JP4264742B2 - ラクトｎビオースホスホリラーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクターを含む形質転換体 - Google Patents
ラクトｎビオースホスホリラーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクターを含む形質転換体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4264742B2 JP4264742B2 JP2004166089A JP2004166089A JP4264742B2 JP 4264742 B2 JP4264742 B2 JP 4264742B2 JP 2004166089 A JP2004166089 A JP 2004166089A JP 2004166089 A JP2004166089 A JP 2004166089A JP 4264742 B2 JP4264742 B2 JP 4264742B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- seq
- dna
- amino acid
- lacto
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 66
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 title claims description 40
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 19
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 title description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 title description 3
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 title description 2
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 claims description 36
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 36
- HMQPEDMEOBLSQB-RCBHQUQDSA-N beta-D-Galp-(1->3)-alpha-D-GlcpNAc Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HMQPEDMEOBLSQB-RCBHQUQDSA-N 0.000 claims description 31
- 229930191176 lacto-N-biose Natural products 0.000 claims description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 67
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 241000933529 Bifidobacterium bifidum JCM 1254 Species 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 7
- 241001608472 Bifidobacterium longum Species 0.000 description 7
- 229940009291 bifidobacterium longum Drugs 0.000 description 7
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 4
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 4
- 241000186016 Bifidobacterium bifidum Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229940002008 bifidobacterium bifidum Drugs 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- HXXFSFRBOHSIMQ-FPRJBGLDSA-N alpha-D-galactose 1-phosphate Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O HXXFSFRBOHSIMQ-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M rubidium chloride Chemical compound [Cl-].[Rb+] FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- GZZOCPZTALAJHU-QEQWBAOXSA-N (2s,3r,4s,5r,6r)-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4,5-tetrol;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GZZOCPZTALAJHU-QEQWBAOXSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241001213452 Bifidobacterium longum NCC2705 Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241000222128 Candida maltosa Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229940102127 rubidium chloride Drugs 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000007861 thermal asymmetric interlaced PCR Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明はラクトＮビオースホスホリラーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクターを含む形質転換体に関する。
ラクトＮビオースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．２１１）は、ラクトＮビオース（ガラクトピラノシルβ１，３Ｎ−アセチルグルコサミン）をガラクトース−１−リン酸とＮ−アセチルグルコサミンに加リン酸分解する酵素であり、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）の菌体内にその活性が報告されている（非特許文献１）。本酵素はまたその逆反応を触媒することから、本酵素を用いることにより、食品用素材，医薬品用素材などとして有用と期待される種々のラクトＮビオース誘導体を合成することが可能である。このように、ラクトＮビオースホスホリラーゼは産業上極めて重要な酵素である。
しかしながら、従来、ラクトＮビオースホスホリラーゼはビフィドバクテリウム・ビフィダム菌体から抽出したものが粗酵素あるいは部分精製酵素として利用されているにすぎず（非特許文献２）、該酵素を安定的に生産して工業的利用の向上を図ることは行われていなかった。
