JPH11514235A - キシラナーゼ、それをコードするオリゴヌクレオチド配列およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 60℃で安定であり、182アミノ酸を含む配列を有するキシラナーゼ、およびそれをコードするオリゴヌクレオチド配列。このオリゴヌクレオチド配列は、好適なベクターに含まれて、キシラナーゼの産生を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】 キシラナーゼ、それをコードする オリゴヌクレオチド配列およびその使用 本発明は、キシラナーゼおよびそれをコードするヌクレオチド配列に関する。 それはまた、紙パルプの漂白におけるこの酵素の使用および、特に植物原料か らのキシロースまたはキシロ-オリゴ糖の調製に関する。 キシラナーゼに関する様々な使用が、生物工学の分野、特に食品分野（ビーリ ー(Biely)、Trends Biotechnol 3(11): 286-290、1985）、製紙工業（モラ(Mora )ら、J．Wood Chem．Technol、6: 147-165、1986）またはヘミセルロースからの 化合物の産生（ライリー ピー．ジェイ．(Reilly P.J.)、1981、Xylanases: st ructure and function in trends in the biology of fermentations for fuels and chemicals．エー．ジェイ．ホラエンダー(A．J．Hollaender)編、プレナム (Plenum)、ニューヨーク）において提案されてきた。 そのような適用の技術的な実行可能性は、中温性菌類によって産生される酵素 を主として用いて評価された。しかしながら、そのような適用は、より優れた温 度安定 性を有する菌類の使用によって促進できた。 様々な細菌および酵素が、キシラナーゼの産生に関して公知である（特に、ウ ォング(Wong)ら、Microbiological Reviews、52、No 3 305 317、1988を参照） 。これまで、酵素の最大収率は、菌類から得られた（ユー(Yu)ら、Enzymo Micro b．Technol．9: 16-24、1987）。しかしながら、バシラス(Bacillus)の高産生株 が既に記載されている（オカザキ(Okazaki)ら、Appl．Microbiol．Biotechnolog y、19: 335-340、1984；オカザキら、Agric．Biol．Chem．49、2033-2039、1985 ）。キシランを分解するバシラスのそのような好熱性の種は、それらの高い増殖 速度およびそれらの遺伝学が周知であるので、キシラナーゼの工業的産生に対す る優れた候補であり得る。 オカザキらによって単離されたキシラナーゼは、その著者によりW1およびW2と 称された２つのバシラス株からのものである。これらの株のそれぞれにおいて、 IおよびIIと称されるキシラナーゼ活性の２つの成分が示された。成分Iは、キシ ランをキシロビオースおよび高い重合度を有するオリゴマーに分解し、他方、成 分IIは、上記の化合物に加えてキシロースを産生する。 成分I（W1.IおよびW2.Iと称される）は、それぞれ分子量21.5 kDaおよび22.5 kDa並びに等電点8.5および8.3を 有する。成分II（W1.IIおよびW2.II）は、それらの部分について、それぞれ分子 量49.5 kDaおよび50 kDaを有する。 ２つの成分IおよびIIは、Hg⁺イオンによって、より少ない程度ではCu⁺によっ て阻害される。 多くの他のキシラナーゼが、就中、バシラス、クロストリジウム、アスペルギ ルス、ストレプトミセスまたはトリコデルマの様々な種から単離された（ウォン グら、1988、上記）。 従って、日本特許JP 130 96 84（リカガクケンキュウショ）の要約は、分子量 50 kDおよび42 kDを有するタイプWIIキシラナーゼに関する。このキシラナーゼ に関する等電点は述べられていない。 ラジャラム(RAJARAM)らによる論文（Applied Microbiology and Biotechnolog y、Vol.34、n°1、1990年10月、141-144ページ）は、自然環境から単離され、最 適な活性を60℃〜70℃、およびpH6〜7で有するキシラナーゼを産生するバシラス 株に関する。この酵素は、その分子量によっても、その等電点によっても特徴付 けられていない。この株はさらに、セルラーゼのような他の酵素を産生する。 リカガクケンキュウショの名称での日本特許(JP-85 1 18 644)の他の要約は、pH6〜7で最適な活性を有するキシラナーゼを記載してい る。この酵素は、限外濾過で測定して、分子量50〜100kDを有すると考えられて いる。