtcga cgaacgtctc ggcagctggg 300
acgacgtcgc cgaactctcc aagacccaca acatcatggt cgacgccatc gtcaaccaca 360
tgagttggga atccaagcag ttccaagacg tgcttgaaaa aggtgaggaa tccgagtatt 420
acccgatgtt cctgaccatg agctccgtct tcccgaacgg cgccaccgaa gaagacctgg 480
ccggcatcta ccgcccgcgc ccgggcctgc cgttcaccca ctacaagttc gccagcaaga 540
cgcgcttggt ctgggtgagc ttcaccccgc agcaggtgga catcgacact gattccgcca 600
agggttggga atacctgatg tcgatcttcg atcagatggc cgccagccac gtgcgctaca 660
tccgtctcga cgccgtgggc tacggcgcca aggaagccgg caccagctgc ttcatgaccc 720
ccaagacctt taagctcatc tcccgtctgc gcgaggaggg cgtcaagcgc ggccttgaaa 780
tcctcatcga ggttcacagc tactacaaga agcaggtgga aatcgcctcc aaggtggacc 840
gcgtctacga tttcgccctg ccgccgctgc ttctgcactc gctgttcacc ggtcacgtcg 900
aacccgtggc ccactggacc gagatccgcc cgaacaacgc cgtcaccgtg ctcgatacgc 960
acgatggcat cggcgtgatc gacatcggct ccgaccagct cgaccgctcc ctcaagggcc 1020
tcgtgcccga cgaggacgtc gacaacctgg tcaacaccat ccatgccaac acccacggcg 1080
aatcccaggc cgccaccggt gccgccgcgt ccaacctcga cctctaccag gtcgactcca 1140
cgtactactc ggccctcggc tgcaacgacc agcactactt ggccgcccgc gccgtgcagt 1200
tcttcctgcc gggcgtgccg caggtctact acgtgggcgc gctcgccggc cgcaacgaca 1260
tggaactgct gcgccgcacc aacaacggcc gcgacatcaa ccgccactac tactccaccg 1320
ccgaaatcga tgaaaacctc gaacgcccgg tggtcaaggc cctgaacgcc ctggccaagt 1380
tccgcaacga actgcctgca ttcgatggcg agttcagcta cgaggtcgat ggcgacacgt 1440
ccatcacctt ccgctggacc gccgccgacg gcacgtccac ggccgccctc accttcgagc 1500
ccggacgcgg cctcggcaca gacaacgcca ccccggttgc cagccttgcc tggagcgatg 1560
ccgccggcga ccacgaaacc cgcgatctgc tcgccaaccc gccgattgcc gatatcgact 1620
aaccgttggc ccataaacgc cactccgctg tgcgcgctcc aagtagtgcg cccggcgtaa 1680
gctgggttca tggagagcaa accgcccgca gtgcactgaa gccagtgcgc ccgggcggtt 1740
ttgcgtatgc ggggttgaag gtcatgctcc tgcgggcgcg gcccaagcat cccgccggaa 1800
tgcgacgaga cgagcagcag 1820
<210> 2
<211> 1238
<212> DNA
<213> Bifidobacterium longum
<400> 2
ggcaacacgg ccgtcttcaa gcagaaagcc accacgcaaa cattcctcga aagccttggt 60
tttgccgcta ggtgaaacag gtcaagtgaa aagtaagctc aatactgaag gaaaaaccga 120
aggcaagtcc ttccaaagga gggaatatga ctactgttct ggttacgggc ggtgctggat 180
tcatcgccac tcacaccgac atcgaactgc tcaacaaggg ctacgacgtt atttccgtag 240
ataactacgg caactcgtcg cccgtggcgc ttgagcgcgt cgagcaaatc accggcaagc 300
cggtcaagcg ttatgacggc gacgtgcgcg atgaggcgct catggaacgc gtcttcgctg 360
aaaacaacat cgactgggtc atccactttg ccggtctcaa ggccgtgggc gagtccgtgg 420
ccaagccgat cgaatactac gacaacaacc tgtactccac gcttgtgctg ctcaaggtga 480
tgaagaagca caacgtcaag aagatcatct tctcatcctc cgccaccgtg tacggcacgc 540
cgaaggaact gccgatcacc gaggagacgc cgaccggcgg caccaccaac ccgtacggca 600
cctccaagct gttccaggag cagattctgc gcgacgtgca tgtggccgat ccgtcctgga 660
ccatcgtgct gctgcgctac ttcaacccgg tcggcgcgca cgagtccggc ctgctgggcg 720
aagacccgaa gggtattccg gcgaacctca ccccgtacgt ggccaaggtc gcggtcggcg 780
agctcaagga agtccaggtc tacggcgacg actacgacac gcccgacggc actggtgtgc 840
gtgactacat ccacgtggtc gacctggcca agggccacgt ggccgtcatt gaccacatcg 900
acaaggaagg cgtgttcgtc tacaacctgg gtactggcca cggctactcc gtgcttgagg 960
ttatcaaggc ttacgagaag gccgccggtc atccgattcc gtacgcgatc aagccgcgtc 1020
gccccggtga catcgccgcc tgctacgccg acgcttccaa ggcggagaag gagcttggct 1080
ggaaggccga gctgaccatc gacgacatgg ccgcctcctc cctcaactgg cagaccaaga 1140
accccaacgg tttccgcgac gcggagtgat atgagcagat gagctccctc tgatgaggga 1200