Ｄａｎｉｅｌｌｅ Ｄｅｒｅｎｓｙ−Ｄｒｏｎ， Ｆｒｅｄｅｒｉｃ Ｋｒｚｅｗｉｎｓｋｉ， Ｃｏｌｅｔｔｅ Ｂｒａｓｓａｒｔ， ａｎｄ Ｓｔｅｐｈａｎｅ Ｂｏｕｑｕｅｌｅｔ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２９， ３−１０ （１９９９）
Ｅｒｚｓｅｂｅｔ Ｆａｒａｋａｓ， Ｊａｃｈｉｍ Ｔｈｉｅｍ， Ｆｅｒｅｄｅｒｉｃ Ｋｒｅｗｉｎｓｋｉ， Ｓｔｅｐｈａｎｅ Ｂｏｕｑｕｅｌｅｔ， Ｓｙｎｌｅｔｔ， ７２８−７３０ （２０００）
ラクトＮビオースホスホリラーゼ遺伝子が提供されれば、それを用いることによりラクトＮビオースホスホリラーゼの安定的で効率的な生産が可能になると期待される。
そこで本発明は、ラクトＮビオースホスホリラーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクターを含む形質転換体を提供することを目的とする。
本発明は以下の発明を包含する。
（１）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡの全部又は一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（１）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡの全部又は一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（２）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡの全部又は一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡの全部又は一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（３）上記（１）又は（２）に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
（４）上記（３）に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（４）上記（３）に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
本発明によれば、ラクトＮビオースホスホリラーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクターを含む形質転換体が提供される。
本発明は、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子に関する。配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質はラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有する。配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号２０の第２８６〜２５３８番のＤＮＡ塩基配列が挙げられる。配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号１９の第２０〜２２７２番のＤＮＡ塩基配列が挙げられる。
本発明に係る遺伝子はまた、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子であってよい。アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、天然に生じたものであってもよく、部位特異的変異導入方法等を行った結果として生じたものであってもよい。
本発明に係る遺伝子はまた、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡの全部又は一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子であってもよい。同様に、本発明に係る遺伝子はまた、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡの全部又は一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子であってもよい。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡに対し高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズする条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０℃〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらにハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、ナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃での条件である場合も、本発明における「ストリンジェントな条件」に含めることができる。
ここで、「一部の配列」とは、所定の遺伝子の塩基配列の一部分を含むＤＮＡの塩基配列であって、該ＤＮＡがラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものを指す。また「一部の配列」は、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせるのに十分な塩基配列の長さを有するもの、例えば、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも５０塩基、より好ましくは少なくとも２００塩基の配列である。
ラクトＮビオースホスホリラーゼ活性は、５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中３０℃において、１０ｍＭ αガラクトース−１−リン酸及び１０ｍＭ Ｎ−アセチルグルコサミンから生じるリン酸の遊離量を測定することにより評価した。
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子は、例えばビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４（理化学研究所微生物系統保存施設より入手可能）から、実施例に示す手法で得ることができる。ビフィドバクテリウム・ビフィダム由来のラクトＮビオースホスホリラーゼをクローニングするためには、ラクトＮビオースホスホリラーゼを完全精製された状態で入手することが不可欠である。しかしながら従来、部分精製の方法および部分精製酵素の利用が報告されているのみであり（非特許文献１，２）、完全精製は安定性の面から困難である旨が報告されていた（非特許文献１）。本発明者らは、疎水クロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーを効果的に配置することにより困難な完全精製に初めて成功した。そして、こうして得られた完全精製酵素を用いることにより本発明を完成するに至った。更にまた本遺伝子のクローニングを行うに際して、全アミノ酸配列情報を得ることが困難であり通常のＰＣＲ法では遺伝子全長を取得することが難しい。