等電点は、この要約に述べられていない。 robiology and Technology、Vol.8、1986年5月、309-314ページ)は、土から単離 され熱に安定なキシラナーゼを産生するバシラス・ステアロサーモプリルス(Bac illus stearothermoplilus)株に関する。その酵素は、最適な活性を78℃およびp H値7.5で有すると特徴付けられている。この酵素は、その分子量によっても、そ の等電pHによっても特徴付けられていない。 キシラナーゼの工業的産生は、セルラーゼのような不純物活性の同時存在によ り妨げられ、追加的な精製コストを導く。 本出願人が知る限り、セルラーゼを産生しない微生物で得られるエンドキシラ ナーゼに関する最高の産生性は、キシラナーゼAおよびBをコードする遺伝子を有 するプラスミドを組込んだ後に、セルラーゼ活性の無いストレプトミセス・リビ ダント(Streptomyces lividans)変異株から得られた。6000〜10,000 IU.l/hのオ ーダーの生産性は、培養培地中で観察された。にもかかわらず、この場合、 キシラナーゼAが不溶性キシランを加水分解できないことに関する問題、またキ シラナーゼBの場合には熱安定性の問題と遭遇する（クループフェル(Kluepfel) ら、Biochem．J．267、47-50、1990）ことが注目されるべきである。 本出願人の知る限り、これまで、これらの酵素のいずれも、工業的応用を可能 にする特徴、即ち、優れた熱安定性、基質分解のための大きな生産能力、高産生 株による産生手段およびアミノ酸配列を修飾する可能性を有しなかった。 他のキシラナーゼが、バシラス株から単離され、CNCMカルチャー・コレクショ ンに番号I-1017で寄託された。それは、本出願人の名称で出願されたEP 0.573.5 36に記載されている。このキシラナーゼは、温度安定性を発揮する。しかしなが ら、その配列は決定されておらず、それは前記バシラス株を増殖させることによ ってのみ産生できる。 従って、その特性を改善する目的で、そのタンパク質配列を修飾するのは可能 でなかった。 本出願人は、従って、このキシラナーゼをコードする遺伝子をクローン化し、 それを配列決定した。 本発明の主題は従って、下記のもの（配列番号２）と少なくとも80%、好まし くは90%、より好ましくは95%の相 同性を共有する配列を有する、好熱性キシラナーゼである。 相同性の程度は、ジェネティック・コンピューター・グループ・インコーポレ ーティッド(Genetic Computer Group，Inc.)パッケージ(GCG)のGAPおよびBESTFI Tプログラムのような対整列法(pairwise alignment methods)を用いて決定でき る。FASTAおよびBLAST（GCGパッケージに含まれる）のようなファスト・データ ベース・サーチング・プログラムは、１つの配列を、データベースの全ての利用 できる配列と比較するのに使用できる。 用語「相同性」の定義のために、アルトシュール(Altschul)ら(1990、J．Mol ．Biol.、215、403-410)およびドゥリットル アール．エフ．(Doolittle R.F.) （編）(Molecular evolution: computer analysis of protein and nucleic aci d sequences．Methods in Enzymology 183、アカデミックプレス、ロンドン、19 90)を参照できる。 この定義に入るキシラナーゼは、特に、配列番号２の配列と比較して、１個ま たは数個のアミノ酸が変化したものである。 そのようなアミノ酸の変化は、好ましくは、１個のアミノ酸を、レーニンジャ ー(Lehninger)（70ページ、仏語第２版、1979、フラマリオン(Flammarion)編） またはその最新の改版によって定義されるような実質的に同じ特性を有する他の １個で置換したものである。20個の基本的アミノ酸が、それらの特性に依存して ４つのグループに類別されている： −疎水性または非極性側鎖を有するもの、 −荷電していない極性側鎖を有するもの、 −負に荷電した側鎖を有するもの、および −正に荷電した側鎖を有するもの。 そのようなキシラナーゼは、SDS-PAGEで測定して約22 kDaの、または質量分析 で測定して20.7 kDaの分子量お よび約7.7の等電点を有し得る。 この酵素は、有利には、60℃で少なくとも24時間優れた安定性を示し、最適pH の活性は4.8〜7の範囲であり、好ましくは、約6である。 この酵素のpHiは、かなり高いが、にもかかわらず幾種かのバシラスによって 産生される類似の分子量のキシラナーゼ、特にオカザキら（1985、上述の刊行物 ）に記載されたもののpHiよりも低いことが注目されるべきである。 