gctcatctgt cgtttatcac acaatgcgcc tatcggcg 1238
<210> 3
<211> 1346
<212> DNA
<213> Bifidobacterium longum
<400> 3
caccagagcg agaccattga ggaaagtgag caaacccatg gctgatttcg ccaactacac 60
ccccggggag tatgcgaagg agcacatccg catcacgccg acgacgcttg ccgacggccg 120
tgacttcttc tacctggacg acgaccccga gttcgtctcc ggtgccaaga cccgcgagct 180
caaggacccg cgcccgctgg actaccgttt cgccccgcac ctggacgccg acggcaacga 240
agtgccgtac gccgccccgc agatgcgccg cgacccgctg accggcgact ggatcccgat 300
ggccaccgcc cgtatgaacc gcccgatcac cgccggcccc ggcgccaccg ccaagggcaa 360
cccgctggcc gcccgcaagc ccggtgaccc gtaccaggac ggcgaagtgc cggacaccga 420
ctacaacgtc gtcgtgttcg agaaccgctt cccctccatg gtgcgcgtgc ccggcgtctc 480
cgaggacgtg acctacgttg acggcaaccc gctgtgggag aagaagctcg ccgccggccg 540
ctgcgaggtc atctgcttcg acccgaacga ggacggcctg ccggccgatc tgccggtctc 600
ccgcctgcgc accgtggttg aggcttgggc cttccgtacc gccgaaatct ccaagatgga 660
aggcatcgag cagatcttcc cgttcgagaa ccacggccag gaaatcggcg tctccctcgc 720
tcacccgcac ggccaggtct actgctaccc gttcatcgcc ccgaagatgg agaaggaact 780
ccagcacacc gaggcctacc acgagaagac cggcggcaac ctgcttaagg acatcatgaa 840
cgccgagctc gaagccggcg aacgcatcgt gatgcgcaac cacagctggg tcgcctacgt 900
gccggccgcc gcccgttggc ccctcgaggt ccacgtggct ccggtgcgcg acgtgctcac 960
cctcgaccag ctcaacgacg aagaacgctg ggacctcgcc tccatgtact cgcacctcct 1020
gaagcgcggc aacgccttct tcgacaaggg cgacggcaag ggcatggacc tgccatacat 1080
cgccgcctgg caccaggccc cgatccacga cgcccgccgc gagaactacc gcctgaacct 1140
gcagttcttc tccttccgcc gcgccgccaa caagatcaag tacctcgccg gctccgaatc 1200
cggcatggcc gcctggatct ccgacaccac gccggaactc atcgccaagc gcttccacga 1260
gctcggctcc atcgacatcg ccgactgata gaaagaaaac atcaatgact gctgttgaat 1320
tcattgagcc gctgacccat gaggaa 1346
<210> 4
<211> 2053
<212> DNA
<213> Bifidobacterium longum
<400> 4
aacatccgcg agaagaagaa gcggaagtga cacgcgcgta atttgccaga tttcaaatat 60
ctggtaaatt atctactcgg tgcttttgca ccatcgggcc gtagcgcagt ttggtagcgc 120
acttgactgg gggtcaaggg gtcgcgggtt caaatcccgc cggcccgacc gattagcccc 180
ggaattctgc cacttttgag tggttgtctt ccggggtttt tccgttttca gacaatatga 240
gacaacatga cgacggactt acctttgtaa gccattcgta atgaattatc accgacaatt 300
caccgcctcc gcacccccgt cgtatgcgtt tgccccaaac aggggctaga ctggttccta 360
ttgatttgac gaaagggacc cgaattgacc gaaataaacg acaaggccca actggatatc 420
gccgccgctg acgacaccga cgccgtcacc tcggacaccc ccgaagaaac cgtaaacacc 480
cccgaagtgg atgagacttt cgagctttcg gccgccaaga tgcgcgagca cggcatgagc 540
gaaaccgcca tcaaccagtt ccaccatttg tatgacgtat ggcgccatga agaagcctcc 600
agctggattc gtgaggacga catcgagccg cttggccacg tgcccagctt ccacgacgtc 660
tatgagacca tcaaccacga caaggccgtg gacgccttcg ccaagaccgc attcctcaag 720
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cgtaggcaca aggccaagca gatgcgcttc atcgacatca tcatcggtca ggtgcttacc 840
gctcgcaccc gcctgaacgt cgaactgccg ctgacgttca tgaactcctt ccacacttcg 900
gcggacacga tgaaggcgct caagcatcat cgcaagttca gccagcatga cgtgccgatg 960
gaaatcatcc agcatcagga acccaaactc gtggccgcca ccggcgaacc ggtgagctac 1020
cccatgaacc cggagctgga atggtgcccg cccggccacg gcgacctgtt ctccaccatc 1080
tgggagtccg gcctgcttga cgtattggag gagcgcggct tcaagtacct gttcatctcc 1140
aattccgaca atctcggtgc acgcccctcg cgtacgttgg cccagcactt cgaaaacaca 1200
ggtgccccgt ttatggctga agtggccatc cgcaccaagg ccgatcgcaa gggaggccat 1260
atcgtgcgag acaaggccac tggtcgcctg atcctgcgtg aaatgagcca ggtccatccg 1320