本発明者らは、鋭意研究の結果、ＤＮＡの内部配列を増幅してからその配列を元に実施例に詳述する特殊なＰＣＲ法を行うことによりタンパク質コード領域全長を取得することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子は、例えばビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）ＪＣＭ １２１７株（理化学研究所微生物系統保存施設より入手可能）から、実施例に示す手法で得ることができる。本遺伝子を得るためには、まず、タンパク質コード領域の外側のＤＮＡ配列に対するプライマーを作成しＰＣＲにて増幅できる条件を検討した後に、得られた増幅断片の配列をもとにプライマーを設計し全長配列のクローニングを行うという二段階のＰＣＲを行うことを特徴とする方法を用いる必要があった。なお、配列番号２で表されるアミノ酸配列は、データベース上に開示されているビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２７０５株由来の機能未知遺伝子ＢＬ１６４１がコードするアミノ酸配列と９７％程度の相同性を示すのであるが、本発明に係る遺伝子の入手にもまた酵素の完全精製が必須であったこと及び上記のように二段階の特殊なＰＣＲ増幅を行う必要があることに鑑みれば、機能未知遺伝子ＢＬ１６４１が開示されているという事実にかかわらず、本発明に係る遺伝子を入手することは決して容易なことではない。
本発明はまた、本発明の遺伝子を含有する組換えベクターに関する。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主細胞で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド、シャトルベクター、ヘルパープラスミドなどが挙げられる。また、該ベクター自体が単独では複製され得ないものであっても、宿主の染色体に挿入されることによって、複製可能となるものであればよい。
プラスミドとしては特に限定されないが、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＥＴ系プラスミド、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹｅｐ１３等のＹｅｐ系、Ｙｃｐ５０等のＹｃｐ系等）が挙げられ、ファージＤＮＡとしては、特に限定されないが、λファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらにはレトロウイルス又はワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターを用いることができる。
本発明はまた、これらの組換えベクターを含む形質転換体に関する。かかる形質転換体は、前記組換えベクターを用いて宿主を形質転換することにより得ることができる。前記形質転換は、例えばプロトプラスト法、塩化ルビジウム法、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、コンピテントセル法等の常法により行われる。宿主としては、ラクトＮビオースホスホリラーゼの発現に適する宿主であればよく、微生物が好ましく、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などのエッシェリヒア属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）などのカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などの動物細胞、ＳＦ９細胞などの昆虫細胞などが挙げられる。
次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株（理化学研究所微生物系統保存施設（埼玉県和光市広沢２番１号）より入手）を減酸素条件下において栄養培地にて培養したのち、培養物から菌体を分離した。次いで該菌体（培養液４Ｌ分）を１０ｍＬの１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で定法により破砕した後、遠心分離を行い菌体破砕液を得た。該菌体破砕液に硫酸アンモニウムを３０％飽和濃度に達するまで加え、生じた沈殿を遠心分離にて除去した。該遠心上清を、３０％飽和濃度硫酸アンモニウムを含んだ１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化したＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ （東ソー）カラムに通液し吸着させた後、該カラムから、１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中３０％飽和〜０％の硫酸アンモニウムの濃度勾配により酵素を溶出させた。ラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を示した画分を集めた後、硫酸アンモニウムを終濃度６０％飽和になるよう加え、遠心分離により沈殿を回収した。該沈殿を１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に再溶解した後、同緩衝液により平衡化されたＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（東ソー）カラムに通液し吸着させた後、該カラムから、１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中１５０〜３００ｍＭ塩化ナトリウムの濃度勾配により酵素を溶出させた。ラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を示した画分を集めた後、硫酸アンモニウムを終濃度６０％飽和になるよう加え、遠心分離により沈殿を回収した。該沈殿を１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に再溶解した後、同緩衝液により平衡化されたＭｏｎｏＱカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に通液し吸着させた後、該カラムから、１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中１５０〜３００ｍＭ塩化ナトリウムの濃度勾配により酵素を溶出させた。ラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を示した画分を集めた後、１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析することにより、精製されたラクトＮビオースホスホリラーゼを得た。得られた酵素はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で単一のバンドを示し高度に精製されていた。
この精製ラクトＮビオースホスホリラーゼについて、プロテインシーケンサー（PerkinElmer社製）により、そのＮ末端のアミノ酸配列を決定した。決定した配列を配列番号３に示す。さらに、このラクトＮビオースホスホリラーゼをＶ８プロテアーゼ（Merck社製）で分解してペプチドフラグメントを調製し、２種類のペプチドフラグメントのアミノ酸配列を決定した。決定されたアミノ酸配列を配列番号４及び５に示す。
解読されたアミノ酸配列について相同検索を行ったところ、ＢＬ１６４１としてＧＥＮＥＳ Ｄａｔａｂａｓｅに登録されているビフィドバクテリウム・ロンガム由来の機能未知遺伝子産物と高い相同性（相同性８１％）を示した。そこでこのＢＬ１６４１のゲノム情報を基に、隣接するタンパク質コード領域及びタンパク質コード領域内部を増幅するために２つのフォーワードプライマー（配列番号６及び７）及び２つのリバースプライマー（配列番号８及び９）を作成した。