pH6は、最適pHに対応するが、その活性は、4.8〜7の範囲で80%より高く維持す る。 本発明の他の主題は、前記キシラナーゼをコードするヌクレオチド配列である 。この配列は、DNAまたはRNA配列、特にcDNA、プラスミドDNA、ゲノムDNAまたは mRNAであり得る。 好ましくは、そのようなヌクレオチド配列は、下記のものである（配列番号１ ）： 従って、本発明によるキシラナーゼは、適切に選択され、前記キシラナーゼを コードするベクターによって形質転換された微生物株によっても産生され得る。 前記微生物は、適切な培地で増殖され、その後キシラナーゼは、下記のように単 離される。 そのような微生物は、それを産生し分泌するように選択される。 それは、大腸菌(Escherichia coli)またはバシラス(Bacillus)種のような細菌 であり得る。 キシラナーゼをコードするベクターは、前記微生物で発現されるように選択さ れる。それは、pブルースクリプトまたは好ましくはpETのようなプラスミドであ り得る。 本発明によるキシラナーゼの産生に好適な発現のシステムは、特にディー．ヴ ィ．ゴェッデル(D.V.Goeddel)（編、Gene expression technology．Methods in Enzymology、185、アカデミックプレス、ロンドン、1990）に記載されている。 pET大腸菌発現システムは、最も広く使用されている細 菌発現システムの１つ（ストゥディアー(Studier)ら、1990、Meth．Enzymol.、1 85、60-89）である。 組換えキシラナーゼの発現は、特に下記のように為され得る。成熟キシラナー ゼをコードするDNAフラグメント、即ち、配列番号１の配列をPCRによって処理し て、T7を基礎とするベクターpET3aでの発現に好適なNdelおよびBamhl末端制限部 位を生じさせる。PCRフラグメントは、Ndel/BamHIフラグメントとしてpET3aにク ローニングする前に、pブルースクリプト（ストラタジーンクローニングシステ ムズ(Stratagene Cloning Systems)）に平滑末端でクローニングする。 組換え酵素は、pLysSを含む大腸菌株BL21(DE3)中でpET3aから発現させる。0.1 mM イソプロピルβ-D-チオガラクトシド(IPTG)で３時間誘導する前に、A₆₀₀が3 に達するまで、培養物をアンピシリン(100μg/ml)およびクロラムフェニコール( 25μg/ml)を含むL-肉汁の中で増殖させる。タンパク質精製のための大量の培養 物を遠心分離し、細胞を50 mM Tris-HCl、pH 8.0、1mM EDTAを含む緩衝液中で、 フレンチプレス(10 MPa)を介して通過させて溶解する。バシラスの培養上清から キシラナーゼを精製するためにEP 0.573.536に記載される同じ方法が使用できる 。細胞培養物 ml当り約1 mgの組換えタンパク質が期待でき る。 キシラナーゼ産生のこの方法の利点は、ヌクレオチド配列が、微生物に導入さ れる前に突然変異され得ることである。従って、様々な配列を有するキシラナー ゼに対応する様々な突然変異を得ることは容易である。 これは、グリュニンガーら（上記）によって記載されたもののような従来技術 に既に記載された熱安定性キシラナーゼでは、それらの配列が公知でない故に、 不可能である。 本発明、特にこの方法の産生を行うために、当業者は、分子生物学の通常の技 術を記載している下記のマニュアル：マニアチス(Maniatis)ら 1982-Molecular Cloning: a Laboratory Manual、コールドスプリング・ハーバー編、ニューヨー ク、またはその最新版の１つを参照できる。 上記のキシラナーゼは、下記の工程を包含する方法によって得ることができる ： −微生物の培養上清の濃縮、 −Ｑセファロース・ファスト・フロー(Q Sepharose Fast Flow)（ファルマ シア(Pharmacia)）のカラムのようなイオン交換カラムによる通過、 −フェニル-セファロース（ファルマシア）のカラム のような疎水性相互作用カラムによる通過。 上清の濃縮は、特に、10 kDa以上の排除閾値を有するポリスルフォン膜による 限外濾過によって行われ得る。 この方法は、実質的に純粋なキシラナーゼ調製物が得られるのを可能にする。 上記のキシラナーゼは、下記の工程を包含する方法によって産生され得る： −グルコースのような増殖基質を含む培地での細菌の増殖、および −培養物に好適な量のキシロ-オリゴ糖を連続的に送り込んで誘導されるキ シラナーゼの産生。 本発明の主題は、上記のキシラナーゼの紙パルプの漂白における使用でもある 。 このキシラナーゼの利点は、紙パルプの水和の程度が殆ど重要でないという事 実にある。