gatgataagg aagcggccca agacatcgcc aagcatcctt acttcaacac caactcgatc 1380
tggattcgca tcgacgcttt gaaagacaag ctcgccgaat gcgatggtgt gttgccgttg 1440
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cagctggaaa ccgccatggg tgccgcaatc ggtctgttca acggttccat ctgcgtccaa 1560
gtggatcgta tgcgcttcct tccggtgaaa accaccaatg atttgttcat tatgcgttcc 1620
gatcgcttcc acctgacgga cacgtatgag atggaagacg gcaattacat cttcccgaac 1680
gtcgaacttg atccgcgata ctacaagaac atccgcgatt tcgacgaacg gttcccctac 1740
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cgtgacgtca tgatgttcgc cgacgccaaa cttgaagata aaggcgagcc aagctatgtg 1860
ccgaacggcg aatacgttgg tccgcaaggc atcgaaccgg acgattgggt gtgatttaca 1920
acacggtcga acgataaaaa agatattatt tttgtgaaat ggcgctcaag tgcggaaaaa 1980
gcctctaaga tagagtgagt gtgaggaaac tcatacgcac ttataacgaa acagtaacta 2040
tacgtgagga cta 2053
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 5
gtccctttcg aggtaatatc gaac 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 6
cgggcgcacg tacggttcca acat 24
<210> 7
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 7
ggcaacacgg ccgtcttcaa gcagaaagc 29
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 8
ttcgaatcgc accgagctca cccgctgggc 30
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 9
gatttagtaa aggagctcgt gctggcc 27
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 10
gaacagcttg gtagcttgcg aaacgcc 27
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 11
gaggaattcg gcttcgaagg cacgc 25
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 12
acgtccgctt gtgccctctg ccat 24
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 13
tatacatatg aaaaacaaag tgcaactcat c 31
<210> 14
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 14
ggccaactcg aggtcgatat cggcaatcgg cgggttggc 39
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 15
tatacatatg actactgttc tggttacggg c 31
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 16
ctgctcctcg agctccgcgt cgcggaaacc gttggggttc 40
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 17
caaacatatg gctgatttcg ccaactac 28
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 18
ttctgcggcc gcgtcggcga tgtcgatgga 30
<210> 19
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 19
accccatatg accgaaataa acgacaaggc 30
<210> 20
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 20
gttgtctcga gcacccaatc gtccggttc 29
1/11
Claims (8)
- N-아세틸글루코사민, 인산, 락토-N-비오스 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 211; 1,3 β-갈락토실-N-아세틸헥소사민 포스포릴라아제) 및 UDP-글루코오스-4-에피머라아제 (EC 5. 1. 3. 2)의 존재하에서,(i) 당질 원료와 상기 당질 원료를 가인산 분해하여 α-글루코오스-1-인산을 생성하는 효소 (GlP 생성효소)의 조합;및(ii) UDP-글루코오스-헥소오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 12)와 UDP-글루코오스, UDP-갈락토오스 또는 그의 혼합물의 조합; 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 9) 및 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 10)와 UTP의 조합; 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2.7. 7. 9) 및 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 10)와 UDP-글루코오스 또는 UDP-갈락토오스 및 피로인산의 조합; 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 9) 및 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 10)와 UTP 및 UDP-글루코오스 또는 UDP-갈락토오스 및 피로인산의 조합; 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제의 양쪽 활성을 갖는 효소와 UTP의 조합; 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제의 양쪽 활성을 갖는 효소와 UDP-글루코오스 또는 UDP-갈락토오스 및 피로인산의 조합; 및 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제의 양쪽 활성을 갖는 효소와 UTP 및 UDP-글루코오스 또는 UDP-갈락토오스 및 피로인산의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 조합을 작용시키며,상기 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제의 양쪽 활성을 갖는 효소는 서열 번호: 4로 표시되는 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 락토-N-비오스 I의 시험관 내 제조방법.
- 제 1항에 있어서, (i)의 조합이, 수크로오스와 수크로오스 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 7)의 조합, 녹말 또는 덱스트린과 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 1)의 조합, 셀로비오스와 셀로비오스 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 20)의 조합, 셀로덱스트린과 셀로덱스트린 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 49) 및 셀로비오스 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 20)의 조합, 라미나리올리고당과 라미나리비오스 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 31)의 조합 또는 라미나리올리고당과 β-1,3 올리고글루칸 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 30) 의 조합, 및 트레할로오스와 트레할로오스 포스포릴라아제 (EC 2.4. 1. 231)의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 조합인 시험관 내 방법.
- 삭제
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 효소가 담체에 고정화되어 있는 시험관 내 방법.
- N-아세틸갈락토사민, 인산, 락토-N-비오스 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 211) 및 UDP-글루코오스-4-에피머라아제 (EC 5. 1. 3. 2)의 존재하에서,(i) 당질 원료와 상기 당질 원료를 가인산 분해하여 α-글루코오스-1-인산을 생성하는 효소 (GlP 생성효소)의 조합; 및(ii) UDP-글루코오스-헥소오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 12)와 UDP-글루코오스, UDP-갈락토오스 또는 그의 혼합물의 조합; 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 9) 및 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 10)와 UTP의 조합; 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 9) 및 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 10)와 UDP-글루코오스 또는 UDP-갈락토오스 및 피로인산의 조합; 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 9) 및 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제 (EC 2. 7. 7. 10)와 UTP 및 UDP-글루코오스 또는 UDP-갈락토오스 및 피로인산의 조합; 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제의 양쪽 활성을 갖는 효소와 UTP의 조합; 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제의 양쪽 활성을 갖는 효소와, UDP-글루코오스 또는 UDP-갈락토오스 및 피로인산의 조합; 및 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제의 양쪽 활성을 갖는 효소와 UTP 및 UDP-글루코오스 또는 UDP-갈락토오스 및 피로인산의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 조합을 작용시키며,상기 글루코오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제와 갈락토오스-1-인산 우리디릴 트랜스퍼라아제의 양쪽 활성을 갖는 효소는 서열 번호: 4로 표시되는 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 갈락토-N-비오스의 시험관 내 제조방법.
- 제 5항에 있어서, (i)의 조합이, 수크로오스와 수크로오스 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 7)의 조합, 녹말 또는 덱스트린과 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 1)의 조합, 셀로비오스와 셀로비오스 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 20)의 조합, 셀로덱스트린과 셀로덱스트린 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 49) 및 셀로비오스 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 20)의 조합, 라미나리올리고당과 라미나리비오스 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 31)의 조합 또는 라미나리올리고당과 β-1,3 올리고글루칸 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 30)의 조합, 및 트레할로오스와 트레할로오스 포스포릴라아제 (EC 2. 4. 1. 231)의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 조합인 시험관 내 방법.
- 삭제
- 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 효소가 담체에 고정화되어 있는 시험관 내 방법.
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