これらのプライマーを組み合わせて使用し、InstaGene Matrix（Bio-Rad社製）を用いて調製したビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株及びビフィドバクテリウム・ロンガム ＪＣＭ １２１７株（理化学研究所微生物系統保存施設より入手）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、それぞれＰＣＲ反応により増幅させた。
ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号７に記載したフォーワードプライマーと、配列番号８に記載したリバースプライマーとを用いてＰＣＲ反応（ＰＣＲ条件：ポリメラーゼとしてＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡）を用い、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７４℃３分を２７サイクル）を行ない、反応産物をアガロースゲル電気泳動に供したところ、１８４８ｂｐの明瞭なバンドが確認された。このバンドをクローニングし、ＤＮＡシークエンサーで分析したところ、配列番号１８で示すＤＮＡ塩基配列（１７８８ｂｐ）が含まれていることが決定された。このＤＮＡ塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、ＢＬ１６４１がコードするアミノ酸配列の一部分と相同であることが確認された（相同性９３％）。すなわち、配列番号１８で示すＤＮＡ塩基配列がタンパク質コード領域の一部分であると推定された。
ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株由来遺伝子の完全長のタンパク質コード領域を取得するために、解析されたＤＮＡ塩基配列（配列番号１８）の情報をもとにＰＣＲ増幅を更に行った。
完全長のタンパク質コード領域を含むＤＮＡの５’末端側上流を増幅することを目的として、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号６に示すフォーワードプライマーと配列番号１０に示すリバースプライマーとを用いてＰＣＲ反応（ＰＣＲ条件：ポリメラーゼとしてＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡）を用い、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７４℃３分を２７サイクル）を行ない、反応産物をアガロースゲル電気泳動に供したところ、１９４９ｂｐの明瞭なバンドが確認された。更にまた、完全長のタンパク質コード領域を含むＤＮＡの３’末端側下流を増幅することを目的として、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、解析されたＤＮＡ塩基配列（配列番号１８）をもとに作製したプライマー（配列番号１１〜１３）を用いてサーマルアシンメトリックインターレイストＰＣＲ法（ＴＡＩＬ−ＰＣＲ、「植物のＰＣＲ実験プロトコール」、島本功、佐々木卓治監修、秀潤社、１９９７年、８３頁）を行った（ＰＣＲ条件：ポリメラーゼ ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡） ＰＣＲ１回目 ９４℃１分、６５℃１分、６８℃３分を５サイクル、９４℃１分、２５℃３分、６８℃３分を１サイクル、９４℃３０秒、６３℃１分、６８℃３分、９４℃３０秒、６３℃１分、６８℃３分、９４℃３０秒４９℃１分、６８℃３分を１５サイクル： ＰＣＲ２回目 ９４℃３０秒、６３℃１分、６８℃３分、９４℃３０秒、６３℃１分、６８℃３分、９４℃３０秒４９℃１分、６８℃３分を１５サイクル）。反応産物をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約１０００ｂｐの明瞭なバンドが確認された。
こうして得られた２つのバンドをそれぞれクローニングし、ＤＮＡシークエンサーで分析してＤＮＡ塩基配列をそれぞれ解読した。解読結果から、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株ゲノムＤＮＡ中には、配列番号２０で示すＤＮＡ塩基配列が存在することが確認された。このＤＮＡ塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、配列番号２０の第２８６番〜第２５３８番がコードするアミノ酸配列が、ＢＬ１６４１がコードするアミノ酸配列と相同であることが確認された（相同性９０％）。すなわち、配列番号２０の第２８６番〜第２５３８番がタンパク質コード領域であると推定された。
また、ビフィドバクテリウム・ロンガム ＪＣＭ １２１７株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号６に記載したフォーワードプライマーと、配列番号９に記載したリバースプライマーとを用いてＰＣＲ増幅を行ない（ＰＣＲ条件：ポリメラーゼとしてＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡）を用い、９８℃１０秒、６０℃１０秒、７４℃２分を２７サイクル）、反応産物をアガロースゲル電気泳動に供したところ、２６００ｂｐの明瞭なバンドが確認された。このバンドをＤＮＡシークエンサーで分析したところ、配列番号１９で示すＤＮＡ塩基配列（２３３５ｂｐ）が含まれていることが決定された。このＤＮＡ塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、配列番号１９の第２０番〜第２２７２番（２２５３ｂｐ）がコードするアミノ酸配列が、ＢＬ１６４１がコードするアミノ酸配列と相同であることが確認された（相同性９７％）。すなわち、配列番号１９の第２０番〜第２２７２番がタンパク質コード領域であると推定された。
次に、これらのタンパク質コード領域がラクトＮビオースホスホリラーゼ遺伝子であることを確認するために、大腸菌による遺伝子の発現系を構築した。
タンパク質コード領域の５’末端配列及び３’末端配列をもとにプライマー（配列番号１４〜１７）を作成した。ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株については配列番号１４のフォーワードプライマー及び配列番号１５のリバースプライマーを用い、また、ビフィドバクテリウム・ロンガム ＪＣＭ １２１７株については配列番号１６のフォーワードプライマー及び配列番号１７のリバースプライマーを用い、それぞれのゲノムＤＮＡを鋳型としてタンパク質コード領域の全長をＰＣＲにより増幅した（ＰＣＲ条件：ポリメラーゼとしてＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡）を用い、９６℃１５秒、６０℃１５秒、７４℃２分を２７サイクル）。ＰＣＲ産物を制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで消化後、同様に処理した市販の遺伝子発現用プラスミドｐＥＴ２８ａ（Novagen社製）にＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて連結した。さらに、これらのプラスミドを用いてSambrook，J.，Fritsch, E. F. and Maniatis, T. "Molecular Cloning, A Laboratory Manual 第２版”1.７４章 Vo1. 1 (1989)に記載された方法に従い、大腸菌ＢＬ２１株（Novagen社製）を形質転換した。形質転換はジーンパルサー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いる電気穿孔法により行った。