優れた酵素的作用を得るために、紙を大がかりに希釈することは必須 ではない。紙パルプの漂白に、このキシラナーゼを助剤として使用することは、 その調製物がセルラーゼ不純物を含まないという事実のために、さらにより有利 である。 キシラナーゼはまた、植物起源の原料からのキシロースまたはキシロ-オリゴ 糖の調製に使用され得、それらは、低価格で再生可能な原料である（例えば、ト ウモロコシ の穂軸）。 キシラナーゼの他の使用は、文献に言及されていた。ゼイクス(Zeikus)らによ る総説（Thermostable saccharidases New Sources uses and Biodesigns in"En zymes in biomass conversion"、リーサム(Leatham)およびヒンメル(Himmel)、A CS Washington D.C.、1991）は、キシラナーゼの主な使用を記載している。それ らは主として、食品製造、そこでは、それらの特性がパン作製、フルーツジュー スおよびワインの清澄化並びに穀物繊維の栄養価を改善させる、また食料品の濃 縮剤の産生に使用される。 第２の応用領域は、紙パルプおよび繊維工業に関連し、そこでは、紙の漂白、 木材パルプの製造およびレーヨン製造のための繊維の精製に使用される。 家禽類飼育での使用も注目され、そこでは飼料の粘度を減少させるためにキシ ラナーゼの使用が行われる（ヴァン・パリドン(Van Paridon)ら、Xylans and Xy lanases、国際シンポジウム、ヴァゲニンゲン(Wageningen)、1991年12月8-11日 ；ベッドフォード(Bedford)およびクラッセン エイチ．エル(Classen H.L)、Xy lans and Xylanases、国際シンポジウム、ヴァゲニンゲン、1991年12月8-11日） 。 紙パルプ工業の副産物の価値を増大させるキシラナーゼの使用は、ビーリィ(B iely)(Trends in Biotechnology、Vol.3、No.11、1985)の論文に詳細に述べられ ている。 ２つのヨーロッパ特許EP 228,732およびEP 227,159も言及されて良く、それら は、グルコースシロップおよびビールの濾過性をそれぞれ改善するためのキシラ ナーゼの使用に関する。 ヘミセルロースから化合物を産生するためのキシラナーゼ使用の可能性（ライ リー、上記）も注目される。 これらの様々な刊行物は、本発明の主題であるキシラナーゼが、多数の用途に 使用され得ることを示す。 本発明は、下記に示す応用例によって例示されるが、それに限定されない。 図１は、本発明によるキシラナーゼ(XYL20)と他のキシラナーゼとの相同性の 程度を示す。 図２は、本発明の１つを含む４つのキシラナーゼのHCAプロットを示す。 図３には、本発明のキシラナーゼに関する二次構造的エレメントの予測が示さ れる。実施例１： キシラナーゼをコードする遺伝子のクローニングお よび配列決定 １．材料および方法 −株、ベクターおよび培養条件 株I-1017を、特許出願EP-0.573.536の実施例１および２に記載される液体培地 で55℃で増殖した。SURE、XL1-BlueおよびXLOLR エシェリキア・コリ株、ベクタ ーZAP Expressおよびpブルースクリプト並びに繊維状ヘルパーファージExAssist^TM は、全てストラタジーンクローニングシステムズから購入した。E.コリ細胞は 、LB培地で37℃で増殖させた。培地は、1.5%(w/v)のバクト(Bacto)アガーを添加 して凝固させた。 −ＤＮＡの調製 細菌のゲノムDNAを、ヤン(Yang)ら(Appl．Environ．Microbiol.、1988、54、1 023-1029)の方法に従い、I-1017から抽出した。 −ＸＹＬ２０をコードする部分的ゲノム・クローンの入手 XYL20をコードする染色体DNAの領域を増幅するために、PCRを使用した。前進 プライマーのヌクレオチド配列(P1)(配列番号３)は、AAYACNTAYTGGCARTAYTGGACN GAYGG（XYL20のN-末端の配列 NTYWQYWTDG から誘導した）であり；逆進プライマ ーのそれ(P2)(配列番号４)は、YTGWCKNACR CTCCARTAYTG（異なるバシラス種からの他のキシラナーゼのC-末端近くの保存領 域である、配列 QYWSVRQ に対応する）であった。鋳型としての染色体DNAおよび プライマーP1とP2とを用いて、サーモサイクラー（パーキン-エルマー(Perkin-E lmer)、フランス）上で下記の温度プロフィール：１分間94℃−１分間50℃−２ 分間72℃で、35サイクルのPCRを行った。PCR産物を、1%アガロースゲル上で精製 し、EcoRVで消化されたpブルースクリプトに連結した。キメラ・プラスミド(pBX 20)は、SURE細胞を形質転換するために使用した。組換え細胞を、アンピシリン( 40μg/ml)、イソプロピル-β-D-チオガラクトシド(0.2 mM)および5-ブロモ-4-ク ロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド(40μg/ml)を含むL-アガー・プレート上 で選択した。 −ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ中でＢ．ｓｐ−１０１７ゲノム・ライブラリーの 構築 染色体DNAを、Sau3AIで部分的に消化し、得られた1.5-8 kbサイズ範囲のDNAフ ラグメントを、BamHIで消化したZAP Expressに連結した。XL1-ブルー細胞を製造 者に指示されるように用いて、ライブラリーを構築した。 −ゲノム・ライブラリーのスクリーニン pBX20を、BamHIおよびHindIIIで消化し、DNA挿入物を精製し、ジゴキシゲニン (digoxigenin)（ベーリンガー・ マンハイム(Boehringer Mannheim)）を用いて、製造者の指示に従い標識した。 標識DNAは、ゲノム・ライブラリーをスクリーニングするために使用した。３回 目のスクリーニングの後、陽性のラムダ・プラークを単離し、繊維状ファージEx Assistを用いてベクターZAP Expressに挿入した組換えプラスミドpBK-CMVを切り 出し、その後、カナマイシン(10μg/ml)の存在下にXLOLR細胞に感染させること によって回収した。 −ＤＮＡ配列分析 配列決定のためのプラスミド調製は、クィアゲンチップ100(Quiagen tip 100) （ディアゲン(Diagen)、コガー(Coger)、フランス）を用いて行った。二本鎖DNA の配列決定は、サンガーらのジデオキシ鎖終止法(Proc．Nat．Acad．Sci．USA、 1977、74、5463-5467)により、ユナイテッドステーツ・バイオケミカル(United States Biochemical)からのSequenase^TM2.0 DNAシークエンシング・キットを用 いて行った。普遍プライマーおよび特異的プライマーの両方を用いて、プラスミ ド中の挿入物のセンス鎖およびアンチセンス鎖を配列決定した。 −タンパク質の配列分析および疎水性クラスター分析 ジェネティックス・コンピューター・インコーポレー ティッド(Genetics Computer，Inc.)によるシークエンス・アナリシス・ソフト ウェア・パッケージ(sequence Analysis Software Package)（GCGパッケージ） を、この作業を通して用いた。特に、パイルアップ・プログラム(Pileup progra m)を用いて複数整列を行わせ、対比較をベストフィット・プログラム(Bestfit p rogram)を用いて行った。 ハイドロフォービック・クラスター・アナリシス(HCA)は、アミノ酸配列を比 較する方法（ガボリアウド(Gaboriaud)ら、FEBS Lett.、1987、224、149-155） であり、それはリム(Lim)の理論(J．Mol．Biol.、1974、88、857-8 らせんの配列の図示を包含し、そこでは、疎水性残基はクラスターを形成する。 クラスターの形状、サイズおよび相対的位置が比較でき、配列の類似性は、それ が存在するとき容易に明示できる。この方法で要請されるアミノ酸配列の2D-ら せんプロットへの変換は、HCA-プロット・ソフトウェアを用いて為された。 ２）結果 キシラナーゼ配列を決定する第１の試みにおいて、キシラナーゼ活性をゲノム ・ライブラリーでテストした。しかしながら、このアプローチは、本発明による キシラ ナーゼの単離を行うのに失敗した。 第２の成功した試みでは、このキシラナーゼの配列が最終的に決定された。 キシラナーゼのN-末端領域のアミノ酸配列が決定された（EP 0.573.536の実施 例４）ことが思い起こされる。それは、枯草菌(Bacillus subtilis)およびバシ ラス・サーキュランス(Bacillus circulans)により産生されるキシラナーゼのN- 末端と67%の同一性を示す。 さらに、Gファミリー（ギルクス(Gilkes)らの分類(Microbiol．Rev.、1991、5 5、303-315)による）に属するこれらの酵素は、それらのポリペプチド鎖に沿っ て幾つかの保存領域を共有する。就中、７アミノ酸からなる１領域がC-末端近く に生じる。 キシラナーゼをコードする遺伝子の一部は、キシラナーゼのN-末端およびC-末 端近くの保存領域にそれぞれ対応する、２つの同義性プライマーP1およびP2を用 いて、PCRにより増幅された。450 bp DNAフラグメントを得て、ベクターpブルー スクリプトにクローニングした。得られたプラスミドpBX20の配列は、疑いもな くキシラナーゼに帰属され得る。キシラナーゼの完全な遺伝子を得るために、フ ァージ・ベクターZAP Expressを用いて、B.sp I-1017のゲノム・ライブラリーを E.コリ XL1-ブルー中で調 製した。このライブラリーを、プラスミドpBX20の挿入物 のプラークは、キシラナーゼの完全な遺伝子を含むことが示された。 このクローンのヌクレオチド配列は、これ以降、配列番号１として配列表に示 される。 キシラナーゼの完全なタンパク質配列は、下記の配列表に配列番号２として示 される。 タンパク質データベースPIRおよびSwiss-Prot中のFASTAサーチの結果から、36 個のキシラナーゼ配列を得た。表に示されるように、そのキシラナーゼは、Gフ ァミリーの他のキシラナーゼと配列相同性を共有する。最良の結果(73%の同一性 )は、枯草菌およびB.サーキュランスからのキシラナーゼで予測されたように観 察される。これは、本発明によるキシラナーゼが、ユニークなアミノ酸配列を有 する新しいタンパク質であることを明瞭に示す。 比較を目的として、異なる生物（表中で太字で書かれているもの）からの代表 的キシラナーゼのみを、図１に示される複数配列整列にリストする。Gファミリ ーの14個のキシラナーゼの一次配列整列の分析は、ファミリーを通して保存され る残基を示す。以前、ワカルチュック(Wakarchuk)らにより報告（Protein Sci. 、1988、3、467- 475）されたように、２個のグルタミン酸残基は、このファミリーのキシラナー ゼに完全に保存されている。この複数整列は、Glu 76およびGlu 169がキシラナ ーゼの触媒性残基であることを示唆する。 整列は次に、HCA法（ガボリアウドら、1987、前記）によって再検討され、そ れは、クラスターの迅速な同定および容易な整列（図２）を可能にする。クラス ターの同定は、たとえクラスター形状に幾つかの変異があるとしても、簡単であ る。整列は、図１に示される３個のキシラナーゼに関して結晶構造でチェックさ れ、β鎖の外延(extension)がHCAプロット上で示される。垂直線が、β鎖の外延 の範囲を定めるために挿入された。最も保存された疎水性クラスターが、より優 れた視覚化のために陰影を付けられた。 本発明によるキシラナーゼ(XYL20)のHCAプロットのために、β鎖の外延を他の プロットから推測した。XLY20の ることが明らかに判る。これらのエレメントは、グリークキーの特徴的な折り畳 みを発揮するのに十分に組織化される。我々はまた、下記の芳香族残基：一方の β鎖上のTyr 67およびTyr 78並びに他方のβ鎖上のTyr 163が、それらの加水分 解の前に、配向およびキシラン多糖の結 合に関連し易いことを推測できる。 図３は、その一次構造および全体的なタンパク質配列分析に基づき、本発明に よるキシラナーゼに関して提案し得る二次構造的エレメントの生起の予測を要約 する。これらの構造的予測は、このキシラナーゼの結晶構造の解明の見地から、 モレキュラー・イソモルフィズム・リプレイスメント(Molecular Isomorphism R eplacement)で使用されるように、推定三次元モデルに翻訳し得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ， ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ドベイル フィリップ フランス国 エフ−59650 ヴィルナーブ ダスク アレー デ シャモワ ４／76

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 配列番号２の下記配列： を有するものと、少なくとも80%、好ましくは90%の相同性を共有する配列を有す るキシラナーゼ。 ２． 約60℃で24時間安定である、請求項１に記載のキシラナーゼ。 ３． 適切に選択され、前記キシラナーゼをコードするベクターにより形質 転換された微生物株によって分泌される、請求項１および２の１つに記載のキシ ラナーゼ。 ４． 請求項１〜３の１つに記載のキシラナーゼをコードするヌクレオチド 配列。 ５． 配列番号１の下記配列： を有するヌクレオチド配列。 ６． 請求項４および５の１つに記載の配列を含むベクター、特にプラスミ ド。 ７． 配列番号２の配列を有する、または配列番号２と少なくとも80%、好 ましくは90%の相同性を共有するキシラナーゼの産生方法であって、 −適切に選択され、請求項６に記載のキシラナーゼをコードするベクターに よって形質転換された微生物株 を好適な培地で増殖させ、および −キシラナーゼを単離する、 方法。