以上のようにして得た形質転換体を用い、常法に従って該遺伝子を発現させ、組換えタンパク質の生産を行った。これらの組換えタンパク質がラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有していたことからクローニングされた遺伝子がいずれもラクトＮビオースホスホリラーゼ遺伝子であることが確認された。なお、ラクトＮビオースホスホリラーゼ活性はαガラクトース１リン酸とＮアセチルグルコサミンからのリン酸遊離、及びラクトＮビオースの加リン酸分解によるガラクトース１リン酸とＮアセチルグルコサミンの生成により確認した。
また、活性型ラクトＮビオースホスホリラーゼの分子量を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて評価したところ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株由来ラクトＮビオースホスホリラーゼ及びビフィドバクテリウム・ロンガム ＪＣＭ １２１７株由来ラクトＮビオースホスホリラーゼのいずれについても約８５,０００ダルトンであり、遺伝子でコードされるタンパク質の分子量８４,２５０及び８４,３２７とそれぞれ良く一致していた。
以上の通り、ラクトＮビオースホスホリラーゼ遺伝子が見出された。すなわち、ラクトＮビオースホスホリラーゼの構造遺伝子は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株では配列番号２０の塩基配列中の２８６番目以降２５３８番目までの間に、ビフィドバクテリウム・ロンガム ＪＣＭ １２１７株では配列番号１９の塩基配列中の２０番目以降２２７２番目までの間にそれぞれ存在することが確認された。
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
配列番号１５：合成ＤＮＡ
配列番号１６：合成ＤＮＡ
配列番号１７：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
配列番号１５：合成ＤＮＡ
配列番号１６：合成ＤＮＡ
配列番号１７：合成ＤＮＡ
Claims (4)
- 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子を含有する組換えベクターを含む形質転換体を用いて前記遺伝子を発現させ、ラクトＮビオースホスホリラーゼを生産する方法。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ - 以下の（ａ）、又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ - 請求項２に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項３に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004166089A JP4264742B2 (ja) | 2004-06-03 | 2004-06-03 | ラクトｎビオースホスホリラーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクターを含む形質転換体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004166089A JP4264742B2 (ja) | 2004-06-03 | 2004-06-03 | ラクトｎビオースホスホリラーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクターを含む形質転換体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2005341883A JP2005341883A (ja) | 2005-12-15 |
| JP4264742B2 true JP4264742B2 (ja) | 2009-05-20 |
Family
ID=35494811
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004166089A Active JP4264742B2 (ja) | 2004-06-03 | 2004-06-03 | ラクトｎビオースホスホリラーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクターを含む形質転換体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4264742B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022034075A1 (en) | 2020-08-10 | 2022-02-17 | Inbiose N.V. | Production of glcnac containing bioproducts in a cell |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4915917B2 (ja) | 2006-12-22 | 2012-04-11 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | ラクト−ｎ−ビオースｉ及びガラクト−ｎ−ビオースの製造方法 |
| JP5800741B2 (ja) * | 2012-03-27 | 2015-10-28 | 森永乳業株式会社 | ラクト−ｎ−ビオースｉの製造方法 |
| JP2014168404A (ja) * | 2013-03-01 | 2014-09-18 | National Agriculture & Food Research Organization | 耐熱性１，３−βガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ |
| JP6222647B2 (ja) * | 2013-03-26 | 2017-11-01 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | １，３−βガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼの製造方法 |
-
2004
- 2004-06-03 JP JP2004166089A patent/JP4264742B2/ja active Active
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022034075A1 (en) | 2020-08-10 | 2022-02-17 | Inbiose N.V. | Production of glcnac containing bioproducts in a cell |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2005341883A (ja) | 2005-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11884916B2 (en) | Materials and methods for the synthesis of error-minimized nucleic acid molecules | |
| Voorhorst et al. | Characterization of the celB gene coding for beta-glucosidase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus and its expression and site-directed mutation in Escherichia coli | |
| Sidoruk et al. | Creation of a producent, optimization of expression, and purification of recombinant Yersinia pseudotuberculosis L-asparaginase | |
| Yanase et al. | Cloning, sequencing, and characterization of the intracellular invertase gene from Zymomonas mobilis | |
| Kato et al. | RecA protein from an extremely thermophilic bacterium, Thermus thermophilus HB8 | |
| EP2981609B1 (en) | Novel dna-polymerases | |
| Savijoki et al. | Molecular genetic characterization of the L-lactate dehydrogenase gene (ldhL) of Lactobacillus helveticus and biochemical characterization of the enzyme | |
| Brochu et al. | The HPr (Ser) kinase of Streptococcus salivarius: purification, properties, and cloning of the hprK gene | |
| JP4264742B2 (ja) | ラクトｎビオースホスホリラーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクターを含む形質転換体 | |
| Bright et al. | Cloning, sequencing and expression of the gene encoding glucose dehydrogenase from the thermophilic archaeon Thermoplasma acidophilum | |
| JP6047143B2 (ja) | ｃｙｃｌｉｃｄｉ−ＧＭＰの実践的酵素合成法 | |
| Emanuelsson et al. | Chemical and mutational modification of histidines in violaxanthin de‐epoxidase from Spinacia oleracea | |
| JP2002505084A (ja) | 植物性アルカリ性および中性インベルターゼ | |
| JP4917542B2 (ja) | 新規ｄｎａポリメラーゼ | |
| US20110020896A1 (en) | Mutant dna polymerases and their genes | |
| Vysotskaya et al. | The ribosomal protein S8 from Thermus thermophilus VK1: Sequencing of the gene, overexpression of the protein in Escherichia coli and interaction with rRNA | |
| Jala et al. | Overexpression and characterization of dimeric and tetrameric forms of recombinant serine hydroxymethyltransferase from Bacillus stearothermophilus | |
| Andreotti et al. | Indole-3-glycerol-phosphate synthase from Sulfolobus solfataricus as a model for studying thermostable TIM-barrel enzymes | |
| KR101778878B1 (ko) | 박테로이데스 속 미생물 유래의 ｇａｂａ 생성 고활성 글루탐산탈탄산효소 및 이의 용도 | |
| JP6369052B2 (ja) | 熱安定性アシルＣｏＡシンテターゼ及びその製造方法 | |
| JPH11514235A (ja) | キシラナーゼ、それをコードするオリゴヌクレオチド配列およびその使用 | |
| JP2021093954A (ja) | ガラクトオリゴ糖を製造可能な酵素、およびガラクトオリゴ糖を製造する方法 | |
| JP2990280B1 (ja) | アミノペプチダ―ゼ及びその前駆体の遺伝子、該遺伝子を含むベクタ―並びに形質転換体 | |
| JP2007053999A (ja) | 抗ｇｔｆ抗体及びその製造方法 | |
| CN111172136A (zh) | 一种具有高比酶活性和高热稳定性的β-葡萄糖苷酶及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060315 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20060919 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20061013 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080624 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080825 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20081007 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081203 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090113 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090203 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4264742 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120227 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120227 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130227 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150227 Year of fee payment: 6 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |