KR20050010053A - 자일라나제, 이를 암호화하는 핵산, 및 이의 제조 및 사용방법 - Google Patents

자일라나제, 이를 암호화하는 핵산, 및 이의 제조 및 사용방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자일라나제 및 자일라나제를 암호화하는 폴리뉴크레오티드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신규 자일라나제의 구성 방법 및 이의 사용 방법도 제공한다. 자일라나제는 증가된 pH 및 온도에서 증가된 활성 및 안정성을 보유한다.

Description

자일라나제, 이를 암호화하는 핵산, 및 이의 제조 및 사용 방법{XYLANASES, NUCLEIC ACIDS ENCODING THEM AND METHODS FOR MAKING AND USING THEM}
자일라나제(예컨대, 엔도-1,4-베타-자일라나제, EC 3.2.1.8)는 자일란 내의 내부 β-1,4-자일로시드계 연결기를 가수분해하여, 보다 작은 분자량의 자일로스 및 자일로-올리고머를 생성시킨다. 자일란은 1,4-β-글리코시드가 연결된 D-자일로피라노즈로부터 형성된 다당류이다. 자일라나제는 상업적 가치가 상당하며, 제빵, 및 과일과 야채 가공을 위한 식품 산업, 농업용 폐기물의 파괴, 동물 사료의 제조 및 펄프 및 종이의 제조에서 사용된다. 자일라나제는 진균류 및 박테리아에 의해형성된다.
아라비노자일라나제는 다양성 및 성장 조건에 따라서 2.5 내지 7.1%w/w를 나타내는 곡류의 주요 비전분 다당류이다. 이 다당류는 산화적 조건 하에서 점성 용액을 생성시키거나, 심지어는 겔화하도록 하는 물리화학적 성질을 가진다. 게다가, 아라비노자일란은 높은 수분결합력을 가지고, 단백질 발포를 안정화시키는 역할을 할 수 있다. 이 모든 특징들은 양조, 제빵, 동물 영양섭취 및 제지를 포함하는 수가지 산업에 있어 문제를 제기한다. 양조 용도에 있어, 자일란의 존재는 맥아즙 여과성 및 헤이즈 형성 관련 문제를 초래한다. 제빵 용도(특히 쿠키 및 크래커의 용도)에 있어, 이 아라비노자일란은 비스킷 크기의 기계화 및 감소화를 어렵게 하는 끈적한 도우를 생성시킨다. 게다가, 이 탄수화물은 바삭거림을 실추시키고 저장 수명을 감소시키는 제빵 제품의 급속한 재함수와 관련이 있다. 곡류 식이법을 이용한 단위 동물의 사료 용도에서, 아라비노자일란은 장 내용물의 점도에 기여하는 주요 인자이기 때문에, 사료의 분해성 및 동물의 성장 속도에 악영향을 준다. 반추 동물의 경우, 이 다당류는 섬유소 섭취의 실질적인 성분을 나타내고, 아라비노자일란의 더욱 완전한 분해(digestion)는 보다 높은 사료 전환 효능을 촉진하게 된다.
자일라나제는 현재 수용성 아라비노자일란의 가수분해를 위한 도우 가공에서 첨가제(도우 컨디셔너)로서 사용된다. 제빵 용도(특히 쿠키 및 크래커 용도)에서, 아라비노자일란은 비스킷 크기의 기계화 및 감소화를 어렵게 하는 끈적한 도우를 생성시킨다. 게다가, 이 탄수화물은 바삭거림을 실추시키고 저장 수명을 감소시키는 제빵 제품의 급속한 재함수와 관련이 있다.
동물 사료에 있어 자일란 분해의 증진은 중요한 탄수화물 및 단백질 사료 영양소의 유용성 및 분해성을 향상시킬 수 있다. 곡류 식이법을 이용한 단위 동물의 사료 용도에서, 아라비노자일란은 장 내용물의 점도에 기여하는 주요 인자이기 때문에, 사료의 분해성 및 동물의 성장 속도에 악영향을 준다. 반추 동물의 경우, 이 다당류는 섬유소 섭취의 실질적인 성분을 나타내고, 아라비노자일란의 더욱 완전한 분해는 보다 높은 사료 전환 효능을 촉진하게 된다. 동물 사료 자일라나제는 동물의 위 내에서 활성적인 것이 바람직하다. 이는 사료 효소가, 37℃에서, 또한 단위 동물의 경우에는 낮은 pH(pH 2 내지 4)에서, 또한 반추 동물의 경우에는 중성 부근의 pH(pH 6.5 내지 7)에서 높은 활성을 가질 것을 요한다. 효소는 또한 동물 장의 자일라나제에 대한 내성, 및 사료 펠릿화와 관련된 고온에서의 안정성을 가져야 한다. 이로써, 당업계에서는 높은 특이적 활성, 35℃ 내지 40℃ 및 pH 2 내지 4에서의 활성, SGF 에서 30분 초과의 반감기 및 제형된 상태에서 85℃에서 5분 초과의 반감기를 가지는 단위동물 사료용 자일라나제 사료 첨가제가 필요하다. 반추동물 사료에서는, 높은 특이적 활성, 35℃ 내지 40℃ 및 pH 6.5 내지 7.0에서의 활성, SRF 에서의 30분 초과의 반감기 및 농축 건조 분말로서의 안정성을 갖는 자일라나제 사료 첨가제가 필요하다.
자일라나제는 또한 수많은 다른 용도들에서도 사용된다. 예를 들어, 자일라나제는 젖소의 우유 단백질 제조에 있어 양질을 향상시키고(예컨대, Kung, L. 등, J. Dairy Science, 2000년 1월, 83: 115-122 참고), 돼지의 위 및 소장에서의 가용성 당류의 양을 증가시키며(예컨대, van der Meulen, J. 등, Arch. Tierernahr,2001 54 : 101-115 참고), 닭의 달걀 생산 효능 및 달걀 수율을 향상시키는데(예컨대, Jaroni, D. 등, Poult. Sci., 1999 June 78: 841-847 참고) 사용된다. 부가적으로, 자일라나제는 화학적 펄프의 생물표백 및 처리(예컨대, U.S. 특허 No. 5,202,249 참고), 목재 또는 종이 펄프의 생물표백 및 처리(예컨대, U.S. 특허 No. 5,179,021, 5,116,746, 5,407,827, 5,405,769, 5,395,765, 5,369,024, 5,457,045, 5,434,071, 5,498,534, 5,591,304, 5,645,686, 5,725,732, 5,759,840, 5,834,301, 5,871,730 및 6,057,438 참고), 목재 내의 리그닌의 감소 및 목재 변형(예컨대, U.S. 특허 No. 5,486,468 및 5,770,012 참고)에 유용하고, 또한 분(flour), 도우 및 빵 향상제로서(예컨대, U.S. 특허 No. 5,108,765 및 5,306,633 참고), 상기 설명된 바와 같은 사료 첨가제 및/또는 보충물로서(예컨대, U.S. 특허 No. 5,432,074, 5,429,828, 5,612,055, 5,720,971, 5,981,233, 5,948,667, 6,099,844, 6,132,727 및 6,132,716) 유용하며, 셀룰로스 용액의 제조(예컨대, U.S. 특허 No. 5,760,211 참고)에 유용한 것으로 나타났다. 자일라나제 활성을 갖는 세제 조성물은 과일, 야채 및/또는 진흙 및 점토 화합물에 유용하다(예컨대, U.S. 특허 No. 5,786, 316 참고).
자일라나제는 또한 콕시듐증의 치료 및/또는 예방 제제를 제조하기 위한, 카르보하이드라제(당질분해효소) 및/또는 자일라나제의 사용 방법 및 조성물에서 유용하다. 제조된 제제는 곡류 기재의 동물 사료의 형태일 수 있다(예컨대, U.S. 특허 No. 5,624,678 참고). 자일라나제의 부가적 용도에는, 수용성 식이 섬유소의 제조(예컨대, U.S. 특허 No. 5,622,738 참고), 전분의 여과성, 분리 및 제조의 향상(예컨대, U.S. 특허 No. 4,960,705 및 5,023,176 참고), 및 음료 산업에서는 맥아즙 또는 맥주의 여과성의 향상(예컨대, U.S. 특허 No. 4,746,517 참고), 효소 조성물에서는 가축의 젖 분비 촉진 및 젖의 품질 향상(예컨대, U.S. 특허 No. 4,144,354 참고), 식물 물질의 점도 감소(예컨대, U.S. 특허 No. 5,874,274), 잼, 마아말레이드, 젤리, 쥬스, 페이스트, 스프, 살사 등과 같은 식품의 점도 또는 겔 강도의 증가(예컨대, U.S. 특허 No. 6,036,981 참고)에서의 용도들이 포함된다. 자일라나제는 또한 특히 셀룰로스의 존재 하에서 그 자일라나제가 선택성을 갖는 헤미셀룰로스의 가수분해에 사용될 수도 있다. 부가적으로, 셀룰라아제 풍부의 농축액(retentate)은 셀룰로스의 가수분해에 적당하다(예컨대, U.S. 특허 No. 4,725,544 참고).
자일라나제의 각종 용도들에는, 에탄올의 제조(예컨대, PCT 출원 No. WO0043496 및 WO8100857 참고), 에탄올을 생성하는 미생물의 형질전환(예컨대, PCT 출원 No. WO99/46362 참고), 포도주양조 탄닌 및 효소계 조성물의 제조(예컨대, PCT 출원 No. WO0164830 참고), 식물의 자연 방어의 자극(예컨대, PCT 출원 No.WO0130161 참고), 헤미셀룰로스 기재로부터의 당 제조(예컨대, PCT 출원 No. WO9203541 참고), 과일, 야채, 진흙 또는 점토 함유 토양의 세정(예컨대, PCT 출원 No. WO9613568 참고), 맥주 여과 막의 세정(예컨대, PCT 출원 No. WO9623579 참고), 미생물 세포의 살생 또는 억제 방법(예컨대, PCT 출원 No. WO9732480 참고) 및 2 가지 UV 흡수 측정값의 비를 이용하여 스펙트럼을 비교함에 의한 목재 펄프 표백으로부터의 가공수의 특성 결정(예컨대, PCT 출원 No. WO9840721 참고)의 용도들이포함된다.
종이 및 펄프 산업에 사용되는 자일라나제에 관해서는, 자일라나제를 많은 원(source)들로부터 분리시켜 왔다. 특히, 이에 대해 U.S. 특허 No. 6,083,733 및 6,140,095 및 6,346,407를 참고로 한다. 특히, U.S. 특허 No. 6,140,095는 알칼리 내성의 자일라나제에 관한 것으로 나타나 있다. 그러나, 당업계에서, 효소가 65℃ 내지 75℃의 온도 범위 및 약 pH 10에서 활성적인 종이 및 펄프 산업에 자일라나제가 사용될 필요가 여전히 있는 것으로 나타나 있다. 부가적으로 종이 및 펄프 산업에서 유용한 본 발명의 효소는 이산화염소와 같은 표백 화학물질의 필요를 감소시킬 것이다.
본원에 논의된 공보들은 본 출원의 출원일 이전에 단지 그 개시 내용만을 위해 제공된 것들이다. 본원에서는 그 어떠한 것도 본원이 종래 발명으로 인해 그와 같은 개시내용을 선행할 수 없도록 하는 승인으로서 간주되지 않도록 한다.
발명의 개요
본 발명은, 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500개, 또는 그 이상의 잔기의 부위 상에서, 본 발명의 예시적 핵산, 예컨대 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19,서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117, 서열 번호 119, 서열 번호 121, 서열 번호 123, 서열 번호 125, 서열 번호 127, 서열 번호 129, 서열 번호 131, 서열 번호 133, 서열 번호 135, 서열 번호 137, 서열 번호 139, 서열 번호 141, 서열 번호 143, 서열 번호 145, 서열 번호 147, 서열 번호 149, 서열 번호 151, 서열 번호 153, 서열 번호 155, 서열 번호 157, 서열 번호 159, 서열 번호 161, 서열 번호 163, 서열 번호 165, 서열 번호 167, 서열 번호 169, 서열 번호 171, 서열 번호 173, 서열 번호 175, 서열 번호 177, 서열 번호 179, 서열 번호 181, 서열 번호 183, 서열 번호 185, 서열 번호 187, 서열 번호 189, 서열 번호 191, 서열 번호 193, 서열 번호 195, 서열 번호 197, 서열 번호 199, 서열 번호 201, 서열 번호 203, 서열 번호 205, 서열 번호 207, 서열 번호 209, 서열 번호 211, 서열 번호 213, 서열 번호 215, 서열 번호 217, 서열 번호 219, 서열 번호 221, 서열 번호 223, 서열 번호 225, 서열 번호227, 서열 번호 229, 서열 번호 231, 서열 번호 233, 서열 번호 235, 서열 번호 237, 서열 번호 239, 서열 번호 241, 서열 번호 243, 서열 번호 245, 서열 번호 247, 서열 번호 249, 서열 번호 251, 서열 번호 253, 서열 번호 255, 서열 번호 257, 서열 번호 259, 서열 번호 261, 서열 번호 263, 서열 번호 265, 서열 번호 267, 서열 번호 269, 서열 번호 271, 서열 번호 273, 서열 번호 275, 서열 번호 277, 서열 번호 279, 서열 번호 281, 서열 번호 283, 서열 번호 285, 서열 번호 287, 서열 번호 289, 서열 번호 291, 서열 번호 293, 서열 번호 295, 서열 번호 297, 서열 번호 299, 서열 번호 301, 서열 번호 303, 서열 번호 305, 서열 번호 307, 서열 번호 309, 서열 번호 311, 서열 번호 313, 서열 번호 315, 서열 번호 317, 서열 번호 319, 서열 번호 321, 서열 번호 323, 서열 번호 325, 서열 번호 327, 서열 번호 329, 서열 번호 331, 서열 번호 333, 서열 번호 335, 서열 번호 337, 서열 번호 339, 서열 번호 341, 서열 번호 343, 서열 번호 345, 서열 번호 347, 서열 번호 349, 서열 번호 351, 서열 번호 353, 서열 번호 355, 서열 번호 357, 서열 번호 359, 서열 번호 361, 서열 번호 363, 서열 번호 365, 서열 번호 367, 서열 번호 369, 서열 번호 371, 서열 번호 373, 서열 번호 375, 서열 번호 377 또는 서열 번호 379에 대해, 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%,78%, 79%, 80%, 81%,82%, 83%, 84%, 85%,86%, 87%,88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상, 또는 완전(100%)의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 핵산으로서, 자일라나제 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 제공하고, 여기에서 서열 상동성은 서열 비교 알고리즘을 이용하는 분석 또는 시각적 조사에 의해 결정된다.
또한 본 발명의 예시적 핵산에는 또한 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 48, 서열 번호 50, 서열 번호 52, 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 58, 서열 번호 60, 서열 번호 62, 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108, 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116, 서열 번호 118, 서열 번호 120, 서열 번호 122, 서열 번호 124, 서열 번호 126, 서열 번호 128, 서열 번호 130, 서열 번호 132, 서열 번호 134, 서열 번호 136, 서열 번호 138, 서열 번호 140, 서열 번호 142, 서열 번호 144, 서열 번호 146, 서열 번호 148, 서열 번호 150, 서열 번호 152, 서열 번호 154, 서열 번호 156, 서열 번호 158, 서열 번호 160, 서열 번호 162, 서열 번호 164, 서열 번호 166, 서열 번호 168, 서열 번호 170, 서열 번호 172, 서열 번호 174, 서열 번호176, 서열 번호 178, 서열 번호 180, 서열 번호 182, 서열 번호 184, 서열 번호 186, 서열 번호 188, 서열 번호 190, 서열 번호 192, 서열 번호 194, 서열 번호 196, 서열 번호 198, 서열 번호 200, 서열 번호 202, 서열 번호 204, 서열 번호 206, 서열 번호 208, 서열 번호 210, 서열 번호 212, 서열 번호 214, 서열 번호 216, 서열 번호 218, 서열 번호 220, 서열 번호 222, 서열 번호 224, 서열 번호 226, 서열 번호 228, 서열 번호 230, 서열 번호 232, 서열 번호 234, 서열 번호 236, 서열 번호 23 8, 서열 번호 240, 서열 번호 242, 서열 번호 244, 서열 번호 246, 서열 번호 248, 서열 번호 250, 서열 번호 252, 서열 번호 254, 서열 번호 256, 서열 번호 258, 서열 번호 260, 서열 번호 262, 서열 번호 264, 서열 번호 266, 서열 번호 268, 서열 번호 270, 서열 번호 272, 서열 번호 274, 서열 번호 276, 서열 번호 278, 서열 번호 280, 서열 번호 282, 서열 번호 284, 서열 번호 286, 서열 번호 288, 서열 번호 290, 서열 번호 292, 서열 번호 294, 서열 번호 296, 서열 번호 298, 서열 번호 300, 서열 번호 302, 서열 번호 304, 서열 번호 306, 서열 번호 308, 서열 번호 310, 서열 번호 312, 서열 번호 314, 서열 번호 316, 서열 번호 318, 서열 번호 320, 서열 번호 322, 서열 번호 324, 서열 번호 326, 서열 번호 328, 서열 번호 330, 서열 번호 332, 서열 번호 334, 서열 번호 336, 서열 번호 338, 서열 번호 340, 서열 번호 342, 서열 번호 334, 서열 번호 336, 서열 번호 338, 서열 번호 340, 서열 번호 342, 서열 번호 344, 서열 번호 346, 서열 번호 348, 서열 번호 350, 서열 번호 352, 서열 번호 354, 서열 번호 356, 서열 번호 358, 서열 번호 360, 서열 번호 362, 서열 번호 364, 서열 번호366, 서열 번호 368, 서열 번호 370, 서열 번호 372, 서열 번호 374, 서열 번호 376, 서열 번호 378 또는 서열 번호 380에 표시되는 서열, 및 그것의 서브서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 분리 또는 재조합 핵산 및 그것의 변이체도 포함된다. 한 측면에서, 폴리펩티드는 자일라나제 활성을 가진다.
한 측면에서, 본 발명은 또한 혼합 배양물로부터 유도된다는 공통된 신규성을 갖는 자일라나제를 암호화하는 핵산을 제공한다. 본 발명은, 적어도 약 50, 75, 100, 150, 200,250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150개 또는 그 이상의 서열 부위 상에서, 본 발명의 예시적 핵산, 예컨대 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 655 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117, 서열 번호 119, 서열 번호 121, 서열 번호 123, 서열 번호 125, 서열번호 127, 서열 번호 129, 서열 번호 131, 서열 번호 133, 서열 번호 135, 서열 번호 137, 서열 번호 139, 서열 번호 141, 서열 번호 143, 서열 번호 145, 서열 번호 147, 서열 번호 149, 서열 번호 151, 서열 번호 153, 서열 번호 155, 서열 번호 157, 서열 번호 159, 서열 번호 161, 서열 번호 163, 서열 번호 165, 서열 번호 167, 서열 번호 169, 서열 번호 171, 서열 번호 173, 서열 번호 175, 서열 번호 177, 서열 번호 179, 서열 번호 181, 서열 번호 183, 서열 번호 185, 서열 번호 187, 서열 번호 189, 서열 번호 191, 서열 번호 193, 서열 번호 195, 서열 번호 197, 서열 번호 199, 서열 번호 201, 서열 번호 203, 서열 번호 205, 서열 번호 207, 서열 번호 209, 서열 번호 211, 서열 번호 213, 서열 번호 215, 서열 번호 217, 서열 번호 219, 서열 번호 221, 서열 번호 223, 서열 번호 225, 서열 번호 227, 서열 번호 229, 서열 번호 231, 서열 번호 233, 서열 번호 235, 서열 번호 237, 서열 번호 239, 서열 번호 241, 서열 번호 243, 서열 번호 245, 서열 번호 247, 서열 번호 249, 서열 번호 251, 서열 번호 253, 서열 번호 255, 서열 번호 257, 서열 번호 259, 서열 번호 261, 서열 번호 263, 서열 번호 265, 서열 번호 267, 서열 번호 269, 서열 번호 271, 서열 번호 273, 서열 번호 275, 서열 번호 277, 서열 번호 279, 서열 번호 281, 서열 번호 283, 서열 번호 285, 서열 번호 287, 서열 번호 289, 서열 번호 291, 서열 번호 293, 서열 번호 295, 서열 번호 297, 서열 번호 299, 서열 번호 301, 서열 번호 303, 서열 번호 305, 서열 번호 307, 서열 번호 309, 서열 번호 311, 서열 번호 313, 서열 번호 315, 서열 번호 317, 서열 번호 319, 서열 번호 321, 서열 번호 323, 서열 번호 325, 서열 번호327, 서열 번호 329, 서열 번호 331, 서열 번호 333, 서열 번호 335, 서열 번호 337, 서열 번호 339, 서열 번호 341, 서열 번호 343, 서열 번호 345, 서열 번호 347, 서열 번호 349, 서열 번호 351, 서열 번호 353, 서열 번호 355, 서열 번호 357, 서열 번호 359, 서열 번호 361, 서열 번호 363, 서열 번호 365, 서열 번호 367, 서열 번호 369, 서열 번호 371, 서열 번호 373, 서열 번호 375, 서열 번호 377 or 서열 번호 379에 대해, 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50%, 51%, 52%,53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%,59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%,82%, 83%,84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상, 또는 완전한(100%) 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 혼합 배양물로부터 분리된 자일라나제를 암호화하는 핵산을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 또한 환경적 원(source), 예컨대 혼합된 환경적 원, 박테리아 원 및/또는 원시세균 원으로부터 유도된다는 공통된 신규성을 갖는 자일라나제를 암호화하는 핵산을 제공하며, 이에 대해 표 3을 참고로 한다. 한 측면에서, 본 발명은 환경적 원, 예컨대 혼합된 환경적 원, 박테리아 원 및/또는 원시세균 원으로부터 분리된 자일라나제를 암호화하는 핵산으로서, 적어도 약 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200개 또는 그 이상의 잔기의 부위 상에서, 본 발명의 예시적 핵산에 대해, 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50%, 51%, 52%, 53%,54%, 55%, 56%,57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%,66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%,82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%,88%,89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,98%, 99%, 또는 그 이상, 또는 완전한(100%) 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공하며, 여기에서 그 핵산은 자일라나제 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화하고, 서열 상동성은 서열 비교 알고리즘을 이용하는 분석 또는 시각적 조사에 의해 결정된다.
한 측면에서, 본 발명은 또한 공통적인 글리코시다아제 부류, 예컨대 이하 표 5에 나와 있는 부류 5, 6, 8, 10, 11, 26 또는 30으로부터 유도된다는 공통된 신규성을 갖는 자일라나제를 암호화하는 핵산도 제공한다.
한 측면에서, 서열 비교 알고리즘은, 필터링 세팅은 -p blastp -d "nr pataa" -FF로 블라스트값을 설정하고, 다른 모든 옵션은 디폴트값으로 설정하는 BLAST 버전 2.2.2 알고리즘이다.
본 발명의 또 다른 측면은, 본 발명의 핵산 서열, 그와 실질적으로 동일한 서열 및 그것과 상보적인 서열의 10개 이상의 연속 염기들을 포함하는 분리 또는 재조합 핵산이다.
한 측면에서, 자일라나제 활성은 내부 β-l,4-자일로시드계 연결기의 가수분해에서 촉매 작용하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 자일라나제 활성은 엔도-1,4-베타-자일라나제 활성을 포함한다.
한 측면에서, 자일라나제 활성은 자일란을 가수분해하여 보다 작은 분자량의 자일로스 및 자일로-올리고머를 생성하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 자일란은수용성 아라비노자일란과 같은 아라비노자일란을 포함한다. 수용성 아라비노자일란은 반죽 또는 빵류 제품을 포함할 수 있다.
한 측면에서, 자일라나제 활성은 1,4-β-글리코시드가 연결된 D-자일로피라노즈를 포함하는 다당류를 가수분해하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 자일라나제 활성은 헤미셀룰로스를 가수분해하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 자일라나제 활성은 목재 또는 종이 펄프 또는 종이 제품에서 헤미셀룰로스를 가수분해하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 본 발명은 목재 또는 목재품을 본 발명의 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는 목재 또는 목재품 내의 리그닌을 감소시키는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 자일라나제 활성은 음료 또는 사료 또는 식품 내의 자일란의 가수분해에 촉매작용하는 것을 포함한다. 사료 또는 식품은 곡류 기재의 동물 사료, 맥아즙 또는 맥주, 우유 또는 유제품, 과일 또는 야채를 포함할 수 있다. 한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 식품, 사료 또는 음료 또는 음료 전구체를 제공한다. 식품은 반죽 또는 빵류 제품일 수 있다. 음료 또는 음료 전구체는 맥주 또는 맥아즙일 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 도우의 컨디셔닝에 충분한 조건 하에, 반죽 또는 빵류 제품을 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는 도우의 컨디셔닝 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 음료의 점도를 감소시키기에 충분한 조건 하에 음료 또는 음료 전구체에 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는 음료의 제조 방법을 제공한다.
한 측면에서, 자일라나제 활성은 세포, 예컨대 식물 세포 또는 미생물 세포 내에서의 자일란의 가수분해에 촉매작용하는 것을 포함한다.
한 측면에서, 분리 또는 재조합 핵산은 열안정성의 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화한다. 폴리펩티드는 약 37℃ 내지 약 95℃, 약 55℃ 내지 약 85℃, 약 70℃ 내지 약 95℃, 또는 약 90℃ 내지 약 95℃의 온도 범위를 포함하는 조건 하에서 자일라나제 활성을 가질 수 있다.
또 다른 한 측면에서, 분리 또는 재조합 핵산은 내열성의 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화한다. 폴리펩티드는 37℃초과 내지 약 95℃범위의 온도, 또는 55℃초과 내지 약 85℃의 범위 내 임의의 온도에 노출된 후, 자일라나제 활성을 가질 수 있다. 폴리펩티드는 약 1℃ 내지 약 5℃, 약 5℃ 내지 약 15℃, 약 15℃ 내지 약 25℃, 약 25℃ 내지 약 37℃, 약 37℃ 내지 약 95℃의 범위, 약 55℃ 내지 약 85℃, 약 70℃ 내지 약 75℃, 또는 약 90℃ 내지 약 95℃, 또는 그 이상의 온도에 노출된 후에 자일라나제 활성을 가질 수 있다. 한 측면에서, 폴리펩티드는 pH 4.5에서 90℃초과 내지 약 95℃범위의 온도에 노출된 후, 자일라나제 활성을 보유한다.
본 발명은, 본 발명의 서열, 예컨대 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 2 1, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117, 서열 번호 119, 서열 번호 121, 서열 번호 123, 서열 번호 125, 서열 번호 127, 서열 번호 129, 서열 번호 131, 서열 번호 133, 서열 번호 13 5, 서열 번호 137, 서열 번호 139, 서열 번호 141, 서열 번호 143, 서열 번호 145, 서열 번호 147, 서열 번호 149, 서열 번호 151, 서열 번호 153, 서열 번호 155, 서열 번호 157, 서열 번호 159, 서열 번호 161, 서열 번호 163, 서열 번호 165, 서열 번호 167, 서열 번호 169, 서열 번호 171, 서열 번호 173, 서열 번호 175, 서열 번호 177, 서열 번호 179, 서열 번호 181, 서열 번호 183, 서열 번호 185, 서열 번호 187, 서열 번호 189, 서열 번호 191, 서열 번호 193, 서열 번호 195, 서열 번호 197, 서열 번호 199, 서열 번호 201, 서열 번호 203, 서열 번호 205, 서열 번호 207, 서열 번호 209, 서열 번호 211, 서열 번호 213, 서열 번호 215, 서열 번호 217, 서열 번호 219, 서열 번호 221, 서열 번호 223, 서열 번호 225, 서열 번호 227, 서열 번호 229, 서열 번호 231, 서열 번호 233, 서열 번호 235, 서열 번호 237, 서열 번호 239, 서열 번호 241, 서열 번호 243, 서열 번호 245, 서열 번호 247, 서열 번호 249, 서열 번호 251, 서열 번호 253, 서열 번호255, 서열 번호 257, 서열 번호 259, 서열 번호 261, 서열 번호 263, 서열 번호 265, 서열 번호 267, 서열 번호 269, 서열 번호 271, 서열 번호 273, 서열 번호 275, 서열 번호 277, 서열 번호 279, 서열 번호 281, 서열 번호 283, 서열 번호 285, 서열 번호 287, 서열 번호 289, 서열 번호 291, 서열 번호 293, 서열 번호 295, 서열 번호 297, 서열 번호 299, 서열 번호 301, 서열 번호 303, 서열 번호 305, 서열 번호 307, 서열 번호 309, 서열 번호 311, 서열 번호 313, 서열 번호 315, 서열 번호 317, 서열 번호 319, 서열 번호 321, 서열 번호 323, 서열 번호 325, 서열 번호 327, 서열 번호 329, 서열 번호 331, 서열 번호 333, 서열 번호 335, 서열 번호 337, 서열 번호 339, 서열 번호 341, 서열 번호 343, 서열 번호 345, 서열 번호 347, 서열 번호 349, 서열 번호 351, 서열 번호 353, 서열 번호 355, 서열 번호 357, 서열 번호 359, 서열 번호 361, 서열 번호 363, 서열 번호 365, 서열 번호 367, 서열 번호 369, 서열 번호 371, 서열 번호 373, 서열 번호 375, 서열 번호 377 또는 서열 번호 379에 표시되는 서열, 또는 그것의 절편 또는 서브서열을 포함하는 핵산에 대해 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 핵산을 제공한다. 한 측면에서, 핵산은 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화한다. 핵산은 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200개 또는 그 이상 잔기들의 길이, 또는 유전자 또는 전사체의 총길이를 가질 수 있다. 한 측면에서, 엄격한 조건은 약 15분간 약 65℃의 온도에서 0.2X SSC에서의 세척을 포함하는 세척 단계를포함한다.
본 발명은 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 동정하기 위한 핵산 프로브로서, 본 발명의 서열, 또는 그것의 절편 또는 서브서열의 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000개 또는 그 이상의 연속 염기를 포함하고, 결합 또는 하이브리드화에 의해 핵산을 동정하는 핵산 프로브를 제공한다. 프로브는 본 발명의 서열, 또는 그것의 절편 또는 서브서열을 포함하는 서열의 적어도 약 10 내지 50, 약 20 내지 60, 약 30 내지 70, 약 40 내지 80, 또는 약 60 내지 100의 연속 염기들을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명은, 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 동정하기 위한 핵산 프로브로서, 본 발명의 핵산에 대해, 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%,69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%,82%,83%, 84%, 85%, 86%,87%,88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,98%, 99%, 또는 그 이상, 또는 완전한(100%) 서열 상동성을 갖는, 적어도 약 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000개 또는 그 이상의 잔기를 갖는 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 프로브를 제공하며, 여기에서 서열 상동성은 서열 비교 알고리즘을 이용하는 분석 또는 시각적 조사에 의해 결정된다.
프로브는 본 발명의 핵산 서열 또는 그것의 서브서열의 적어도 약 10 내지 50, 약 20 내지 60, 약 30 내지 70, 약 40 내지 80, 또는 약 60 내지 100의 연속 염기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명은 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 증폭시키기 위한 증폭 프라이머 쌍으로서, 본 발명의 서열, 또는 그것의 절편을 포함하는 핵산을 증폭시킬 수 있는 증폭 프라이머 쌍을 제공한다. 증폭 프라이머 서열 쌍의 하나 또는 각 원은 서열의 적어도 약 10 내지 50개의 연속 염기, 또는 서열의 약 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 이상의 연속 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 핵산의 대략 처음의(즉, 5' 말단으로부터) 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 이상의 잔기에 의해 표시되는 서열을 갖는 제1 원, 및 그 제1 원의 상보 가닥의 대략 처음의(즉, 5' 말단으로부터) 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 이상의 잔기에 의해 나타나는 서열을 갖는 제2 원을 포함하는 프라이머 쌍을 제공한다.
본 발명은, 본 발명의 증폭 프라이머 쌍을 이용하는, 증폭, 예컨대 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에 의해 발생되는 자일라나제를 암호화하는 핵산을 제공한다. 본 발명은, 본 발명의 증폭 프라이머 쌍을 이용하는, 증폭, 예컨대 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에 의해 발생되는 자일라나제를 제공한다. 본 발명은, 본 발명의 증폭 프라이머 쌍을 이용하는, 증폭, 예컨대 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에 의한 자일라나제의 제조 방법을 제공한다. 한 측면에서, 증폭 프라이머 쌍은 라이브러리, 예컨대 환경적 라이브러리와 같은 유전자 라이브러리로부터 핵산을 증폭시킨다.
본 발명은, 본 발명의 핵산 서열, 또는 그것의 절편 또는 서브서열을 증폭시킬 수 있는 증폭 프라이머 서열 쌍을 이용하여, 주형 핵산을 증폭시키는 것을 포함하는, 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 증폭 방법을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 핵산 또는 그것의 서브서열을 포함하는 발현 카세트를 제공한다. 한 측면에서, 발현 카세트 는 프로모터에 작동적으로 연결되는 핵산을 포함할 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 포유동물 또는 식물의 프로모터일 수 있다. 한 측면에서, 식물 프로모터는 감자, 벼, 옥수수, 밀, 담배 또는 보리 프로모터일 수 있다. 프로모터는 구성 프로모터일 수 있다. 구성 프로모터는 CaMV35S를 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다. 한 측면에서, 프로모터는 조직-특이적 프로모터, 또는 환경적 제어 또는 발달적 제어 프로모터일 수 있다. 이에 따라, 프로모터는 예를 들어 씨-, 잎-, 뿌리-, 줄기-특이적 또는 이탈-유도적 프로모터일 수 있다. 한 측면에서, 발현 카세트는 식물 또는 식물 바이러스 발현 벡터를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 발현 카세트(예컨대, 벡터) 또는 본 발명의 핵산을 포함하는 클로닝 비히클을 제공한다. 클로닝 비히클은 바이러스 벡터, 플라스미드, 파지, 파지미드, 코스미드, 포스미드, 박테리오파지 또는 인공 염색체일 수 있다. 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 클로닝 비히클은 박테리아 인공 염색체(BAC), 플라스미드, 박테리오파지 P-1 유도 벡터(PAC), 효모 인공 염색체(YAC), 또는 포유동물 인공 염색체(MAC)를 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 발현 카세트(예컨대, 벡터) 또는 본 발명의 클로닝 비히클을 포함하는 형질전환된 세포를 제공한다. 한 측면에서, 형질전환된 세포는 박테리아 세포, 포유동물 세포, 진균류 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 식물 세포일 수 있다. 한 측면에서, 식물 세포는 곡류, 감자, 밀, 벼, 옥수수, 담배 또는 보리 세포일 수 있다.
본 발명은 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 발현 카세트(예컨대, 벡터)를 포함하는 유전자이식 비인간 동물을 제공한다. 한 측면에서, 동물은 마우스이다.
본 발명은 본 발명의 핵산 본 발명의 발현 카세트(예컨대, 벡터)를 포함하는 유전자이식 식물을 제공한다. 유전자이식 식물은 곡류 식물, 옥수수 식물, 감자 식물, 토마토 식물, 밀 식물, 유종자 식물, 평지씨 식물, 대두 식물, 벼 식물, 보리 식물 또는 담배 식물일 수 있다.
본 발명은 본 발명의 핵산 본 발명의 발현 카세트(예컨대, 벡터)를 포함하는 유전자이식 씨를 제공한다. 유전자이식 씨는 곡류 식물, 옥수수 씨, 밀 커넬(낟알), 유종자, 평지씨, 대두 씨, 팜 커넬, 해바라기 씨, 참깨 씨, 땅콩 또는 담배 식물 씨일 수 있다.
본 발명은 본 발명의 핵산에 대해 상보적이거나 그것에 대해 엄격한 조건 하에 하이브리드화할 수 있는 핵산 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를제공한다. 본 발명은 본 발명의 핵산에 대해 상보적이거나 그것에 대해 엄격한 조건 하에 하이브리드화할 수 있는 핵산 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 세포에 투여하거나 그것을 세포 내에서 발현시키는 것을 포함하는, 세포 내의 자일라나제 메시지의 번역을 억제하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 약 10 내지 50개, 약 20 내지 60개, 약 30 내지 70개, 약 40 내지 80개, 또는 약 60 내지 100개의 염기의 길이를 가질 수 있다.
본 발명은 본 발명의 핵산에 대해 상보적이거나 그것에 대해 엄격한 조건 하에 하이브리드화할 수 있는 핵산 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 세포에 투여하거나 그것을 세포 내에서 발현시키는 것을 포함하는, 세포 내의 자일라나제 메시지의 번역을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 서열의 서브서열을 포함하는 이중가닥의 억제 RNA(RNAi) 분자를 제공한다. 한 측면에서, RNAi은 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 또는 그 이상의 이중구조 뉴클레오티드의 길이를 가진다. 본 발명은 이중가닥의 억제 RNA(iRNA)를 세포에 투여하거나, 그것을 세포 내에서 발현시키는 것을 포함하는, 세포 내의 자일라나제의 발현을 억제하는 방법을 제공하며, 여기에서 RNA는 본 발명의 서열의 서브서열을 포함한다.
본 발명은 적어도 약 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350개 또는 그 이상의 잔기의 부위 상에서, 또는 폴리펩티드의 전체 길이 상에서, 본 발명의 예시적 폴리펩티드 또는 펩티드에 대해, 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%,66%, 67%, 68%,69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상, 또는 완전한(100%) 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공하며, 서열 상동성은 서열 비교 알고리즘을 이용하는 분석 또는 시각적 조사에 의해 결정된다. 본 발명의 예시적 폴리펩티드 또는 펩티드 서열에는, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 48, 서열 번호 50, 서열 번호 52, 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 58, 서열 번호 60, 서열 번호 62, 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108, 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116, 서열 번호 118, 서열 번호 120, 서열 번호 122, 서열 번호 124, 서열 번호 126, 서열 번호 128, 서열 번호 130, 서열 번호 132, 서열 번호 134, 서열 번호 136, 서열 번호 138, 서열 번호 140, 서열 번호 142, 서열 번호 144, 서열 번호 146, 서열 번호 148, 서열 번호 150, 서열 번호 152, 서열 번호 154, 서열 번호156, 서열 번호 158, 서열 번호 160, 서열 번호 162, 서열 번호 164, 서열 번호 166, 서열 번호 168, 서열 번호 170, 서열 번호 172, 서열 번호 174, 서열 번호 176, 서열 번호 178, 서열 번호 180, 서열 번호 182, 서열 번호 184, 서열 번호 186, 서열 번호 188, 서열 번호 190, 서열 번호 192, 서열 번호 194, 서열 번호 196, 서열 번호 198, 서열 번호 200, 서열 번호 202, 서열 번호 204, 서열 번호 206, 서열 번호 208, 서열 번호 210, 서열 번호 212, 서열 번호 214, 서열 번호 216, 서열 번호 218, 서열 번호 220, 서열 번호 222, 서열 번호 224, 서열 번호 226, 서열 번호 228, 서열 번호 230, 서열 번호 232, 서열 번호 234, 서열 번호 236, 서열 번호 238, 서열 번호 240, 서열 번호 242, 서열 번호 244, 서열 번호 246, 서열 번호 248, 서열 번호 250, 서열 번호 252, 서열 번호 254, 서열 번호 256, 서열 번호 258, 서열 번호 260, 서열 번호 262, 서열 번호 264, 서열 번호 266, 서열 번호 268, 서열 번호 270, 서열 번호 272, 서열 번호 274, 서열 번호 276, 서열 번호 278, 서열 번호 280, 서열 번호 282, 서열 번호 284, 서열 번호 286, 서열 번호 288, 서열 번호 290, 서열 번호 292, 서열 번호 294, 서열 번호 296, 서열 번호 298, 서열 번호 300, 서열 번호 302, 서열 번호 304, 서열 번호 306, 서열 번호 308, 서열 번호 310, 서열 번호 312, 서열 번호 314, 서열 번호 316, 서열 번호 318, 서열 번호 320, 서열 번호 322, 서열 번호 324, 서열 번호 326, 서열 번호 328, 서열 번호 330, 서열 번호 332, 서열 번호 334, 서열 번호 336, 서열 번호 338, 서열 번호 340, 서열 번호 342, 서열 번호 344, 서열 번호 346, 서열 번호 348, 서열 번호 350, 서열 번호 352, 서열 번호 354, 서열 번호356, 서열 번호 358, 서열 번호 360, 서열 번호 362, 서열 번호 364, 서열 번호 366, 서열 번호 368, 서열 번호 370, 서열 번호 372, 서열 번호 374, 서열 번호 376, 서열 번호 378 또는 서열 번호 380, 및 그것의 서브서열 및 그것의 변이체가 포함된다. 예시적 폴리펩티드에는 또한 적어도 약 10,15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600개 또는 그 이상의 잔기들의 길이, 또는 효소의 총길이를 갖는 절편이 포함된다. 본 발명의 예시적 폴리펩티드 또는 펩티드 서열에는 본 발명의 핵산에 의해 암호화된 서열이 포함된다. 본 발명의 예시적 폴리펩티드 또는 펩티드 서열에는 본 발명의 항체에 의해 특이적으로 결합된 폴리펩티드 또는 펩티드가 포함된다. 한 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 하나 이상의 자일라나제 활성을 가진다.
본 발명의 또 다른 측면은, 본 발명의 폴리펩티드 또는 펩티드 서열, 그것과 실질적으로 동일한 서열, 및 그것과 상보적인 서열의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100개, 또는 그 이상의 연속 염기를 포함하는 분리 또는 재조합 폴리펩티드 또는 펩티드를 제공한다. 펩티드는 예컨대 면역원성 절편, 모티브(예컨대, 결합 부위), 시그널 서열, 프리프로 서열 또는 활성 부위일 수 있다.
본 발명은 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 서열, 및 시그널 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 핵산으로서, 본 발명의 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 시그널 서열은 또 다른 자일라나제 또는 비-자일라나제(이종) 효소로부터 유도될 수 있다. 본 발명은 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 핵산으로서, 서열이 시그널 서열을 함유하지 않고 핵산이 본 발명의 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 핵산을 제공한다.
한 측면에서, 자일라나제 활성은 내부 β-1,4-자일로시드계 연결기의 가수분해에서 촉매 작용하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 자일라나제 활성은 엔도-1,4-베타-자일라나제 활성을 포함한다. 한 측면에서, 자일라나제 활성은 자일란을 가수분해하여, 보다 작은 분자량의 자일로스 및 자일로-올리고머를 생성시키는 것을 포함한다. 한 측면에서, 자일란은 수용성 아라비노자일란과 같은 아라비노자일란을 포함한다. 수용성 아라비노자일란은 반죽 또는 빵류 제품을 포함할 수 있다.
한 측면에서, 자일라나제 활성은 1,4-β-글리코시드가 연결된 D-자일로피라노즈를 포함하는 다당류의 가수분해를 포함한다. 한 측면에서, 자일라나제 활성은 헤미셀룰로스의 가수분해를 포함한다. 한 측면에서, 자일라나제 활성은 목재 또는 종이 펄프 또는 종이 제품 내의 헤미셀룰로스의 가수분해를 포함한다.
한 측면에서, 자일라나제 활성은 사료 또는 식품 내의 자일란의 가수분해에 촉매작용하는 것을 포함한다. 사료 또는 식품은 곡류 기재의 동물 사료, 맥아즙 또는 맥주, 우유 또는 유제품, 과일 또는 야채를 포함할 수 있다.
한 측면에서, 자일라나제 활성은 세포, 예컨대 식물 세포 또는 미생물 세포에 내의 자일란의 가수분해에 촉매작용하는 것을 포함한다.
한 측면에서, 자일라나제 활성은 열 안정성을 가진다. 폴리펩티드는 약 1℃ 내지 약 5℃, 약 5℃ 내지 약 15℃, 약 15℃ 내지 약 25℃, 약 25℃ 내지 약 37℃, 약 37℃ 내지 약 95℃, 약 55℃ 내지 약 85℃, 약 70℃ 내지 약 75℃, 또는 약 90℃ 내지 약 95℃, 또는 그 이상의 온도 범위를 포함하는 조건 하에서 자일라나제 활성을 보유할 수 있다. 또 다른 한 측면에서, 자일라나제 활성 내열성을 가질 수 있다. 폴리펩티드는 37℃초과 내지 약 95℃, 또는 55℃초과 내지 약 85℃범위의 온도에 노출된 후에 자일라나제 활성을 보유할 수 있다. 한 측면에서, 폴리펩티드는 pH 4.5에서 90℃초과 내지 약 95℃범위의 온도에 노출된 후에 자일라나제 활성을 보유할 수 있다.
한 측면에서, 분리 또는 재조합 폴리펩티드는 시그널 서열이 결여된 본 발명의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 한 측면에서, 분리 또는 재조합 폴리펩티드는 이종 자일라나제 또는 비-자일라나제 시그널 서열과 같은 이종 시그널 서열을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 시그널 서열을 포함하는 제1 도메인 및 적어도 제2 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 제공한다. 그 단백질은 융합 단백질일 수 있다. 제2 도메인은 효소를 포함할 수 있다. 효소는 자일라나제일 수 있다.
본 발명은 본 발명의 신호 펩티드(SP), 프리프로 서열 및/또는 촉매적 도메인(CD)을 포함하는 제1 도메인, 및 이종 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함하는 적어도 제2 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩티드로서, 상기 이종 폴리펩티드 또는 펩티드가 신호 펩티드(SP), 프리프로 서열 및/또는 촉매적 도메인(CD) 과 본래 연합되지 않는 키메라 폴리펩티드를 제공한다. 한 측면에서, 이종 폴리펩티드 또는 펩티드는 자일라나제가 아니다. 이종 폴리펩티드 또는 펩티드는 신호 펩티드(SP), 프리프로 서열 및/또는 촉매적 도메인(CD)의 양 말단에 있거나, 그에 대해 아미노 말단 또는 카르복시 말단일 수 있다.
본 발명은 키메라 폴리펩티드를 암호화하는 분리 또는 재조합 핵산으로서, 키메라 폴리펩티드가 본 발명의 신호 펩티드(SP), 프리프로 서열 및/또는 촉매적 도메인(CD)을 포함하는 제1 도메인, 및 이종 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함하는 적어도 제2 도메인을 포함하고, 이종 폴리펩티드 또는 펩티드가 신호 펩티드(SP), 프리프로 서열 및/또는 촉매적 도메인(CD) 과 본래 연합되지 않는 분리 또는 재조합 핵산을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 잔기 1 내지 14, 1 내지 15, 1 내지 16, 1 내지 17, 1 내지 18, 1 내지 19, 1 내지 20, 1 내지 21, 1 내지 22, 1 내지 23, 1 내지 24, 1 내지 25, 1 내지 26, 1 내지 27, 1 내지 28, 1 내지 28, 1 내지 30, 1 내지 31, 1 내지 32, 1 내지 33, 1 내지 34, 1 내지 35, 1 내지 36, 1 내지 37, 1 내지 38, 1 내지 40, 1 내지 41, 1 내지 42, 1 내지 43 또는 1 내지 44에 표시되는 서열, 예컨대, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 48, 서열 번호 50, 서열 번호 52, 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 58, 서열 번호 60, 서열 번호 62, 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108, 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116, 서열 번호 118, 서열 번호 120, 서열 번호 122, 서열 번호 124, 서열 번호 126, 서열 번호 128, 서열 번호 130, 서열 번호 132, 서열 번호 134, 서열 번호 136, 서열 번호 138, 서열 번호 140, 서열 번호 142, 서열 번호 144, 서열 번호 146, 서열 번호 148, 서열 번호 150, 서열 번호 152, 서열 번호 154, 서열 번호 156, 서열 번호 158, 서열 번호 160, 서열 번호 162, 서열 번호 164, 서열 번호 166, 서열 번호 168, 서열 번호 170, 서열 번호 172, 서열 번호 174, 서열 번호 176, 서열 번호 178, 서열 번호 180, 서열 번호 182, 서열 번호 184, 서열 번호 186, 서열 번호 188, 서열 번호 190, 서열 번호 192, 서열 번호 194, 서열 번호 196, 서열 번호 198, 서열 번호 200, 서열 번호 202, 서열 번호 204, 서열 번호 206, 서열 번호 208, 서열 번호 210, 서열 번호 212, 서열 번호 214, 서열 번호 216, 서열 번호 218, 서열 번호 220, 서열 번호 222, 서열 번호 224, 서열 번호 226, 서열 번호 228, 서열 번호 230, 서열 번호 232, 서열 번호 234, 서열 번호 236, 서열 번호 238, 서열 번호 240, 서열 번호 242, 서열 번호 244, 서열 번호 246, 서열 번호 248, 서열 번호 250, 서열 번호 252, 서열 번호 254, 서열 번호 256, 서열 번호 258, 서열 번호 260, 서열 번호 262, 서열 번호 264, 서열 번호 266, 서열 번호 268, 서열 번호 270, 서열 번호 272, 서열 번호 274, 서열 번호 276, 서열 번호278, 서열 번호 280, 서열 번호 282, 서열 번호 284, 서열 번호 286, 서열 번호 288, 서열 번호 290, 서열 번호 292, 서열 번호 294, 서열 번호 296, 서열 번호 298, 서열 번호 300, 서열 번호 302, 서열 번호 304, 서열 번호 306, 서열 번호 308, 서열 번호 310, 서열 번호 312, 서열 번호 314, 서열 번호 316, 서열 번호 318, 서열 번호 320, 서열 번호 322, 서열 번호 324, 서열 번호 326, 서열 번호 328, 서열 번호 330, 서열 번호 332, 서열 번호 334, 서열 번호 336, 서열 번호 338, 서열 번호 340, 서열 번호 342, 서열 번호 344, 서열 번호 346, 서열 번호 348, 서열 번호 350, 서열 번호 352, 서열 번호 354, 서열 번호 356, 서열 번호 358, 서열 번호 360, 서열 번호 362, 서열 번호 364, 서열 번호 366, 서열 번호 368, 서열 번호 370, 서열 번호 372, 서열 번호 374, 서열 번호 376, 서열 번호 378 또는 서열 번호 380으로 구성된 분리 또는 재조합 시그널 서열(예컨대, 신호 펩티드)을 제공한다.
한 측면에서, 자일라나제 활성은 약 37℃에서 약 1 내지 약 1200 단위/단백질 mg 범위, 또는 약 100 내지 약 1000 단위/단백질 mg 범위의 특이적 활성을 포함한다. 또 다른 한 측면에서, 자일라나제 활성은 약 100 내지 약 1000 단위/단백질 mg 범위, 또는 약 500 내지 약 750 단위/단백질 mg 범위의 특이적 활성을 포함한다. 대안적으로, 자일라나제 활성은 37℃에서 약 1 내지 약 750 단위/단백질 mg 범위, 또는 약 500 내지 약 1200 단위/단백질 mg 범위의 특이적 활성을 포함한다. 한 측면에서, 자일라나제 활성은 37℃에서 약 1 내지 약 500 단위/단백질 mg 범위, 또는 약 750 내지 약 1000 단위/단백질 mg 범위의 특이적 활성을 포함한다. 또 다른한 측면에서, 자일라나제 활성은 37℃에서 약 1 내지 약 250 단위/단백질 mg 범위의 특이적 활성을 포함한다. 대안적으로, 자일라나제 활성은 약 37℃에서 약 1 내지 약 100 단위/단백질 mg 범위의 특이적 활성을 포함한다. 또 다른 한 측면에서, 내열성은 승온으로 가열된 후에, 37℃에서 자일라나제의 특이적 활성의 반 이상을 보유하는 것을 포함한다. 대안적으로, 내열성은 승온으로 가열된 후에, 37℃에서 약 1 내지 약 1200 단위/단백질 mg 범위, 또는 약 500 내지 약 1000 단위/단백질 mg 범위의 특이적 활성을 보유하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 한 측면에서, 내열성은 승온으로 가열된 후에, 37℃에서 약 1 내지 약 500 단위/단백질 mg 범위의 특이적 활성을 보유하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함하는 본 발명의 분리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 한 측면에서, 글리코실화는 N-연결의 글리코실화일 수 있다. 한 측면에서, 폴리펩티드는P. 파스토리스(pastoris)또는S. 폼베(pombe)에서 발현된 후에 글리코실화될 수 있다.
한 측면에서, 폴리펩티드는 약 pH 6.5, pH 6, pH 5.5, pH 5, pH 4.5 또는 pH 4를 포함하는 조건 하에서 자일라나제 활성을 보유할 수 있다. 또 다른 한 측면에서, 폴리펩티드는 약 pH 7, pH 7.5, pH 8.0, pH 8.5, pH 9, pH 9.5, pH 10, pH 10.5 또는 pH 11을 포함하는 조건 하에서, 자일라나제 활성을 보유할 수 있다. 한 측면에서, 폴리펩티드는 약 pH 6.5, pH 6, pH 5.5, pH 5, pH 4.5 또는 pH 4를 포함하는 조건에 노출된 후에, 자일라나제 활성을 보유할 수 있다. 또 다른 한 측면에서, 폴리펩티드는 약 pH 7, pH 7.5, pH 8.0, pH 8.5, pH 9, pH 9.5, pH 10, pH10.5 또는 pH 11을 포함하는 조건에 노출된 후에, 자일라나제 활성을 보유할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 단백질 제제로서, 액체, 고체 또는 겔을 포함하는 단백질 제제를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 및 제2 단백질 또는 도메인을 포함하는 이종이량체를 제공한다. 이종이량체의 제2 원은 상이한 인지질분해효소, 상이한 효소 또는 또 다른 단백질일 수 있다. 한 측면에서, 제2 도메인은 폴리펩티드일 수 있고, 이종이량체는 융합 단백질일 수 있다. 한 측면에서, 제2 도메인은 동위원소 또는 표지일 수 있다. 한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 동종이량체를 제공한다.
본 발명은 자일라나제 활성을 갖는 고정화 폴리펩티드로서, 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드, 및 제 도메인을 포함하는 고정화 폴리펩티드를 제공한다. 한 측면에서, 폴리펩티드는 세포, 금속, 수지, 중합체, 세라믹, 유리, 미세전극, 흑연 전극, 비이드, 겔, 플레이트, 어레이 또는 모세관 상에 고정화될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 고정화 핵산을 포함하는 어레이를 제공한다. 본 발명은 본 발명의 항체를 포함하는 어레이를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 분리 또는 재조합 항체를 제공한다. 항체는 단일클론 또는 다중클론 항체일 수 있다. 본 발명은 본 발명의 항체, 예컨대 본 발명의폴리펩티드 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 하이브리도마를 제공한다.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드의 분리 또는 동정 방법을 제공한다:
(a) 본 발명의 항체를 제공하는 단계;
(b) 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 제공하는 단계; 및
(c) 항체가 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 조건 하에, 단계(b)의 샘플과 단계(a)의 항체를 접촉시킴으로써, 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 분리 또는 동정하는 단계.
본 발명은 체액성 면역 반응을 일으키기에 충분한 양의 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 폴리펩티드 또는 그것의 서브서열을 비인간 동물에게 투여함으로써, 안티-자일라나제 항체를 제조하는 것을 포함하는, 안티-자일라나제 항체의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 면역 반응을 일으키기에 충분한 양의 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 폴리펩티드 또는 그것의 서브서열을 비인간 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 안티-자일라나제 면역의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 재조합 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다:
(a) 프로모터에 작동적으로 연결된 본 발명의 핵산을 제공하는 단계; 및
(b) 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에서 단계(a)의 핵산을 발현시킴으로써, 재조합 폴리펩티드를 제조하는 단계. 한 측면에서, 본 방법은 숙주 세포를단계(a)의 핵산으로 형질변환시킨 후, 단계(a)의 핵산을 발현시킴으로써, 형질전환된 세포 내의 재조합 폴리펩티드를 제조함을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드의 동정 방법을 제공한다:
(a) 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 제공하는 단계;
(b) 자일라나제 기질을 제공하는 단계; 및
(c) 단계(a)의 폴리펩티드 또는 그것의 변이체를 단계(b)의 기질과 접촉시키고, 기질의 양의 감소 또는 반응 생성물의 양의 증가를 탐지하는 단계(여기에서, 기질의 양의 감소 또는 반응 생성물의 양의 증가는 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 탐지함).
본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 자일라나제 기질의 동정 방법을 제공한다:
(a) 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 제공하는 단계;
(b) 테스트 기질을 제공하는 단계; 및
(c) 단계(a)의 폴리펩티드와 단계(b)의 테스트 기질을 접촉시키고, 기질의 양의 감소 또는 반응 생성물의 양의 증가를 탐지하는 단계(여기에서, 기질의 양의 감소 또는 반응 생성물의 양의 증가 자일라나제 활성을 갖는 자일라나제 기질로서의 테스트 기질을 탐지함).
본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 시험 화합물이 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는지의 여부를 결정하는 방법을 제공한다:
(a) 핵산이 폴리펩티드로 번역되는 것을 허용하는 조건 하에, 핵산, 또는 핵산을 포함하는 벡터를 발현시킴(여기에서, 핵산은 본 발명의 핵산을 포함함), 또는 본 발명의 폴리펩티드를 제공하는 단계;
(b) 시험 화합물을 제공하는 단계;
(c) 폴리펩티드와 시험 화합물을 접촉시키는 단계; 및
(d) 단계(b)의 시험 화합물이 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는지의 여부를 결정하는 단계.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 자일라나제 활성의 조절자의 동정 방법을 제공한다:
(a) 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 제공하는 단계;
(b) 시험 화합물을 제공하는 단계;
(c) 단계(a)의 폴리펩티드와 단계(b)의 시험 화합물을 접촉시키고, 자일라나제의 활성을 측정하는 단계(여기에서, 시험 화합물의 부재 하에서와 대비하여, 시험 화합물의 존재 하에 측정된 자일라나제 활성의 변화는 시험 화합물이 자일라나제 활성을 조절한다는 결정을 제공함). 한 측면에서, 자일라나제 활성은 자일라나제 기질을 제공하고, 기질 양의 감소 또는 반응 생성물의 양의 증가, 또는 기질의 양의 증가 또는 반응 생성물의 양의 감소를 탐지함으로써 측정될 수 있다. 시험 화합물의 부재 하에서의 기질 또는 반응 생성물의 양과 대비하여, 시험 화합물의 존재 하에서의 기질 양의 감소 또는 반응 생성물의 양의 증가는 자일라나제 활성의 활성화제로서 시험 화합물을 동정한다. 시험 화합물의 부재 하에서의 기질 또는 반응 생성물의 양과 대비하여, 시험 화합물의 존재 하에서의 기질의 양의 증가 또는 반응 생성물의 양의 감소는 자일라나제 활성의 억제제로서 시험 화합물을 동정한다.
본 발명은 프로세서 및 데이터 저장 장치를 포함하는 컴퓨터 시스템으로서, 상기 데이터 저장 장치가 본 발명의 폴리펩티드 서열 또는 핵산 서열(예컨대, 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드)을 저장하고 있는 컴퓨터 시스템을 제공한다. 한 측면에서, 컴퓨터 시스템은 서열 비교 알고리즘, 및 하나 이상의 참조 서열을 저장하고 있는 데이터 저장 장치를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 한 측면에서, 서열 비교 알고리즘은 다형성을 지적하는 컴퓨터 시스템을 포함한다. 한 측면에서, 컴퓨터 시스템은 상기 서열 내의 하나 이상의 특징(feature)을 확인하는 확인자를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 서열 또는 핵산 서열을 저장하고 있는 컴퓨터 판독가능 매체를 제공한다. 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 서열 내의 특징을 동정하는 방법을 제공한다:
(a) 서열 내의 하나 이상의 특징을 동정하는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열을 판독하는 단계(여기에서, 서열은 본 발명의 폴리펩티드 서열 또는 핵산 서열을 포함함); 및
(b) 서열 내의 하나 이상의 특징을 컴퓨터 프로그램으로 확인하는 단계.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 제1 서열 및 제2 서열을 비교하는 방법을 제공한다:
(a) 서열을 비교하는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 제1 서열 및 제2 서열을 판독하는 단계(여기에서, 제1 서열은 본 발명의 폴리펩티드 서열 또는 핵산 서열을 포함함); 및
(b) 컴퓨터 프로그램을 이용하여 제1 서열 및 제2 서열 간의 차이를 결정하는 단계. 제1 서열 및 제2 서열 간의 차이를 결정하는 단계는 다형태를 동정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 한 측면에서, 본 방법은 서열 내의 하나 이상의 특징을 동정하는 확인자를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 한 측면에서, 본 방법은 컴퓨터 프로그램을 이용하여 제1 서열을 읽고, 서열 내의 하나 이상의 특징을 동정하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 환경적 샘플로부터 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 분리 또는 회수하기 위한 방법을 제공한다:
(a) 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 증폭시키기 위한 증폭 프라이머 서열 쌍을 제공하는 단계(여기에서, 프라이머 쌍은 본 발명의 핵산을 증폭시킬 수 있음);
(b) 환경적 샘플로부터 핵산을 분리하거나, 환경적 샘플을 샘플 내의 핵산이 증폭 프라이머 쌍에 대해 하이브리드화되기 용이하도록 처리하는 단계; 및
(c) 단계(b)의 핵산을 단계(a)의 증폭 프라이머 쌍과 조합하고, 환경적 샘플로부터 핵산을 증폭시킴으로써, 환경적 샘플로부터 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 분리 또는 회수하는 단계. 증폭 프라이머 서열 쌍의 하나 또는 각 원은 본 발명의 서열의 적어도 약 10 내지 50개의 연속 염기들을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 한 측면에서, 증폭 프라이머 서열 쌍은 본 발명의 증폭 쌍이다.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 환경적 샘플로부터 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 분리 또는 회수하기 위한 방법을 제공한다:
(a) 본 발명의 핵산 또는 그것의 서브서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 제공하는 단계;
(b) 환경적 샘플로부터 핵산을 분리하거나, 환경적 샘플을 샘플 내의 핵산이 단계(a)의 폴리뉴클레오티드 프로브에 대해 하이브리드화되기 용이하도록 처리하는 단계;
(c) 단계(b)의 분리된 핵산 또는 처리된 환경적 샘플을 단계(a)의 폴리뉴클레오티드 프로브와 조합하는 단계; 및
(d) 단계(a)의 폴리뉴클레오티드 프로브와 특이적으로 하이브리드화하는 핵산을 분리함으로써, 환경적 샘플로부터 핵산을 증폭시킴으로써, 환경적 샘플로부터 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 분리 또는 회수하는 단계. 환경적 샘플에는 물 샘플, 액체 샘플, 토양 샘플, 공기 샘플 또는 생물학적 샘플이 포함될 수 있다. 한 측면에서, 생물학적 샘플은 박테리아 세포, 원생동물문 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 식물 세포, 진균류 세포 또는 포유동물 세포로부터 유도될 수 있다.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 변이체를 발생시키는 방법을 제공한다:
(a) 본 발명의 핵산을 포함하는 주형 핵산을 제공하는 단계; 및
(b) 주형 서열 또는 그것의 조합물에서의 하나 이상의 뉴클레오티드를 변형, 결실 또는 부가하여, 주형 핵산의 변이체를 발생시키는 단계. 한 측면에서, 본 방법은 변이체 핵산을 발현시켜, 변이체 자일라나제 폴리펩티드를 발생시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 변형, 부가 또는 결실은 에러프론(error-prone) PCR, 셔플링, 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이, 어셈블리 PCR, 성별 PCR 돌연변이, 생체내 돌연변이, 카세트 돌연변이, 순환 앙상블(recursive ensemble) 돌연변이, 지수 앙상블(exponential ensemble) 돌연변이, 부위 특이적 돌연변이, 유전자 리어셈블리(예컨대, GeneReassemblyTM, 예컨대 U.S. 특허 No. 6,537,776 참고), 유전자 부위 포화 돌연변이(GSSMTM), 합성 접합 리어셈블리(SLR) 또는 그것의 조합물을 포함하는 방법에 의해 도입될 수 있다. 또 다른 한 측면에서, 변형, 부가 또는 결실은 재조합, 순환 서열 재조합, 포스포티오에이트-변형 DNA 돌연변이, 우라실 함유의 주형 돌연변이, 갭핑 이중(gapped duplex) 돌연변이, 점 부정합 쌍 수복 돌연변이, 수복-결핍 숙주 균주 돌연변이, 화학적 돌연변이, 방사능에 의한 돌연변이, 결실 돌연변이, 제한-선택 돌연변이, 제한-정제 돌연변이, 인공 유전자 합성, 앙상블 돌연변이, 키메라 핵산 다량체 생성 및 그것의 조합을 포함하는 방법에 의해 도입된다.
한 측면에서, 본 발명은 주형 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드에서 변형되거나 그와 상이한 활성, 또는 그 폴리펩티드에서 변형되거나 그와 상이한 안정성을 갖는 자일라나제가 제조될 때까지, 되풀이하여 반복될 수 있다. 한 측면에서, 변이체 자일라나제 폴리펩티드는 내열성을 가지고, 승온에 노출된 후에 약간의 활성을 보유한다. 또 다른 한 측면에서, 변이체 자일라나제 폴리펩티드는 주형 핵산에 의해 암호화된 자일라나제에 비해, 증가된 글리코실화를 가진다. 대안적으로, 변이체 자일라나제 폴리펩티드는 높은 온도에서 자일라나제 활성을 가지며, 여기에서 주형 핵산에 의해 암호화된 자일라나제는 높은 온도에서 활성을 가지지 않는다. 한 측면에서, 본 방법은 주형 핵산의 코돈 이용에서 변형된 코돈 이용을 갖는 자일라나제 암호화 서열이 제조될 때까지 되풀이하여 반복될 수 있다. 또 다른 한 측면에서, 본 방법은 주형 핵산의 경우보다 메시지 발현 또는 안정성의 수준이 더 높거나 더 낮은 자일라나제 유전자가 제조될 때까지 되풀이하여 반복될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 하기 돌연변이들 중 하나 이상을 갖는 서열 번호 189에서 표시되는 서열을 포함하는 분리 또는 재조합 핵산을 제공한다: 위치 22 내지 24의 뉴클레오티드가 TTC이거나, 위치 31 내지 33의 뉴클레오티드가 CAC이거나, 위치 34 내지 36의 뉴클레오티드가 TTG이거나, 위치 49 내지 51의 뉴클레오티드가 ATA이거나, 위치 31 내지 33의 뉴클레오티드가 CAT이거나, 위치 67 내지 69의 뉴클레오티드가 ACG이고, 위치178 내지 180의 뉴클레오티드가 CAC이거나, 위치 190 내지 192의 뉴클레오티드가 TGT이거나, 위치 190 내지 192의 뉴클레오티드가 GTA이거나, 위치 190 내지 192의 뉴클레오티드가 GTT이거나, 위치 193 내지 195의 뉴클레오티드가 GTG이거나, 위치 202 내지 204의 뉴클레오티드가 GCT이거나, 위치 235 내지 237의 뉴클레오티드가 CCA이거나 위치 235 내지 237의 뉴클레오티드가 CCC 임. 한 측면에서, 본 발명은 상기 서열을 포함하는 핵산의 제조 방법으로서, 서열 번호 189에서의 돌연변이가 유전자 부위 포화 돌연변이(GSSMTM)에 의해 수득되는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 하기 돌연변이들 중 하나 이상을 갖는 서열 번호 190 을 포함하는 분리 또는 재조합 핵산을 제공한다:
아미노산 위치 8의 아스파르트산이 페닐알라닌이거나, 아미노산 위치 11의 글루타민이 히스티딘이거나, 아미노산 위치 12의 아스파라긴이 류신이거나, 아미노산 위치 17의 글리신이 이소류신이거나, 아미노산 위치 23의 트레오닌이 야생형 코돈 이외의 코돈에 의해 암호화된 트레오닌이거나, 아미노산 위치 60의 글리신이 히스티딘이거나, 아미노산 위치 64의 프롤린이 시스테인이거나, 아미노산 위치 64의 프롤린이 발린이거나, 아미노산 위치 65의 세린이 발린이거나, 아미노산 위치 68의 글리신이 이소류신이거나, 아미노산 위치 68의 글리신이 알라닌이거나 아미노산 위치 79의 발린이 프롤린임.
본 발명은 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 내의 코돈을 숙주 세포 내에서의 발현이 증가되도록 변형시키는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공한다:
(a) 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 본 발명의 핵산을 제공하는 단계; 및
(b) 단계(a)의 핵산 내의 바람직하지 않거나 덜 바람직한 코돈을 동정하여, 그것을 바람직하거나 중간적으로 사용되는 코돈으로 대체하는 단계(여기에서, 바람직한 코돈은 숙주 세포 내의 유전자 내 서열을 암호화할 때 과다 표출되는 코돈이고, 바람직하지 않거나 덜 바람직한 코돈은 숙주 세포 내의 유전자의 서열을 암호화함에 있어 과소 표출되는 코돈임)으로써, 핵산을 숙주 세포 내에서의 발현이 증가되도록 변형시킴.
본 발명은 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 내의 코돈을 변형시키는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공한다:
(a) 본 발명의 핵산을 제공하는 단계; 및
(b) 단계(a)의 핵산 내의 코돈을 동정하여, 그것을 대체 코돈과 동일한 아미노산을 암호화하는 상이한 코돈으로 대체함으로써, 자일라나제를 암호화하는 핵산 내의 코돈을 변형시키는 단계.
본 발명은 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 내의 코돈을 숙주 세포 내에서의 발현이 증가되도록 변형시키는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공한다:
(a) 자일라나제 폴리펩티드를 암호화하는 본 발명의 핵산을 제공하는 단계; 및
(b) 단계(a)의 핵산 내의 바람직하지 않거나 덜 바람직한 코돈을 동정하여, 그것을 바람직하거나 중간적으로 사용되는 코돈으로 대체하는 단계(여기에서, 바람직한 코돈은 숙주 세포 내의 유전자 내 서열을 암호화할 때 과다 표출되는 코돈이고, 바람직하지 않거나 덜 바람직한 코돈은 숙주 세포 내의 유전자의 서열을 암호화함에 있어 과소 표출되는 코돈임)로서, 핵산을 숙주 세포 내에서의 발현이 증가되도록 변형시키는 것인 단계.
본 발명은 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 내의 코돈을 숙주 세포 내에서의 발현이 감소되도록 변형시키는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공한다:
(a) 본 발명의 핵산을 제공하는 단계; 및
(b) 단계(a)의 핵산 내의 하나 이상의 바람직한 코돈을 동정하여, 그것을 대체 코돈과 동일한 아미노산을 암호화하는 바람직하지 않거나 덜 바람직한 코돈으로 대체함으로써(여기에서, 바람직한 코돈은 숙주 세포 내의 유전자 내 서열을 암호화할 때 과다 표출되는 코돈이고, 바람직하지 않거나 덜 바람직한 코돈은 숙주 세포 내의 유전자의 서열을 암호화함에 있어 과소 표출되는 코돈임), 핵산을 숙주 세포 내에서의 발현이 감소되도록 변형시키는 단계. 한 측면에서, 숙주 세포는 박테리아 세포, 진균류 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포일 수 있다.
본 발명은 제1 활성 부위 또는 제1 기질 결합 부위를 암호화하는 서열을 포함하는 제1 핵산으로부터 유도되는 복수의 변형된 자일라나제 활성 부위 또는 기질 결합 부위를 암호화하는 핵산의 라이브러리의 제조 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공한다:
(a) 제1 활성 부위 또는 제1 기질 결합 부위를 암호화하는 제1 핵산을 제공하는 단계(여기에서, 제1 핵산 서열은 본 발명의 핵산에 대해 엄격한 조건 하에 하이브리드화하는 서열을 포함하고, 핵산은 자일라나제 활성 부위 또는 자일라나제 기질 결합 부위를 암호화함);
(b) 제1 핵산 내의 복수의 표적 코돈에서 자연 발생적 아미노산 변이체를 암호화하는 한 세트의 돌연변이성 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계; 및
(c) 돌연변이성 올리고뉴클레오티드 세트를 이용하여, 돌연변이화된 각 아미노산 코돈에서 일정 범위의 아미노산 변형을 암호화하는 한 세트의 활성 부위-암호화 또는 기질 결합 부위-암호화의 변이체 핵산을 생성시킴으로써, 복수의 변형된 자일라나제 활성 부위 또는 기질 결합 부위를 암호화하는 핵산의 라이브러리를 생성하는 단계. 한 측면에서, 본 방법은 최적화 지정 전개 시스템, 유전자 부위-포화 돌연변이(GSSMTM), 합성 접합 리어셈블리(SLR), 에러 프론 PCR, 셔플링, 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이, 어셈블리 PCR, 성적 PCR 돌연변이, 생체내 돌연변이, 카세트 돌연변이, 순환 앙상블 돌연변이, 지수 앙상블 돌연변이, 부위-특이적 돌연변이, 유전자 리어셈블리(GeneReassemblyTM, U.S. 특허 No. 6,537,776), 유전자 부위 포화 돌연변이(GSSMTM), 합성 접합 리어셈블리(SLR) 및 그것의 조합 방법을 포함하는 방법에 의해, 단계(a)의 제1 핵산을 돌연변이화하는 것을 포함한다. 또 다른 한 측면에서, 재조합, 순환 서열 재조합, 포스포티오에이트-변형 DNA 돌연변이, 우라실 함유 주형 돌연변이, 갭핑 이중 돌연변이, 점 부정합 쌍 수복 돌연변이, 수복-결핍 숙주 균주 돌연변이, 화학적 돌연변이, 방사능에 의한 돌연변이, 결실 돌연변이, 제한-선택 돌연변이, 제한-정제 돌연변이, 인공 유전자 합성, 앙상블 돌연변이, 키메라 핵산 다량체 생성 및 그것의 조합 방법을 포함하는 방법에 의해 단계(a)의 제1 핵산 또는 변이체를 돌연변이화하는 것을 포함한다.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는 작은 분자들의 제조 방법을 제공한다:
(a) 작은 분자를 합성 또는 변형시킬 수 있는 복수의 생합성 효소를 제공하는 단계(여기에서, 효소들 중 하나는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 자일라나제 효소를 포함함);
(b) 단계(a)의 효소들 중 하나 이상을 위한 기질을 제공하는 단계; 및
(c) 복수의 생촉매적 반응을 촉진하는 조건 하에서 단계(b)의 기질을 효소와 반응시켜, 일련의 생촉매적 반응에 의해 작은 분자를 생성시키는 단계.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는 작은 분자의 변형 방법을 제공한다:
(a) 자일라나제 효소를 제공하는 단계(여기에서, 효소는 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드, 또는 그것의 서브서열을 포함함);
(b) 작은 분자를 제공하는 단계; 및
(c) 자일라나제 효소가 촉매 작용하는 효소 반응을 촉진하는 조건 하에서 단계(a)의 효소를 단계(b)의 작은 분자와 반응시킴으로써, 자일라나제 효소 반응에 의해 작은 분자를 변형시키는 단계. 한 측면에서, 본 발명은 단계(a)의 효소를 위한 복수의 작은 분자 기질을 포함함으로써, 자일라나제 효소가 촉매 작용하는 하나 이상의 효소 반응에 의해 생성되는 변형된 작은 분자의 라이브러리를 생성시킬 수있다. 한 측면에서, 본 방법은 효소에 의한 복수의 생촉매적 반응을 촉진하는 조건 하에서 복수의 부가적 효소들을 포함하여, 복수의 효소 반응에 의해 생성되는 변형된 작은 분자의 라이브러리를 형성시킬 수 있다. 또 다른 한 측면에서, 본 방법은 원하는 활성을 나타내는 특별한 변형된 작은 분자가 라이브러리 내에 존재하는지의 여부를 결정하기 위해 라이브러리를 시험하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 라이브러리의 시험 단계는, 원하는 활성을 갖는 특별한 변형된 작은 분자의 존재 또는 부재에 대해 변형된 작은 분자의 부분을 시험하고 원하는 활성을 갖는 특별한 변형된 작은 분자를 생성하는 하나 이상의 특이적 생촉매적 반응을 식별함으로써, 라이브러리 내의 복수의 변형된 작은 분자들을 생성시키는데 사용되는 생촉매적 반응들 중 하나를 제외한 모든 반응을 계통적으로 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 자일라나제 효소의 기능적 절편을 결정하는 방법을 제공한다:
(a) 자일라나제 효소를 제공하는 단계(여기에서, 효소는 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드, 또는 그것의 서브서열을 포함함); 및
(b) 단계(a)의 서열로부터 복수의 아미노산 잔기를 제거하고, 나머지 서브서열을 자일라나제 활성에 대해 시험함으로써, 자일라나제 효소의 기능적 절편을 결정하는 단계. 한 측면에서, 자일라나제 활성은 자일라나제 기질을 제공하고, 기질의 양의 감소 또는 반응 생성물의 양의 증가를 탐지함으로써 측정된다.
본 발명은 실시간 대사 흐름 분석을 이용함으로써 신규 또는 변형 표현형의 전체 세포 공학처리를 하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공한다:
(a) 세포의 유전 조성물을 변형시킴으로써 변형 세포를 제조하는 단계(여기에서, 유전 조성물은 본 발명의 핵산을 세포에 부가함으로써 변형됨);
(b) 변형 세포를 배양하여, 복수의 변형 세포를 생성시키는 단계;
(c) 실시간으로 단계(b)의 세포 배양물을 모니터함으로써, 세포의 하나 이상의 대사 파라미터를 측정하는 단계; 및
(d) 단계(c)의 데이터를 분석하여, 측정된 파라미터가 유사한 조건 하에서 변형 세포에서의 필적할만한 측정과 상이한지의 여부를 결정함으로써, 실시간 대사 흐름 분석을 이용하여 세포 내 공학처리된 표현형을 식별하는 단계. 한 측면에서, 세포의 유전 조성물은 서열의 결실, 또는 세포 내의 서열의 변형, 또는 유전자 발현의 정지를 포함하는 방법에 의해 변형될 수 있다. 한 측면에서, 본 방법은 새로이 공학처리된 표현형을 갖는 세포를 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 한 측면에서, 본 방법은 선택된 세포를 배양함으로써, 새로이 공학처리된 표현형을 갖는 신규 세포 균주를 생성시킴을 포함할 수 있다.
본 발명은 자일라나제 폴리펩티드를 글리코실화하는 것을 포함하는, 자일라나제 폴리펩티드의 내열성 또는 열안정성을 증가시키는 방법으로서, 폴리펩티드가 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 핵산 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 30개 이상의 연속 아미노산을 포함함으로써, 자일라나제 폴리펩티드의 내열성 또는 열안정성을 증가시키는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 자일라나제 특이적 활성은약 37℃초과 내지 약 95℃범위의 온도에서 열안정성 또는 내열성을 가질 수 있다.
본 발명은 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 핵산 서열을 갖는 핵산을 포함하는 벡터를 발현시키는 것을 포함하는, 세포 내의 재조합 자일라나제 폴리펩티드를 과다발현시키는 방법을 제공하며, 여기에서 서열 상동성은 서열 비교 알고리즘을 이용하는 분석 또는 시각적 조사에 의해 결정되며, 과다발현은 높은 활성 프로모터, 디시스트로닉 벡터의 이용, 또는 벡터의 유전자 증폭에 의해 행해진다.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는 유전자이식 식물의 제조 방법을 제공한다:
(a) 이종 핵산 서열을 세포에 도입하는 단계(여기에서, 이종 핵산 서열은 본 발명의 핵산 서열을 포함함으로써, 형질전환된 식물 세포를 생성시킴); 및
(b) 형질전환된 세포로부터 유전자이식 식물을 제조하는 단계. 한 측면에서, 단계(a)는 식물 세포 원형질의 전기천공법 또는 미세주입법에 의해 이종 핵산 서열을 도입하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 한 측면에서, 단계(a)는 DNA 입자 충돌에 의해 이종 핵산 서열을 식물 조직에 직접적으로 도입하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 단계(a)는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 숙주를 이용하여, 이종 핵산 서열을 식물 세포 DNA에 도입하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 한 측면에서, 식물 세포는 감자, 옥수수, 쌀, 밀, 담배 또는 보리 세포일 수 있다.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는 식물 세포 내의 이종 핵산 서열을 발현시키는 방법을 제공한다:
(a) 프로모터에 작동적으로 연결된 이종 핵산 서열을 이용하여 식물 세포를 형질전환시키는 단계(여기에서, 이종 핵산 서열은 본 발명의 핵산을 포함함); 및
(b) 이종 핵산 서열이 식물 세포 내에서 발현되는 조건 하에서 식물을 성장시키는 단계.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는 식물 세포 내의 이종 핵산 서열을 발현시키는 방법을 제공한다:
(a) 프로모터에 작동적으로 연결된 이종 핵산 서열을 이용하여 식물 세포를 형질전환시키는 단계(여기에서, 이종 핵산 서열은 본 발명의 핵산을 포함함); 및
(b) 이종 핵산 서열이 식물 세포 내에서 발현되는 조건 하에서 식물을 성장시키는 단계.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는 자일란 함유의 조성물을 가수분해, 파괴 또는 붕괴시키는 방법을 제공한다:
(a) 자일라나제 활성을 갖는 본 발명의 폴리펩티드를 제공하는 단계;
(b) 자일란을 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 및
(c) 자일라나제가 자일란 함유의 조성물을 가수분해, 분해 또는 붕괴시키는 조건 하에서, 단계(a)의 폴리펩티드를 단계(b)의 조성물과 접촉시키는 단계. 한 측면에서, 본 조성물은 식물 세포, 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 동물 세포를 포함한다. 이에 따라, 본 조성물은 임의의 식물 또는 식물 부분, 임의의 자일란 함유의 식품 또는 사료, 폐기물 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는 자일란 함유의 조성물을 액화 또는 제거하는 방법을 제공한다:
(a) 자일라나제 활성을 갖는 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 제공하는 단계;
(b) 자일란을 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 및
(c) 자일라나제가 자일란 함유의 조성물을 제거, 연화 또는 액화시키는 조건 하에서, 단계(a)의 폴리펩티드를 단계(b)의 조성물과 접촉시키는 단계.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 포함하는 세제 조성물로서, 폴리펩티드가 자일라나제 활성을 갖는 세제 조성물을 제공한다. 자일라나제는 비표면활성 자일라나제 또는 표면활성 자일라나제일 수 있다. 자일라나제는 비수성 액체 조성물, 캐스트 고체, 과립 형태, 미립 형태, 압착 정제, 겔 형태, 페이스트 또는 슬러리 형태로 제형화될 수 있다. 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 목적물의 세정 방법을 제공한다:
(a) 자일라나제 활성을 갖는 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
(b) 목적물을 제공하는 단계; 및
(c) 조성물이 목적물을 세정하는 조건 하에서, 단계(a)의 폴리펩티드를 단계(b)의 목적물과 접촉시키는 단계.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 포함하는, 예컨대 실 등의 텍스타일 또는 패브릭을 제공한다. 한 측면에서, 텍스타일 또는 패브릭은 자일란-함유의 섬유를 포함한다. 본 발명은 하기단계들을 포함하는 텍스타일 또는 패브릭의 처리(예컨대, 조성물로부터의 오염 제거) 방법을 제공한다:
(a) 자일라나제 활성을 갖는 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
(b) 자일란을 포함하는 텍스타일 또는 패브릭을 제공하는 단계; 및
(c) 텍스타일 또는 패브릭을 처리하는(예컨대, 오염을 제거하는) 조건 하에서, 단계(a)의 폴리펩티드를 단계(b)의 조성물과 접촉시키는 단계.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는 패브릭의 피니쉬를 향상시키는 방법을 제공한다:
(a) 자일라나제 활성을 갖는 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
(b) 패브릭을 제공하는 단계; 및
(c) 폴리펩티드가 패브릭을 처리함으로써, 패브릭의 피니쉬를 향상시킬 수 있는 조건 하에서, 단계(a)의 폴리펩티드를 단계(b)의 패브릭과 접촉시키는 단계. 한 측면에서, 패브릭은 울 또는 실크이다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 포함하는 사료 또는 식품을 제공한다. 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 사료 또는 식품 내의 자일란을 동물에 의해 소비되기 전에 가수분해하는 방법을 제공한다:
(a) 본 발명의 자일라나제, 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 자일라나제를 포함하는 사료 물질을 수득하는 단계; 및
(b) 자일란의 가수분해 및 처리된 식품 또는 사료의 형성을 일으키기에 충분한 시간 동안 충분한 양의 사료 또는 식품 물질에 단계(a)의 폴리펩티드를 첨가함으로써, 식품 또는 사료 내의 자일란을 동물에 의해 소비되기 전에 가수분해시키는 단계.
한 측면에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 사료 또는 식물 내의 자일란을 동물에 의해 소비되기 전에 가수분해하는 방법을 제공한다:
(a) 본 발명의 자일라나제, 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 자일라나제를 포함하는 사료 물질을 수득하는 단계;
(b) 단계(a)의 폴리펩티드를 사료 또는 식품 물질에 첨가하는 단계; 및
(c) 사료 또는 식품 물질을 동물에게 투여하는 단계(여기에서, 소비 후, 자일라나제는 동물의 소화관 내에서 사료 또는 식품 내의 자일란의 가수분해를 일으킴). 식품 또는 사료는 예컨대 곡류, 그레인, 옥수수 등일 수 있다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 예컨대 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 포함하는 동물용 식품 또는 영양 보충물을 제공한다. 한 측면에서, 식품 또는 영양 보충물 내의 폴리펩티드는 가수분해될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 예컨대 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 포함하는 식용성 효소 전달 매트릭스를 제공한다.
한 측면에서, 전달 매트릭스는 펠릿을 포함한다. 한 측면에서, 폴리펩티드는 글리코실화될 수 있다. 한 측면에서, 자일라나제 활성은 내열성을 가진다. 또 다른한 측면에서, 자일라나제 활성은 열안정성을 가진다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 식품, 사료 또는 영양 보충물을 제공한다. 본 발명은 동물 식이요법에 있어 자일라나제를 영양 보충물로서 이용하는 방법으로서, 본 발명의 폴리펩티드의 30개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 자일라나제 효소를 함유하는 영양 보충물을 제조함; 및 영양 보충물을 동물에게 투여하여, 동물에 의해 분해되는 사료 또는 식품 내에 함유된 자일란의 이용을 증가시킴을 포함하는 방법을 제공한다. 동물은 인간, 반추 동물 또는 단위 동물일 수 있다. 자일라나제 효소는 박테리아, 효모, 식물, 곤충, 진균류 및 동물로 구성된 군으로부터 선택되는 유기체 내의 자일라나제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 제조될 수 있다. 유기체는 에스. 폼베(S. pombe),에스. 세레비재(S. cerevisiae),피치아 파스토리스(Pichia pastoris),슈도모나스 종(Pseudomonas sp.),이. 콜라이(E.coli),스트렙토마이세스 종(Streptomyces sp.),바실러스 종(Bacillus sp.)및 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 열안정성 재조합 자일라나제 효소를 포함하는 효소 전달 매트릭스, 예컨대 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 식용성 효소 전달 매트릭스를 제공한다. 본 발명은 자일라나제 보출물을 동물에게 전달하는 방법으로서, 그래뉼리트 식용성 담체 및 열안정성 재조합 자일라나제 효소를 포함하는 펠릿 형태의 식용성 효소 전달 매트릭스를 제조함(여기에서, 펠릿은 그 안에 함유된 자일라나제 효소를 용이하게 분산시킴), 및 식용성 효소 전달 매트릭스를 동물에게 투여함을 포함하는방법을 제공한다. 재조합 자일라나제 효소는 본 발명의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 과립성 식용 담체는 곡물 배아(germ), 오일이 제거된 곡물 배아, 건초, 알팔파, 티모시, 대두 껍질, 해바라기 씨분 및 밀 미드로 구성된 군으로부터 선택되는 담체를 포함할 수 있다. 식용성 담체는 오일이 소비된 곡물 배아를 포함할 수 있다. 자일라나제 효소는 글리코실화되어, 펠릿화 조건 하에서 열안정성을 제공할 수 있다. 전달 매트릭스는 곡물 배아 및 자일라나제를 포함하는 혼합물을 펠릿화함으로써 형성될 수 있다. 펠릿화 조건은 스팀의 적용을 포함할 수 있다. 펠릿화 조건은 약 5분간 약 80℃ 이상의 온도의 적용을 포함할 수 있고, 효소는 350 이상 내지 약 900 유닛/효소 mg의 특이적 활성을 보유한다.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는 낙농 제품의 조직 및 풍미를 향상시키는 방법을 제공한다:
(a) 자일라나제 활성을 갖는 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 자일라나제를 제공하는 단계;
(b) 유제품을 제공하는 단계; 및
(c) 자일라나제가 유제품의 조직 또는 풍미를 향상시킬 수 있는 조건 하에서, 단계(a)의 폴리펩티드를 단계(b)의 낙농 제품과 접촉시키는 단계. 한 측면에서, 낙농 제품은 치즈 또는 요구르트를 포함한다. 본 발명은 본 발명의 자일라나제를 포함하는 낙농 제품을 제공하거나, 본 발명의 핵산에 의해 암호화된다.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는 오일 풍부 식물 물질로부터의 오일 추출을 향상시키는 방법을 제공한다:
(a) 자일라나제 활성을 갖는 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 자일라나제를 제공하는 단계;
(b) 오일 풍부 식물 물질을 제공하는 단계; 및
(c) 단계(a)의 폴리펩티드를 오일 풍부 식물 물질과 접촉시키는 단계. 한 측면에서, 오일 풍부 식물 물질은 오일 풍부 씨를 포함한다. 오일은 대두 오일, 올리브 오일, 평지씨(카놀라) 오일 또는 해바라기 오일일 수 있다.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는 과일 또는 야채 쥬스, 시럽, 퓨레 또는 추출물의 제조 방법을 제공한다:
(a) 자일라나제 활성을 갖는 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 자일라나제를 제공하는 단계;
(b) 과일 또는 야채 물질을 포함하는 조성물 또는 액체를 제공하는 단계; 및
(c) 단계(a)의 폴리펩티드를 조성물과 접촉시킴으로써, 과일 또는 야채 쥬스, 시럽, 퓨레 또는 추출물을 제조하는 단계.
본 발명은 본 발명의 자일라나제, 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 포함하는 종이 또는 종이 제품, 또는 종이 펄프를 제공한다. 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 종이, 또는 종이 또는 목재 펄프의 처리 방법을 제공한다:
(a) 자일라나제 활성을 갖는 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 자일라나제를 제공하는 단계;
(b) 종이, 또는 종이 또는 목재 펄프를 포함하는 조성물을 제공하는 단계;및
(c) 자일라나제가 종이, 또는 종이 또는 목재 펄프를 처리할 수 있는 조건 하에서, 단계(a)의 폴리펩티드를 단계(b)의 조성물과 접촉시키는 단계. 한 측면에서, 약제학적 조성물은 분해 보조제 또는 항미생물제(예컨대, 살모넬라균(Salmonella)에 대한 미생물제) 로서 작용한다. 한 측면에서, 처리는 예방적이다. 한 측면에서, 본 발명은 자일라나제 활성을 갖는 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 자일라나제를 포함하는 구강 케어 제품을 제공한다. 구강 케어 제품은 치약, 덴탈 크림, 겔 또는 치아 분말제, 치의, 구강청결제, 전- 또는 후-브러슁 린스 제형물, 츄잉검, 로젠지 또는 캔디를 포함할 수 있다. 본 발명은 자일라나제 활성을 갖는 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 자일라나제를 포함하는 콘택트렌즈 클렌징 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 자일란을 갖는 미생물로부터 동물을 제거 또는 보호하는 방법을 제공한다. 미생물은 자일란을 포함하는 박테리아, 예컨대 살로넬라균일 수 있다.
본 발명은 서열 번호 189에 표시되는 서열, 및 서열 번호 189와 50% 이상의 서열 상동성을 갖는 상기 서열의 변이체를 가지고, 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코팅하는 분리 핵산을 제공한다. 한 측면에서, 폴리펩티드는 자일라나제 활성, 예컨대 열안정성을 갖는 자일라나제 활성을 가진다.
본 발명은, 하기 서열 변이체들 중 하나 이상, 또는 모두를 포함하는 서열 번호 189를 갖는 분리 또는 재조합 핵산을 제공한다: 위치 22 내지 24의 뉴클레오티드가 TTC이거나, 위치 22 내지 24의 뉴클레오티드가 TTT이거나, 위치 31 내지 33의 뉴클레오티드가 CAC이거나, 위치 31 내지 33의 뉴클레오티드가 CAT이거나, 위치 34 내지 36의 뉴클레오티드가 TTG이거나, 위치 34 내지 36의 뉴클레오티드가 TTA이거나, 위치 34 내지 36의 뉴클레오티드가 CTC이거나, 위치 34 내지 36의 뉴클레오티드가 CTT이거나, 위치 34 내지 36의 뉴클레오티드가 CTA이거나, 위치 34 내지 36의 뉴클레오티드가 CTG이거나, 위치 49 내지 51의 뉴클레오티드가 ATA이거나, 위치 49 내지 51의 뉴클레오티드가 ATT이거나, 위치 49 내지 51의 뉴클레오티드가 ATC이거나, 위치 178 내지 180의 뉴클레오티드가 CAC이거나, 위치 178 내지 180의 뉴클레오티드가 CAT이거나, 위치 190 내지 192의 뉴클레오티드가 TGT이거나, 위치 190 내지 192의 뉴클레오티드가 TGC이거나, 위치 190 내지 192의 뉴클레오티드가 GTA이거나, 위치 190 내지 192의 뉴클레오티드가 GTT이거나, 위치 190 내지 192의 뉴클레오티드가 GTC이거나, 위치 190 내지 192의 뉴클레오티드가 GTG이거나, 위치 193 내지 195의 뉴클레오티드가 GTG이거나, 위치 193 내지 195의 뉴클레오티드가 GTC이거나, 위치 193 내지 195의 뉴클레오티드가 GTA이거나, 위치 193 내지 195의 뉴클레오티드가 GTT이거나, 위치 202 내지 204의 뉴클레오티드가 ATA이거나, 위치 202 내지 204의 뉴클레오티드가 ATT이거나, 위치 202 내지 204의 뉴클레오티드가 ATC이거나, 위치 202 내지 204의 뉴클레오티드가 GCT이거나, 위치 202 내지 204의 뉴클레오티드가 GCG이거나, 위치 202 내지 204의 뉴클레오티드가 GCC이거나, 위치 202 내지 204의 뉴클레오티드가 GCA이거나, 위치 235 내지 237의 뉴클레오티드가 CCA이거나, 위치 235 내지 237의 뉴클레오티드가 CCC이거나, 위치 235 내지 237의 뉴클레오티드가 CCG 임.
본 발명은 하기 서열 변이체들 중 하나 이상, 또는 모두를 포함하는 서열 번호 190 을 갖는 분리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다: 아미노산 위치8의 아스파르트산이 페닐알라닌이거나, 아미노산 위치 11의 글루타민이 히스티딘이거나, 아미노산 위치 12의 아스파라긴이 류신이거나, 아미노산 위치 17의 글리신이 이소류신이거나, 아미노산 위치 23의 트레오닌이 야행형 코돈 이외의 코돈에 의해 암호화되는 트레오닌이거나, 아미노산 위치 60의 글리신이 히스티딘이거나, 아미노산 위치 64의 프롤린이 시스테인이거나, 아미노산 위치 64의 프롤린이 발린이거나, 아미노산 위치 65의 세린이 발린이거나, 아미노산 위치68의 글리신이 이소류신이거나, 아미노산 위치 68의 글리신이 알라닌이거나, 아미노산 위치 79의 세린이 프롤린임. 한 측면에서, 폴리펩티드는 자일라나제 활성, 예컨대 열안정성을 갖는 자일라나제 활성을 가진다.
본 발명은 표 1 또는 표 2에서 표시되는 하나 이상, 또는 모든 서열 변형을 포함하는 서열 번호 189를 갖는 분리 또는 재조합 핵산을 제공한다. 본 발명은 표 1 또는 표 2에서 표시되는 하나 이상, 또는 모든 서열 변형을 포함하는 서열 번호 189를 갖는 분리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 한 측면에서, 폴리펩티드는 자일라나제 활성, 예컨대 열안정성을 갖는 자일라나제 활성을 가진다.
본 발명은 하기 서열 변이체들 중 하나 이상, 또는 모두를 포함하는 서열 번호 379를 갖는 분리 또는 재조합 핵산을 제공한다: 위치 22 내지 24의 뉴클레오티드가 TTC이거나, 위치 31 내지 33의 뉴클레오티드가 CAC이거나, 위치 49 내지 51의뉴클레오티드가 ATA이거나, 위치178 내지 180의 뉴클레오티드가 CAC이거나, 위치 193 내지 195의 뉴클레오티드가 GTG이거나, 위치 202 내지 204의 뉴클레오티드가 GCT 임.
본 발명은 하기 서열 변이체들 중 하나 이상, 또는 모두를 포함하는 서열 번호 380 을 갖는 분리 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다: D8F, QllH, G17I, G60H, S65V 및/또는 G68A. 한 측면에서, 폴리펩티드는 자일라나제 활성, 예컨대 열안정성을 갖는 자일라나제 활성을 가진다.
본 발명의 분리 또는 재조합 핵산은 또한 "A 군 핵산 서열"이라고 칭해진다. 본 발명은 A 군 핵산 서열, 그것과 실질적으로 동일한 서열 및 그것과 상보적인 서열에서 표시되는 서열의 10개 이상의 연속 염기들을 포함하는 분리 핵산을 제공한다.
본 발명의 예시적 서열의 기능적 절편을 포함하는 본 발명의 분리 또는 재조합 폴리펩티드는 또한 "B 군 아미노산 서열"이라고 칭해진다. 본 발명의 또 다른 측면은, B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열에서 표시되는 서열의 10개 이상의 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 분리 또는 재조합 핵산이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열에서 표시되는 서열을 갖는 정제된 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면은, B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열에서 표시되는 서열을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 분리 또는 정제된 항체이다.
본 발명의 또 다른 측면은 B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한서열의 폴리펩티드들 중 하나의 10개 이상의 연속 아미노산을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 분리 또는 정제된 항체, 또는 그것의 결합 절편이다.
본 발명의 또 다른 측면은 B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열에서 표시되는 서열을 갖는 폴리펩티드의 제조 방법이다. 본 방법은 프로모터에 작동적으로 연결된, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 숙주 세포에 도입하고, 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면은 B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열의 10개 이상의 연속 아미노산을 갖는 폴리펩티드의 제조 방법이다. 본 방법은 프로모터에 작동적으로 연결된, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 숙주 세포에 도입하고, 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양함으로써, 폴리펩티드를 제조하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 A 군 핵산 서열, 그것과 실질적으로 동일한 서열, A 군 핵산 서열의 서열과 상보적인 서열, 상기 서열의 30개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 절편에서 표시되는 서열을 갖는 핵산을 수득하고, 서열 내의 하나 이상의 뉴클레오티드를 또 다른 뉴클레오티드로 바꾸거나, 서열 내의 하나 이상의 뉴클레오티드를 결실시키거나, 서열 내의 하나 이상의 뉴클레오티드를 부가하는 것을 포함하는 변이체의 생성 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 A 군 핵산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열에서 표시되는 서열, 또는 B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열에서 표시되는 서열을 저장하고 있는 컴퓨터 판독가능한 매체이다.
본 발명의 또 다른 측면은 A 군 핵산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열에서 표시되는 서열, 또는 B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열에서 표시되는 서열을 갖는 폴리펩티드를 저장하고 있는 데이터 저장 장치, 및 프로세서를 포함하는 컴퓨터 시스템이다.
본 발명의 또 다른 측면은 A 군 핵산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열에서 표시되는 서열, 또는 B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티드 코드를 갖는 핵산인 제1 서열을 참조 서열과 비교하는 방법이다. 본 방법은 서열을 비교하는 컴퓨터 프로그램의 사용을 통해 제1 서열 및 참조 서열을 읽고, 컴퓨터 프로그램을 이용하여 제1 서열 및 참조 서열 간의 차이를 결정하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 A 군 핵산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열에서 표시되는 서열, 또는 B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열에서 표시되는 서열을 갖는 폴리펩티드 내의 특징을 동정하는 방법으로서, 서열 내의 특징을 동정하는 컴퓨터 프로그램의 사용을 통해 서열을 읽음; 및 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 내의 특징을 동정함을 포함하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은, 자일란 또는 그것의 유도체의 파괴에서 촉매 작용하는 방법으로서, 자일란의 파괴를 촉진하는 조건 하에서, 자일란 또는 그것의 유도체를 함유하는 샘플을 B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티드를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한서열의 폴리펩티드의 효소적 기능을 보유하는, B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열의 절편 또는 변이체를 동정하는 검정법이다. 그 검정법은 폴리펩티드 절편 또는 변이체가 기능하도록 하는 조건 하에서, B 군 아미노산 서열, 그것과 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드 절편 또는 변이체를 기질 분자와 접촉시킴, 및 기질 수준의 감소 또는, 폴리펩티드 및 기질 간의 반응의 특이적 반응 생성물 수준의 증가를 탐지함으로써, 상기 서열의 절편 또는 변이체를 동정함.
본 발명의 또 다른 측면은 A 군 핵산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열의 핵산 표적 영역과 50% 이상 상보적이고, 온화한 조건 내지 매우 엄격 조건 하에서 핵산 표적 영역에 대해 하이브리드화하여, 탐지가능한 표적:프로브 이중체를 형성하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 한 세그먼트를 가지는, 약 10 내지 50개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는 올리고뉴클레오티드의 핵산 프로브이다.
본 발명의 또 다른 측면은 A 군 핵산 서열 중 하나의 하나 이상의 절편과 동일하거나 그와 전부 상보적인 서열을 갖는 자일라나제 유전자의 분리 또는 동정을 위한 폴리뉴클레오티드 프로브이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 액체인 단백질 제제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 고체인 단백질제제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 A 군 핵산 서열, 그것과 실질적으로 동일한 서열 및 그것과 상보적인 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 하나 이상의 폴리펩티드와 하나 이상의 작은 분자를 혼합하여, 하나 이상의 생촉매적 반응을 통해 하나 이상의 변형된 작은 분자를 제조하는 단계를 포함하는 작은 분자의 변형 방법으로서, 하나 이상의 폴리펩티드가 자일라나제 활성을 가지는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 서열의 클로닝 벡터로서, 상기 서열이 A 군 핵산 서열, 그것과 실질적으로 동일한 서열 및 그것과 상보적인 서열로부터 선택되는 클로닝 벡터이다.
본 발명의 또 다른 측면은 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코팅하는 서열을 포함하는 숙주 세포로서, 상기 서열이 A 군 핵산 서열, 그것과 실질적으로 동일한 서열 및 그것과 상보적인 서열로부터 선택되는 숙주 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 A 군 핵산 서열, 그것과 실질적으로 동일한 서열, 그것과 상보적인 서열로부터 선택되는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및, 엄격함이 낮은 조건, 중간인 조건 및 높은 조건 하에서 상기 서열들 중 임의의 서열을 갖는 핵산에 대해 하이브리드화하는 분리된 핵산을 포함하는 숙주 세포에서 복제가능한 발현 벡터를 제공한다.
또 다른 한 측면에서, 본 발명은 도우를 컨디셔닝하기에 충분한 조건 하에서, 도우를 B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열의 하나 이상의폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는 도우의 컨디셔닝 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 맥아즙 또는 맥주의 점도를 감소시키기에 충분한 조건 하에서, B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열의 하나 이상의 폴리펩티드의 투여를 포함하는 음료 제조 방법이다.
본 발명의 자일라나제는 포유동물 사료 내의 고분자량의 아라비노자일란을 파괴하는데 사용된다. 본 발명의 자일라나제의 첨가는 분해성을 향상시킴으로써 성장 속도를 자극하고, 이는 또한 동물의 새끼의 품질을 향상시킨다. 자일라나제는 위장관을 통해, 장내 점도를 감소시키고, 췌장 효소의 확산을 증가시키는 기능을 한다. 부가적으로, 본 발명의 자일라나제는 사료 그레인 및 식물성 단백질의 배젖 세포벽의 처리에 사용될 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 신규 자일라나제를 동물에게 투여하여, 식품 내의 자일란의 유용을 증가시킨다. 본 발명의 자일라나제의 그러한 활성은 세포벽 내의 영양성분들을 유리시키면서 불용성 세포벽 물질을 파괴하여, 동물에게 유용될 수 있도록 한다. 그것은 또한 헤미셀룰로스를 영양 당으로 변화시켜, 세포벽 내에 이전에 포획된 영양성분들이 해리되도록 한다. 자일라나제는 또한 반추 미생물총을 위한 영양원일 수 있는 화합물을 생성시킨다.
본 발명의 또 다른 측면은 동물의 식이법에 있어서 자일라나제를 영양 보충물로 이용하는 방법으로서, B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열의 30개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 재조합 자일라나제 효소를 갖는 영양 보충물을 제조함, 및 그 영양 보충물을 동물에게 투여하여, 동물에 의해 분해되는 식품 내에 함유된 자일란의 유용을 증가시킴을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 동물에게 자일라나제 보충물을 전달하는 방법으로서, 그래뉼리트 식용성 담체 및 열안정성을 갖는 재조합 자일라나제 효소를 포함하는 펠릿 형태의 식용성 효소 전달 매트릭스를 제조함(여기에서 입자는, 수성 매질 내에 함유된 자일라나제 효소를 용이하게 분산시킴), 및 식용성 효소 전달 매트릭스를 동물에게 투여함을 포함하는 방법을 제공한다. 그래뉼리트 식용성 담체는 오일이 소비된 곡물 배아, 건초, 알팔파, 큰조아재비, 콩 꼬투리, 해바라기 씨분 및 보리 미드로 구성된 군으로부터 선택되는 담체를 포함할 수 있다. 자일라나제 효소는 B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열에서 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 한 측면에서, 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 핵산으로서, 서열이 A 군 핵산 서열, 그것과 실질적으로 동일한 서열 및 그것과 상보적인 서열로부터 선택되고, 서열이 시그널 서열을 함유하는 분리된 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 핵산으로서, 서열이 A 군 핵산 서열, 그것과 실질적으로 동일한 서열 및 그것과 상보적인 서열로부터 선택되고, 서열이 또 다른 자일라나제로부터 시그널 서열을 함유하는 분리된 핵산을 제공한다. 부가적으로, 본 발명은 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 핵산으로서, 서열이 A 군 핵산 서열, 그것과 실질적으로 동일한 서열 및 그것과 상보적인 서열로부터 선택되고, 서열이 시그널 서열을 함유하지 않는 분리된 핵산을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 서열 번호 189의 돌연변이인 분리된 핵산을 제공한다. 또 다른 측면은 서열 번호 190의 돌연변이인 아미노산 서열을 제공한다.
본 발명의 하나 이상의 구현예의 상세한 설명은 이하 첨부 도면 및 발명의 상세한 설명에 의해 설명된다. 본 발명의 다른 특성, 목적 및 이점은 발명의 상세한 설명 및 도면으로부터, 또한 특허청구범위로부터 명백해질 것이다.
본원에 인용된 모든 공보, 특허, 특허 출원, GenBank 서열 및 ATCC 수탁은 모든 목적을 위해 본원에 명시적으로 인용된다.
관련 출원 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. §119(e) 규정 하에 2002년 6월 14일에 출원된 미국 가출원 제60/389,299호를 기초로 하여 우선권을 주장한다. 상기 출원은 전체적으로 모든 목적을 위해 명백히 본원에 참조 인용된다.
본 발명은 효소, 그 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 그러한 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 용도, 더욱 상세하게는 자일라나제 활성을 갖는 효소, 예컨대 내부 β-1,4-자일로시드계 연결기 또는 엔도-β-1,4-글루카나제 연결기의 가수분해에서 촉매 작용하는 효소에 관한 것이다.
하기 도면은 본 발명의 측면들을 설명하기 위한 것으로서, 특허청구범위에 의한 본 발명의 범주를 제한하지 않는 것으로 한다.
특허 또는 출원 파일은 하나 이상의 칼라 도면을 포함한다.
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도 1은 컴퓨터 시스템의 블록 다이어그램이다.
도 2는 새로운 서열 및 데이터베이스 내의 서열 간의 상동성 수준을 결정하기 위해, 새로운 뉴클레오티드 또는 단백질 서열을 서열의 데이터베이스와 비교하는 방법의 한 측면을 설명하는 플로우 다이어그램이다.
도 3은 2개의 서열이 상동성을 갖는지의 여부를 결정하기 위한 컴퓨터에서의 방법의 한 측면을 설명하는 플로우 다이어그램이다.
도 4는 서열 내의 특징의 존재를 탐지하기 위한 확인자 프로세스 300의 한측면을 설명하는 플로우 다이어그램이다.
도 5는 야생형 서열(서열 번호 189 및 190)와 8x 돌연변이(서열 번호 375 및 376), 표 1에서의 돌연변이체 D, F, H, I, S, V, X 및 AA의 조합체의 활성을 비교하는 그래프이다.
도 6A는 이하 실시예 5에서 상세히 설명되는 바와 같이, 서열 번호 190(서열 번호 189에 의해 암호화됨)의 유전자 부위 포화 돌연변이(GSSMTM)에 의해 생성되는 서열 번호 378(서열 번호 377 에 의해 암호화됨)의 9개의 단일 부위 아미노산 돌연변이체를 설명한다.
도 6B는 이하 실시예 5에서 상세히 설명되는 바와 같이, 각 효소에 대한 DSC 에 의해 결정되는 융점 전이 중간점(Tm)에서의 서열 번호 190 및 서열 번호 378의 풀림을 설명한다.
도 7A은 이하 실시예 5에서 상세히 설명되는 바와 같이, 효소 서열 번호 190 및 서열 번호 378에 대한 pH 및 온도 활성 프로파일을 설명한다.
도 7B은 이하 실시예 5에서 상세히 설명되는 바와 같이, 효소 서열 번호 190 및 서열 번호 378에 대한 속도/온도 활성 최적점을 설명한다.
도 7C은 이하 실시예 5에서 상세히 설명되는 바와 같이, 효소 서열 번호 190 및 서열 번호 378에 대한 내열성/잔류 활성을 설명한다.
도 8A은 이하 실시예 5에서 상세히 설명되는 바와 같이, 내열성 및 활성이 향상된 돌연변이체에 대해 구축되고 선별된 9 GSSMTM점돌연변이의 모든 가능한 조합의 GeneReassemblyTM라이브러리를 설명한다.
도 8B 이하 실시예 5에서 상세히 설명되는 바와 같이, 최적 온도 및 pH 6.0에서, 서열 번호 190("야생형")와 대비되는 "6X-2" 변이체 및 "9X" 변이체(서열 번호 378)의 상대적 활성을 설명한다.
도 9A는 이하 실시예 5에서 상세히 설명되는 바와 같이, 서열 번호 190("야생형") 및 "9X" 변이체(서열 번호 378) 효소에 의한 올리고자일란 (Xyl)3, (Xyl)4, (Xyl)5 및 (Xyl)6의 가수분해 후에 수득되는 지문을 설명한다.
도 9B는 이하 실시예 5에서 상세히 설명되는 바와 같이, 서열 번호 190("야생형") 및 "9X" 변이체(서열 번호 378) 효소에 의한 너도밤나무 자일란의 가수분해 후에 수득되는 지문을 설명한다.
도10A는 이하 실시예 5에서 상세히 설명되는 바와 같이, GSSMTM진화에 의해 수득되는 서열 번호 190("야생형")에 비한, 열안정성(Tm으로 표시)의 향상 수준을 설명하는 도시적 다이어그램이다.
도10B는 이하 실시예 5에서 상세히 설명되는 바와 같이, GSSMTM및 GeneReassemblyTM기술을 조합함으로써 수득되는 서열 번호 378 및 서열 번호 380의 형태의 효소 향상의 "적합성 다이어그램" 을 설명한다.
도 11은 이하 실시예 6에서 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명의 자일라나제가 종이 펄프를 예비 처리하는데 유용한지의 여부를 결정하기 위한 예시적 통상적 선별 프로토콜의 도시적 흐름 다이어그램을 설명한다.
각종 도면에서의 부호는 요소를 가리킨다.
본 발명은 자일라나제 및 그것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 그것의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드의 자일라나제 활성은 가수분해효소 활성을 갖는 효소, 예를 들어 자일란 내에 존재하는 글리코시드계 연결기를 가수분해할 수 있는 효소, 예컨대 자일란, 예컨대, 내부 β-1,4-자일로시드계 연결기의 가수분해에서 촉매 작용하는 효소를 포괄한다. 본 발명의 자일라나제는 식품, 사료, 영양 보충물, 텍스타일, 세제 등을 제조하고/하거나 가공하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 자일라나제는 약제학적 조성물 및 식이 보조제에서 사용될 수 있다. 본 발명의 자일라나제는 특히 제빵, 동물 사료, 음료 및 종이 가공에서 유용하다.
정의
용어 "항체"는 항원 또는 동위원소와 특이적으로 결합할 수 있는, 펩티드 또는, 면역글로불린 유전자로부터 유도되거나, 면역글로불린 유전자와 유사하게 모델링되거나, 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 암호화된 폴리펩티드, 또는 그것의 절편을 포함하고, 이에 대해 예컨대 [Fundamental Immunology, 제3판, W. E. Paul 저, Raven Press, N.Y. (1993); Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175: 267-273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25: 85-97]를 참고로 한다. 용어 "항체"는, (i) Fab 절편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 단가 절편; (ii) F(ab') 2 절편, 힌지 영역에서 디술피드 다리 연결된 2 개의 Fab 절편을 포함하는 이가 절편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 절편; (iv) 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 절편; (v) VH 도메인으로 구성되는 dAb 절편(Ward 등 (1989) Nature 341: 544-546); 및 (vi) 분리된 상보적 결정 영역(CDR)을 포함하는, 항원-결합 부분, 즉 항원 결합능을 보유하는 "항원 결합 부위"(예컨대, 절편, 서브서열, 상보적 결정 영역(CDR))를 포함한다. 단일 사슬 항체는 또한 용어 "항체"에서 참고로 포함된다.
본원에 사용된 용어 "어레이" 또는 "마이크로어레이", 또는 "바이오칩" 또는 "칩"은 이하 더욱 상세히 논의되는 바와 같이, 기질 표면의 일정 면적 상에 고정화된 하나 이상의 폴리펩티드(항체 포함) 또는 핵산을 일정량 각기 포함하는 복수의 표적 성분이다.
본원에 사용된 용어 "컴퓨터", "컴퓨터 프로그램" 및 "프로세서"는 그것의 최광의 일반적 문맥으로 사용되며, 이하 상세히 기술되는 것과 같은 장치들을 모두 포함한다. 특별한 폴리펩티드 또는 단백질"의 암호화 서열" 또는 특별한 폴리펩티드 또는 단백질을 "암호화하는 서열" 은, 적당한 조절 서열의 제어 하에 둘 때, 폴리펩티드 또는 단백질로 전사 및 번역되는 핵산 서열이다.
본원에 사용된 표현 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 이들 중 임의의 것의 절편, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나 센스 또는 안티센스 가닥일 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, 펩티드 핵산(PNA), 또는 천연 또는 합성 기원의 임의의 DNA-형 또는RNA-형 물질을 가리킨다. 표현 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 이들 중 임의의 것의 절편, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나 센스 또는 안티센스 가닥일 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA (예컨대, mRNA, rRNA, tRNA, iRNA), 펩티드 핵산(PNA), 또는 천연 또는 합성 기원의 임의의 DNA-형 또는 RNA-형 물질, 예를 들면 iRNA, 리보뉴클레오 단백질(예컨대, iRNP 등의 이중 가닥 iRNA)을 포함한다. 그 용어는 핵산, 즉 천연 뉴클레오티드의 공지된 상동체를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포괄한다. 그 용어는 또한 합성 골격을 갖는 핵산-형 구조를 포괄하며, 이에 대해서는 예컨대 [Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144: 189-197;Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36: 8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6: 153-156]를 참고로 한다. "올리고뉴클레오티드"에는 화학적으로 합성될 수 있는 단일 가닥의 폴리데옥시뉴클레오티드 또는 2개의 상보적 폴리데옥시뉴클레오티드 가닥을 포함한다. 그러한 합성 올리고뉴클레오티드는 5' 인산염을 가지지 않고, 키나아제의 존재 하에서 ATP 를 갖는 인산염을 첨가하지 않고는 또 다른 올리고뉴클레오티드와 접합되지 않을 것이다. 합성 올리고뉴클레오티드는 탈인산화되지 않은 절편에 접합될 수 있다.
특별한 폴리펩티드 또는 단백질의 "암호화 서열" 또는 특별한 폴리펩티드 또는 단백질을 "암호화하는 뉴클레오티드 서열"은 적당한 조절 서열을 제어하는 경우에서는 폴리펩티드 또는 단백질로 전사 및 번역되는 핵산 서열이다.
용어 "유전자"는 폴리펩티드 사슬의 생성에 관여하는 DNA의 세그먼트를 의미하고; 그것은 적용가능한 경우에는 개별적인 암호화 세그먼트들(엑손) 간의 삽입 서열(인트론)을 비롯하여, 암호화 영역의 선행 및 후행 영역을 포함한다. 본원에 사용된 "작동적으로 연결된" 이라는 표현은 2개 이상의 핵산(예컨대, DNA) 세그먼트들 간의 기능적 관계를 가리킨다. 전형적으로, 그것은 전사된 서열에 대한 전사적 조절 서열의 기능적 관계를 가리킨다. 예를 들어, 프로모터는, 그것이 적당한 숙주 세포 또는 다른 발현 시스템 내의 암호화 서열의 전사를 자극 또는 조절할 경우, 본 발명의 핵산과 같은 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 일반적으로, 전사된 서열에 작동적으로 연결된 프로모터 전사적 조절 서열은 전사된 서열과 물리적으로 접해 있고, 즉 시스-작용한다. 그러나 인핸서와 같은 일부 전사적 조절 서열은 전사가 증진되는 암호화 서열에 물리적으로 접해있거나 매우 근접하게 위치할 필요가 없다.
본원에 사용된 용어 "발현 카세트"는 본 서열과 상용적인 숙주 내에서 구조적 유전자의 발현에 영향을 줄 수 있는 뉴클레오티드 서열(즉, 본 발명의 자일라나제와 같은 단백질 암호화 서열)을 가리킨다. 발현 카세트는 폴리펩티드 암호화 서열에, 또한 임의적으로는 전사 종결 시그널 등의 다른 서열에 작동적으로 연결된 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 발현 수행에 필요하거나 도움이 되는 부가적인 인자, 예컨대 인핸서가 사용될 수 있다. 이에 따라서, 발현 카세트는 또한 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 임의의 형태의 재조합 "네이키드 DNA" 벡터 등을 포함한다. "벡터"는 세포를 감염시키거나, 트랜스펙션시키거나, 일시적 또는 영구적으로 형질도입할 수 있는 핵산을 포함한다. 벡터는 네이키드 핵산, 또는 단백질이나 지질과 복합화된 핵산일 수 있음을 인지할 것이다. 벡터는 임의적으로 바이러스 및/또는 박테리아 핵산 및/또는 단백질, 및/또는 막(예컨대, 세포막,바이러스 지질 엔벨로프 등)을 포함한다. 벡터는 비제한적으로 DNA의 절편이 부착되거나 복제될 수 있는 레플리콘(예컨대, RNA 레플리콘, 박테리오파지)을 포함한다. 이에 따라, 벡터는 비제한적으로 RNA, 자동적 자기-복제의 원형 또는 선형 DNA 또는 RNA(예컨대, 플라스미드, 바이러스 등, 예컨대 U.S. 특허 No. 5,217,879 참고)을 포함하고, 발현 및 비발현 플라스미드를 모두 포함한다. 세포 배양물의 재조합 미생물이 "발현 벡터" 를 호스팅하는 것으로 기재할 경우, 이는 원형 및 선형 DNA, 및 숙주 염색체(들)에 혼입된 염색체 외부의 DNA를 모두 포함한다. 벡터가 숙주 세포에 의해 유지되고 있는 경우, 이 벡터는 자발적 구조로서의 유사분열 중에 세포에 의해 안정하게 복제되거나,혹은 숙주의 게놈 내에 혼입된다.
본원에 사용된 용어 "프로모터"는 세포 내의 암호화 서열의 전사를 유도할 수 있는 모든 세포들, 예컨대, 식물 세포를 포함한다. 이에 따라, 본 발명의 구성에 사용된 프로모터는 시스-작용 전사적 조절 성분 및, 유전자의 전사 시간 및/또는 속도를 조절 또는 제어하는 조절 서열을 포함한다. 예를 들어, 프로모터는 전사 조절에 관여하는, 인핸서, 프로모터, 전사 종결자, 복제 기원, 염색체 삽입 서열, 5' 및 3' 비번역 영역, 또는 인트론 서열을 포함하는, 시스-작용의 전사적 조절 성분일 수 있다. 이 시스-작용의 서열은 전형적으로 전사를 수행(작동/비작동, 조절, 제어 등) 하기 위해 단백질 또는 다른 생체분자들과 통상적으로 상호작용한다. "구성" 프로모터는 전개 또는 세포 분화의 대부분의 환경적 조건 및 상태 하에서 연속으로 발현을 유도하는 것들이다. "유도가능한" 또는 "제어가능한" 프로모터는 환경적 조건 또는 전개 조건의 영향 하에서 본 발명의 핵산의 발현을 주도한다. 유도성 프로모터에 의해 전사에 영향을 줄 수 있는 환경적 조건의 예는 혐기성 조건, 승온, 건조(수분 고갈), 또는 광 존재를 포함한다.
"조직-특이적" 프로모터는 예컨대 식물 또는 동물 내의 특별한 세포 또는 조직 또는 기관에서 단지 활성을 갖는 전사 조절 성분이다. 조직-특이적 조절은 주어진 조직에 특이적인 단백질을 암호화하는 유전자가 확실히 발현되도록 하는 특정한 고유 인자에 의해 달성될 수 있다. 그러한 인자는 포유동물 및 식물 내에 존재하여, 특정 조직의 엔벨로프를 허용하는 것으로 알려져 있다.
용어 "식물"은 식물의 전체, 식물의 부분(예컨대, 잎, 줄기, 꽃, 뿌리 등), 식물 원형질, 씨 및 식물 세포 및 그것의 자손을 포함한다. 본원의 방법에 사용될 수 있는 식물의 부류는 일반적으로 나자 식물 을 비롯하여 피자 식물(단자엽 및 쌍자엽 식물)을 포함하는, 형질전환 기술을 적용할 수 있는 고급 식물 부류와 같이 넓은 범위이다. 그것은 배수체, 이수체, 반수체 및 반접합자 상태를 포함하는 다양한 수체 수준의 식물을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "유전자이식 식물"은 이종 핵산 서열이 삽입된 식물 또는 식물 세포, 예컨대, 본 발명의 핵산 및 각종 재조합 작제물(예컨대, 발현 카세트)을 포함한다.
"플라스미드"는 비제한적으로 시중 입수가능하고, 공개적으로 입수가능하거나, 공개된 절차에 따라 이용가능한 플라스미드로부터 구축될 수 있다. 그러한 것들과 동등한 플라스미드가 당업계에 알려져 있고, 당업자에게 명백하다.
본원에 사용된 "아미노산" 또는 "아미노산 서열"은 올리고펩티드, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열, 또는 그것들 중 임의의 것의 절편, 부분 또는 서브유니트, 및 천연 또는 합성 분자를 가리킨다.
"아미노산" 또는 "아미노산 서열"은 올리고펩티드, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열, 또는 그것들 중 임의의 것의 절편, 부분 또는 서브유니트, 및 천연 또는 합성 분자를 가리킨다. 본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합에 의해 상호 연결된 아미노산, 즉 펩티드 등가근을 가리키고, 20개의 유전자로 암호화된 아미노산 이외의 변형된 아미노산을 함유할 수 있다. 폴리펩티드는 전사후 가공과 같은 천연 공정, 또는 당업계에 공지된 화학적 변형 기술에 의해 변형될 수 있다. 변형은 펩티드 골격, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복실 말단을 포함하는, 폴리펩티드 내의 임의의 부분에서 일어날 수 있다. 동일한 유형의 변형이 주어진 폴리펩티드 내의 수개 부위에서 동일한 정도 또는 다양한 정도로 존재할 수 있음을 인지한다. 또한 주어진 폴리펩티드는 많은 유형의 변형을 가질 수 있다. 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 결합, 헴 단자의 공유 결합, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유 결합, 포스피티딜리노시톨의 공유 결합, 가교 고리화, 디술피드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교결합의 형성, 시스테인의 형성, 파이로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 페길화, 자일란 가수분해효소 가공, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 술페이트화 및, 아르기닐화와 같은, 단백질에 대한 아미노산의 전달-RNA 매개 부가를 포함한다[Creighton, T. E., Proteins-Structure and Molecular Properties 제2판, W. H. Freeman and Company, N.Y. (1993);Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson 저, Academic Press, N.Y., pp. 1-12 (1983) 참고]. 본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는 또한 이하 더욱 상세하게 기재되는, 모든 "미메틱" 및 "펩티도미메틱" 을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "분리(된)"는 물질이 본래의 환경(예컨대, 천연 발생될 경우에는 천연 환경)에서 제거됨을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물 내에 존재하는 천연 발생의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 분리되지 않으나, 자연계 내에 공존하는 물질들 중 일부 또는 모두로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 분리된다. 그러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부일 수 있고/있거나 및/또는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있고, 상기 벡터 또는 조성물은 그것의 천연 환경의 일부가 아님에 분리될 수 있다. 본원에 사용된 "정제(된)"는 절대적인 순수를 요하지 않으며, 상대적인 정의로 의도된다. 라이브러리로부터 수득된 개별적 핵산은 전기영동 상동성을 갖도록 통상적으로 정제화되었다. 이 클론으로부터 수득된 서열은 라이브러리 또는 총 인간 DNA 로부터 직접적으로 수득될 수 없었다. 본 발명의 정제된 핵산은 적어도 104내지 106배로 유기체 내의 나머지 게놈 DNA으로부터 정제되었다. 그러나, 용어 "정제(된)"는 또한 1 차원 이상의 등급, 전형적으로는 2 또는 3 차원, 더욱 통상적으로는4 또는 5 차원의 등급만큼, 나머지 게놈 DNA 또는 라이브러리 또는 다른 환경 내의 다른 서열로부터 정제된 핵산을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "재조합" 은, 핵산이 천연 환경 내에서는 인접하지 않은 "골격" 핵산에 인접하고 있음을 의미한다. 부가적으로, 용어 "풍부"는 핵산이 핵산 골격 분자의 집단 중, 핵산 삽입부의 수가 5% 이상을 나타내는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 골격 분자는 발현 벡터, 자기 복제 핵산, 바이러스, 일체화 핵산 및, 당 핵산 삽입부를 유지 또는 조작하는데 사용되는 다른 벡터 또는 핵산과 같은 핵산들을 포함한다. 통상적으로, 풍부 핵산은, 재조합 골격 분자의 집단 중 핵산 삽입부의 수가 15% 이상을 나타낸다. 더욱 통상적으로는, 재조합 골격 분자의 집단 중 핵산 삽입부의 수가 50% 이상을 나타낸다. 한 측면에서, 풍부 핵산은 재조합 골격 분자의 집단 중 핵산 삽입부의 수가 90% 이상을 나타낸다.
"재조합" 폴리펩티드 또는 단백질은 재조합 DNA 기술에 의해 제조된, 즉 원하는 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 외인성 DNA 작제물에 의해 형질전환된 세포로부터 제조된 폴리펩티드 또는 단백질을 가리킨다. "합성" 폴리펩티드 또는 단백질은 화학적 합성에 의해 제조된 것들이다. 고체상 화학적 펩티드 합성법은 또한 본 발명의 폴리펩티드 또는 절편을 합성하는데 사용될 수 있다. 그러한 방법은 1960년대 초반 이후로 당업계에 공지되어 왔고[Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154,1963] (또한 Stewart, J. M. 및 Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 제2판, Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., pp.11-12) 참고), 시중 입수가능한 실험용 펩티드 설계 및 합성 키트(Cambridge ResearchBiochemicals)에 최근 이용되었다. 그러한 시중 입수가능한 실험용 키트는 일반적으로 [H. M. Geysen 등,Proc. Natl. Acad. Sci.미국, 81: 3998 (1984)] 의 교시 내용을 이용하였고, 단일 플레이트에 모두 연결되는 다수의 "로드(rod)" 또는 "핀"의 끝에 펩티드의 합성을 제공한다. 그러한 시스템을 이용할 경우, 로드 또는 핀의 플레이트를, 핀 또는 로드의 끝에 적당한 아미노산을 부착 또는 앵커시키기 위한 용액을 함유하는 상응하는 웰 또는 저장부의 두 번째 플레이트에 전환 및 삽입한다. 그러한 공정 단계, 즉 로드 및 핀의 끝을 적당한 용액에 전환 및 삽입하는 단계를 반복함으로써, 아미노산이 원하는데 펩티드에 구축된다. 게다가, 수많은 입수가능한 FMOC 펩티드 합성 시스템이 이용가능하다. 예를 들어, 폴리펩티드 또는 절편의 어셈브리를 어플라이드 바이오시스템사(Applied Biosystems, Inc.)의 모델 431A 자동화 펩티드 합성기를 이용하여 고체 지지체 상에 행할 수 있다. 그러한 장치는 직접적 합성, 또는 다른 공지된 기술들과 조합될 수 있는 일련의 절편 합성에 의해, 본 발명의 펩티드를 수득할 수 있게 한다.
프로모터 서열은 프로모터에서 전사를 개시하는 RNA 폴리머라아제는 암호화서열을 mRNA로 전사할 때, 암호화 서열에 "작동적으로 연결된다".
"플라스미드"는 대문자 및/또는 숫자에 의해 선행 및/또는 후행되는 소문자 "p"로 표시된다. 본원에서의 출발 플라스미드는 비제한적으로 시중 입수가능하고, 공개적으로 입수가능하거나, 공지된 절차에 따라 입수가능한 플라스미드로부터 구축될 수 있다. 게다가, 본원에 기재된 것들과 동등한 플라스미드가 당업계에 알려져 있고, 당업자에게 명백할 것이다.
DNA의 "분해" DNA 내의 특정 서열에서만 작용하는 제한 효소로 DNA의 촉매적 절단을 가리킨다. 본원에 사용된 각종 제한 효소들은 입수 가능하고, 그것들의 반응 조건, 조인자 및 다른 요건들은 당업자에게 공지된 바대로 이용된다. 분석적 목적을 위해, 통상 1 ㎍의 플라스미드 또는 DNA 절편을 약 20 ㎖의 완충액 내의 약 2 단위의 효소와 함께 사용된다. 플라스미드 구축을 위해 DNA 절편을 분리하기 위한 목적으로, 통상 5 내지 50 ㎍의 DNA를 더 큰 체적 내의 20 내지 250 단위의 효소로 분해한다. 특별한 제한 효소에 대한 적당한 완충액 및 기질 양은 제조업자에 의해 특정화된다. 37℃에서 약 1 시간의 배양 시간이 일반적으로 사용되나, 공급업자의 지시에 따라 다양할 수 있다. 분해 후에, 겔 전기영동을 수행하여, 원하는 절편을 분리할 수 있다.
2개의 핵산 또는 폴리펩티드에 관한 기재에서의 표현 "실질적으로 동일한"은 공지된 서열 비교 알고리즘들 중 하나를 이용하거나 시각적으로 조사하여 측정 시, 최대 대등성에 대해 비교하여 배열할 때, 예컨대 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%,87%,88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기(서열) 상동성을 갖는 2개 이상의 서열을 가리킨다. 통상적으로, 실질적인 상동성은 약 100개 이상의 잔기로 된 영역에 존재하고, 가장 통상적으로는 서열이 약 150 내지 200개 이상의 잔기들에서 실질적으로 동일하다. 일부 측면에서, 서열은 전체 길이의 암호화 영역에서 실질적으로 동일하다.
부가적으로, "실질적으로 동일한" 아미노산 서열은 하나 이상의 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의해 참조 서열과 상이하게 된 서열로서, 특히 사익 치환이 분자의 활성 부위가 아닌 부위에서 일어날 때의 서열이며, 여기에서 단 폴리펩티드는 본질적으로 기능적 성질을 보유한다. 보존적 아미노산 치환은 예를 들어 하나의 아미노산을 동일 부류의 또 다른 아미노산으로 치환하는 것이다(예컨대, 소수성 아미노산, 예컨대 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌의 또 다른 아미노산으로의 치환, 또는 하나의 극성 아미노산의 또 다른 아미노산으로의 치환, 예컨대 아르기닌의 리신으로의 치환, 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환, 또는 글루타민의 아스파라긴으로의 치환). 하나 이상 아미노산은 예를 들어 자일라나제 폴리펩티드로부터 결실될 수 있고, 이에 생물학적 활성을 상당히 변경시키지 않으면서 폴리펩티드의 구조를 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 자일라나제 생물학적 활성을 위해 필요하지 않은 아미노- 또는 카르복실-말단의 아미노산을 제거할 수 있다. 본 발명의 변형된 폴리펩티드 서열은, 변형된 폴리펩티드 서열을 자일라나제 기질과 접촉시키고, 변형된 폴리펩티드가 검정에서 특이적 기질의 양을 감소시키거나, 기능적 자일라나제 폴리펩티드와 기질의 효소적 반응의 생체생성물을 증가시키는지의 여부를 결정하는 것을 포함하는, 임의의 수의 방법들에 의해 자일라나제 생물학적 활성에 대해 검정될 수 있다.
본원에 사용된 "절편"은 2개 이상의 상이한 형태로 존재할 수 있는 천연 발생 단백질의 부분이다. 절편은 천연 발생 단백질과 동일하거나 실질적으로 동일한아미노산 서열을 가질 수 있다. 표현 "실질적으로 동일한"은, 아미노산 서열이 전적으로는 아니나 대체로 동일하고, 그와 관계된 서열의 하나 이상의 기능적 활성을 보유하는 것을 의미한다. 일반적으로, 2개의 아미노산 서열은, 그것들이 85% 이상 동일할 경우에, "실질적으로 동일하거나", "실질적으로 상동성을 가진다". 천연 발생 단백질로서 상이한 3차원 구조를 가지는 절편이 또한 포함된다. 그것의 한 예는, 절단에 의해 변형되어, 상당히 높은 활성을 갖는 성숙 효소를 생성시킬 수 있는 낮은 활성의 프로단백질과 같은 "프로형(pro-form)"의 분자이다.
"하이브리드화"는 핵산 가닥이 염기가 쌍을 지음으로써 상보적 가닥과 연합되는 공정을 가리킨다. 하이브리드화 반응은 당해 서열이 낮은 농도로 존재하고 있는 샘플 내에서도 동정될 수 있도록 민감하고 선택적이어야 한다. 적당하게, 엄격한 조건은 예를 들어 프리하이브리드화 및 하이브리드화 용액 내에서 염 또는 포름아미드의 농도에 의해, 또는 하이브리드화 온도에 의해 정의될 수 있고, 당업계에 공지되어 있다. 특히, 엄격성은 염의 농도를 감소시키고, 포름아미드의 농도를 증가시키거나, 하이브리드화 온도를 승온시킴으로써 증가될 수 있다. 대안적 측면에서, 본 발명의 핵산은 본원에 설명된, 엄격성이 다양한 조건(예컨대, 엄격성이 높거나, 중간이거나, 낮은 조건) 하에서 하이브리드화되는 능력에 의해 정의된다.
예를 들어, 엄격성이 높은 조건 하에서의 하이브리드화는 약 37℃ 내지 42℃에서 약 50% 포름아미드 내에서 일어날 수 있다. 하이브리드화는 약 30℃ 내지 35℃에서 약 35% 내지 25% 포름아미드 내에서 엄격성이 감소된 조건 하에서 일어날 수 있다. 특히, 하이브리드화는 42℃에서의 엄격성이 높은 조건 하에서, 50% 포름아미드, 5X SSPE, 0.3% SDS 및 200 n/ml 전단 및 변성 연어 정자 DNA 내에서 일어날 수 있다. 하이브리드화는 상기 기술한 바와 같은 엄격성이 감소된 조건 하에서, 단 35℃의 감소된 온도에서 35% 포름아미드 내에서 일어날 수 있다. 특별한 수준의 엄격성에 대응하는 온도 범위는, 당해 핵산의 퓨린:피리미딘의 비를 계산하고, 이에 따라 온도를 조정함으로써 더 좁아질 수 있다. 상기 범위 및 조건에서의 다양화는 당업계에 공지되어 있다.
용어 "변이체"는 본 발명의 자일라나제의 생물학적 활성을 여전히 보유하는, 하나 이상의 염기 쌍, 코돈, 인트론, 엑손 또는 아미노산 잔기에서(각기) 변형된 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 가리킨다. 변이체는 예를 들어 에러 프론 PCR, 셔플링, 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이, 어셈블리 PCR, 성적 PCR 돌연변이, 생체내 돌연변이, 카세트 돌연변이, 순환 앙상블 돌연변이, 지수 앙상블 돌연변이, 부위-특이적 돌연변이, 유전자 리어셈블리(예를 들어, GeneReassemblyTM, 예컨대 U.S. 특허 No. 6,537,776 참고), GSSMTM및 그것의 조합 방법을 포함하는 방법과 같은 임의의 수의 방법들에 의해 제조될 수 있다.
표 1 및 표 2는 GSSMTM에 의해 서열 번호 189(서열 번호 190 암호화)을 돌연변이화시킴으로써 수득되는 변이체들을 열거하고 있다 본 발명은 표 1 및 표 2에 표시된 서열들 중 하나 이상 또는 모두를 갖는 핵산, 즉 서열 번호 189의 변이체인 서열을 갖는 핵산 (여기에서, 변이체들은 표 1 및 표 2에 표시되어 있음), 및 이들 변이체에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 제공한다.
(표 1 및 표 2에 나와 있는) 이들 GSSMTM변이체들에게 내열성에 대해 시험하였다 (이하 실시예 참고). 돌연변이체 D, F, G, H,I, J, K, S, T, U, V, W, X, Y, Z, AA, DD 및 EE는 표 1의 돌연변이체들 중 내열성이 가장 높은 것으로 나타났다. 돌연변이체들은 또한 조합되어, 보다 큰 돌연변이를 형성할 수 있다. 예를 들어, 표 1의 돌연변이체 D, F, H,I, S, V, X 및 AA를 조합하여, 서열 번호 375(폴리펩티드 암호화의 핵산) 및 서열 번호 376(아미노산 서열)에서 표시되는 서열을 갖는, "8x"라고 하는 보다 큰 돌연변이체를 형성한다. 도 5는 야생형 서열(서열 번호 189 및190)의 활성을 8x 돌연변이체(서열 번호 259 및 260)와 비교하는 그래프이다. 야생형 및 8x 돌연변이체의 비교 시, 양자의 최적 온도가 65℃이고, 양자의 최적 pH 가 5.5임이 밝혀졌다. 야생형 서열은 65℃에서 1분 미만 동안 안정성을 유지하는 것이 밝혀졌고, 반면 8x 돌연변이체(서열 번호 375 및 376)는 85도에서 10분 초과 동안 안정성을 유지한다는 것이 밝혀졌다. 사용된 기질은 AZO-AZO-자일란이었다. 한 측면에서, 8x 돌연변이체(서열 번호 375 및 376)는 GSSMTM에 의해 진화시켰다. 또 다른 한 측면에서, 야생형은 내열성 진화에 대해 GSSMTM모(parent)이다.
내열성에 있어 "야생형"(서열 번호 189)보다 "향상"되거나 최상으로 변형된 변이체 (서열 번호 189)를 생성시키는, 표 2에 나와 있는 코돈 변이체가 강조되었다. 상기 언급된 바와 같이, 본 발명은 핵산, 및 표 2 및 표1에 표시된 하나, 수개 또는 모두의 변이체들을 포함하고, 상기 핵산을 암호화하는 폴리펩티드를 제공한다.
한 측면에서, B 군 아미노산 서열들 중 아미노산 서열(서열 번호 208)의 아미노산 서열은 단일 아미노산 돌연변이에 의해 변형된다. 한 특정 측면에서, 돌연변이는 아스파라긴의 아스파르트산으로의 돌연변이이다. 수득된 아미노산 서열 및 대응하는 핵산 서열이 서열 번호 252 및 서열 번호 251에 각기 표시되어 있다. 서열 번호 208의 돌연변이와 같이, 효소의 최적 pH 가 향상된 단일 아미노산 돌연변이가 자일라나제에 대해 당업계에 알려져 있다(예컨대, Joshi, M., Sidhu, G., Pot, I., Brayer, G., Withers, S., McIntosh, L., J. Mol. Bio. 299, 255-279 (2000) 참고). 또한 상기 단일 아미노산 돌연변이에서, 서열의 일부를 서브클로닝 공정에서 제거될 수 있는 것으로 나타났다. 예를 들어, 서열 번호 207 및 서열 번호 251 은 서열이 배열된 영역 상에서, 단지 하나의 뉴클레오티드만이 상이하다. 그러나, 서브클로닝에서 서열 번호 207의 N-말단에 있는 78 뉴클레오티드 영역을 서열 번호 251의 N-말단으로부터 제거되는 것으로 나타났다. 부가적으로, 서열 번호 251 내의 첫 번째 3개의 뉴클레오티드를 ATG로 변경시킨 후, 서열 번호 251의 6 번째 뉴클레오티드에서 점돌연변이를 일으켰다.
용어 "포화 돌연변이", "유전자 부위 포화 돌연변이" 또는 "GSSMTM"는, 이하 상세하게 기술되는 바와 같은, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 분해하여, 폴리뉴클레오티드에 점돌연변이를 도입하는 방법을 포함한다.
용어 "최적화 지정 진화 시스템" 또는 "최적화 지정 진화"는 이하 상세하게 설명되는 바와 같은, 관련 핵산 서열, 예컨대 관련 유전자의 절편을 리어셈블링하는 방법을 포함한다.
용어 "합성 접합 리어셈블리" 또는"SLR" 는 이하 상세하게 설명되는 바와 같은, 비-확률론적 양식으로 올리고뉴클레오티드 절편을 접합시키는 방법을 포함한다.
핵산의 생성 및 조작
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는, 발현 벡터와 같은 발현 카세트를 포함하는 핵산(예컨대, 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117, 서열 번호 119, 서열 번호 121, 서열 번호 123, 서열 번호 125, 서열 번호 127, 서열 번호 129, 서열 번호 131, 서열 번호 133, 서열 번호 135, 서열 번호 137, 서열 번호 139, 서열 번호 141, 서열 번호 143, 서열 번호 145, 서열 번호 147, 서열 번호 149, 서열 번호 151, 서열 번호 153, 서열 번호 155, 서열 번호 157, 서열 번호 159, 서열 번호 161, 서열 번호 163, 서열 번호 165, 서열 번호 167, 서열 번호 169, 서열 번호 171, 서열 번호 173, 서열 번호 175, 서열 번호 177, 서열 번호 179, 서열 번호 181, 서열 번호 183, 서열 번호 185, 서열 번호187, 서열 번호 189, 서열 번호 191, 서열 번호 193, 서열 번호 195, 서열 번호 197, 서열 번호 199, 서열 번호 201, 서열 번호 203, 서열 번호 205, 서열 번호 207, 서열 번호 209, 서열 번호 211, 서열 번호 213, 서열 번호 215, 서열 번호 217, 서열 번호 219, 서열 번호 221, 서열 번호 223, 서열 번호 225, 서열 번호 227, 서열 번호 229, 서열 번호 231, 서열 번호 233, 서열 번호 235, 서열 번호 237, 서열 번호 239, 서열 번호 241, 서열 번호 243, 서열 번호 245, 서열 번호 247, 서열 번호 249, 서열 번호 251, 서열 번호 253, 서열 번호 255, 서열 번호 257, 서열 번호 259, 서열 번호 261, 서열 번호 263, 서열 번호 265, 서열 번호 267, 서열 번호 269, 서열 번호 271, 서열 번호 273, 서열 번호 275, 서열 번호 277, 서열 번호 279, 서열 번호 281, 서열 번호 283, 서열 번호 285, 서열 번호 287, 서열 번호 289, 서열 번호 291, 서열 번호 293, 서열 번호 295, 서열 번호 297, 서열 번호 299, 서열 번호 301, 서열 번호 303, 서열 번호 305, 서열 번호 307, 서열 번호 309, 서열 번호 311, 서열 번호 313, 서열 번호 315, 서열 번호 317, 서열 번호 319, 서열 번호 321, 서열 번호 323, 서열 번호 325, 서열 번호 327, 서열 번호 329, 서열 번호 331, 서열 번호 333, 서열 번호 335, 서열 번호 337, 서열 번호 339, 서열 번호 341, 서열 번호 343, 서열 번호 345, 서열 번호 347, 서열 번호 349, 서열 번호 351, 서열 번호 353, 서열 번호 355, 서열 번호 357, 서열 번호 359, 서열 번호 361, 서열 번호 363, 서열 번호 365, 서열 번호 367, 서열 번호 369, 서열 번호 371, 서열 번호 373, 서열 번호 375, 서열 번호 377 또는 서열 번호 379; 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8,10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 48, 서열 번호 50, 서열 번호 52, 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 58, 서열 번호 60, 서열 번호 62, 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108, 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116, 서열 번호 118, 서열 번호 120, 서열 번호 122, 서열 번호 124, 서열 번호 126, 서열 번호 128, 서열 번호 130, 서열 번호 132, 서열 번호 134, 서열 번호 136, 서열 번호 138, 서열 번호 140, 서열 번호 142, 서열 번호 144, 서열 번호 146, 서열 번호 148, 서열 번호 150, 서열 번호 152, 서열 번호 154, 서열 번호 156, 서열 번호 158, 서열 번호160, 서열 번호 162, 서열 번호 164, 서열 번호 166, 서열 번호 168, 서열 번호 170, 서열 번호 172, 서열 번호 174, 서열 번호 176, 서열 번호 178, 서열 번호 180, 서열 번호 182, 서열 번호 184, 서열 번호 186, 서열 번호 188, 서열 번호 190, 서열 번호 192, 서열 번호 194, 서열 번호 196, 서열 번호 198, 서열 번호 200, 서열 번호 202, 서열 번호 204, 서열 번호 206, 서열 번호 208, 서열 번호 210, 서열 번호 212, 서열 번호 214, 서열 번호 216, 서열 번호218, 서열 번호 220, 서열 번호 222, 서열 번호 224, 서열 번호 226, 서열 번호 228, 서열 번호 230, 서열 번호 232, 서열 번호 234, 서열 번호 236, 서열 번호 238, 서열 번호 240, 서열 번호 242, 서열 번호 244, 서열 번호 246, 서열 번호 248, 서열 번호 250, 서열 번호 252, 서열 번호 254, 서열 번호 256, 서열 번호 258, 서열 번호 260, 서열 번호 262, 서열 번호 264, 서열 번호266, 서열 번호 268, 서열 번호 270, 서열 번호 272, 서열 번호 274, 서열 번호 276, 서열 번호 278, 서열 번호 280, 서열 번호 282, 서열 번호 284, 서열 번호 286, 서열 번호 288, 서열 번호 290, 서열 번호 292, 서열 번호 294, 서열 번호 296, 서열 번호 298, 서열 번호 300, 서열 번호 302, 서열 번호 304, 서열 번호 306, 서열 번호 308, 서열 번호 310, 서열 번호 312, 서열 번호 314, 서열 번호 316. 서열 번호 318, 서열 번호 320, 서열 번호 322, 서열 번호 324, 서열 번호 326, 서열 번호 328, 서열 번호 330, 서열 번호 332, 서열 번호 334, 서열 번호 336, 서열 번호 338, 서열 번호 340, 서열 번호 342, 서열 번호 344, 서열 번호 346, 서열 번호 348, 서열 번호 350, 서열 번호 352, 서열 번호 354, 서열 번호 356, 서열 번호 358, 서열 번호 360, 서열 번호 362, 서열 번호 364, 서열 번호 366, 서열 번호 368, 서열 번호 370, 서열 번호 372, 서열 번호 374, 서열 번호 376, 서열 번호 378 또는 서열 번호 380에 표시된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산)을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 이용하여, 새로운 자일라나제 서열을 발견하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 자일라나제 유전자의 발현, 전사, 및 본 발명의 핵산을 이용하는 폴리펩티드를 억제하는 방법을 포함한다. 또한 예컨대 합성 접합리어셈블리, 최적화 지정 진화 시스템 및/또는 포화 돌연변이에 의해, 본 발명의 핵산을 변형시키는 방법도 제공된다.
본 발명의 핵산은 예컨대, cDNA 라이브러리의 클로닝 및 발현, PCR에 의한 메시지 또는 게놈 DNA의 증폭 등에 의해 제조, 분리 및/또는 조작될 수 있다. 예를 들어, 하기 본 발명의 예시적 서열은 하기 원들로부터 초기에 유도되었다:
[표 3]
서열 번호 : 원(source)
1, 2 : 박테리아 원
101, 102 : 환경적 원
103, 104 : 박테리아 원
105, 106 : 환경적 원
107, 108 : 박테리아 원
109, 110 : 환경적 원
11, 12 : 환경적 원
111, 112 : 환경적 원
113, 114 : 환경적 원
115, 116 : 환경적 원
117, 118 : 환경적 원
119, 120 : 환경적 원
121, 122 : 환경적 원
123, 124 : 환경적 원
125, 126 : 환경적 원
127, 128 : 환경적 원
129, 130 : 박테리아 원
13, 14 : 환경적 원
131, 132 : 환경적 원
133, 134 : 환경적 원
135, 136 : 환경적 원
137, 138 : 환경적 원
139, 140 : 환경적 원
141, 142 : 환경적 원
143, 144 : 박테리아 원
145, 146 : 진핵세포 원
147, 148 : 환경적 원
149, 150 : 환경적 원
15, 16 : 환경적 원
151, 152 : 환경적 원
153, 154 : 환경적 원
155, 156 : 환경적 원
157, 158 : 환경적 원
159, 160 : 환경적 원
161, 162 : 환경적 원
163, 164 : 환경적 원
165, 166 : 환경적 원
167, 168 : 환경적 원
169, 170 : 환경적 원
17, 18 : 박테리아 원
171, 172 : 환경적 원
173, 174 : 환경적 원
175, 176 : 환경적 원
177, 178 : 환경적 원
179, 180 : 환경적 원
181, 182 : 환경적 원
183, 184 : 환경적 원
185, 186 : 환경적 원
187, 188 : 환경적 원
189, 190 : 환경적 원
19, 20 : 환경적 원
191, 192 : 환경적 원
193, 194 : 환경적 원
195, 196 : 환경적 원
197, 198 : 환경적 원
199, 200 : 환경적 원
201, 202 : 환경적 원
203, 204 : 환경적 원
205, 206 : 환경적 원
207, 208 : 환경적 원
209, 210 : 환경적 원
21, 22 : 환경적 원
211, 212 : 환경적 원
213, 214 : 환경적 원
215, 216 : 환경적 원
217, 218 : 환경적 원
219, 220 : 환경적 원
221, 222 : 환경적 원
223, 224 : 환경적 원
225, 226 : 환경적 원
227, 228 : 환경적 원
229, 230 : 환경적 원
23, 24 : 환경적 원
231, 232 : 박테리아 원
233, 234 : 환경적 원
235, 236 : 환경적 원
237, 238 : 환경적 원
239, 240 : 환경적 원
241, 242 : 환경적 원
243, 244 : 환경적 원
245, 246 : 환경적 원
247, 248 : 환경적 원
249, 250 : 환경적 원
25, 26 : 환경적 원
251, 252 : 환경적 원
253, 254 : 환경적 원
255, 256 : 환경적 원
257, 258 : 환경적 원
259, 260 : 환경적 원
261, 262 : 환경적 원
263, 264 : 환경적 원
265, 266 : 환경적 원
267, 268 : 박테리아 원
269, 270 : 환경적 원
27, 28 : 환경적 원
271, 272 : 환경적 원
273, 274 : 환경적 원
275, 276 : 환경적 원
277, 278 : 환경적 원
279, 280 : 환경적 원
281, 282 : 환경적 원
283, 284 : 환경적 원
285, 286 : 환경적 원
287, 288 : 환경적 원
289, 290 : 환경적 원
29, 30 : 원시세균 원
291, 292 : 환경적 원
293, 294 : 환경적 원
295, 296 : 환경적 원
297, 298 : 환경적 원
299, 300 : 환경적 원
3, 4 : 환경적 원
301, 302 : 환경적 원
303, 304 : 환경적 원
305, 306 : 박테리아 원
307, 308 : 환경적 원
309, 310 : 환경적 원
31, 32 : 환경적 원
311, 312 : 환경적 원
313, 314 : 박테리아 원
315, 316 : 환경적 원
317, 318 : 환경적 원
319, 320 : 환경적 원
321, 322 : 환경적 원
323, 324 : 환경적 원
325, 326 : 환경적 원
327, 328 : 환경적 원
329, 330 : 환경적 원
33, 34 : 환경적 원
331, 332 : 환경적 원
333, 334 : 환경적 원
335, 336 : 환경적 원
337, 338 : 환경적 원
339, 340 : 환경적 원
341, 342 : 환경적 원
343, 344 : 환경적 원
345, 346 : 환경적 원
347, 348 : 환경적 원
349, 350 : 환경적 원
35, 36 : 환경적 원
351, 352 : 환경적 원
353, 354 : 환경적 원
355, 356 : 환경적 원
357, 358 : 환경적 원
359, 360 : 환경적 원
361, 362 : 환경적 원
363, 364 : 환경적 원
365, 366 : 환경적 원
367, 368 : 환경적 원
369, 370 : 환경적 원
37, 38 : 환경적 원
371, 372 : 환경적 원
373, 374 : 환경적 원
375, 376 : 인공적 원
377, 378 : 인공적 원
39, 40 : 환경적 원
41, 42 : 환경적 원
43, 44 : 환경적 원
45, 46 : 환경적 원
47, 48 : 환경적 원
49, 50 : 환경적 원
5, 6 : 환경적 원
51, 52 : 환경적 원
53, 54 : 박테리아 원
55, 56 : 환경적 원
57, 58 : 환경적 원
59, 60 : 환경적 원
61, 62 : 환경적 원
63, 64 : 환경적 원
65, 66 : 환경적 원
67, 68 : 환경적 원
69, 70 : 환경적 원
7, 8 : 환경적 원
71, 72 : 환경적 원
73, 74 : 환경적 원
75, 76 : 환경적 원
77, 78 : 환경적 원
79, 80 : 환경적 원
81, 82 : 환경적 원
83, 84 : 환경적 원
85, 86 : 박테리아 원
87, 88 : 환경적 원
89, 90 : 박테리아 원
9, 10 : 환경적 원
91, 92 : 환경적 원
93, 94 : 환경적 원
95, 96 : 환경적 원
97, 98 : 환경적 원
99, 100 : 환경적 원
한 측면에서, 본 발명은 환경 원 또는 박테리아 원, 또는 원시세균 원으로부터 유도된다는 공통된 신규성을 갖는 자일라나제를 암호화하는 핵산을 제공한다.
본 발명의 방법을 수행할 때, 상동성 유전자는 본원에 기재된 바와 같이, 주형 핵산을 조작함으로써 변형될 수 있다. 본 발명은 과학 문헌 및 특허 문헌에 잘기재되어 있는, 당업계에 공지된 임의의 방법 또는 프로토콜 또는 장치를 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 한 측면은, A 군 핵산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열, 그것과 상보적인 서열 중 하나, 또는 A 군 핵산 서열(또는 그것과 상보적인 서열)의 서열들 중 하나의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 또는 500개의 연속 염기들을 갖는 절편을 포함하는 분리된 핵산이다. 분리된 핵산은 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함하는 DNA를 포함할 수 있다. DNA는 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있고, 단일 가닥인 경우, 암호화 가닥 또는 비암호화(안티센스) 가닥일 수 있다. 대안적으로, 분리된 핵산은 RNA를 포함할 수 있다.
이하 보다 상세하게 논의되는 바와 같이, A 군 핵산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열 중 하나의 분리된 핵산은, B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티들 중 하나, 또는 B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티드들 중 하나의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 또는 150개의 연속 아미노산들을 포함하는 절편을 제조하는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티드들 중 하나, 또는 B 군 아미노산 서열의 폴리펩티드들 중 하나의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 또는 150개의 연속 아미노산들을 포함하는 절편을 암호화하는 분리된 핵산이다. 이들 핵산의 암호화 서열은 A 군 핵산 서열 또는 그것의 절편의 핵산들 중 하나의 암호화 서열들 중 하나와 동일할 수 있거나, B 군 아미노산 서열, 그것과 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티드들 중 하나, 및 B 군 아미노산 서열의 폴리펩티드들 중 하나의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 또는 150개의 연속 아미노산을 포함하는 절편 중 하나를 암호화하는 상이한 암호화 서열일 수 있으며, 이는 유전 코드의 풍부 또는 퇴화의 결과이다. 유전 코드는 당업자에게 공지되어 있고, 예컨대, [B. Lewin, Genes VI, 옥스포드 대학 출판부(Oxford University Press), 1997]의 제214면에서 수득될 수 있다.
B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티드들 중 하나를 암호화하는 분리된 핵산은, 비제한적으로 하기 것들을 포함할 수 있다: 단지, A 군 핵산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열 중 하나의 암호화 서열 및 부가적 암호화 서열, 예컨대 리더 서열 또는 프로단백질 서열 및 비-암호화 서열, 예컨대 암호화 서열의 인트론 또는 5' 및/또는 3' 비-암호화 서열. 본원에 사용된 용어 "폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드"는 부가적 암호화 및/또는 비-암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 비롯한, 폴리펩티드용 암호화 서열만을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다.
대안적으로, A 군 핵산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열의 핵산 서열은 통상적 기술, 예컨대 부위 지정 돌연변이, 또는 당업자에게 잘 알려진 다른 기술들을 이용하여 돌연변이화하여, A 군 핵산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열의 폴리뉴클레오티드에 침묵 변화를 도입할 수 있다. 본원에 사용된 "침묵 변화"는 예를 들어 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 변형시키지 않는 변화를 포함한다. 그러한 변화는 숙주 유기체에 빈번하게 일어나는 코돈 또는 코돈 쌍을 도입함으로써, 폴리펩티드를 암호화하는 벡터를 함유하는 숙주 세포에 의해 생성되는 폴리펩티드의 수준을 증가시키기 위해 바람직할 수 있다.
본 발명은 또한 B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티드에 있어, 아미노산 치환, 부가, 결실, 융합 및 절단을 가져오는, 뉴클레오티드 변화를 갖는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 그러한 뉴클레오티드 변화는 부위 지정 돌연변이, 무작위 화학적 돌연변이, 엑소뉴클레아제 III 결실 및 기타 재조합 재조합 DNA 기술과 같은 기술들을 이용하여 도입될 수 있다. 대안적으로, 그러한 뉴클레오티드 변화는, 본원에서 제공된 바와 같은 엄격성이 높거나 중간이거나 낮은 조건 하에서, A 군 핵산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열(또는 그것과 상보적인 서열)의 서열들 중 하나의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 또는 500개의 연속 염기들을 포함하는 프로브에 대해 특이적으로 하이브리드화하는 핵산을 동정함으로써 분리되는 천연 발생적 대립유전자형질의 변이체일 수 있다.
일반 기술
본 발명에 사용되는 핵산은, 그것이 RNA, iRNA, 안티센스 핵산, cDNA, 게놈 DNA, 벡터, 바이러스 또는 그것의 하이브리드인지와 상관없이, 유전공학 처리, 증폭 및/또는 발현/재조합 생성되는 각종 원들로부터 분리될 수 있다. 상기 핵산들로부터 생성된 재조합 폴리펩티드(예컨대, 자일라나제)는 개별적으로 분리되거나 클로닝되어, 원하는 활성에 대해 시험한다. 박테리아, 포유동물, 효모, 곤충 또는 식물 세포 발현 시스템을 포함하는 임의의 재조합 발현 시스템이 사용될 수 있다.
대안적으로, 이들 핵산은 예컨대, [Adams(1983) J. Am. Chem. Soc. 105: 661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3440-3444; renkel (1995) Free Radio. Biol. Med. 19: 373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68: 90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68: 109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22: 1859; U.S. 특허 No. 4,458,066]에 기재된 바와 같은 공지된 화학적 합성 기술에 의해 생체외 합성될 수 있다. 예컨대 서브클로닝, 프로브 라벨링(예컨대, 클레노우(Klenow) 폴리머라아제, 닉(nick) 번역, 증폭을 이용하는 무작위-프라이머 라벨링), 시퀀싱, 하이브리드화 등과 같은 핵산의 조작을 위한 기술이 과학 문헌 및 특허 문헌에 잘 기재되어 있으며, 이에 대해 예컨대, [Sambrook 저, MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL(제2판), 제1-3권, Cold Spring Harbor Laboratory (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel 저, John Wiley & Sons, Inc., N.Y. (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, 파트 I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen 저, Elsevier, N.Y. (1993)]를 참고로 한다.
본 발명의 방법을 수행하는데 사용되는 핵산을 수득하여 조작하는 또 다른 유용한 수단은, 게놈 샘플로부터 클로닝하고, 원할 경우 예컨대, 게놈 클론 또는 cDNA 클론으로부터 분리 또는 증폭된 삽입부를 선별하여 재클로닝하는 것이다.
본 발명의 방법에 사용되는 핵산의 원은 예컨대, 포유동물 인공 염색체(MAC)에 함유된 게놈 또는 cDNA 라이브러리(예컨대, U.S. 특허 No. 5,721,118 및 6,025,155를 참고로 함); 인간 인공 염색체(예컨대, Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15: 333-335를 참고로 함); 효모 인공 염색체(YAC); 박테리아 인공 염색체(BAC); P1 인공 염색체(예컨대, Woon (1998) Genomics 50: 306-316를 참고로 함); PI-유도 벡터(PAC)(예컨대, Kern (1997) Biotechniques 23: 120-124를 참고로 함); 코스미드, 재조합 바이러스, 파지 또는 플라스미드를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을, 번역된 폴리펩티드 또는 그것의 절편의 분비를 주도할 수 있는 리더 서열을 이용하여 적당한 상에서 어셈블링한다.
본 발명은 융합 단백질 및 그것을 암호화하는 핵산을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 증가된 안정성 또는 단순화된 정제와 같은 원하는 특성을 부여하는 N-말단 동정 펩티드 등의 이종 펩티드 또는 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드를 또한, 연결되어 있는 하나 이상의 부가적 도메인을 이용하여, 예컨대 더욱 면역원성을 갖는 펩티드를 생성시켜, 재조합 합성된 펩티드를 더욱 용이하게 분리하고, 이로써 항체 및 항체-발현 B 세포 등을 동정함으로써, 융합 단백질로서 합성 및 발현될 수 있다. 탐지 및 정제를 용이하게 하는 도메인은 예를 들어 금속 킬레이트화 펩티드, 예컨대 고정화된 금속 상의 정제를 허용하는 폴리히스티딘 관 및 히스티딘-트립토판 모듈, 고정화된 면역글로불린 상에 정제를 허용하는 단백질 A 도메인, 및 FLAGS 확장/친화성 정제 시스템(Immunex Corp., 미국 워싱턴주 시애틀 소재)에서 이용되는 도메인을 포함한다. 정제 도메인 및 모티브-포함의 펩티드 또는 폴리펩티드 간의 인자 Xa 또는 엔테로키나아제(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)와 같은 절단가능한 링커 서열을 포함한다. 예를 들어, 발현 벡터는 6 개의 히스티딘 잔기에 연결된 동위원소-암호화의 핵산 서열, 및 그 다음에는 티오레독신 및 엔테로키나아제 절단 부위를 포함할 수 있다(예컨대, Williams (1995) Biochemistry 34: 1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12: 404-414을 참고로 한다). 히스티딘 잔기는 탐지 및 정제를 용이하게 하고, 한편 엔테로키나아제 절단 부위는 나머지 융합 단백질로부터 동위 원소를 정제하는 수단을 제공한다. 융합 단백질을 암호화하는 벡터 및 융합 단백질의 적용이 과학 문헌 및 특허 문헌에 잘 기재되어 있으며, 이는 예컨대 [Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12: 441-53]을 참고로 한다.
전사 및 번역 조절 서열
본 발명은 예컨대 프로모터 또는 인핸서와 같은 발현(예컨대, 전사 또는 번역) 조절 서열(들)에 작동적으로 연결되어, RNA 합성/발현을 주도 또는 조절하는 본 발명의 핵산(예컨대, DNA) 서열을 제공한다. 발현 조절 서열은 발현 벡터 내에 있을 수 있다. 발현 조절 서열은 발현 벡터 내에 있을 수 있다. 예시적 박테리아 프로모터는 lacI, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 PR, PL 및 trp 를 포함한다. 예시적 진핵세포 프로모터는 조기 발현 CMV, HSV 티미딘 키나아제, 조기 및 후기 발현 SV40, 레트로바이러스로부터의 LTR 및 마우스 메탈로티오네인 I을 포함한다.
박테리아 내에서 폴리펩티드를 발현하는데 적당한 프로모터는 E. coli lac 또는 trp 프로모터, lacI 프로모터, lacZ 프로모터, T3 프로모터, T7 프로모터,gpt 프로모터, 람다 PR 프로모터, 람다 PL 프로모터, 3-포스포글리세레이트 키나아제(PGK)와 같은 당분해 효소를 암호화하는 오페론으로부터의 프로모터, 및 산 포스파타아제 프로모터를 포함한다. 진핵세포 프로모터는 조기 발현 CMV 프로모터, HSV 티미딘 키나아제 프로모터, 열 쇼크 프로모터, 조기 및 후기 SV40 프로모터, 레트로바이러스로부터의 LTR, 및 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터를 포함한다. 원핵 또는 진핵 세포, 또는 그것의 바이러스 내의 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 다른 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 박테리아 내의 폴리펩티드 또는 그것의 절편을 발현하는데 적당한 프로모터는E. coli lac또는trp프로모터,lacI프로모터,lacZ프로모터,T3프로모터,T7프로모터,gpt프로모터,람다 P R 프로모터,람다 P L 프로모터, 3-포스포글리세레이트 키나아제(PGK)와 같은 당분해 효소를 암호화하는 오페론으로부터의 프로모터, 및 산 포스파타아제 프로모터를 포함한다 진균류 프로모터는 α인자 프로모터를 포함한다. 진핵세포 프로모터는 CMV 조기 발현 프로모터, HSV 티미딘 키나아제 프로모터, 열 쇼크 프로모터, 조기 및 후기 발현 SV40 프로모터, 레트로바이러스로부터의 LTR 및 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터를 포함한다. 원핵 또는 진핵 세포, 또는 그것의 바이러스 내의 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 다른 프로모터도 또한 사용될 수 있다.
조직-특이적 식물 프로모터
본 발명은 조직-특이적 방식으로 발현될 수 있는, 예컨대 조직-특이적 방식으로 본 발명의 자일라나제를 발현할 수 있는 발현 카세트를 제공한다. 본 발명은또한 조직-특이적 방식으로 본 발명의 자일라나제를 발현하는 식물 또는 씨를 제공한다. 조직-특이성은 씨, 줄기, 잎, 뿌리, 과실 등에 대한 특이성일 수 있다.
한 측면에서, 식물의 특정 부분 또는 씨 또는 식물 전체에 통해 발현하는데 CaMV 35S 프로모터와 같은 구성 프로모터를 사용할 수 있다. 예를 들어, 과다발현의 경우, 식물, 예컨대, 재생 식물과 같은 식물의 일부 또는 모든 조직들 내의 핵산의 발현을 주도하는 식물 프로모터 절편을 이용할 수 있다. 그러한 프로모터는 본원에서 "구성" 프로모터를 가리키며, 전개 또는 세포 분화의 대부분의 환경적 조건 및 상태 하에서 활성적이다. 구성 프로모터의 예는 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 전사 개시 영역, 아그로박테리움 투메파시엔의 T-DNA로부터 유도되는 1'- 또는 2'-프로모터, 및 당업자에 공지된 다양한 식물 유전자로부터의 다른 전사 개시 영역을 포함한다. 그러한 유전자는 예컨대, 아라비도프시스 유래의ACT11(Huang (1996)Plant Mol. Biol.33: 125-139);아라비도프시스(Arabidopsis)유래의Cat3(GenBank No. U43147, Zhong (1996)Mol. Gen. Genet.251: 196-203);브라시카 나푸스(Brassica napus)유래의 스테아로일-아실 담체 단백질 변성효소를 암호화하는 유전자(Genbank No. X74782, Solocombe (1994)Plant Physiol.104: 1167-1176); 옥수수 유래의GPcl(GenBank No. X15596; Martinez (1989)J. Mol. Biol.208: 551-565); 옥수수 유래의Gpc2(GenBank No. U45855, Manjunath (1997)Plant Mol. Biol.33: 97-112); U.S. 특허 No. 4,962,028; 5,633,440에 기재되어 있는 식물 프로모터를 포함한다.
본 발명은 예컨대, 토바모바이러스 서브게놈 프로모터를 포함할 수 있는 바이러스로부터 유도된 조직-특이적 또는 구성 프로모터(Kumagai (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1679-1683; 강한 체관부-특이적 리포터 유전자 발현을 유도하는 프로모터를 갖는, 감염된 쌀 식물에서 체관부 세포에서만 복제를 하는 쌀 텅그로 바실러스형 바이러스(RTBV); 혈관 성분, 잎살 세포 및 뿌리끝에서 최고의 활성을 갖는 카사바 엽맥 모자이크 바이러스(CVMV) 프로모터(Verdaguer(1996) Plant Mol. Biol. 31: 1129-1139)를 이용한다.
대안적으로, 식물 프로모터는 특정 조직, 기관 또는 세포 유형에서 자일라나제-발현 핵산을 주도할 수 있고(즉, 조직-특이적 프로모터), 그와 다르게는 더욱 정교한 환경적 또는 전개 조절 하에, 또는 유도성 프로모터의 조절 하에 놓일 수 있다. 전사에 영향을 줄 수 있는 환경적 조건의 예는 혐기성 조건, 승온, 광 존재, 또는 화학물질/호르몬의 분무를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 옥수수 유래의 건조-유도성 프로모터(Busk (1997) 이하 동일); 감자로부터 유도되는 저온, 건조 및 고염분 유도성 프로모터(Kirch (1997) Plant Mol. Biol. 33: 897-909). 을 포함한다.
조직-특이적 프로모터는 조직 내에서 전개 단계의 특정 시간 틀 내에서만 전사를 촉진할 수 있다. 예컨대,아라비도프시스(Arabidopsis)LEAFY 유전자 프로모터를 특징으로 하는 [Blazquez (1998) 식물 세포 10: 791-800]를 참고로 한다. 또한,A. 탈리아나(thaliana)꽃 정체성 결정 유전자 AP1의 프로모터 영역 내의 보존된 서열 모티브를 인식하는 전사 인자 SPL3 를 기재하고 있는 [Cardon (1997)Plant J12: 367-77]; 및 정체성 결정 프로모터 eIF4 를 기재하고 있는 [Mandel(1995) Plant Molecular Biology, Vol. 29, pp 995-1004]를 참고로 한다. 특별한 조직의 수명 사이클 전체에 걸쳐 활성적인 조직 특이적 프로모터를 사용할 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 핵산은 면섬유 세포 내에만 주로 활성적인 프로모터에 작동적으로 연결된다. 한 측면에서, 본 발명의 핵산은 [Rinehart (1996) 이하 동일]에 기재된 바와 같이, 면섬유 세포 신장의 단계 중에 주로 활성적인 프로모터에 작동적으로 연결된다. 핵산은 면섬유 세포(Ibid) 내에서 우선적으로 발현되는 Fbl2A 유전자 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 또한, 면섬유-특이적 프로모터, 유전자이식 면 식물의 구축 방법에 대해 기재하고 있는 [John (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5769-5773; John 등, U.S. 특허 No. 5,608,148 및 5,602,321]을 참고로 한다. 뿌리-특이적 프로모터는 본 발명의 핵산을 발현하는데 사용될 수 있다. 뿌리-특이적 프로모터의 예는, 알코올 탈수소화효소 유전자로부터의 프로모터를 포함한다[DeLisle (1990) Int. Rev. Cytol. 123: 39-60]. 본 발명의 핵산을 발현하는데 사용될 수 있는 다른 프로모터는 예컨대, 난세포-특이적, 배아-특이적, 배적-특이적, 외피-특이적, 씨 코트-특이적 프로모터, 또는 이들의 일부 조합 프로모터; 잎-특이적 프로모터(예컨대, 옥수수 내의 잎-특이적 프로모터에 대해 기재하고 있는 Busk (1997) Plant J. 11: 1285-1295 를 참고함);아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes)로부터의 ORF13 프로모터(뿌리에서 높은 활성을 나타냄, 예컨대 Hansen (1997) 이하 동일 참고); 옥수수 화분 특이적 프로모터(예컨대, Guerrero (1990) Mol. Gen. Genet. 224: 161-168 참고); 과실 노화 및 잎 이탈 및 보다 적은 정도의 꽃 이탈 중에 활성적인 토마토 프로모터(예컨대,Blume (1997) Plant J. 12: 731-746 참고); 감자 SK2 유전자로부터의 암술-특이적 프로모터(예컨대, Ficker (1997) Plant Mol. Biol. 35: 425431 참고); 외래 유전자를 활성적으로 성장하는 신초 또는 섬유의 표피층에 발현시키는 것을 목표로 하는 것을 유용한 도구로 만드는 유전자이식 알팔파의 성장 및 꽃 생장점의 표피 조직에서 활성적인 완두콩으로부터의 Blec4 유전자; 난세포-특이적 BEL1 유전자 (예컨대 Reiser (1995) Cell 83 : 735-742, GenBank No. U39944 참고); 및/또는 분열조직 및/또는 급속 분할 세포에서 높은 전사 수준을 부여할 수 있는 식물 프로모터 영역에 대해 기재하고 있는 Klee의 U.S. 특허 No. 5,589,583의 프로모터를 포함한다.
대안적으로, 옥신과 같은 식물 호르몬에 노출 시에 유도가능한 식물 프로모터를 본 발명의 핵산을 발현하는데 사용한다. 예를 들어, 본 발명은 대두(Glycine max L.) 내의 옥신-반응 원소 E1 프로모터 절편(AuxREs) (Liu (1997) Plant Physiol. 115: 397-407); 옥신-반응성아라비도프시스(Arabidopsis)GST6 프로모터 (또한 살리실산 및 과산화수소에 대해 반응성임) (Chen (1996) Plant J. 10: 955-966); 담배로부터의 옥신-유도성 parC 프로모터 (Sakai (1996) 37: 906-913); 식물 바이오틴 반응성 성분(Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10: 933-937); 및 스트레스 호르몬 아브시스산에 대해 반응성인 프로모터(Sheen (1996) Science 274: 1900-1902)를 사용할 수 있다.
본 발명의 핵산은 또한, 제초제 또는 항생제와 같은 식물에 투여될 수 있는 화학적 시약에 대해 노출 시에 유도될 수 있는 식물 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 벤젠술폰아미드 제초제 완화제에 의해 활성화된 옥수수 In2-2프로모터를 사용할 수 있고(De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38: 568-577); 상이한 제초제 완화제의 적용은 뿌리, 배수조직 및 생장점 분열조직에서의 발현을 포함한 유전자 발현 패턴을 유도한다. 암호화 서열은, 아베나 사티바(Avena sativa) L. (귀리) 아르기닌 데카르복시나아제 유전자를 함유하는 유전자이식 담배 식물과 함께 기재된 바와 같은 예컨대 테트라사이클린-유도성 프로모터 (Masgrau (1997) Plant J. 11: 465-473); 또는 살리실산-반응성 성분 (Stange (1997) Plant J. 11: 1315-1324)의 조절 하에 있을 수 있다. 화학적-유도(예컨대, 호르몬- 또는 살충제-) 프로모터, 즉 당 기술분야에서 유전자이식 식물에 적용될 수 있는 화학 물질에 대해 반응성인 프로모터를 이용하여, 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 식물의 특별한 전개 단계에서 유도할 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 또한 작물의 임의의 전개 단계에서 유도가능하며, 숙주가 옥수수, 쌀, 보리, 밀, 감자 또는 다른 작물들과 같은 식물 종에 제한되지 않는 폴리펩티드를 위한 유도성 유전자 암호화를 갖는 유전자이식 식물을 제공한다.
당업자라면 조직-특이적 식물 프로모터가 표적 조직 외의 조직에서 작동적으로 연결된 서열의 발현을 유도할 수 있음을 인식할 것이다. 이에 따라, 조직-특이적 프로모터는 표적 조직 또는 세포 유형에서 우선적으로 발현을 유도하나, 다른 조직에서도 일부 발현을 초래할 수도 있는 것이다.
본 발명의 핵산은 또한 화학적 시약에 노출 시에 유도가능한 식물 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 이 시약은 예컨대, 유전자이식 식물에 분무되는 등, 그 적용이 가능한 제초제, 합성 옥신 또는 항생제를 포함한다. 본 발명의 자일라나제-생성 핵산의 유도성 발현은 사육자가 최적의 자일라나제 발현 및/또는 활성을 갖는 식물을 선택하도록 한다. 이에 따라, 식물 부분의 전개가 조절될 수 있다. 이러한 식으로, 본 발명은 식물 및 식물 부분의 수확을 용이하게 하는 수단을 제공한다. 예를 들어, 각종 구현예에서, 벤젠술폰아미드 제초제 완화제에 의해 활성화된 옥수수 In2-2 프로모터를 사용할 수 있고(De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38: 568-577) ; 상이한 제초제 완화제의 적용은 뿌리, 배수조직 및 생장점 분열조직에서의 발현을 포함한 유전자 발현 패턴을 유도한다. 암호화 서열은,아베나 사티바(Avena sativa) L.(귀리) 아르기닌 데카르복시나아제 유전자를 함유하는 유전자이식 담배 식물과 함께 기재된 바와 같은 예컨대 테트라사이클린-유도성 프로모터(Masgrau(1997) Plant J. 11: 465-473); 또는 살리실산-반응성 성분(Stange (1997) Plant J. 11: 1315-1324)의 조절 하에 있을 수 있다.
일부 측면에서, 적절한 폴리펩티드 발현은 암호화 영역의 3'-말단에 폴리아데닐화 영역을 요할 수 있다. 폴리아데닐화 영역은 천연 유전자, 다양한 다른 식물(또는 동물 등) 유전자, 또는아그로박테리아(Agrobacterial)T-DNA 내의 유전자로부터 유도될 수 있다.
발현 벡터 및 클로닝 비히클
본 발명은 본 발명의 핵산, 예컨대 본 발명의 자일라나제를 암호화하는 서열을 포함하는 발현 벡터 및 클로닝 비히클을 제공한다. 본 발명의 발현 벡터 및 클로닝 비히클은 바이러스 입자, 바쿨로바이러스, 파지, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 포스미드, 박테리아 인공 염색체, 바이러스 DNA(예컨대, 우두, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 가성 광견병 및 SV40의 유도체), PI-기재의 인공 염색체, 효모 플라스미드, 효모 인공 염색체 및, 당해 특정 숙주에 대해 특이적인 임의의 다른 벡터(예컨대, 바실러스, 아스퍼질러스 및 효모)를 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는, 염색체성, 비-염색체성 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있다. 많은 수의 적당한 벡터가 당업자에게 공지되어 있고, 시중 입수가능하다. 예시적 벡터는 하기 것들을 포함한다: 박테리아: pQE 벡터(Qiagen), pBluescript 플라스미드, pNH 벡터, 람다-ZAP 벡터 (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); 진핵세포: pXTl, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). 그러나, 임의의 다른 플라스미드 또는 다른 벡터가, 그것이 숙주 내에서 복제가능하고 생존가능하다면 사용될 수 있다. 적은 복제 수 또는 큰 복제 수의 벡터를 본 발명에서 사용할 수 있다.
발현 벡터는 프로모터, 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위 및 전사 종결자를 포함할 수 있다. 벡터는 또한 발현 증폭을 위한 적당한 서열을 포함할 수 있다. 포유동물 발현 벡터는 복제 기원, 임의의 필요한 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스(접합) 도너 및 어셉터 부위, 전사 종결 서열 및 5' 측부 비-전사 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, SV40 스플라이스 및 폴리아데닐화 부위로부터 유도된 DNA 서열을 사용하여, 요구되는 비-전사 유전 요소를 제공할 수 있다.
한 측면에서, 발현 벡터는 통상적으로, 벡터를 함유하는 숙주 세포의 선택을 허용하기 위해, 하나 이상 선택가능한 마커 유전자를 함유한다. 그러한 선택가능한 마커는 디히드로폴레이트 환원효소를 암호화하는 유전자, 또는 진핵세포 배양물을위한 네오마이신 내성을 부여하는 유전자, E. coli 내에서 테트라사이클린 또는 암피실린 내성을 부여하는 유전자, 및S. 세레비지아에(cerevisiae)TRP1 유전자를 포함한다. 클로르암페시콜 전달효소(CAT) 벡터 또는 선택가능한 마커를 갖는 다른 벡터를 이용하여, 임의의 원하는 유전자로부터 프로모터 영역을 선택할 수 있다.
진핵세포 내에서 폴리펩티드 또는 그것의 절편을 발현하기 위한 벡터는 또한 발현 수준을 증가시키기 위해 인핸서를 함유할 수 있다. 인핸서는 전사를 증진하기 위해 프로모터 상에 작용하고, 길이가 통상 약 10 내지 약 300 bp인 DNA의 시스-작용 원소이다. 그 예는 복제 기원 bp 100 내지 270의 후측에 있는 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 조기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 후측에 있는 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다.
핵산 서열은 다양한 절차들에 의해 벡터에 삽입될 수 있다. 일반적으로, 서열은 적당한 제한 엔도뉴클레아제로 삽입부 및 벡터를 분해한 후, 벡터 내에 원하는 위치에 접합된다. 대안적으로, 삽입부 및 벡터의 양자 모두의 블런트 말단이 접합될 수 있다. 다양한 클로닝 기술이, 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 Ausubel 및 Sambrook 등에 의해 공지되어 있다. 그러한 절차 및 기타 절차는 당업자의 범주 내에 포함되는 것으로 한다.
벡터는 플라스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태일 수 있다. 다른 벡터는 염색체성, 비-염색체성 및 합성 DNA 서열, SV40의 유도체; 박테리아 플라스미드, 파지 DNA, 바쿨로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드와 파지 DNA의 조합으로부터 유도된 벡터, 바이러스 DNA, 예컨대 우두, 아데노바이러스, 계두 바이러스및 가성 광견병을 포함한다. 원핵 및 진핵 생물계 숙주에 사용하기 위한 다양한 클로닝 및 발현 벡터가 예컨대 Sambrook 에 의해 기재되어 있다.
사용될 수 있는 특별한 박테리아 벡터는, 공지된 클로닝 벡터 pBR322 (ATCC 37017), pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, 스웨덴 우프살라 소재), GEM1 (Promega Biotec, 미국 위스콘신주 매디슨 소재) pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pD10, psiX174 pBluescript II KS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, DR540, pRIT5 (Pharmacia), pKK232-8 및 pCM7 를 포함하는 유전 요소를 포함하는 시중 입수가능한 플라스미드를 포함한다. 특히 진핵세포 벡터는 pSV2CAT, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL(Pharmacia)를 포함한다. 그러나, 임의의 다른 벡터도 숙주 세포 내에서 복제가능하고 생존가능하다면 사용될 수 있다.
본 발명의 핵산은 발현 카세트, 벡터 또는 바이러스 내에서 발현될 수 있고, 식물 세포 및 씨 내에서 안정하게 발현될 수 있다. 한 예시적인 일시 발현 시스템은 유전자부체 발현 시스템, 예컨대 초고도 코일 DNA를 함유하는 유전자부체 미니-염색체의 전사에 의해 핵 내에서 생성된 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV)의 바이러스 RNA 유전자를 이용하며, 이에 대해서는 예컨대, [Covey (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1633-1637]를 참고로 한다. 대안적으로, 암호화 서열, 즉 본 발명의 서열의 모두 또는 서브-절편을, 숙주 염색체 DNA의 일체적 일부가 되는 식물 숙주 세포 게놈에 삽입할 수 있다. 센스 또는 안티센스 전사가 이런 식으로 발현될 수 있다. 본 발명의 핵산으로부터의 서열(예컨대, 프로모터 또는 암호화 영역)을 포함하는 벡터는 식물 세포 또는 씨에 대해 선택가능한 표현형을 부여하는 마커 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 마커는 살생제 내성, 특히 항생 내성, 예컨대 카나마이신, G418, 블레오마이신, 하이그로마이신에 대한 내성, 또는 제초제 내성, 예컨대 클로로술푸론 또는 바스타(Basta)에 대한 내성을 암호화할 수 있다.
식물 내에서 핵산 및 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터가 당업계에 공지되어 있고, 이는, 예컨대아그로박테리움 spp., 감자 바이러스 X(예컨대, Angell (1997) EMBO J. 16: 3675-3684 참고), 담배 모자이크 바이러스(예컨대, Casper (1996) Gene 173: 69-73 참고), 토마토 부쉬 왜화 바이러스(예컨대, Hillman (1989) Virology 169: 42-50 참고), 담배 에취 바이러스(예컨대, Dolja (1997) Virology 234: 243-252참고), 강낭콩 금빛 누른 모자이크 바이러스(예컨대, Morinaga (1993) Microbiol. Immunol. 37: 471-476 참고), 꽃양배추 모자이크 바이러스(예컨대, Cecchini (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10: 1094-1101 참고), 옥수수 Ac/Ds 전위성 성분(예컨대, Rubin (1997) Mol. Cell. Biol. 17: 6294-6302; Kunze (1996) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204: 161-194 참고), 및 옥수수 억제자-변이자(Spm) 전위성 성분(예컨대, Schlappi (1996) Plant Mol. Biol. 32: 717-725 참고); 및 그것들의 유도체로부터의 벡터를 포함할 수 있다.
한 측면에서, 발현 벡터는 두 개의 유기체, 예를 들어 발현을 위한 포유동물 세포 또는 곤충 세포에서, 또한 클로닝 및 증폭을 위한 원핵세포 숙주 내에서 유지될 수 있도록 하는 2 개의 복제 시스템을 가질 수 있다. 또한, 발현 벡터의 일체화를 위해, 발현 벡터는 숙주 세포 게놈에 대해 상동성인 하나 이상의 서열을 가질 수 있다. 그것은 발현 작제물의 측면에 설수 있는 2 개의 상동성 서열을 가질 수 있다. 일체화 벡터는 벡터에 포함되기에 적당한 상동성 서열을 선택함으로써, 숙주 세포 내의 특이적 위치에 지정될 수 있다. 일체화 벡터를 위한 작제물이 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 발현 벡터는 또한 형질변환된 박테리아 균주의 선택을 허용하는 선택가능한 마커 유전자, 예컨대 박테리아가 암피실린, 클로로암페니콜, 에리트로마이신, 카나마이신, 네오마이신 및 테트라사이클린과 같은 약물에 대해 내성을 가질 수 있도록 하는 유전자를 포함할 수 있다. 선택가능한 마커는 또한 생합성 유전자, 예컨대 히스티딘, 트립토판 및 류신 생합성 경로에서의 생합성 유전자를 포함할 수 있다.
발현 벡터 내의 DNA 서열은 적당한 발현 조절 서열(들)(프로모터)에 작동적으로 연결되어, RNA 합성을 주도한다. 특히 박테리아 프로모터라고 하는 것은, lacI, lacZ, T3,T7, gpt, 람다 PR, PL및 trp을 포함한다. 진핵세포 프로모터는 조기 발현 CMV, HSV 티미딘 키나아제, 조기 및 후기 발현 SV40, LTR, 및 마우스 메탈로티오네인 I을 포함한다 적당한 벡터 및 프로모터의 선택은 당업자의 수준 내에 포함된다. 발현 벡터는 또한 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위 및 전자 종결자를 함유한다. 벡터는 또한 발현 증폭을 위해 적당한 서열을 포함할 수 있다. 프로모터 영역은 클로르암페니콜 전달효소(CAT) 벡터, 또는 선택가능한 마커를 갖는 기타 벡터를 이용하여 임의의 원하는 유전자로부터 선택될 수 있다. 게다가, 발현 벡터는 바람직하게 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자를 함유하여, 예컨대 디히드로폴레이트 환원효소, 또는 진핵세포 배양물을 위한 네오마이신 내성, E. coli 내에서의 테트라사이클린 또는 암피실린 내성과 같은, 형질전환된 숙주 세포의 선택을 위한 표현형을 제공한다.
포유동물 발현 벡터는 또한 복제 기원, 임의의 필요한 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 도너 및 어셉터 부위, 전사 종결 서열 및 5' 측부 비-전사 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, SV40 스플라이스 및 폴리아데닐화 부위로부터 유도된 DNA 서열을 사용하여, 요구되는 비-전사 유전 요소를 제공할 수 있다.
진핵세포 내에서 폴리펩티드 또는 그것의 절편을 발현하기 위한 벡터는 또한 발현 수준을 증가시키기 위해 인핸서를 함유할 수 있다. 인핸서는 전사를 증진하기 위해 프로모터 상에 작용하고, 길이가 통상 약 10 내지 약 300 bp인DNA의 시스-작용 원소이다. 그 예는 복제 기원 bp 100 내지 270의 후측에 있는 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 조기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 후측에 있는 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다.
부가적으로, 발현 벡터는 통상적으로 벡터를 함유하는 숙주 세포의 선택을 허용하기 위해, 하나 이상 선택가능한 마커 유전자를 함유한다. 그러한 선택가능한 마커는 디히드로폴레이트 환원효소를 암호화하는 유전자, 또는 진핵세포 배양물을 위한 네오마이신 내성을 부여하는 유전자,E. coli내에서 테트라사이클린 또는 암피실린 내성을 부여하는 유전자, 및 에스. 세레비재 TRP1 유전자를 포함한다.
일부 측면에서, B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티드들 중 하나, 또는 그것의 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 또는150개 연속 아미노산을 포함하는 절편을 암호화하는 핵산을 적당한 상에서 번역된 폴리펩티드 또는 그것의 절편의 분비를 주도할 수 있는 리더 서열과 함께 어셈블링한다. 임의적으로, 핵산은 B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티드들 중 하나, 또는 그것의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 또는 150개 연속 아미노산을 포함하는 절편이 이종 펩티드 또는 폴리펩티드, 예컨대 증가된 안정성 또는 단순화된 정제와 같은 원하는 특성을 부여하는 N-말단 동정 펩티드에 융합된 융합 폴리펩티드를 암호화할 수 있다.
핵산 서열은 다양한 절차들에 의해 벡터에 삽입될 수 있다. 일반적으로, 서열은 적당한 제한 엔도뉴클레아제로 삽입부 및 벡터를 분해한 후, 벡터 내에 원하는 위치에 접합된다.
대안적으로, 삽입부 및 벡터의 양자 모두의 블런트 말단이 접합될 수 있다. 다양한 클로닝 기술이 [Ausubel 등의 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. (1997) 및 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에 공지되어 있다. 그러한 절차 및 기타 절차는 당업자의 범주 내에 포함되는 것으로 한다.
벡터는 예를 들어 플라스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태일 수 있다. 다른 벡터는 염색체성, 비-염색체성 및 합성 DNA 서열, SV40의 유도체; 박테리아플라스미드, 파지 DNA, 바쿨로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드와 파지 DNA의 조합으로부터 유도된 벡터, 바이러스 DNA, 예컨대 우두, 아데노바이러스, 계두 바이러스 및 가성 광견병을 포함한다. 원핵 및 진핵 생물계 숙주에 사용하기 위한 다양한 클로닝 및 발현 벡터가 [Sambrook 등의 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 기재되어 있다.
숙주 세포 및 형질전환된 세포
본 발명은 본 발명의 핵산 서열, 예컨대, 본 발명의 자일라나제 또는 본 발명의 벡터를 암호화하는 서열을 포함하는 형질전환된 세포를 제공한다. 숙주 세포는 당업자에게 잘 알려진 임의의 숙주 세포들일 수 있고, 이는 원핵 세포, 진핵 세포, 예컨대 박테리아 세포, 진균류 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포 또는 식물 세포를 포함한다. 예시적 박테리아 세포는 이. 콜라이(E. coli),스트렙토마이세스(Streptomyces),바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis),살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)및, 슈도모나스(Pseudomonas),스트렙토마이세스(Streptomyces)및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)속에 속하는 각종 종들을 포함한다. 예시적 곤충 세포는 드로소필라(Drosophila) S2및 스포도프테라(Spodoptera) Sf9를 포함한다. 예시적 동물 세포는 CHO, COS 또는 바우스 흑색종(Bowes melanoma) 또는 임의의 마우스 또는 인간 세포주를 포함한다. 적당한 숙주의 선택은 당업자의 역량 내이다. 매우 다양한 고급 식물 종들의 형질전환 기술들이 공지되어 있고, 기술 및 과학 문헌에 기재되어 있다. 이에 대해, 예컨대 [Weising (1988) Ann. Rev. Genet. 22: 421-477; U.S. 특허 No. 5,750,870]를 참고로 한다.
벡터는 형질전환, 트랜스펙션, 형질도입, 바이러스 감염, 유전자 총 또는 Ti-매개 유전자 전달을 포함하는 다양한 기술들 중 임의의 기술을 이용하여 숙주 세포에 도입될 수 있다. 특별한 방법은 인산칼슘 트랜스펙션, DEAE-Dextran 매개 트랜스펙션, 리포펙션 또는 전기천공[Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology (1986)]을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명의 핵산 또는 벡터를 선별을 위한 세포에 도입하여, 후속되는 핵산의 발현에 적당한 방식으로 핵산이 세포에 들어가게 된다. 도입 방법은 대체로 표적 세포 유형에 의해 정해진다. 예시적 방법은 CaPO4석출법, 리포솜 융합, 리포펙션(예컨대, LIPOFECTINTM), 전기천공, 바이러스 감염 등을 포함한다. 후보 핵산은 안정하게 숙주 세포의 게놈으로 일체화될 수 있거나(예를 들어, 레트로바이러스 도입을 이용), 세포질에 일시적으로 또는 안정하게 존재할 수 있다(즉, 표준 조절 서열, 선택 마커 등을 이용하여, 전통적인 플라스미드의 이용을 통해). 많은 약제학적으로 중요한 선별이 인간 또는 모델 포유동물 세포 표적을 필요로 하기 때문에, 그러한 표적을 트랜스펙션할 수 있는 레트로바이러스 벡터를 사용할 수 있다.
적당한 경우, 공학처리된 숙주 세포를, 프로모터의 활성화, 형질변이체의 선택 또는 본 발명의 유전자 증폭에 적당하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양할 수 있다. 적당한 숙주 균주의 형질전환 및 적당한 세포 밀도에 대한 숙주 균주의성질에 따라, 선택된 프로모터는 적당한 수단(예컨대, 온도 이동 또는 화학적 유도)을 이용하여 유도될 수 있고, 세포는 원하는 폴리펩티드 또는 그것의 절편을 생성시키도록 하는 부가적 기간동안 배양될 수 있다.
세포는 원심분리 및 물리적 또는 화학적 수단에 의한 붕괴로써 수득될 수 있고, 이에 수득된 조질의 추출물을 추가 정제를 위해 보유한다. 단백질의 발현을 위해 이용되는 미생물 세포는 냉해동 사이클링, 초음파처리, 기계적 붕괴 또는 세포 분해제의 이용을 포함하는 임의의 통상적인 방법에 의해 붕괴될 수 있다. 그러한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 발현된 폴리펩티드 또는 그것의 절편은 황산암모늄 또는 에탄올 석출, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친수성 크로마토그래피, 히드록시라파타이트 크로마토그래피 및 레시틴 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 폴리펩티드의 형상(configuration)을 완성할 때, 필요한 경우, 단백질 재풀림 단계를 이용할 수 있다. 원할 경우, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 최종 정제 단계를 위해 이용할 수 있다.
숙주 세포 내의 작제물을 통상적 방식으로 이용하여, 재조합 서열에 의해 암호화되는 유전자 산물을 생성할 수 있다. 재조합 생성 절차에서 이용되는 숙주에 따라, 벡터를 함유하는 숙주 세포에 의해 생성되는 폴리펩티드는 글리코실화되거나, 비-글리코실화될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 개시 메티오닌 아미노산 잔기를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
세포-비함유 번역 시스템을 또한 이용하여, 본 발명의 폴리펩티드를 생성시킬 수 있다. 세포-비함유 번역 시스템은 폴리펩티드 또는 그것의 절편을 암호화하는 핵산에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 DNA 작제물로부터 전사된 mRNA를 사용할 수 있다. 일부 측면에서, DNA 작제물은 생체외 전사 반응을 수행하기 전에 선형화될 수 있다. 이어서, 전사된 mRNA를 토끼 망상적혈구 추출물과 같은 적당한 세포-비함유 번역 추출물과 함께 항온처리하여, 원하는 폴리펩티드 또는 그것의 절편을 생성시킨다.
발현 벡터는 하나 이상 선택가능성 마커 유전자를 함유하여, 디히드로폴레이트 환원효소 또는 진핵세포 배양물을 위한 네오마이신 내성,E. coli내에서 테트라사이클린 또는 암피실린 내성과 같은 형질전환된 숙주 세포의 선택을 위한 표현형을 제공할 수 있다.
당해 폴리뉴클레오티드, 예컨대 본 발명의 핵산을 함유하는 숙주 세포를, 프로모터의 활성화, 형질전환체의 선택 또는 유전자의 증폭에 적당하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양할 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에서 이전에 사용된 것들과 동일하고, 이는 당업자에게 명백할 것이다. 이어서, 특이화 효소 활성을 갖는 것으로 동정된 클론을 시퀀싱하여, 증진된 활성을 갖는 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 동정한다.
본 발명은 본 발명의 핵산, 예컨대, 약 100개 이상의 잔기로 된 영역 상에, 핵산 A 군 핵산 서열의 서열에 대해, 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%,62%,63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%,72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%,78%, 79%,80%, 81%, 82%,83%, 84%, 85%,86%, 87%, 88%,89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산(여기에서 서열 상동성은 서열 비교 알고리즘을 이용하는 분석 또는 시각적 조사에 의해 결정됨), 또는 A 군 핵산 서열, 또는 그것의 서브서열에서 표시되는 핵산 서열에 대해 엄격한 조건 하에 하이브리드화하는 핵산을 갖는 벡터를 발현하는 것을 포함하는 세포 내에서의 재조합 자일라나제을 과다발현시키는 방법을 제공한다. 과다발현은 임의의 수단, 예컨대 고활성 프로모터, 디시스트로닉 벡터 또는 벡터의 유전자 증폭을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 핵산은 임의의 생체내 또는 생체외 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 임의의 세포 배양물 시스템을 이용하여, 박테리아, 곤충, 효모, 진균류 또는 포유동물 배양물을 포함하는 재조합 단백질을 발현 또는 과다발현시킬 수 있다. 과다발현은 프로모터, 인핸서, 벡터(예컨대, 레플리콘 벡터, 디시스트로닉 벡터의 이용) (예컨대, Gurtu (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 229: 295-8 참고), 매질, 배양 시스템 등의 적당한 선택에 의해 수행될 수 있다. 한 측면에서, 세포계 내에서, 예컨대 글루타민 합성효소와 같은 선택 마커를 이용하는 유전자 증폭(예컨대, Sanders (1987) Dev. Biol. Stand. 66: 55-63 참고)을 이용하여, 본 발명의 폴리펩티드를 과다발현시킨다.
이러한 접근법에 관한 부가적인 상세한 설명이 공개된 문헌에 나와 있고/있거나, 당업자에게 알려져 있다. 특히 비제한적 예시, 예컨대 공개적으로 입수가능한 문헌은 EP 0659215(WO 9403612 Al) (Nevalainen 등); Lapidot, A., Mechaly, A., Shoham, Y., "바실러스 스테아로써모필러스T-6으로부터의 열안정성 자일라나제의 과다발현 및 단일단계 정제(Overexpression and single-step purification of a thermostable Xylanase fromBacillus stearothermophilusT-6)", J. Biotechnol. Nov 51: 259-64(1996); Luthi, E., Jasmat, N. B., Bergquist, P.L., "매우 호열성인칼도셀럼 사카로라이티쿰으로부터의 자일라나제(Xylanase from the extremely thermophilic bacteriumCaldocellum saccharolyticum):에쉐리키아 콜라이내의 유전자의 과다발현 및 유전자 산물의 특성화(overexpression of the gene inEscherichia coliand characterization of the gene product)", Appl. Environ. Microbiol. Sep 56: 2677-83(1990); 및 Sung, W.L., Luk, C.K., Zahab, D.M., Wakarchuk, W., "바실러스 섭틸리스의 과다발현 및에쉐리키아 콜라이내의 서큘란스 자일라나제(Overexpression of theBacillus subtilisandcirculansXylanase inEscherichia coli)", Protein Expr. Purif. Jun 4: 200-6 (1993)"]을 포함하며, 단 이 참고문헌들은 본원의 본 발명에 따른 효소를 교시하고 있지 않다.
숙주 세포는 원핵 세포, 진핵 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포 또는 식물 세포를 포함하는 당업자에게 자명한 임의의 숙주 세포일 수 있다. 적당한 숙주의 전형적인 예로서, 박테리아 세포, 예컨대E. coli, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)및,슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces)및스타필로코쿠스(Staphylococcus)속에 속하는 각종 종들, 진균류 세포, 예컨대 효모, 곤충 세포, 예컨대드로소필라(Drosophila) S2및스포도프테라(Spodoptera) Sf9, 동물 세포, 예컨대 CHO, COS 또는 바우스 흑색종 및 아데노바이러스를 들 수 있다. 적당한 숙주의 선택은 당업자의 역량 내에 속한다.
벡터는 형질전환, 트랜스펙션, 형질도입, 바이러스 감염, 유전자 총 또는 Ti-매개 유전자 전달을 포함하는 다양한 기술들 중 임의의 기술을 이용하여 숙주 세포에 도입될 수 있다. 특별한 방법은 인산칼슘 트랜스펙션, DEAE-Dextran 매개 트랜스펙션, 리포펙션 또는 전기천공[Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology (1986)]을 포함한다.
적당한 경우, 공학처리된 숙주 세포를, 프로모터의 활성화, 형질변이체의 선택 또는 본 발명의 유전자 증폭에 적당하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양할 수 있다. 적당한 숙주 균주의 형질전환 및 적당한 세포 밀도에 대한 숙주 균주의 성질에 따라, 선택된 프로모터는 적당한 수단(예컨대, 온도 이동 또는 화학적 유도)을 이용하여 유도될 수 있고, 세포는 원하는 폴리펩티드 또는 그것의 절편을 생성시키도록 하는 부가적 기간동안 배양될 수 있다.
세포는 원심분리 및 물리적 또는 화학적 수단에 의한 붕괴로써 수득될 수 있고, 이에 수득된 조질의 추출물을 추가 정제를 위해 보유한다. 단백질의 발현을 위해 이용되는 미생물 세포는 냉해동 사이클링, 초음파처리, 기계적 붕괴 또는 세포 분해제의 이용을 포함하는 임의의 통상적인 방법에 의해 붕괴될 수 있다. 그러한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 발현된 폴리펩티드 또는 그것의 절편은 황산암모늄 또는 에탄올 석출, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친수성 크로마토그래피, 히드록시라파타이트 크로마토그래피 및 레시틴 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 폴리펩티드의 형상(configuration)을 완성할 때, 필요한 경우, 단백질 재풀림 단계를 이용할 수 있다. 원할 경우, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 최종 정제 단계를 위해 이용할 수 있다.
각종 포유동물 세포 배양 시스템을 또한 이용하여, 재조합 단백질을 발현시킬 수 있다. 포유동물 발현 시스템의 예는 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 세포주 [Gluzman 기재, Cell, 23: 175 (1981)] 및 상용가능한 벡터로부터 단백질을 발현시킬 수 있는 기타 세포주, 예컨대 C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주를 포함한다.
숙주 세포 내의 작제물을 통상적 방식으로 이용하여, 재조합 서열에 의해 암호화되는 유전자 산물을 생성할 수 있다. 재조합 생성 절차에서 이용되는 숙주에 따라, 벡터를 함유하는 숙주 세포에 의해 생성되는 폴리펩티드는 글리코실화되거나, 비-글리코실화될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 개시 메티오닌 아미노산 잔기를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
대안적으로, B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티드, 또는 그것의 적어도5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 또는 150개의 연속 아미노산들을 포함하는 절편을 통상적인 펩티드 합성기로써 합성 제조할 수 있다. 다른 측면에서, 폴리펩티드의 절편 또는 부분을 이용하여, 펩티드 합성에 의해 대응하는 전장 폴리펩티드를 생성시킬 수 있으므로, 절편을 전장 폴리펩티드의 제조를 위한 중간체로서 이용할 수 있다.
폴리펩티드를 암호화하는 핵산 또는 그것의 절편에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 DNA 작제물로부터 전사된 mRNA를 이용하여, B 군 아미노산 서열 및 그것과 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티드, 또는 그것의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 또는 150개의 연속 아미노산을 포함하는 절편 중 하나를 생성시키기 위해, 세포-비함유 번역 시스템을 또한 이용할 수 있다. 한 측면에서, DNA 작제물은 생체외 전사 반응을 수행하기 전에 선형화될 수 있다. 이어서, 전사된 mRNA를 토끼 망상적혈구 추출물과 같은 적당한 세포-비함유 번역 추출물과 함께 항온처리하여, 원하는 폴리펩티드 또는 그것의 절편을 생성시킨다.
핵산의 증폭
본 발명의 실행에 있어서, 본 발명의 핵산 및 본 발명의 자일라나제를 암호화하는 핵산, 또는 본 발명의 변형 핵산은 증폭에 의해 복제될 수 있다. 증폭은 본 발명의 핵산의 클로닝 또는 변형을 위해서도 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 본 발명의 핵산의 증폭을 위한 증폭용 프라이머 서열 쌍을 제공한다. 당 업계의 숙련자라면 일부 또는 전장의 이러한 서열을 위한 증폭용 프라이머 서열 상을 고안할 수 있다.
하나의 태양에 있어서, 본 발명은 본 발명의 프라이머쌍, 예를 들어 본 발명의 핵산의 대략 첫번째의 (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 잔기, 및 상보성 가닥의 대략 첫번째의 (5') 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 잔기에 의해 나타내어지는 프라이머쌍에 의해 증폭되는 핵산을 제공한다.
본 발명은 자일라나제 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 증폭시키기 위한 증폭용 프라이머 서열 쌍을 제공하는데, 이 프라이머쌍은 본 발명의 서열, 또는 그의 단편 또는 서브서열을 포함하는 핵산을 증폭시킬 수 있다. 증폭용 프라이머 서열 쌍 중 하나 또는 그의 각각의 구성원은 이 서열의 적어도 약 10 내지 50개의 연속 염기, 또는 이 서열의 약 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 연속 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명은 본 발명의 핵산의 대략 첫번째 (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 잔기에 의해 나타내어지는 서열을 가지는 제1 구성원과, 제1 구성원의 상보성 가닥의 대략 첫번째의 (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 잔기에 의해 나타내어지는 서열을 가지는 제2 구성원을 포함하는 증폭용 프라이머쌍을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 증폭용 프라이머쌍을 이용한 증폭, 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 생성되는 자일라나제를 제공한다. 본 발명은 본 발명의 증폭용 프라이머쌍을 사용한 증폭, 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의한 자일라나제의 제조 방법을 제공한다. 하나의 태양에 있어서, 증폭용 프라이머쌍은 라이브러리, 에를 들어 유전자 라이브러리, 예를 들어 환경적 라이브러리로부터 핵산을 증폭시킨다.
증폭 반응은 샘플 중 핵산의 양 (예를 들어 세포 샘플 중 메시지의 양)의 정량화, 핵산의 표지 (예를 들어 핵산을 어레이 또는 블롯에 적용하기 위한 것임),핵산의 검출, 또는 샘플 중 특정 핵산의 양의 정량화를 위하여 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 하나의 태양에 있어서, 세포 또는 cDNA 라이브러리로부터 단리되는 메시지를 증폭시킨다.
숙련자라면 적합한 올리고뉴클레오티드 증폭용 프라이머를 선택 및 고안할 수 있다. 증폭 방법은 또한 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응, PCR (예를 들어 문헌[PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990)] 및 문헌[PCR STRATEGIES (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y.] 참조), 리가제 연쇄 반응 (ligase chain reaction, LCR) (예를 들어 문헌[Wu (1989) Genomics 4: 560]; 문헌[Landegren (1988) Science 241: 1077]; 문헌[Barringer (1990) Gene 89: 117] 참조); 전사 증폭법 (예를 들어 문헌[Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173] 참조); 및 자가-지속성 (self-sustained) 서열 복제법 (예를 들어 문헌[Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874] 참조); Q Beta 레플리카제 증폭법 (예를 들어 문헌[Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35: 1477-1491] 참조), 자동화 Q-베타 레플리카제 증폭 분석법 (예를 들어 문헌[Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10: 257-271] 참조) 및 기타 RNA 폴리머라제 매개 기술 (예를 들어 NASBA (Cangene, 미국 온타리오주 미시사우가 소재) 참조; 또한 문헌[Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 307-316]; 문헌[Sambrook]; 문헌[Ausubel]; 미국 특허 제4,683,195호 및 동 제4,683,202호; 문헌[Sooknanan (1995) Biotechnology 13: 563-564]을 참조)을 포함한다.
서열 동일성 정도의 결정
본 발명은 본 발명의 예시적 핵산 (예를 들어 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117, 서열 번호 119, 서열 번호 121, 서열 번호 123, 서열 번호 125, 서열 번호 127, 서열 번호 129, 서열 번호 131, 서열 번호 133, 서열 번호 135, 서열 번호 137, 서열 번호 139, 서열 번호 141, 서열 번호 143, 서열 번호 145, 서열 번호 147, 서열 번호 149, 서열 번호 151, 서열 번호 153, 서열 번호 155, 서열 번호 157, 서열 번호 199, 서열 번호 161, 서열 번호 163, 서열 번호 165, 서열 번호 167, 서열 번호 169, 서열 번호 171, 서열 번호 173, 서열 번호 175, 서열 번호 177, 서열 번호 179, 서열 번호 181, 서열 번호 183, 서열 번호 185, 서열 번호 187, 서열 번호 189, 서열 번호 191, 서열 번호 193, 서열 번호 195, 서열 번호 197, 서열 번호 199, 서열 번호 201, 서열 번호 203, 서열 번호 205, 서열 번호 207, 서열 번호 209, 서열 번호 211, 서열 번호 213, 서열 번호 215, 서열 번호 217, 서열 번호 219, 서열 번호 221, 서열 번호 223, 서열 번호 225, 서열 번호 227, 서열 번호 229, 서열 번호 231, 서열 번호 233, 서열 번호 235, 서열 번호 237, 서열 번호 239, 서열 번호 241, 서열 번호 243, 서열 번호 245, 서열 번호 247, 서열 번호 249, 서열 번호 251, 서열 번호 253, 서열 번호 255, 서열 번호 257, 서열 번호 259, 서열 번호 261, 서열 번호 263, 서열 번호 265, 서열 번호 267, 서열 번호 269, 서열 번호 271, 서열 번호 273, 서열 번호 275, 서열 번호 277, 서열 번호 279, 서열 번호 281, 서열 번호 283, 서열 번호 285, 서열 번호 287, 서열 번호 289, 서열 번호 291, 서열 번호 293, 서열 번호 295, 서열 번호 297, 서열 번호 299, 서열 번호 301, 서열 번호 303, 서열 번호 305, 서열 번호 307, 서열 번호 309, 서열 번호 311, 서열 번호 313, 서열 번호 315, 서열 번호 317, 서열 번호 319, 서열 번호 321, 서열 번호 323, 서열 번호 325, 서열 번호 327, 서열 번호 329, 서열 번호 331, 서열 번호 333, 서열 번호 335, 서열 번호 337, 서열 번호 339, 서열 번호 341, 서열 번호 343, 서열 번호 345, 서열 번호 347, 서열 번호 349, 서열 번호 351, 서열 번호 353, 서열 번호 355, 서열 번호 357, 서열 번호 359, 서열 번호 361, 서열 번호 363, 서열 번호 365, 서열 번호 367, 서열 번호 369, 서열 번호 371, 서열 번호 373, 서열 번호 375, 서열 번호 377 또는 서열 번호 379)에 대하여 적어도 약 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450,500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550개 이상의 잔기의 영역에 걸쳐 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그보다 큰, 또는 완전한 (100%) 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 예시적 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그보다 큰, 또는 완전한 (100%) 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 서열 동일성의 정도 (상동성)는 본 명세서에 기술된 것을 비롯한 디폴트 파라미터를 가지는 BLAST 2.2.2 또는 FASTA 버전 3.Ot78을 포함하는 임의의 컴퓨터 프로그램 및 관련 파라미터를 사용하여 결정할 수 있다.
본 핵산 서열은 "그룹 A"의 핵산 서열로도 칭해지며, 이는 그에 실질적으로 동일한 서열과, 그룹 A의 핵산 서열에 상동성인 서열 및 그의 단편과 전술한 서열 모두에 상보성인 서열을 포함한다. 본 발명의 핵산 서열은 본 발명의 예시적 서열의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 또는 500개의 연속 뉴클레오티드 (예를 들어 그룹 A의 핵산 서열)와 그에 실질적으로 동일한 서열을 포함할 수 있다. 그룹 A의 핵산 서열의 상동성 서열 및 단편과 그에 실질적으로 동일한 서열은 이 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50%의 상동성을 가지는 서열을 나타낸다. 상동성은 디폴트 파라미터를 가지는 FASTA 버전 3.Ot78을 비롯한 본 명세서에 기술된 컴퓨터 프로그램 및 파라미터 중 임의의 것을 사용하여 결정할 수 있다. 상동성 서열은 그룹 A의 핵산 서열에 나타낸 핵산 서열 중 우리딘이 티민을 대체한 RNA 서열도 포함한다. 상동성 서열은 본 명세서에 기술된 임의의 절차의 사용에 의해 수득될 수 있거나 서열 결정 오류의 보정에 의해 생길 수 있다. 그룹 A의 핵산 서열에 나타낸 핵산 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열이 전통적인 1문자 포맷 (문헌[Stryer, Lubert. Biochemistry, 3rd Ed., W. H Freeman & Co., New York.]의 뒤쪽 겉면 안쪽을 참조) 또는 뉴클레오티드의 실체(identity)를 서열로 기록하는 임의의 다른 포맷으로 표시될 수 있음을 알아야 한다.
본 특허 명세서의 다른 곳에서 확인되는 다양한 서열 비교 프로그램이 본 발명의 이러한 태양에서의 사용을 위하여 특별히 고려된다. 단백질 및/또는 핵산 서열 상동성은 당 업계에 공지된 다양한 서열 비교 알고리즘 및 프로그램 중 임의의 것을 사용하여 평가할 수 있다. 이러한 알고리즘 및 프로그램은 TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA 및 CLUSTALW를 포함하지만 그에 한정되는 것은 전혀 아니다 (문헌[Pearson and Lipman, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 85 (8): 2444-2448, 1988]; 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (3): 403-410, 1990]; 문헌[Thompson et al.. Nucleic Acids Res. 22 (2): 4673-4680, 1994]; 문헌[Higgins et al.,Methods Enzymol. 266:383-402, 1996]; 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (3): 403-410, 1990]; 문헌[Altschul et al., Nature Genetics 3: 266-272, 1993]).
상동성 또는 동일성은 서열 분석 소프트웨어 (예를 들어 Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 미국 53705 위스콘신주 매디슨 유니버시티 애비뉴 1710)의 사용에 의해 종종 측정된다. 이러한 소프트웨어는 다양한 결실, 치환 및 기타 변형에 대하여 상동성의 정도를 지정함으로써 유사한 서열을 매치시킨다. 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 정황에서 "상동성" 및 "동일성"이라는 용어는 임의의 갯수의 서열 비교 알고리즘을 사용하거나 수동 배열 및 육안 검사에 의해 측정되는 명시된 영역 또는 비교 창에서의 최대 상응성에 대한 비교 및 배열시 명기된 퍼센트의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 가지거나 동일한 2개 이상의 서열 또는 서브서열을 나타낸다.
서열 비교에 있어서, 일반적으로 하나의 서열이 시험 서열이 비교되는 참조 서열로 작용한다. 서열 비교 알고리즘의 사용시 시험 및 참조 서열이 컴퓨터에 입력되며, 필요할 경우 서브서열 동등물 (coordinate)이 지정되며 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터가 이용될 수 있거나, 대안적인 파라미터가 지정될 수 있다. 이어서 서열 비교 알고리즘에 의해 프로그램 파라미터에 기초하여 참조 서열에 대한 시험 서열의 서열 동일성 퍼센트가 계산된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "비교 창"은 20 내지 600, 일반적으로는 약 50 내지 약 200, 더 일반적으로는 약 100 내지 약 150으로 구성된 군으로부터 선택되는 연속 위치의 갯수 중 임의의 하나의 절편에 대한 참조를 포함하는데, 여기서 서열은 2개의 서열을 최적으로 배열한 후 동일한 갯수의 연속 위치의 참조 서열과 비교할 수 있다. 비교를 위한 서열 배열 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 최적의 서열 배열은 예를 들어 문헌[Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981]의 국소적 상동성 알고리즘, 문헌[Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol 48:443, 1970]의 상동성 배열 알고리즘, 문헌[person & Lipman, Proc. Nafl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988]의 유사성 탐색 방법, 이러한 알고리즘의 컴퓨터화 도구 (Wisconsin Genetics Software Package의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 닥터. 575), 또는 수동 배열 및 육안 검사에 의해 행해질 수 있다. 다른 상동성 또는 동일성 결정 알고리즘은 예를 들어 BLAST 프로그램 (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information) 외에도, ALIGN, AMAS (Analysis of Multiply Aligned Sequences), AMPS (Protein Multiple Sequence Alignment), ASSET (Aligned Segment Statistical Evaluation Tool), BANDS, BESTSCOR, BIOSCAN (Biological Sequence Comparative Analysis Node), BLIMPS (BLocks IMProved Searcher), FASTA, Intervals & Points, BMB, CLUSTAL V, CLUSTAL W. CONSENSUS, LCONSENSUS, WCONSENSUS, Smith-Waterman 알고리즘, DARWIN, Las Vegas 알고리즘, FNAT (Forced Nucleotide Alignment Tool), Framealign, Framesearch, DYNAMIC,FILTER, FSAP (Fristensky Sequence Analysis Package), GAP (Global Alignment Program), GENAL, GIBBS, GenQuest, ISSC (Sensitive Sequence Comparison), LALIGN (Local Sequence Alignment), LCP (Local Content Program), MACAW (Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench), MAP (Multiple Alignment Program), MBLKP, MBLKN, PEVA (Pattern-Induced Multi-sequence Alignment), SAGA (Sequence Alignment by Genetic Algorithm) 및 WHAT-IF를 포함한다. 이러한 배열 프로그램은 게놈 데이터베이스를 스크리닝하여 실질적으로 동일한 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열을 확인하는 데에도 사용될 수 있다. 다수의 게놈 데이터베이스가 이용가능한데, 예를 들어 인간 게놈의 상당한 부분이 인간 게놈 서열 결정 프로젝트 (Human Genome Sequencing Project)의 일부로 이용가능하다(J. Roach, http://weber.u.Washington.edu/~roach/human_genome_progress 2.html) (Gibbs, 1995). 예를 들어 엠. 게니탈리움 (M genitalium) (Fraser et al., 1995), 엠, 잔나쉬이 (M. jannaschii) (Bult et al., 1996), 에이치. 인플루엔자에 (H. influenzae) (Fleischmann et aL, 1995), 이. 콜라이 (E. coli) (Blattner et al., 1997) 및 효소 (에스. 세레비지아에 (S. cerevisiae)) (Mewes et al., 1997) 및 디. 멜라노가스터 (D. melanogaster) (Adams et al., 2000)를 비롯한 적어도 21개의 다른 게놈이 이미 서열 결정되었다. 모델 유기체, 예를 들어 생쥐, 씨. 엘레간스 (C. elegans) 및 아라비돕시스 (Arabadopsis) sp.의 게놈의 서열 결정도 상당히 진행되었다. 일부 기능 상의 정보가 주석으로 달린 게놈 정보를 포함하는 여러 데이터베이스가 상이한 조직에 의해 유지되며 인터넷을 통하여 접근가능하다.
유용한 알고리즘의 일례로는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이 있는데 이는 문헌[Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977] 및 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990]에 각각 기술되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information을 통하여 공식적으로 이용가능하다. 이러한 알고리즘은, 먼저 쿼리 (query) 서열에 있어서의 길이 W의 짧은 워드 (word)의 확인에 의해 고 스코어링 서열 쌍 (high scoring sequence pairs, HSPs)를 확인하는 것을 포함하는데, 상기 HSP는 데이터베이스 서열에 있어서 동일 길이의 워드와 배열될 경우 일부 양의 값의 역 (threshold) 스코어 T에 매치되거나 상기 T를 만족시킨다. T는 근접한 워드 스코어 역으로 칭해진다 (문헌[Altschul et al., supra]). 이러한 초기 근접 워드 히트 (hit)는 그를 포함하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 탐색을 시작하기 위한 종자 (seed)로 작용한다. 워드 히트는 누적 배열 스코어가 증가될 수 있게 하는 한 각각의 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 누적 스코어는 뉴클레오티드 서열에 있어서 파라미터 M (매칭 잔기의 쌍의 보상 (reward) 스코어; 항상 >0)을 사용하여 계산한다. 아미노산 서열에 있어서, 스코어링 매트릭스를 사용하여 누적 스코어를 계산한다. 각 방향으로의 워드 히트의 연장은, 누적 배열 스코어가 그의 최대 성취 값으로부터 양 X만큼 감소될 경우; 하나 이상의 음의 스코어링의 잔기 배열의 축적으로 인하여 누적 스코어가 0 이하로 될 경우; 또는 어느 하나의 서열의 말단에 도달될 경우 정지된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 이 배열의 민감성 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열의 경우)에서는 디폴트로서 11의 워드길이 (W), 10의 기대치 (E), M=5, N=-4 및 양 가닥의 비교가 이용된다. 아미노산 서열에 있어서, BLASTP 프로그램에서는 디폴트로서 3의 워드길이 및 10의 기대치 (E), BLOSUM62 스코어링 매트릭스 (문헌[Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989] 참조), 50의 배열 (B), 10의 기대치 (E), M=5, N= -4 및 양 가닥의 비교가 이용된다.
BLAST 알고리즘은 또한 두 서열간의 유사성의 통계학적 분석을 수행한다 (예를 들어 문헌[Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873, 1993] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 하나의 유사성 측도는 가장 작은 합의 확률 (P (N))인데, 이는 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열간의 매치가 우연히 일어날 확률을 나타낸다. 예를 들어 시험 핵산의 참조 핵산과의 비교에 있어서 가장 작은 합의 확률이 약 0.2 미만, 더 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만일 경우 핵산은 참조 서열에 유사한 것으로 생각된다.
하나의 태양에 있어서, 단백질 및 핵산 서열의 상동성은 Basic Local Alignment Search Tool ("BLAST")를 사용하여 평가한다. 특히 5가지의 특정 BLAST 프로그램을 사용하여 하기 과제를 수행한다:
(1) BLASTP 및 BLAST3은 단백질 서열 데이터베이스에 대하여 아미노산 쿼리 서열을 비교하며;
(2) BLASTN은 뉴클레오티드 서열 데이터베이스에 대하여 뉴클레오티드 쿼리 서열을 비교하며;
(3) BLASTX는 단백질 서열 데이터베이스에 대하여 쿼리 뉴클레오티드 서열 (양 가닥)의 6개의 프레임의 개념의 번역 산물을 비교하며;
(4) TBLASTN은 모든 6개의 판독 프레임에서 번역되는 (양 가닥) 뉴클레오티드 서열에 대하여 쿼리 단백질 서열을 비교하며;
(5) TBLASTX는 뉴클레오티드 서열 데이터베이스의 6개의 프레임의 번역에 대하여 뉴클레오티드 쿼리 서열의 6개의 프레임의 번역을 비교한다.
BLAST 프로그램에 의해 쿼리 아미노산 또는 핵산 서열과 바람직하게는 단백질 또는 핵산 서열 데이터베이스로부터 획득되는 시험 서열 사이의, 본 명세서에서 "높은 스코어링의 절편 쌍"으로 칭해지는 유사한 절편의 확인에 의해 상동성 서열을 확인한다. 높은 스코어링의 절편 쌍은 바람직하게는 스코어링 매트릭스에 의해 확인되는데 (즉, 배열됨), 이들 중 다수는 당 업계에 공지되어 있다. 바람직하게는, 사용되는 스코어링 매트릭스는 BLOSLTM62 매트릭스 (문헌[Gonnet et al., Science 256:1443-1445, 1992]; 문헌[Henikoff and Henikoff, Proteins 17:49-61, 1993])이다. 덜 바람직하게는 PAM 또는 PAM250 매트릭스도 사용될 수 있다 (예를 들어 문헌[Schwartz and Dayhoff, eds., 1978, Matricesfor Detecting Distance Relationships: Atlas ofProtein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation] 참조). BLAST 프로그램은 미국 국립 의학 도서관 (U.S. National Library of Medicine)을 통하여 접근가능하다.
상기 알고리즘에 사용되는 파라미터는 연구되는 서열의 길이 및 상동성의 정도에 따라 수정될 수 있다. 일부 태양에 있어서, 파라미터는 사용자의 지시의 부재 하에서 알고리즘에 의해 사용되는 디폴트 파라미터일 수 있다.
컴퓨터 시스템 및 컴퓨터 프로그램 제품
컴퓨터 상에서 (in silico) 서열 동일성, 구조적 상동성, 모티프 등을 결정 및 확인하기 위하여 본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 컴퓨터에 의해 판독 및 접근될 수 있는 임의의 매체 상에서 저장, 기록 및 조작할 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 핵산 및 폴리펩티드 서열이 기록되거나 저장된 컴퓨터, 컴퓨터 시스템, 컴퓨터 판독가능한 매체, 컴퓨터 프로그램 제품 등을 제공한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "기록되는" 및 "저장되는"이라는 용어는 컴퓨터 매체 상에 정보를 저장하는 프로세스를 나타낸다. 숙련자라면 컴퓨터 판독가능한 매체 상에 정보를 기록하는 임의의 공지된 방법을 손쉽게 수정하여 본 발명의 핵산 및/또는 폴리펩티드 서열 중 하나 이상을 포함하는 제품을 생성할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 그룹 B의 아미노산 서열의 폴리펩티드 서열, 본 발명의 예시적 서열, 및 그에 실질적으로 동일한 서열과, 전술한 서열 중 임의의 서열의 단편을 포함한다. 실질적으로 동일하거나 상동성인 폴리펩티드 서열은 본 발명의 예시적 서열, 예를 들어 그룹 B의 아미노산 서열의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그보다 큰, 또는 완전한 (100%) 서열 동일성을가지는 폴리펩티드 서열을 나타낸다.
상동성은 디폴트 파라미터 또는 임의의 수정된 파라미터를 포함하는 FASTA 버전 3.Ot78을 비롯하여 본 명세서에 기술된 컴퓨터 프로그램 및 파라미터 중 임의의 것을 사용하여 결정할 수 있다. 상동성 서열은 본 명세서에 기술된 절차 중 임의의 것을 사용하여 수득될 수 있거나 서열 결정 오류의 보정으로부터 생길 수 있다. 본 폴리펩티드 단편은 그룹 B의 아미노산 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티드의 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500개 또는 그보다 많은 연속 아미노산을 포함한다. 그룹 B의 아미노산 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열에 나타낸 폴리펩티드 암호는 전통적인 1문자 포맷 또는 3문자 포맷 (문헌[Stryer, Lubert. Biochemisqy, 3rd Ed., W. H Freeman & Co., New York.]의 뒤쪽 겉면 안쪽을 참조) 또는 서열 형태의 폴리펩티드의 신원과 관련된 임의의 다른 포맷으로 표시될 수 있다.
본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드 서열은 컴퓨터에 의해 판독 및 접근될 수 있는 임의의 매체 상에서 저장, 기록 및 조작될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "기록되는" 및 "저장되는"이라는 용어는 컴퓨터 매체 상에 정보를 저장하는 프로세스를 나타낸다. 숙련자라면 컴퓨터 판독가능한 매체 상에 정보를 기록하는 현재 공지된 방법 중 임의의 것을 손쉽게 수정하여 그룹 A의 핵산 서열에 나타낸 핵산 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열 중 하나 이상, 그룹 B의 아미노산 서열에 나타낸 폴리펩티드 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열 중 하나 이상을포함하는 제품을 생성할 수 있다. 본 발명의 다른 태양은 그룹 A의 핵산 서열에 나타낸 적어도 2, 5, 10, 15, 또는 20개 이상의 핵산 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열이 기록된 컴퓨터 판독가능한 매체이다.
본 발명의 다른 태양은 그룹 A의 핵산 서열에 나타낸 핵산 서열 중 하나 이상과 그에 실질적으로 동일한 서열이 기록된 컴퓨터 판독가능한 매체이다. 본 발명의 다른 태양은 그룹 B의 아미노산 서열에 나타낸 폴리펩티드 서열 중 하나 이상과 그에 실질적으로 동일한 서열이 기록된 컴퓨터 판독가능한 매체이다. 본 발명의 다른 태양은 상기에 나타낸 서열 중 적어도 2, 5, 10, 15, 또는 20개 이상의 서열이 기록된 컴퓨터 판독가능한 매체이다.
컴퓨터 판독가능한 매체는 자기적으로 판독가능한 매체, 광학적으로 판독가능한 매체, 전자적으로 판독가능한 매체 및 자기/광학적 매체를 포함한다. 예를 들어 컴퓨터 판독가능한 매체는 하드 디스크, 플로피 디스크, 자기 테이프, CD-ROM, 디지털 다기능 디스크 (Digital versatile Disk, DVD), 임의 접근 기억 장치 (Random Access Memory, RAM), 또는 판독 전용 기억 장치 (Read Only Memory, ROM)와, 당 업계의 숙련자에게 공지된 다른 유형의 기타 매체일 수 있다.
본 발명의 태양은 시스템 (예를 들어 인터넷 기반의 시스템), 특히 본 명세서에 기술된 서열 정보를 저장 및 조작하는 컴퓨터 시스템을 포함한다. 컴퓨터 시스템 (100)의 일례가 도 1의 블럭도 형태로 도시되어 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 "컴퓨터 시스템"은 그룹 A의 핵산 서열에 나타낸 핵산 서열의 뉴클레오티드 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열, 또는 그룹 B의 아미노산 서열에 나타낸 폴리펩티드 서열의 분석에 사용되는 하드웨어 컴포넌트, 소프트웨어 컴포넌트 및 데이터 저장 컴포넌트를 나타낸다. 컴퓨터 시스템 (100)은 일반적으로 서열 데이터의 처리 (processing), 접근 및 조작을 위한 프로세서를 포함한다. 프로세서 (105)는 임의의 잘 알려진 유형의 중앙 처리 장치, 예를 들어 Intel Corporation제의 Pentium III, 또는 Sun, Motorola, Compaq, AMD 또는 International Business Machines제의 유사한 프로세서일 수 있다.
일반적으로 컴퓨터 시스템 (100)은 프로세서 (105)와 데이터를 저장하기 위한 하나 이상의 내부 데이터 저장 컴포넌트 (110)와 데이터 저장 컴포넌트 상에 저장된 데이터의 검색을 위한 하나 이상의 데이터 검색 장치를 포함하는 일반 용도의 시스템이다. 숙련자라면 현재 이용가능한 컴퓨터 시스템 중 임의의 것이 적합하다는 것을 손쉽게 인식할 수 있다.
하나의 특정 태양에 있어서, 컴퓨터 시스템 (100)은 주기억 장치 (115) (바람직하게는 RAM으로 제공됨)에 연결된 버스에 연결된 프로세서 (105) 및 하나 이상의 내부 데이터 저장 장치 (110), 예를 들어 데이터가 기록된 하드 드라이브 및/또는 기타 컴퓨터 판독가능한 매체를 포함한다. 일부 태양에 있어서, 컴퓨터 시스템 (100)은 내부 데이터 저장 장치 (110)에 저장된 데이터의 판독을 위한 하나 이상의 데이터 검색 장치 (118)을 더 포함한다.
데이터 검색 장치 (118)는 예를 들어 플로피 디스크 드라이브, 콤팩트 디스크 드라이브, 자기 테이프 드라이브, 또는 원격 데이터 저장 시스템 (예를 들어 인터넷을 통하여)에 연결될 수 있는 모뎀 등을 나타낼 수 있다. 일부 태양에 있어서, 내부 데이터 저장 장치 (110)는 제어 논리 및/또는 기록 데이터를 포함하는 분리성의 컴퓨터 판독가능한 매체, 예를 들어 플로피 디스크, 콤팩트 디스크, 자기 테이프 등이다. 컴퓨터 시스템 (100)은 데이터 검색 장치에 일단 삽입되면 데이터 저장 컴포넌트로부터 데이터 및/또는 제어 논리를 판독하는 적절한 소프트웨어를 포함하거나 상기 소프트웨어에 의해 프로그래밍될 수 있는 것이 유리하다.
컴퓨터 시스템 (100)은 출력을 컴퓨터 사용자에게 표시해 주는 데에 사용되는 디스플레이 (120)를 포함한다. 컴퓨터 시스템 (100)은 통신망 또는 광역 통신망에서 다른 컴퓨터 시스템 125a-c에 연결되어 컴퓨터 시스템 (100)에 중앙 집중형 접근을 제공할 수 있다는 것을 또한 알아야 한다.
그룹 A의 핵산 서열에 나타낸 핵산 서열의 뉴클레오티드 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열, 또는 그룹 B의 아미노산 서열에 나타낸 폴리펩티드 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열에 접근하여 이를 처리하기 위한 소프트웨어 (예를 들어 탐색 도구, 비교 도구 및 모델링 도구 등)가 실행 동안 주기억 장치 (115)에 존재할 수 있다.
일부 태양에 있어서, 컴퓨터 시스템 (100)은, 컴퓨터 판독가능한 매체 상에 저장된 그룹 A의 핵산 서열에 나타낸 핵산 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열, 또는 그룹 B의 아미노산 서열에 나타낸 폴리펩티드 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열을 컴퓨터 판독가능한 매체 상에 저장된 참조 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 (들)과 비교하기 위한 서열 비교 알고리즘을 더 포함할 수 있다. "서열 비교 알고리즘"은 뉴클레오티드 서열을 데이터 저장 수단 내에 저장된 다른 뉴클레오티드 서열 및/또는 화합물과 비교하기 위하여 컴퓨터 시스템 (100) 상에서 (국소적으로 또는 원격으로) 구현되는 하나 이상의 프로그램을 나타낸다. 예를 들어 서열 비교 알고리즘은 컴퓨터 판독가능한 매체 상에 저장된 그룹 A의 핵산 서열에 나타낸 핵산 서열의 뉴클레오티드 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열, 또는 그룹 B의 아미노산 서열에 나타낸 폴리펩티드 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열을 컴퓨터 판독가능한 매체 상에 저장된 참조 서열과 비교하여 상동성 또는 구조적 모티프를 확인할 수 있다.
도 2는 새로운 서열 및 데이터베이스의 서열 사이의 상동성의 수준을 결정하기 위하여 새로운 뉴클레오티드 또는 단백질 서열을 데이터베이스의 서열과 비교하기 위한 프로세스 (200)의 하나의 태양을 도시하는 흐름도이다. 서열의 데이터베이스는 컴퓨터 시스템 (100) 내에 저장된 개인 데이터베이스, 또는 인터넷을 통하여 이용가능한 GENBANK와 같은 공공 데이터베이스일 수 있다.
프로세스 (200)는 시작 상태 (201)에서 시작하며, 이어서 비교할 새로운 서열을 컴퓨터 시스템 (100)의 기억 장치에 저장하는 상태 (202)로 이동한다. 상기에 논의된 바와 같이 기억 장치는 RAM 또는 내부 저장 장치를 비롯하여 임의의 유형의 기억 장치일 수 있다.
이어서 프로세스 (200)는 서열의 데이터베이스를 분석 및 비교를 위하여 여는 상태 (204)로 이동한다. 이어서 프로세스 (200)는 데이터베이스에 저장된 제1 서열을 컴퓨터 상의 기억 장치 내로 판독하는 상태 (206)로 이동한다. 이어서 비교를 상태 (210)에서 수행하여 제1 서열이 제2 서열과 동일한지를 결정한다. 이단계는 새로운 서열과 데이터베이스의 제1 서열 사이의 정확한 비교를 수행하는 것에 한정되는 것은 아님을 아는 것이 중요하다. 두 뉴클레오티드 또는 단백질 서열을, 심지어 이들이 동일하지 않다 해도 비교하기 위한 잘 알려진 방법이 숙련자에게 공지되어 있다. 예를 들어 갭이 두 시험 서열들 사이의 상동성 수준을 상승시키기 위하여 하나의 서열 내로 도입될 수 있다. 갭 또는 기타 특징이 비교 동안 서열 내로 도입되는지를 제어하는 파라미터가 컴퓨터 시스템의 사용자에 의해 보통 입력된다.
일단 두 서열의 비교가 상태 (210)에서 수행되면, 두 서열이 동일한지를 결정 상태 (210)에서 결정한다. 물론, "동일"이라는 용어는 절대적으로 동일한 서열에 한정되는 것은 아니다. 사용자에 의해 입력되는 상동성 파라미터 이내인 서열은 프로세스 (200)에서 "동일"로 나타낸다.
두 서열이 동일하다고 결정되면 프로세스 (200)는 데이터베이스로부터의 서열의 명칭이 사용자에게 표시되는 상태 (214)로 이동한다. 상기 상태는 사용자에게 표시된 명칭의 서열이 입력된 상동성 제약 조건을 만족시킨다는 것을 알려준다. 일단 저장된 서열의 명칭이 사용자에게 표시되면, 프로세스 (200)는 더 많은 서열이 데이터베이스에 존재하는지를 결정하는 결정 상태 (218)로 이동한다. 더이상의 서열이 데이터베이스에 존재하지 않으면 프로세스 (200)는 종료 상태 (220)에서 종결된다. 그러나 더 많은 서열이 데이터베이스에 존재하면 프로세스 (200)는 포인터 (pointer)가 데이터베이스 중의 다음 서열로 이동하여 새로운 서열과 비교될 수 있는 상태 (224)로 이동한다. 이러한 방식으로 새로운 서열은 배열되며 데이터베이스 중의 모든 서열과 비교된다.
결정 상태 (212)에서 서열이 상동성이지 않다고 결정되면 프로세스 (200)는 임의의 다른 서열이 비교를 위하여 데이터베이스에서 이용가능한지를 결정하기 위하여 결정 상태 (218)로 즉시 이동한다는 것을 알아야 한다.
따라서 본 발명의 하나의 태양은 프로세서, 그룹 A의 핵산 서열에 나타낸 핵산 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열, 또는 그룹 B의 아미노산 서열에 나타낸 폴리펩티드 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열이 저장된 데이터 저장 장치, 그룹 A의 핵산 서열에 나타낸 핵산 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열, 또는 그룹 B의 아미노산 서열에 나타낸 폴리펩티드 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열에 비교될 참조 뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열이 검색가능하게 저장된 데이터 저장 장치 및 비교를 수행하기 위한 서열 비교자를 포함하는 컴퓨터 시스템이다. 서열 비교자는 비교되는 서열간의 상동성 수준을 나타내거나 상기 그룹 A의 핵산 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열의 핵산 코드, 또는 그룹 B의 아미노산 서열에 나타낸 폴리펩티드 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열에서 구조적 모티프를 확인할 수 있거나, 상기 핵산 코드 및 폴리펩티드 코드에 비교되는 서열에서 구조적 모티프를 확인할 수 있다. 일부 태양에 있어서, 데이터 저장 장치에는 그룹 A의 핵산 서열에 나타낸 핵산 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열, 또는 그룹 B의 아미노산 서열에 나타낸 폴리펩티드 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열 중 적어도 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 또는 40개 이상의 서열이 저장될 수 있다.
본 발명의 다른 태양은 그룹 A의 핵산 서열에 나타낸 핵산 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열, 또는 그룹 B의 아미노산 서열에 나타낸 폴리펩티드 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열과 참조 뉴클레오티드 서열 사이의 상동성의 수준을 결정하는 방법이다. 본 방법은 상동성 수준을 결정하는 컴퓨터 프로그램의 사용을 통하여 핵산 코드 또는 폴리펩티드 코드 및 참조 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 판독하는 단계 및 컴퓨터 프로그램을 이용하여 핵산 코드 또는 폴리펩티드 코드와 참조 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 사이의 상동성을 결정하는 단계를 포함한다. 컴퓨터 프로그램은 본 명세서에서 구체적으로 열거된 것 (예를 들어 디폴트 파라미터를 가지거나 임의의 수정된 파라미터를 가지는 BLAST2N)을 비롯하여 상동성 수준 결정용의 다수의 컴퓨터 프로그램 중 임의의 것일 수 있다. 본 방법은 상기에 기술된 컴퓨터 시스템을 사용하여 구현된다. 본 방법은 컴퓨터 프로그램의 사용을 통하여 상기의 그룹 A의 핵산 서열에 나타낸 핵산 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열, 또는 그룹 B의 아미노산 서열에 나타낸 폴리펩티드 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열 중 적어도 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 또는 40개 이상을 판독하는 단계 및 핵산 코드 또는 폴리펩티드 코드 및 참조 뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열 사이의 상동성을 결정하는 단계에 의해 또한 수행될 수 있다.
도 3은 두 서열이 상동성인지를 결정하기 위한 컴퓨터에서 프로세스 (250)의 하나의 태양을 도시하는 흐름도이다. 프로세스 (250)는 시작 상태 (252)로부터 시작되며 이어서 비교될 제1 서열이 기억 장치에 저장되는 상태 (254)로 이동한다. 이어서 비교될 제2 서열이 상태 (256)에서 기억 장치에 저장된다. 이어서 프로세스 (250)는 제1 서열 중의 첫번째 문자가 판독되는 상태 (260)로 이동하며 이어서 제2 서열의 첫번째 문자가 판독되는 상태 (262)로 이동한다. 서열이 뉴클레이티드 서열이면 문자는 보통 A, T, C, G 또는 U라는 것을 알아야 한다. 서열이 단백질 서열이면 제1 및 서열 서열이 용이하게 비교될 수 있도록 1문자 아미노산 코드인 것이 바람직하다.
이어서 두 문자가 동일한지를 결정 상태 (264)에서 결정한다. 이들이 동일하다면 프로세스 (250)는 제1 및 제2 서열 중의 다음 문자가 판독되는 상태 (268)로 이동한다. 이어서 다음 문자가 동일한지를 결정한다. 이들이 동일하다면 프로세스 (250)는 두 문자가 동일하지 않을때까지 상기 루프를 계속한다. 다음의 두 문자가 동일하지 않다고 결정되면 프로세스 (250)는 결정 상태 (274)로 이동하여 임의의 더 많은 문자가 판독되는 어느 하나의 서열에 있는지를 결정한다.
다른 문자가 더이상 판독되지 않으면 프로세스 (250)는 제1 및 제2 서열 사이의 상동성의 수준이 사용자에게 표시되는 상태 (276)로 이동한다. 상동성의 수준은 제1 서열 중의 총 서열 갯수로부터 동일한 서열들 사이의 문자의 비율을 계산함으로써 결정한다. 따라서, 100개의 제1 뉴클레오티드의 서열 중 모든 문자가 제2 서열의 모든 문자와 배열되면, 상동성 수준은 100%이다.
대안적으로는, 본 컴퓨터 프로그램은, 본 발명에 나타낸 핵산 서열의 뉴클레오티드 서열을 하나 이상의 참조 뉴클레오티드 서열과 비교하여 그룹 A의 핵산 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열의 핵산 코드가 하나 이상의 위치에서 참조 핵산 서열과 다른지를 결정하는 컴퓨터 프로그램일 수 있다. 선택적으로는 이러한프로그램은 참조 폴리뉴클레오티드 또는 그룹 A의 핵산 서열에 나타낸 핵산 및 그에 실질적으로 동일한 서열 중 어느 하나의 서열에 대하여 삽입, 결실 또는 치환된 뉴클레오티드의 길이 및 신원을 기록한다. 하나의 태양에 있어서, 본 컴퓨터 프로그램은 그룹 A에 나타낸 핵산 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열이 참조 뉴클레오티드 서열에 대하여 단일 뉴클레오티드 다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP)을 포함하는지를 결정하는 프로그램일 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 태양은 그룹 A의 핵산 서열에 나타낸 핵산 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열이 하나 이상의 뉴클레오티드에서 참조 뉴클레오티드 서열과 다른지를 결정하는 방법으로서 핵산 서열들 사이의 차이를 확인하는 컴퓨터 프로그램의 사용을 통하여 상기 핵산 코드와 참조 뉴클레오티드 서열을 판독하는 단계 및 이 핵산 코드와 참조 뉴클레오티드 서열 사이의 차이를 컴퓨터 프로그램을 이용하여 확인하는 단계를 포함한다. 일부 태양에 있어서, 본 컴퓨터 프로그램은 단일 뉴클레오티드 다형성을 확인하는 프로그램이다. 본 방법은 상기에 기술된 컴퓨터 시스템 및 도 3에 도시된 방법에 의해 구현될 수 있다. 본 방법은 컴퓨터 프로그램의 사용을 통하여 그룹 A의 핵산 서열에 나타낸 핵산 서열 및 그에 실질적으로 동일한 서열 중 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 또는 40개 이상의 서열 및 참조 뉴클레오티드 서열을 판독하는 단계 및 핵산 코드와 참조 뉴클레오티드 서열 사이의 차이를 컴퓨터 프로그램을 이용하여 확인하는 단계에 의해서도 수행될 수 있다.
다른 태양에서, 컴퓨터 기반의 시스템은 그룹 A의 핵산 서열에 나타낸 핵산 서열 또는 그룹 B의 아미노산 서열에 나타낸 폴리펩티드 서열 및 그와 실질적으로동일한 서열 내의 특징을 확인하기 위한 확인자를 추가로 포함할 수도 있다.
"확인자"는 그룹 A의 핵산 서열에 나타낸 핵산 서열 및 그와 실질적으로 동일한 서열, 또는 그룹 B의 아미노산 서열에 나타낸 폴리펩티드 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열내의 일부 특징을 확인하는 하나 이상의 프로그램을 말한다. 한 태양에서, 확인자는 그룹 A의 핵산 서열에 나타낸 핵산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열내의 개봉 판독 프레임을 확인하는 프로그램을 포함할 수도 있다.
도 4는 서열내의 특징의 존재를 검출하기 위한 확인자 프로세스 (300)의 한 태양을 예시하는 흐름도이다. 프로세스 (300)는 시작 상태 (302)에서 시작하여, 특징을 확인할 제1 서열이 컴퓨터 시스템 (100)내의 기억 장치 (115)에 저장되는 상태 (304)로 이동한다. 프로세스 (300)는 이어서 서열 특징의 데이터베이스가 공개되는 상태 (306)로 이동한다. 그러한 데이터베이스는 각 특징의 명칭과 함께 각 특징의 특성의 리스트를 포함할 것이다. 예를 들어, 특징 명칭은 "개시 코돈"일 수 있으며 특성은 "ATG"일 것이다. 다른 예는 특성 명칭은 "TAATAA 박스"이고 특징 특성은 "TAATAA"일 것이다. 그러한 데이터베이스의 예는 위스콘신 대학 유전학 컴퓨터 그룹에 의해 생산된다. 다르게는, 상기 특징들은 알파 헬릭스, 베타 시트와 같은 구조적 폴리펩티드 모티프, 또는 효소 활성 부위, 헬릭스-턴-헬릭스 모티프 또는 당 업계에 공지된 다른 모티프와 같은 기능적 폴리펩티드 모티프일 수 있다.
일단 특징의 데이터베이스가 상태 (306)에서 공개되면, 프로세스 (300)는 제 1 특징이 데이터베이스로부터 판독되는 상태 (308)로 이동한다. 이어서 제1 특징의 특성과 제1 서열의 비교가 상태 (310)에서 이루어진다. 이어서 상기 특징의 특성이 제 1 서열에서 발견되었는지 여부가 결정 상태 (316)에서 결정된다. 만일 특성이 발견되었으면, 프로세스 (300)는 발견된 특징의 명칭이 사용자에게 표시되는 상태 (318)로 이동한다.
이어서 프로세스 (300)는 데이터베이스에 더 이상의 특징이 존재하는지를 결정하는 결정 상태 (320)로 이동한다. 더 이상의 특징이 존재하지 않으면, 프로세스 (300)는 종료 상태 (324)에서 종결된다. 하지만, 더 이상의 특징이 데이터베이스에 존재하면, 프로세스 (300)는 상태 (326)에서 다음 서열 특징을 판독하고, 다음 특징의 특성이 제1 서열에 대하여 비교되는 상태 (310)으로 돌아간다. 만일 특징 특성이 결정 상태 (316)에서 제 1서열에서 발견되지 않으면 프로세스 (300)는 더 이상의 특징이 데이터베이스에 존재하는지를 결정하기 위하여 결정 상태 (320)로 직접 이동함을 주목해야 한다.
따라서, 본 발명의 다른 태양은 그룹 A의 핵산 서열에 나타낸 핵산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열, 또는 그룹 B의 아미노산 서열에 나타낸 폴리펩티드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 서열의 특징을 확인하는 방법으로서, 서열 내의 특징을 확인하는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 핵산 코드 또는 폴리펩티드 코드를 판독하는 단계 및 핵산 코드내의 특징을 컴퓨터 프로그램으로 확인하는 단계를 포함한다. 한 태양에서, 컴퓨터 프로그램은 개봉 판독 프레임을 확인하는 컴퓨터 프로그램을 포함한다. 상기 방법은 그룹 A의 핵산 서열에 나타낸 핵산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열, 또는 그룹 B의 아미노산 서열에 나타낸 폴리펩티드 서열및 이와 실질적으로 동일한 서열 중 단일 서열 또는 적어도 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 또는 40개를 컴퓨터 프로그램을 이용하여 판독하고, 상기 핵산 코드 또는 폴리펩티드 코드내의 특징을 컴퓨터 프로그램으로 확인함으로써 수행될 수 있다.
그룹 A의 핵산 서열에 나타낸 핵산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열, 또는 그룹 B 아미노산 서열에 나타낸 폴리펩티드 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열은 다양한 포맷의 다양한 데이터 프로세서 프로그램에 저장되고 조작될 수 있다. 예를 들어, 그룹 A의 핵산 서열에 나타낸 핵산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열, 또는 그룹 B의 아미노산 서열에 나타낸 폴리펩티드 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열은 마이크로소프트 WORD (등록상표) 또는 WORDPERFECT (등록상표)와 같은 워드 프로세싱 파일내의 텍스트로서, 또는 DB2 (등록상표), SYBASE (등록상표), 또는 ORACLE (등록상표)과 같은 당 업계에 친숙한 다양한 데이터베이스 프로그램내의 ASCII 파일로서 저장될 수 있다. 또한, 많은 컴퓨터 프로그램과 데이터베이스가 서열 비교 알고리즘, 확인자, 또는 그룹 A의 핵산 서열에 나타낸 핵산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열, 또는 그룹 B의 아미노산 서열에 나타낸 폴리펩티드 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열과 비교될 참조 뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열의 소스로 이용될 수 있다. 하기 목록은 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니라 그룹 A의 핵산 서열에 나타낸 핵산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열, 또는 그룹 B의 아미노산 서열에 나타낸 폴리펩티드 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열에서 유용한 프로그램과 데이터베이스에 대한 지침을 제공하기 위한 것이다.
이용될 수 있는 프로그램과 데이터베이스는 하기를 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다: MacPattem (EMBL), DiscoveryBase (Molecular Applications Group), GeneMine (Molecular Applications Group), Look (Molecular Applications Group), MacLook (Molecular Applications Group), BLAST와 BLAST2 (NCBI), BLASTN과 BLASTX (Altschul et al, J. Mol. Biol. 215. 403,1990), FASTA (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444,1988), FASTDB (Brutlag et al. Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990), Catalyst (Molecular Simulations Inc.), Catalyst/SHAPE (Molecular Simulations Inc.), Cerius2.DBAccess (Molecular Simulations Inc.), HypoGen (Molecular Simulations Inc.), Insight II, (Molecular Simulations Inc.), Discover (Molecular Simulations Inc.), CHARMm (Molecular Simulations Inc.), Felix (Molecular Simulations Inc.), DelPhi, (Molecular Simulations Inc.), QuanteMM, (Molecular Simulations Inc.), Homology (Molecular Simulations Inc.), Modeler (Molecular Simulations Inc.), ISIS (Molecular Simulations Inc.), Quanta/Protein Design (Molecular Simulations Inc.), WebLab (Molecular Simulations Inc.), WebLab Diversity Explorer (Molecular Simulations Inc.), Gene Explorer (Molecular Simulations Inc.), SeqFold (Molecular Simulations Inc.), MDL Available Chemicals Directory database, MDL Drug Data Report data base, Comprehensive Medicinal Chemistry database, Derwents's World Drug Index database, BioByteMasterfiledatabase, Genbank database 및 Genseqn database. 많은 다른 프로그램과 데이터 베이스가 본 발명의 개시 내용에 비추어 당업자에게는 자명할 것이다.
상기 프로그램을 이용하여 검출될 수 있는 모티프는 루이신 지퍼를 암호화하는 서열, 헬릭스-턴-헬릭스 모티프, 글리코실화 부위, 유비퀴틴화 부위, 알파 헬릭스 및 베타 시트, 암호화 단백질의 분비를 지시하는 신호 펩티드를 암호화하는 시그널 서열, 호메오박스와 같은 전사 조절에 관여하는 서열, 산성 스트레치, 효소 활성 부위, 기질 결합 부위 및 효소 절단 부위를 포함한다.
핵산의 하이브리드화
본 발명은 본 발명의 예시적 서열 (예를 들어, 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117, 서열 번호 119, 서열 번호 121, 서열 번호123, 서열 번호 125, 서열 번호 127, 서열 번호 129, 서열 번호 131, 서열 번호 133, 서열 번호 135, 서열 번호 137, 서열 번호 139, 서열 번호 141, 서열 번호 143, 서열 번호 145, 서열 번호 147, 서열 번호 149, 서열 번호 151, 서열 번호 153, 서열 번호 155, 서열 번호 157, 서열 번호 159, 서열 번호 161, 서열 번호 163, 서열 번호 165, 서열 번호 167, 서열 번호 1 69, 서열 번호 171, 서열 번호 173, 서열 번호 175, 서열 번호 177, 서열 번호 179, 서열 번호 181, 서열 번호 183, 서열 번호 185, 서열 번호 187, 서열 번호 189, 서열 번호 191, 서열 번호 193, 서열 번호 195, 서열 번호 197, 서열 번호 199, 서열 번호 201, 서열 번호 203, 서열 번호 205, 서열 번호 207, 서열 번호 209, 서열 번호 211, 서열 번호 213, 서열 번호 215, 서열 번호 217, 서열 번호 219, 서열 번호 221, 서열 번호 223, 서열 번호 225, 서열 번호 227, 서열 번호 229, 서열 번호 231, 서열 번호 233, 서열 번호 235, 서열 번호 237, 서열 번호 239, 서열 번호 241, 서열 번호 243, 서열 번호 245, 서열 번호 247, 서열 번호 249, 서열 번호 251, 서열 번호 253, 서열 번호 255, 서열 번호 257, 서열 번호 259, 서열 번호 261, 서열 번호 263, 서열 번호 265, 서열 번호 267, 서열 번호 269, 서열 번호 271, 서열 번호 273, 서열 번호 275, 서열 번호 277, 서열 번호 279, 서열 번호 281, 서열 번호 283, 서열 번호 285, 서열 번호 287, 서열 번호 289, 서열 번호 291, 서열 번호 293, 서열 번호 295, 서열 번호 297, 서열 번호 299, 서열 번호 301, 서열 번호 303, 서열 번호 305, 서열 번호 307, 서열 번호 309, 서열 번호 311, 서열 번호 313, 서열 번호 315, 서열 번호 317, 서열 번호 319, 서열 번호 321, 서열 번호323, 서열 번호 325, 서열 번호 327, 서열 번호 329, 서열 번호 331, 서열 번호 333, 서열 번호 335, 서열 번호 337, 서열 번호 339, 서열 번호 341, 서열 번호 343, 서열 번호 345, 서열 번호 347, 서열 번호 349, 서열 번호 351, 서열 번호 353, 서열 번호 355, 서열 번호 357, 서열 번호 359, 서열 번호 361, 서열 번호 363, 서열 번호 365, 서열 번호 367, 서열 번호 369, 서열 번호 371, 서열 번호 373, 서열 번호 375, 서열 번호 377 또는 서열 번호 379)에 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 분리된 또는 재조합 핵산을 제공한다. 엄격한 조건은 매우 엄격한 조건, 중간 엄격도 조건 및/또는 낮은 엄격도 조건일 수 있으며, 여기서 개시된 높은 엄격도 조건 및 감소된 엄격도 조건을 포함한다. 한 태양에서, 하기하는 바와 같이, 핵산이 본 발명 범위내인지를 결정하는 조건을 정하는 것은 세척 조건의 엄격도이다.
다른 태양에서, 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 그들의 능력에 의해 정의되는 본 발명의 핵산은 본 발명의 핵산의 약 5개의 잔기와 전장 사이일 수 있다; 예를 들어, 이들은 길이가 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 또는 그 이상 잔기일 수 있다. 전장보다 짧은 핵산 또한 포함된다. 이들 핵산은 예를 들어, 하이브리드화 프로브, 표지화 프로브, PCR 올리고뉴클레오티드 프로브, iRNA (단일 또는 이중쇄), 안티센스 또는 항체 결합 펩티드 (에피토프)를 암호화하는 서열, 모티프, 활성 부위 등으로서 유용할 수 있다.
한 태양에서, 본 발명의 핵산은 약 37℃ 내지 42℃에서 약 50% 포름아미드의 조건을 포함하는 높은 엄격도하에서 그들이 하이브리드화하는 능력에 의해 정의된다. 한 태양에서, 본 발명의 핵산은 약 30℃ 내지 35℃에서 약 35% 내지 25% 포름아미드에서의 조건을 포함하는 감소된 엄격도하에서 그들이 하이브리드화하는 능력에 의해 정의된다.
다르게는, 본 발명의 핵산은 50% 포름아미드, 5X SSPE, 0.3% SDS, 및 cot-1 또는 연어 정자 DNA (예, 200 n/ml 전단되고 변성된 연어 정자 DNA)와 같은 반복 서열 차단 핵산에서 42℃의 조건을 포함하는 높은 엄격도하에서 그들이 하이브리드화하는 능력에 의해 정의된다. 한 태양에서, 본 발명의 핵산은 35℃의 감소된 온도에서 35% 포름아미드를 포함하는 감소된 엄격도 조건하에서 하이브리드화하는 능력에 의해 정의된다.
핵산 하이브리드화 반응에서, 특정 수준의 엄격도를 이루기 위해 이용된 조건은 하이브리드화될 핵산의 특성에 따라 다를 것이다. 예를 들어, 핵산의 하이브리드화 영역의 길이, 상보성의 정도, 뉴클레오티드 서열 조성 (예, GC 대 AT 함량) 및 핵산 유형 (예, RNA 대 DNA)이 하이브리드화 조건을 선택할 때 고려될 수 있다. 추가의 고려 사항은 핵산중 하나가 예를 들어 필터상에 고정되는 지 여부이다.
하이브리드화는 낮은 엄격도, 중간 엄격도 또는 높은 엄격도의 조건하에서 실시될 수 있다. 핵산 하이브리드화의 예로서, 고정된 변성 핵산을 함유한 중합체 막이 먼저 0.9 M NaCl, 50 mM NaH2PO4, pH 7.0, 5.0 mM Na2EDTA, 0.5% SDS, 1OX 덴하르트 및 0.5 mg/ml 폴리리보아데닐산으로 구성된 용액에서 45℃에서 30분동안 예비하이브리드화된다. 약 2 X 107cpm (비활성 4-9 X 108CPM/㎍)의32P 말단-표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 이어서 상기 용액에 첨가한다. 12-16시간동안 항온처리한 후, 상기 막을 실온에서 0.5% SDS를 함유한 1X SET (150 mM NaCl, 20 mM Tris 하이드로클로라이드, pH 7.8, 1 mM Na2EDTA)에서 30분간 세척하고, 이어서 올리고뉴클레오티드 프로브를 위한 Tm-10℃에서 새로운 1X SET에서 30분 세척한다. 이어서 상기 막을 하이브리드화 시그널의 검출을 위해 방사성 필름에 노출시킨다.
전술한 모든 하이브리드화는 높은 엄격도 조건하인 것으로 간주된다.
하이브리드화 후, 필터를 세척하여 임의의 비-특이적으로 결합된 검출가능한 프로브를 제거한다. 필터를 세척하기 위해 이용된 엄격도는 또한 하이브리드화될 핵산의 특성, 하이브리드화될 핵산의 길이, 상보성의 정도, 뉴클레오티드 서열 조성 (예, GC 대 AT 함량) 및 핵산 유형 (예, RNA 대 DNA)에 따라 달라질 것이다. 점차적으로 더 높은 엄격도 조건 세척의 예는 다음과 같다: 실온에서 15분간 2X SSC, 0.1% SDS (낮은 엄격도); 실온에서 30분 내지 1 시간동안 0.1X SSC, 0.5% SDS (중간 엄격도); 하이브리드화 온도와 68℃ 사이에서 15 내지 30분간 0.1X SSC, 0.5% SDS (높은 엄격도); 및 72℃에서 15분동안 0.15M NaCl (매우 높은 엄격도). 최종 낮은 엄격도 세척은 실온에서 0.1 X SSC에서 실시될 수 있다. 상기 예들은 필터를 세척하기 위해 이용될 수 있는 조건의 한 세트의 예시일 뿐이다. 당업자는 다른 엄격도 세척을 위한 많은 레시피가 있음을 알 것이다. 일부 다른 예가 하기에 주어진다.
프로브에 하이브리드화한 핵산은 방사선사진촬영 또는 기타 종래 기술로 확인된다.
상기 절차는 프로브 서열에 대해 감소된 상동성 정도를 갖는 핵산을 확인하기 위해 변형될 수도 있다. 예를 들어, 검출가능한 프로브에 대해 감소된 상동성의 핵산을 얻기 위해서는, 덜 엄격한 조건을 이용할 수 있다. 예를 들어, 하이브리드화 온도는 약 1M의 Na+ 농도를 갖는 하이브리드화 완충액에서 68℃에서 42℃로 5℃ 만큼씩 감소될 수 있다. 하이브리드화 후, 필터를 하이브리드화 온도에서 2X SSC, 0.5% SDS로 세척할 수 있다. 이들 조건은 50℃ 이상에서는 "온건한" 조건 그리고 50℃ 미만에서 "낮은" 조건으로 간주된다. "온건한" 하이브리드화 조건의 구체적인 예는 상기 하이브리드화가 55℃에서 실시될 때이다. "낮은 엄격도" 하이브리드화 조건의 구체적인 예는 상기 하이브리드화가 45℃에서 실시될 때이다.
다르게는, 하이브리드화는 42℃의 온도에서 포름아미드를 함유한 6X SSC와 같은 완충액에서 실시될 수 있다. 이 경우에, 하이브리드화 완충액내의 포름아미드의 농도는 프로브에 대해 감소하는 상동성을 갖는 클론들을 확인하기 위하여 50%에서 0% 로 5% 씩 감소될 수 있다. 하이브리드화 후, 필터는 50℃에서 6X SSC, 0.5% SDS로 세척될 수 있다. 이들 조건은 25% 이상 포름아미드에서는 "온건한" 조건으로, 그리고 25% 이하 포름아미드에서는 "낮은" 조건으로 간주된다. "온건한" 하이브리드화 조건의 구체적인 예는 상기 하이브리드화가 30% 포름아미드에서 실시될 때이다. "낮은 엄격도" 하이브리드화 조건의 구체적인 예는 상기 하이브리드화가 10% 포름아미드에서 실시될 때이다.
하지만, 하이브리드화 포맷의 선택은 중요하지 않다 - 핵산이 본 발명의 범위내인지를 결정하는 조건을 결정하는 것은 세척 조건의 엄격도이다. 본 발명 범위내의 핵산을 확인하기 위해 이용된 세척 조건은 예를 들어, pH 7에서 약 0.02 몰의 염 농도와 적어도 약 50℃ 또는 약 55℃ 내지 약 60℃의 온도; 또는 약 15분간 72℃에서 약 0.15M NaCl의 염 농도; 또는 약 15 내지 약 20분동안 적어도 약 50℃ 또는 약 55℃ 내지 약 60℃의 온도와 약 0.2 X SSC의 염 농도; 또는 하이브리드화 복합체를 0.1% SDS를 함유한 약 2X SSC의 염 농도를 갖는 용액으로 실온에서 15분간 두번 세척하고 이어서 0.1% SDS를 함유한 0.1 X SSC에 의해 68℃에서 15분간 세척하기; 또는 등가의 조건. SSC 완충액과 등가의 조건의 설명을 위해서는 Sambrook, Tijssen 및 Ausubel을 참고한다.
이들 방법은 본 발명의 핵산을 분리하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법들은 그룹 A의 핵산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열 중 하나 또는 그것의 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 또는 500개의 연속 염기를 포함하는 단편 및 여기에 상보적인 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 적어도 약 97%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55%, 적어도 50% 상동성을 갖는 서열을 갖는 핵산을 분리하기 위해 이용될 수 있다. 상동성은 배열 알고리즘을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 상동성 폴리뉴클레오티드는 여기서 개시된 암호화 서열 중 하나의 자연 발생 대립유전자 변이체인 암호화 서열을 가질 수 있다. 그러한 대립유전자 변이체는 그룹 A의 핵산 서열 또는 이와 상보적인 서열의 핵산과 비교할 때 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 부가를 가질 수 있다.
부가적으로, 상기 절차는 그룹 B의 아미노산 서열과 이와 실질적으로 동일한 서열중 하나 또는 서열 배열 알고리즘 (예, 디폴트 파리미터를 이용한 FASTA 버젼 3.0t78 알고리즘)을 이용하여 결정할 때 상기 폴리펩티드의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 또는 150 연속인 아미노산을 포함하는 단편의 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 약 99%, 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55%, 또는 적어도 50% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 분리하기 위해 이용될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 프로브와 이를 이용하는 방법
본 발명은 또한 예를 들어 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 그 단편을 암호화하는 핵산 또는 자일라나제 유전자를 확인하기 위해 이용될 수 있는 핵산 프로브를 제공한다. 한 태양에서, 상기 프로브는 본 발명의 핵산의 적어도 10 연속 염기를 포함한다. 다르게는, 본 발명의 프로브는 본 발명의 핵산에서 기재된 서열의 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 150 또는 약 10 내지 50, 약 20 내지 60, 약 30 내지 70개의 연속 염기일 수 있다. 상기 프로브는 결합 및/또는 하이브리드화에 의해 핵산을 확인한다. 상기 프로브는 예를 들어 모세관 어레이를 비롯한 본 발명의 어레이에 이용될 수 있다. 본 발명의 프로브는 또한 다른 핵산 또는 폴리펩티드를 분리하기 위해 이용될 수 있다.
그룹 A의 핵산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열, 이에 상보적인 서열, 또는 그룹 A의 핵산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열, 또는 이에 상보적인 서열 중 하나의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100,150, 200, 300, 400, 또는 500 연속 염기를 포함하는 단편의 분리된 핵산은 또한 토양 샘플과 같은 생물학적 샘플이 본 발명의 핵산 서열을 갖는 유기체 또는 상기 핵산이 얻어진 유기체를 함유하는지를 결정하기 위해 프로브로서 이용될 수 있다. 그러한 절차에서, 상기 핵산이 분리된 유기체를 보유한 생물학적 샘플이 얻어지고 그 샘플로부터 핵산을 얻는다. 상기 핵산을 그안에 존재하는 임의의 상보성 서열에 프로브가 특이적으로 하이브리드화하도록 하는 조건하에서 프로브와 접촉시킨다.
필요할 경우, 프로브가 상보성 서열에 특이적으로 하이브리드화하도록 하는 조건은, 상보성 서열을 함유하는 것으로 알려진 샘플로부터의 상보성 서열 및 상보성 서열을 함유하지 않는 참조 서열과 프로브가 접촉하도록 함으로써 결정될 수 있다. 하이브리드화 완충액의 염 농도, 하이브리드화 완충액의 포름아미드 농도, 또는 하이브리드화 온도와 같은 하이브리드화 조건은 프로브가 상보성 핵산에 특이적으로 하이브리드화하도록 하는 조건을 확인하기 위해 변형될 수 있다.
만일 샘플이 상기 핵산이 분리된 유기체를 함유하면, 프로브의 특이적 하이브리드화가 검출된다. 하이브리드화는 방사성 동위원소, 형광 염료, 또는 검출가능한 생성물의 형성을 촉매할 수 있는 효소와 같은 검출가능한 제제로 프로브를 표지함으로써 검출될 수 있다.
샘플내의 상보성 핵산의 존재를 검출하기 위해 표지된 프로브를 이용하기 위한 많은 방법들이 당업자에게 잘 알려져 있다. 이들은 서던 블롯, 노던 블롯, 콜로니 하이브리드화 과정 및 돗 블롯을 포함한다. 이들 과정의 각각을 위한 프로토콜은 Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. (1997) 및 Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)에 제공된다.
다르게는, 샘플이 본 발명의 핵산 서열을 함유한 유기체 (예, 상기 핵산이 분리된 유기체)를 함유하는지를 결정하기 위하여 하나보다 많은 프로브 (핵산 샘플내에 존재하는 임의의 상보성 서열에 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 적어도 하나)를 증폭 반응에 이용할 수 있다. 일반적으로, 상기 프로브는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 태양에서, 증폭 반응은 PCR 반응을 포함할 수 있다. PCR 프로토콜은 상기한 Ausubel과 Sambrook에 개시된다. 다르게는, 증폭은 리가제 연쇄 반응, 3SR, 또는 쇄 치환 반응을 포함할 수도 있다. (Barany, F., "The Ligase Chain Reaction in a PCR World", PCR Methods and Applications 1:5-16,1991; E. Fahy et al., "Selfsustained Sequence Replication (3SR): An Isothermal Transcription-based Amplification System Alternative to PCR", PCR Methods and Applications 1:25-33,1991; 및 Walker G.T. et al., "Strand Displacement Amplification-an Isothermal in vitro DNA Amplification Technique", Nucleic Acid Research 20:1691-1696, 1992 참고). 그러한 과정에서, 샘플내의 핵산은 프로브와 접촉되고, 증폭 반응이 실시되고 임의의 생성된 증폭 생성물이 검출된다.증폭 생성물은 반응 생성물에 대해 젤 전기영동을 실시하고 에티듐 브로마이드와 같은 인터킬레이터로 젤을 염색함으로써 검출될 수 있다. 다르게는, 프로브 중 하나 이상을 방사성 동위원소로 표지하여 방사성 증폭 생성물의 존재를 젤 전기영동 후 방사성사진에 의해 검출할 수 있다.
그룹 A의 핵산 서열의 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열의 말단 근처의 서열로부터 유래한 프로브는 또한 그룹 A의 핵산 서열의 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열의 근처에 위치한 게놈 서열을 함유한 클론을 확인하기 위해 염색체 워킹 과정에 이용될 수도 있다. 그러한 방법은 숙주 유기체로부터 추가의 단백질을 암호화하는 유전자의 분리를 가능하게 한다.
그룹 A의 핵산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열, 이에 상보적인 서열, 또는 그룹 A의 핵산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열, 또는 이에 상보적인 서열의 서열 중 하나의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 또는 500 연속 염기를 포함하는 단편의 분리된 핵산을 프로브로 이용하여 관련 핵산을 확인하고 분리할 수 있다. 일부 태양에서, 관련 핵산은 상기 핵산이 분리된 유기체와 다른 유기체로부터의 cDNA 또는 게놈 DNA일 수 있다. 예를 들어, 다른 유기체는 관련 유기체일 수도 있다. 그러한 과정에서, 핵산 샘플은 프로브가 관련 서열에 특이적으로 하이브리드화하도록 하는 조건하에서 프로브와 접촉된다. 관련 유기체로부터의 핵산 서열에의 프로브의 하이브리드화를 이어서 전술한 임의의 방법을 이용하여 검출한다.
검출가능한 프로브에 하이브리드화하는 cDNA 또는 게놈 DNA와 같은 핵산을확인하기 위해 이용된 하이브리드화 조건의 엄격도를 변화시킴으로써, 프로브에 대한 상동성의 정도가 다른 핵산들이 확인되고 분리될 수 있다. 엄격도는 프로브의 융점 이하의 변하는 온도에서 하이브리드화를 실시함으로써 변화될 수 있다. 융점 Tm은 표적 서열의 50%가 완전히 상보적인 프로브에 하이브리드화하는 온도 (한정된 이온 강도와 pH하에서)이다. 매우 엄격한 조건은 구체적 프로브를 위한 Tm과 동일하거나 약 5℃ 낮은 온도로 선택된다. 프로브의 융점은 하기 식을 이용하여 계산될 수 있다:
길이가 14 내지 70 뉴클레오티드인 프로브의 경우, 융점은 식 Tm=81.5+16.6 (log [Na+])+0.41 (G+C 분율)- (600/N) (이때 N은 프로브의 길이)을 이용하여 계산된다.
만일 하이브리드화가 포름아미드를 함유한 용액에서 실시되면, 융점은 식 Tm = 81.5+16.6 (log [Na+])+0.41 (G+C 분율)- (0.63% 포름아미드)- (600/N) (N은 프로브의 길이)을 이용하여 계산될 수 있다.
예비하이브리드화는 6X SSC, 5X 덴하르트 시약, 0.5% SDS, 100㎍ 변성된 단편화된 연어 정자 DNA, 50% 포름아미드에서 실시될 수 있다. SSC와 덴하르트 용액을 위한 식은 상기한 Sambrook 등에 열거된다.
하이브리드화는 검출가능한 프로브를 상기에서 열거한 예비하이브리드화 용액에 첨가함으로써 실시된다. 프로브가 이중쇄 DNA를 포함하는 경우, 프로브는 하이브리드화 용액에 첨가하기 전에 변성시킨다. 필터를 충분한 기간동안 하이브리드화 용액과 접촉시켜 프로브가 프로브에 상보적이거나 상동성인 서열을 함유하는cDNA 또는 게놈 DNA에 하이브리드화하도록 한다. 200 뉴클레오티드 길이가 넘는 프로브의 경우, 하이브리드화는 Tm보다 15-25℃ 낮은 온도에서 실시될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브와 같은 더 짧은 프로브의 경우, 하이브리드화는 Tm보다 5-10℃ 낮은 온도에서 실시될 수 있다. 일반적으로, 6X SSC에서의 하이브리드화의 경우, 하이브리드화는 약 68 ℃에서 실시된다. 대개, 50% 포름아미드 함유 용액에서의 하이브리드화의 경우, 하이브리드화는 약 42℃ 에서 실시된다.
자일라나제의 발현 억제
본 발명은 본 발명의 핵산, 예를 들어 자일라나제-암호 핵산에 상보적인 (예를 들어 안티센스 서열) 핵산을 제공한다. 안티센스 서열은 자일라나제-암호 유전자의 수송, 스플라이싱 또는 전사를 억제할 수 있다. 상기 억제는 게놈 DNA 또는 메신저 RNA를 표적화함으로써 이루어질 수 있다. 표적화된 핵산의 전사 또는 기능은 예를 들어 하이브리드화 및/또는 절단에 의해 억제될 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 한 가지 특히 유용한 억제제 세트는 자일라나제 유전자 또는 메시지에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 자일라나제의 생산 또는 기능을 막거나 억제한다. 상기 연합은 서열 특이적 하이브리드화를 통해서일 수 있다. 다른 유용한 억제제 부류는 자일라나제 메시지의 불활성화 또는 절단을 야기하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 리보자임과 같은, 그러한 절단을 야기하는 효소 활성을 가질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 변형되거나, 상보성 핵산 서열을 절단할 수 있는 효소 또는 조성물에 결합될 수 있다. 많은 다른 그러한 올리고뉴클레오티드의 풀을 원하는 활성을 갖는 것들에 대해 검사할 수 있다. 따라서, 본 발명은 핵산 및/또는 단백질 수준에서 자일라나제 발현의 억제를 위한 다양한 조성물을 제공하며, 예를 들어 본 발명의 자일라나제 서열을 포함하는 안티센스, iRNA 및 리보자임 및 본 발명의 항-자일라나제 항체가 있다.
자일라나제 발현의 억제는 다양한 산업적 적용을 가질 수 있다. 예를 들어, 자일라나제 발현의 억제는 부패를 늦추거나 막을 수 있다. 부패는 다당류, 예를 들어 구조 다당류가 효소적으로 분해될 때 발생할 수 있다. 이것은 과일 및 야채의 품질이 저하되거나 썩게 할 수 있다. 한 태양에서, 자이라나제의 발현 및/또는 활성을 억제하는 본 발명의 조성물, 예를 들어 항체, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임 및 RNAi의 이용은 부패를 늦추거나 막기 위해 이용된다. 따라서, 한 태양에서, 본 발명은 부패를 늦추거나 막기 위해 본 발명의 항체, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임 및 RNAi를 식물 또는 식물 생성물 (예, 시리얼, 곡물, 과일, 종자, 뿌리, 잎, 등)에 적용하는 것을 포함한 방법 및 조성물을 제공한다. 이들 조성물은 또한 식물 (예, 트랜스제닉 식물) 또는 다른 유기체 (예, 본 발명의 자일라나제 유전자로 형질전환된 박테리아 또는 다른 미생물)에 의해 발현될 수 있다.
자일라나제 발현의 억제를 위한 본 발명의 조성물 (예, 안티센스, iRNA, 리보자임, 항체)은 약학 조성물, 예를 들어 항-병원균 제제로서 또는 다른 치료, 예를 들어 살모넬라를 위한 항균제로서 사용될 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드
본 발명은 mRNA를 표적화함으로써 자일란 하이드롤라제 활성 (예, 내부 β-1,4-자일로시드 결합의 가수분해를 촉매)을 억제할 수 있는, 자일라나제 메시지에 결합할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 고안하기 위한 전략은 과학 문헌 및 특허 문헌에 잘 개시되어 있으며, 당업자는 본 발명의 신규한 시약을 이용하여 그러한 자일라나제 올리고뉴클레오티드를 고안할 수 있다. 예를 들어, 효과적인 안티센스 올리고뉴클레오티드를 스크리닝하기 위한 유전자 워킹/RNA 맵핑 프로토콜이 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 가능한 안티센스 서열 선별을 위한 쉽고 믿을만한 방법을 제공하기 위한 표준 분자 기술에 기초한 RNA 맵핑 분석을 개시한 Ho (2000) Methods Enzymol. 314:168-183을 참고한다. 또한 Smith (2000) Eur. J. Pharm. Sci. 11: 191을 참고한다.
자연 발생 핵산이 안티센스 올리고뉴클레오티드로 이용된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 임의의 길이일 수 있으며, 예를 들어 다른 태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 약 5 내지 100, 약 10 내지 80, 약 15 내지 60, 약 18 내지 40사이이다. 적절한 길이는 일반적인 스크리닝에 의해 결정될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 임의의 농도로 존재할 수 있다. 적절한 농도는 일반적인 스크리닝에 의해 결정될 수 있다. 가능한 문제를 해결할 수 있는 광범위한 합성, 비자연 발생 뉴클레오티드 및 핵산 유사체가 공지되어 있다. 예를 들어, N- (2-아미노에틸)글리신 유닛과 같은 비이온성 백본을 함유한 펩티드 핵산 (PNAs)이 이용될 수 있다. WO 97/0321 1; WO 96/39154; Mata (1997) Toxicol Appl Pharmacol 144:189-197; Antisense Therapeutics, ed. Agrawal (Humana Press, Totowa, N.J.,1996)에 개시된 대로, 포스포로티오에이트 결합을 가진 안티센스 올리고뉴클레오티드가 또한 이용될 수 있다. 본 발명에 의해 제공된 합성 DNA 백본 유사체를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한 전술한 대로, 포스포로-디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 알킬 포스포트리에스테르, 설파메이트, 3'-티오아세탈, 메틸렌 (메틸이미노), 3'-N-카르바메이트, 및 모르폴리노 카르바메이트 핵산을 포함할 수 있다.
조합 화학 방법을 이용하여, 본 발명의 센스 및 안티센스 자일라나제 서열과 같은, 임의의 표적에 대하여 적절한 결합 친화도와 특이성을 갖는 특정 올리고뉴클레오티드를 위해 신속하게 스크리닝될 수 있는 방대한 수의 올리고뉴클레오티드를 생성할 수 있다. (예, Gold (1995) J. of Biol. Chem. 270.13581-13584 참고)
억제성 리보자임
본 발명은 자일라나제 메시지에 결합할 수 잇는 리보자임을 제공한다. 이들 리보자임은 예를 들어 mRNA를 표적화함으로써 자일라나제 활성을 억제할 수 있다. 리보자임을 고안하고 표적화를 위한 자일라나제-특이적 안티센스 서열을 선별하기 위한 전략은 과학 및 특허 문헌에 잘 개시되어 있으며, 당업자는 본 발명의 신규한 시약을 이용하여 그러한 리보자임을 고안할 수 있다. 리보자임은 표적 RNA를 절단하는 RNA의 효소 부분에 인접한 리보자임의 표적 RNA 결합 부분을 통해 표적 RNA에 결합함으로써 작용한다. 따라서, 리보자임은 상보성 염기-쌍형성을 통해 표적 RNA를 인식하고 결합하며, 일단 정확한 부위에 결합되면, 표적 RNA를 효소적으로 절단하여 불활성화시킨다. 그러한 방식으로 표적 RNA를 절단하면, 그 절단이 암호화서열에 발생한 경우 RNA가 암호화 단백질의 합성을 지시하는 능력을 파괴할 것이다. 리보자임이 그 RNA 표적에 결합하여 절단한 후, 리보자임은 그 RNA로부터 유리되어 새로운 표적에 반복하여 결합하고 절단할 수 있다.
일부 경우에, 리보자임의 효소 특성은 치료를 하기 위해 필요한 리보자임의 효과적인 농도가 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도보다 낮을 수 있으므로, 안티센스 기법 (이 경우 핵산 분자는 단지 표적 핵산에 결합하여 핵산의 전사, 번역 또는 다른 분자와의 결합을 차단함)과 같은 다른 기술에 비하여 유익할 수 있다. 이 잠재적인 효과는 리보자임이 효소적으로 작용하는 능력을 반영한다. 따라서, 단일 리보자임 분자는 표적 RNA 분자 다수를 절단할 수 있다. 또한, 리보자임은 일반적으로 결합의 염기 쌍 형성 기작뿐만 아니라 이 분자가 그것이 결합하는 RNA의 발현을 억제하는 기작에 의존하는 억제 특이성을 갖는, 매우 특이적인 억제제이다. 즉, 상기 억제는 RNA 표적의 절단에 의해 야기되며, 따라서 특이성은 비-표적 RNA의 절단 속도에 대한 표적 RNA의 절단 속도의 비율로 정의된다. 이 절단 기작은 염기 쌍 형성에 관련된 것에 더하여 부가적인 요소들에 의존한다. 따라서, 리보자임의 작용의 특이성은 동일한 RNA 부위에 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드보다 더 클 수 있다.
본 발명의 리보자임, 예를 들어 효소적 리보자임 RNA 분자는 해머해드 모티프, 헤어핀 모티프, 간염 델타 바이러스 모티프, 그룹 I 인트론 모티프 및/또는 RNA 가이드 서열과 연합된 RNaseP-유사 RNA로 형성될 수 있다. 해머해드 모티프의 예는 예를 들어, Rossi (1992) Aids Research and Human Retroviruses 8:183에 개시되고; 헤어핀 모티프는 Hampel (1989) Biochemistry 28:4929, 및 Hampel (1990) Nuc. Acids Res. 18:299에 개시되며; 간염 델타 바이러스 모티프는 Perrotta (1992) Biochemistry 31:16에 개시되며; RNaseP 모티프는 Guerrier-Takada (1983) Cell 35:849에 개시되며; 그리고 그룹 I 인트론은 Cech의 미국 특허 4,987,071호에 개시된다. 이들 특정 모티프의 언급은 제한의 의도가 아니다. 당업자는 본 발명의 리보자임, 예를 들어 본 발명의 효소적 RNA 분자가 표적 유전자 RNA 영역 중 하나 이상에 상보적인 특이적인 기질 결합 부위를 가질 수 있음을 인식할 것이다. 본 발명의 리보자임은 상기 기질 결합 부위내 또는 그 주위에 상기 분자에 RNA 절단 활성을 부여하는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
RNA 간섭 (RANi)
한 태양에서, 본 발명은 본 발명의 자일라나제 서열을 포함하는, RNA 억제 분자, 소위 "RNAi" 분자를 제공한다. 상기 RNAi 분자는 이중쇄 RNA (dsRNA) 분자를 포함한다. RNAi는 자일라나제 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 한 태양에서, RNAi는 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 그 이상 길이의 이중쇄 뉴클레오티드이다. 본 발명이 어느 특정 작용 기작에 의해 제한되지 않음에도 불구하고, RNAi는 세포에 들어가 내인성 mRNA를 비롯한 유사한 또는 동일한 서열의 단일쇄 RNA (ssRNA)의 분해를 야기할 수 있다. 세포가 이중쇄 RNA (dsRNA)에 노출될 경우, 상동성 유전자로부터의 mRNA는 RNA 간섭 (RNAi)로 불리는 과정에 의해 선택적으로 분해된다. RNAi의 가능한 기본 기작은 특정 유전자 서열에 매치하는 이중쇄 RNA (dsRNA)를 짧은 간섭 RNA로 불리는 작은 조각들로 분해하여, 그 서열에 매치하는 mRNA의 분해를 야기하는 것이다. 한 태양에서, 본 발명의 RNAi는 유전자-사일런싱 치료에 이용되며, 예를 들어, Shuey (2002) Drug Discov. Today 7:1040-1046을 참고한다. 한 태양에서, 본 발명은 본 발명의 RNAi를 이용하여 RNA를 선택적으로 분해하는 방법을 제공한다. 이 방법은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 실시될 수 있다. 한 태양에서, 본 발명의 RNAi 분자는 세포, 기관 또는 동물에서 기능 상실 돌연변이를 생성시키기 위해 이용될 수 있다. RNA를 선택적으로 분해시키기 위해 RNAi 분자를 만들고 이용하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제6,506,559호; 동 제6,511,824호; 동 제6,515,109호; 동 제6,489,127호를 참고한다.
핵산의 변형
본 발명은 본 발명의 핵산, 예를 들어 자일라나제를 암호화하는 핵산의 변이체를 생성하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 다양한 조합으로 반복되거나 이용되어 주형 핵산에 의해 암호화되는 자일라나제와 비교하여 변형되거나 상이한 활성 또는 변형되거나 상이한 안정성을 갖는 자일라나제를 생성할 수 있다. 이들 방법은 또한 예를 들어, 유전자/메시지 발현, 메시지 번역 또는 메시지 안정성에서 변화를 생성하기 위해 다양한 조합으로 반복되거나 이용될 수 있다. 다른 태양에서, 세포의 유전적 조성은 예를 들어 상동성 유전자의 생체외 변형 및 이것을 세포내로 삽입함으로써 변형될 수 있다.
본 발명의 핵산은 임의의 수단에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 임의의 또는 확률적인 방법, 또는, 비-확률적인, 또는 "지시된 진화" 방법이 있으며, 예를들어 미국 특허 6,361,974호를 참고한다. 유전자의 임의 돌연변이 방법은 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 5,830,696호를 참고한다. 예를 들어, 뮤타젠을 이용하여 유전자를 임의로 돌연변이시킬 수 있다. 뮤타젠은 예를 들어, 단독 또는 조합된, 자외선 또는 감마선, 또는 화학적 뮤타젠, 예, 미토마이신, 질산, 광활성화된 프소라렌을 포함하며 재조합에 의해 회복가능한 DNA 파괴를 유도한다. 다른 화학적 뮤타젠은 예를 들어, 소듐 비설파이트, 질산, 하이드록실아민, 하이드라진 또는 포름산을 포함한다. 다른 뮤타젠은 뉴클레오티드 전구체의 유사체, 예를 들어 니트로소구아니딘, 5-브로모우라실, 2-아미노퓨린, 또는 아크리딘이다. 이들 제제는 뉴클레오티드 전구체 대신 PCR 반응에 첨가되어 서열을 돌연변이시킬 수 있다. 프로플라빈, 아크리플라빈, 퀴나크린 등과 같은 인터킬레이트제 또한 이용될 수 있다.
분자 생물학의 임의의 기법, 예를 들어, 임의 PCR 돌연변이유발법이 이용될 수 있으며, 예를 들어 Rice (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5467-5471를 참고하며; 또는 조합 다중 카세트 돌연변이유발법이 이용될 수 있으며, 예를 들어 Crameri (1995) Biotechniques 18:194-196을 참고한다. 다르게는, 핵산, 예를 들어 유전자는 임의, 또는 "확률적" 단편화 후에 재조립될 수 있으며, 예를 들어 미국 특허 6,291,242호; 6,287,862호; 6,287,861호; 5,955,358호; 5,830,721호; 5,824,514호; 5,811,238호; 및 5,605,793호를 참고한다. 다른 태양에서, 에러-프론 PCR, 셔플링, 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이유발법, 조립 PCR, 성적 PCR 돌연변이유발법, 생체내 돌연변이유발법, 카세트 돌연변이유발법, 반복 앙상블 돌연변이유발법, 지수 앙상블 돌연변이유발법, 부위-특이적 돌연변이유발법, 유전자 재조립 (예, GeneReassembly (등록상표), 예를 들어 미국 특허 6.537,776호 참고), 유전자 부위 포화 돌연변이유발법 (GSSM (등록상표)), 합성 라이게이션 재조립 (SLR), 재조합, 반복성 서열 재조합, 포스포티오에이트-변형된 DNA 돌연변이유발법, 우라실-함유 주형 돌연변이유발법, 갭을 가진 이중쇄 돌연변이유발법, 점 미스매치 회복 돌연변이유발법, 회복-결핍 숙주 균주 돌연변이유발법, 화학적 돌연변이유발법, 방사능에 의한 돌연변이유발법, 결실 돌연변이유발법, 제한-선별 돌연변이유발법, 제한-정제 돌연변이유발법, 인공 유전자 합성, 앙상블 돌연변이유발법, 키메릭 핵산 다량체 생성, 및/또는 이들 및 다른 방법의 조합에 의해 변형, 부가 또는 결실이 도입된다.
하기 문헌은 본 발명의 방법에 통합될 수 있는 다양한 반복성 재조합 과정 및/또는 방법을 개시한다: Stemmer (1999) "Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties" Tumor Targeting 4:1-4; Ness (1999) Nature Biotechnology 17:893 -896; Chang (1999) "Evolution of a cytokine using DNA family shuffling" Nature Biotechnology 17:793-797; Minshull (1999) "Protein evolution by molecular breeding" Current Opinion in Chemical Biology 3:284-290; Christians (1999) "Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling" Nature Biotechnology 17:259-264; Crameri (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution" Nature 391:288-291; Crameri (1997) "Molecularevolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling," Nature Biotechnology 15:436-438; Zhang (1997) "Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Patten et al. (1997) "Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines" Current Opinion in Biotechnology 8:724-733; Crameri et al. (1996) "Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling" Nature Medicine 2:100-103; Gates et al. (1996) "Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac; repressor 'headpiece dimer, " Journal of Molecular Biology 255:373-386; Stemmer (1996) "Sexual PCR and Assembly PCR" In: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, New York. pp 457; Crameri and Stemmer (1995) "Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes" BioTechniques 18: 194-195; Stemmer et al. (1995) "Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxyribonucleotides" Gene, 164:49-53; Stemmer (1995) "The Evolution of Molecular Computation" Science 270: 1510; Stemmer (1995) "Searching Sequence Space" Bio/Technology 13:549-553; Stemmer (1994) "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling" Nature 370:389-391; 및 Stemmer (1994) "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution." Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:10747-10751.
다양성을 생성하는 돌연변이 방법은 예를 들어, 부위-지시된 돌연변이유발법 (Ling et al. (1997) "Approaches to DNA mutagenesis: an overview" Anal Biochem. 254 (2): 157-178; Dale et al. (1996) "Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method" Methods Mol. Biol. 57:369-374; Smith (1985) "In vitro mutagenesis" Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botstein & Shortle (1 985) "Strategies and applications of in vitro mutagenesis" Science 229:1193-1201; Carter (1986) "Site-directed mutagenesis" Biochem. J. 237:1-7; 및 Kunkel (1987) "The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis" in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin)); 우라실 함유 주형을 이용하는 돌연변이 (Kunkel (1985) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" Methods in Enzymol. 154, 367-382; 및 Bass et al. (1988) "Mutant Tip repressors with new DNA-binding specificities" Science 242:240-245); 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이유발법 (Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller (1982) "Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 -derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in anyDNA fragment" Nucleic Acids Res. 10:6487-6500; Zoller & Smith (1983) "Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors" Methods in Enzymol. 100:468-500; 및 Zoller (1987) Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template" Methods in Enzymol. 154:329-350); 포스포로티오에이트-변형된 DNA 돌연변이유발법 (Taylor (1985) "The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA" Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764; Taylor (1985) "The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA" Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye (1986) "Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis" Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698; Sayers (1988) "Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis" Nucl. Acids Res. 16:791-802; 및 Sayers et al. (1988) "Strand specific cleavage of phosphorothioate containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide" Nucl. Acids Res. 16: 803-814); 갭을 가진 이중쇄 DNA를 이용한 돌연변이 (Kramer et al. (1984) "The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction" Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer & Fritz (1987) Methods in Enzymol. "Oligo-nucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA" 154:350-367; Kramer (1988) "Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations" Nucl. Acids Res. 16: 7207; 및 Fritz (1988) "Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro" Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999)를 포함한다.
본 발명을 실시하기 위해 이용될 수 있는 추가의 프로토콜은 점 미스매치 회복 (Kramer (1984) "Point Mismatch Repair" Cell 38:879-887), 회복-결핍 숙주 균주를 이용한 돌연변이유발법 (Carter et al. (1985) "Improved oligonucleotide site directed mutagenesis using M13 vectors" Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443; 및 Carter (1987) "Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors" Methods in Enzymol. 154. 382-403), 결실 돌연변이유발법 (Eghtedarzadeh (1986) "Use of oligonucleotides to generate large deletions" Nucl. Acids Res. 14: 5115), 제한-선별 및 제한-선별과 제한-정제 (Wells et al. (1986) "Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin" Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317. 415-423), 전체 유전자 합성에 의한 돌연변이유발법 (Nambiar et al. (1984) "Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein" Science 223: 1299-1301; Sakarriar and Khorana (1988) "Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-bindingprotein (transducin) " Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372; Wells et al. (1985) "Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites" Gene 34:315-323; 및 Grundstrom et al. (1985) "Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis" Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316), 이중쇄 파괴 회복 (Mandecki (1986); Arnold (1993) "Protein engineering for unusual environments" Current Opinion in Biotechnology 4:450 "Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181)을 포함한다. 상기 방법의 다수에 대한 추가의 상세 사항은 다양한 돌연변이유발 방법의 문제점을 위한 유용한 조절법을 개시하는 Methods in Enzymology Volume 154에 개시되어 있다.
본 발명을 실시하기 위해 이용될 수 있는 프로토콜은 Stemmer의 미국 특허 제5,605,793호 (1997년 2월 25일), "Methods for In Vitro Recombination"; Stemmer 등의 미국 특허 5,811,238호 (1998년 9월 22) "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination"; Stemmer 등의 미국 특허 제5,830,721호 (1998년 11월 3), "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly;" Stemmer 등의 미국 특허 제5,834,252호 (1998년 11월 10) "End-Complementary Polymerase Reaction;" Minshull 등의 미국 특허 5,837,458호 (1998년 11월 17), "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering"; Stemmer와 Crameri의 WO95/22625호, "Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"; Stemmer와 Lipschutz의 WO 96/33207호 "End Complementary Polymerase Chain Reaction"; Stemmer와 Crameri의 WO 97/20078호 "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination"; Minshull 과 Stemmer의 WO 97/35966호 "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering"; Punnonen 등의 WO 99/41402호 "Targeting of Genetic Vaccine Vectors"; Punnonen 등의 WO 99/41383호 "Antigen Library Immunization"; Punnonen 등의 WO 99/41368호 "Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines"; Stemmer와 Crameri의 EP 752008호 "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"; Stemmer의 EP 0932670호 "Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination"; Stemmer 등의 WO 99/23107호 "Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genomes Shuffling"; Apt 등의 WO 99/21979호 "Human Papillomavirus Vectors"; Cardayre 등의 WO 98/31837호 "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination"; Patten 및 Stemmer의 WO 98/27230호 "Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection"; WO 00/00632호, "Methods for Generating Highly Diverse Libraries", WO 00/09679, "Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotides Sequence Banks and Resulting Sequences"; Arnold 등의 WO 98/42832호 "Recombination of Polynucleotide Sequence Using Random or Defined Primers"; Arnold 등의 WO99/29902호 "Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences"; Vind 의 WO 98/41653호 "An in Vitro Method for Construction of a DNA Library", Borchert 등의 WO 98/41622호, "Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling," 및 Pati와 Zarling의 WO 98/42727호, "Sequence Alterations using Homologous Recombination."에 개시된다.
본 발명을 실시하기 위해 이용될 수 있는 프로토콜은 (다양한 다양성 생성 방법에 관한 상세 사항을 제공함) 예를 들어 1999년 9월 28일에 출원된 Patten 등의 미국 특허 출원 (USSN) 제09/407,800호, "SHUFFLING OF CODON ALTERED GENES" ; del Cardayre 등의 미국 특허 제6,379,964호, "EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION"; Crameri 등의 "OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION", 미국 특허 제6,319,714호; 동 제6,368,861호; 동 제6,376,246호; 동 제6,423,542호; 동 제6,426,224호 및 PCT/US00/01203호; Welch 등의 "USE OF CODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUFFLING", 미국 특허 제6,436,675호; 2000년 1월 18일에 Selifonov 등이 출원한 "METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS" (PCT/US00/01202) 및 예를 들어, 2000년 1월 18일에 Selifonov 등이 출원한 "METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS" (미국 특허 출원 제09/618,579호); 2000년 1월 18일에 Selifonov와 Stemmer가 출원한 "METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS" (PCT/US00/01138); 및2000년 9월 6일에 Afffiolter가 출원한 "SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATEMEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLATION" (미국 특허 출원 제09/656,549호); 및 미국 특허 제6,177,263호; 동 제6,153,410호에 개시된다.
비-확률적, 또는 "지시된 진화" 방법은 예를 들어 포화 돌연변이 유발법 (GSSMTM), 합성 라이게이션 재조립 (SLR), 또는 그 조합을 이용하여 본 발명의 핵산을 변형시켜 새로운 또는 변형된 특성 (예, 매우 산성 또는 염기성 조건, 높거나 낮은 온도 하에서의 활성 등)을 갖는 자일라나제를 생성한다. 변형된 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드는 자일란 가수분해 또는 다른 활성에 대해 시험하기 전에 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어 모세관 어레이 플랫폼을 이용하는 것과 같은 임의의 시험 양식 또는 프로토콜을 이용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,361,974호; 동 제6,280,926호; 동 제5,939,250호를 참고한다.
포화 돌연변이유발, 또는 GSSM TM
일 측면에서, 축퇴성 N,N,G/T 서열을 포함하는 코돈 프라이머를 사용하여 점 돌연변이를 폴리뉴클레오티드, 예컨대 크실라나제 또는 본 발명의 항체에 도입하여, 전범위의 단일 아미노산 치환이 각 아미노산 위치, 예컨대 변형하고자 하는 표적화된 리간드 결합 부위 또는 효소 활성 부위 내의 아미노산 잔기에 나타나는 자손 폴리펩티드 세트를 형성한다. 이들 올리고뉴클레오티드는 인접한 제1 상동성 서열, 축퇴성 N,N,G/T 서열 및 경우에 따라 제2 상동성 서열을 포함할 수 있다.N,N,G/T 서열의 축퇴성은 모든 20개 아미노산에 대한 코돈을 포함하기 때문에, 그러한 올리고뉴클레오티드의 사용으로 얻은 하류 자손 전사 생성물은 폴리펩티드를 따라 각 아미노산 부위에서의 모든 가능한 아미노산 변화를 포함한다. 일 측면에서, 그러한 축퇴성 올리고뉴클레오티드(예컨대 하나의 축퇴성 N,N,G/T 카세트를 포함함)는 어버이 폴리뉴클레오티드 주형의 각각의 본래 코돈을 전체 범위의 코돈 치환시키는 데 사용된다. 또 다른 측면에서, 어버이 폴리뉴클레오티드 주형 내의 2개 이상의 본래 코돈을 전범위의 코돈 치환시키기 위해 2개 이상의 축퇴성 카세트가- 동일한 올리고뉴클레오티드 내인지 여부와 관련없이- 사용된다. 예를 들어, 하나 이상의 N,N,G/T 서열을 하나의 올리고뉴클레오티드에 포함시켜 하나 이상의 부위에 아미노산 돌연변이를 도입할 수 있다. 다수의 N,N,G/T 서열은 직접 인접하고 있거나, 또는 하나 이상의 추가의 뉴클레오티드 서열(들)에 의해 분리되어 있을 수 있다. 또 다른 측면에서, 삽입 및 결실을 도입하기 위해 사용가능한 올리고뉴클레오티드를 단독으로, 또는 N,N,G/T 서열을 함유하는 코돈과 함께 사용하여 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환의 임의의 조합 또는 순열을 도입할 수 있다.
일 측면에서, 2개 이상의 인접하는 아미노산 위치의 동시 돌연변이유발은 인접하는 N,N,G/T 트리플릿, 즉 축퇴성 (N,N,G/T)n 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 실시한다. 또 다른 측면에서, N,N,G/T 서열보다 축퇴성이 적은 축퇴성 카세트가 사용된다. 예를 들어, 일부 예에서 하나의 N만을 포함하는 축퇴성 트리플릿 서열을 (예컨대 올리고뉴클레오티드 중에) 사용하는 것이 바람직할 수 있으며, 여기서 상기 N은 트리플릿의 제1, 제2 또는 제3 위치내에 있을 수 있다. 임의의 조합 및 순열을 비롯한 임의의 다른 염기를 트리플릿의 남은 2개 위치에 사용할 수 있다. 대안적으로, 일부 예에서는 축퇴성 N,N,N 트리플릿 서열을 (예컨대 올리고뉴클레오티드 중에서) 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
일 측면에서, 축퇴성 트리플릿(예, N,N,G/T 트리플릿)을 사용하면 (총 20개 아미노산에 대한) 가능한 전범위의 천연 아미노산을 폴리펩티드 내의 각각의 모든 아미노산 위치로 체계적이고 수월하게 형성할 수 있다(대안적인 측면에서, 이 방법은 아미노산 잔기 또는 코돈, 위치당 모든 가능한 치환보다 적은 형성을 포함한다). 예를 들어, 100 아미노산 폴리펩티드의 경우, 2000개의 특징적인 종(즉, 위치당 20개의 가능한 아미노산 X 100 아미노산 위치)이 형성될 수 있다. 축퇴성 N,N,G/T 트리플릿을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하면, 32개의 각 서열은 20개의 가능한 모든 천연 아미노산을 암호화할 수 있다. 따라서, 하나 이상의 그러한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 어버이 폴리뉴클레오티드 서열을 포화 돌연변이유발시키는 반응 용기에서, 20개의 특징적인 폴리펩티드를 암호화하는 32개의 특징적인 자손 폴리뉴클레오티드가 형성된다. 대조적으로, 부위 지향적 돌연변이유발에서 비축퇴성 올리고뉴클레오티드의 사용은 반응 용기당 오직 한개의 자손 폴리펩티드 산물을 유도한다. 비축퇴성 올리고뉴클레오티드는 경우에 따라서 개시된 축퇴성 프라이머와 함께 사용될 수 있다; 예를 들어, 비축퇴성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 작용 폴리뉴클레오티드 내의 특이적 점 돌연변이를 형성할 수 있다. 이것은 특이적 침묵 점 돌연변이, 상응하는 아미노산 변화를 초래하는 점 돌연변이, 및 종지 코돈의 형성과 폴리펩티드 단편의 상응하는 발현을 유발하는 점 돌연변이를 형성하는 수단을 제공한다.
일 측면에서, 각각의 포화 돌연변이유발 반응 용기는, 어버이 폴리뉴클레오티드에서 돌연변이유발된 코돈 위치에 상응하는 하나의 특이적 아미노산 위치에서 모든 20개의 천연 아미노산이 나타나도록 20개 이상의 자손 폴리펩티드(예, 크실라나제) 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다(다른 측면에서는 모든 20개 천연 조합 미만을 이용한다). 각 포화 돌연변이유발 반응 용기로부터 형성된 32배 축퇴성 자손 폴리펩티드를 클론 증폭시키고(예컨대, 발현 벡터를 사용하여 적절한 숙주(예, 이.콜리 숙주)로 클로닝시킴), 발현 스크리닝한다. 스크리닝으로 바람직한 성질 변화(어버이 폴리펩티드와 비교하여, 예컨대 알칼리 또는 산성 조건 하에 크실란 가수분해 활성 증가)를 나타내는 각 자손 폴리펩티드가 확인되면, 그 내부에 포함된 상응하게 바람직한 아미노산 치환을 확인하기 위해 서열 결정할 수 있다.
일 측면에서, 본 명세서에 개시된 바와 같이 포화 돌연변이유발을 사용하여 어버이 폴리펩티드 내의 각각의 모든 아미노산 위치를 돌연변이시키면, 하나 이상의 아미노산 위치에서 바람직한 아미노산 변화가 확인될 수 있다. 바람직한 아미노산 치환 전체 또는 일부의 조합을 포함하는 하나 이상의 신규한 자손 분자를 형성할 수 있다. 예를 들어, 2 특이적인 바람직한 아미노산 변화가 폴리펩티드 중 3 아미노산 위치 각각에서 확인되는 경우, 순열은 각 위치(본래 아미노산으로부터의 변화가 없는 경우, 및 2가지 바람직한 변화 각각) 및 3개 위치에서 3가지 가능성을 포함한다. 따라서, 미리 시험된 6개의 단일 점 돌연변이(즉, 3개 위치 각각에서 2개) 및 임의의 위치에서의 무변화인 7 경우를 비롯하여 전체 가능성은 3 x 3 x 3, 즉 27이다.
또 다른 측면에서, 스크리닝과 병행하여, 부위 포화 돌연변이유발을 셔플링, 키메라, 재조합 및 기타 돌연변이유발 과정과 함께 사용할 수 있다. 본 발명은 포화 돌연변이유발을 비롯한 임의의 돌연변이유발 과정(들)을 반복적 방식으로 이용한다. 한가지 적례에서, 임의의 돌연변이유발 과정(들)의 반복적 사용을 스크리닝과 조합하여 이용한다.
또한 본 발명은 전범위의 단일 아미노산 치환이 각 아미노산 위치에서 나타나는(유전자 부위 포화된 돌연변이유발(GSSMTM)) 자손 폴리펩티드 세트를 형성하기 위해서, 점 돌연변이를 폴리뉴클레오티드로 도입하기 위한 (축퇴성 N,N,N 서열을 포함하는) 독점의 코돈 프라이머의 용도를 제공한다. 사용된 올리고뉴클레오티드는 제1 상동성 서열, 축퇴성 N,N,N 서열 및 바람직하지만 필수적인 것은 아닌 제2 상동성 서열을 인접한 상태로 포함한다. N,N,N 서열의 축퇴성은 모든 20개 아미노산에 대한 코돈을 포함하기 때문에, 그러한 올리고뉴클레오티드의 사용으로부터 생긴 하류 자손 번역 생성물은 폴리펩티드를 따라 각 아미노산 부위에서 모든 가능한 아미노산 변화를 포함한다.
일 측면에서, 그러한 하나의 축퇴성 올리고뉴클레오티드(하나의 축퇴성 N,N,N 카세트를 포함함)는 어버이 폴리뉴클레오티드 주형 내의 각각의 본래 코돈을 전범위 코돈 치환시키는 데 사용된다. 또 다른 측면에서, 어버이 폴리뉴클레오티드주형 내의 2개 이상의 본래 코돈을 전범위의 코돈 치환시키기 위해 2개 이상의 축퇴성 N,N,N 카세트가- 동일한 올리고뉴클레오티드 내인지 여부와 관련없이- 사용된다. 따라서, 하나 이상의 N,N,N 서열을 하나의 올리고뉴클레오티드에 포함시켜 하나 이상의 부위에 아미노산 돌연변이를 도입할 수 있다. 다수의 N,N,N 서열은 직접 인접하고 있거나, 또는 하나 이상의 추가의 뉴클레오티드 서열(들)에 의해 분리되어 있을 수 있다. 또 다른 측면에서, 삽입 및 결실을 도입하기 위해 사용가능한 올리고뉴클레오티드를 단독으로, 또는 N,N,N 서열을 함유하는 코돈과 함께 사용하여 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환의 임의의 조합 또는 순열을 도입할 수 있다.
특정 적례에서, 인접하는 N,N,N 트리플릿, 즉 축퇴성 (N,N,N)n서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 2 이상의 인접한 아미노산 위치를 동시에 돌연변이시킬 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 N,N,N 서열보다 축퇴성이 적은 축퇴성 카세트의 사용을 포함한다. 예를 들어, 일부 예에서 하나의 N만을 포함하는 축퇴성 트리플릿 서열을 (예컨대 올리고뉴클레오티드 중에) 사용하는 것이 바람직할 수 있으며, 여기서 상기 N은 트리플릿의 제1, 제2 또는 제3 위치내에 있을 수 있다. 임의의 조합 및 순열을 비롯한 임의의 다른 염기를 트리플릿의 남은 2개 위치에 사용할 수 있다. 대안적으로, 일부 예에서는 축퇴성 N,N,N 트리플릿 서열, N,N.G/T 또는 N,N,G/C 트리플릿 서열을 (예컨대 올리고뉴클레오티드 중에서) 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
그러나, 본 명세서 중에 개시된 축퇴성 트리플릿(예, N,N,G/T 또는 N,N,G/C 트리플릿 서열)의 사용은 몇몇 이유로 유리할 것으로 예상된다. 일 측면에서, 본 발명은 (총 20개의 아미노산에 대한) 전범위의 가능한 아미노산의 치환을 폴리펩티드의 각각의 모든 아미노산 위치에 체계적으로 꽤 수월하게 형성하는 수단을 제공한다. 따라서, 100 아미노산 폴리펩티드에 대하여, 본 발명은 2000개의 별개의 종(즉, 위치당 20개의 가능한 아미노산 X 100개 아미노산 위치)을 체계적으로 매우 수월하게 형성하는 방법을 제공한다. 축퇴성 N,NG/T 또는 N,N,G/C 트리플릿 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 사용하면 20개의 가능한 아미노산에 대해 암호화하는 32개의 개별 서열이 제공된다. 따라서, 그러한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 어버이 폴리뉴클레오티드 서열을 포화 돌연변이유발시키는 반응 용기에서, 20개의 별개의 폴리펩티드를 암호화하는 32개의 별개의 자손 폴리뉴클레오티드가 형성된다. 대조적으로, 부위 지정 돌연변이유발법에서의 비-축퇴성 올리고뉴클레오티드의 사용은 반응 용기당 단 하나의 자손 폴리펩티드 생성물을 유도한다.
본 발명은 또한 개시된 축퇴성 프라이머와 함께 경우에 따라 사용될 수 있는 비축퇴성 올리고뉴클레오티드의 사용에 관한 것이다. 일부 상황에서 작용 폴리뉴클레오티드 내에 특이적 점 돌연변이를 형성하기 위해 비축퇴성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이 유리할 것으로 예상된다. 이것은 특이적인 침묵 점 돌연변이, 상응하는 아미노산 변화를 초래하는 점 돌연변이 및 종지 코돈의 형성과 폴리펩티드 단편의 상응하는 발현을 유발하는 점 돌연변이를 형성하는 수단을 제공한다.
본 발명의 일 측면에서, 각 포화 돌연변이유발 반응 용기는 적어도 20개의자손 폴리펩티드 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 어버이 폴리뉴클레오티드에서 돌연변이된 코돈 위치에 상응하는 하나의 특이적 아미노산 위치에 모든 20개 아미노산이 나타나도록 한다. 각 포화 돌연변이유발 반응 용기로부터 형성된 32배 축퇴성 자손 폴리펩티드를 클론 증폭시키고(예컨대, 발현 벡터를 사용하여 적절한 이.콜리 숙주로 클로닝시킴), 발현 스크리닝한다. 스크리닝으로 (어버이 폴리펩티드와 비교하여) 바람직한 성질 변화를 나타내는 각 자손 폴리펩티드가 확인되면, 그 내부에 포함된 상응하게 바람직한 아미노산 치환을 확인하기 위해 서열 결정할 수 있다.
일 측면에서, 본 명세서에 개시된 바와 같이 포화 돌연변이유발을 사용하여 어버이 폴리펩티드 내의 각각의 모든 아미노산 위치를 돌연변이시키면, 하나 이상의 아미노산 위치에서 바람직한 아미노산 변화가 확인될 수 있다. 바람직한 아미노산 치환 전체 또는 일부의 조합을 포함하는 하나 이상의 신규한 자손 분자를 형성할 수 있다. 예를 들어, 2 특이적인 바람직한 아미노산 변화가 폴리펩티드 중 3 아미노산 위치 각각에서 확인되는 경우, 순열은 각 위치(본래 아미노산으로부터의 변화가 없는 경우, 및 2가지 바람직한 변화 각각) 및 3개 위치에서 3가지 가능성을 포함한다. 따라서, 미리 시험된 6개의 단일 점 돌연변이(즉, 3개 위치 각각에서 2개) 및 임의의 위치에서의 무변화인 7 경우를 비롯하여 전체 가능성은 3 x 3 x 3, 즉 27이다.
따라서, 비제한적인 적례에서, 본 발명은 2 이상의 관련 폴리뉴클레오티드가 적절한 숙주 세포 내로 도입되어 하이브리드 폴리뉴클레오티드가 재조합 및 감법재분류에 의해 형성되는 방법과 같은 추가의 돌연변이화 방법과 함께 포화 돌연변이유발법을 사용하는 것을 제공한다.
전체 유전자 서열을 따라 돌연변이유발시키는 것 외에, 본 발명에서는 폴리뉴클레오티드 서열 내의 임의의 수의 염기 각각을 치환하는 데 돌연변이유발법을 사용할 수 있으며, 이 때 돌연변이화하려는 염기의 수는 바람직하게는 15∼100,000의 모든 정수이다. 따라서, 분자를 따라 모든 위치에서 돌연변이시키는 대신에, 모든 또는 이산된 수의 염기(바람직하게는 총 15∼100,000의 서브세트)를 돌연변이유발시킬 수 있다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드 서열을 따라 각 위치 또는 위치군을 돌연변이유발하는 데 별도의 뉴클레오티드를 사용한다. 돌연변이하고자 하는 3위치군은 코돈일 수 있다. 돌연변이성 카세트라고도 하는 이종성 카세트를 포함하는 돌연변이성 프라이머를 사용하여 돌연변이를 도입하는 것이 바람직하다. 예시적 카세트는 1∼500 염기를 가질 수 있다. 그러한 이종성 카세트 내의 각 뉴클레오티드 위치는 N, A, C, G, T, A/C, A/G, A/T, C/G, C/T, G/T, C/G/T, A/G/T, A/C/T, A/C/G 또는 E이며, 여기서 E는 A, C, G 또는 T가 아닌 임의의 염기이다(E는 디자이너 올리고뉴클레오티드라고도 언급될 수 있음).
일반적인 의미에서, 포화 돌연변이유발은 돌연변이시키고자 하는 규명된 폴리뉴클레오티드(이 때 돌연변이시키고자 하는 서열은 바람직하게는 약 15∼100,000 염기 길이임) 내의 돌연변이성 카세트의 완전한 세트(이 때, 각 카세트는 바람직하게는 약 1∼500 염기 길이임)를 돌연변이시키는 것을 포함한다. 따라서, 돌연변이군(1∼100 돌연변이)을 돌연변이시키고자 하는 각 카세트에 도입한다. 하나의 카세트 내로 도입하고자 하는 돌연변이의 그룹핑은, 포화 돌연변이 1회 적용 과정에서 제2 카세트로 도입하고자 하는 돌연변이의 제2 그룹핑과 상이하거나 또는 동일할 수 있다. 그러한 그룹핑의 예는 결실, 첨가, 특정 코돈의 그룹핑 및 특정 뉴클레오티드 카세트의 그룹핑이다.
돌연변이시키고자 하는 규명된 서열은 전체 유전자, 경로, cDNA, 전체 오픈 리딩 프레임(ORF) 및 전체 프로모터, 인헨서, 리프레서/트랜스액티베이터, 복제 기점, 인트론, 오퍼레이터 또는 임의의 폴리뉴클레오티드 작용기를 포함한다. 일반적으로, 이러한 목적의 "소정 서열"은 임의의 폴리뉴클레오티드, 즉 15염기 폴리뉴클레오티드 서열과 15∼15,000 염기의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다(본 발명은 구체적으로 그 사이의 모든 정수를 포함한다). 코돈의 그룹핑을 선택하는 데 있어서의 고려 사항으로는 축퇴성 돌연변이 카세트가 암호화하는 아미노산의 유형이 포함된다.
돌연변이성 카세트로 도입할 수 있는 돌연변이의 그룹핑의 일례에서, 본 발명은 각 위치에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20 아미노산에 대해 암호화하는 (축퇴성 올리고뉴클레오티드를 사용한) 축퇴성 코돈 치환 및 이에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 라이브러리를 제공한다.
합성 연결 재조립(SLR)
본 발명은 신규하거나 변형된 성질을 갖는 폴리펩티드, 예컨대 크실라나제 또는 본 발명의 항체를 형성하는 "유도성 진화 과정"인 "합성 연결 재조립" 또는 간단히 "SLR"이라고 하는 비확률론적인 유전자 변형 시스템을 제공한다.
SLR은 비확률론적으로 올리고뉴클레오티드 단편을 함께 연결시키는 방법이다. 이 방법은 핵산 빌딩 블록이 셔플링, 농축 또는 무작위하게 키메라화되지 않는다는 점에서 확률론적인 올리고뉴클레오티드 셔플링과는 다르며, 오히려 비확률론적으로 조립된다. 예컨대 "Synthetic Ligation Reassembly in Directed Evolution"이라는 명칭으로 1999년 6월 14일에 출원된 미국 특허 출원(USSN) 09/332,835호 ("USSN 09/332,835호") 참조. 일 측면에서, SLR은 하기의 단계들을 포함한다: (a) 상동성 유전자를 암호화하는 서열을 포함하는 주형 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계; (b) 소정의 서열에서 주형 폴리뉴클레오티드와 교차 재조립하도록 고안되고, 주형 폴리뉴클레오티드의 측면에 있는 변종 서열에 상동성인 서열 및 상동성 유전자 변종인 서열을 포함하는 다수의 빌딩 블록 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계; (c) 빌딩 블록 폴리뉴클레오티드를 주형 폴리뉴클레오티드와 조합하여 빌딩 블록 폴리뉴클레오티드를 주형 폴리뉴클레오티드와 교차 재조립하여 상동성 유전자 서열 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계.
SLR은 재배열하고자 하는 폴리뉴클레오티드 사이의 높은 레벨의 상동성의 존재에 따라 좌우되지 않는다. 따라서, 이 방법을 사용하여 10100이상의 상이한 키메라를 포함하는 자손 분자의 라이브러리(또는 세트)를 비확률론적으로 형성할 수 있다. SLR을 이용하여 101000이상의 상이한 자손 키메라를 포함하는 라이브러리를 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 측면들은 디자인에 의해 선택된 전체 조립 순서로 축소된 최종 키메라 핵산 분자 세트를 생성하는 비확률론적인 방법을 포함한다.이 방법은 사용가능한 상호 상용성 연결성 말단을 갖는 다수의 특이적 핵산 빌딩 블록을 디자인으로 형성하는 단계, 및 이들 핵산 빌딩 블록을 조립하는 단계를 포함하여 디자인된 전체 조립 순서를 실현한다.
조립하고자 하는 핵산 빌딩 블록의 상호 상용성 연결성 말단은, 소정 순서로 빌딩 블록을 커플링시킬 수 있는 경우 이러한 유형의 순서에 따른 조립에 대해 '사용가능한' 것으로 간주된다. 따라서, 핵산 빌딩 블록이 커플링될 수 있는 전체 조립 순서를 연결성 말단의 디자인으로 특정한다. 하나 이상의 조립 단계를 사용하는 경우, 핵산 빌딩 블록이 커플링될 수 있는 전체 조립 순서는 조립 단계(들)의 순차적인 순서에 의해 특정된다. 일 측면에서, 어닐링된 빌딩 조각을 효소, 예컨대 리가제(예, T4 DNA 리가제)로 처리하여 빌딩 조각의 공유 결합을 형성한다.
일 측면에서, 올리고뉴클레오티드 빌딩 블록의 디자인은 최종 키메라 폴리뉴클레오티드의 자손 세트를 생성하는 베이스로서 작용하는 선조 핵산 서열 주형의 세트를 분석하여 얻는다. 따라서, 이들 어버이 올리고뉴클레오티드 주형은 돌연변이시키고자 하는, 예컨대 키메라화 또는 셔플링시키고자 하는 핵산 빌딩 블록의 디자인을 보조하는 서열 정보원으로서 작용한다. 본 발명의 일 측면에서, 다수의 어버이 핵산 주형의 서열을 정렬시켜 하나 이상의 분계점(demarcation point)을 선택한다. 분계점은 상동성 영역에 위치할 수 있으며, 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 이들 분계점은 선조 주형 중 2개 이상과 공유되는 것이 바람직하다. 분계점을 사용하여 어버이 폴리뉴클레오티드를 재배열하기 위해 형성하고자 하는 올리고뉴클레오티드 빌딩 블록의 경계를 정할 수 있다. 선조 분자 내에서 확인 및 선택된 분계점은 최종 키메라 자손 분자의 조립시 유효 키메라점으로서 작용한다. 분계점은 2 이상의 어버이 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 공유되는 상동성 영역(하나 이상의 상동성 뉴클레오티드 염기를 포함함)일 수 있다. 대안적으로, 분계점은 어버이 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 1/2에 의해 공유되는 상동성 영역이거나, 또는 어버이 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 2/3에 의해 공유되는 상동성 영역일 수 있다. 더욱 더 바람직하게는 작용가능한 분계점은 어버이 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 3/4에 의해 공유되는 상동성 영역이거나, 또는 거의 모든 어버이 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 공유될 수 있다. 일 측면에서, 분계점은 모든 어버이 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 공유되는 상동성 영역이다.
일 측면에서, 자손 키메라 폴리뉴클레오티드의 남김없는 라이브러리를 형성하기 위해서 연결 재조립 과정을 철저히 실시한다. 즉, 핵산 빌딩 블록의 모든 가능한 순서의 조합이 최종 키메라 핵산 분자 세트 내에 나타난다. 동시에, 또 다른 측면에서, 각 조합의 조립 순서(즉, 각 최종 키메라 핵산의 5' → 3' 서열에서 각 빌딩 블록의 조립 순서)는 전술한 바와 같이 디자인에 의한다(즉, 비확률론적임). 본 발명의 비확률론적 특성으로 인하여, 원하지 않는 부산물의 가능성이 크게 감소된다.
또 다른 측면에서, 연결 조립 방법은 체계적으로 실시한다. 예를 들어, 자손 분자의 체계적으로 구획화된 라이브러리를 형성하기 위해서 이 방법을 실시하는 데, 구획은 예컨대 하나씩 체계적으로 스크리닝될 수 있다. 다시 말하면, 본 발명에 따르면, 순차적 단계의 조립 반응의 선별적이고 적절한 사용과 함께, 특이적 핵산빌딩 블록의 선별적이고 적절한 사용을 통해 특정 자손 생성물 세트가 일부 반응 용기 각각에서 제조되는 디자인을 실현할 수 있다. 이로 인하여 체계적 조사 및 스크리닝 절차가 실시 가능해진다. 따라서, 이들 방법에서는 잠재적으로 매우 많은 수의 자손 분자를 더 적은 군에서 체계적으로 검사할 수 있게 된다. 매우 융통성이 있지만 철저하고 체계적인 방법으로 키메라화를 실시하는 능력으로 인하여, 특히 선조 분자들 사이의 상동성 레벨이 낮은 경우, 이들 방법은 다수의 자손 분자를 포함하는 라이브러리(또는 세트)를 형성한다. 본 연결 재조립 발명의 비확률론적인 특성으로 인하여, 생성된 자손 분자는 디자인에 의해 선택된 전체 조립 순서를 갖는 최종 키메라 핵산 분자의 라이브러리를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 포화 돌연변이유발 및 최적화된 유도성 진화 방법을 사용하여 상이한 자손 분자 종을 형성할 수 있다. 본 발명은 분계점의 선택, 핵산 빌딩 블록의 크기 및 수, 그리고 커플링의 크기 및 디자인에 관해 자유로히 선택하고 조절할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 작동능을 위한 분자간 상동성에 대한 요건은 매우 완화될 것으로 예상된다. 실제로, 분계점은 분자간 상동성이 거의 또는 전혀 없는 영역에서 선택할 수 있다. 예를 들어, 코돈 동요, 즉 코돈의 축퇴성으로 인하여, 상응하는 선조 주형에서 본래 암호화된 아미노산을 변경하지 않고 뉴클레오티드 치환을 핵산 빌딩 블록 내로 도입할 수 있다. 대안적으로, 본래의 아미노산에 대한 암호가 변경되도록 코돈을 변경할 수 있다. 본 발명은 그러한 치환을 핵산 빌딩 블록 내에 도입하여 분자간 상동성 분계점의 발생을 증가시키고, 따라서 빌딩 블록 중에서 증가된 수의 커플링을 실현할 수 있으며, 이는 더 많은 수의 자손 키메라 분자를 형성할 수 있게 한다.
합성 유전자 재조립
일 측면에서, 본 발명은 합성 유전자 재조립(예, GeneReassemblyTM, 예컨대 미국 특허 제6,537,776호 참조)라고 하는 비확률론적 방법을 제공하는 데, 이 방법은 핵산 빌딩 블록이 셔플링되거나 농축되거나 또는 무작위적으로 키메라화되지 않는다는 점에서 확률론적인 셔플링과는 다르며, 그 보다는 비확률론적으로 조립된다.
합성 유전자 재조립법은 셔플링하고자 하는 폴리뉴클레오티드 사이의 높은 레벨의 상동성의 존재에 따라 달라지지 않는다. 본 발명을 이용하여 10100이상의 상이한 키메라를 포함하는 자손 분자의 라이브러리(또는 세트)를 비확률론적으로 형성할 수 있다. 생각할 수 있는 바로는, 합성 유전자 재조립을 이용하여 101000이상의 상이한 자손 키메라를 포함하는 라이브러리를 형성할 수 있다.
따라서, 일 측면에서, 본 발명은 디자인에 의해 선택된 전체 조립 순서를 갖는 최종 키메라 핵산 분자 세트를 생성하는 비확률론적인 방법을 제공하는 데, 이 방법은 상호 상용성 연결성 말단을 갖는 다수의 특이적 핵산 빌딩 블록을 디자인에 의해 형성하는 단계, 및 이들 핵산 빌딩 블록을 조립하는 단계를 포함하여, 디자인된 전체 조립 순서를 실현한다.
일 측면에서, 합성 유전자 재조립은 1) 하나 이상의 조상 또는 어버이 세대 주형(들)으로부터, 돌연변이시켜 하나 이상의 점 돌연변이, 삽입, 결실 및/또는 키메라화를 실시한 (폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분자, 예컨대 폴리펩티드 암호 서열을 포함하는 분자를 비롯한) 자손 세대의 분자(들)를 제조하는 단계, 2) 예컨대 고 처리량 방법을 이용하여 주목되는 하나 이상의 성질(예, 효소 활성의 개선)에 대해 자손 세대 분자(들)를 스크리닝하는 단계; 3) 경우에 따라서, 어버이 및/또는 자손 세대 분자에 관한 구조 및/또는 기능 정보를 얻고/또는 분류하는 단계; 4) 경우에 따라 1) 내지 3) 중 임의의 단계를 반복하는 단계의 방법을 포함한다. 일 측면에서, "코돈 부위 포화 돌연변이유발"시 (예컨대 어버이 폴리뉴클레오티드 주형으로부터) 자손 세대의 폴리뉴클레오티드가 형성되며, 각각은 3개 이하의 인접 점 돌연변이(즉 새로운 코돈을 포함하는 상이한 염기들)의 세트를 하나 이상 갖고 있어서, 모든 코돈(또는 동일한 아미노산을 암호화하는 축퇴성 코돈의 모든 패밀리)이 각 코돈 위치에 나타난다. 이러한 자손 세대 폴리뉴클레오티드에 상응하고 이에 의해 암호화된 자손 폴리펩티드 세트가 형성되며, 이들 각각은 하나 이상의 단일 아미노산 점 돌연변이를 갖는다. 일 측면에서, "아미노산 부위 포화 돌연변이유발"시 폴리펩티드를 따라 각각의 모든 아미노산 위치에서 19개의 자연적으로 암호화된 폴리펩티드 형성 알파 아미노산 치환 각각에 대해 그러한 돌연변이 폴리펩티드 1개가 형성된다. 이는, 어버이 폴리펩티드를 따라 각각의 모든 아미노산 위치에 대해, 본래의 아미노산을 비롯한 총 20개의 별개의 자손 폴리펩티드, 또는 20개의 자연적으로 암호화된 아미노산 대신에 또는 이와 함께 부가의 아미노산이 사용된 경우 가능하게는 21개 이상의 별개의 자손 폴리펩티드를 형성한다.
따라서, 일 측면에서, 20개의 자연적으로 암호화된 폴리펩티드 형성 알파 아미노산 외에 및/또는 이와 조합하여, 기타의 희소한 및/또는 자연적으로 암호화되지 않는 아미노산 및 아미노산 유도체를 포함하는 돌연변이를 형성하는 데 이 방법이 이용가능하다. 또 다른 측면에서, 적절한 숙주의 천연 또는 비변형된 코돈 인식 시스템 외에 및/또는 이와 조합하여, (하나 이상의 변형된 tRNA 분자를 갖는 숙주 세포 내에서와 같이) 변형된 코돈, 돌연변이된 코돈 및/또는 디자이너 코돈 인식 시스템을 사용하여 돌연변이를 형성하는 데 이 방법을 이용할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 재조합에 관한 것이며, 더욱 구체적으로, 부분 상동성 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 생체내 재분류 방법으로 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 준비하고, 폴리뉴클레오티드를 조립하여 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 형성하며, 유용한 성질을 갖는 폴리펩티드(들)를 생성하기 위한 폴리뉴클레오티드를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 일 측면에서, 본 발명은 임의의 분자 성질(예, 효소 활성) 또는 현행 방법에 의해 허용되는 성질들의 조합에 대하여 실현된 임의의 돌연변이 변화 효과(예, 특히 포화 돌연변이유발)를 분석 및 분류하는 데 본 발명을 이용할 수 있다. 따라서, 어버이 폴리펩티드 중 각 아미노산을 19개 이상의 가능한 치환 각각으로 변화시킨 효과를 측정하기 위해서 포괄적인 방법이 제공된다. 이 방법으로 어버이 폴리펩티드내의 각 아미노산을 폴리펩티드의 측정가능한 성질에 대한 가능한 효과 범위에 따라 특성화 및 분류할 수 있다.
일 측면에서, 인트론을 핵산 빌딩 블록에 의해 키메라 자손 분자로 도입할 수 있다. 종종 인트론은 작동하게 되기 위해서 양 말단에 공통 서열을 보유한다.인트론은 유전자 스플라이싱을 가능하게 하는 것 외에, 상동성 부위를 다른 핵산에 제공하여 상동성 재조합을 가능하게 하는 부가적인 목적에 사용될 수 있다. 이러한 목적 및 유효한 기타 목적을 위해서, 인트론을 도입하기 위한 거대한 핵산 빌딩 블록을 형성하는 것이 때로 바람직할 수 있다. 그 크기가 지나치게 커서 2개의 1본쇄 올리고뉴클레오티드의 직접적인 화학 합성에 의해 쉽게 형성할 수 있는 경우, 그러한 전문화된 핵산 빌딩 블록은, 2개 이상의 1본쇄 올리고뉴클레오티드의 직접적인 화학적 합성에 의해 또는 폴리머라제계 증폭 반응을 이용하여 형성할 수 있다.
조립하고자 하는 핵산 빌딩 블록의 상호 상용성 연결성 말단은, 소정 순서로 빌딩 블록을 커플링시킬 수 있는 경우 이러한 유형의 순서에 따른 조립에 대해 '사용가능한' 것으로 간주된다. 따라서, 일 측면에서 핵산 빌딩 블록이 커플링될 수 있는 전체 조립 순서를 연결성 말단의 디자인으로 특정하고, 하나 이상의 조립 단계를 사용하는 경우, 핵산 빌딩 블록이 커플링될 수 있는 전체 조립 순서는 조립 단계(들)의 순차적인 순서에 의해 특정된다. 일 측면에서, 어닐링된 빌딩 조각을 효소, 예컨대 리가제(예, T4 DNA 리가제)로 처리하여 빌딩 조각의 공유 결합을 실현한다.
관여하는 돌출부 중 모든 뉴클레오티드를 이용하지 않는 방식으로 커플링이 일어날 수 있다. 커플링이 리가제 효소 처리로 보강되어 "갭 연결" 또는 "갭형 연결"이라고 것을 형성하는 경우, 이 커플링은 특히 (예컨대 형질전환된 숙주에서) 강하게 잔존한다. 이러한 종류의 커플링은 원하지 않는 배경 생성물(들)의 형성에 기여할 수 있지만, 이를 이용하여 디자인된 연결 재조립에 의해 형성된 자손 라이브러리의 다양성을 유리하게 증가시킬 수 있다. 일부 돌출부는 회문식 커플링을 형성하기 위해 자가 커플링을 진행할 수 있다. 리가제 효소를 이용한 처리에 의해 커플링이 보강되는 경우, 이는 실질적으로 강화된 것이다. 돌출부에서의 5' 포스페이트 결핍을 이용하여 이러한 종류의 회문식 자가 연결을 유리하게 예방할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 5' 포스페이트기가 결핍된 핵산 빌딩 블록을 화학적으로 제조(또는 순서대로 제조)한다. 대안적으로, 예컨대 송아지 장 알칼리 포스파타제(CIAP)와 같은 포스파타제 효소를 이용한 처리에 의해 핵산 빌딩 블록을 제거하여, 연결 재조립 과정에서 회문식 자가 연결을 예방할 수 있다.
또 다른 측면에서, 최종 키메라 핵산 분자의 자손 세트를 생성하는 베이스로서 작용하는 선조 핵산 주형 세트의 서열을 분석하면 핵산 빌딩 블록의 디자인이 얻어진다. 따라서, 이들 선조 핵산 주형은 돌연변이시키고자 하는, 예컨대 키메라화 또는 셔플링시키고자 하는 핵산 빌딩 블록의 디자인을 보조하는 서열 정보원으로서 사용된다.
일례에서, 본 발명은 관련 유전자의 패밀리 및 관련된 생성물의 암호화된 패밀리의 키메라화를 위해 제공된다. 특정 예에서, 암호화된 생성물은 효소이다. 본 발명의 크실라나제를 본 명세서에 개시된 방법에 따라 돌연변이시킬 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따라서, 다수의 선조 핵산 주형의 서열(예, 그룹 A 핵산 서열의 폴리뉴클레오티드)을 정렬하여 하나 이상의 분계점을 선택하며, 분계점은 상동성 영역에 배치될 수 있다. 분계점을 이용하여 생성하고자 하는 핵산 빌딩 블록의 경계를 정할 수 있다. 따라서, 선조 분자에서 확인 및 선택된 분계점은 자손 분자의 조립체 내의 유효 키메라 점으로서 기능한다.
통상적으로, 사용가능한 분계점은 2개 이상의 선조 주형에 의해 공유되는 (하나 이상의 상동성 뉴클레오티드 염기를 포함하는) 상동성 영역이지만, 분계점은 선조 주형의 적어도 1/2, 선조 주형의 적어도 2/3, 선조 주형의 적어도 3/4, 바람직하게는 거의 모든 선조 주형에 의해 공유되는 상동성 영역일 수 있다. 더욱 더 바람직하게는, 사용가능한 분계점은 모든 선조 주형에 의해 공유되는 상동성 영역이다.
일 측면에서, 유전자 재조립 과정을 철저히 실시하여 남김없이 라이브러리를 형성한다. 즉, 핵산 빌딩 블록의 모든 가능한 순서의 조합이 최종 키메라 핵산 분자 세트 내에 나타난다. 동시에, 각 조합의 조립 순서(즉, 각 최종 키메라 핵산의 5' → 3' 서열에서 각 빌딩 블록의 조립 순서)는 디자인에 의한다(즉, 비확률론적임). 본 발명의 비확률론적 특성으로 인하여, 원하지 않는 부산물의 가능성이 크게 감소된다.
또 다른 측면에서, 본 방법에 따라 유전자 재조립 방법을 체계적으로 실시하여, 예를 들어 체계적으로 구획화된 라이브러리를 형성하는 데, 구획은 예컨대 하나씩 체계적으로 스크리닝될 수 있다. 다시 말하면, 본 발명에 따르면, 순차적 단계의 조립 반응의 선별적이고 적절한 사용과 함께, 특이적 핵산 빌딩 블록의 선별적이고 적절한 사용을 통해 특정 자손 생성물 세트가 일부 반응 용기 각각에서 제조되는 실험 디자인을 실현할 수 있다. 이로 인하여 체계적 조사 및 스크리닝 절차가 실시 가능해진다. 따라서, 이들 방법은 잠재적으로 매우 많은 수의 자손 분자를더 적은 군에서 체계적으로 검사할 수 있게 한다.
매우 융통성이 있지만 철저하고 체계적인 방법으로 키메라화를 실시하는 능력으로 인하여, 특히 선조 분자들 사이의 상동성 레벨이 낮은 경우, 본 방법은 다수의 자손 분자를 포함하는 라이브러리(또는 세트)의 형성을 제공한다. 본 유전자 재조립 발명의 비확률론적인 특성으로 인하여, 생성된 자손 분자는 바람직하게는 디자인에 의해 선택된 전체 조립 순서를 갖는 최종 키메라 핵산 분자의 라이브러리를 포함하는 것이 바람직하다. 특정 측면에서, 형성된 그러한 라이브러리는 103이상 내지 101000이상의 상이한 자손 분자 종을 포함한다.
일 측면에서, 개시된 바와 같이 생성된 최종 키메라 핵산 분자의 세트는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일 측면에 따라서, 이 폴리펩티드는 유전자이며, 이 유전자는 인공 유전자일 수 있다. 또 다른 측면에 따르면, 이 폴리뉴클레오티드는 유전자 경로로서, 인공 유전자 경로일 수 있다. 본 발명에 따르면 본 발명에 의해 형성된 하나 이상의 인공 유전자를 인공 유전자 경로, 예컨대 진핵 유기체(예, 식물)에서 작동가능한 경로에 도입할 수 있다.
또 다른 적례에서, 빌딩 블록이 형성되는 단계의 합성 특성으로 인하여 이후에 시험관내 과정(예컨대 돌연변이유발) 또는 생체내 과정(예컨대, 숙주 유기체의 유전자 스플라이싱 능력 이용)으로 임의 제거될 수 있는 뉴클레오티드(예, 하나 이상의 뉴클레오티드, 이 뉴클레오티드는 예를 들면 코돈 또는 인트론 또는 조절 서열일 수 있음)의 디자인 및 도입이 가능해진다. 여러 예에서, 사용가능한 분계점을형성하는 잠재적인 잇점 외에도 여러 가지 다른 이유로 인하여 이들 뉴클레오티드의 도입이 바람직할 수 있을 것으로 기대된다.
따라서, 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 핵산 빌딩 블록을 사용하여 인트론을 도입할 수 있음을 규정한다. 따라서, 본 발명에 따르면 기능성 인트론을 본 발명의 인공 유전자에 도입할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 기능성 인트론을 본 발명의 인공 유전자 경로에 도입할 수 있다. 따라서, 본 발명은 인공적으로 도입된 하나(또는 그 이상)의 인트론(들)을 포함하는 인공 유전자인 키메라 폴리뉴클레오티드의 형성을 위해 제공된다.
따라서, 본 발명은 또한 인공적으로 도입된 하나(또는 그 이상)의 인트론(들)을 포함하는 인공 유전자 경로인 키메라 폴리뉴클레오티드의 형성을 위해 제공된다. 바람직하게는, 인공적으로 도입된 인트론(들)은, 자연 발생적 인트론이 유전자 스플라이싱에 있어서 기능적으로 작용하는 방식으로 유전자 스플라이싱을 위해 하나 이상의 숙주 세포에서 기능한다. 본 발명은 재조합 및/또는 스플라이싱을 위해 숙주 유기체 내로 도입하고자 하는 인공 인트론 함유 폴리뉴클레오티드의 제조 방법을 제공한다.
본 발명을 이용하여 생성된 인공 유전자는 또 다른 핵산과의 재조합을 위한 기질로서 작용할 수 있다. 유사하게, 본 발명을 이용하여 형성된 인공 유전자 경로는 또 다른 핵산과의 재조합을 위한 기질로서 작용할 수 있다. 일 측면에서, 인공의 인트론 함유 유전자와 재조합쌍으로서 기능하는 핵산 사이의 상동성 영역에 의해 재조합이 촉진되거나, 또는 그 영역에서 재조합이 일어난다. 일 측면에서, 재조합쌍은 또한 인공 유전자 또는 인공 유전자 경로를 비롯하여 본 발명에 의해 생성된 핵산일 수 있다. 인공 유전자 내에 인공적으로 도입된 하나(또는 그 이상)의 인트론(들)에 존재하는 상동성 영역에 의해 재조합이 촉진되거나, 또는 이 영역에서 재조합이 일어날 수 있다.
본 발명의 합성 유전자 재조립 방법에서는 다수의 핵산 빌딩 블록을 이용하며, 이들 각각은 2개의 연결성 말단을 갖는 것이 바람직하다. 각 핵산 빌딩 블록 상에서의 2개의 연결성 말단은 2개의 평활 말단(즉, 각각 0 뉴클레오티드의 돌출부를 가짐)이거나, 또는 바람직하게는 하나의 평활 말단 및 하나의 돌출 말단이거나, 또는 더욱 바람직하게는 2개의 돌출 말단일 수 있다.
이러한 목적으로 유용한 돌출부는 3' 돌출부 또는 5' 돌출부일 수 있다. 따라서, 핵산 빌딩 블록은 3' 돌출부 또는, 대안적으로 5' 돌출부 또는, 대안적으로 2개의 3' 돌출부 또는, 대안적으로 2개의 5' 돌출부를 가질 수 있다. 최종 키메라 핵산 분자를 형성하기 위해 핵산 빌딩 블록이 조립된 전체 순서는 의도한 실험 디자인에 의해 결정되는 것이며, 무작위한 것이 아니다.
일 측면에서, 2개의 1본쇄 핵산(1본쇄 올리고뉴클레오티드라고도 함)을 화학적으로 합성하고, 이들이 어닐링되도록 접촉시켜 2본쇄 핵산 빌딩 블록을 형성함으로써 핵산 빌딩 블록을 형성한다.
2본쇄 핵산 빌딩 블록은 가변 크기의 것일 수 있다. 빌딩 블록의 크기는 작거나 클 수 있다. 예시적인 빌딩 블록의 크기는 1 염기쌍(임의의 돌출부를 포함하지 않음) 내지 100,000 염기쌍(임의의 돌출부를 포함하지 않음) 범위이다. 다른 예시적인 크기 범위, 즉 1 bp 내지 10,000 bp(이 사이의 모든 정수값 포함)의 하한값과 2 bp 내지 100,000 bp(이 사이의 모든 정수값 포함)의 상한값을 갖는 범위도 제공된다.
본 발명에서 이용가능한 2본쇄 핵산 빌딩 블록이 형성될 수 있는 여러 가지 방법이 존재하며; 이들 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자가 용이하게 실시할 수 있다.
한 관점에 따라, 이본쇄 핵산 빌딩 블록은 먼저 일본쇄 핵산을 생성하고, 생성된 일본쇄 핵산을 어닐링하여 이본쇄 핵산 빌딩 블록을 형성함으로써 생성한다. 이본쇄 핵산 빌딩 블록의 두 스트랜드는 돌출부(overhang)를 형성하는 임의의 뉴클레오티드 이외의 모든 뉴클레오티드에서 상보적일 수 있으며; 따라서, 임의의 돌출부(들) 이외에 부정합을 함유하지 않는다. 다른 관점에서, 이본쇄 핵산 빌딩 블록의 두 스트랜드는 돌출부를 형성하는 임의의 뉴클레오티드 이외의 모든 뉴클레오티드 보다 더 적은 뉴클레오티드가 상보적이다. 따라서, 이 관점에서, 이본쇄 핵산 빌딩 블록을 이용하여 코돈 축퇴성을 도입할 수 있다. 코돈 축퇴성은 본원에 개시된 부위-포화 돌연변이유발법을 이용하여 도입하는 것이 바람직한데, 이때 하나 이상의 N,N,G/T 카세트 또는 대안으로 하나 이상의 N,N,N 카세트를 이용한다.
본 발명의 생체내 재조합법은 특이적인 폴리뉴클레오티드 또는 서열의 미지 하이브리드 또는 대립유전자 풀에 대해 맹검 방식으로 수행할 수 있다. 그러나, 특이적인 폴리뉴클레오티드의 실질적인 DNA 또는 RNA 서열을 알 필요는 없다.
유전자의 혼합 군집내 재조합을 이용하는 방법은 임의의 유용한 단백질, 예를 들어 인터류킨 I, 항체, tPA 및 성장 호르몬의 생성을 위해 유용할 수 있다. 이 방법은 변경된 특이성 또는 활성을 보유하는 단백질을 생성하는 데 사용할 수 있다. 또한, 이 방법은 하이브리드 핵산 서열, 예를 들어 프로모터 영역, 인트론, 엑손, 인핸서 서열, 유전자의 31 미번역된 영역 또는 51 미번역된 영역의 생성을 위해 유용할 수 있다. 따라서, 이 방법은 증가된 발현 속도를 보유하는 유전자를 생성하는 데 사용할 수 있다. 또한, 이 방법은 반복 DNA 서열의 연구에 유용할 수 있다. 최종적으로, 이 방법은 리보자임 또는 압타머(aptamer)를 돌연변이시키는 데 유용할 수 있다.
한 관점에서, 본 발명은 매우 복잡한 선형 서열, 예를 들어 DNA, RNA 또는 단백질의 유도된 분자 진화를 가능하게 하는 환원성 재분류, 재조합 및 선택의 반복 사이클의 이용에 관한 것이다.
최적화된 유도 진화 시스템
본 발명은 새로운 특성 또는 변경된 특성을 보유하는 폴리펩티드, 예를 들어 본 발명의 자일라나제 또는 항체를 생성하는 "최적화된 유도 진화 시스템"이라 칭하는 비확률적 유전자 변경 시스템을 제공한다. 최적화된 유도 진화는 재조합을 통한 핵산의 유도된 분자 진화를 가능하게 하는 환원성 재분류, 재조합 및 선택의 반복 사이클의 이용에 관한 것이다. 최적화된 유도 진화는 진화된 키메라 서열의 대형 군집의 생성을 가능하게 하는데, 이때 생성된 군집은 미리설정된 수의 교차 현상을 보유하는 서열이 상당히 풍부하다.
교차 현상은 서열 내의 이동이 하나의 모(母) 변이체로부터 다른 모 변이체로 일어나는 키메라 서열내의 점(point)이다. 이러한 점은 보통 두개의 모 변이체로부터 유래한 올리고뉴클레오티드가 함께 연결되어 단일 서열을 형성하는 접합부이다. 이 방법은 올리고뉴클레오티드 서열의 올바른 농도의 계산을 가능하게 하여 서열의 최종 키메라 군집에 선택된 수의 교차 현상이 풍부하도록 한다. 이는 미리설정된 수의 교차 현상을 보유하는 키메라 변이체를 선택하는 것에 대한 조절을 제공한다.
또한, 이 방법은 다른 시스템과 비교하여 상당량의 가능한 단백질 변이체 공간을 탐색하는 편리한 수단을 제공한다. 이전에는, 예를 들어 한 반응중에 1013개의 키메라 분자가 생성되는 경우, 특정 활성에 대해 그렇게 많은 수의 키메라 변이체를 테스트하는 것은 매우 어려웠다. 더구나, 후대 군집의 상당 부분은 특정 활성의 증가된 수준을 보유하는 것으로 덜 생각되는 단백질을 생성하는 매우 큰 수의 교차 현상을 보유한다. 이들 방법을 이용함으로써, 키메라 분자의 군집은 특정 수의 교차 현상을 보유하는 이들 변이체가 풍부할 수 있다. 따라서, 반응중 1013개의 키메라 분자가 생성될 수 있지만, 추가 분석을 위해 선택된 각각의 분자는 예를 들어 단지 3개의 교차 현상을 보유하는 것으로 생각된다. 생성된 후대 군집은 미리설정된 수의 교차 현상을 보유하는 것으로 왜곡될 수 있기 때문에, 키메라 분자들간의 기능적인 다양성에 대한 경계는 감소된다. 이는 원래의 모 폴리뉴클레오티드로부터 유래한 어떤 올리고뉴클레오티드가 특정 성질에 영향을 줄 수 있는가를 알아보는 경우 더 관리가능한 수의 변수를 제공한다.
키메라 후대 폴리뉴클레오티드 서열을 생성하는 한 방법은 각각의 모 서열의 단편 또는 부분에 상응하는 올리고뉴클레오티드를 생성하는 것이다. 각각의 올리고뉴클레오티드는 독특한 중첩 영역을 포함하여 올리고뉴클레오티드의 혼합이 올바른 순서로 어셈블링된 각각의 올리고뉴클레오티드 단편을 보유하는 새로운 변이체를 생성하도록 하는 것이 바람직하다. 또한, 이에 대한 추가 정보는 예를 들어 USSN 09/332,835; 미국 특허 6,361,974에서 확인할 수 있다.
각각의 모 변이체에 대해 생성된 올리고뉴클레오티드의 수는 궁극적으로 생성된 키메라 분자내의 생성된 교차의 총 수와 일정 관계를 갖는다. 예를 들어, 3개의 모 뉴클레오티드 서열 변이체는 연결 반응을 수행하기 위해 제공하여 예를 들어 고온에서 더 큰 활성을 보유하는 키메라 변이체를 확인하는 것이 가능하다. 한 예로서, 각각의 모 변이체의 각 부분에 상응하는 50개의 올리고뉴클레오티드 서열로 이루어진 세트를 생성할 수 있다. 따라서, 연결 재어셈블리 과정중, 각각의 키메라 서열내 50개 이하의 교차 현상이 존재할 수 있다. 생성된 각각의 키메라 폴리뉴클레오티드가 교대로 각각의 모 변이체로부터 유래한 올리고뉴클레오티드를 함유할 가능성은 매우 낮다. 각각의 올리고뉴클레오티드 단편이 동일한 몰량으로 연결 반응에 존재하는 경우, 몇몇 위치에서 동일한 모 폴리뉴클레오티드로부터 유래한 올리고뉴클레오티드는 서로 인접하여 연결될 것이고, 따라서 교차 현상은 일어나지 않는다. 각각의 모 폴리뉴클레오티드로부터 유래한 각각의 올리고뉴클레오티드의 농도가 본 실시예의 임의의 연결 반응중 일정하게 유지되는 경우, 동일한 모 변이체로부터 유래한 올리고뉴클레오티드가 키메라 서열 내에서 연결되어 교차되지 않을 1/3의 가능성(3개의 모 폴리뉴클레오티드를 추정함)이 존재한다.
따라서, 확률밀도함수(PDF)를 결정하여 주어진 세트 수의 모 변이체, 각각의 변이체에 상응하는 다수의 올리고뉴클레오티드 및 연결 반응에서 각각의 단계중 각 변이체의 농도에서 연결 반응중 각각의 단계에서 일어나는 것으로 생각되는 교차 현상의 집단을 예상할 수 있다. 이하, PDF 결정 이면의 통계학 및 수학을 기술한다. 이들 방법을 이용함으로써, 이러한 확률 밀도 함수를 계산할 수 있고, 따라서 특정 연결 반응에 기인하는 미리설정된 수의 교차 현상에 대해 키메라 후대 군집을 풍부하게 할 수 있다. 더구나, 교차 현상의 표적 수는 미리 설정할 수 있으며, 이어서 상기 시스템은 미리설정된 수의 교차 현상에 대해 중앙에 위치하는 확률 밀도 함수를 생성하는, 연결 반응에서 각각의 단계중 각각의 모 올리고뉴클레오티드의 출발 양을 계산한다. 이들 방법은 재조합을 통해 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 유도된 분자 진화를 가능하게 하는 환원성 재분류, 재조합 및 선택의 반복 사이클의 이용에 관한 것이다. 이 시스템은 진화된 키메라 서열의 대형 군집의 생성을 가능하게 하는데, 이때 생성된 군집은 미리설정된 수의 교차 현상을 보유하는 서열이 현저히 풍부하다. 교차 현상은 서열 내의 이동이 하나의 모(母) 변이체로부터 다른 모 변이체로 일어나는 키메라 서열내의 점이다. 이러한 점은 보통 두개의 모 변이체로부터 유래한 올리고뉴클레오티드가 함께 연결되어 단일 서열을 형성하는 접합부이다. 이 방법은 올리고뉴클레오티드 서열의 올바른 농도의 계산을 가능하게 하여 서열의 최종 키메라 군집이 선택된 수의 교차 현상이 풍부하도록 한다. 이는 미리설정된 수의 교차 현상을 보유하는 키메라 변이체를 선택하는 것에 대한 조절을제공한다.
또한, 이들 방법은 다른 시스템과 비교하여 상당량의 가능한 단백질 변이체 공간을 탐색하는 편리한 수단을 제공한다. 이들 방법을 이용함으로써, 키메라 분자의 군집은 특정 수의 교차 현상을 보유하는 이들 변이체가 풍부할 수 있다. 따라서, 반응중 1013개의 키메라 분자가 생성될 수 있지만, 추가 분석을 위해 선택된 각각의 분자는 예를 들어 단지 3개의 교차 현상을 보유하는 것으로 생각된다. 생성된 후대 군집은 미리설정된 수의 교차 현상을 보유하는 것으로 왜곡될 수 있기 때문에, 키메라 분자들간의 기능적인 다양성에 대한 경계는 감소된다. 이는 원래의 모 폴리뉴클레오티드로부터 유래한 어떤 올리고뉴클레오티드가 특정 성질에 영향을 줄 수 있는가를 알아보는 경우 더 관리가능한 수의 변수를 제공한다.
한 관점에서, 상기 방법은 각각의 모 서열의 단편 또는 부분에 상응하는 올리고뉴클레오티드를 생성함으로써 키메라 후대 폴리뉴클레오티드 서열을 생성한다. 각각의 올리고뉴클레오티드는 독특한 중첩 영역을 포함하여 올리고뉴클레오티드의 혼합이 올바른 순서로 어셈블링된 각각의 올리고뉴클레오티드 단편을 보유하는 새로운 변이체를 생성하도록 하는 것이 바람직하다. USSN 09/332,835를 참조할 수 있다.
교차 현상의 결정
본 발명의 관점들은 입력값으로서 소정 교차 확률 밀도 함수(PDF), 재어셈블링되는 모 유전자의 수 및 재어셈블리에서 단편의 수를 수용하는 시스템 및 소프트웨어를 포함한다. 이 프로그램의 출력값은 재어셈블링된 유전자 및 이들 유전자의 추산된 교차 PDF를 생성하기 위한 방법을 결정하는데 사용할 수 있는 "단편 PDF"이다. 본원에 기술한 프로세싱은 MATLAB(상표명)(The Mathworks, Natick, Massachusetts) 프로그래밍 언어 및 기술적 계산을 위해 개발된 환경에서 수행하는 것이 바람직하다.
반복 과정
본 발명을 실시하기 위해, 이들 과정은 되풀이하여 반복할 수 있다. 예를 들어, 변경된 또는 새로운 자일라나제 표현형의 원인인 핵산(또는 상기 핵산)은 동정하고, 재분리하고, 다시 변경하고, 활성에 대해 재테스트한다. 이 과정은 소정 표현형이 조작될 때까지 되풀이하여 반복할 수 있다. 예를 들어, 전체적인 생화학적 동화 경로 또는 이화 경로를 세포 내로 도입하도록 조작하여 예를 들어 자일라나제 활성을 부여할 수 있다.
유사하게, 특정 올리고뉴클레오티드가 소정 특성(예를 들어, 새로운 자일라나제 표현형)에 대해 전혀 영향을 미치지 못하는 것으로 결정된 경우, 제거한 서열을 포함하는 더 큰 모 올리고뉴클레오티드를 합성하므로써 변수로서 제거할 수 있다. 더 큰 서열 내로 서열을 혼입하는 것은 임의의 교차 현상을 예방하기 때문에, 후대 폴리뉴클레오티드내 이 서열의 변이는 더 이상 존재하지 않을 것이다. 어떤 올리고뉴클레오티드가 소정 특성에 가장 관련되어 있고, 어떤 올리고뉴클레오티드가 관련되어 있지 않은가를 결정하기 위한 상기 반복 실시는 특정 특성 또는 활성을 제공할 수 있는 가능한 단백질 변이체 모두의 더 효과적인 탐색을 가능하게 한다.
생체내 셔플링
분자의 생체내 셔플링은 본 발명의 폴리펩티드의 변이체, 예를 들어 항체, 자일라나제 등을 제공하는 본 발명의 방법에서의 용도이다. 생체내 셔플링은 재조합 다량체에 대한 세포의 자연적인 특성을 이용하여 수행할 수 있다. 생체내 재조합이 분자 다양성에 대한 중요한 자연적인 경로를 제공하지만, 유전자 재조합은 (1) 상동성의 인식; (2) 스트랜드 절단, 스트랜드 침입 및 재조합 키아즈마의 생성을 유도하는 대사 단계; 및 (3) 최종적으로, 키아즈마의 불연속 재조합 분자로의 분해를 포함하는 상대적으로 복잡한 과정이다. 키아즈마의 형성은 상동 서열의 인식을 필요로한다.
다른 관점에서, 본 발명은 적어도 제1 뉴클레오티드 및 제2 뉴클레오티드로부터 하이브리드 폴리뉴클레오티드를 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 적합한 숙주 세포 내로 적어도 제1 폴리뉴클레오티드 및 부분적인 서열 상동성(예를 들어, 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225,227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257 및 이의 조합)의 적어도 한 영역을 공유하는 제2 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 하이브리드 폴리뉴클레오티드를 생성하는 데 사용할 수 있다. 부분 서열 상동성 영역은 하이브리드 폴리뉴클레오티드를 생성하는 서열 인식을 초래하는 과정을 촉진시킨다. 본원에 사용한 용어 "하이브리드 폴리뉴클레오티드"는 본 발명의 방법에 기인한 임의의 뉴클레오티드 서열이며, 적어도 두개의 원래 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다. 이러한 하이브리드 폴리뉴클레오티드는 DNA 분자 사이의 서열 통합을 촉진하는 분자간 재조합 현상에 기인할 수 있다. 또한, 이러한 하이브리드 폴리뉴클레오티드는 DNA 분자내 뉴클레오티드 서열을 변경시키는 반복 서열을 이용하는 분자내 환원성 재분류 과정에 기인할 수 있다.
생체내 재분류는 총괄적으로 박테리아에서 "RecA-의존성" 현상으로서 고찰되는 "재조합"이라 칭하는 "분자간" 과정에 집중된다. 본 발명은 서열을 재조합 또는 재분류하는 숙주 세포의 재조합 과정 또는 결실에 의해 세포 내에서 준-반복 서열의 복잡성을 감소시키기 위한 환원성 과정을 매개할 수 있는 세포의 능력에 의존할 수 있다. 상기한 "환원성 재분류" 과정은 "분자내" RecA-의존성 과정에 의해 일어난다.
따라서, 본 발명의 다른 관점에서, 신규 폴리뉴클레오티드는 환원성 재분류 과정에 의해 생성될 수 있다. 상기 방법은 연속 서열(원래의 암호화 서열)을 함유하는 작제물의 생성, 적합한 벡터 내로 상기 작제물의 도입 및 적합한 숙주 세포 내로의 후속 도입을 포함한다. 개별적인 분자 실체의 재분류는 상동성 영역을 보유하는 작제물내 연속 서열 사이 또는 준-반복 단위 사이의 조합 과정에 의해 일어난다. 재분류 과정은 반복 서열의 복잡성과 정도를 재조합 및/또는 감소시키며 신규 분자 종의 생성을 초래한다. 여러가지 처리를 적용하여 재분류 비율을 높일 수 있다. 이들은 자외선, 또는 DNA 손상 화학물질 및/또는 "유전자 불안정성"의 증가된 수준을 나타내는 숙주 세포주를 이용하는 처리를 포함할 수 있다. 따라서, 재분류 과정은 자신의 진화를 유도하기 위한 준-반복 서열의 자연적인 특성 또는 상동성 재조합을 포함할 수 있다.
반복 서열 또는 "준-반복" 서열은 유전자 불안정성에서 일정 역할을 수행한다. 본 발명에서, "준-반복"은 그들의 원래 단위 구조에 제한되지 않는 반복부이다. 준-반복 단위는 작제물내 서열의 어레이, 즉 유사 서열의 연속 단위로서 존재할 수 있다. 일단 연결되면, 연속 서열 사이의 접합부는 본질적으로 보이지 않게 되고, 생성된 작제물의 준-반복 특성은 현재 분자 수준에서 연속성이다. 생성된 작제물의 복잡성을 감소시키기 위해 세포가 수행하는 결실 과정은 준-반복 서열 사이에서 진행된다. 준-반복 유닛은 미끄러짐 현상(slippage event)이 일어날 수 있는 주형의 실질적으로 무제한 레파토리를 제공한다. 따라서, 준-반복부를 함유하는 작제물은 결실(및 가능하게는 삽입) 현상이 실질적으로 준-반복 단위내 어디에서나 발생할 수 있는 충분한 분자 탄성을 효과적으로 제공한다.
준-반복 서열이 모두 동일한 배향, 예를 들어 머리-꼬리 또는 그 역으로 연결되는 경우, 세포는 개개의 단위를 구별할 수 없다. 결과적으로, 환원성 과정은 서열 전체에서 일어날 수 있다. 대조적으로, 예를 들어 상기 단위가 머리-꼬리 보다는 머리-머리로 존재하는 경우, 역전은 결실부 형성이 불연속 유닛의 상실을 옹호하도록 인접 단위의 종말점을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 경우, 서열이 동일한 배향으로 존재하는 것이 바람직하다. 준반복 서열의 무작위 배향은 재분류 효율의 상실을 초래하는 반면, 서열의 일관된 배향은 높은 효율을 제공할 것이다. 그러나, 동일한 배향에서 더 적은 연속 서열을 보유하는 경우 상기 효율을 감소시키지만, 이는 신규 분자의 효과적인 회수를 위한 충분한 탄성을 여전히 제공할 수 있다. 작제물은 더 높은 효율을 가능하게 하는 동일한 배향으로 준-반복 서열을 이용하여 제조할 수 있다.
서열은 하기 방법을 포함하는 여러가지 방법중 임의의 방법을 이용하여 머리-꼬리 배향으로 어셈블링할 수 있다:
(a) 일본쇄로 제조되는 경우 배향을 제공하는 폴리-A 머리 및 폴리-T 꼬리를 포함하는 프라이머를 사용할 수 있다. 이는 RNA로 제조된 프라이머의 최초 몇몇 염기를 보유함으로써 달성되며, 따라서 RNAseH로 용이하게 제거된다.
(b) 독특한 제한 절단 부위를 포함하는 프라이머를 사용할 수 있다. 다중 부위, 독특한 서열 배터리 및 반복 합성 단계와 연결 단계가 필요하다.
(c) 상기 프라이머의 몇몇 내부 염기는 티올화될 수 있으며, 엑소뉴클레아제는 적절하게 꼬리잘린 분자를 생성하기 위해 사용한다.
재분류된 서열의 회수는 감소된 반복 지수(RI)를 갖는 클로닝 벡터의 동정에 의존한다. 이어서, 상기 재분류된 암호화 서열은 증폭에 의해 회수할 수 있다. 생성물은 재클로닝하고 발현시킨다. 감소된 RI를 보유하는 클로닝 벡터의 회수는 하기 사항에 의해 영향받을 수 있다:
(1) 벡터의 이용은 단지 작제물의 복잡성이 감소되는 경우에 안정하게 유지된다.
(2) 물리적인 과정에 의해 짧아진 벡터의 물리적인 회수. 이 경우, 클로닝 벡터는 표준 플라스미드 분리 절차 및 아가로즈 겔, 또는 표준 절차를 이용하는 저분자량 컷오프 컬럼 상에서의 크기 분별에 의해 회수한다.
(3) 삽입물 크기가 감소하는 경우 선택할 수 있는 삽입된 유전자를 함유하는 벡터의 회수.
(4) 발현 벡터 및 적합한 선택을 이용하는 직접 선택 기법의 이용.
관련된 유기체로부터 유래한 암호화 서열(예를 들어, 유전자)은 높은 정도의 상동성을 나타낼 수 있으며, 상당히 다양한 단백질 생성물을 암호화할 수 있다. 이들 서열 타입은 준-반복부로서 본 발명에서 특히 유용하다. 그러나, 후술하는 실시예들은 거의 동일한 원래의 암호화 서열(준-반복부)의 재분류를 나타내지만, 이 방법은 그러한 거의 동일한 반복부에 제한되는 것은 아니다.
하기 실시예는 본 발명을 예시한다. 세개(3)의 독특한 종으로부터 유래한 암호화 핵산 서열(준-반복부)을 기술한다. 각각의 서열은 구별되는 세트의 특성을 가진 단백질을 암호화한다. 각각의 서열은 서열내의 독특한 위치에서 단일 염기쌍 또는 몇몇 염기쌍에 차이가 있다. 준-반복 서열은 개별적으로 또는 총괄적으로 증폭되고, 무작위 어셈블리 내로 연결되어 모든 가능한 순열 및 조합이 연결된 분자 집단에서 가능하도록 한다. 준-반복 단위의 수는 어셈블리 조건에 의해 제어할 수 있다. 작제물내 준-반복 단위의 평균 수는 반복 지수(RI)로서 정의한다.
일단 형성되면, 작제물은 공지된 프로토콜에 따라 아가로즈 겔 상에서 크기 분별, 클로닝 벡터내로의 삽입 및 적합한 숙주 세포로의 형질감염을 수행할 수도 있고, 수행하지 않을 수도 있다. 이어서, 세포는 번식시키고, "환원성 재분류"를 수행한다. 환원성 재분류 과정의 속도는 필요에 따라 DNA 손상의 도입에 의해 촉진시킬 수 있다. RI의 감소가 반복 서열 사이에서 "분자내" 메카니즘에 의한 결실부 형성에 의해 매개되는지 또는 "분자간" 메카니즘을 통한 재조합 유사 현상에 의해 매개되는지 여부는 중요하지 않다. 최종 결과는 모든 가능한 조합으로의 분자의 재분류이다.
필요에 따라, 상기 방법은 셔플링된 풀의 라이브러리 구성원을 스크리닝하여 미리설정된 거대분자, 예를 들어 단백질성 수용체, 올리고사카라이드, 비리온 또는 다른 미리설정된 화합물 또는 구조와의 결합 또는 상호작용 또는 특정 반응(예를 들어, 환자의 촉매 도메인)을 가능하게 할 수 있는 능력을 보유하는 개개의 셔플링된 라이브러리 구성원을 동정하는 추가 단계를 포함한다.
이러한 라이브러리로부터 동정된 폴리펩티드는 치료 목적, 진단 목적, 연구 목적 및 관련 목적(예를 들어, 촉매, 수용액의 삽투압을 증가시키기 위한 용질 등)을 위해 사용할 수 있고/있거나, 셔플링 및/또는 선택의 하나 이상의 추가 사이클에 이용할 수 있다.
다른 관점에서, 재조합 또는 재분류 이전 또는 과정 중에, 본 발명의 방법에 의해 생성된 폴리뉴클레오티드는 원래의 폴리뉴클레오티드내로의 돌연변이의 도입을 촉진하는 제제 또는 과정에 이용할 수 있다. 이러한 돌연변이의 도입은 생성된 하이브리드 폴리뉴클레오티드 및 그로부터 암호화된 폴리펩티드의 다양성을 증가시킨다. 돌연변이유발을 촉진하는 제제 또는 과정의 예로는 (+)-CC-1065, 또는 합성 유사체, 예를 들어 (+)-CC-1065-(N3-아데닌(참조: Sun and Hurley, (1992)); DNA 합성을 억제할 수 있는 N-아세틸화 또는 탈아세틸화 4'-플루오로-4-아미노비페닐 부가반응생성물(참조: 예를 들어, van de Poll et al. (1992)); 또는 DNA 합성을 억제할 수 있는 N-아세틸화 또는 탈아세틸화 4-아미노비페닐 부가반응생성물(참조: van de Poll et al. (1992), pp. 751-758); DNA 복제를 억제할 수 있는 3가 크롬, 3가 크롬염, 다환 방향족 탄화수소(PAH) DNA 부가반응생성물, 예를 들어 7-브로모메틸벤즈[a]안트라센("BMA"), 트리스(2,3-디브로모프로필)포스페이트("Tris-BP"), 1,2-디브로모-3-클로로프로판("DBCP"), 2-브로모아크롤레인(2BA), 벤조[a]피렌-7,8-디히드로디올-9-10-에폭사이드("BPDE"), 백금(II) 할로겐 염, N-히드록시-2-아미노-3-메틸아미다조[4,5-t-퀴놀린("N-히드록시-IQ") 및 N-히드록시-2-아미노-1-메틸-6-페닐이미다조[4,5-fl-피리딘("N-히드록시-PhIP")를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. PCR 증폭을 둔화시키거나 정지시키는 수단의 예로는 자외선 (+)-CC-1065 및 (+)-CC-1065-(N3-아데닌)을 들 수 있다. 특히 포함되는 수단은 DNA 부가반응생성물 또는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 풀로부터 DNA 부가반응생성물을 포함하는 폴리뉴클레오티드인데, 이는 추가 처리 이전에 폴리뉴클레오티드를 포함하는 용액을 가열하는 단계를 포함하는 방법에 의해 방출 또는 제거될 수 있다
다른 관점에서, 본 발명은 하이브리드 또는 재분류된 폴리뉴클레오티드의 생성을 제공하는 본 발명의 조건 하에서 야생형 단백질을 암호화하는 이본쇄 주형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 샘플을 처리함으로써 생물학적 활성을 보유하는 재조합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
서열 변이체의 제조
또한, 본 발명은 본 발명의 핵산(예를 들어, 자일라나제) 서열의 서열 변이체를 제조하는 추가 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 핵산 및 폴리펩티드를 이용하여 자일라나제를 분리하기 위한 추가의 방법을 제공한다. 한 관점에서, 본 발명은 본 발명의 자일라나제 암호 서열(예를 들어, 유전자, cDNA 또는 메세지)의 변이체를 제공하는데, 이는 상기한 바와 같은 무작위적 또는 확률적 방법, 또는 비확률적 또는 "직접 진화" 방법을 포함하는 임의의 수단에 의해 변경될 수 있다.
분리된 변이체는 자연발생할 수 있다. 또한, 변이체는 시험관 내에서 생성할 수도 있다. 변이체는 유전 공학 기법, 예를 들어 부위 지정 돌연변이유발법, 무작위 화학적 돌연변이유발법, 엑소뉴클레아제 III 결실 과정, 및 표준 클로닝 기법을 이용하여 생성할 수 있다. 대안으로, 이러한 변이체, 단편, 유사체 또는 유도체는 화학 합성 또는 변경 절차를 이용하여 생성할 수 있다. 또한, 변이체를 제조하는 다른 방법은 당업자에게 매우 친숙한 방법들이다. 이들은 천연 분리체로부터 얻은 핵산 서열을 변경하여 산업적으로 또는 실험실에서 사용하기에 적합한 가치를 증대시킨 특성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 생성하는 방법을 포함한다.이러한 과정에서, 천연 분리체로부터 얻은 서열에 대해 하나 이상의 뉴클레오티드 차이를 보유하는 다수의 변이체 서열이 생성되고 그 특징을 규명한다. 이들 뉴클레오티드 차이는 천연 분리체에서 유래한 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드에 대해 아미노산 변화를 초래할 수 있다.
예를 들어, 변이체는 에러 프론 PCR을 이용하여 생성할 수 있다. 에러 프론 PCR에서, PCR은 DNA 폴리머라제의 복제 신뢰도가 낮은 조건하에서 수행하여 높은 비율의 점 돌연변이가 PCR 생성물의 전체 길이를 따라 얻어지도록 한다. 에러 프론 PCR은 예를 들어 문헌(참조: Leung, D. W., et al., Technique, 1: 11-15, 1989 및 Caldwell, R. C. & Joyce G. F. , PCR Methods Applic. , 2: 28-33, 1992)에 기재되어 있다. 개략적으로 이러한 절차에서, 돌연변이유발시키려는 핵산은 전체 길이의 PCR 생성물을 따라 높은 비율의 점 돌연변이를 획득하기 위해 PCR 프라이머, 반응 버퍼, MgCl2, MnCl2, Taq 폴리머라제 및 적합한 농도의 dNTPs와 혼합한다. 예를 들어, 상기 반응은 돌연변이유발시키려는 핵산 20 fmole, 각각의 PCR 프라이머 30 pmol, 반응 버퍼(50 mM KC1, lO mM Tris HCl(pH 8.3) 및 0.01% 겔라틴을 함유함), 7 mM MgCl2, 0.5 mM MnCl2, Taq 폴리머라제 5 유닛, 0.2 mM dGTP, 0.2 mM dATP, 1 mM dCTP 및 1 mM dTTP를 이용하여 수행한다. PCR은 94℃에서 1분, 45℃에서 1분 및 72℃에서 1분의 30 사이클로 수행한다. 그러나, 이들 매개변수는 적절히 변경시킬 수 있는 것으로 이해될 것이다. 돌연변이유발된 핵산은 적합한 벡터 내로 클로닝하고, 돌연변이유발된 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드의 활성을 평가한다.
또한, 변이체는 임의의 클로닝된 소정의 DNA에서 부위-특이성 돌연변이를 생성하는 올리고뉴클레오티드 지정된 돌연변이유발법을 이용하여 생성할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 돌연변이유발법은 문헌(참조: 예를 들어, Reidhaar-Olson (1988) Science 241: 53-57)에 기재되어 있다. 개략적으로, 이러한 절차에서, 클로닝된 DNA내로 도입하려는 하나 이상의 돌연변이를 보유하는 다수의 이본쇄 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 돌연변이유발시키려는 클로닝된 DNA 내로 삽입한다. 돌연변이유발된 DNA를 함유하는 클론은 회수하고, 이들이 암호화한 폴리펩티드의 활성을 평가한다.
변이체를 생성하는 다른 방법은 어셈블리 PCR이다. 어셈블리 PCR은 작은 DNA 단편의 혼합물로부터 PCR 생성물의 어셈블리를 포함한다. 다수의 상이한 PCR 반응이 동일한 바이알 내에서 병렬적으로 일어나는데, 한 반응의 생성물은 다른 반응의 생성물을 프라이밍한다. 어셈블리 PCR은 예를 들어 미국 특허 5,965,408에 기술되어 있다.
변이체를 생성하는 또 다른 방법은 성별 PCR 돌연변이유발법이다. 성별 PCR 돌연변이유발법에서, 시험관 내에서 상이하나 매우 관련된 DNA 서열의 DNA 분자들 사이에 집중 상동 재조합이 일어나며, 그 결과 서열 상동성에 기초한 DNA 분자의 무작위 단편화가 일어나며, 이어서 PCR 반응에서 프라이머 연장에 의해 교차의 고정이 일어난다. 성별 PCR 돌연변이유발법은 예를 들어 문헌(참조: Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751)에 기재되어 있다. 개략적으로, 이러한 절차에서, 재조합하려는 다수의 핵산은 DNase로 분해하여 평균 크기가 50∼200개의 뉴클레오티드를 보유하는 단편을 생성한다. 소정 평균 크기의 단편은 정제하고 PCR 생성물 중에 재현탁시킨다. PCR은 핵산 단편들의 재조합을 용이하게 하는 조건 하에서 수행한다. 예를 들어, PCR은 0.2 mM 각 dNTP, 2.2 mM MgCl2, 50 mM KCl, lO mM Tris HCl, pH 9.0 및 0.1% 트리톤 X-100의 용액중 10∼30 ng/㎕ 농도로 정제된 단편을 재현탁시킴으로써 수행할 수 있다. 반응 혼합물 100 ㎕당 Taq 폴리머라제 2.5 유닛을 첨가하고, PCR은 다음과 같은 방법으로 수행한다: 94℃에서 60초, 94℃에서 30초, 50∼55℃에서 30초, 72℃에서 30초(30∼45회) 및 72℃에서 5분. 그러나, 이들 매개변수는 적절히 변경할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 몇몇 관점에서, 올리고뉴클레오티드는 PCR 반응물에 포함될 수 있다. 다른 관점에서, DNA 폴리머라제 I의 클리나우 단편은 첫번째 세트의 PCR 반응에서 사용할 수 있고, Taq 폴리머라제는 후속 세트의 PCR 반응에서 사용할 수 있다. 재조합 서열은 분리하고, 이들이 암호화하는 폴리펩티드의 활성을 평가한다.
또한, 변이체는 생체내 돌연변이유발법에 의해 생성할 수 있다. 몇몇 관점에서, 소정 서열 내의 무작위 돌연변이는 박테리아 균주, 예를 들어 하나 이상의 DNA 수복 경로내에 돌연변이를 보유하는 이. 콜라이 균주 내에서 소정 서열을 전파시킴으로써 생성된다. 이러한 "돌연변이자(mutator)" 균주는 야생형 모 균주의 랜덤 돌연변이 비율 보다 더 큰 무작위 돌연변이 비율을 보유한다. 이들 균주중 하나 내에서 DNA의 전파는 상기 DNA 내에 무작위 돌연변이를 실질적으로 생성할 것이다. 생체내 돌연변이유발법에 사용하기에 적합한 돌연변이자 균주는 "Methods forPhenotype Creation from Multiple Gene Populations" 라는 명칭의 1991년 10월 31일 공개된 WO 91/16427호에 기재되어 있다.
또한, 변이체는 카세트 돌연변이유발법으로 생성할 수 있다. 카세트 돌연변이유발법에서, 이본쇄 DNA 분자의 작은 영역은 천연 서열과는 상이한 합성 올리고뉴클레오티드 "카세트"로 대체된다. 종종, 올리고뉴클레오티드는 완전히 및/또는 부분적으로 무작위화된 천연 서열을 함유한다.
또한, 반복 앙상블 돌연변이유발법을 사용하여 변이체를 생성할 수도 있다. 반복 앙상블 돌연변이유발법은 구성원들의 아미노산 서열이 상이한 표현형적으로 관련된 돌연변이체들의 다양한 군집을 생성하기 위해 개발된 단백질 조작(단백질 돌연변이유발)을 위한 알고리즘이다. 이 방법은 연속 라운드의 조합 카세트 돌연변이유발을 제어하기 위해 피드백 메카니즘을 이용한다. 반복 앙상블 돌연변이유발법은 문헌(참조: Arkin, A. P. and Youvan, D. C. , PNAS, USA, 89: 7811-7815, 1992)에 기재되어 있다.
몇몇 관점에서, 변이체는 지수 앙상블 돌연변이유발법을 이용하여 생성한다. 지수 앙상블 돌연변이유발법은 고비율의 독특하고 기능적인 돌연변이체를 갖는 조합 라이브러리를 생성하는 과정인데, 이때 잔기의 작은 기는 병렬적으로 무작위화되어 각각의 변경된 위치에서 기능적인 단백질을 유도하는 아미노산을 확인한다. 지수 앙상블 돌연변이유발법은 문헌(참조: Delegrave, S. and Youvan, D. C. , Biotechnology Research, 11 : 1548-1552,1993)에 기재되어 있다. 무작위 돌연변이유발법 및 부위-지정 돌연변이유발법은 문헌(참조: Arnold, F. H. , CurrentOpinion in Biotechnology, 4: 450-455, 1993)에 기재되어 있다.
몇몇 관점에서, 변이체는 셔플링 절차를 이용하여 생성하는데, 이때 뚜렷한 폴리펩티드를 암호화하는 다수의 핵산의 일부가 함께 융합되어 문헌(참조: "Method of DNA Reassembly by Interrupting Synthesis"라는 명칭의 1996년 7월 9일 출원된 미국 특허 5,965,408 및 "Production of Enzymes Having Desired Activities by Mutagenesis"라는 명칭의 1996년 5월 22일 출원된 미국 특허 5,939,250)에 기재된 키메라 폴리펩티드를 암호화하는 키메라 핵산 서열을 생성한다.
B 그룹 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드의 변이체는 B 그룹 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드의 아미노산 잔기중 하나 이상이 보존 및 비보존 아미노산 잔기(바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환되고, 치환된 아미노산 잔기가 유전 코드에 의해 암호화되는 것이거나 암호화되지 않는 변이체일 수 있다.
보존성 치환은 폴리펩티드내 소정 아미노산을 유사 특성의 다른 아미노산으로 치환하는 것을 의미한다. 전형적으로, 보존성 치환의 예로는 하기 치환을 들 수 있다: 지방족 아미노산, 예를 들어 알라닌, 발린, 루신 및 이소루신의 다른 지방족 아미노산으로의 치환; 세린의 트레오닌으로의 치환 또는 이의 역; 산성 잔기, 예를 들어 아스파르트산 및 글루탐산의 다른 산성 잔기로의 치환; 아미드 잔기를 보유하는 잔기, 예를 들어 아스파라긴 및 글루타민의 아미드기를 보유하는 다른 잔기로의 치환; 염기성 잔기, 예를 들어 라이신과 아르기닌의 다른 염기성 잔기로의 치환; 및 방향족 잔기, 예를 들어 페닐알라닌, 티로신의 다른 방향족 잔기로의 치환을 들 수 있다.
다른 변이체는 B 그룹 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드의 아미노산 잔기중 하나 이상이 치환기를 포함하는 것이다.
또 다른 변이체는 폴리펩티드가 다른 화합물, 예를 들어 상기 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물(예를 들어, 폴리에티렌 글리콜)과 결합된 것이다.
다른 변이체는 추가의 아미노산 서열, 예를 들어 리더 서열, 분비 서열, 프로단백질 서열 또는 폴리펩티드의 정제, 농축 또는 안정화를 용이하게 하기 위한 서열이 융합된 것을 말한다.
몇몇 관점에서, 단편, 유도체 및 유사체는 B 그룹 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드에 실질적으로 동일한 서열과 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 보유한다. 다른 관점에서, 단편, 유도체 또는 유사체는 프로단백질을 포함하여, 상기 단편, 유도체 또는 유사체는 활성 폴리펩티드를 생성하기 위해 프로단백질 부분의 절단에 의해 활성화될 수 있다.
숙주 세포 내에서 높은 수준의 단백질 발현을 달성하기 위한 코돈 최적화
본 발명은 코돈 용법을 변경하기 위해 자일라나제-암호화 핵산을 변형시키는 방법을 제공한다. 한 관점에서, 본 발명은 숙주 세포 내에서 자일라나제 발현을 증가 또는 감소시키기 위해 자일라나제를 암호화하는 핵산내 코돈을 변경하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 숙주 세포 내에서 자일라나제의 발현을 증가시키기 위해 변경된 자일라나제를 암호화하는 핵산, 그렇게 변경된 자일라나제 및 변경된 자일라나제를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 자일라나제-암호화 핵산내 "바람직하지 않은" 또는 "덜 바람직한" 코돈을 확인하는 단계; 이들 바람직하지 않은또는 덜 바람직한 코돈중 하나 이상을 대체된 코돈과 동일한 아미노산을 암호화하는 "바람직한 코돈"으로 대체하는 단계를 포함하며, 상기 핵산중 하나 이상의 바람직하지 않은 코돈 또는 덜 바람직한 코돈은 동일한 아미노산을 암호화하는 바람직한 코돈에 의해 대체된다. 바람직한 코돈은 숙주 세포내의 유전자내 암호 서열내에서 과도하게 나타나는 코돈이며, 바람직하지 않거나 덜 바람직한 코돈은 숙주 세포 내에서 유전자내 암호 서열에서 과소하게 나타나는 코돈이다.
본 발명의 핵산을 발현하는 숙주 세포, 발현 카세트 및 벡터는 박테리아, 효모, 균류, 식물 세포, 곤충 세포 및 포유류 세포이다. 따라서, 본 발명은 이들 모든 세포에서 코돈 용법을 최적화하는 방법, 코돈 변경된 핵산 및 상기 코돈 변경된 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드를 제공한다. 숙주 세포의 예로는 그람 음성 박테리아, 예를 들어 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 및 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens); 그람 양성 박테리아, 예를 들어 스트렙토마이세스 다이버사(Streptomyces diversa), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실러스 크레모리스(Lactococcus cremoris), 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilis)를 들 수 있다. 또한, 숙주 세포로는 진핵 유기체도 사용할 수 있는데, 이의 예로는 여러가지 효모, 예를 들어 사카로마이세스 세레비재(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사크로마이세스 폼브(Schizosaccharomyces pombe), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 아스퍼길러스 나이저(Aspergillus niger)를 포함하는 사카로마이세스종(Saccharomyces sp.) 및 포유동물 세포 및 세포주 및 곤충 세포 및 세포주를 들 수 있다. 따라서, 본 발명은 이들 유기체 및 종에서 발현을 위해 최적화된 핵산 및 폴리펩티드를 포함한다.
예를 들어, 박테리아 세포로부터 분리된 자일라나제를 암호화하는 핵산의 코돈은 상기 핵산이 상기 자일라나제가 유도된 박테리아와는 다른 박테리아 세포, 효모, 진균, 식물 세포, 곤충 세포 또는 포유류 세포에서 최적 발현되도록 변경할 수 있다. 코돈 최적화 방법은 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 5,795,737; Baca (2000) Int. J. Parasitol. 30: 113-118; Hale (1998) Protein Expr. Purif. 12: 185-188; Narum (2001) Infect. Immun. 69: 7250-7253를 참조할 수 있다. 또한, 문헌(참조: Narum (2001) Infect. Immun. 69: 7250-7253, describing optimizing codons in mouse systems; Outchkourov (2002) Protein Expr. Purif. 24: 18-24, describing optimizing codons in yeast; Feng (2000) Biochemistry 39: 15399-15409, describing optimizing codons in E. coli ; Humphreys (2000) Protein Expr. Purif. 20: 252-264, describing optimizing codon usage that affects secretion in E. coli)을 참고할 수도 있다..
트랜스게닉 비인간 동물
본 발명은 본 발명의 핵산, 폴리펩티드(예, 자일라나제), 발현 카셋트 또는 벡터 또는 형질감염 또는 형질전환된 세포를 포함하는 트랜스게닉 비인간 동물을 제공한다. 본 발명은 또한 트랜스게닉 비인간 동물의 제조 방법 및 사용 방법을 제공한다.
트랜스게닉 비인간 동물은 예컨대, 본 발명의 핵산을 포함하는 염소, 토끼, 양, 돼지, 소, 랫트 및 마우스일 수 있다. 이들 동물들은 예컨대, 자일라나제 활성을 연구하는 생체내 모델, 또는 생체내 자일라나제 활성을 변화시키는 작용제를 스크리닝하기 위한 모델로서 사용될 수 있다. 트랜스게닉 비인간 동물에서 발현되는 폴리펩티드에 대한 코딩 서열은 연속적이거나, 또는 조직-특이적, 발달-특이적 또는 유도성 전사 조절 인자의 조절하에 있도록 디자인될 수 있다. 트랜스게닉 비인간 동물은 본 기술 분야에 공지된 방법에 의해 디자인 및 생성할 수 있다; 예컨대, 형질전환된 세포 및 수정란, 및 트랜스게닉 마우스, 랫트, 토끼, 양, 돼지 및 소를 제조하고 사용하는 방법에 대하여 서술하고 있는 미국 특허 제6,211,428호; 제6,187,992호; 제6,156,952호; 제6,118,044호; 제6,111,166호; 제6,107,541호; 제5,959,171호; 제5,922,854호; 제5,892,070호; 제5,880,327호; 제5,891,698호; 제5,639,940호; 제5,573,933호; 제5,387,742호; 제5,087,571호를 참조하라. 또한, 예컨대, 트랜스게닉 낙농 동물의 우유에서 재조합 단백질의 생산에 대해 서술하는 [Pollock (1999) J. Immunol. Methods 231: 147-157]; 및 트랜스게닉 염소에 대해 서술하고 있는 [Baguisi (1999) Nat. Biotechnol. 17: 456-461]을 참고하라. 미국 특허 출원 제6,211,428호는 DNA 서열을 포함하는 뇌 핵산 작제물에서 발현되는 트랜스게닉 비인간 동물의 제조 및 사용에 대해 서술한다. 미국 특허 제6,211,428호는 클로닝된 재조합 또는 합성 DNA 서열을 수정된 마우스 수정란에 주입하고, 주입된 수정란을 가임신 수컷에게 착상시켜, 트랜스게닉 마우스 세포가 알츠하이머 병의 병리학과 연관된 단백질을 발현하도록 하는 것에 대해 서술한다. 미국 특허 제6,187,992호는 마우스의 게놈이 아밀로이드 전구체 단백질(APP)을 코딩하는 유전자의 파괴를 포함하는 트랜스게닉 마우스의 제조 및 사용에 대해 서술한다.
"넉아웃 동물"은 또한 본 발명의 방법을 수행하는 데 사용될 수 있다. 예컨대, 한 양태에서, 본 발명의 트랜스게닉 또는 개질된 동물은 "넉아웃 동물", 예컨대, 본 발명의 자일라나제 또는 본 발명의 자일라나제를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 유전자로 대체되어진 내인성 유전자를 발현하지 않도록 조작된 "넉아웃 마우스"를 포함한다.
트랜스게닉 식물 및 종자
본 발명은 본 발명의 핵산, 폴리펩티드(예, 자일라나제), 발현 카셋트 또는 벡터 또는 형질감염된 또는 형질전환된 세포를 포함하는 트랜스게닉 식물 및 종자를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 및/또는 폴리펩티드(예, 자일라나제)를 포함하는 식물 산물들, 예컨대, 오일, 종자, 잎, 추출물 등을 제공한다. 트랜스게닉 식물은 쌍떡잎 식물(디콧)이거나 외떡잎 식물(모노콧)일 수 있다. 본 발명은 또한 이들 트랜스게닉 식물 및 종자의 제조 및 사용 방법을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 트랜스게닉 식물 또는 식물 세포는 본 기술 분야에 공지된 어떠한 방법에 따라 작제될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 제6,309,872호를 참조하라.
본 발명의 핵산 및 발현 작제물은 어떠한 수단에 의해 식물 세포로 도입될 수 있다. 예컨대, 핵산 및 발현 작제물은 소정의 식물 숙주의 게놈으로 도입될 수 있거나, 또는 핵산 또는 발현 작제물은 에피좀일 수도 있다. 소정의 식물의 게놈으로의 도입은 숙주의 자일라나제 생산이 내인성 전사 또는 번역 조절 요소에 의해 조절되도록 할 수 있다. 본 발명은 또한 예컨대, 상동적 재조합에 의해 일어난 유전자 서열의 삽입이 내인성 유전자의 발현을 파괴하는 "넉아웃 식물"을 제공한다. "넉아웃" 식물을 생성하는 수단은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예컨대, [Strepp (1998) Proc Natl. Acad. Sci. USA 95: 4368-4373; Miao (1995) Plant J 7: 359-365]를 참조하라. 이하, 트랜스게닉 식물에 대한 서술을 참조하라.
본 발명의 핵산은 어떠한 식물, 예컨대, 감자, 밀, 쌀, 보리 등과 같은 전분을 생산하는 식물에 본질적으로 소정의 특성을 부여하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 핵산은 숙주의 자일라나제 발현을 최적화하거나 변화시키기 위해, 식물의 대사 경로를 조작하는 데 사용될 수 있다. 이는 식물에서 자일라나제 활성을 변화시킬 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 자일라나제는 그 식물에 의해 원래 생산되지 않는 화합물을 생산하기 위해, 트랜스게닉 식물을 제조하는 데 사용될 수 있다. 이는 생산 비용이 적거나, 신규한 산물을 생성하게 할 수 있다.
한 양태에서, 트랜스게닉 식물을 제조하는 첫 단계는 식물 세포에서 발현하는 발현 작제물을 제조하는 것을 포함한다. 이들 기술은 본 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 여기에는 프로모터의 선별 및 클로닝, 리보좀이 mRNA에 효율적으로 결합하는 것을 용이하게 하는 코딩 서열의 선별 및 클로닝, 및 적절한 유전자 종결자 서열의 선별이 포함될 수 있다. 하나의 대표적인 연속적 프로모터는 식물에서 과량 발현을 일반적으로 초래하는 콜리플라워 모자이크 바이러스 유래의 CaMV35S이다. 다른 포로모터는 식물 내부 또는 외부 환경의 신호에 더욱 특이하게 반응한다. 대표적인 광유도성 프로모터는 주된 엽록소 a/b 결합 단백질을 코딩하는 cab 유전자의 단백질이다.
한 양태에서, 핵산은 식물 세포에서 더욱 과량의 발현을 얻기위해 개질된다. 예컨대, 본 발명의 서열은 식물에서 관찰되는 서열에 비교하여 높은 %의 A-T 뉴클레오티드 쌍을 가질 수 있으며, 일부의 경우는 G-C 뉴클레오티드 쌍의 %가 더 높다. 따라서, 코딩 서열내 A-T 뉴클레오티드는 식물 세포에서 유전자 산물의 생산을 강화시키기 위해 아미노산 서열의 두드러진 변화없이도 G-C 뉴클레오티드로 대체될 수 있다.
선별적 마커 유전자는 연속적으로 트랜스유전자에 삽입된 식물 세포 또는 조직을 확인하기 위해 유전자 작제물에 첨가될 수 있다. 이는 식물 세포내에 유전자의 삽입 및 발현이 드문 일이며, 표적화된 조직 또는 세포의 몇 %에서만 발생하므로 필수적일 수 있다. 선별적 마커 유전자는 식물에 일반적으로 독성인 약제에 내성을 제공하는 단백질, 예컨대, 항생제 또는 제초제를 코딩한다. 삽입된 선별적 마커 유전자를 갖는 식물 세포만이 적절한 항생제나 제초제를 함유하는 배지에서 배양시 생존할 것이다. 다른 삽입된 유전자를 위해, 마커 유전자는 또한 더 나은 기능을 갖는 프로모터 및 종결 서열을 요구한다.
한 양태에서, 트랜스게닉 식물 또는 종자를 제조하는 것은 본 발명의 서열, 및 임의적으로 마커 유전자를 표적 발현 작제물(예, 플라스미드)에 프로모터 및 종결자 서열의 위치에 따라 삽입하는 것을 포함한다. 이에는 개질된 유전자를 적절한 방법을 통해 식물에 전달시키는 것을 포함할 수 있다. 예컨대, 작제물은 전기충격및 식물 세포 프로토플라스트의 미세주입과 같은 기술들을 사용하여, 식물 세포의 게놈 DNA에 직접 도입되거나, 또는 작제물은 DNA 입자 포격과 같은 탄도 방법을 사용하여 식물 조직에 직접 도입될 수 있다. 예컨대, 입자 포격을 사용하여 밀에 트랜스유전자를 도입하는 것에 대해 서술하는 [Christou (1997) Plant Mol. Biol. 35: 197-203; Pawlowski (1996) Mol. Biotechnol. 6: 17-30; Klein (1987) Nature 327: 70-73; Takumi (1997) Genes Genet. Syst. 72: 63-69] 및 입자 포격을 사용하여 YAC을 식물 세포에 도입하는 것에 대해 서술하고 있는 [Adam (1997) supra]를 참조하라. 예컨대, [Rinehart (1997) supra]는 입자 포격을 사용하여 트랜스게닉 코튼 식물을 생성하였다. 입자를 가속화시키는 장치는 미국 특허 제5,015,580호에 서술되어 있으며, BioRad (Biolistics) PDS-2000 입자 가속화 기기가 시판중이며, 또한 겉씨 식물의 입자-매개 형질전환에 대해 서술하고 있는 John의 미국 특허 제 5,608,148호 및 Ellis의 미국 특허 제5,681,730호를 참조하라.
한 양태에서, 프로토플라스트는 고정되고, 핵산, 예컨대, 발현 작제물이 주입될 수 있다. 프로토플라스트 유래의 식물 재발생이 곡식에는 용이하지 않음에도, 식물 재발생은 프로토플라스트 유래된 캘러스의 체세포 배형성을 사용하여, 콩과 식물에서는 가능하다. 유기된 조직은 DNA를 텅스텐 미세발사물로 코팅하며, 이 때 발사체는 세포 크기의 1/100 크기이고, 이로 인해 DNA가 세포 및 조직으로 운반되는 유전자 총 기술을 사용하여, 네이키드 DNA로 형질전환될 수 있다. 그 후, 형질전환된 조직은 체세포 배형성에 의해 일반적으로 재발생될 수 있다. 이 기술은 옥수수 및 쌀을 비롯한 여러 곡식 종에서 성공되어 왔다.
핵산, 예컨대, 발현 작제물은 또한 재조합 바이러스를 사용하여 식물 세포에 도입될 수 있다. 식물 세포는 담배 모자이크 바이러스에서 유래된 벡터와 같은 바이러스 벡터를 사용하여 형질전환될 수 있다(Rouwendal (1997) Plant Mol. Biol. 33: 989-999), Porta (1996) "Use of viral replicons for the expression of genes in plants", Mol. Biotechnol. 5: 209-221 참조).
선택적으로, 핵산, 예컨대, 발현 작제물은 적절한 T-DNA 플랭킹 부위와 조합되어, 종래의 아그로박테리엄 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 숙주 벡터로 도입될 수 있다. 아그로박테리엄 투메파시엔스 숙주의 병독성 기능은 세포가 박테리아로 감염시, 작제물 및 인접한 마커가 식물 세포 DNA로 삽입되는 것을 가능케 한다. 무력화되고 바이너리 벡터의 사용을 포함하는 아그로박테리엄 투메파시엔스-매개된 형질전환 기술은 과학 문헌에 잘 서술되어 있다. 예컨대, [Horsch (1984) Science 233: 496-498; Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803 (1983); Gene Transfer to Plants, Potrykus, ed. (Springer-Verlag, Berlin 1995)]를 참조하라. 아그로박테리엄 투메파시엔스 세포의 DNA는 Ti(종양-유도) 플라스미드로 알려져 있는 기타 구조내에는 물론 박테리아 염색체 내에 함유된다. Ti 플라스미드는 감염 과정시 식물 세포로 전이되는 T-DNA(~20 kb 길이) 및 감염 과정을 초래하는 일련의 vir(병독성) 유전자로 일컬어 지는 DNA를 함유한다. 아그로박테리엄 투메파시엔스는 단지 상처를 통해서만 식물에 감염될 수 있다: 식물 뿌리 또는 줄기가 상처를 입으면, 여기서 어떠한 화학적 신호를 내게 되고, 이 신호에 반응하여, 아그로박테리엄 투메파시엔스의 vir 유전자는 활성화되어 Ti-플라스미드의 T-DNA를 식물의 염색체로 전이시키는 데 필요한 일련의 과정들을 초래하게 된다. 그 후, T-DNA는 상처 부위를 통해 식물 세포로 들어간다. T-DNA는 식물 DNA가 복제되거나 전사될 때까지 기다린 후, 노출된 식물 DNA에 그 자신을 삽입시킨다고 추정된다. 아그로박테리엄 투메파시엔스를 트랜스유전자 벡터로 사용하기 위해서, T-DNA의 종양-유도 부위는 제거되어야만 하며, 반면에 T-DNA 경계 부위 및 vir 유전자는 유지되어야만 한다. 트랜스유전자는 그 후 T-DNA 경계 부위들 사이에 삽입되어, 식물 세포로 전이되어 식물의 염색체에 삽입되게 될 것이다.
본 발명은 본 발명의 핵산을 사용한 중요한 곡식을 포함하는 외떡잎 식물의 형질전환을 제공한다. [Hiei (1997) Plant Mol. Biol. 35: 205-218]을 참조하라. 또한, 예컨대, 게놈 DNA에 T-DNA의 삽입에 대해 서술하고 있는 [Horsch, Science(1984) 233: 496; Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci USA 80: 4803; Thykjaer (1997) supra; Park (1996) Plant Mol. Biol. 32: 1135-1148]를 참조하라. 또한, 곡식 또는 기타 외떡잎 식물의 세포에서 작동하는 유전자를 포함하는 DNA의 안정적 삽입 방법에 대해 서술하고 있는 D'Halluin의 미국 특허 제5,712,135호를 참조하라.
한 양태에서, 세번째 단계는 통합된 표적 유전자를 다음 세대까지 전달할 수 있는 전체 식물의 선별 및 재발생을 포함할 수 있다. 이러한 재발생 기술은 조직 배양 성장 배지에서 어떠한 피토호르몬을 조작하는 것에 의존하며, 전형적으로 소정의 뉴클레오티드 서열과 함께 도입된 살생물제 및/또는 제초제 마커에 의존한다. 배양된 프로토플라스트로부터의 식물 재발생은 [Evans et al., ProtoplastsIsolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp.124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; 및 Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985]에 서술되어 있다. 재발생은 또한 식물 캘러스, 외식편, 기관 또는 이들의 부분에서 얻을 수 있다. 이러한 재발생 기술은 일반적으로 [Klee (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467-486]에 서술되어 있다. 비성숙된 배아와 같은 트랜스게닉 조직에서 전체 식물을 얻기 위해서, 이들은 조직 배양으로 알려진 영양소 및 호르몬을 함유하는 일련의 배지에서 조절되는 환경 조건하에 성장될 수 있다. 일단 전체 식물이 생성되고 종자를 생산하면, 자손의 평가가 시작된다.
발현 카셋트가 트랜스게닉 식물에 안정적으로 통합된 후, 이는 교배에 의해 다른 식물로 도입될 수 있다. 여러 표준 육종 기술 중 어떠한 것들이 교배될 종에 따라 사용될 수 있다. 본 발명의 핵산의 트랜스게닉 발현이 표현형 변화를 초래하기 때문에, 본 발명의 재조합 핵산을 포함하는 식물은 제2 식물과 교배되어 최종 산물을 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명의 종자는 본 발명의 2개의 트랜스게닉 식물의 교배를 통해 유래되거나, 본 발명의 식물과 다른 식물과의 교배에 의해 유래될 수 있다. 소정의 효과(예, 본 발명의 폴리펩티드의 발현이 개화 양식이 변화된 식물을 생산함)가 양쪽 부모 식물이 본 발명의 폴리펩티드(예, 자일라나제)를 발현하는 경우 강화될 수 있다. 소정의 효과는 표준 증식 수단에 의해 미래의 식물 세대로 전달될 수 있다.
본 발명의 핵산 및 폴리펩티드는 어떠한 식물 또는 종자에서 발현되거나 이에 삽입된다. 본 발명의 트랜스게닉 식물은 쌍떡잎 식물 또는 외떡잎 식물일 수 있다. 본 발명의 외떡입 트랜스게닉 식물의 예는 풀, 예컨대, 왕포아풀(파란 풀, 포아(Poa)), 마초 풀, 예컨대, 페스투카, 로리엄, 템퍼레이트(temperate) 풀, 예컨대, 아그로스티스(Agrostis) 및 곡식, 예컨대, 밀, 귀리, 호밀, 보리, 쌀, 사탕수수 및 옥수수(콘)이 있다. 본 발명의 쌍떡잎 트랜스게닉 식물의 예는 담배, 콩과 식물, 예컨대, 루핀, 감자, 사탕무, 완두, 콩 및 대두, 및 겨자과 식물(브라시카세아(Brassicaceae) 패밀리)), 예컨대, 콜리플라워, 평지 종자, 및 밀접하게 관련된 모델 유기체인 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)가 있다. 따라서, 본 발명의 트랜스게닉 식물 및 종자는 아나카리듐(Anacardium), 아라치스(Arachis), 아스파라거스(Asparagus), 아트로파(Atropa), 아베나(Avena), 브라시카(Brassica), 시트러스(Citrus), 시트럴러스(Citrullus), 캡시컴(Capsicum), 카르타머스(Carthamus), 코코스(Cocos), 코피아(Coffea), 쿠쿠미스(Cucumis), 쿠쿠르비타(Cucurbita), 다우커스(Daucus), 엘라에시스(Elaeis), 프라가리아(Fragaria), 글라이신(Glycine), 고시피엄(Gossypium), 헬리안터스(Helianthus), 헤테로칼리스(Heterocallis), 호르테우튼(Hordeutn), 하이오시아머스(Hyoscyamus), 락투카(Lactuca), 린넘(Linum), 로리엄(Lolium), 루피너스(Lupinus), 리코퍼시콘(Lycopersicon), 말러스(Malus), 만니호트(Manihot), 메이요라나(Majorana), 메디카고(Medicago), 니코티아나(Nicotiana), 올레아(Olea), 오리자(Oryza), 페니엄(Panieum), 파니세텀(Pannisetum), 페르지아(Persea), 파세올러스(Phaseolus), 피스타치아(Pistachia), 피섬(Pisum), 피러스(Pyrus), 프루너스(Prunus), 라파너스(Raphanus), 리치너스(Ricinus), 세케일(Secale), 세네시오(Senecio), 시나피스(Sinapis), 솔라넘(Solanum), 소르클라엄(Sorglaum), 를제오브로머스(Tlzeobromus), 트리고넬라(Trigonella), 트리티컴(Triticum), 비시아(Vicia), 비티스(Vitis), 비그나(Vigna) 및 지아(Zea) 속에서 유래된 종들을 포함하나, 이로 제한되지 않는 광범위한 식물을 포함한다.
선택적 구체예에서, 본 발명의 핵산은 섬유 세포를 함유하는 식물, 예컨대, 코튼, 실크 코튼 나무(Kapok, Ceiba pentandra), 사막 버드나무, 크레오소트 덤블, 윈터팻, 발사, 라미, 양마, 삼, 로젤, 황마, 사이잘 삼 및 아마에서 발현된다. 선택적 구체예에서, 본 발명의 트랜스게닉 식물은 어떠한 고시피엄 종, 예컨대, 고시피엄 아르보레엄(G. arboreum); 고시피엄 헤르바세엄(G. herbaceum), 고시피럼 바르바덴스(G. barbadense) 및 고시피엄 히르서텀(G. hirsutum)의 멤버를 포함하는 고시피엄(Gossypium) 속의 구성원일 수 있다.
본 발명은 또한 많은 양의 본 발명의 폴리펩티드(예, 자일라나제 또는 항체)를 생산하는 데 사용되는 트랜스게닉 식물을 제공한다. 예컨대, [Palmgren (1997) Trends Genet. 13:348; Chong (1997) Transgenic Res. 6: 289-296]를 참조하라(옥신-유도성, 양방향 만노파인 신테타제(mas 1', 2') 프로모터를 사용하여, 아그로박테리엄 투메파시엔스-매개된 잎 디스크 형질전환 방법으로, 트랜스게닉 감자에서 인간 우유 단백질인 베타-카제인을 생산함).
공지된 과정들을 사용하여, 당업자는 트랜스게닉 식물에서 트랜스유전자 mRNA나 단백질의 증가 또는 감소를 검출하여 본 발명의 식물을 스크린할 수 있다.mRNA나 단백질의 검출 및 정량화 수단은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다.
폴리펩티드 및 펩티드
한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 대표적 서열과 서열 동일성(예, 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%,73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%,81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%,88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상, 또는 완전한(100%) 서열 동일성)을 갖는 완전히(100%) 분리되거나 재조합된 폴리펩티드를 제공한다. 예컨대, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, SEQ I : D NO : 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 48, 서열 번호 50, 서열 번호 52, 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 58, 서열 번호 60, 서열 번호 62, 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108, 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116, 서열 번호 118, 서열 번호 120, 서열 번호 122, 서열 번호 124, 서열 번호 126, 서열 번호 128, 서열 번호 130, 서열 번호132; 서열 번호 134; 서열 번호 136; 서열 번호 138; 서열 번호 140; 서열 번호 142; 서열 번호 144; 서열 번호 146, 서열 번호 148, 서열 번호 150, 서열 번호 152, 서열 번호 154, 서열 번호 156, 서열 번호 158, 서열 번호 160, 서열 번호 162, 서열 번호 164, 서열 번호 166, 서열 번호 168, 서열 번호 170, 서열 번호 172, 서열 번호 174, 서열 번호 176, 서열 번호 178, 서열 번호 180, 서열 번호 182, 서열 번호 184, 서열 번호 186, 서열 번호 188, 서열 번호 190, 서열 번호 192, 서열 번호 194, 서열 번호 196, 서열 번호 198, 서열 번호 200, 서열 번호 202, 서열 번호 204, 서열 번호 206, 서열 번호 208, 서열 번호 210, 서열 번호 212, 서열 번호 214, 서열 번호 216, 서열 번호 218, 서열 번호 220, 서열 번호 222, 서열 번호 224, 서열 번호 226, 서열 번호 228, 서열 번호 230, 서열 번호 232, 서열 번호 234, 서열 번호 236, 서열 번호 238, 서열 번호 240, 서열 번호 242, 서열 번호 244, 서열 번호 246, 서열 번호 248, 서열 번호 250, 서열 번호 252, 서열 번호 254, 서열 번호 256, 서열 번호 258, 서열 번호 260, 서열 번호 262, 서열 번호 264, 서열 번호 266, 서열 번호 268, 서열 번호 270, 서열 번호 272, 서열 번호 274, 서열 번호 276, 서열 번호 278, 서열 번호 280, 서열 번호 282, 서열 번호 284, 서열 번호 286, 서열 번호 288, 서열 번호 290, 서열 번호 292, 서열 번호 294, 서열 번호 296, 서열 번호 298, 서열 번호 300, 서열 번호 302, 서열 번호 304, 서열 번호 306, 서열 번호 308, 서열 번호 310, 서열 번호 312, 서열 번호 314, 서열 번호 316, 서열 번호 318, 서열 번호 320, 서열 번호 322, 서열 번호 324, 서열 번호 326, 서열 번호 328, 서열 번호 330, 서열 번호332, 서열 번호 334, 서열 번호 336, 서열 번호 338, 서열 번호 340, 서열 번호 342, 서열 번호 344, 서열 번호 346, 서열 번호 348, 서열 번호 350, 서열 번호 352, 서열 번호 354, 서열 번호 356, 서열 번호 358, 서열 번호 360, 서열 번호 362, 서열 번호 364, 서열 번호 366, 서열 번호 368, 서열 번호 370, 서열 번호 372, 서열 번호 374, 서열 번호 376, 서열 번호 378 또는 서열 번호 380으로 나타낸 서열을 갖는 단백질이다. 한 양태에서, 폴리펩티드는 자일라나제 활성을 가지며, 예컨대, 다당류(예, 자일란)내 글리코시딕 결합을 가수분해할 수 있다. 한 양태에서, 폴리펩티드는 내부 β-1,4-자일로시딕 결합의 가수분해를 촉매화할 수 있는 자일라나제 활성을 가진다. 한 양태에서, 자일라나제 활성은 엔도-1,4-베타-자일라나제 활성을 포함한다. 한 양태에서, 자일라나제 활성은 자일란을 가수분해하여, 더 소분자량의 자일로즈 및 자일로-올리고머를 생산하는 것을 포함한다. 한 양태에서, 자일란은 아라비노자일란, 예컨대, 수용성 아라비노자일란을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드는 자일라나제를 활성 형태 또는 비활성 형태로 포함한다. 예컨대, 본 발명의 폴리펩티드는 프로단백질이 전환되어 "활성" 성숙한 단백질을 생성하는, 예컨대, 프로단백질-가공 효소에 의한 "성숙화" 또는 프리프로 서열의 가공 이전의 프로단백질을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 예컨대, 엔도- 또는 엑소-펩티다제 또는 프로테나제 작용, 인산화 반응, 아미드화, 당화 또는 황화, 다이머화 반응 등과 같은 후-번역 과정에 의해 "활성화"되기 이전인, 다른 이유로 비활성 형태인 자일라나제를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 자일라나제의 활성 서브서열, 예컨대, 촉매 도메인 또는 활성 부위를 포함하는, 모든 활성 형태를 포함한다.
"프리프로" 도메인 서열 및 신호 서열을 확인하는 방법은 본 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 예컨대, [Van de Ven (1993) Crit. Rev. Oncog. 4 (2): 115-136]를 참조하라. 예컨대, 프리프로 서열을 확인하기 위해서는, 단백질을 세포외 공간에서 정제하고, N-말단 단백질 서열을 결정하고 비가공된 형태와 비교한다.
본 발명은 신호 서열 및/또는 프리프로 서열이 포함되거나 포함되지 않은 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명은 이질적 신호 서열 및/또는 프리프로 서열이 포함된 폴리펩티드를 포함한다. 프리프로 서열(이질적 프리프로 도메인으로 사용된 본 발명의 서열 포함)은 단백질의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 위치할 수 있다. 본 발명은 또한 분리되거나 재조합된 신호 서열, 프리프로 서열 및 본 발명의 서열을 포함하는 촉매 도메인(예, "활성 부위")을 포함한다.
% 서열 동일성은 폴리펩티드 전체 길이에 걸쳐 존재하거나, 또는 동일성이 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 또는 그 이상의 잔기 부위에 걸쳐 존재할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 대표적인 폴리펩티드의 전체 길이보다 더 짧을 수 있다. 선택적 양태에서, 본 발명은 약 5 내지 전체 폴리펩티드, 예컨대, 자일라나제와 같은 효소길이의 크기 범위를 갖는 폴리펩티드(펩티드, 단편)를 제공하며, 대표적인 크기는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 또는 그 이상의 잔기, 예컨대, 본 발명의 대표적인 자일라나제의 연속 잔기의 범위이다.
본 발명의 펩티드(예, 본 발명의 대표적인 폴리펩티드의 서브서열)는 예컨대, 표지된 프로브, 항원, 톨러라젠, 모티프, 자일라나제 활성 부위(예, "촉매 도메인"), 신호 서열 및/또는 프리프로 도메인으로 유용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 및 펩티드는 천연원에서 분리되거나 합성되거나, 또는 재조합적으로 발생된 폴리펩티드일 수 있다. 펩티드 및 단백질은 시험관내 또는 생체내에서 재조합적으로 발현될 수 있다. 본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는 본 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 제조 및 분리될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 및 펩티드는 또한 본 기술 분야에 잘 알려진 화학적 방법을 사용하여 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 예컨대, [Caruthers(1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser.225-232; Banga, A. K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA]을 참조하라. 예컨대, 펩티드 합성은 다양한 고체상 기술을 사용하여 수행될 수 있으며(예, Roberge (1995) Science 269: 202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289: 3-13 참조), 자동화된 합성도 제조자에 의해 제공되는 지시에 따라, 예컨대, ABI 431A 펩티드 합성기(Perkin Elmer)를 사용하여 성취될 수 있다.
본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는 또한 당화될 수 있다. 당화는 후-번역적으로 화학적 또는 세포내 생합성 메카니즘에 의해 첨가될 수 있으며, 후자의 경우는 서열에 네이티브 하거나, 또는 펩티드로 첨가되거나 핵산 코딩 서열로 첨가될수 있는 공지된 당화 모티프의 사용을 포함한다. 당화는 0-결합되거나 N-결합될 수 있다.
전술된 바와 같이, 본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는 모든 "의태체" 및 "펩티도의태체" 형태를 포함한다. 용어 "의태체" 및 "펩티도의태체"는 본 발명의 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 구조적 및/또는 기능적 특징을 가지는 합성 화학 화합물을 나타낸다. 의태체는 아미노산의 합성된 비천연 유사체로 구성되거나, 부분적으로 천연 펩티드 아미노산 및 부분적으로 아미노산의 비천연 유사체의 키메릭 분자일 수 있다. 의태체는 또한 치환이 의태체의 구조 및/또는 활성을 실질적으로 변화시키지 않는 한, 일정한 양의 천연 아미노산 보존적 대체를 포함할 수 있다. 구조적 변형체인 본 발명의 폴리펩티드 아미노산으로, 일상적 실험은 의태체가 본 발명의 범위 이내임을, 즉, 의태체의 구조 및/또는 기능이 실질적으로 변화되지 않았음을 확인할 것이다. 따라서, 한 양태에서, 의태체 조성은 만약 의태체 조성이 자일라나제 활성을 갖는다면 본 발명의 범위 이내이다.
본 발명의 폴리펩티드 의태체 조성은 비천연 구조적 성분들의 어떠한 조합을 포함할 것이다. 선택적 양태에서, 본 발명의 의태체 조성은 이하 세가지 구조적 군의 하나 또는 전부를 포함한다: a) 천연 아미드 결합("펩티드 결합")이 아닌 다른 잔기 결합 군; b) 천연적으로 발생하는 아미노산 잔기를 대신하는 비천연 잔기; 또는 c) 2차 구조적 의태체를 유도하는, 즉, 2차 구조, 예컨대, 베타 턴, 감마 턴, 베타 쉬트, 알파 헬릭스 구성 등을 유도하거나 안정화시키는 잔기. 예컨대, 본 발명의 폴리펩티드는 이 잔기들의 전부 또는 일부가 천연 펩티드 결합이 아닌 다른화학적 수단으로 연결되는 경우, 의태체로 특징화될 수 있다. 개별적인 펩티도의태체 잔기는 펩티드 결합, 기타 화학적 결합 또는 커플링 수단, 예컨대, 글루타알데히드, N-히드록시숙시니미드 에스터, 이중작용성 말레이미드, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 또는 N,N'-디이소프로필카르보디이미드(DIC)에 의해 연결될 수 있다. 전통적인 아미드 결합("펩티드 결합")을 대체할 수 있는 결합 기에는 예컨대, 케토메틸렌(예, -C(=O)-NH-의 경우 -C(=O)-CH2-), 아미노메틸렌(CH2-NH), 에틸렌, 올레핀(CH=CH), 에테르(CH2-O), 티오에테르(CH2-S), 테트라졸(CN4-), 티아졸, 레트로아미드, 티오아미드, 또는 에스터가 포함된다(예, Spatola(1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, "Peptide Backbone Modifications", Marcell Dekker, NY).
본 발명의 폴리펩티드는 또한 천연적으로 발생하는 아미노산 잔기를 대신하는 비천연 잔기의 전부 또는 일부를 함유하는 의태체로 특징화될 수 있다. 비천연 잔기는 과학 문헌 및 특허 문허에 잘 서술되어 있다; 천연 아미노산 잔기의 의태체로 유용한 대표적인 비천연 조성의 일부 및 이에 대한 가이드라인은 이하 서술된다. 방향족 아미노산의 의태체는 예컨대, D- 또는 L-나필알라닌; D- 또는 L-페닐글라이신; D- 또는 L-2 티에네일알라닌; D- 또는 L-1-, 2-, 3-, 또는 4-피레네일알라닌; D- 또는 L-3 티에네일알라닌; D- 또는 L- (2-피리디닐)-알라닌; D- 또는 L-(3-피리디닐)-알라닌; D- 또는 L-(2-피라지닐)-알라닌; D- 또는 L-(4-이소프로필)-페닐글라이신; D-(트리플루오로메틸)-페닐글라이신; D-(트리플루오로메틸)-페닐알라닌; D-p-플루오로-페닐알라닌; D- 또는 L-p-비페닐페닐알라닌; D- 또는 L-p-메톡시-비페닐페닐알라닌; D- 또는 L-2-인돌(알킬)알라닌; 및 D- 또는 L-알킬알라닌으로 대체 함으로써 발생될 수 있으며, 여기서, 알킬은 치환된 또는 비치환된 메틸, 에틸, 프로필, 헥실, 부틸, 펜틸, 이소프로필, 이소-부틸, sec-이소틸, 이소-펜틸, 또는 비산성 아미노산일 수 있다. 비천연 아미노산의 방향족 고리에는 예컨대, 티아졸릴, 티오페닐, 피라졸릴, 벤지미다졸릴, 나프틸, 푸라닐, 피롤릴 및 피리딜 방향족 고리를 포함한다.
산성 아미노산의 의태체는 예컨대, 음성 전하는 유지하면서 비-카르복실레이트 아미노산; (포스포노)알라닌; 황화 트레오닌을 대체함으로써 발생될 수 있다. 카르복실 측면 기(예, 아스파르틸 또는 글루타밀)는 또한 카르보디이미드(R'-N-C-N-R'), 예컨대, 1-시클로헥실-3(2-모르폴리닐-(4-에틸) 카르보디이미드 또는 1-에틸-3(4-아조니아-4,4-디메톨펜틸) 카르보디이미드와의 반응으로 선택적으로 개질될 수 있다. 아스파르틸 또는 글루타밀은 또한 암모늄 이온과의 반응으로 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환될 수 있다. 염기성 아미노산의 의태체는 예컨대, (라이신 및 아르기닐에 부가하여), 아미노산 오르니틴, 시트룰린, 또는 (구아니디노)-아세트산, 또는 (구아니디노)알킬-아세트산과의 치환으로 발생될 수 있으며, 여기서 알킬은 상기 정의된 바와 같다. 니트릴 유도체(예, COOH 대신 CN-부분을 함유)는 아스파라긴 또는 글루타민을 대체할 수 있다. 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기는 대응되는 아스파틸 또는 글루타밀 잔기로 탈아민화될 수 있다. 아르기닌 잔기 의태체는 아르기닐을 예컨대, 하나 이상의 종래의 시약들(예, 페닐글리옥살,2,3-부탄디온, 1,2-시클로-헥산디온, 또는 닌히드린)과 함께 바람직하게는 알칼리 조건하에 반응함으로써 발생될 수 있다. 티로신 잔기 의태체는 티로실을 예컨대, 방향족 디아조니엄 화합물 또는 테트라니트로메탄과 반응함으로써 발생될 수 있다. N-아세틸이미디졸 및 테트라니트로메탄은 0-아세틸 티로실 종 및 3-니트로 유도체를 형성하는 데 각각 사용될 수 있다. 시스테인 잔기 의태체는 시스테이닐 잔기를 예컨대, 알파-할로아세테이트, 예컨대, 2-클로로아세트산 또는 클로로아세타미드 및 대응되는 아민과 반응시킴으로써, 카르보시메틸 또는 카르복시아미도메틸 유도체를 형성함으로써, 발생될 수 있다. 시스테인 잔기 의태체는 또한 시스테이닐 잔기를 예컨대, 브로모-트리플루오로아세톤, 알파-브로모-베타-(5-이미도조일) 프로피온산; 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디설피드; 메틸 2-피리딜 디설피드; p-클로로머큐리벤조에이트; 2-클로로머큐리-4 니트로페놀; 또는, 클로로-7-니트로벤조-옥사-1,3-디아졸과 반응시킴으로써 발생될 수 있다. 라이신 의태체는 라이시닐을 예컨대, 카르복실산 무수화물과 반응시킴으로써, 발생되거나 (및 아미노 말단 잔기는 변화될) 수 있다. 라이신 및 기타 알파-아미노-함유 의태체는 또한 이미도에스터, 예컨대, 메틸 피콜린이미데이트, 피리독살 포스페이트, 피리독살, 클로로보로히드리드, 트리니트로-벤젠술폰산, O-메틸이소우레아, 2,4-펜탄디온과의 반응, 및 글리옥실레이트와의 트랜스아미다제-촉매화 반응에 의해 발생될 수 있다. 메티오닌 의태체는 예컨대, 메티오닌 설폭시드와의 반응으로 발생될 수 있다. 프롤린 의태체에는 예컨대, 피페콜산, 티아졸리딘 카르복실산, 3- 또는 4-히드록시 프롤린, 데히드로프롤린, 3- 또는 4-메틸프롤린, 또는 3,3-디메틸프롤린이 포함된다. 히스티딘 잔기 의태체는 히스티딜을 예컨대, 디에틸프로카보네이트 또는 파라-브로모펜아크릴 브로마이드와 반응시킴으로써 발생될 수 있다. 기타 의태체에는 예컨대, 프롤린 및 라이신의 히드록실화; 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실 기의 인산화; 라니신, 아르기닌 및 히스티딘의 알파-아미노기의 메틸화; N-말단 아민의 아세틸화; 주된 사슬 아미드 잔기의 메틸화 또는 N-메틸 아미노산으로의 치환; 또는 C-말단 카르복실기의 아미드화에 의해 발생된 것들이 포함된다.
본 발명의 폴리펩티드의 잔기, 예컨대, 아미노산은 또한 반대 키랄리티의 아미노산(또는 펩티도의태체 잔기)을 대체함으로써 대체될 수 있다. 따라서, L-배위로 천연적으로 발생하는 어떠한 아미노산(화학적 엔티티의 구조에 따라 R 또는 S로도 언급될 수 있음)은 D-아미노산으로 언급되는, 동일한 화학 구조의 유형 또는 펩티도의태체이나 반대 키랄리티를 갖는 아미노산으로 대체될 수 있으며, 이 또한 R- 또는 S-형태로 언급될 수 있다.
본 발명은 또한 후-번역 가공(예, 인산화, 아실화 등)과 같은 천연 과정, 또는 화학적 개질 기술에 의해 본 발명의 폴리펩티드를 개질하는 방법을 제공하며, 결과적으로 개질된 폴리펩티드를 제공한다. 개질은 펩티드 백본, 아미노산 측사슬 및 아미노 말단 및 카르복시 말단을 포함하는 폴리펩티드의 어떠한 부위에서도 일어날 수 있다. 동일한 유형의 개질이 주어진 폴리펩티드에서 여러 분위에 동일하거나 다양한 정도로 존재할 수 있음을 이해될 것이다. 또한, 주어진 폴리펩티드는 여러 유형의 개질을 포함할 수 있다. 개질에는 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 결합, 헴 부분의 공유 결합, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유 결합, 포스파티딜이노시톨의 공유 결합, 교차 결합 시클화, 디설피드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 교차 결합의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포밀화, 감마-카르복실화, 당화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스톨화, 산화, 페닐화, 프로테올리틱 가공, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황화, 및 단백질에 아미노산의 트랜스퍼 RNA 매개된 첨가, 예컨대, 아르기닐화가 포함된다. 예컨대, [ Creighton, T. E., Proteins-Structure and Molecular Properties 2nd Ed. , W. H. Freeman and Company, New York(1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp. 1-12 (1983)]를 참조하라.
고체상 화학적 펩티드 합성 방법은 또한 본 발명의 폴리펩티드 또는 단편을 합성하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 1960년대 이래로 본 기술 분야에 공지되어 왔으며(Merrifield, R. B. , J. Am. Chem. Soc. , 85: 2149-2154, 1963. 또한, Stewart, J. M. and Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., pp. 11-12를 참조하라), 최근에는 시판되는 실험실 펩티드 디자인 및 합성 키트로 사용되고 있다(Cambridge Research Biochemicals). 이러한 시판중인 실험실 킷트는 [H. M. Geysen et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 3998 (1984)]의 기술을 일반적으로 사용하며, 다수의 "로드" 또는 "핀"으로 펩티드를 합성하는 방법을 제공하며, 이들 모두는 단일 플레이트에연결된다. 이러한 시스템이 사용되는 경우, 로드 또는 핀의 플레이트는 인버팅되고, 핀 또는 로드의 팁에 적절한 아미노산을 부착 또는 앵커링시키는 용액을 함유하고 있는 대응되는 웰 또는 레저부아의 제2 플레이트로 전환된다. 이러한 과정들을 반복함으로써, 즉, 인버팅하고, 로드 및 핀의 팁을 적절한 용액으로 삽입함으로써, 아미노산은 소정의 펩티드가 된다. 덧붙여, 여러 이용 가능한 FMOC 펩티드 합성 시스템이 이용가능하다. 예컨대, 폴리펩티드 또는 단편의 어셈블리는 고체 지지체 상에서, Applied Biosystems, Inc. Model 431A™자동화된 펩티드 합성기를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 장비는 다른 공지된 기술을 사용하여 커플될 수 있는 일련의 단편들을 합성하거나 직접 합성함으로써, 본 발명의 펩티드에 대한 용이한 접근을 제공한다.
본 발명은 신호의 존재 또는 부존재하에 본 발명의 자일라나제를 포함한다. 본 발명의 신호 서열을 포함하는 폴리펩티드는 본 발명의 자일라나제 또는 다른 자일라나제 또는 다른 효소 또는 다른 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명은 고정화된 자일라나제, 항-자일라나제 항체 및 이들의 단편을 포함한다. 본 발명은 예컨대, 본 발명의 우성 음성 돌연변이체 또는 항-자일라나제 항체를 사용하여, 자일라나제 활성을 저해하는 방법을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 자일라나제를 포함하는 헤테로복합체, 예컨대, 융합 단백질, 헤테로다이머 등을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드는 다양한 조건하에, 예컨대, 극단적인 pH, 및/또는 온도, 산화제 등의 존재하에 자일라나제 활성을 가질 수 있다. 본 발명은 예컨대, 온도, 산화제 및 세척 조건의 변화에 대해 상이한 촉매적 효율 및 안정성을 갖는 변화된 자일라나제 제조를 초래하는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 자일라나제 변이체는 사이트-다이렉티드 돌연변이 유발 및/또는 랜덤 돌연변이 유발의 기술을 사용하여, 유도될 수 있다. 한 양태에서, 직접적인 진화는 선택적인 특이성 및 안정성을 갖는 매우 다양한 자일라나제 변이체를 생성하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 단백질은 또한 자일라나제 조절자, 예컨대, 자일라나제 활성의 활성제 또는 저해제를 확인하는 데 탐구 시약으로서 유용할 수 있다. 간단하게, 시험 샘플(화합물, 배지, 추출물 등)을 자일라나제 분석에 첨가하여, 이들의 기질 절단을 저해하는 활성을 결정한다. 이와 같은 방식으로 확인된 저해제는 산업적으로 사용될 수 있으며, 바람직하지 않은 프로테올리스를 감소 또는 예방하는 데 연구되어 진다. 자일라나제와 같이, 저해제는 활성의 범위를 증가시키도록 조합될 수 있다.
본 발명의 효소는 또한 단백질을 분해하고 단백질 서열 분석에 이용되는 탐구 시약으로 유용할 수 있다. 예컨대, 자일라나제는 예컨대, 자동화된 서열 분석기를 사용한 서열 분석시, 서열 분석을 위한 더 작은 단편으로 폴리펩티드를 잘라주는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산, 폴리펩티드 및 항체를 사용하여 새로운 자일라나제를 발견하는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 파아지미드 라이브러리는 자일라나제의 발현에 기초한 발견을 위해 스크리닝된다. 다른 양태에서, 람다 파아지 라이브러리는 자일라나제의 발현에 기초한 발견을 위해 스크리닝된다. 파아지 또는 파아지미드 라이브러리의 스크리닝은 독성 유전자의 검출, 기질에 대한 개선된 접근성; 라이브러리의 매스 절단으로 초래되는 어떠한 바이어스의 잠재성을 통과시킴으로써, 필요한 숙주 조작의 감소; 및 낮은 클론 밀도에서 빠른 성장을 가능케 할 수 있다. 파아지 또는 파아지미드 라이브러리의 스크리닝은 액체 상태 또는 고체 상태에서 일어날 수 있다. 한 양태에서, 본 발명은 액체 상태에서의 스크리닝을 제공한다. 이는 고체 상태의 스크리닝 보다, 분석 조건; 추가적인 기질 유연성; 약한 클론에 대해 더 높은 선택성; 및 자동화의 용이함에서 더욱 유동적이다.
본 발명은 본 발명의 단백질 및 핵산을 사용하여, 높은 수치의 정확성 및 재현성은 물론, 짧은 시간에 걸쳐(예, 하루당) 수천개의 생촉매적 반응 및 스크리닝 분석을 평가할 수 있는 로보트화된 자동화된 스크리닝 방법을 제공한다(이하, 어레이에 대한 서술을 참고). 결과적으로, 유도체 화합물의 라이브러리는 몇 주일만에 생산될 수 있다. 소분자를 포함한 분자들의 개질에 대해 보다 자세히는 PCT/US94/09174를 참조하라.
본 발명의 다른 양태는 군 A 핵산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열 중 하나의 서열을 포함하는 분리된거나 정제된 폴리펩티드, 또는 이들의 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 또는 150개의 연속적 아미노산을 포함하는 분리된거나 정제된 단편이다. 전술된 바와 같이, 이러한 폴리펩티드는 벡터에 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 삽입함으로써 얻어지며, 이 때, 코딩 서열이 적절한 숙주 세포에서 코딩된 폴리펩티드의 발현을 유도할 수 있는 서열에 작동적으로 연결된다. 예컨대, 발현 벡터는 프로모터, 번역 개시를 위한 리보좀 결합 부위, 및 전사 종결자를 포함할 수 있다. 벡터는 또한 발현을 증폭시키는 적절한 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 B 군 아미노산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티드, 또는 이들의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 또는 150개의 연속적 아미노산을 포함하는 단편 중 적어도 하나에 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 95% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 단편이다. 상동성은 폴리펩티드 또는 단편을 정렬하여, 이들을 서로 비교하고 아미노산 동일성 또는 유사성의 정도를 결정하는 전술된 어떠한 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 아미노산 "상동성"은 전술된 것들과 같은 보존적 아미노산 대체를 포함한다는 것은 이해될 것이다.
B 군 아미노산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티드, 또는 이들의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 또는 150개의 연속적 아미노산을 포함하는 단편 중 적어도 하나에 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 단편은 전술된 기술을 사용하여 이들을 코딩하는 핵산을 분리함으로써 얻어질 수 있다.
선택적으로, 상동적인 폴리펩티드 또는 단편은 생화학적 농축 또는 정제 과정을 통해 얻어질 수도 있다. 잠재적으로 상동적인 폴리펩티드 또는 단편의 서열은 자일란 히드롤라제 분해, 겔 전기영동 및/또는 마이크로 서열 분석에 의해 결정될 수 있다. 예기되는 상동적인 폴리펩티드 또는 단편의 서열은 B 군 아미노산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티드, 또는 이들의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 또는 150개의 연속적 아미노산을 포함하는 단편중 하나와 비교될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 B 군 아미노산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열의 효소적 기능을 보유하고 있는, B 군 아미노산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열의 단편 및 변형체를 확인하는 분석법이다. 예컨대, 상기 폴리펩티드의 단편 또는 변형체는 생화학적 반응을 촉매화하는 데 사용될 수 있으며, 이는 단편 및 변형체가 B 군 아미노산 서열의 폴리펩티드의 효소적 활성을 보유함을 의미한다.
변형체의 단편이 B 군 아미노산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티드의 효소적 활성을 보유하는지 여부를 결정하는 분석법은 하기의 단계를 포함한다: 폴리펩티드 단편 또는 변형체가 기능할 수 있는 조건에서 폴리펩티드 단편 또는 변형체를 기질 분자와 접촉시키는 단계, 및 기질의 수치의 감소 또는 폴리펩티드와 서열간의 반응에 의한 특이적 반응 산물의 수치의 증가를 검출하는 단계.
B 군 아미노산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티드, 또는 이들의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 또는 150개의 연속적 아미노산을 포함하는 단편은 다양한 적용에 사용될 수 있다. 예컨대, 폴리펩티드 및 이들의 단편은 생화학적 반응을 촉매화하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 한 양태에 따라, B 군 아미노산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티드, 또는 글리코시딕 결합을 가수분해하기 위해 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용하는 방법이 제공된다. 이러한 과정에서, 글리코시딕 결합을 함유하는 물질(예, 전분)은 글리코시딕 결합의 가수분해를 용이하게 하는 조건하에서, B 군 아미노산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티드 중 하나와접촉한다.
본 발명은 효소의 유일한 촉매적 성질을 사용한다. 화학적 변형시 생촉매의 사용(즉, 정제된 또는 원 효소, 죽어있는 또는 살아있는 세포)은 특정 개시 화합물과 반응하는 특정 생촉매의 확인을 요구하는 반면, 본 발명은 소분자와 같은 여러 개시 화합물에 존재하는 작용기에 특이적인 반응 촉매 및 선택적인 생촉매를 사용한다. 각각의 생촉매는 하나의 작용기 또는 여러 관련된 작용기에 특이적이며, 작용기를 함유하는 여러 개시 화합물들과 반응할 수 있다.
생촉매 반응는 단일 개시 화합물 유래의 유도체 집단을 생성한다. 이들 유도체들은 다른 라운드의 생촉매 반응을 겪어 유도체 화합물의 제2 집단을 생성한다. 오리지날 소분자 또는 화합물의 수천개의 변형체들은 생촉매성 유도체화의 각각의 반복에 의해 생성될 수 있다.
효소들은 나머지 분자들에 영향을 주지 않으면서 개시 화합물의 특정 부위에서 반응하며, 이 과정은 전통적인 화학적 방법을 사용하여 성취하기에는 매우 어렵다. 이러한 생촉매성 특이성의 높은 정도는 라이브러리 이내에서 단일 활성 화합물을 확인하는 수단을 제공한다. 라이브러리는 소위 "생합성 히스토리"로 불리우는 이를 생산하는 데 사용되는 일련의 생촉매성 반응에 의해 특징지워 진다. 생물학적 활성에 대해 라이브러리를 스크리닝하는 것 및 생합성 히스토리를 트레이싱하는 것은 활성 화합물을 생성하는 특이적 반응 서열을 확인하는 것이다. 반응 서열은 반복되며, 합성된 화합물의 구조는 결정된다. 이 확인 양식은 다른 합성 및 스크리닝 접근법과 달리, 고정화 기술을 요구하지 않으며, 화합물은 실질적으로 어떠한 유형의 스크리닝 분석법을 사용하여, 용액이 아닌 곳에서도 합성 및 시험될 수 있다. 작용기에 대한 효소 반응의 고도의 특이성은 생촉매적으로 생산된 라이브러리를 구성하는 특이적 효소 반응의 "트랙킹"을 가능케 함을 주의해야 한다.
여러 과정적 단계들은 높은 수치의 정확성 및 재현성은 물론, 하루당 수천개의 생촉매적 반응 및 스크리닝 분석을 평가할 수 있는 로보트화된 자동화에 의해 수행된다. 이 결과로서, 유도체 화합물의 라이브러리는 현재 화학적 방법 사용시 수년이 걸리던 것을 수 주일만에 생성할 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 서술된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 효소적으로 활성 있는 이들의 단편을 소분자와 접촉하여 개질된 소분자를 생성하는 단계를 포함하는 소분자의 개질 방법을 제공한다. 개질된 소분자의 라이브러리는 개질된 소분자가 소정의 활성을 나타내는 라이브러리 이내에 존재하는지 여부가 시험된다. 소정의 활성을 갖는 개질된 소분자를 생성하는 특이적 생촉매성 반응은 라이브러리의 일부분을 제조하는 데 사용되는 각각의 생촉매성 반응을 제거한 후, 소정의 활성을 갖는 개질된 소분자의 존재 또는 부재하에 라이브러리의 일부분을 제조하는 데 사용된 소분자를 시험함으로써 확인된다. 소정의 활성을 갖는 개질된 소분자를 생성하는 특이적 생촉매성 반응은 임의적으로 반복된다. 생촉매성 반응은 소분자의 구조 이내에서 발견되는 구별되는 구조적 부분과 반응하는 한 군의 생촉매와 수행되며, 각각의 생촉매는 하나의 구조적 부분 또는 한 군의 관련된 구조적 부분에 특이적이고, 각각의 생촉매는 별개의 구조적 부분을 함유하는 여러 상이한 소분자들과 반응한다.
자일라나제 신호 서열, 프리프로 및 촉매 도메인
본 발명은 자일라나제 신호 서열(예, 신호 펩티드(SP)), 프리프로 도메인 및 촉매 도메인(CD)을 제공한다. 본 발명의 SP, 프리프로 도메인 및/또는 CD는 분리되며, 재조합 펩티드는 예컨대, 키메릭 단백질의 이질적 도메인으로서 융합 단백질의 일부일 수 있다. 본 발명은 촉매 도메인(CD), 프리프로 도메인 및 신호 서열(SP, 예, 본 발명의 폴리펩티드의 아미노 말단 잔기를 포함하는/구성되는 서열을 갖는 펩티드)을 코딩하는 핵산을 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 잔기 1 내지 15, 1 내지 16, 1 내지 17, 1 내지 18, 1 내지 19,1 내지 20, 1 내지 21, 1 내지 22, 1 내지 23, 1 내지 24, 1 내지 25, 1 내지 26, 1 내지 27, 1 내지 28, 1 내지 28, 1 내지 30, 1 내지 31, 1 내지 32, 1 내지 33, 1 내지 34, 1 내지 35, 1 내지 36, 1 내지 37, 1 내지 38, 1 내지 39, 1 내지 40, 1 내지 41, 1 내지 42, 1 내지 43, 1 내지 44의 본 발명의 폴리펩티드로 서술되는 서열을 포함하는/구성되는 펩티드를 포함하는 신호 서열을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 이하 표 4에 나타낸 서열을 포함하는/구성되는 펩티드를 포함하는 신호 서열을 제공한다. 예컨대, 표 4에서, 본 발명은 서열 번호 102(서열 번호 101에 의해 코딩됨)의 1 내지 23 잔기를 포함하는/구성되는 신호 서열, 서열 번호 104(서열 번호 103에 의해 코딩됨)의 1 내지 41 잔기를 포함하는/구성되는 신호 서열, 등을 제공한다.
표 4: 본 발명의 대표적인 신호 서열
신호 서열 번호; 신호 서열(아미노산 위치)
101, 102 1-23
103, 104 1-41
105, 106 1-22
109, 110 1-26
11, 12 1-28
113, 114 1-28
119, 120 1-33
121, 122 1-20
123, 124 1-20
131, 132 1-26
135, 136 1-25
139, 140 1-24
141, 142 1-25
143, 144 1-32
147, 148 1-28
149, 150 1-18
15, 16 1-20
151, 152 1-21
153, 154 1-16
155, 156 1-21
157, 158 1-29
159, 160 1-23
161, 162 1-32
163, 164 1-26
165, 166 1-23
167, 168 1-36
169, 170 1-24
17, 18 1-31
171, 172 1-29
173, 174 1-22
175, 176 1-27
177, 178 1-26
179, 180 1-19
181, 182 1-25
183, 184 1-32
185, 186 1-27
187, 188 1-28
19, 20 1-29
191, 192 1-27
193, 194 1-21
195, 196 1-23
197, 198 1-28
199, 200 1-30
203, 204 1-30
205, 206 1-29
207, 208 1-27
209, 210 1-25
21, 22 1-28
211, 212 1-29
215, 216 1-31
217, 218 1-29
219, 220 1-23
221, 222 1-24
223, 224 1-28
225, 226 1-25
227, 228 1-39
229, 230 1-28
23, 24 1-29
231, 232 1-41
233, 234 1-26
235, 236 1-28
237, 238 1-32
239, 240 1-30
241, 242 1-28
243, 244 1-33
245, 246 1-32
249, 250 1-33
253, 254 1-24
255, 256 1-51
259, 260 1-24
261, 262 1-26
263, 264 1-29
267, 268 1-30
27, 28 1-27
271, 272 1-22
273, 274 1-74
277, 278 1-19
279, 280 1-22
283, 284 1-28
287, 288 1-23
289, 290 1-22
295, 296 1-26
299, 300 1-24
301, 302 1-28
303, 304 1-74
305, 306 1-32
309, 310 1-20
311, 312 1-33
313, 314 1-22
315, 316 1-28
319, 320 1-27
325, 326 1-27
327, 328 1-29
329, 330 1-35
33, 34 1-23
331, 332 1-28
333, 334 1-30
335, 336 1-50
339, 340 1-23
341, 342 1-45
347, 348 1-20
349, 350 1-20
351, 352 1-73
353, 354 1-18
355, 356 1-21
357, 358 1-25
359, 360 1-31
361, 362 1-26
365, 366 1-65
367, 368 1-23
369, 370 1-27
39, 40 1-24
41, 42 1-37
45, 46 1-25
47, 48 1-26
5, 6 1-47
51, 52 1-30
53, 54 1-37
55, 56 1-24
57, 58 1-22
59, 60 1-21
63, 64 1-20
65, 66 1-22
67, 68 1-28
69, 70 1-25
7, 8 1-57
73, 74 1-21
75, 76 1-22
77, 78 1-27
79, 80 1-36
83, 84 1-30
87, 88 1-29
89, 90 1-40
9, 10 1-36
95, 96 1-24
99, 100 1-33
본 발명의 자일라나제 신호 서열(SP) 및/또는 프리프로 서열은 예컨대, 융합(키메릭) 단백질로서, 다른 자일라나제 또는 비자일라나제 폴리펩티드에 인접한 서열 또는 분리된 펩티드일 수 있다. 한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 자일라나제 신호 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명의 자일라나제신호 서열 SP 및/또는 프리프로를 포함하는 폴리펩티드는 본 발명의 자일라나제에 이질적인 서열을 포함한다(예, 본 발명의 SP 및/또는 프리프로, 및 다른 자일라나제 또는 비자일라나제 단백질의 서열을 포함하는 융합 단백질). 한 양태에서, 본 발명은 이질적인 SP 및/또는 프리프로 서열, 예컨대, 효모 신호 서열과 함께 본 발명의 자일라나제를 제공한다. 본 발명의 자일라나제는 벡터에서, 예컨대, pPIC 시리즈 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 이질적 SP 및/또는 프리프로를 포함할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 SP 및/또는 프리프로 서열은 이하 신규한 자일라나제 폴리펩티드를 확인하기 위해 사용된다. 단백질이 분류되고 이들의 적절한 위치로 이동되는 경로를 종종 단백질 표적화 경로로 언급된다. 이들 표적화 시스템의 모두에서 가장 중요한 요소들 중 하나는 신호 서열이라고 불리우는 새로 합성된 폴리펩티드의 아미노 말단의 짧은 아미노산 서열이다. 이 신호 서열은 단백질이 세포 내에서 적절한 위치로 이동되도록 하고, 이의 최종 목적지에 도달한 경우 또는는 전송 과정 중에 제거된다. 대부분의 라이소조말, 멤브레인 또는 분비 단백질은 소포체의 루멘으로 위치시켜주는 아미노 말단 신호 서열을 가진다. 이 군의 단백질의 100개 이상의 신호 서열이 결정되었다. 신호 서열은 13 내지 36개의 아미노산 잔기의 길이로 다양할 수 있다. 신호 서열의 다양한 인식 방법은 본 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 예컨대, 한 양태에서, 신규한 자일라나제 신호 펩티드는 SignalP라고 언급되는 방법에 의해 확인된다. SignalP는 신호 펩티드 및 이들의 절단 부위 모두를 인식하는 조합된 신경 네트워크를 사용한다(Nielsen, et al.,"Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. "Protein Engineering, vol. 10, no. 1, p. 1-6 (1997)).
본 발명의 일부 양태의 자일라나제는 SP 및/또는 프리프로 서열, 또는 "도메인"을 갖지 않을 것이라는 것을 이해해야만 한다. 한 양태에서, 본 발명은 SP 및/또는 프리프로 도메인의 전부 또는 일부를 결여한 본 발명의 자일라나제를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 상이한 자일라나제의 핵산 서열에 작동적으로 결합된 하나의 자일라나제 유래의 신호 서열(SP) 및/또는 프리프로, 또는, 임의적으로, 바람직할 수 있는 비자일라나제 단백질 유래의 신호 서열(SP) 및/또는 프리프로를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 신호 서열(SP), 프리프로 도메인 및/또는 촉매 도메인(CD) 및 이질적 서열을 포함하는 분리된 또는 재조합된 폴리펩티드를 제공한다. 이질적 서열은 SP, 프리프로 도메인 및/또는 CD와 천연적으로 연관되지 않는 서열이다(예, 자일라나제에 대해). SP, 프리프로 도메인 및/또는 CD가 천연적으로 연관되지 않는 서열은 SP, 프리프로 도메인 및/또는 CD의 아미노산 말단, 카르복시 말단 및/또는 SP 및/또는 CD의 양쪽 말단에 위치할 수 있다. 한 양태에서, 본 발명은 그것이 (예컨대, 자일라나제에 대해) 천연적으로 연관되지 않은 어떠한 서열과 연관되지 않는다는 가정하에, 본 발명의 신호 서열(SP), 프리프로 도메인 및/또는 촉매 도메인(CD)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는(또는 구성되는) 분리된 또는 재조합된 폴리펩티드를 제공한다. 유사하게, 한 양태에서, 본 발명은 이들 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 또는 재조합된 핵산을 제공한다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명의 분리된 또는 재조합된 핵산은 본 발명의 신호 서열(SP), 프리프로 도메인 및/또는 촉매 도메인(CD), 및 이질적 서열(즉, 본 발명의 신호 서열(SP), 프리프로 도메인 및/또는 촉매 도메인(CD)과 천연적으로 연관되지 않은 서열)에 대한 코딩 서열을 포함한다. 이질적 서열은 3' 말단, 5' 말단, 및/또는 SP, 프리프로 도메인 및/또는 CD 코딩 서열의 양쪽 말단에 위치한다.
하이브리드(키메릭) 자일라나제 및 펩티드 라이브러리
한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 서열을 포함하는 펩티드 라이브러리를 포함한 하이브리드 자일라나제 및 융합 단백질을 제공한다. 본 발명의 펩티드 라이브러리는 자일라나제 기질, 수용체, 효소와 같은 표적의 펩티드 조절자(예, 활성제 또는 저해제)를 분리하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드 라이브러리는 리간드, 예컨대, 사이토카인, 호르몬 등과 같은 표적의 정식적 결합 파트너를 확인하는 데 사용될 수 있다. 한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 신호 서열(SP), 프리프로 도메인 및/또는 촉매 도메인(CD), 또는 이들의 조합, 및 또는 이질적인 서열(상기 참조)을 포함하는 키메릭 단백질을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명의 융합 단백질(예, 펩티드 부분)은 표적에 대한 높은 결합 친화도를 제공하도록 구조적으로 안정하다(선형 펩티드에 비하여). 본 발명은 본 발명의 자일라나제 및 공지된 및 랜덤 펩티드를 포함하는 기타 펩티드의 융합을 제공한다. 이들은 자일라나제의 기질이 현저하게 교란되지 않아, 펩티드가 대사적으로 또는 구조적으로 안정화되는 방식으로 융합될 수 있다. 이는 세포내에서 이의존재 및 이의 정량 모두를 쉽게 모니터링하는 펩티드 라이브러리의 생성을 가능케 한다.
본 발명의 아미노산 서열 변형체는 변형체의 예측되는 성질(자일라나제 서열의 대립형질 또는 종간 변형체와 같은 천연적으로 발생하는 형태로 상이하게 서술되는 특징)에 의해 특징화될 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 변형체는 천연적으로 발생하는 유사체와 동일한 정량적인 생물학적 활성을 나타낸다. 선택적으로, 변형체는 개질된 특징을 갖도록 선별될 수 있다. 한 양태에서, 아미노산 변형체가 도입된 부위 또는 위치가 미리 예측되는 반면, 요구되는 돌연변이는 예측될 수 없다. 예컨대, 주어진 위치에서의 돌연변이 수행을 최적화하기 위해, 랜던 돌연변이 유발이 표적 코돈 또는 그 부위에서 수행될 수 있으며, 발현된 자일라나제 변형체는 소정의 활성의 최적 조합에 대해 스크리닝된다. 알려진 서열을 갖는 DNA에서 예측된 부위를 돌연변이로 대체시키는 기술은 본 명세서에 서술한 바와 같이, 잘 알려져 있다(예컨대, M13 프라이머 돌연변이 유발 및 PCR 돌연변이 유발). 돌연변이체의 스크리닝은 예컨대, 자일라나제 가수분해 분석법을 사용하여 수행될 수 있다. 선택적 양태에서, 아미노산 치환은 단일 잔기에 일어날 수 있다; 상당히 더 큰 삽입이 행해질 수 있음에도 불구하고, 삽입은 1 내지 20개의 아미노산에서 일어날 수 있다. 결실은 약 1 내지 약 20, 30, 40, 50, 60, 70 잔기 또는 그 이상일 수 있다. 최적의 성질을 갖는 최종 유도체를 얻기 위해서, 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 어떠한 조합이 사용될 수 있다. 일반적으로, 이들 변화들은 분자의 변화를 최소화하기 위해 몇개의 아미노산에서만 행해진다.
본 발명은 폴리펩티드 백본의 구조, 2차 또는 3차 구조, 예컨대, 알파-헬리칼 또는 베타-쉬트 구조가 개질된 자일라나제를 제공한다. 한 양태에서, 전하 또는 소수성이 개질된다. 한 양태에서, 측면 사슬의 벌크가 개질되었다. 기능이나 면역학적 동일성의 실질적 변화가 더욱 두드러진 효과를 만들 수 있다: 변화부에서 폴리펩티드 백본의 구조, 예컨대, 알파-헬리칼 또는 베타-쉬트 구조; 활성 부위에 존재할 수 있는 분자의 전하 또는 소수성 부위; 또는 측면 사슬. 본 발명은 (a) 친수성 잔기, 예컨대, 세릴 또는 트레오닐이 소수성 잔기, 예컨대, 루실, 이소루실, 페닐알라닐, 발릴 또는 알라닐로(또는 이에 의해) 치환되거나; (b) 시스테인 또는 프롤린이 다른 어떠한 잔기들로(또는 이에 의해) 치환되거나; (c) 전기양성 측면 사슬을 갖는 잔기, 예컨대, 라이실, 아르기닐 또는 히스티딜이 전기음성 잔기, 예컨대, 글루타밀 또는 아스파틸로(또는 이에 의해) 치환되거나; 또는 (d) 벌키 측면 사슬을 갖는 잔기, 예컨대, 페닐알라닌이 측면 사슬을 갖지 않는 잔기, 예컨대, 글라이신으로(또는 이에 의해) 치환되는 본 발명의 폴리펩티드의 치환을 제공한다. 변형체가 사용된 자일라나제의 특징을 개질하도록 선택될 수 있음에도 불구하고, 변형체는 동일한 정량적 생물학적 활성(즉, 자일라나제 활성)을 나타낼 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 자일라나제는 에피토프, 또는 정제 태그, 신호 서열 또는 기타 융합 서열 등을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 자일라나제는 랜덤 펩티드와 융합되어, 융합 폴리펩티드를 형성할 수 있다. 본 명세서에서 "융합된" 또는 "작동적으로 연결된"은 자일라나제 활성을 보유하도록 자일라나제 구조의 안정성의 파괴를 최소화하는 방식으로, 랜덤 펩티드 및 자일라나제가 서로 연결되어있음을 의미한다. 융합 단백질(또는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드)은 다중 루프에서 다중 펩티드를 포함하여 추가적 성분들을 포함할 수 있다.
한 양태에서, 펩티드 및 이들을 코딩하는 핵산은 완전히 램덤화 또는 이들의 랜더화시 바이어스되어, 예컨대, 일반적으로 위치당 핵산/잔기 빈도로 램덤화될 수 있다. "랜덤화된"은 각각의 핵산 및 펩티드가 랜덤 뉴클레오티드 및 아미노산으로 각각 필수적으로 구성됨을 의미한다. 한 양태에서, 펩티드를 초래하는 핵산은 화학적으로 합성되며, 따라서 어떠한 뉴클레오티드로 어떠한 위치에 통합될 수 있다. 따라서, 핵산이 발현되어 펩티드를 형성하는 경우, 어떠한 아미노산 잔기는 어떠한 위치에 통합될 수 있다. 합성 과정은 핵산을 랜덤화하도록 디자인될 수 있으며, 이는 핵산의 전체 길이에 걸쳐 가능한 조합의 모두 또는 대부분을 형성하게 하며, 랜덤화된 핵산의 라이브러리를 형성한다. 라이브러리는 랜덤화된 발현 산물의 충분히 구조적으로 다양한 집단을 제공하여, 세포의 반응에 가능성있는 충분한 범위로 영향을 주며, 소정의 반응을 나타내는 하나 이상의 세포를 제공한다. 따라서, 본 발명은 이의 적어도 하나의 멤버가 일부 분자, 단백질 또는 기타 인자에 친화도를 부여하는 구조를 가지도록 충분히 큰 상호작용 라이브러리를 제공한다.
자일라나제는 임의적으로 신호 펩티드, 탄수화물 결합 모듈, 자일라나제 활성 도메인, 링커 및/또는 기타 촉매 도메인으로 구성되는 다중도메인 효소이다.
본 발명은 생물학적으로 활성 있는 하이브리드 폴리펩티드(예, 하이브리드 자일라나제)를 코딩할 수 있는 키메릭 폴리펩티드를 생성하는 수단을 제공한다. 한양태에서, 오리지날 폴리뉴클레오티드는 생물학적으로 활성 있는 폴리펩티드를 코딩한다. 본 발명의 방법은 오리지날 폴리펩티드의 서열에 삽입되는 세포 과정을 사용하여 새로운 하이브리드 폴리펩티드를 생산하며, 결과적인 하이브리드 폴리뉴클레오티드는 오리지날 생물학적으로 활성 있는 폴리펩티드로부터 유래된 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩한다. 예컨대, 오리지날 폴리뉴클레오티드는 상이한 미생물에서 특정 효소를 코딩할 수 있다. 한 개체 또는 변이체 유래의 제1 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 효소는 예컨대, 특정 환경 조건하에서, 예컨대, 고 염도 조건하에서 효과적으로 작용할 수 있다. 상이한 개체 또는 변이체 유래의 제2 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 효소는 상이한 환경 조건 하에서, 예컨대, 극단적으로 높은 온도에서 효과적으로 작용할 수 있다. 제1 및 제2 오리지날 폴리뉴클레오티드 유래의 서열을 함유하는 하이브리드 폴리뉴클레오티드는 오리지날 폴리펩티드에 의해 코딩되는 양 효소의 특징을 나타내는 효소를 코딩할 수 있다. 따라서, 하이브리드 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 효소는 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 효소들 각각에 의해 공여되는 환경 조건 하에서, 예컨대, 고 염도 및 극단적인 온도에서 효과적으로 작용할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 효소는 자일라나제와 같은 히드롤라제를 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 글리코시다제 히드롤라제는 1991년에 처음으로 패밀리로 분류되었다. 예컨대, [Henrissat (1991) Biochem. J. 280: 309-316]를 참조하라. 이 이후로, 분류는 연속적으로 업데이트되어 왔다. 예컨대, [Henrissat (1993) Biochem. J. 293: 781-788; Henrissat (1996) Biochem. J. 316:695-696; Henrissat (2000) Plant Physiology 124: 1515-1519]를 참조하라. 글리코시다제 히드롤라제에는 87가지의 확인된 패밀리가 존재한다. 한 양태에서, 본 발명의 자일라나제는 패밀리 8, 10, 11, 26 및 30으로 분류될 수 있다. 한 양태에서, 본 발명은 또한 통상적인 패밀리, 예컨대, 표 5에 서술된 패밀리 5, 6, 8, 10, 11, 26 또는 30에서 유래된 통상의 신규성을 갖는 자일라나제-코딩 핵산을 제공한다.
표 5
서열 확인 번호 패밀리
9, 10 8
1, 2 8
5, 6 8
7, 8 8
99, 100 10
11, 12 10
127, 128 10
27, 28 10
97, 98 10
45, 46 10
141, 142 10
107, 108 10
129, 130 10
93, 94 10
63, 64 10
25, 26 10
49, 50 10
67, 68 10
85, 86 10
29, 30 10
51, 52 10
35, 36 10
147, 148 10
119, 120 10
123, 124 10
249, 250 10
149, 150 10
83, 84 10
43, 44 10
133, 134 10
113, 114 10
105, 106 10
75, 76 10
111, 112 10
117, 118 10
115, 116 10
125, 126 10
137, 138 10
135, 136 10
69, 70 10
89, 90 10
31, 32 10
13, 14 10
65, 66 10
57, 58 10
77, 78 10
73, 74 10
109, 110 10
59, 60 10
71, 72 10
139, 140 10
55, 56 10
15, 16 10
131,132 10
95, 96 10
101, 102 10
39, 40 10
143, 144 10
103, 104 10
17, 18 10
53, 54 10
21, 22 10
151, 152 10
23, 24 10
121, 122 10
41, 42 10
47, 48 10
247, 248 10
33, 34 10
19, 20 10
87, 88 10
81, 82 10
91, 92 10
61, 62 10
37, 38 10
79, 80 10
231, 232 11
157, 158 11
189, 190 11
167, 168 11
207, 208 11
251, 252 11
213, 214 11
177, 178 11
187, 188 11
205, 206 11
211, 212 11
197, 198 11
209, 210 11
185, 186 11
229, 230 11
223, 224 11
179, 180 11
193, 194 11
173, 174 11
217, 218 11
153, 154 11
219, 220 11
183, 184 11
253, 254 11
199, 200 11
255, 256 11
155, 156 11
169, 170 11
195,196 11
215, 216 11
191, 192 11
175, 176 11
161, 162 11
221, 222 11
225, 226 11
163, 164 11
159, 160 11
233, 234 11
171, 172 11
203, 204 11
181, 182 11
227, 228 11
165, 166 11
257, 258 26
237, 238 30
241, 242 30
239, 240 30
245, 246 30
235, 236 30
313, 314 30
345, 346 10
321, 322 10
323, 324 10
315, 316 10
201, 202 10
265, 266 10
145, 146 10
287, 288 10
293, 294 10
351, 352 10
311, 312 10
279, 280 10
289, 290 10
283, 284 10
373, 374 10
337, 338 10
371, 372 10
291, 292 10
3, 4 10
307, 308 10
343, 344 10
349, 350 10
329, 330 10
355, 356 10
339, 340 10
295, 296 10
333, 334 10
281, 282 10
361, 362 10
347, 348 10
319, 320 10
357, 358 10
365, 366 10
273, 274 10
277, 278 10
271, 272 10
285, 286 10
259, 260 10
325, 326 10
331, 332 10
359, 360 10
303, 304 10
363, 364 10
305, 306 10
341, 342 10
375, 376 11
377, 378 11
379, 380 11
301, 302 11
309, 310 11
263, 264 11
269, 270 11
353, 354 11
299, 300 11
367, 368 11
261, 262 11
369, 370 11
267, 268 11
317, 318 11
297, 298 11
327, 328 5
275, 276 6
본 발명의 방법에 의해 초래된 하이브리드 폴리펩티드는 오리지날 효소에서는 나타나지 않던 특정화된 효소 활성을 보일 수 있다. 예컨대, 히드롤라제 활성을 코딩하는 폴리펩티드의 이하 재조합 및/또는 감소된 재분류는 결과적인 하이브리드 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 하이브리드 폴리펩티드가 오리지날 효소의 각각에서 얻어진 특정화된 히드롤라제 활성, 즉, 히드롤라제가 작용하는 결합의 유형및 히드롤라제가 작용하는 온도에 대해 스크리닝될 수 있다. 따라서, 예컨대, 히드롤라제는 오리지날 히드롤라제에서 하이브리드 히드롤라제를 구별하는 화학적 작용성, 예컨대, (a) 아미드(펩티드 결합), 즉, 자일라나제; (b) 에스터 결합, 즉, 에스터라제 및 리파아제; (c) 아세탈, 즉, 글리코시다제, 및 예컨대, 하이브리드 폴리펩티드가 작용하는 온도, pH 또는 염 농도을 확인하기 위해 스크리닝될 수 있다.
오리지날 폴리뉴클레오티드원은 개별적인 개체("분리체", 정의된 배지에서 성장하는 개체들의 집합체("강화 배양") 또는 배양되지 않은 개체("환경적 샘플")에서 분리될 수 있다. 환경 샘플에서 신규한 생활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유도하는 배양-비의존적 접근법의 사용은 생체다양성을 갖는 자원들의 확인이 가능하므로 가장 바람직하다.
"환경적 라이브러리"는 환경적 샘플에서 발생되며, 적절한 원핵세포 숙주에서 증식될 수 있는 클로닝 벡터에서 얻어지는 천연적으로 발생하는 개체의 집합적 게놈을 대표한다. 클로닝된 DNA가 환경 샘플로부터 직접 초기에 추출되므로, 라이브러리는 순수 배양시 성장할 수 있는 원핵 세포의 적은 분획으로 제한되지 않는다. 부가적으로, 이들 샘플들에 존재하는 환경적 DNA의 정규화는 오리지날 샘플에 존재하는 모든 종들의 DNA의 더욱 동일한 대표를 가능케 한다. 이는 우성 종에 비해 여러 등급만큼 큰 대표될 수 있는 샘플의 소수 구성 유래의 흥미있는 유전자를 발견하는 효율을 극적으로 증가시킬 수 있다.
예컨대, 하나 이상의 배양되지 않은 미생물에서 발생된 유전자 라이브러리는 흥미있는 활성에 대해 스크리닝된다. 흥미있는 생활성 분자를 코딩하는 잠재적인경로는 유전자 발현 라이브러리의 형태로 원핵 세포내에서 먼저 캡쳐된다. 흥미있는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이러한 라이브러리에서 분리되어, 숙주 세포로 도입된다. 숙주 세포는 재조합 및/또는 감소된 재분류를 촉진하여 신규하거나 강화된 활성을 갖는 잠재적으로 활성 있는 생체분자를 생성하는 조건 하에서 배양된다.
부가적으로, 서브클로닝은 흥미있는 서열의 추가적 분리를 위해 수행될 수 있다. 서브클로닝시, 일부분의 DNA는 증폭, 일반적으로 제한 효소에 의해 분해되어 소정의 서열을 절단하며, 소정의 서열은 수용 벡터에 결찰되어 증폭된다. 서브클로닝시 각각의 단계에서, 일부분은 구조적 단백질을 코딩하는 DNA가 배제되지 않았는지를 확인하기 위해, 흥미있는 활성에 대해 조사된다. 결찰부는 서브클로닝의 각 단계마다, 예컨대, 겔 전기영동에 의해 벡터로 결찰되기 이전에 정제될 수 있으며, 수용 벡터를 함유하는 세포 및 수용 벡터를 함유하지 않은 세포는 예컨대, 수용 벡터를 함유하지 않는 세포를 죽이는 항생제를 함유하는 선택적 배지에 둔다. cDNA 결찰부를 벡터에 서브클로닝하는 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). 다른 양태에서, 본 발명의 효소는 서브클론이다. 이러한 서브클론은 예컨대, 길이, 돌연변이, 태그 또는 표지에 있어 모 클론과 상이할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 신호 서열은 이하 신규한 자일라나제 폴리펩티드를 확인하기 위해 사용된다. 단백질이 분류되고 이들의 적절한 위치로 이동되는 경로를 종종 단백질 표적화 경로로 언급된다. 이들 표적화 시스템의 모두에서 가장 중요한 요소들 중 하나는 신호 서열이라고 불리우는 새로 합성된 폴리펩티드의 아미노 말단의 짧은 아미노산 서열이다. 이 신호 서열은 단백질이 세포 내에서 적절한 위치로 이동되도록 하고, 이의 최종 목적지에 도달한 경우 또는는 전송 과정 중에 제거된다. 대부분의 라이소조말, 멤브레인 또는 분비 단백질은 소포체의 루멘으로 위치시켜주는 아미노 말단 신호 서열을 가진다. 이 군의 단백질의 100개 이상의 신호 서열이 결정되었다. 신호 서열은 13 내지 36개의 아미노산 잔기의 길이로 다양할 수 있다. 신호 서열의 다양한 인식 방법은 본 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 한 양태에서, 신규한 자일라나제 신호 펩티드는 SignalP라고 언급되는 방법에 의해 확인된다. SignalP는 신호 펩티드 및 이들의 절단 부위 모두를 인식하는 조합된 신경 네트워크를 사용한다. 예컨대, [Nielsen, et al.,"Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. "Protein Engineering, vol. 10, no. 1, p. 1-6 (1997)]를 참조하라. 본 발명의 자일라나제의 일부는 신호 서열을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다는 것을 이해해야만 한다. 상이한 자일라나제의 핵산 서열에 작동적으로 연결된 하나의 자일라나제 유래의 신호 서열을 코딩하는 핵산 서열, 또는 임의적으로 바람직할 수 있는 비자일라나제 단백질 유래의 신호 서열을 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
폴리뉴클레오티드가 준비될 수 있는 미생물에는 원핵세포 미생물, 예컨대, 유박테리아(Eubacteria) 및 아케박테리아(Archaebacteria), 및 하등 진핵세포 미생물, 예컨대, 진균, 일부 조류 및 원생동물이 포함된다. 폴리뉴클레오티드는 핵산이하나 이상의 배양된 개체로부터 회수되거나 개체의 배양없이 회수될 수 있는 경우에는 환경 샘플에서 분리될 수 있다. 한 양태에서, 이러한 미생물은 익스트리모파일, 예컨대, 하이퍼써모파일, 사이크로파일, 사이크로트로프, 할로파일, 바로파일 및 아시도파일일 수 있다. 익스티리모파일 미생물에서 분리된 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 이러한 효소는 지질 온천 및 심해 열공에서의 100℃ 이상의 온도 및 북극 물에서의 0℃ 이하, 사해의 포화된 염 환경, 석탄 매장 및 기하열 황 풍부 온천에서의 0에 까까운 pH 값, 또는 오수 슬러지의 11 이상의 pH 값에서도 작용할 수 있다. 예컨대, 익스트리모파일 개체에서 클로닝되고 발현된 여러 에스터라제 및 리파아제는 광범위한 온도 및 pH에 걸쳐 높은 활성을 나타낸다.
전술된 바와 같이 선별 및 분리된 폴리뉴클레오티드는 적절한 숙주 세포에 도입된다. 적절한 숙주 세포는 재조합 및/또는 감소된 재분류를 촉진할 수 있는 어떠한 세포이다. 선택된 폴리뉴클레오티드는 적절한 조절 서열을 포함하는 벡터에 이미 존재하는 것이 바람직하다. 숙주 세포는 고등 진핵 세포, 예컨대, 포유동물 세포, 또는 하등 진핵 세포, 예컨대, 효모 세포일 수 있으며, 또는 바람직하게는 원핵 세포, 예컨대, 박테리아 세포인 것이 바람직하다. 작제물의 숙주 세포로의 도입은 인산 칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 또는 전기충격이 효과적일 수 있다(Davis et al., 1986).
적절한 숙주의 대표적인 예로서, 이하가 언급될 수 있다: 박테리아 세포, 예컨대, 대장균(E.coli), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 살모넬라 티피무리엄(Salmonella typhimurium); 진균 세포, 예컨대, 효모; 곤충 세포, 예컨대, 드로소필라(Drosophila)S2및 스포돕테라(Spodoptera)Sf9; 동물 세포, 예컨대, CHO, COS 또는 보웨스 멜라노마(Bowes melanoma); 아데노바이러스; 및 식물 세포. 적절한 숙주의 선별은 본 명세서에 나타낸 사항으로부터 본 기술 분야의 당업자의 범위 이내에서 예정된다.
재조합 단백질을 발현하는 데 사용될 수 있는 다양한 포유동물 세포 배양 시스템에 관해서는, 포유동물 발현 시스템의 예에는 "SV40-transformed simian cells support the replication of earlySV40 mutants"(Gluzman,1981)에 서술된 원숭이 신장 선유아세포에서 유래된 COS-7 세포주, 및 양립가능한 벡터를 발현할 수 있는 기타 세포주, 예컨대, C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주가 포함된다. 포유동물 발현 벡터는 복제 오리진, 적절한 프로모터 및 인헨서, 또한 필요한 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 도너 및 어셉터 부위, 전사 종결 서열 및 5' 플랭킹 비전사 서열을 포함할 것이다. SV40 스플라이싱 및 폴리아데닐화 부위로부터 유래된 DNA 서열은 요구되는 비전사된 유전 요소를 제공하는 데 사용될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 오페론 또는 유전자 다발 또는 이들의 일부분 유래의 생화학적 경로를 코딩하는 신규한 폴리뉴클레오티드를 생성하는 데 사용될 수 있음이 증명된다. 예컨대, 박테리아 및 여러 원핵 세포는 유전자의 산물이 관련된 과정에 포함되는 유전자를 조절하는 통합된 메카니즘을 가지고 있다. 유전자는 단일 염색체 상에 "유전자 다발"이라고 불리우는 구조로 다발져있으며, 전체 다발의 전사를 개시하는 단일 프로모터를 포함하는 단일 조절 서열의 조절 하에 함께 전사된다. 따라서, 유전자 다발은 일반적으로 이들의 기능이 동일하거나 관련된, 인접한 유전자의 군으로 존재한다. 유전자 다발에 의해 코딩되는 생화학적 경로의 예는 폴리케티드이다.
유전자 다발 DNA는 상이한 개체에서 분리되어, 벡터에 결찰될 수 있으며, 특히, 결찰된 유전자 다발 유래의 검출가능한 단백질 또는 단백질-관련된 정렬 활성의 생산을 조절 및 통제할 수 있는 발현 조절 서열을 함유하는 벡터에 결찰되는 것이 바람직하다. 예외적으로 매우 큰 외인성 DNA 도입이 가능한 벡터의 사용은 특히 이러한 유전자 다발에 사용하기 적절하며, 본 명세서에 서술된 예시 수단에 의해 서술되며, 대장균의 f-인자(또는 수정 인자)를 포함한다. 대장균의 f-인자는 콘주게이션 동안 이 인자 자체의 고빈도의 전이에 영향을 주는 플라스미드이며, 혼합된 미생물 샘플에서 유전자 다발과 같은 큰 DNA 단편을 안정하게 증식시키며 이를 얻는 데 이상적이다. 본 발명의 한 양태는 "포스미드"로 언급되는 클로닝 벡터 및 박테리아 인공 염색체(BAC) 벡터를 사용한다. 이들은 게놈 DNA의 큰 단편이 안정적으로 삽입가능한 대장균 f-인자에서 유래된 것이다. 혼합된 배양되지 않은 환경 샘플 유래의 DNA가 삽입시, 이는 안정한 "환경적 DNA 라이브러리"의 형태로 큰 게놈 단편을 얻는 것을 가능하게 한다. 본 발명에 사용되는 다른 유형의 벡터는 코스미드 벡터이다. 코스미드 벡터는 게놈 DNA의 큰 단편을 증식 및 클로닝하도록 최초에 디자인되었다. 코스미드 벡터로의 클로닝은 [Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에서술되어 있다. 적절한 벡터에 결찰된 후, 상이한 폴리케티드 신테타제 유전자 다발을 함유하고 있는 2개 이상의 벡터들은 적절한 숙주 세포에 도입될 수 있다. 유전자 다발에 의해 공여되는 부분적 서열 상동상 부위는 하이브리드 유전자 다발에서 초래되는 서열 재구성을 초래하는 과정을 촉진할 것이다. 그 후, 신규한 하이브리드 유전자 다발은 오리지날 유전자 다발에서 발견되지 않는 증강된 활성에 대해 스크리닝된다.
따라서, 한 양태에서, 본 발명은 하기 단계들에 의해, 생물학적으로 활성 있는 하이브리드 폴리펩티드를 제조하는 방법 및 강화된 활성을 갖는 폴리펩티드를 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다:
1) 작동적으로 연결된 적어도 제1 폴리뉴클레오티드 및 작동적으로 연결된 제2 폴리뉴클레오티드를 적절한 숙주 세포에 도입하는 단계로서, 적어도 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 적어도 한 부분의 부분적 서열 상동성을 공여하는 것인 단계;
2) 상기 숙주 세포를 서열 재구성을 촉진하는 조건 하에서 배양하여, 작동적으로 연결된 하이브리드 폴리뉴클레오티드를 초래하는 단계;
3) 상기 하이브리드 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 하이브리드 폴리펩티드를 발현하는 단계;
4) 강화된 생물학적 활성의 확인을 촉진하는 조건 하에서 상기 하이브리드 폴리펩티드를 스크리닝하는 단계; 및
5) 상기 하이브리드 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계.
다양한 효소 활성을 스크리닝하는 방법은 본 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 본 명세서를 통해 서술되어 있다. 이러한 방법은 본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 분리시 사용될 수 있다.
스크리닝 방법론 및 "온라인" 모니터링 장치
본 발명의 방법 수행시, 다양한 장치 및 방법론이 예컨대, 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 스크리닝하기 위해(예, 자이모그람에서 카제인 가수분해, 젤라틴에서 형광물질의 방출, 또는 다양한 작은 펩티드 기질에서 p-니트로아날리드의 방출과 같은 분석법), 자일라나제 활성의 잠재적 조절자(예, 활성제 또는 저해제)인 화합물을 스크리닝하기 위해, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해, 본 발명의 핵산에 하이브리드화되는 핵산을 스크리닝하기 위해, 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 세포를 스크리닝하기 위해, 본 발명의 폴리펩티드 및 핵산과 함께 사용될 수 있다. 이하 샘플링에 대해 상세히 서술된 어레이 포멧에 덧붙여, 선택적인 포멧 또한 본 발명의 방법을 실행하는 데 사용될 수 있다. 이러한 포멧에는 예컨대, 매스 스펙트로미터, 크로마토그패프, 예컨대, 고-트루풋 HPLC 및 기타 액체 크로마토그래피의 형태가 포함되며, 더 작은 포멧에는 예컨대, 1536-웰 플레이트, 384-웰 플레이드 등이 포함된다. 하이 트루풋 스크리닝 장치는 본 발명의 방법의 실행에 사용되며 적용될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 출원 제20020001809호를 참조하라.
모세관 어레이
본 발명의 핵산 및 폴리펩티드는 어레이에 고정화 되거나 어레이에 적용될 수 있다. 어레이는 본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드의 활성을 조절하기 위해 또는 이에 결합하여 이들의 활성을 갖는 조성물(예, 소분자, 항체, 핵산 등)의 라이브러리를 모니터링하거나 스크리닝하는 데 사용된다. 모세관 어레이, 예컨대, GIGAMATRIXTM( Diversa Corporation, San Diego, CA) 및 예컨대, 미국 특허 출원 제20020080350호 Al; WO 0231203 A; WO 0244336 A에 서술된 어레이는 샘플을 유지 및 스크리닝하는 선택적 장치를 제공한다. 한 양태에서, 모세관 어레이는 인접한 모세관의 어레이에 형성된 다수의 모세관을 포함하며, 이 때, 각각의 모세관은 샘플을 보유하는 루멘으로 정의되는 적어도 하나의 벽을 포함한다. 벽이 액체 또는 샘플의 보유를 위해 루멘을 형성하는 한, 루멘은 원통, 구형, 헥사고날형 또는 어떠한 기타 기하학적 형태일 수 있다. 모세관 어레이의 모세관은 매우 근접하게 함께 위치하여 평면 구조를 형성할 수 있다. 모세관은 면끼리 융합(예, 모세관이 유리로 제조됨), 글루, 결합 또는 클램프함으로써, 함께 결합될 수 있다. 부가적으로, 모세관 어레이는 어레이내 인접한 모세관 등 사이에 놓여진 간극 물질을 포함할 수 있으며, 이에 따라 다수의 트루-홀을 함유하는 고체 평면 장치를 형성한다.
모세관 어레이는 예컨대, 100 내지 4,000,000개의 모세관들의 범위인 어떠한 수의 개별적인 모세관들로 형성될 수 있다. 추가적으로, 약 100,000 또는 그 이상의 개별적인 모세관을 가진 모세관 어레이는 표준 실험실 장비에 피트되는 Microtiter?플레이트의 표준 크기 및 형태로 형성될 수 있다. 루멘은 얇은 바늘을사용한 미세주입 또는 모세관 작용을 사용하여 자동적으로 또는 수동적으로 충전된다. 흥미있는 샘플은 그 후 추가 분석 또는 특징화를 위해 개별적인 모세관에서 제거될 수 있다. 예컨대, 얇은, 바늘 유사 프로브는 선택된 모세관과 함께 유체 연통적으로 위치하여, 루멘으로부터 물질을 첨가하거나 철회시킨다.
단일-포트 스크리닝 분석법에서, 이 분석 성분은 모세관 어레이에 삽입되기 이전에 혼합되어 흥미있는 용액을 초래한다. 루멘은 적어도 일부분의 어레이가 흥미있는 용액에 함침되는 경우 모세관 작용으로 충전된다. 각각의 모세관에서의 화학적 또는 생물학적 반응 및/또는 활성은 검출가능한 경우 모니터링된다. 검출가능하다는 것은 종종 "힛트"로 언급되며, 이는 광학 검출에 의해 모세관을 생성하는 "비-힛트"와 일반적으로 구분될 수 있다. 따라서, 모세관 어레이는 "힛트"의 묵중하게 평행인 검출을 가능케 한다.
다중-포트 스크리닝 분석법에서, 폴리펩티드 또는 핵산, 예컨대, 리간드는 제1 성분에 도입될 수 있으며, 이는 모세관 어레이의 적어도 일부분의 모세관에 도입된다. 공기 버블은 그 후 제1 성분 뒤의 모세관으로 도입될 수 있다. 제2 성분은 그 후 모세관으로 도입될 수 있으며, 여기서 제2 성분이 제1 성분과 공기 버블에 의해 분리된다. 제1 및 제2 성분은 그 후 모세관 어레이의 버블과 충돌하도록 양 측면에 히드로스태틱 압력을 가함으로써 혼합될 수 있다. 모세관 어레이는 그 후 검출 가능한 것에 대해 모니터링되고, 두 성분들의 반응 또는 비반응의 결과를 낳는다.
결합 스크리닝 분석법에서, 흥미있는 샘플은 검출가능한 입자로 표지된 제1액체로서 모세관 어레이의 모세관에 도입될 수 있으며, 이 때, 모세관의 루멘은 검출 가능한 입자를 루멘에 결합시키는 결합 물질로 코팅된다. 그 후, 제1 액체는 모세관 튜브에서 제거될 수 있으며, 이 때, 결합된 검출 가능한 입자는 모세관 이내에 유지되고, 제2 액체는 모세관 튜브에 도입될 수 있다. 그 후, 모세관은 검출 가능한 것에 대해 모니터링되고, 입자의 제2 액체와의 반응 또는 비반응의 결과를 낳는다.
어레이 또는 "바이오칩"
본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드는 어레이에 고정화되거나 또는 어레이에 적용된다. 어레이는 본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드의 활성을 조절하기 위해 또는 이에 결합하여 이들의 활성을 갖는 조성물(예, 소분자, 항체, 핵산 등)의 라이브러리를 모니터링하거나 스크리닝하는 데 사용된다. 예컨대, 본 발명의 한 양태에서, 모니터링된 변수는 자일라나제 유전자의 전사 활성이다. 하나 이상의 또는 모든 세포의 전사체는 세포의 전사체, 또는 세포의 전사체를 대표하거나 이에 상보적인 핵산을 포함하는 샘플을 하이브리드화함으로써 측정될 수 있거나, 또는 어레이 또는 "바이오칩" 상에 고정화된 핵산을 하이브르드화 함으로써 측정될 수 있다. 마이크로칩 상의 핵산의 "어레이"를 사용함으로써, 일부 또는 모두의 세포의 전사체들은 동시에 분석된다. 선택적으로, 게놈 핵산을 포함하는 어레이는 또한 본 발명의 방법에 의해 제조된 새로 가공된 균주의 유전자형을 결정하는 데 사용될 수 있다. "폴리펩티드 어레이"는 또한 다수의 단백질을 동시에 분석하는 데 사용될 수 있다. 본 발명은 어떠한 공지된 "어레이"(또한 "마이크로어레이" 또는 "핵산 어레이" 또는 "폴리펩티드 어레이" 또는 "항체 어레이" 또는 "바이오칩"으로 알려짐) 또는 이들의 변형체로 수행될 수 있다. 어레이는 다수의 "스팟" 또는 "표적 성분"을 가지며, 각각의 표적 성분은 샘플 분자, 예컨대, mRNA 전사체에 특이적으로 결합하는 기질 표면의 정의된 면적 상에 고정된, 정의된 양의 하나 이상의 생물학적 분자, 예컨대, 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 방법 시행시, 어떠한 공지된 어레이 및/또는 어레이를 사용 및 제조하는 방법 또는 이들의 변형체들이 전체적으로 또는 부분적으로 통합될 수 있으며, 이는 예컨대, 미국 특허 제6,277,628호; 제6,277,489호; 제6,261,776호; 제6,258,606호; 제6,054,270호; 제6,048,695호; 제6,045,996호; 제6,022,963호; 제6,013,440호; 제5,965,452호; 제5,959,098호; 제5,856,174호; 제5,830,645호; 제5,770,456호; 제5,632,957호; 제5,556,752호; 제5,143,854호; 제5,807,522호; 제5,800,992호; 제5,744,305호; 제5,700,637호; 제5,556,752호; 제5,434,049호에 서술되어 있다. 또한, 예컨대, WO 99/51773; WO 99/09217; WO 97/46313; WO 96/17958을 참조하라. 또한 예컨대, [Johnston (1998) Curr. Biol.8 :R171-R174; Schummer (1997) Biotechniques 23: 1087-1092; Kern (1997) Biotechniques 23: 120-124; Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes & Cancer 20: 399-407; Bowtell (1999) Nature Genetics Supp. 21: 25-32]를 참조하라. 또한, 공개된 미국 특허 출원 제20010018642호; 제20010019827호; 제20010016322호; 제20010014449호; 제20010014448호; 제20010012537호; 제20010008765호를 참조하라.
항체 및 항체에 기초한 스크리닝 방법
본 발명은 본 발명의 자일라나제에 특이적으로 결합하는 분리되거나 또는 재조합된 항체를 제공한다. 이들 항체들은 본 발명의 자일라나제 또는 관련된 폴리펩티드의 분리, 확인 또는 정량화에 사용된다. 이들 항체들은 본 발명의 범위 이내인 기타 폴리펩티드 또는 기타 관련된 자일라나제를 분리하는 데 사용될 수 있다. 항체는 자일라나제의 활성 부위에 결합하도록 디자인 될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항체들을 사용하여, 자일라나제를 저해하는 방법을 제공한다(본 발명의 항-자일라나제 조성에 대한 상기 서술을 참조).
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 면역적 단편을 포함하여 본 발명의 효소의 단편을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 또는 펩티드 및 어주번트 또는 담체 등을 포함하는 조성물을 제공한다.
항체는 면역침전, 염색, 면역친화성 컬럼 등에 사용될 수 있다. 소정의 경우, 특정 항원을 코딩하는 핵산 서열은 폴리펩티드 또는 핵산을 분리하고, 증폭 또는 클로닝한 후, 폴리펩티드를 본 발명의 어레이 상에 고정함으로써 면역화되어 발생될 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 방법은 개질될 세포에 의해 생산되는 항체의 구조를 변형시키는 데 사용될 수 있으며, 예컨대, 항체의 친화도는 증가 또는 감소될 수 있다. 더욱이, 항체를 개질 또는 제조하는 능력은 본 발명의 방법에 의해 세포로 가공된 표현형일 수 있다.
면역화, 항체의 생산 및 분리 방법(폴리클로날 및 모노클로날)은 본 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 과학 및 특허 문헌에 서술되어 있다. 예컨대, [Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY(1991); Stites(eds. ) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7th ed. ) Lange Medical Publications, Los Altos, CA ("Stites"); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES : PRINCIPLES AND PRACTICE (2d ed. ) Academic Press, New York, NY (1986); Kohler (1975) Nature 256: 495; Harlow(1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, New York]를 참조하라. 항체는 또한 동물을 사용한 전통적인 생체내 방법에 덧붙여, 예컨대, 파아지 디스플레이 라이브러리가 발현하는 재조합 항체 결합 부위를 사용하여, 시험관내에서 발생될 수 있다. 예컨대, [Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15: 62-70; Katz (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 27-45]를 참조하라.
B 군 아미노산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티드, 또는 이들의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 또는 150개의 연속적 아미노산을 포함하는 단편은 또한 폴리펩티드 또는 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 결과적인 항체는 면역친화성 크로마토그래피 과정에서 사용되어, 폴리펩티드를 분리 또는 정제하거나, 또는 생물학적 샘플내에 폴리펩티드가 존재하는지의 여부를 결정할 수 있다. 이러한 과정에서, 단백질 제제, 예컨대, 추출물 또는 생물학적 샘플은 B 군 아미노산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티드, 또는 이들의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 또는 150개의 연속적 아미노산을 포함하는 단편 중 하나에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉한다.
면역친화성 과정에서, 항체는 고체 지지체, 예컨대, 비드 또는 기타 컬럼 매트릭스에 부착한다. 단백질 제제는 항체가 B 군 아미노산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티드, 또는 이들의 단편 중 하나에 특이적으로 결합하는 조건하에서 항체와 접촉된다. 세척하여 비 특이적으로 결합된 단백질을 제거한 후, 특이적으로 결합된 폴리펩티드를 용출한다.
항체에 결합하는 생물학적 샘플내 단백질의 능력은 본 기술 분야의 당업자에게 공지된 다양한 과정들 중 어떤 것을 사용하여 결정될 수 있다. 예컨대, 결합은 형광제, 효소적 표지 또는 방사성동위원소와 같은 검출 가능한 표지로 항체를 표지함으로써 결정될 수 있다. 선택적으로, 항체의 샘플로의 결합은 검출가능한 표지를 갖는 제2 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 특정 분석법에는 ELISA 분석법, 샌드위치 분석법, 방사면역분석법 및 웨스턴 블롯이 포함된다.
B 군 아미노산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티드, 또는 이들의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 또는 150개의 연속적 아미노산을 포함하는 단편에 대해 발생된 폴리클로날 항체는 동물, 예컨대, 비인간에게 폴리펩티드를 투여함으로써, 또는 동물에게 폴리펩티드를 직접 주입함으로써 얻어질 수 있다. 이렇게 얻어진 항체는 그 후, 폴리펩티드 그 자체에 결합할 것이다. 이 방식으로, 폴리펩티드의 단편만을 코딩하는 서열 조차도 전체 천연 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 이러한 항체들은 그 후 폴리펩티드를 발현하는 세포로부터 폴리펩티드를 분리하는 데 사용될 수 있다.
모노클로날 항체의 제조를 위해, 연속적 세포주 배양에 의해 생산되는 항체를 제공하는 어떠한 기술들이 사용될 수 있다. 예로는 하이브리도마 기술(Kohlerand Milstein, Nature, 256: 495-497,1975), 트리오마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kozbor et al., Immunology Today 4: 72, 1983) 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole, et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)을 들 수 있다.
단일 사슬 항체의 제조에 대해 서술한 기술(미국 특허 제4,946,778호)은 B 군 아미노산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티드, 또는 이들의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 또는 150개의 연속적 아미노산을 포함하는 단편에 대한 단일 사슬 항체를 제조하는 데 적용될 수 있다.
B 군 아미노산 서열 및 이와 실질적으로 동일한 서열의 폴리펩티드, 또는 이들의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 또는 150개의 연속적 아미노산을 포함하는 단편에 대해 발생된 항체들은 기타 개체 및 샘플 유래의 유사한 폴리펩티드를 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 이러한 기술에서, 개체의 폴리펩티드는 항체와 접촉되며, 항체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드가 검출된다. 전술된 과정들 중 어떠한 것도 항체 결합을 검출하는 데 사용될 수 있다. 이러한 스크리닝 분석법 중 하나는 문헌[참조: "Methods for Measuring Cellulase Activities", Methods in Enzymology, Vol 160, pp. 87-116]에 서술되어 있다.
키트
본 발명은 이하의 성분, 예컨대, 핵산, 발현 카세트, 벡터, 세포, 유전자전이 종자 또는 식물 또는 식물의 부분, 폴리펩티드 (예컨대, 자일라나제) 및/또는 본 발명의 항체를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 또한 사용 방법 및 본원에 기재된 본 발명의 산업상 용도를 안내하는 설명서를 포함할 수 있다.
전체 세포 조작 및 대사 파라미터의 측정
본 발명의 방법은, 세포의 유전자 조성을 변형시킴으로써, 신규한 표현형, 예컨대, 신규하거나 또는 변형된 자일라나제 활성을 갖는 신규한 세포 스트레인으로의 세포의 전체 세포 진화, 또는 전체 세포 조작을 제공한다. 유전자 조성은 본 발명의 핵산, 예컨대, 본 발명의 효소에 대한 암호화 서열을 세포에 첨가함으로써 변형될 수 있다. 예컨대, W00229032; W00196551 참조.
신규한 표현형을 검출하기 위해, 변형된 세포의 1 이상의 파라미터가 세포에서 "실시간"으로 또는 "온라인" 시간 프레임으로 모니터링된다. 하나의 양태에서, 세포 배양물과 같은 복수의 세포가 "실시간"으로 또는 "온라인"으로 모니터링된다. 하나의 양태에서, 복수의 대사 파라미터가 "실시간"으로 또는 "온라인"으로 모니터링된다. 대사 파라미터는 본 발명의 자일라나제를 사용하여 모니터링될 수 있다.
대사 플럭스 분석 (MFA)은 공지의 생화학 프레임워크를 기초로 한다. 세포내 대사체에 대한 질량 보존의 법칙 및 유사-정상 상태 가설 (PSSH)를 기초로 선형 독립 대사 매트릭스가 구축되었다. 본 발명의 방법을 수행하는데 있어, 다음과 같은 대사 네트워트가 확립되었다:
모든 경로 기질, 생성물 및 중간 대사체의 확인
경로 대사체를 상호변환시키는 모든 화학 반응, 경로 반응의 화학양론의 확인,
반응을 촉매하는 모든 효소, 효소 반응 동력학의 확인,
경로 성분 사이의 조절성 상호작용, 예컨대 알로스테릭 상호작용, 효소-효소 상호작용 등,
효소 또는 다른 효소의 거대분자성 조직의 세포내 구획, 그리고,
대사체, 효소 또는 이펙터(effector) 분자 또는 그들의 운동에 대한 확산 장벽(diffusion barriers) 중에 임의의 농도 구배의 존재.
주어진 스트레인에 대해 일단 대사 네트워크가 구축되고, 만약 온라인 메타볼롬(metabolome) 데이타가 유용하다면, 매트릭스 개념으로 수학적 소개가 세포간 대사 플럭스를 추정하는데 도입될 수 있다. 대사 표현형은 세포 안에서 전체 대사 네트워크의 변화에 의존적이다. 대사 표현형은 환경적 조건, 유전자적 조절, 발달 상태 및 유전자형, 등에 관해서 경로 활용의 변화에 의존적이다. 본 발명의 방법의 하나의 양태에서, 온라인 MFA 계산 이후, 세포의 다이나믹 행동, 그들의 표현형 및 다른 성질이 경로 활용을 조사함으로써 분석된다. 예컨대, 만약 효모 발효 동안 글루코스 공급이 증가하고 그리고 산소가 감소한다면, 호흡 경로의 활용이 감소 및/또는 정지하게 될 것이며, 발효 경로의 활용이 우세하게 될 것이다. 세포 배양물의 생리적 조절은 경로 분석 이후 가능하게 될 것이다. 본 발명의 방법은, 바람직한 방향을 따라 이동하는 세포의 생리적 상태를 조절하기 위해, 기질 공급, 온도, 인듀서의 사용 등이 어떻게 변화하는지 측정함으로써 발효를 어떻게 조작하는지 측정하는 것을 도울 수 있다. 본 발명의 방법을 수행함에 있어, MFA 결과는, 대사성 조작 또는 유전자 셔플링(shuffling) 등에 대한 실험 및 프로토콜을 디자인하기 위해 트랜스크립톰(transcriptome) 및 프로테옴(proteome) 데이타와 또한 비교될 수 있다.
본 발명의 방법을 수행하는데 있어, 임의의 변형되거나 또는 신규한 표현형이 언급되고 검출될 수 있으며, 이는 세포의 신규하거나 또는 향상된 특성을 포함한다. 대사 또는 성장의 어떤 양태라도 모니터링될 수 있다.
mRNA 전사체의 발현 모니터링
본 발명의 하나의 양태에서, 조작된 표현형은 mRNA 전사체 (예컨대, 자일라나제 메세지)의 발현을 증가시키거나 또는 감소시키는 것 또는 세포에서 신규한 (예컨대, 자일라나제) 전사체를 발생시키는 것을 포함한다. 이 증가되거나 또는 감소된 발현은 본 발명의 자일라나제의 존재에 대해 테스트함으로써 또는 자일라나제 활성 분석으로 추적될 수 있다. mRNA 전사체, 또는 메세지는, 또한 예컨대, 노던 블랏(Northern blots), 정량적 증폭 반응, 배열에 대한 혼성, 등을 포함하는 본 기술 분야에서 공지된 임의의 방법으로 검출되고 정량화될 수 있다. 정량적 증폭 반응은, 예컨대, 정량적 역전사 폴리머라제 체인 반응, 또는 RT-PCR을 포함하는 정량적 PCR; 정량적 실시간 RT-PCR, 또는 "실시간 동력학적 RT-PCR"을 포함한다 (예컨대, Kreuzer (2001) Br. J. Haematol. 114: 313-318; Xia (2001) Transplantation 72: 907-914 참조).
본 발명의 하나의 양태에서, 조작된 표현형이 상동 유전자의 넉 아웃(knocking out) 발현에 의해 발생된다. 유전자의 암호화 서열 또는 1 또는 그 이상의 전사 제어 성분, 예컨대, 프로모터 또는 인핸서가 넉 아웃될 수 있다. 따라서, 전사체의 발현은 완전히 제거되거나 또는 단지 감소될 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 조작된 표현형은 상동 유전자의 발현의 증가를 포함한다. 이는, 시스- 또는 트랜스-로 작용하는 전사 조절 성분을 포함하거나, 또는, 파지티브 제어 성분을 돌연변이화시키는 네가티브 제어 성분을 넉 아웃시킴으로써 영향을 받을 수 있다. 1 또는 그 이상, 또는 세포의 모든 전사체가 세포의 전사체를 포함하는 시료, 또는, 대표적인 또는 세포의 전사체에 상보적인 핵산의 혼성에 의해, 배열 상에 부동화된 핵산에 대한 혼성으로 측정될 수 있다.
폴리펩티드, 펩티드 및 아미노산의 발현 모니터링
본 발명의 하니의 양태에서, 조작된 표현형은 세포에서 폴리켑티드 (예컨대, 자일라나제)의 발현을 증가시키거나 또는 감소시키는 것 또는 새로운 폴리펩티드를 발생시키는 것을 포함한다. 이 증가되거나 또는 감소된 발현은 본 발명의 자일라나제 함량을 측정함으로써 또는 자일라나제 활성 분석에 의해 추적될 수 있다. 폴리펩티드, 펩티드 및 아미노산은 또한, 예컨대, 핵 자기 공명 (NMR), 분광학, 방사선사진법 (단백질 방사선 라벨링), 전기영동, 모세관 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 박층 크로마토그래피 (TLC), 초과 확산 크로마토그래피, 다양한 면역학적 방법, 예컨대 면역 침전, 면역 확산, 면역-전기영동, 방사선 면역 분석 (RIAs), 효소-결합 면역 흡착 분석 (ELISAs), 면역-형광 분석, 젤 전기영동 (예컨대, SDS-PAGE), 항체에 의한 스테이닝, 형광 활성화 세포 분류기 (FACS), 열분해 질량 분광학, 푸리에-전이 적외선 분광학, 라만 분광학, GC-MS, 및 LC-전기분무 및 캡-LC-탠덤-전기분무 질량 분광학, 등을 포함하는 본 기술분야에서 공지된 임의의 방법으로 검출되고 정량화될 수 있다. 또한 새로운 생체활성이 미국 특허6,057,103에 기재된 방법, 또는 그것의 변형을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 게다가, 이하에 상세히 기재된 바와 같이, 1 또는 그 이상, 또는, 세포의 모든 폴리펩티드가 단백질 배열을 사용하여 측정될 수 있다.
산업상 응용
본 발명의 자일라나제 효소는 촉매에 상당히 선택적일 수 있다. 그들은 종래의 합성 화학과 견줄데 없는 정교한 입체-선택성, 위치-선택성 및 화학-선택성으로 반응을 촉매화할 수 있다. 게다가, 효소는 현저하게 다재다능하다. 본 발명의 자일라나제 효소는, 유기 용매에서 작용하고, 극단적인 pH (예컨대, 높은 pH 및 낮은 pH) 극단적인 온도 (예컨대, 고온 및 저온), 극단적인 염도 레벨 (예컨대, 고염도 및 저염도)에서 작동하고 그리고 그들의 자연적, 생리학적 기질과 구조적으로 무관한 화합물들과의 반응을 촉매하도록 맞춤될 수 있다.
세정 조성물
본 발명은 1 또는 그 이상의 본 발명의 폴리펩티드 (예컨대, 자일라나제)를 포함하는 세정 조성물, 및 이들 조성물의 제조 및 사용 방법을 제공한다. 본 발명은 세정 조성물의 모든 제조 및 사용 방법을 포함한다, 예컨대, 미국 특허 6,413,928; 6,399,561; 6,365,561; 6,380,147 참조. 세정 조성물은 1 및 2 부 수성 조성물, 비수성 액체 조성물, 캐스트 고체, 과립형, 소립자형, 압축 정제, 젤 및/또는 페이스트 및 슬러리형일 수 있다. 본 발명의 자일라나제는 또한 고체 또는 액체 형 중에 세제 첨가제 생성물로서 사용될 수 있다. 그런 첨가제 생성물은 종래의 세정 조성물의 성능을 보충하거나 강화시킬 것으로 기대되며 세척 과정의 임의의스테이지에 첨가될 수 있다.
실질적인 활성 효소 함량은 세정 조성물의 제조 방법에 좌우되며, 세제 용액이 목적하는 효소 활성을 갖는다는 것을 가정하는데 있어 중요하지는 않다. 하나의 양태에서, 최종 용액 중 본 발명의 자일라나제 함량은 세정 조성물 그랭 당 약 0.001 mg 내지 0.5 mg 범위이다. 본 발명의 방법 및 생성물에 사용하기 위해 선택된 특정 효소는 생성물의 물리적 형태, 사용 pH, 사용 온도, 및 분해되거나 또는 변형되는 토양의 유형을 포함하여, 최종 사용 조건에 좌우된다. 효소는 임의의 소정 사용 조건의 세트에 대해 최적 활성 및 안정성을 제공하도록 선택될 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 자일라나제는 pH 범위 약 4 내지 약 12 그리고 온도 범위 약 20℃ 내지 약 95℃에서 활성이다. 본 발명의 세제는 양이온성, 반극성 비이온성 또는 양쪽성 이온성 계면활성제 또는 그들의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 자일라나제는 pH 4.0과 12.0 사이에서 약 0.01 내지 약 5 중량% (바람직하게는 0.1% 내지 0.5%)의 레벨로 분말 및 액체 세제 내에서 제제화될 수 있다. 이들 세정 조성물은 자일라나제, 셀룰라제, 리파제 또는 엔도글리코시다제, 엔도-베타-1,4-글루카나제, 베타-글루카나제, 엔도-베타-1,3(4)-글루카나제, 쿠티나제, 퍼옥시다제, 락카제(laccases), 아밀라제, 글루코아밀라제, 펙티나제, 리덕타제, 옥시다제, 페놀옥시다제, 리그니나제, 풀루라나제, 아라비나나제, 헤미셀룰라제, 만나나제, 자일로글루카나제, 자일라나제, 펙틴 아세틸 에스테라제, 람노갈락투로난 아세틸 에스테라제, 폴리갈락투로나제, 람노갈락투로나제, 갈락타나제, 펙틴 라이아제, 펙틴 메틸에스테라제, 셀로비오히드롤라제 및/또는 트랜스들루타밀라제와 같은 다른 표소를 포함할 수 있다. 이들 세정 조성물은 또한 빌더(builder) 및 안정화제를 포함할 수 있다.
본 발명의 자일라나제를 종래의 세척 조성물에 첨가하는 것은 임의의 특별한 사용 제한을 만들어 내지 않는다. 다시 말하면, 효소가, 사용하고자 하는 그 pH 및/또는 온도에서 활성이거나 또는 문제점이 없는 한, 세제에 적절한 임의의 온도 및 pH는 또한 본 발명의 조성물에 대해서도 적절하다. 게다가, 본 발명의 자일라나제는 세제 없이, 다시 말하면 단독으로 또는 빌더 및 안정화제와 조합되어 세척 조성물 중에 사용될 수 있다.
본 발명은, 단단한 표면을 세척하기 위한 세정 조성물, 직물을 세척하기 위한 세정 조성물, 식기세척용 조성물, 경구용 세척 조성물, 치아 세척 조성물, 및 콘택트 렌즈 세척 용액을 포함하는 세척 조성물을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 세척하기에 충분한 조건 하에서 본 발명의 폴리펩티드와 대상을 접촉시키는 것을 포함하는 대상의 세척 방법을 제공한다. 본 발명의 자일라나제는 세제 첨가제로서 포함될 수 있다. 본 발명의 세정 조성물은, 예컨대, 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는, 손 또는 기계 세탁 세정 조성물로서 제제화될 수 있다. 얼룩진 직물의 사전 처리를 위해 적당한 세탁 첨가제는 본 발명의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 직물 유연제 조성물은 본 발명의 자일라나제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 자일라나제는 일반적으로 가정용 단단한 표면 세척 작용으로 사용하기 위한 세정 조성물로서 제제화될 수 있다. 대안적 양태에서, 본 발명의 세제 첨가제 및 세정 조성물은, 자일라나제, 리파제, 쿠티나제, 다른 자일라나제, 카보하이드라제, 셀룰라제, 펙티나제, 만나나제, 아라비나제, 갈락타나제, 자일라나제, 옥시다제, 예컨대, 락타제, 및/또는 퍼옥시다제 (상기 참조)와 같은 1 또는 그 이상의 다른 효소를 포함할 수 있다. 본 발명의 효소(들)의 특성은 선택된 세제와 양립할 수 있도록 선택되며 (즉 pH-최적, 다른 효소 및 비효소 성분들 등과의 양립가능성) 그리고 효소(들)는 유효량으로 존재한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 자일라나제 효소는 직물로부터 악취 물질을 제거하는데 사용된다. 본 발명을 수행하는데 있어 사용될 수 있는 다양한 세정 조성물 및 이들의 제조 방법은, 예컨대, 미국 특허 6,333,301; 6,329,333; 6,326,341; 6,297,038; 6,309,871; 6,204,232; 6,197,070; 5,856,164에 기재되어 있다.
세탁기 세척 방법에 사용되기에 적절한 조성물로서 제제화될 때, 본 발명의 자일라나제는 계면활성제 및 빌더 화합물을 둘 다 포함할 수 있다. 그들은 추가적으로 1 또는 그 이상의 세제 성분, 예컨대, 유기 중합체 화합물, 표백제, 추가 효소, 거품 억제제, 분산제, 라임-비누 분산제, 토양 현탁액 및 재석출 방지제 및 부식 억제제를 포함할 수 있다. 본 발명의 세탁 조성물은 부가적 세제 성분으로서 유연제를 또한 포함할 수 있다. 탄수화물을 함유하는 그런 조성물은 세탁 세정 조성물로서 제제화될 때 직물 세척, 얼룩 제거, 백색 유지, 연화, 착색 외관, 염료 전이 억제 및 위생을 제공할 수 있다.
본 발명의 세탁 세정 조성물의 밀도는 조성물의 약 200 내지 1500 g/리터, 또는, 약 400 내지 1200 g/리터, 또는, 약 500 내지 950 g/리터, 또는, 600 내지 800 g/리터 범위일 수 있으며; 이는 약 20℃에서 측정될 수 있다.
본 발명의 세탁 세정 조성물의 "압축"형은, 밀도로 그리고, 조성물의 측면에서, 무기 충진 염의 함량으로 최선 반영된다. 무기 충진 염은 분말형 세정 조성물의 통상적인 성분이다. 종래의 세정 조성물에서, 충진 염은 실질적인 양, 구체적으로 총 조성물의 17% 내지 35중량%로 존재한다. 압축 조성물의 하나의 양태에서, 충진 염은 총 조성물의 15%를 초과하지 않는 양, 또는, 10%를 초과하지 않는 양, 또는, 조성물의 5 중량%를 초과하지 않는 양으로 존재한다. 무기 충진 염은 설페이트 및 클로라이드의 알칼리 및 알칼리 토금속 염, 예컨대, 황산 나트륨으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 액체 세정 조성물은 또한 "농축형"일 수 있다. 하나의 양태에서, 액체 세정 조성물은 종래의 액체 세제에 비해 소량의 물을 함유할 수 있다. 대안적 양태에서, 농축 액체 세제의 물 함량은 세정 조성물의 40% 이하, 또는, 30% 이하, 또는, 20 중량% 이하이다. 본 발명의 세제 화합물은 WO 97/01629에 기재된 것과 같은 제제를 포함할 수 있다.
본 발명의 자일라나제는 다양한 세척 조성물을 제제화하는데 유용할 수 있다. 몇가지 공지된 화합물은, 예컨대, 미국 특허 4,404,128; 4,261,868; 5,204,015에 개시된 것으로서 사용될 수 있는, 비이온성, 음이온성, 양이온성, 또는 양쪽성이온성 세제를 포함하는 적절한 계면활성제이다. 게다가, 자일라나제는, 예컨대, 막대 또는 액체 비누 제품, 식기 보호 제제, 콘택트 렌즈 세척 용액 또는 생성물, 펩티드 가수분해, 폐기물 처리, 직물 제품, 단백질 합성에 있어서 융합-절단 효소, 등으로 사용될 수 있다. 자일라나제는 다른 세제 자일라나제에 비해 세정 조성물중에서 향상된 성능을 제공할 수 있다. 즉, 효소군은, 표준 세척 사이클 이후 일반적인 평가에 의해 측정되는 것으로서 풀 또는 혈액과 같은 특정 효소 민감성 얼룩의 세척을 증가시킬 수 있다. 자일라나제는 pH 6.5와 12.0 사이를 갖는 공지의 분말 및 액체 세제 내로 약 0.01 내지 약 5 중량% (예컨대, 약 0.1% 내지 0.5%)의 레벨로 제제화될 수 있다. 이들 세제 세척 조성물은 공지의 자일라나제, 자일라나제, 아밀라제, 셀룰라제, 리파제 또는 엔도글리코시다제, 뿐 아니라 빌더 및 안정화제화 같은 다른 효소를 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 과일, 야채 및/또는 진흙 및 점토 화합물과 사용하기 위한 자일라나제 활성 (본 발명의 자일라나제)을 갖는 세정 조성물을 제공한다 (예컨대, 미국 특허 5,786,316 참조).
섬유 및 직물 처리
본 발명은 1 또는 그 이상의 본 발명의 자일라나제를 사용하여 섬유 또는 직물의 처리 방법을 제공한다. 자일라나제는 본 기술 분야에서 공지된 임의의 섬유- 또는 직물-처리 방법에 사용될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 6,261,828; 6,077,316; 6,024,766; 6,021,536; 6,017,751; 5,980,581; US 특허 공개 20020142438 A1 참조. 예컨대, 본 발명의 자일라나제는 섬유 및/또는 직물 크기감소(desizing)에 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 용액 중 본 발명의 자일라나제와 섬유를 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 의해 섬유의 촉감 및 외관이 향상된다. 하나의 양태에서, 가압하에서 용액으로 직물이 처리된다. 예컨대, 본 발명의 자일라나제는 얼룩의 제거에 사용될 수 있다.
본 발명의 자일라나제는, 섬유 (예컨대, 면, 삼, 아마 또는 린넨으로부터의 섬유), 재봉된 및 재봉되지 않은 직물, 예컨대, 면으로부터 얻은 니트, 부직포, 데님, 실, 및 타올, 면 혼방 또는 천연 또는 합성 셀룰로스 물질 (예컨대 목재 펄프와 같은 것으로부터 얻은 자일란-함유 셀룰로스로부터 유래하는 것) 또는 그들의 혼방을 포함하는 임의의 셀룰로스계 물질을 처리하는데 사용될 수 있다. 혼방의 예는 면 또는 레이온/비스코스와 1 또는 그 이상의 모, 합성 직물 (예컨대 폴리아미드 섬유, 아크릴계 섬유, 폴리에스테르 섬유, 폴리비닐 알콜 섬유, 염화 폴리비닐 섬유, 염화 폴리비닐리덴 섬유, 폴리우레탄 섬유, 폴리우레아 섬유, 아라미드 섬유), 및 셀룰로스-함유 섬유 (예컨대 레이온/비스코스, 모시, 삼, 아마/린넨, 황마, 셀룰로스 아세테이트 섬유, 리오셀)와 같은 동반 물질과의 혼방이다 .
(본 발명의 자일라나제를 사용하는) 본 발명의 직물 처리 과정은 다른 직물 처리, 예컨대, 스커링(scouring) 및 표백과 관련하여 사용될 수 있다. 스커링은 면 섬유로부터 비-셀룰로스계 물질, 예컨대, (주로 왁스로 구성된) 큐티클(cuticle) 및 (주로 펙틴, 단백질 및 자일로글루칸으로 구성된) 1차 세포벽을 제거하는 것이다. 높은 습윤성을 얻기 위해 적절한 왁스 제거가 필요하다. 이것은 염색을 위해 필요하다. 본 발명의 방법에 의한 1차 세포벽의 제거는 왁스 제거를 향상시키고 그리고 더 확실한 염색을 보장한다. 본 발명의 방법에 의한 직물 처리는 표백 과정에서 백색 정도를 향상시킨다. 스커링에 사용되는 주된 화학물은 소농도 및 고온의 염화 나트륨이다. 표백은 직물을 산화시키는 것을 포함한다. 완전히 표백된 (백색) 직물 또는 염료의 깨끗한 채색을 얻기 위해, 표백은 특히 산화제로서 과산화수소의사용을 포함한다.
본 발명은 또한 알칼리성 자일라나제 (알칼리 조건 하에서 활성인 자일라나제)를 제공한다. 이들은 직물 공정, 식물 섬유의 검질 제거 (예컨대, 식물 인피 섬유), 펙틴질 폐수의 처리, 제지, 및 커피 및 차의 발효에서 광범위로 응용된다. 예컨대, Hoondal (2002) Applied Microbiology and Biotechnology 59: 409-418 참조.
식품 및 식품 가공의 처리
본 발명의 자일라나제는 식품 가공 산업에서 많이 응용된다. 예컨대, 하나의 양태에서, 본 발명의 자일라나제는 오일이 풍부한 식물성 물질, 예컨대, 오일이 풍부한 씨앗으로부터, 예컨대, 대두로부터 대두유, 올리브로부터 올리브유, 평지씨로부터 평지씨유 및/또는 해바라기씨로부터 해바라기 오일의 추출을 향상시키는데 사용된다.
본 발명의 자일라나제는 식물 세포 물질의 성분을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 자일라나제는 자일란 풍부 물질 (예컨대, 식물 세포)을 성분으로 분리하는데 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 자일라나제는 자일란 풍부- 또는 오일-풍부 작물로부터 가치있는 단백질 및 오일 및 헐(hull) 분율로 분리하는데 사용될 수 있다. 분리 과정은 본 기술 분야에서 공지된 방법을 사용함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 자일라나제는 과일 또는 야채 주스, 시럽, 추출물 등의 제조에 있어 수득율을 증가시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 자일라나제는 다양한 식물 세포벽 유도 물질 또는 폐기물, 예컨대 씨리얼, 그레인, 와인 또는 주스 제조, 또는 식물피, 대두피, 사탕무 펄프, 올리브 펄프, 감자 펄프, 등과 같은 농업상 잔류물의 효소 처리에 사용될 수 있다 (예컨대, 자일란 함유 식물 물질의 가수분해). 본 발명의 자일라나제는 가공된 과일 또는 야채의 밀도(consistency) 및 외관을 변형하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 자일라나제는, 음식을 포함하여 식물 물질의 가공을 촉진하기 위해, 식물 성분의 정제 또는 추출을 촉진하기 위해 식물 물질을 처리하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 자일라나제는, 사료가(feed value)를 향상시키는데, 물 결합능을 감소시키는데, 폐수 식물에서 분해성을 감소시키는데 및/또는 식물 물질의 저장물로의 전환을 향상시키는데, 등등 사용될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 자일라나제는 베이킹 응용, 예컨대, 쿠키 및 크래커에, 장치가 어렵지 않으면서 비스킷 크기를 감소시키지 않으면서, 아라비노자일란을 가수분해시키는데 그리고 끈끈하지 않은 반죽을 만들어내는데 사용될 수 있다. 본 발명의 자일라나제를 아라비노자일란을 가수분해하는데 사용하는 것은 구워낸 제품의 빠른 재수화로 인하여 바삭거림의 손실 및 감소된 유효 보존기간을 방지하는데 사용된다. 하나의 양태에서, 본 발명의 자일라나제는 반죽(dough) 과정에서 첨가제로 사용된다. 하나의 양태에서, 본 발명의 자일라나제는 반죽의 컨디셔닝에 사용되며, 여기서 하나의 양태로 자일라나제는 약 25-35℃ 온도 범위 및 거의 중성 pH (7.0-7.5)에 걸쳐 높은 활성을 가진다. 하나의 양태에서, 반죽 컨디셔닝 효소는 베이킹의 극단적인 온도에서 불활성될 수 있다 (＞ 500℉).
하나의 양태에서, 본 발명의 자일라나제는 반죽 pH 및 온도 조건을 최적으로 수행하기 위해 반죽 과정에서 첨가제로서 사용된다. 하나의 양태에서, 본 발명의효소는 반죽 컨디셔닝을 위해 사용된다. 하나의 양태에서, 본 발명의 자일라나제는 온도 범위 25-35℃ 및 거의 중성 pH (7.0-7.5)에 걸쳐 높은 활성을 가진다. 하나의 양태에서, 효소는 베이킹의 극단적인 온도, 예컨대, ＞ 500℉에서 불활성화된다.
종이 또는 펄프 처리
본 발명의 자일라나제는 종이 또는 펄프 처리 또는 종이의 잉크 제거에 사용될 수 있다. 예컨대, 하나의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 자일라나제를 사용하는 종이 처리 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 자일라나제는 이산화염소와 같은 화학적 표백제의 필요를 감소시키는데, 그리고 높은 알칼리성 및 고온 환경에서 적용할 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 자일라나제는, 0.5% 이하의 펄프 손실률로 크래프트 펄프의 이산화염소 요구에 있어서 25% 이상의 감소로 영향을 미칠 수 있는 내열성 알칼리성 엔도자일라나제이다. 하나의 양태에서, 한계 파라미터는 pH 10, 65-85℃ 및 효소 로딩 0.001 wt% 이하에서 60분 이하의 처리 시간이다. 자일라나제의 풀(pool)은 예컨대, pH 10 및 60℃에서 염료-라벨링된 자일란을 가수분해하는 능력에 대해 테스트될 수 있다. 이들 조건 하에서 파지티브로 테스트된 효소는 이후, 예컨대 pH 10 및 70℃에서 평가될 수 있다. 대안적으로, 효소는 pH 8 및 pH 10, 70℃에서 테스트될 수 있다. 펄프 및 종이 산업 연구실에서 목적하는 자일라나제의 발견은 고온 또는 높은 알칼리성 환경을 타겟으로 하였다. 특히, 이들 연구실은 알칼리성 pH 및 대략 45℃의 온도에서 작용하는 효소를 스크리닝하였다. 다른 양태에서, 본 발명의 자일라나제는, 리그닌을 방출하기 위해 리그닌 헤미셀룰로스 결합의 분해에 있어서 종이 및 펄프 산업에 유용하다.
동물 사육 및 식품 또는 사료 첨가제
본 발명은 본 발명의 자일라나제를 사용하여 동물 사료 및 식품 및 식품 또는 사료 첨가제를 처리하는 방법을 제공하며, 동물은 포유동물 (예컨대, 인간), 새, 물고기 등을 포함한다. 본 발명은 본 발명의 자일라나제를 함유하는 동물 사료, 식품, 및 첨가제를 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 자일라나제를 사용하여 동물 사료, 식품 및 첨가제를 처리하는 것은 동물 사료 첨가제 중에 영양분, 예컨대, 전분, 단백질, 등의 이용률에 도움이 될 수 있다. 소화되기 어려운 단백질 또는 직접 또는 간접으로 마스킹되지 않은 전분 (또는 다른 영양분)을 분해시킴으로써, 자일라나제가 영양분으로 하여금 다른 내인성 또는 외인성 효소에 더 잘 접근할 수 있게 한다. 자일라나제는 또한 용이하게 소화될 수 있고 그리고 용이하게 흡수되는 영양분 및 당의 방출을 간단히 유발시킬 수 있다.
동물 사료에 첨가될 때, 본 발명의 자일라나제는 장관의 점도를 감소시키는 것에 의해 식물 세포벽 물질의 부분적인 생체내 분해를 향상시키며 (예컨대, Bedford et al., Proceedings of the 1st Symposium on Enzyme in Animal Nutrition, 1993, pp. 73-77), 그럼으로써 동물에 의한 식물 영양분의 더 나은 활용을 얻게 한다. 따라서, 사료에 본 발명의 자일라나제를 사용함으로써 동물의 성장 속도 및/또는 사료 전환률 (즉 늘어난 체중에 상대적인 섭취된 사료의 중량)이 향상된다.
본 발명의 동물 사료 첨가제는 사료 성분과 용이하게 혼합될 수 있는 과립화된 효소 생성물일 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 사료 첨가제는 프리믹스(pre-mix)의 성분을 형성할 수 있다. 본 발명의 과립화된 효소 생성물은 코팅되거나 또는 코팅되지 않을 수 있다. 효소 과립의 입자 크기는 사료 및 프리믹스 성분의 것과 양립가능할 수 있다. 이는 사료 내로 효소 도입의 안전하고 용이한 수단을 제공한다. 대안적으로, 본 발명의 동물 사료 첨가제는 안정화된 액체 조성물일 수 있다. 이는 수성 또는 오일계 슬러리일 수 있다. 예컨대, 미국 특허 6,245,546 참조.
본 발명의 자일라나제는, 동물 사료 또는 식품의 변형시, 시험관내 (사료 또는 식품의 성분을 가공함으로써) 또는 생체내에서 식품 또는 사료를 가공할 수 있다. 자일라나제는 고함량의 자일란을 함유하는 동물 사료 또는 식품 조성물에 첨가될 수 있으며, 예컨대 식물 물질 함유 사료 또는 식품은 씨리얼, 그레인 등으로부터 얻는다. 자일라나제를 식품 또는 사료에 첨가할 때 자일란 함유 물질, 예컨대, 식물 세포벽의 생체내 분해가 현저하게 향상되며, 그럼으로써 동물 (예컨대, 인간)에 의한 식물 영양분의 더 나은 활용이 얻어진다. 하나의 양태에서, 동물의 성장 속도 및/또는 사료 전환률 (즉, 늘어난 체중에 상대적인 섭취된 사료의 중량)이 향상된다. 예컨대 부분적으로 또는 소화될 수 없는 자일란-함유 단백질이, 예컨대 다른 효소, 예컨대, 베타-갈락토시다제와 조합된 본 발명의 자일라나제에 의해, 펩티드 및 갈락토스 및/또는 갈락토올리고머로 완전히 또는 부분적으로 분해된다. 이들 효소 소화 생성물은 동물에 의해 더 잘 소화될 수 있다. 따라서, 본 발명의 자일라나제는 사료 또는 식품의 가용 에너지에 기여할 수 있다. 또한, 자일란 함유 단백질의 분해에 기여함으로써, 본 발명의 자일라나제는 탄수화물 및 단백질, 지방 및 미네랄과 같은 비-탄수화물 사료 또는 식품 성분의 소화가능성 및 섭취를 향상시킬수 있다.
다른 양태에서, 본 발명의 자일라나제는 그레인, 씨리얼, 옥수수, 대두, 평지씨, 루핀 등과 같은 유전자 전이 작물에서 직접 (예컨대, 유전자 전이 식물, 종자 등으로서) 발현시킴으로써 공급될 수 있다. 전술한 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 전이 식물, 식물의 부분 및 식물 세포를 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 자일라나제가 복구 가능한 양으로 생성되도록 핵산이 발현된다. 자일라나제는 임의의 식물 또는 식물의 부분으로부터 복구될 수 있다. 대안적으로, 재조합 폴리펩티드를 함유하는 식물 또는 식물의 부분은 식품 또는 사료의 질을 향상시키기 위해, 예컨대, 영양가, 맛, 및 유동학적 성질를 향상시키는데, 또는 영양분 파괴 팩터를 분해시키기 위해 사용될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 자일라나제를 사용하여 동물 개체에 의해 소비되기에 앞서 시료로부터 올리고사카리드를 제거하는 방법을 제공한다. 이 과정에서 사료는 증가된 대사가능한 에너지 값을 갖도록 형성된다. 본 발명의 자일라나제 뿐 아니라, 갈락토시다제, 셀룰라제 및 그것들의 조합이 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 효소가 사료 물질의 약 0.1%와 1중량% 사이와 동등한 양으로 첨가된다. 하나의 양태에서, 사료는 씨리얼, 밀, 그리엔, 대두 (예컨대, 그라인딩된 대두) 물질이다. 예컨대, 미국 특허 6,399,123 참조.
다른 양태에서, 본 발명은 아미노산 서열 B군의 아미노산이 적어도 30개 인접하는 아미노산을 포함하는 재조합 자일라나제 효소를 함유하는 영양분을 제조함으로써, 그리고 동물에 의해 섭취되는 식품에 함유된 자일란의 활용을 증가시키기 위해 동물에 영양분을 투여함으로써 동물의 식이에 영양분으로써 자일라나제를 활용하기 위한 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 동물에게 예컨대 영양분으로서, 자일라나제를 공급하기 위한 식용 펠릿화된 효소 공급 매트릭스 및 사용 방법을 제공한다. 효소 공급 매트릭스는, 예컨대, 동물의 소화액과 같은 수성 매질에서 아미노산 서열 B군의 아미노산 서열, 또는 그것들의 적어도 30개의 인접한 아미노산을 갖도록 용이하게 자일라나제 효소를 방출한다. 본 발명의 효소 공급 매트릭스는 그레인 배아와 같은 성분으로부터 선택된 입자화된 식용 담체로부터 제조되며, 그것은 수성 매질 내로 그것에 함유된 재조합 효소를 용이하게 분산시키는 오일, 건초, 알팔파(alfalfa), 티모시(timothy), 대두피, 해바라기 씨 분말, 밀 미드(wheat midd), 등을 소비한다. 사용시, 동물에게 자일라나제를 공급하기 위해 식용 펠릿화된 효소 공급 매트릭스가 동물에게 투여된다. 밀, 옥수수, 대두, 수수, 알팔파, 보리 등과 같은 적절한 그레인계 기질을 함유하거나 또는 임의의 적절한 식용 그레인으로부터 유도된다. 예시적 그레인계 기질은 옥수수계 기질이다. 기질은 그레인의 임의의 적절한 부분으로부터 유도될 수 있지만, 바람직하게는, 습식 또는 건식 밀링 과정으로 얻어진 옥수수 배아와 같이 동물 사료 용도로 승인된 그레인 배아이다. 바람직하게는 그레인 배아는 스펜트 배아(spent germ)를 함유하며, 여기서 그레인 배아는, 예컨대 압착시킴으로써 또는 헥산 또는 다른 용매 추출에 의해 오일을 제거한 것이다. 대안적으로, 그레인 배아는 축출기로 추출되며, 즉 압착시킴으로써 오일이제거되었다.
본 발명의 효소 공급 매트릭스는 별개로 된 복수의 입자, 펠릿 또는 과립의 형태이다. "과립"은 매트릭스로부터 물을 제거하기 위해 펠릿화, 압출에 의해, 또는 유사하게 압축시킴으로써 압착되거나 압축된 입자를 의미한다. 입자의 그런 압착 또는 압축은 또한 입자의 입자내 응집을 향상시킨다. 예컨대, 펠릿 밀에서 그레인계 기질을 펠릿화함으로써 과립이 제조될 수 있다. 그렇게 제조된 펠릿을 그라인딩하거나 또는 부수어서 동물 사료에서 애쥬반트(adjuvant)로서 사용하기에 적절한 과립 크기가 되게 한다. 매트릭스 그 자체가 동물 사료로 사용하도록 승인되기 때문에, 그것은 동물 사료 중에 효소의 공급을 위해 희석제로서 사용될 수 있다.
바람직하게는, 효소 공급 매트릭스는 과립 크기 약 4 내지 약 400 메시 (USS); 더 바람직하게는, 약 8 내지 약 80 메시; 및 가장 바람직하게는 약 14 내지 약 20 메시 범위를 갖는 과립의 형태이다. 만약 그레인 배아가 용매 추출을 경유하여 소비된다면, 옥수수 오일과 같은 광택제의 사용이 펠릿화 장비에 필수적일 수 있지만, 만약 배아가 축출기로 추출된다면 그런 광택제는 일반적으로 필요하지 않다. 본 발명의 다른 양태에서, 다른 압축 및 압착 과정에 의해, 예컨대, 압출물의 다이 및 그라인딩을 통해 그레인계 기질을 추출시킴으로써 적절한 과립 크기로 매트릭스가 제조된다.
효소 공급 매트릭스는 매트릭스 과립의 응집성을 향상시키기 위해 응집제로서 폴리사카리드 성분을 더 함유할 수 있다. 응집제는 매트릭스 과립 내의 그레인 단백질 사이의 결합을 향상시키는 추가의 하이드록실 기를 제공하는 것으로 여겨진다. 또한 전분 및 다른 단백질에 대한 단백질의 수소 결합을 강화시킴으로써 추가의 하이드록실 기가 작용하게 되는 것으로 여겨진다. 응집제는 효소 공급 매트릭스의 과립의 응집을 향상시키는데 적절한 임의의 양으로 존재할 수 있다. 적절한 응집제는 1 또는 그 이상의 덱스트린, 말토덱스트린, 전분, 예컨대 옥수수 전분, 분말(flours), 셀룰로스 물질, 헤미셀룰로스 물질, 등을 포함한다. 예컨대, 그레인 배아 및 응집제의 매트릭스 중 (효소를 함유하지 않는) 퍼센트는 78% 옥수수 배아 분말 및 20중량%의 옥수수 전분이다.
본 발명의 효소-방출 매트릭스는 생물 분해 가능 물질로부터 만들어지기 때문에, 매트릭스는, 예컨대 몰딩으로써 부패의 대상이 될 수 있다. 그런 몰딩을 막거나 또는 방지하기 위해, 매트릭스는 프로피오네이트 염과 같은 몰딩 억제제를 함유할 수 있으며, 이는 효소-방출 매트릭스의 몰딩을 억제하기에 충분한 임의의 양으로 존재할 수 있으며, 따라서 공급 매트릭스로 하여금 냉장을 요하지 않는 안정한 제제로 존재하게끔 제공된다.
본 발명의 효소 공급 매트릭스 및 방법에 포함된 자일라나제 효소는 바람직하게는, 전술한 것으로서, 제조 동안 자일라나제의 불활성을 방지하도록 내열성 자일라나제이며, 여기서 상승 온도 및/또는 기류가 펠릿화된 효소 공급 매트릭스를 제조하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 효소 공급 매트릭스를 함유하는 사료의 소화 동안, 수성 소화액이 활성 효소의 방출을 초래할 수 있다. 다른 종류의 내열성 효소 및 내열성인 영양분이 또한 임의의 종류의 수성 조건 하에서 방출되기 위해 공급 매트릭스 중에 도입될 수 있다.
동물 사료에 맛 또는 영양분을 추가하기 위해, 위와 같은 조건에서 동물 사료의 영양분과 효소의 방출을 지연시키기 위한 것 등과 같이 다양한 상이한 목적으로 본 발명의 효소 매트릭스 입자에 코팅이 적용될 수 있다. 또는 예컨대, 매트릭스 입자로부터 효소를 느리게 방출하거나 또는 효소가 방출되게 되는 조건 하에서 조절되는 것이 바람직한 때에는 언제라도, 기능적 목적을 얻기 위해 코팅이 적용될 수 있다. 코팅재의 조성물은 그것이 민감한 것 (예컨대 열, 산 또는 염기, 효소 또는 다른 화학물질)으로서 시약에 의해 선택적으로 분해되는 그런 것일 수 있다. 대안적으로, 상이한 분해 시약에 민감한 2 또는 그 이상의 코팅이 매트릭스 입자에 연속하여 적용될 수 있다.
본 발명은 또한 효소-방출 매트릭스를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라, 그 방법은 효소-방출 매트릭스로서 사용되기에 적절한 입자 크기로 그레인계 기질의 별개의 복수의 입자를 제공하는 것을 포함하며, 여기서 그 입자는 아미노산 서열 B군의 아미노산 서열 또는 그것의 적어도 30개의 인접하는 아미노산에 의해 암호화된 자일라나제 효소를 함유한다. 바람직하게는, 그 방법은 효소-방출 매트릭스의 입자를 과립으로 압축 또는 압착하는 것을 포함하며, 가장 바람직하게는 펠릿화에 의해 수행된다. 몰딩 억제제 및 응집제는, 사용되는 경우, 임의의 적절한 시간에 첨가될 수 있으며, 그리고 바람직하게는 그레인계 기질의 펠릿화에 앞서 소정의 분율로 그레인계 기질과 혼합된다. 펠릿 밀(mill) 사료 중에 수분 함량은 바람직하게는 최종 생성물 중에 수분 함량에 맞춰 전술한 범위이며, 바람직하게는 약 14-15%이다. 바람직하게는, 이 수분 함량을 갖도록 효소의 수성 제제의 형태로 공급원료에 수분이 첨가된다. 펠릿 밀의 온도는 바람직하게는 증기로서 약 82℃로 공급된다. 펠릿 밀은 공급원료가 펠릿을 제공하도록 충분한 작업에 참여하는 임의의 조건 하에서 작동될 수 있다. 펠릿화 과정 그 자체는 효소-함유 조성물로부터 물을 제거하기 위한 비용-효율적 과정이다.
하나의 양태에서, 펠릿 밀은 1/8 in. × 2 in. 다이로 100 lb./min 압력에서 82℃에서 작동하여 펠릿을 제공하며 이후 펠릿 밀 크럼블러(crumbler)에서 부숴져서 8 메시 스크린을 통과할 수 있지만 20 메시 스크린에는 남게 되는 입자 크기를 갖는 분리된 복수의 입자를 제공한다.
내열성의 본 발명의 자일라나제는 본 발명의 펠릿에 사용될 수 있다. 그들은 효소 반응이 여기 언급되지 않은 온도에서 수행되는 것이 가능할 수 있도록 최적 온도 및 최고 열 내성을 가질 수 있다. 본 발명에 따른 자일라나제를 암호화하는 유전자 (예컨대 A군 핵산 서열 중에 임의의 서열로 기재된 것)는 B군 아미노산 서열의 자일라나제와는 상이한 특성 (최적 pH, 최적 온도, 열 내성, 용매에 대한 안정성, 특정 활성, 기질에 대한 친화도, 분비 능력, 번역 속도, 전사 제어 등)을 갖는 자일라나제의 제조에 사용될 수 있다 (예컨대 전술한 GSSMTM사용). 또한, A군 핵산 서열의 폴리뉴클레오티드는, 그들이 향상되거나 또는 변형된 내열성 또는 열안정성과 같은 목적하는 성질을 갖는지 측정하기 위해 본원에 기재된 방법으로 제조된 다양한 자일라나제의 스크리닝을 위해 사용될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 5,830,732는 자일라나제의 내열성을 측정하기 위한 스크리닝 분석을 기재하고 있다.
폐기물 처리
본 발명의 자일라나제는 다양한 다른 산업 응용, 예컨대, 폐기물 처리에 사용될 수 있다. 예컨대, 하나의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 자일라나제를 사용하는 고체 폐기물 분해 과정을 제공한다. 그 방법은 실질적으로 처리되지 않은 고체 폐기물의 질량과 부피를 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 고체 폐기물은 (본 발명의 자일라나제를 함유하는) 효소 용액의 존재 하에서 조절된 온도로 효소적 분해 과정으로 처리될 수 있다. 이는 추가되는 미생물로부터 감지할 수 있는 박테리아 발효가 없는 반응을 초래한다. 고체 폐기물은 액화 폐기물 및 임의의 잔류 고체 폐기물로 전환된다. 만들어진 액화 폐기물은 상기 임의의 잔류 고체화된 폐기물로부터 분리될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 5,709,796 참조.
구강 보호 제품
본 발명은 본 발명의 자일라나제를 함유하는 구강 보호 제품을 제공한다. 예시적 구강 보호 제품은 치약, 치과용 크림, 젤 또는 치분, 치아(odontics), 구강 세척제, 양치 전후 세정 제제, 츄잉 검, 로젠지, 또는 캔디를 포함한다. 예컨대, 미국 특허 6,264,925 참조.
양조 및 발효
본 발명은 본 발명의 자일라나제를 함유하는 맥주의 양조 (예컨대, 발효) 맥주 방법을 제공한다. 하나의 예시적 방법에서, 전분 함유 원재료가 분해되고 가공되어 몰트(malt)를 형성한다. 본 발명의 자일라나제는 발효 과정 중 임의의 시점에사용된다. 예컨대, 본 발명의 자일라나제는 보리 몰트의 가공 중에 사용될 수 있다. 맥주 양조의 주된 원재료는 보리 몰트이다. 이것은 3단계 과정일 수 있다. 먼저, 보리 그레인을, 예컨대, 약 40% 부근으로 수분 함량이 증가하도록 담글 수 있다. 두번째, 지베렐린의 조절 하에서 효소 합성이 자극될 때, 그레인을 15 내지 25℃에서 3 내지 6일 동안 인큐베이션함으로써 발아시킬 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 자일라나제가 과정 중 이 단계 (또는 임의의 다른 단계)에 첨가된다. 본 발명의 자일라나제는, 예컨대, 미국 특허 5,762,991; 5,536,650; 5,405,624; 5,021,246; 4,788,066에 기재된 방법으로 제조된 임의의 맥주 또는 알콜성 음료에 사용될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 효소는 여과성 및 맥아즙 점도를 향상시키기 위해 그리고 배유 성분의 더 완전한 가수분해를 얻기 위해 사용된다. 본 발명의 효소의 사용은 또한 추출 수득률을 증가시킨다. 양조의 과정은 보리 그레인의 발아 (몰팅, malting) 이어서 저장된 탄수화물의 추출 및 분해로 효모에 의해 알콜 발효를 위해 사용되는 간단한 당을 얻는 것을 포함한다. 보리 배유 및 양조 부가물 중에 존재하는 예비적 탄수화물의 효율적인 분해는 몇가지 상이한 효소의 활성을 요한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 효소는 약산성 pH (예컨대, 5.5-6.0), 예컨대, 40℃ 내지 70℃ 온도 범위에서 활성을 가지며; 그리고, 하나의 양태에서, 95℃에서 불활성이다. 그런 조건 하에서 활성은 최적이지만, 효율성에 필수적인 요구사항은 아니다. 하나의 양태에서, 본 발명의 효소는 40-75℃ 사이, 및 pH 5.5-6.0에서 활성을 가지며; 70℃에서 적어도 50분 동안 안정하며, 그리고, 하나의 양태에서, 96-100℃에서 불활성이다. 본 발명의 효소는 다른 효소, 예컨대, 베타-1,4-엔도글루카나제 및 아밀라제와 함께 사용될 수 있다.
의학 및 연구 응용
본 발명의 자일라나제는 그들의 박테리아 분해 성질에 의해 항미생물제로서 사용될 수 있다. 본 발명의 자일라나제는, 예컨대, PCT 출원 WO0049890 및 WO9903497에 기재된 바와 같이 살모넬라로부터 동물을 보호하거나 그것을 제거하는데 사용될 수 있다.
다른 산업상 응용
아미노산 서열 B군이 광범위한 식품, 동물 사료 및 음료 응용에 사용되는 것을 포함하여, 본 발명의 자일라나제가 사용될 수 있다. 다양하게 중온성 및 적당히 고온성 위치 뿐 아니라 소화성 식물군, 동물 폐기물 중의 미생물, 토양 박테리아 및 높은 알칼리성 거주물을 포함하는 목적하는 공급원으로 구축된 기존 라이브러리 및 DNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 신규한 자일라나제가 발견되었다. 1차적 동물 사료 물질의 아라비노자일란 기질 및/또는 불용성 폴리사카리드 분율을 사용하는 생물학적 트랩 및 1차적 농축 전략이 또한 유용하다.
두개의 스크리닝 포맷 (활성 기초 및 서열 기초)이 신규한 자일라나제를 발견하는데 사용되었다. 활성 기초 접근은 아조-자일란(AZO-xylan, Megazyme)과 같은 기질을 사용하여 아가(agar) 플레이트에서 자일라나제 활성에 대한 직접 스크리닝하는것이다. 대안적으로 서열 기초 접근이 사용될 수 있으며, 이는 혼성 및 생물패닝(biopanning)에 대한 프로브(probe)를 디자인하기 위한 생물 정보학 및 분자 생물학에 좌우된다. 예컨대, 미국 특허 6,054,267, 6,030,779, 6,368,798, 6,344,328 참조. 기본적인 생화학적 성질을 위해, 스크리닝으로부터 히트(hit)가 정제되고, 서열화되고, 특성화되고 (예컨대, 퇴적 특이성, 온도 및 pH의 측정), 생물 정보학을 사용하여 분석되고, 서브클로닝되고 그리고 발현된다. 이들 방법은, 반죽 컨디셔닝 및 동물 사료 첨가제 효소를 포함하는 무수한 응용에 유용한 자일라나제에 대한 스크리닝에 사용될 수 있다.
스크리닝으로부터 얻은 효소를 특성화하는데 있어, 반죽 가공 및 베이킹 응용시 예시적 사용이 평가될 수 있다. 특성화는, 예컨대, 기질 특이성 (자일란, 아라비노자일란, CMC, BBG), 온도 및 pH 안정성 및 특정 활성의 측정을 포함할 수 있다. 상업상 구입할 수 있는 효소가 기준점으로서 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 효소는 pH > 7 및 25-35℃에서 명백한 활성을 가지며, 불용성 자일란 상에서 불활성이며, 50-67% 수크로스에서 안정하고 활성이다.
다른 양태에서, 후보 효소의 특성화로부터 사료 첨가제로서의 활용이 평가될 수 있다. 특성화는, 예컨대, 기질 특이성 (자일란, 아라비노자일란, CMC, BβG), 온도 및 pH 안정성, 특정 활성 및 위장관 활성의 측정을 포함할 수 있다. 하나의 양태에서 사료는 단일 위 동물에 대해 디자인되며 그리고 다른 양태에서 사료는 반추 동물에 대해 디자인되었다. 하나의 양태에서, 본 발명의 효소는 pH 2-4 및 35-40℃에서 맹백한 활성, 소화 유체에서 30분 이상의 반감기, 85℃에서 5분 이상의 제제 (완충액 또는 세포에서) 반감기를 가지며 단일 위 동물 사료 첨가제로서 사용된다. 다른 양태에서, 본 발명의 효소는 1 또는 그 이상의 다음의 성질을 가진다: pH 6.5-7.0 및 35-40℃에서 명백한 활성, 반추(rumen) 유체에서 30분 이상의 반감기, 건조 분말로서 안정하고 반추 동물 사료 첨가제로서 사용되는 제제 안정성.
효소는 광범위한 천연 및 합성(unnatural) 기질에 대해 반응성이며, 따라서 임의의 유기 납 화합물을 실질적으로 변형시키는 것이 가능하다. 게다가, 종래의 화학 촉매와 달리, 효소는 상당히 거울상 이성질체-특이적 및 위치-특이적이다. 효소에 의해 나타내어지는 높은 수준의 작용기 특이성은 신규한 화합물을 유도하는 합성 서열에서 각 반응의 트랙을 유지하는 것을 가능하게 한다. 효소는 또한 본래 그들의 생리적 작용과 무관한 많은 다양한 반응을 촉매할 수 있다. 예컨대, 퍼옥시다제는 과산화수소에 의한 페놀의 산화를 촉매한다. 퍼옥시다제는 또한 그 효소의 본래 작용과 관련이 없는 수소화 반응을 촉매할 수 있다. 다른 예는 폴리펩티드의 분해를 촉매하는 자일라나제이다. 유기 용액에서 어떤 자일라나제는 또한 이들 효소의 본래 작용과 무관한 기능으로서 설탕을 아실레이트화 할 수 있다.
본 발명은 효소의 유일한 촉매적 성질을 개발하였다. 화학적 변이에서 생물 촉매 (즉, 정제되거나 또는 조 효소, 무생물 또는 생물 세포)의 사용은 특정 출발 화합물과 반응하는 특정 생물촉매의 인식을 정상적으로 필요로 하는 반면, 본 발명은 다양한 출발 화합물에 존재하는 작용기에 특이적인 반응 조건 및 선택된 생물촉매를 사용한다. 각 생물촉매는 하나의 작용기 또는 여러개의 관련 작용기에 특이적이고 그리고 이 작용기를 함유하는 많은 출발 화합물과 반응할 수 있다. 생물촉매 반응은 하나의 출발 화합물로부터 다수의 유도체를 제조해낸다. 이들 유도체는 다음 라운드의 생물촉매 반응의 대상이 될 수 있으며 유도체 화합물의 2차 집단을 제조해낸다. 생물촉매 유도체화가 각각 반복되어 본래 화합물의 수천가지 유도체가 제조될 수 있다.
효소는 분자의 나머지에 영향을 미치지 않으면서 출발 화합물의 특정 부위에서 반응하며, 그 과정은 종래의 화학적 방법을 사용하여서는 얻기 상당히 어렵다. 이런 높은 수준의 생물촉매적 특이성은 라이브러리 내에서 단일 활성 화합물을 인식하는 수단을 제공한다. 라이브러리는, 소위 "생물 합성 히스토리"라고 불리는 것을 만들어내기 위해 사용되는 일련의 생물촉매 반응으로 특성화된다. 생물학적 활성에 대한 라이브러리의 스크리닝 및 생물 합성 히스토리의 추적은 활성 화합물을 제조해내는 특정 반응 서열을 확인한다. 그 반응 서열이 반복되고 그리고 합성된 화합물의 구조가 결정된다. 이런 인식 모드는, 다른 합성 및 스크리닝 접근과 달리, 고정화 기술을 필요로 하지 않으며 실질적으로 임의의 유형의 스크리닝 분석을 사용하여 용액에서 화합물들이 자유롭게 합성되고 테스트될 수 있다. 작용기에 대한 효소 반응의 높은 수준의 특이성이, 생물 촉매적으로 제조된 라이브러리를 메이크업하는 특정 효소 반응의 "트랙킹(tracking)"을 허용한다는 것이 중요하다.
하루 동안에 생물촉매 반응 및 스크리닝 분석을 수행하는 것을 가능하게 하며 게다가 높은 수준의 정밀도 및 재현성을 보장하는 로보트 자동화를 이용하여 많은 과정의 단계가 수행되었다. 결과적으로, 현재의 화학적 방법으로 수년이 걸리게 되는 유도체 화합물의 라이브러리가 몇 주 만에 이루어질 수 있다. (소형 분자를 포함하는 분자의 변형에 대한 추가의 교시는 PCT/US94/09174 참조).
본 발명은 이하의 실시예를 참조로 더 설명될 것이지만; 다만, 그런 실시예가 본 발명을 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
실시예 1: 플레이트를 기초로 한 엔도글리코시다제 효소 발견: 발현 스크리닝
람다 라이브러리(Lambda Library)의 역가(titer) 측정: 1.0 ㎕의 람다 Zap 발현 증폭 라이브러리 스탁을 600㎕ 대장균(E.coli) MRF' 세포 (OD600=1.0)에 첨가하였다. MRF' 스탁을 10mM MgS04로 희석하였다. 혼합물을 37℃에서 15분 동안 배양하고, 이후 현탁액을 5-6mL의 NZY 탑 아가(top agar)로 50℃에서 이동시키고 부드럽게 혼합하였다. 아가 용액을 즉시 대형 (150mm) NZY 배지 플레이트에 쏟아붓고 그리고 탑 아가를 완전히 고형화되도록 방치하였다 (대략 30분).
플레이트를 돌려놓았다. 플레이트를 39℃에서 8-12시간 동안 배양하였다(플라그의 갯수를 추정하였다. 50,000 pfu/플레이트가 되도록 파지 역가를 측정하였다. 필요하다면 라이브러리 파지의 분취량을 SM 완충액으로 희석하였다.).
기질 스크리닝: 증폭된 라이브러리로부터 얻은 람다 Zap Express (50,000pfu)를 600㎕의 대장균 MRF' 세포 (OD600=1.0)에 첨가하고 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 파지/세포 현탁액을 배양하는 동안, 1.OmL의 목적하는 폴리사카리드 염료-라벨링된 기질 (일반적으로 1-2% w/v)을 50℃에서 5.0mL NZY 탑 아가에 첨가하고 완전히 혼합하였다. (필요할 대까지 용액을 50℃로 유지하였다.) 세포 현탁액을 기질/탑 아가 용액으로 옮기고 부드럽게 혼합하였다. 용액을 대형 (150mm) NZY 배지 플레이트에 즉시 쏟아부었다. 탑 아가를 완전히 고형화되도록 방치하고 (대략 30분), 이후 플레이트를 돌려놓았다. 플레이트를 39℃에서 8-12시간 동안 배양하였다. 플라그 주변의 청정 영역 (헤일로, halo)에 대해 플레이트를 관찰하였다. 코어 플라그와 헤일로를 아가로부터 걷어내고 무균 마이크로 튜브에 이동시켰다. (대형 입구의 200㎕ 피펫 팁으로 목적하는 플라그를 함유하는 아가 플러그 (코어)로부터 제거하는 것이 용이하다. 파지를 500㎕의 SM 완충액에 재현탁시켰다. 20㎕의 클로로포름을 첨가하여 임의의 추가의 세포 성장을 억제하였다.
순수 클론의 분리: 5㎕의 재현탁된 파지 현탁액을 500㎕의 대장균 MRF' 세포 (OD600=1.0)에 첨가하였다. 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 파지/세포 현탁액이 배양되는 동안, 600㎕의 목적하는 폴리사카리드 염료-라벨링된 기질 (일반적으로 1-2% w/v)을 3.0mL NZY 탑 아가에 50℃에서 첨가하고 완전히 혼합하였다. (필요할 때까지 용액을 50℃로 유지하였다.) 세포 현탁액을 기질/탑 아가 용액으로 옮기고 부드럽게 혼합하였다. 용액을 소형 (90mm) NZY 배지 플레이트에 즉시 쏟아부었으며 탑 아가를 완전히 고형화되도록 방치하고 (대략 30분), 이후 플레이트를 돌려놓았다. 플레이트를 39℃에서 8-12시간 동안 배양하였다. 단일 플라그 (순수 클론) 주변의 청정 영역 (헤일로)에 대해 플레이트를 관찰하였다. (만약 단일 플라그가 분리될 수 없다면, 역가를 맞추고 파지 현탁액을 재플레이팅한다.) 파지를 500㎕의SM 완충액에 재현탁시켰으며 20㎕의 클로로포름을 첨가하여 임의의 추가의 세포 성장을 억제하였다.
순수 클론의 절단: 실온에서 2 내지 3시간 동안 또는 4℃에서 밤새 배양되도록 순수 파지 현탁액을 방치하였다. 100㎕의 순수 파지 현탁액을 200㎕의 대장균 MRF' 세포 (OD600=1.0)에 첨가하였다. 1.O㎕의 ExAssist 헬퍼 파지 (＞ 1 × 106pfu/mL; Stratagene)을 첨가하였다. 현탁액을 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 3.0 mL의 2 × YT 배지를 세포 현탁액에 첨가하였다. 37℃에서 2-2.5시간 동안 진동시키면서 배양하였다. 튜브를 70℃로 20분 동안 이동시켰다. 50-100 ㎕의 파지미드(phagemid) 현탁액을 200㎕의 대장균 Exp 505 세포 (OD600=1.0)를 함유하는 마이크로 튜브로 이동시켰다. 현탁액을 37℃에서 45분 동안 배양하였다. 100㎕의 세포 현탁액을 LBkan 50배지 (카나마이신 50㎍/mL을 갖는 LB 배지) 상에 플레이팅하였다. 현탁액을 37℃에서 8-12시간 동안 배양하였다. 콜로니에 대해 플레이트를 관찰하였다. 성장하는 임의의 콜로니는 순수 파지미드를 함유한다. 콜로니를 들어올리고 소형 (3-lOmL) 액체 배양물로 8-12시간 동안 성장시켰다. 배양 배지는 LBkan 50이다.
활성 검증: 1.OmL의 액체 배양물을 무균의 마이크로 팁으로 옮겼다. 13200 rpm (16000 g)에서 1분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고 200㎕의 인산 완충액 pH 6.2를 첨가하였다. 얼음 상에서 마이크로 팁을 사용하여 5 내지 10초 동안 초음파처리하였다. 200㎕의 적절한 기질을 첨가하고, 부드럽게 혼합하고 37℃에서1.5-2시간 동안 배양하였다. 단지 버퍼와 기질만을 함유하는 음성 대조군을 또한 작동시켰다. 1.OmL의 무수 에탄올 (200도)을 현탁액에 첨가하고 혼합하였다. 13200 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액의 색을 관찰하였다. 착색량은 다양할 수 있지만, 임의의 튜브에 대해서도 활성에 대해 양성으로 고려되는 대조군보다 더 착색되었다. 만약 목적하거나 또는 필요하다면 이 단계에서 분광분석기가 사용될 수 있다. (아조-자일란, Megazyme, 590nm에서 읽음).
몇가지 라이브러리로부터 얻은 순수 클론의 RFLP: 1.OmL의 액체 배양물을 무균의 마이크로 튜브로 옮겼다. 13200 rpm (16000 g)에서 1분 동안 원심분리하였다. 플라스미드 분리를 위한 QIAprep 스핀 미니 키트 (Qiagen) 프로토콜이 이어졌으며 용출 완충액으로 40㎕의 성수가 사용되었다. 10㎕의 플라스미드 DNA를 무균의 마이크로 튜브로 옮겼다. 1.5 ㎕의 완충액 3 (New England Biolabs), 1.5㎕ 100× BSA 용액 (New England Biolabs) 및 2.0㎕ 성수를 첨가하였다. 여기에 1.O㎕ Not 1 및 1.0㎕ Pst 1 제한 엔도뉴틀레아제 (New England Biolabs)를 첨가하였다. 1.5시간 동안 37℃에서 배양하였다. 3.0㎕의 6× 로딩 버퍼 (Invitrogen)를 첨가하였다. 15㎕의 분해된 시료를 1.0% 아가로스 젤 상에 1-1.5시간 동안 120 볼트에서 전개시켰다. 젤 이미지 출력기로 젤을 관찰하였다. 상이한 분해 패턴으로 모든 클론 상에서 서열 분석을 수행하였다.
표 6은 본 발명의 예시적 효소의 다양한 특성을 기재한 것이다.
* 기질로서 AZO-AZO-자일란을 사용하는 초기 속력에 의해 결정된 최적 pH 또는 온도
** 효소가 명백한 활성 (대략 ＞ 50%)을 유지하는 열 안정성, 시간
*** 반죽 컨디셔닝
**** 동물 사료 응용에 대한 내열성 발달에 대한 GSSMTM페어런트
***** -공지의 지식을 기초로- 낮은 pH 활성의 증가하도록 이루어진 N35D 돌연변이 - 돌연변이 효소의 상대적 활성이 pH 4에서 현저하게 증가하였다
****** 반죽 컨디셔닝
실시예 2: 내열성 돌연변이체에 대한 GSSM TM 스크린
이하의 실시예는 내열성 효소에 대한 예시적 스크리닝 방법을 기재한 것이다.
마스터 플레이트: 96 웰 플레이트를 라벨링함으로써 및 200 ㎕ LB Amp100을 각 웰로 분취함으로써 콜로니 수확기(picker)에 대한 플레이트를 제조하였다. (96 웰 플레이트 당 ~20ml 필요). 수확기로부터 플레이트를 되돌려보낸 이후, 플레이트 A로부터 6열로부터 배지를 제거하였다. 서열 번호 189의 배양물로 대치하였다. 37℃ 습윤 인큐베이터에서 밤새 방치하였다.
분석 플레이트: 신선한 96 웰 플레이트 내에서 배양물을 찍어내었다 (200㎕/웰 LB Amp 100). 플라스틱 커버를 제거하고 기체 투과성 밀봉으로 대치하였다. 습윤 인큐베이터에서 밤새 방치하였다. 밀봉을 제거하고 플라스틱 뚜껑으로 대치하였다. 배양물을 테이블 상에서 하향 회전시키고 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 종이 타올 상에서 전환시킴으로써 상청액을 제거하였다. 45㎕ Cit-Phos-KCl 버퍼 pH 6을 각 웰 내로 분취하였다. 플라스틱 뚜껑을 알루미늄 플레이트 밀봉으로 대치하였다. 롤러를 사용하여 우수한 밀봉을 얻었다. 세포를 플레이트 진동기에서 6-7 레벨로 ~30초 동안 재현탁시켰다.
96 웰 플레이트를 80℃ 인큐베이터에 20분 동안 위치시켰다. 겹치지 않게 한다. 이후, 즉시 플레이트를 제거하고 얼음물로 몇초 동안 냉각시켰다. 알루미늄 밀봉을 제거하고 플라스틱 뚜껑으로 대치하였다. 30㎕의 2% 아조-자일란을 첨가하였다. 플레이트 진동기 상에 올리기 이전에 혼합하였다. 37℃에서 습윤 인큐베이터에서 밤새 배양하였다.
200㎕ 에탄올을 각 웰에 첨가하고 수회 피펫을 들어올렸다 내렸다 하면서 혼합하였다. 대안으로서 각 회마다 팁을 교환하고, 에탄올 세척으로 세정하고 종이 타올로 닦아냄으로써 건조시켰다. 플레이트를 3000 rpm에서 10분 동안 회전시켰다. 신선한 96 웰 플레이트에서 100㎕의 상청액을 제거하였다. OD590을 읽었다.
실시예 3: 내열성 돌연변이체의 히트 검증을 위한 GSSM TM 분석
이하의 실시예는 내열성 효소를 분석하는 예시적 방법을 기재하고 있다.
이중의 96 웰 플레이트 내에서 배양물을 찍어내거나 또는 들어올렸다 (200㎕/웰 LB Amp 100). 플라스틱 커버를 제거하고 기체 투과성 밀봉으로 대치하였다. 습윤 인큐베이터에서 밤새 방치하였다. 밀봉을 제거하고 플라스틱 뚜껑으로 대치하였다. 고형 아가로 클론을 찍어내었다. 배양물을 테이블 상에서 하향 회전시키고 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 종이 타올 상에서 전환시킴으로써 상청액을 제거하였다. 25㎕ BPER/리소자임/DNase 용액 (이하 참조)을 각 웰 내로 분취하였다. 세포를 플레이트 진동기에서 6-7 레벨로 ~30초 동안 재현탁시켰다.
얼음 상에서 15분 동안 배양하였다. 20㎕의 Cit-Phos-KCl 버퍼 pH 6을 각 웰내로 첨가하였다. 플라스틱 뚜껑을 알루미늄 플레이트 밀봉으로 대치하였다. 롤러를 사용하여 우수한 밀봉을 얻었다. 세포를 플레이트 진동기에서 6-7 레벨로 ~30초 동안 혼합하였다.
하나의 96 웰 플레이트를 80℃ 인큐베이터에 다른 것은 37℃에서 20분 동안 위치시켰다. 겹치지 않게 한다. 즉시 플레이트를 제거하고 얼음물로 몇초 동안 냉각시켰다 (필요하다면 대형 플라스틱 트레이를 사용한다). 알루미늄 밀봉을 제거하였다. 30㎕의 2% 아조-자일란을 첨가하였다. 플라스틱 기체 투과성 밀봉으로 밀봉하였다. 플레이트 진동기 상에 올리기 이전에 혼합하였다. 37℃ 및 80℃ 플레이트 세트를 습윤 인큐베이터에서 37℃에서 2시간 동안 나머지는 4시간 동안 배양하였다.
배양 이후, 플레이트를 ~5분 동안 실온에 방치시켰다. 200㎕ 에탄올을 각 웰에 첨가하고 수회 피펫을 들어올렸다 내렸다 하면서 혼합하였다. 각 회마다 팁을 교환하는 대신, 에탄올 세척으로 세정하고 종이 타올로 닦아냄으로써 건조시켰다. 플레이트를 3000 rpm에서 10분 동안 회전시켰다. 다만, 각 클론에 대해 새로운 세트의 팁을 사용하였다. 3000rpm에서 10분 동안 플레이트를 회전시켰다. OD590을 읽었다.
BPER/리소자임/DNase 용액 (총 4.74 mL):
4.5 mL BPR
200 ㎕ 10 mg/mL 리소자임 (pH 6 Cit-phos-버퍼로 신선하게 만들어짐)
40 ㎕ 5 mg/mL DNase I (pH 6 Cit-phos-버퍼로 신선하게 만들어짐)
실시예 4: 기질로서 밀 아라비노자일란을 사용한 자일라나제 분석
이하의 실시예는, 본 발명의 범위 내에서 예컨대, 효소를 측정하기 위해 사용될 수 있는 예시적 자일라나제 분석을 기재하고 있다.
SEQ ID NOS: 11, 12, 69, 70, 77, 78, 113, 114, 149, 150, 159, 160, 163, 164, 167, 168, 181, 182, 197, 및 198이 pH 8 (Na-인산 버퍼) 및 70℃에서 밀 아라비노자일란을 기질로서 사용하는 분석의 대상이 되었다. 효소는 표 7에 기재된 바와 같이 특성화되었다.
* 각 시료에 1 mL의 물을 첨가하는 것에 기초함.
단위는 환원당 분석을 기초로 분 당 방출된 μ몰 자일로스이다.
실시예 5: 본 발명의 예시적 자일라나제의 제조
이하의 실시예는 "9×" 변이체 또는 돌연변이체 (서열 번호 377로 기재된 핵산, 서열 번호 378로 기재된 폴리펩티드 서열)로서 표시되는 유전자 부위-포화 돌연변이 유도 (GSSMTM) 기술을 사용하여 본 발명의 예시적 자일라나제의 제조를 기재하고 있다.
(서열 번호 189에 의해 암호화된) 예시적 서열 번호 190, "야생형" 자일라나제에서 점 돌연변이의 포괄 라이브러리(comprehensive library)를 제조하는데 있어 GSSMTM이 사용되었다. 전술한 자일라나제 내열성 스크린은 야생형 효소에 비해 향상된 내열성을 갖는 9개의 단일 부위 아미노산 돌연변이를 확인시켜 주었다 (도 6A) (D8F, Q11H, N12L, G17I, G60H, P64V, S65V, G68A & S79P) (80℃에서 20분 동안 이하의 열 자극으로 측정됨). 야생형 효소 및 모든 9개의 단일 부위 아미노산 돌연변이체는 대장균에서 생성되었으며 N-말단 헥사히스티딘 택(tag)을 이용하여 정제되었다. 택에 의한 활성의 차이는 감지할 수 없었다.
도 6은 "변이체 9×", 또는, (서열 번호 189에 의해 암호화되는) 예시적 서열 번호 190 "야생형" 효소의 유전자 부위 포화 돌연변이 유도 (GSSMTM)에 의해 발생된 것으로서 (서열 번호 377에 의해 암호화되는) 서열 번호378로 기재된 것인 9개의 단일 부위 아미노산 돌연변이체를 도시하고 있다. 도 6A는 "야생형" 유전자 (서열 번호 189에 의해 암호화된 서열 번호 190)의 내열성 점 돌연변이에 대한 위치, 번호 및 아미노산 변화를 도시하는 개략도이다. 유전자에서 모든 아미노산 위치마다 전체 64 코돈의 라이브러리가 생성되었으며 (~13,000 돌연변이체) 내열성이 증가된 돌연변이체를 스크리닝하였다. 9개의 단일 부위 돌연변이체를 하나의 효소로 조합함으로써 "9×" 변이체가 생성되었다. 각 돌연변이체 효소에 대해 대응하는융점 온도 전이 중간지점 (Tm)은 DSC에 의해 측정되었으며 "9×" (서열 번호 378) 변이체를 오른쪽에 보였다. 도 6B는 폴딩되지 않은 "야생형" (서열 번호 190) "9×" (서열 번호 378)를 도시하였다. "변이체/돌연변이체" 효소가 DSC에 의해 주사 속도 1℃/min으로 모니터링되었다. 베이스라인을 감안한 DSC 데이타가 단백질 농도에 대해 표준화되었다.
자일라나제 활성 분석
550㎕의 CP (시트레이트-포스페이트) 버퍼, pH 6.0 지시된 온도에서 400㎕의 2% 아조-자일란을 기질로써 사용하여 효소 활성이 측정되었다. pH의 함수로서 활성의 측정은 50 mM Britton 및 Robinson 버퍼 용액 (pH 3.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0 및 9.0)을 사용하여 측정되었으며 이는 0.1 M 인산 용액, 0.1M 붕산 및 0.1 M 아세트산을 혼합하으로써 이어서 1 M 수산화 나트륨으로 pH를 조정함으로써 제조되었다. 50㎕의 0.1 mg/ml 정제된 효소를 첨가함으로써 반응이 개시되었다. 0부터 15분까지시간 지점을 취하였으며 여기서 50 ㎕의 반응 혼합물을 200 ㎕의 침전 용액 (100% 에탄올)에 첨가하였다. 모든 시간 지점을 다 취한 후에, 시료를 혼합하고, 10분 동안 배양하고 4℃ 3000 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액 (150 ㎕)을 신선한 96 웰 플레이트로 분취하고 590 nm에서 흡광도를 측정하였다. A590값을 시간에 대해 플롯하고 직선의 기울기로부터 초기 속력을 측정하였다.
시차주사 열량법 (Differential Scanning Calorimetry, DSC).
데이타 수집을 위해 DSCRun 소프트웨어 패키지, 분석을 위해 CpCalc, 마이크로와트로부터 몰 열용량으로의 전환을 위해 CpConvert 그리고 계산을 위해 CpDeconvolute를 사용하는 Model 6100 Nano II DSC 장비 (Calorimetry Sciences Corporation, American Fork, UT)를 사용하여 열량법이 수행되었다. 20 mM 인산 칼륨 (pH 7.0) 및 100 mM KCl 중의 1mg/ml 재조합 단백질로 주사 속도 1℃/min으로 분석이 수행되었다. 가열에 의한 용액의 가능한 탈기체화를 막기 위해 전체 DSC 실험 동안 5 atm의 일정한 압력이 유지되었다. 버퍼로 충진된 두 세포로 실험 이전에 일반적으로 장비 베이스라인을 기록하였다. 최초 작동의 냉각 이후 즉시 열량계 세포에서 용액을 재가열함으로써 열 유도 전이의 가역성이 테스트되었다.
내열성 측정.
20 mM 인산 칼륨 (pH 7.0) 및 100 mM KCl 중에서 내열성에 대하여 전체 효소를 80℃에서 분석하였다. 효소를 80℃에서 0,5, 10 또는 30분 동안 얇은-벽 튜브에서 가열하였으며 얼음 상에서 냉각하였다. 아조-자일란을 기질로써 활성 측정에 대해 전술한 분석을 사용하여 잔류 활성이 측정되었다.
폴리사카리드 지문(Fingerprinting)
탄수화물 젤 전기영동(PACE)을 사용하는 폴리사카리드 분석에 의해 폴리사카리드 지문이 측정되었다. 비치우드(Beechwood) 자일란 (0.1 mg/mL, 100 ㎕, Sigma, Poole, Dorset, UK) 또는 자일로올리고사카리드 (1 mM, 20 ㎕, Megazyme, Wicklow, Ireland)를 총 부피 250 ㎕에서 16시간 동안 효소 (1-3 ㎍)로 처리하였다. 반응을 0.1 M 암모늄 아세테이트 pH 5.5로 완충시켰다. 효소, 폴리사카리드/올리고사카리드 또는 라벨링 시약 중에 임의의 불특정 화합물을 확인하기 위해, 기질 또는 효소가 없는 대조군으로 동일한 조건 하에서 수행하였다. 20분 동안 끓임으로써 반응을 정지시켰다. 각 조건에 대해 적어도 2회 개별적으로 분석을 수행하였다. ANTS (8-아미노나프탈렌-1,3,6-트리설폰산, Molecular Probes, Leiden, The Netherlands)를 이용하는 유도체화, 전기영동 및 이미지화를 기재된 바대로 수행하였다 (Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. and Dupree, P. (2002) Anal. Biochem. 300, 53-68).
적합성 계산(Fitness Calculation).
변성 온도 전이 중간지점 (Tm)의 증가 및 모든 변이체를 가로지르는 각 파라미터에서 가장 큰 차이에 대하여 상대적인 효소 활성의 증가 (또는 감소)를 동등하게 비중을 둠으로써 주어진 효소 변이체에 대한 적합성 (Fn), n이 계산되었다: Fn= FTn+ FVn이고, 여기서 FTn= 변이체의 Tm적합성 팩터이고 그리고 FVn= 변이체의 활성 적합성 팩터이다. 각각 (Tm및 활성)의 적합성 팩터는 Tm또는 모든 변이체를 가로지르는 속도에서 가장 큰 차이에 상대적이다. FTn= (Tm- TmL) / (TmH- TmL)이고 여기서 Tmn은 주어진 변이체, n에 대한 Tm이고, 그리고 TmL은 모든 변이체를 가로지르는 가장 낮은 Tm이고 그리고 TmH는 모든 변이체를 가로지르는 가장 높은 Tm이고 FVn= (Vn- VL) / (VH- VL)이고 여기서 Vn은 주어진 변이체, n에 대한 상대 속도이고, 그리고 VL은 모든 변이체를 가로지르는 가장 낮은 속도이고 그리고 VH는 모든 변이체를 가로지르는 가장 높은 속도이다.
GSSM TM 방법에 의한 진화.
예시적 본 발명의 자일라나제 서열 번호 378 (서열 번호 377에 의해 암호화되는)를 포함하는 예시적 본 발명의 자일라나제 서열 번호 190 (서열 번호 189에 의해 암호화되는) 중에서 점 돌연변이의 포괄 라이브러리를 제작하는데 있어 GSSMTM기술이 사용되었다. 전술한 자일라나제 내열성 스크린은, 80℃에서 20분 동안 열 자극에 이어 측정된 것으로써, 예시적 "야생형" 효소 서열 번호 190 (서열 번호 189에 의해 암호화되는)에 비해 향상된 내열성을 갖는 9개의 단일 부위 아미노산 돌연변이 (도 6A), D8F, Q11H, N12L, G17I, G60H, P64V, S65V, G68A & S79P를 확인시켜주었다. 야생형 효소 및 모든 9개의 단일 부위 아미노산 돌연변이체는 대장균에서 생성되었으며 N-말단 헥사히스티딘 택을 이용하여 정제되었다. 택에 의한 활성의 차이는 감지할 수 없었다.
효소 활성에 대한 단일 아미노산 돌연변이의 효과를 측정하기 위해, 9개의 모든 돌연변이체를 정제하였으며 그들의 자일라나제 활성 (야생형 최적 온도, 70℃에서 초기 속도)이 예시적 서열 번호 190 "야생형" 효소에 대해 비교되었다. 야생형 (초기 속도를 1.0으로 표준화됨)에 대해 D8F, N12L, G17I, G60H, P64V, S65V G68A 및 S79P 돌연변이체 (상대적 초기 속도 각각 0.65, 0.68, 0.76, 1.1, 1.0, 1.2, 0.98 및 0.84)의 효소 활성이 비교되었으며 이는 이들 돌연변이가 그들의 효소 활성을 현저하게 바꾸지 않는 것을 확인시켜 주었다. 초기 속도는 3 또는 그 이상의 시간에서 측정되었으며 그리고 편차는 전형적으로 10 % 이하였다. 이들 8개의돌연변이체와는 대조적으로, 최선 내열성의 단일 부위 돌연변이체, Q11H (상대적 초기 속도 0.35)에 대해 효소 활성에 있어 현저한 감소가 관찰되었다.
"야생형" 및 내열성 단일 부위 아미노산 돌연변이체 효소의 융점 온도(T m ).
정제된 서열 번호 190 "야생형" 자일라나제 및 9개의 내열성 단일 부위 아미노산 돌연변이체가 시차 주사 열량법 (DSC)을 사용하여 분석되었다. 그것의 열 변성에 대한 DSC 트레이스에서 어깨 부분에 의해 증명되는 것으로서 야생형 효소에 대해 응집이 명백하다, 도 6B 참조. 진화된 돌연변이체 효소는 응집의 증거를 보이지 않았다. 모든 효소에 대해, 열 유도 변성은 비가역적이며 시료의 두번째 주사에서 식별할 수 있는 전이가 관찰되지 않았다. 변성의 비가역성 때문에, 단지 겉보기 Tm(융점 온도)만이 계산될 수 있다 (예컨대, Sanchez-Ruiz (1992) Biophys. J. 61: 921-935; Beldarrain (2000) Biotechnol. Appl. Biochem. 31: 77-84에 기재된 바와 같이). 야생형 효소의 Tm은 61℃이며 모든 점 돌연변이체에서 증가하였으며 64℃ 내지 70℃ 범위이었다 (도 6A). 야생형에 대해 Q11H 돌연변이가 가장 큰 증가 (Tm= 70℃)를 도입하였으며 이어서 P64V (69℃), G17I (67℃) 및 D8F (67℃)이었다.
"9×" 조합 GSSMTM예시적 효소 서열 번호 378
부위-지향 돌연변이 유도 (도 6A)에 의한 9개의 내열성 상승 돌연변이체의 단일 부위 변화를 조합함으로써 "9×" 효소 (서열 번호 378)가 구축되었다. "9×" (서열 번호 378) 효소가 대장균에서 발현되었으며 균질하도록 정제되었다. 융점 온도를 측정하기 위해 DSC가 수행되었다. "9×" 효소의 Tm은 서열 번호 190, "야생형" 효소보다 34도 높았으며, 이는 그것의 열적 안정성의 엄청난 전이를 보여주는 것이다 (도 6B).
효소의 생화학적 성질에 대한 조합된 돌연변이 및 융점 온도의 상승의 효과를 평가하기 위해, pH 및 온도 프로파일이 구축되었으며 서열 번호 190, "야생형" 효소와 비교되었다. 도 7은 "야생형" 및 "진화된" 9× 돌연변이체 효소의 생화학적 특성을 도시하고 있다. 도 7A는 야생형 및 진화된 9× 돌연변이체 효소에 대한 활성의 pH-의존성을 도시하고 있다. 자일라나제 활성이 37℃ 각 pH에서 측정되었으며 초기 속력(rate)을 측정하기 위해 초기 속도(velocity)가 590 nm에서의 흡광도에 대해 플롯되었다. 도 7B는 야생형 및 진화된 9× 돌연변이체 효소에 대한 활성의 온도-의존성을 도시하고 있다. 야생형 및 진화된 9× 돌연변이체 효소의 최적 온도는 25-100℃ 온도 범위에서 pH 6.0에서 측정되었으며 5분에 걸친 초기 속도를 기초로 한다. 도 7C는 야생형 및 진화된 9× 돌연변이체 효소의 열 안정성을 도시하고 있다. 야생형 및 진화된 9× 돌연변이체 효소의 활성의 열 의존도는 먼저 효소를 각각의 지시된 온도에서 5분 동안 가열함으로써 이어서 실온으로 냉각함으로써 그리고 잔류 활성 (37℃, pH 6.0에서 초기 속도)을 측정함으로써 측정되었다. 모든 실험에서 초기 속도는 2 또는 그 이상 측정되었으며 편차는 10 % 이하이었다.
서열 번호 190 및 서열 번호 378 ("9×" 돌연변이체) 효소는 pH 5와 6 사이에서 가장 높은 활성으로 비교할만한 pH/활성 프로파일을 갖는다 (도 7A). 두 효소는 70℃에서 최적의 유사한 초기 속도/온도를 갖지만, 그렇지만, 서열 번호 190, "야생형" 효소가 더 낮은 온도 (25-50℃)에서 더 높은 활성을 가지며, 서열 번호 378 ("9×" 돌연변이체)은 기질의 존재하에서 100℃까지 그것의 활성의 60% 이상을 유지한다 (초기 속도에 의해 결정됨) (도 7B). 서열 번호 190, "야생형" 효소의 활성은 70℃ 이상의 온도에서 검출할 수 없엇다.
효소 내열성에 대한 9개의 조합된 돌연변이의 효과를 측정하기 위해, 잔류 활성이 측정되었으며 서열 번호 190, "야생형" 효소에 대해 비교되었다. 각 온도 (37, 50, 60, 70, 80 및 90℃)에서 5분 동안 열 자극에 의해 이어서 37℃에서 활성 측정으로 잔류 활성이 측정되었다. 서열 번호 190은 70℃ 이상에서 완전히 불활성화되었으며 진화된 9× 돌연변이체는 70, 80 및 심지어 90℃로 가열한 이후에도 현저한 활성을 나타내었다 (도 7C). 또한, 온도가 증가함에 따라 비록 야생형 효소의 활성이 감소하였지만, 9× 변이체는 온도를 60℃까지 가열함으로써 어느정도 활성화되었다.
유전자 재조립(GeneReassembly) TM 기술을 이용한 조합 GSSM TM 변이체 제조.
9개의 단일 부위 아미노산 돌연변이체의 조합 변이체를 확인하기 위해 추가적으로 구축된 서열 번호 378 ("9×" 변이체)에 대해 최대 내열성 및 활성이 비교되었으며, 모든 가능한 돌연변이체 조합 (29)의 유전자 재조합 라이브러리 (미국 특허 6,537,776)가 구축되었으며 스크리닝되었다. 확인된 9개 돌연변이의 33개의 독특한 조합의 스크리닝 기준으로써 내열성을 사용하는 것이 본래 9× 변이체인 것으로 확인되었다. 진화된 9×보다 더 높은 활성/발현을 갖는 변이체를 선택하기 위해 2차적 스크린이 수행되었다. 이런 스크린은, 본래 단일 돌연변이의 6과 8 사이에서 다양한 조합으로 가공되는 서열을 갖는 10 변이체를 제조해 내었으며, 도 8A에 도시되었다. 도 8은 유전자 재조립TM기술을 사용하여 확인된 조합 변이체를 도시하고 있다. 도 8A는 9개의 GSSMTM점 돌연변이의 모든 가능한 조합의 유전자 재조립TM라이브러리를 도시하고 있으며 이는 향상된 내열성 및 활성을 갖는 변이체에 대해 구축되고 스크리닝된 것이다. 9× 변이체를 포함하여 11개의 변이체가 얻어졌다. 도에 보여지는 바와 같이, 변이체는 점 돌연변이의 다양한 조합으로 6, 7, 8, 또는 9를 갖는다. 각 변이체의 DSC에 의해 측정된 대응하는 융점 온도 전이 중간지점 (Tm)을 오른쪽에 보였다. 도 8B는 최적 온도 (70℃) 및 pH 6.0에서 야생형에 비교된 6×-2 및 9× 변이체의 상대적 활성을 도시한 것이다 (5분 시간 지점에 걸쳐 초기 속도가 측정되었다). 에러 바는 3회 측정에 대한 초기 속도의 범위를 나타낸다.
각 조합 변이체의 융점 온도 (Tm)는 야생형보다 적어도 28℃ 이상이었으며 (도 8A) 그리고 모든 재조립 변이체는 9× 효소보다 상대적으로 더 높은 활성을 보였다. 하나의 변이체, 특히 6×-2의 활성은, 야생형 효소보다 컸으며 9× 효소보다 현저히 컸다 (1.7×) (도 8B). 재조립 변이체의 서열 비교는 적어도 6개의, 증가된 열 안정성 (＞ 20도)이 요구되었던 돌연변이를 확인시킨다. 초기 열 안정성 스크린에서 발견된 모든 33개의 독특한 변이체는 그들의 내열성에 중요한 두개의 Q11H 및G17I 돌연변이 표시를 포함하였다.
야생형 및 변이체 폴리사카리드 생성물 지문의 분석.
"야생형, "6×-2 및 9× 변이체에 의해 제조된 생성물이 탄수화물 젤 전기영동 (PACE)을 사용하는 폴리사카리드 분석에 의해 비교되었다. 자일라나제에 의한 가수분해에 대해 상이한 기질 (올리고사카리드 및 폴리사카리드)이 시험되었다. 테스트된 3 자일라나제의 소화 생성물은 도 9에 도시된 바와 같이 매우 유사하였다. 모든 3 효소가 (Xyl)6및 (Xyl)5를, 주로 (Xyl)3및 (Xyl)2로 가수분해하고, 그리고 (Xyl)4를 (Xyl)2로 가수분해하였다 (도 9A). (Xyl)3의 (Xyl)2및 Xyl로의 단지 소량의 가수분해가 관찰되었으며 이는 (Xyl)3이 효소에 대한 상대적으로 나쁜 기질임을 의미한다. (Xyl)2상에서는 활성이 검출되지 않았다. 글루쿠로노실 잔기를 함유하는 비치우드 자일란은 모든 세가지 효소에 의해 주로 (Xyl)2및 (Xyl)3으로 가수분해되지만, 올리고자일란 밴드 사이로 이동된 다른 밴드가 검출되었다 (도 9B). PACE 분석에서, 각 올리고사카리드는 당 조성물 및 중합화 정도에 좌우되는 특정 이동을 가지며 (Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. and Dupree, P. (2002) Anal. Biochem. 300, 53-68), 따라서, 이들 밴드는 올리고글루쿠로노자일란에 유사하게 대응한다. 이후, 진화된 효소는 "야생형" 효소의 기질 특이성을 보유한다.
전술한 바와 같이, 도 9는 PACE에 의해 측정된 것으로서 (서열 번호 189에 의해 암호화되는) "야생형" 서열 번호190, 6×-2 (서열 번호 379에 의해 암호화되는 서열 번호380) 및 서열 번호 378 ("9×" 돌연변이체) 효소 변이체의 생성물 지문을 도시한 것이다. 도 9A는 "야생형" 및 변이체 효소에 의한 올리고자일란 (Xyl)3, (Xyl)4, (Xyl)5및 (Xyl)6의 가수분해 이후 얻어진 지문을 도시하고 있다. 대조 레인은 효소의 부재시 분석 조건 하에서 배양된 올리고사카리드를 함유한다. 도 9B는 야생형 및 변이체 효소에 의한 비치우드 자일란의 가수분해 이후 얻어진 지문을 도시하고 있다. 표준은 (Xyl)2, (Xyl)3, (Xyl)4를 함유한다. 모든 분석은 37℃ 및 pH 5.5에서 수행되었다.
다수의 산업상 시장 응용시 제조 양립가능성에 대해 최적인 높은 활성, 열적 안정한 자일라나제를 신속하게 제조해내기 위해 실험실 유전자 진화 전략의 조합이 사용되었다. 예시적 "야생형" 자일라나제 (서열 번호 189에의해 암호화되는) 서열 번호 190의 전체 서열을 스캔하는데 그리고 내열성을 향상시키는 9개의 점 돌연변이를 확인하는데 있어 GSSMTM방법론이 사용되었다. 비록 그것이 효소의 가수분해 생성물 프로파일에 대해서는 감지할 수 있는 효과가 없지만, 도 9에 도시된 바와 같이, 단백질 서열에 9개 돌연 변이의 첨가는 서열 번호 190 ("야생형")의 최적 온도 70℃에서의 효소 특이적 활성의 적당한 감소를 초래하였다, 도 9B 참조. 유전자 재조립TM방법을 사용하여 9개의 단일 부위 아미노산 돌연변이체의 조합 라이브러리를 생성시켰으며, 활성에 있어서 이런 감소가 극복되었다. "9×" 변이체 보다 더 나은 활성을 갖는 10개의 열 안정성 변이체 (Tm89℃와 94℃ 사이)가 유전자 재조립TM라이브러리 스크리닝으로부터 발견되었다. Tm90℃를 가지며, 야생형을 능가하는 효소 특이적 활성 및 생성물 지문이 바뀌지 않았으며 서열 번호 190 ("야생형")에 비해, (SEQID NO: 380, 서열 번호 379에 의해 암호화되는) 6×-2 변이체가 특히 눈에 띈다. 우리의 지식으로 이들 변이체에 대해 얻어진 Tm이동은 진화 기술에 대한 응용으로부터 가장 큰 증가로 보고된 것이다.
서열 번호 380 (6×-2 변이체)는, 서열 번호 190 ("야생형"): D8F에 비해 다음의 변화를 포함한다, Q11H, G17I, G60H, S65V 및 G68A. 서열 번호 379는, "야생형" 서열 번호 189에 비해 다음의 뉴클레오티드 변화를 포함한다: 뉴클레오티드 위치 22 내지 24가 TTC, 뉴클레오티드 위치 31 내지 33이 CAC, 뉴클레오티드 위치 49 내지 51이 ATA, 뉴클레오티드 위치 178 내지 180이 CAC, 뉴클레오티드 위치 193 내지 195가 GTG, 뉴클레오티드 위치 202 내지 204가 GCT.
목적하는 표현형에 대한 점 돌연변이체의 첨가에 대한 조합 혼합의 유효성을 평가하기 위해, 효소 활성 및 열안정성에서 변화로부터 기여를 조합한 적합성 파라미터가 각 돌연변이체에 대해 계산되었다. 본원에 기재된 용어 적합성은 다른 효소에 비교될 수 있는 객관적인 측정은 아니지만, 이 특정 자일라나제를 향한 진화에 대한 성공의 측정을 허용하는 용어이다. 효소 적합성, F는 이 세트의 변이체에 대해 Tm및 효소 활성에서 동등한 비중을 차지하는 변화에 의해 계산되기 때문에, 최대 허용 적합성 값은 2 이다 (FT≤ 1 및 FV≤ 1, 상기 참조). 달리 말하면, 만약최대 활성을 갖는 변이체가 또한 가장 높은 Tm을 갖는다면, 그것의 적합성 값은 2가 될 것이다. 적합성 값이 거의 2인 경우 (도 10B 참조), 6×-2 변이체 (서열 번호 380, 서열 번호 379에 의해 암호화되는)가 열 안정성 및 효소 활성의 가능한 가장 최선의 조합을 갖는 것에 가깝다. 가장 높은 적합성 값을 제공하는 단일 부위 돌연변이는 S65V이다. 비록 S65V 돌연변이체의 Tm이 Q11H 돌연변이체의 것보다 더 낮지만 (각각 66℃ 대 70℃), 그것의 특정 활성이 야생형에 비해 감소되지 않았기 때문에 그것은 더 높은 적합성 값을 갖는다.
도 10A는 GSSMTM진화에 의해 얻어진 "야생형"에 대한 열 안정성 (Tm으로 대표되는) 향상의 레벨을 도시하는 개략도이다. 가장 높은 열 안정성을 갖는 단일 부위 아미노산 돌연변이체 및 조합 변이체 (각각 Q11H 및 "9×" (서열 번호 378))를 야생형에 비교하여 보였다. 도 10B는 GSSMTM및 유전자 재조립TM기술을 조합함으로써 얻어진 효소의 "적합성 다이아그램" 향상을 도시한 것이다. 화학식 F = FT + FV를 사용하여 적합성이 정의되었으며 여기서 적합성 (F)은 전술한 내열성 적합성 (FT) 및 상대적 활성 적합성 (FV)을 동등하게 비중을 둠으로써 계산된다. 가장 큰 적합성 (S65V)을 제공하는 점 돌연변이가 보였다. 모든 9개의 점 돌연변이를 조합하는 것은 또한 적합성이 향상되었다 (서열 번호 378, "9×"변이체). 그렇지만, 적합성에 있어서 가장 큰 향상은 최선의 변이체, 6×-2를 얻기 위한 GSSMTM및 유전자 재조립TM방법을 조합함으로써 얻어졌다 (서열 번호380).
유전자 재조립TM방법은 또한 향상된 열 안정성에 대한 절대적 필요성을 드러내는 중요한 잔기의 확인을 허용한다. 2개의 중요한 잔기 Q11H 및 G17I가 내열성을 기초로 확인된 모든 유전자 재조립TM변이체에 존재한다 (도 6A 참조). 단백질의 열 안정성에 대한 구조적 결정 인자는 연구되었으며, 예컨대, Kinjo (2001) Eur. Biophys. J. 30: 378-384; Britton (1999) J. Mol. Biol. 293: 1121-1132; Ladenstein (1998) Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 61: 37-85; Britton (1995) Eur. J. Biochem. 229: 688-695; Tanner (1996) Biochemistry 35: 2597-2609; Vetriani (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2300-2305에 의해 몇가지 이론이 정립되었다. 비록 단백질 안정성에 대한 각각의 기여가 완전히 이해되지는 않았지만, 수소 결합 패턴, 이온성 상호작용, 소수성 패킹 및 표면 루프(loop)의 감소된 길이가 그 중 중요한 팩터이다. 모든 가능한 단일 아미노산 치환은 상대적으로 극성, 하전되거나 또는 작은 (글리신) 잔기를 더 큰 소수성 잔기로 대치하는 것에 관여하는 것을 테스트하는 것으로부터 대부분의 유익한 점 치환이 확인된다는 것으로부터, 소수성 상호작용이 이 단백질의 열 안정성을 강화시키는데 있어 가장 현저힌 역할을 담당한다는 것을 추측할 수 있다. 심지어 내열성을 향상시키기 위한 최적의 상호작용에 대해 잘 이해한다고 해도, 그런 상호작용을 소개하는 돌연변이가 어디서 만들어지는지에 대한 예상은 직선적이지 않다. 그렇지만, GSSMTM방법을 사용하는 합리적이지 않은 접근은, 단백질 구조 내에서 모든 위치의 사이드체인의 신속한 샘플링을 허용한다. 그런 접근은 지금까지 발견된 바 없는 작용기 상호작용을소개하는 아미노산 치환의 발견을 초래하였다.
실시예 6: 본 발명의 자일라나제를 이요한 종이 펄프의 전처리
하나의 양태에서, 본 발명의 자일라나제는 종이 펄프의 전처리에 사용될 수 있다. 본 실시예는 자일라나제가 종이 펄프의 전처리에 유용한지 여부; 예컨대, 크래프트 (Kraft) 종이 펄프에 사용될 때 표백 화학물질의 사용을 감소시키는지 (예컨대, 이산화염소, ClO2)를 결정하기 위해 일반적인 예시적 스크리닝 프로토콜을 기재한다.
스크리닝 프로토콜은 두개의 대안적인 테스트 파라미터를 갖는다: 산소 탈리그닌화 단계 (포스트(post)-O2펄프) 이후 장일라나제 처리 충격; 및, 산소 탈목질화를 포함하지 않는 과정 중에 자일라내제의 충격 (프리(pre)-O2브라운스탁).
산업상 환경, 예컨대, 공장에서 반응 조건을 자극하는 펄프 처리 조건: pH 8.0; 70℃; 60 분 기간.
도 11의 흐름도에서 그 과정을 개략적으로 도시하였다.
이들 조건 하에서 활성인 20개의 자일라나제가 생화학적 테스트에 의해 확인되었다. 20개의 자일라나제 중에서, 그것이 화학적으로 표백되기 전에 크래프트 펄프 전처리에 그들이 사용될 때, 6개가 명백하게 ClO2요구량을 현저하게 감소시킬 수 있었다. 6개는: 서열 번호 182 (서열 번호 181에 의해 암호화되는) ; 서열 번호 160 (서열 번호 159); 서열 번호 198 (서열 번호 197에 의해 암호화되는); 서열 번호 168 (서열 번호 167에 의해 암호화되는); 서열 번호 216 (서열 번호 215에 의해암호화되는); 서열 번호 260 (서열 번호 259에 의해 암호화되는)이다. 나머지는 약간의 활성을 보였지만 우수하지는 않았다. 자일라나제 서열 번호 182 (서열 번호181에 의해 암호화되는) 그리고 서열 번호 160 (서열 번호 159에 의해 암호화되는)는 모듈 방식이며 탄수화물 결합 모듈 뿐 아니라 자일라나제 촉매 도메인을 함유한다. 단지 촉매 도메인 만을 함유하는 이들 2 자일라나제의 끝이 잘린 유도체가 본 응용에 더 효과적인 것으로 설명되었다. 최고의 자일라나제, 서열 번호 160 (서열 번호 159에 의해 암호화되는)를 더 포괄적으로 연구하였다. 결과는 다음과 같이 요약될 수 있다:
- 2 단위/g의 서열 번호 160 (서열 번호 159에 의해 암호화되는)에 의한 포스트-O2스프루스(spruce)/소나무/전나무 (SPF) 펄프의 전처리는 이어지는 ClO2사용을 22%로 감소시켰으며 65% GE 광도를 얻었다;
- 0.5 단위/g 서열 번호 160 (서열 번호 159에 의해 암호화되는)에 의한 프리-O2브라운스탁 SPF의 전처리는 이어지는 ClO2사용을 13%로 감소시켰으며 65% GE 광도를 얻었다;
- 0.5 단위/g 서열 번호 160 (서열 번호 159에 의해 암호화되는)에 의한 프리-O2아스펜(Aspen) 펄프의 전처리는 ClO2사용을 적어도 22%로 감소시킨다;
- 0.5 단위/g 서열 번호 160 (서열 번호 159에 의해 암호화되는)에 의한 프리-O2Douglas Fir/Hemlock 펄프의 전처리는 ClO2사용을 적어도 22%로 감소시킨다;
- 처리 조건 하에서 수행될 때, 동일한 카파 팩터에서 표백되었지만 자일라나제로는 처리되지 않았을 때와 비교된 때, 자일라나제 처리로부터 수득률 감소는 펄프에 비해 0.5%를 초과하지 않았다;
- 포스트-O2SPF 펄프를 SEQ ID NOS: 159, 160로 처리하기 위한 최적 조건은, pH 6-7, 효소량 0.3 단위/g, 처리 시간 20-25분이다. 이들 조건 하에서, 28%의 ClO2사용의 감소사 가능하며 69% GE 광도에 도달하였다.
추가의 실험에서:
서열 번호 159에 의해 암호화되는 서열 번호 160 (XYLA) = 야생형 자일라나제의 전체 길이:
·XYLA (E.c) = 단지 대장균에서 발현된 자일라나제 촉매 도메인을 포함하는 SEQ ID NOS: 159, 160의 끝이 잘린 변이체
·XYLA (P.f) = 상기와 동일하지만 P. 플루오레센(P. fluorescens)에서 발현되었다.
서열 번호 182 (서열 번호181에 의해 암호화되는) = 야생형 자일라나제의 두번째 전체 길이:
·XYLB (E.c) = 끝이 잘린 변이체 etc, etc 대장균에서 발현되었다
·XYLB (P.f) = 상기와 동일하지만 P. 플루오레센에서 발현되었다
프리-O 2 브라운스탁에 대한 리드(lead) 자일라나제의 투약량 반응 데이타
자일라나제 스테이지 (X-스테이지)에 대한 조건은 다음과 같다:
pH 8
온도70℃
시간 60분
카파 팩터 0.24
비-효소 조절군에 대한, 카파 팩터는 0.30
결과는 이산화염소 (ClO2)의 낮은 하전에서 자일라나제-처리된 시료의 광도가 투약량에 의존적으로 증가한다는 것을 보여주었다 (Kf 0.24 vs Kf 0.30).
각 경우에서, 끝이 잘린 유도체가 완전-길이 자일라나제보다 더 효과적인 것으로 드러났다. 최적 자일라나제 투약량은 0.6 내지 0.7 U/g 펄프 부근으로 드러났다.
최선의 4 자일라나제에 의한 대륙간 프리-O 2 브라운스탁의 전처리
Do에서 ClO2투약량 반응의 측정
실험 개요
·프리-O2브라운스탁
o 초기 카파 31.5
·X 스테이지 조건
o 자일라나제 하전 0.7 U/gm
o 온도70℃
o pH 8
o 처리 시간 1시간
o 펄프 밀도 10%
·표백 배열 XDEp
o 카파 팩터 0.22, 0.26 및 0.30 (펄프 상에서 %D: 2.63, 3.12 및 3.60)
3-스테이지 표백 배열 이후 최종 광도 대 카파 팩터 (ClO 2 하전):
·XYLB - 61.5 최종 광도에서, X-스테이지는 ClO2사용을 3.89 kg/ton 펄프로 감소시킬 수 있다.
·XYLB (E.c) - 61.5 최종 광도에서, X-스테이지는 ClO2하전을 4.07 kg/ton 펄프로 감소시킬 수 있다.
·XYLA - 61.5 최종 광도에서, X-스테이지는 ClO2사용을 4.07 kg/ton 펄프로 감소시킬 수 있다.
· XYLA (E.c) - 61.5 최종 광도에서, X-스테이지는 ClO2사용을 4.90 kg/ton 펄프로 감소시킬 수 있다.
Do에서 ClO 2 투약량 반응의 측정:
효소 Do에서 ClO2감소(kg/ton OD) Do에서 Kf 감소
XYLB 3.89 11.7%
XYLB (E.c) 5.08 15.8%
XYLA 4.07 12.2%
XYLA (E.c) 4.90 14.7%
자일라나제 0.7 U/g, pH 8.0, 70℃, 1시간
펄프: 프리-O2브라운스탁, 초기 카파 31.5
ClO2의 퍼센트 감소는 산업상 거의 현저하지 않은 것이다. 그들의 1차적인 관심은 ton OD 펄프 당 필요한 ClO2의 lbs이다. 낮은 퍼센트 감소가 감소된 ClO2의 lbs 측면에서 타겟 광도에 도달하는데 있어 더 낮은 ClO2의 총 하전을 요구하게 되는 낮은 초기 카파 펄프에 대한 더 높은 퍼센트 감소보다 더 가치있을 수 있는 높은 초기 카파 브라운스탁을 갖는 것으로 보여졌다는 것을 고려할 때에는 이것도 일리가 있다.
표백된 대조 펄프에 대한 광도, 수득률 및 카파 팩터의 상호관계:
결과는 더 높은 타겟 광도를 얻기 위해 ClO2의 투약량을 증가시키면서 표백시키는 것은 펄프 수득률의 손실의 증가를 초래한다는 것을 보여주었다. 이는 본 과정의 이 스테이지에서 펄프가 톤 당 거의 $400의 가치 및 셀룰로스 손실 비용을 갖기 때문에 문제가 된다.
자일라나제 (예컨대, 본 발명의 자일라나제)의 장점은, 자일라나제 자체의 작용이 수득한 것을 취소시키지 않는 한, 낮은 ClO2투약량으로 수득률 손실을 감소시킬 수 있다는 것이다.
자일라나제 XYLB (P.f)로 프리-O 2 브라운스탁의 전처리에 대한 투약량 반응 데이타:
실험 개요
·노스우드(Northwood) 프리-O2브라운스탁
- 초기 카파 28.0
- 초기 밀도 32.46%
- 초기 광도 28.37
·X 스테이지 조건
- 자일라나제 하전 0 내지 2.70 U/gm
- 온도 58℃ 내지 61℃
- pH 8.2 내지 8. 5
- 처리 시간 1시간
·표백 배열 XDEp
- 카파 팩터 0.24
·ClO2감소는 0.24와 0.30 사이의 카파 팩터에 대해 계산되었다
본 실험의 목적은 세척되지 않은 SPF 브라운스탁 상에서 4 자일라나제 중 최선을 평가하기 위함이다. 결과는, 낮은 Kf 0.24에서 자일라나제의 존재시 얻어진 광도를 가지며, 더 높은 Kf 0.30에서 얻어진 광도에 점근적으로 접근하면서, XYLB (E.c)로 처리된 펄프에 대한 최종 광도의 투약량-의존적 증가를 보여주었다.
자일라나제 XYLB (E.c) 및 이산화염소 감소의 투약량 사이의 상호관계 (프리-O2브라운스탁) :
ClO2감소% OD 펄프 ClO2감소kg/ton 펄프 자일라나제 투약량U/gm
0.299% 2.99 0.31
0.363% 3.63 0.51
0.406% 4.06 0.71
0.439% 4.39 0.91
0.483% 4.83 1.26
0.523% 5.32 1.80
0.587% 5.87 2.70
최적 자일라나제 투약량은 0.5 및 0.9 U/gm이다.
최적 투약량은 0.5 내지 0.9 U/g 범위에 놓여있다. 이 투약량 이상에서는 자일라나제의 단위 증가 당 회복이 감소하였다. 이 크기로 처리된 펄프의 톤 당 이산화염소 투약량의 감소는 상업상 현저한 것이다.
3-스테이지 생물 표백 과정
펄프 밀 표백 공장에서 실질적인 표백 작동에 유사하게 가장된 3-스테이지 생물 표백 과정이 개발되었다 (도 1). 이 표백 배열은 (X)DoEp로 표시되며, 여기서X는 자일라나제 처리 스테이지,D는 이산화염소 표백 스테이지, 그리고Ep는 알칼리성 과산화물 추출 스테이지를 나타낸다. 본 발명자들의 응용에 사용된 1차적 공급원료는 서던 소프트우드 크래프트(Southern Softwood Kraft) 브라운스탁 (산소 탈목질화 없는)이다. 생물 표백 분석에서 높은 화학적 표백 감소 전위를 보이는 대부분의 효과적인 자일라나제 후보가 하드우드 크래프트 펄프 (maple 및 aspen)의 두 종 상에서 또한 테스트되었다. 각 생물 표백 라운드의 완료에 따라, TAPPI (펄프 및 종이 산업의 기술 연합) - 표준 핸드시트를 만들어내는데 계속하여 펄프가 사용되었다. 각 시트의 GE% 광도가 측정되었으며, 각 효소가 효소적 전처리 스테이지 (X) 동안 펄프 상에서 얼마나 잘 수행되는 지에 대하여 광도 값이 지시로써 사용되었다.
결과:
(X)DoEp 생물 표백 서열을 사용하여 스크리닝되었던 대략 110 자일라나제 중, 4 효소, 즉, XYLA (P.f); XYLB (P.f); SEQ ID N0 216 (서열 번호 215에 의해 암호화되는); 서열 번호 176 (서열 번호 175에 의해 암호화되는) 만이 표백 화학물질의 사용을 감소시키기 위한 가장 큰 잠재력을 보여주었다. XYLA (P.f) 및 XYLB (P.f)는 동등한 높은 성능을 보였으며 (4개의 우수한 성능 중에서 최고), XYLA (P.f)는 XYLB (P.f)보다 더 나은 pH 내성을 보였다. 결과는 다음과 같이 요약될 수 있다:
·다음의 네가지 효소로 이하에 나열한 로딩 레벨에서 서던 소프트우드 크래프트 브라운스탁의 전처리를 포함하는 3-스테이지 표백 배열 [(X)DoEp]을 사용하여 60 (GE%)의 시트 광도를 얻는 것이 가능하였다 (pH=8, 65℃ & 1시간):
o XYLA (P.f) 0.55 U/g 펄프
o XYLB (P.f) 0.75 U/g 펄프
o SEQ ID NOS : 215, 216 1.80 U/g 펄프
o SEQ ID NOS : 175, 176 1.98 U/g 펄프
·2 U/g 펄프의 XYLA (P.f)를 이용한 서던 소프트우드 크래프트 브라운스탁의 전처리는 ClO2사용을 18.7%로 감소시키고 최종 GE% 광도 61을 얻었다.
·XYLA (P.f)는 더 높은 pH에서 우수한 내성을 나타내며 효소 전처리 스테이지가 pH = 10에서 작동할 때 14% 이상의 화학물질 감소를 제공한다.
·2 U/g 펄프의 XYLB (P.f)를 이용한 서던 소프트우드 크래프트 브라운스탁의 전처리는 ClO2사용을 16.3%로 감소시키고 최종 GE% 광도 60.5을 얻었다.
·2 U/g 펄프의 XYLA (P.f) 및 XYLB (P.f)를 이용한 아스펜 크래프트 펄프의 전처리는 ClO2사용을 35%로 감소시키고 최종 GE% 광도 77을 얻었다.
·2 U/g 펄프의 XYLA (P.f) 및 XYLB (P.f)를 이용한 메이클 크래프트 펄프의 전처리는 ClO2사용을 38%로 감소시키고 최종 GE% 광도 79를 얻었다.
·두개의 최고 성능 자일라나제, 즉 XYLA (P.f) 및 XYLB (P.f)는, 단지 촉매 도메인을 포함하는 끝이 잘린 효소이며 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)에서 생성되었다.
본 발명이 그것의 바람직한 특정 양태를 참고로 상세히 기재되었으며, 변형 및 응용은 여기 기재되고 청구된 것들의 범위 및 사상 내에 포함된다는 것을 이해하여야 할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Steer, Brian Callen, Walter Healey, Shaun Hazlewood, Geoff Wu, Di Blum, David Esteghlalian, Alireza <120> XYLANASES, NUCLEIC ACIDS ENCODING THEM AND METHODS FOR MAKING AND USING THEM <130>56446-20079.40_290WO1_D1680-2WO <140> not assigned <141> 2003-03-16 <150> US 60/389,299 <151> 2002-06-14 <160> 380 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1128 <212> DNA <213> Bacteria <400> 1 atgaccgacc acaacgcttc cgaaaccagc ctgttcgaac agtgcggcta cagccgcgag 60 gccatccagg cccgcctgga gcgcaactgg tatgagatgt tcgaaggccc ggacaagatt 120 tactgggaga acgacgaagg cctggggtac gtgatggaca ccggcaacca cgacgtgcgc 180 accgagggca tgagctacgc gatgatgatc gccgtgcagt acggccgcaa ggacgtgttc 240 gacaagctgt ggggttgggt catgaaatac atgttcatga ccgagggcct gcaccagggc 300 tacttcgcct ggtctgtgga ccccagcggc gtaccgaacg ccgacggtcc ggccccggac 360 ggcgaggaat acttcgcgat ggacctgttc ctggcctccg cgcgatgggg cgacggcgaa 420 ggcgtgtacg agtactcccg ccacgcccgc tcgatcctcc acacctgcgt gcaccagggc 480 gaggacggtg aaggctatcc 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tattcatggc attggactgc aggcgcattg gaatttgtat 660 ggtccttctc tcggcgagat ccgagcggca ctggagaagt atgcttctct tggcctgcag 720 ctgcagctta cggagctgga tatgtcgctg tttcgttttg acgacaagcg tacggatata 780 accgagcctc cggcggaatt gcttgagctg caggctgagc ggtatgagga aattttcaag 840 ctgctgaggg aataccggga tgtaatcact tccgtgacct tctggggggc tgcggatgat 900 tatacgtggc tgaacgattt tcccgtccgg gggcggaaaa attggccttt cctgttcgat 960 gagcagcatc accccaaact ggcatttcat cgggtcgctg cactttcccg ccagtga 1017 <210> 82 <211> 338 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample <400> 82 Leu Thr Thr Arg Ala Ile Arg Thr Glu Ala Ala Leu Lys Glu Met Phe 1 5 10 15 Ala Glu Asp Phe Gln Ile Gly Ala Ala Val Asn Pro Met Thr Ile Arg 20 25 30 Thr Gln Glu Glu Leu Leu Ala Tyr His Phe Asn Ser Ile Thr Ala Glu 35 40 45 Asn Glu Met Lys Phe Ala Ser Leu Gln Pro Glu Glu Gly Ala Tyr Ala 50 55 60 Phe Asp Glu Ala Asp Arg Leu Ala Ala Phe Ala Arg Lys His Gly Met 65 70 75 80 Ala Met Arg Gly His Thr Leu Val Trp His Asn Gln Ser Thr Gly Trp 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60 ttttcaatag gtgccgctgt taatccactt actttaggta cgcaaaaaaa gctgttaacc 120 aaacatttta atagtataac ggctgagaat gaaatgaaat ttgaagcatt acagcctaaa 180 ccagatcaat ttacatttga tacggcggat aaaatggttg cctttgccca agcacatgat 240 atgaagatgc gtggccatac attaatctgg cacaatcaaa caccagattg gatgtttttg 300 caaaaagacg gtacgacaat tgatcgtgaa acactcttgg agagaatgaa aaaacatatt 360 aagacggtgg tggaaagata taaaggcaaa atatattgtt gggacgttgt aaatgaagcg 420 gtagctgatg aaggcgaagc tattttaaga ccatcaaaat ggacggacat tattggcgac 480 tcgtttattg agtatgcttt taaatacgcc cacgaggccg atcccgatgc actgttgttt 540 tacaatgact acaatgcttg ccaccctcat aaaagagata agatttatca acttgtaaag 600 gggttaatag acaagggtgt gcccatacac ggtattggcc tacaagcaca ttggaacatt 660 gttgacccgt cttacgatga tattaaacga gccatcgaaa cttatgcatc attaggatta 720 agcatacact ttactgaaat ggatgtgtct gtttttgaat atcatgatcg aagaacagac 780 ttattggaac ctacaaaaga tatggtttca cgtcaagctg agcgttatca ggcatttttt 840 gaaatattta ggtcgtatgc tgatgtgatt gattccgtta cgttttgggg catggccgat 900 gattatacat ggcttgatga ttttccggtg acaggtcgaa aaaattggcc ctttgtattt 960 gatgcgagac atcagcctaa aacagcattc tggaacatcg ttgattttta a 1011 <210> 94 <211> 336 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample <400> 94 Met Asn Gln Ser Val Asn Glu Ala Gln Val Pro Ala Leu Ser Asp Val 1 5 10 15 Tyr Glu Asp Tyr Phe Ser Ile Gly Ala Ala Val Asn Pro Leu Thr Leu 20 25 30 Gly Thr Gln Lys Lys Leu Leu Thr Lys His Phe Asn Ser Ile Thr Ala 35 40 45 Glu Asn Glu Met Lys Phe Glu Ala Leu Gln Pro Lys Pro Asp Gln Phe 50 55 60 Thr Phe Asp Thr Ala Asp Lys Met Val Ala Phe Ala Gln Ala His Asp 65 70 75 80 Met Lys Met Arg Gly His Thr Leu Ile Trp His Asn Gln Thr Pro Asp 85 90 95 Trp Met Phe Leu Gln Lys Asp Gly Thr Thr Ile Asp Arg Glu Thr Leu 100 105 110 Leu Glu Arg Met Lys Lys His Ile Lys Thr Val Val Glu Arg Tyr Lys 115 120 125 Gly Lys Ile Tyr Cys Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Val Ala Asp Glu 130 135 140 Gly Glu Ala Ile Leu Arg Pro Ser Lys Trp Thr Asp Ile Ile Gly Asp 145 150 155 160 Ser Phe Ile Glu Tyr Ala Phe 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cgccgatgtg gaaaaagcat gggaaaaccg ctatctcgat 960 tttttcaaac tgttcctgaa atatcatcag catatcgagc gtgttacgtt ttggggcgtt 1020 agcgatatcg attcctggaa gaacgatttt ccagtaagag gacgtaccga ttatccacta 1080 ccgtttaacc gacagtatca ggcaaaacct ttggtgcaga aattaataga cttaacgaaa 1140 tag 1143 <210> 96 <211> 380 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample <221> SIGNAL <222> (1)...(24) <400> 96 Met Lys Lys Thr Ile Ala His Phe Thr Leu Trp Ile Val Phe Phe Leu 1 5 10 15 Phe Thr Ser Cys Ala Val Thr Ala Gln Lys Asn Ala Lys Asn Thr Arg 20 25 30 Val Lys Leu Thr Thr Leu Lys Glu Ala Tyr Gln Gly Lys Phe Tyr Ile 35 40 45 Gly Thr Ala Met Asn Leu Arg Gln Ile His Gly Asp Asp Pro Gln Ser 50 55 60 Glu Asn Ile Ile Lys Lys Gln Phe Asn Ser Ile Val Ala Glu Asn Cys 65 70 75 80 Met Lys Ser Met Tyr Leu Gln Pro Glu Glu Gly Lys Phe Phe Phe Asp 85 90 95 Asp Ala Asp Lys Phe Val Asp Phe Gly Leu Gln Asn Asn Met Phe Ile 100 105 110 Ile Gly His Cys Leu Ile Trp His Ser Gln Ala Pro Lys Trp Phe Phe 115 120 125 Thr 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environmental sample <221> SIGNAL <222> (1)...(23) <400> 102 Met Lys Tyr Trp Leu Thr Thr Leu Val Leu Met Ile Ala Gly Ile Pro 1 5 10 15 Leu Ala Phe Gly Ser Ser Ala Lys Gln Asp Lys Ser Lys Ser Leu Lys 20 25 30 Asp Ala Phe Lys Asn Lys Phe Tyr Ile Gly Val Ala Leu Asn Arg Ser 35 40 45 Gln Tyr Leu Glu Gln Asn Glu Gln Ala Asp Lys Glu Ile Lys Ala Gln 50 55 60 Phe Ser Ser Ile Val Ala Glu Asn Cys Met Lys Ser Glu Asn Leu Glu 65 70 75 80 Pro Lys Glu Gly Lys Phe Phe Phe Asp Asp Ala Asp Arg Phe Val Ala 85 90 95 Phe Gly Glu Lys Asn Gly Met Tyr Ile Ile Gly His Thr Leu Ile Trp 100 105 110 His Ser Gln Val Pro Lys Trp Phe Phe Ile Asp Asn Glu Gly Lys Val 115 120 125 Val Ser Arg Glu Val Leu Ile Glu Arg Met Lys Asn Tyr Ile His Thr 130 135 140 Val Val Gly His Tyr Lys Gly Arg Val Lys Gly Trp Asp Val Val Asn 145 150 155 160 Glu Ala Ile Leu Asp Asp Gly Ser Phe Arg Gln Ser Asn Phe Phe Lys 165 170 175 Ile Leu Gly Ala Asp Phe Ile Lys Leu Ala Phe Gln Phe Ala His Glu 180 185 190 Ala Asp Pro Asn Ala Glu Leu Tyr Tyr 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aattgggcgg cctcggcgcg 60 gcgctgctcg tcggcgccgt cggcgccgcc accgtgctcg tggcgcccct cacctcgcac 120 gccgccgaga gcacgctcgg cgccgcggcg aagcagagcg gccggtactt cggcaccgcc 180 atcgcctcgg gcaggctcaa cgactcgacg tacacgacga tcgcgaaccg cgagttcaac 240 tcggtgaccg ccgagaacga gatgaagatc gacgccaccg aaccccagca gggccgcttc 300 gacttcaccg ccggcgaccg cgtctacaac tgggcggtgc agaacggcaa gcaggtacgg 360 ggccacaccc tggcctggca ctcccagcag cccgcctgga tgcagaacct cagcggcagc 420 gcgctgcgca cggcgatgac caaccacatc aacggcgtca tggcccacta caagggcaag 480 atcggccagt gggacgtcgt caacgaggcg ttcgcggacg gcagttcggg agcgcgccgg 540 gactccaacc tccagcggag cggcaacgac tggatcgagg tcgccttccg caccgcccgc 600 gccgccgacc cggccgccaa gctctgctac aacgactaca acgtcgagaa ctggacgtgg 660 gccaagaccc aggccatgta cgccatggtc aaggacttca agcagcgcgg cgtgcccatc 720 gactgcgtcg gcttccagtc gcacttcaac aacgacagcc cctacaacag caacttccgc 780 accaccctcc agagtttcgc cgccctcggc gtcgacgtgg ccatcaccga actcgacatc 840 cagggcgcct cgggcacgac ctacgccaac gtgaccaacg actgcctggc cgtcccgcgc 900 tgcctcggca tcaccgtctg gggtgtccgc gacaccgact cctggcgagc cgagcacact 960 ccgctgctct tcaacggcga cggcagcaag aagcccgcct actcctccgt cctcaacgcc 1020 ctcaactccg tctcccccaa ccccaacccc actccgaccc cctcccccgg cgccgggccg 1080 atcaagggag tcgcctcggg ccgctgcgtg gacgtacccg gagccggcac cgccgacggc 1140 acccaggtcc agctgtggga ctgcaacaac cgcaccaacc agcagtggac cctcaccgcc 1200 gccggtgagc tcagggtcta cggcgacaag tgcctggacg ccgccggcac cggcaacggc 1260 gccaaggtcc agatctacag ctgctggggc ggcgacaacc agaagtggcg cctcaactcc 1320 gacggttcca tcgtcggtgt ccagtccggc ctctgcctcg acgccgctgc cggcggcacc 1380 gccaacggca cgctgatcca gctctactcc tgctggaaca gcggcaacca gcgctggacc 1440 cgcacctga 1449 <210> 104 <211> 482 <212> PRT <213> Bacteria <220> <223> Obtained from an environmental sample <221> SIGNAL <222> (1)...(41) <400> 104 Met Arg Ser His Ser Leu Pro Pro Ser Thr Val Arg Arg Lys Leu Gly 1 5 10 15 Gly Leu Gly Ala Ala Leu Leu Val Gly Ala Val Gly Ala Ala Thr Val 20 25 30 Leu Val Ala Pro Leu Thr Ser His Ala Ala Glu Ser Thr Leu Gly 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Leu Ile Gln Leu Tyr Ser Cys Trp Asn Ser Gly Asn Gln Arg Trp Thr 465 470 475 480 Arg Thr <210> 105 <211> 2793 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample <400> 105 atgaagttca ctttgatgcc gctgctgtgc gggttcgcct tgctgttggg ttgcgcggtg 60 caggcaaccc cagccgcttc gttacagcag gcttatcagc cgtatttcca tatcggtact 120 gccgtcagct tggcgcaact gcaagcatcg aaaaaccatg aacgagattt aatcgcccag 180 cactttaaca gtctgaccgc tgaaaacctg atgaaatggg aaaaaatcca accgactgaa 240 ggcaactttg attttacagc ggccgacaag ctcgtcgctt ttgctgaaca acatcggatg 300 tggctggtcg gccatacgat cctgtggcat gaacaaaccc cggactgggt atttcagggg 360 ccagatggca aaccggccag caagcaagtg ttactcggca gattaaaaaa gcatatccaa 420 actgtggtcg gtcgttacca aggtcgggta catggctggg atgtagtgaa tgaagcgctg 480 aatgaagatg gcagtctgcg cgatacgccg tggcgaaaaa ttctgggtga tgattacatt 540 gccaccactt ttgcgctggt gcatcaggtc gaccccaaag ccaaactcta ttacaacgac 600 tacaacctgt ataaaccaaa aaaacgcact ggcgtgctac ggatcatcca gcaactgcag 660 caacaacaag tgcccattca tgccattggc gaacaagcgc attatggtct cgattcgccg 720 aaattgcagg aagttgaaga ctcgatcaac gcctttgcag ccaccggcct cgacgtgatg 780 ctgaccgagt tggaaatttc ggtgctaccg tttccgcctg gcatgacacc aggcgccgat 840 atcagtcagc atcaggaact gcaacaacag ctgaatcctt accgcgaagg cttaccaaaa 900 accgtcgaac aggcctggca acaacgttat ctggatctgt tttcgctgtt attgcgccag 960 catcaaaaat tacaccgggt gacgttttgg ggtttagatg atggccaaag ctggcgcaat 1020 aactttccaa tgcgcggtcg taccgattac ccgctactgt ttgaccgcaa gctgcaagcc 1080 aaaccgctat tgagcgcact gatcaaactg gcagaaactc aagcctcagc caagccgaaa 1140 gtaaatcagc tcggttttgc gccaaatgcg caaaaattgc tggtggtgcc ggggcggcag 1200 gcggtgtcgt ttcagatcat caatcaaagc aacggcaaaa cggtgttgca aggccaaagt 1260 tcggtggctc agttttggcc cgaatcgggc gagtgggtca gtatcgctga cttttcgacc 1320 ttaaccaccc aagggcgtta tcaggttgaa gcggctggat taactccgat caccgtcgag 1380 attactgctg aaccttatgc cgcgctgcat gatgcgtcca tcaaagccta ttattttaat 1440 cgcgcctcgc tggcgctgga gccaagtttt gccgggcctt gggcgcgcgc tgccggtcat 1500 ccggataaca aagtgttggt gcacacttcc gccgcttccg acaagcgacc agccggtttt 1560 gtgatcagcg ccgctaaagg ctggtatgac gccggtgact ataacaaata cgtggtcaat 1620 tccggtattt ccagttacac cctattgcaa gcctggcagg attttcctga gttttatcgc 1680 gacagaacat ggaatcttcc ggagtccagc aacaacctac cagacattct cgacgagacg 1740 ttatggaatt tacagtggct gagcaccatg caggacccaa gcgacggcgg cgtgtatcac 1800 aagctgactg aactgaattt ctctgctacc caaatgccgt cagaagtgac agcgccacgt 1860 tatgtggtgc aaaaaaccac ggcagcggca cttaatttcg cggcggtgct ggccaaagcc 1920 agtcgcattt ttacagaatt tgaaacgcaa ctgcccggcc tgtcacagca atatcgccag 1980 caagcattag cagcctggca atgggcgcaa aaaaatccac aacaaattta tcagcaacca 2040 gccgatgttc acaccggtgc ttatggcgac aaacagctgg ctgatgaatg ggcttgggct 2100 ggggcggagc tatatttatt aaccggtgag cagagttacc tgcagccgtt gttggcactt 2160 gagacgccaa tcaccgcagc ttcctgggcc aatgtggcgg cgttgggtta ttttgcgttg 2220 gcatccgctg aacagtttga gcctgcactt cgaaaaaaag tgcagcaaaa aatccaacaa 2280 gccgcggcgc aaattgtagc cgagcatcaa gcgtccgcct accaggtggc gatgactcaa 2340 aaagattttg tctggggcag taatgcggtg gcgatgaaca aaggcatgtt gttatatcaa 2400 gcgtggaaaa ttgacccaca accagagctg cgacaggcga tgcaagggct gctggattac 2460 gtcctcggtc gcaacccgct gcagctgtct tatgtcacag gttttggtgc gcaaagcccg 2520 caacatatcc atcaccgccc ctcggcggca gatcagatca aagcaccagt gccgggctgg 2580 ttagtgggtg gtgcacagcc gggtaagcaa gataaatgct cttattccgg tatttttgct 2640 accggcactt tacccgctgc cagcacttta cctgcaacga cttatctcga ccactggtgc 2700 agctacgcca ccaatgaagt ggcgattaac tggaatgcac ctttagtgta cgtgctggcc 2760 tggagccttt caccagactc catgaccaaa tga 2793 <210> 106 <211> 930 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample <221> SIGNAL <222> (1)...(22) <400> 106 Met Lys Phe Thr Leu Met Pro Leu Leu Cys Gly Phe Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Cys Ala Val Gln Ala Thr Pro Ala Ala Ser Leu Gln Gln Ala Tyr 20 25 30 Gln Pro Tyr Phe His Ile Gly Thr Ala Val Ser Leu Ala Gln Leu Gln 35 40 45 Ala Ser Lys Asn His Glu Arg Asp Leu Ile Ala Gln His Phe Asn Ser 50 55 60 Leu Thr Ala Glu Asn Leu Met Lys Trp Glu Lys Ile Gln Pro Thr Glu 65 70 75 80 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ccccacgatt tcgggaaatg ctcttaggga ttatgcggag 780 gcaaggggaa taaaaatcgg aacatgtgtc aactatccgt tttacaacaa ttcagatcca 840 acctacaaca gcattttgca aagagaattt tcaatggttg tatgtgaaaa tgaaatgaag 900 tttgatgctt tgcagccgag acaaaacgtt tttgattttt cgaaaggaga ccagttgctt 960 gcttttgcag aaagaaacgg tatgcagatg aggggacata cgttgatttg gcacaatcaa 1020 aacccgtcat ggcttacaaa cggtaactgg aaccgggatt cgctgcttgc ggtaatgaaa 1080 aatcacatta ccactgttat gacccattac aaaggtaaaa ttgttgagtg ggatgtggca 1140 aacgaatgta tggatgattc cggcaacggc ttaagaagca gcatatggag aaatgtaatc 1200 ggtcaggact accttgacta tgctttcagg tatgcaagag aagcagatcc cgatgcactt 1260 cttttctaca atgattataa tattgaagac ttgggtccaa agtccaatgc ggtatttaac 1320 atgattaaaa gtatgaagga aagaggtgtg ccgattgacg gagtaggatt ccaatgccac 1380 tttatcaatg gaatgagccc cgagtacctt gccagcattg atcaaaatat taagagatat 1440 gcggaaatag gcgttatagt atcctttacc gaaatagata tacgcatacc tcagtcggaa 1500 aacccggcaa ctgcattcca ggtacaggca aacaactata aggaacttat gaaaatttgt 1560 ctggcaaacc ccaattgcaa tacctttgta atgtggggat tcacagataa atacacatgg 1620 attccgggaa ctttcccagg atatggcaat ccattgattt atgacagcaa ttacaatccg 1680 aaaccggcat acaatgcaat aaaggaagct cttatgggct attga 1725 <210> 108 <211> 574 <212> PRT <213> Bacteria <400> 108 Val Trp Lys Pro Gly Leu Trp Asn Phe Leu Gln Met Ala Asp Glu Ala 1 5 10 15 Gly Leu Thr Arg Asp Gly Asn Thr Pro Val Pro Thr Pro Ser Pro Lys 20 25 30 Pro Ala Asn Thr Arg Ile Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Gly Ile Asn Ser 35 40 45 Ser Ser Ile Glu Ile Ile Gly Val Pro Pro Glu Gly Gly Arg Gly Ile 50 55 60 Gly Tyr Ile Thr Ser Gly Asp Tyr Leu Val Tyr Lys Ser Ile Asp Phe 65 70 75 80 Gly Asn Gly Ala Thr Ser Phe Lys Ala Lys Val Ala Asn Ala Asn Thr 85 90 95 Ser Asn Ile Glu Leu Arg Leu Asn Gly Pro Asn Gly Thr Leu Ile Gly 100 105 110 Thr Leu Ser Val Lys Ser Thr Gly Asp Trp Asn Thr Tyr Glu Glu Gln 115 120 125 Thr Cys Ser Ile Ser Lys Val Thr Gly Ile Asn Asp Leu Tyr Leu Val 130 135 140 Phe Lys Gly Pro Val Asn Ile Asp Trp Phe Thr Phe Gly Val Glu Ser 145 150 155 160 Ser Ser Thr Gly Leu Gly Asp Leu 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240 acacagcagt gcggtgcgac tgcgattggc cacactttgc tctggcacca acagacaccg 300 aaatggtttt tcgaggggcc agatgaccag cctactaacc gcgagttggc cctggcacgc 360 atgagaaagc acatcgccac tcttgttggc cgttacaaag gtcgcattaa gcaatgggat 420 gtggtgaatg aggcgattag cgatgcagag ggcgagtact tgagaccaaa tagtccatgg 480 ttcaaggctg ttggagaaga tcacattgcg caggctttcc gggcagcgca cgaagccgat 540 cctgacgcca tcctcatcta taacgattac aacatcgagc aggagtacaa gcgtcccaaa 600 gcgatacgac tgctgaggtc attacttgag caggacgttc cccttcatgc cgtgggcatc 660 cagggccact ggcgtatgga cactctgaat gttgccgaaa tcgaagaagc tatcaaagaa 720 tttgctgcgc tgggtctcaa ggtcatgatc accgagcttg acatcagcgt gctaccgaca 780 aagtatcagg gagccgatct ctctacccgc gaagaattga cgcctgaaat caatccctat 840 acggagggac tacccgagaa cgttgcccgg caacatgccg aatgttaccg ccaagtcttc 900 aaaatgttcc tgtgccacaa ggatgccatt ggccgtgtca cgctctgggg cgttcatgat 960 ggcagatcat ggttcaatga ctttcccgtc agagggcgca ccgattatcc tctgcttttc 1020 gaccggcagg gcaaacccaa gccagcattt tttgccgtct tgaaggctgc gcaagatcag 1080 ccacaatga 1089 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gtgatatatt aagagtttgt 780 ctttcatcag aaaaatgcac agcattcatt atgtggggat ttactgaccg ctattcatgg 840 ataccaaatt acttcagcgg ctacggttca gctttaatat tcgatgagca atataagccc 900 aaactagcat attactatat acttcggaca ttcatcgaaa aactaggcat taaaggttaa 960 <210> 128 <211> 319 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample <400> 128 Val Asp Leu Ala Glu Lys Cys Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Ala Val Glu 1 5 10 15 Pro Gly Tyr Leu Ile Ile Arg Glu Tyr Ala Glu Ile Leu Ser Arg Glu 20 25 30 Phe Asn Val Val Thr Ala Glu Asn Ala Leu Lys Phe Glu Ala Ile His 35 40 45 Pro Gln Arg Gly Val Tyr Ser Phe Glu Gly Ala Asp Ala Ile Val Arg 50 55 60 Phe Ala Glu Thr His Gly Met Lys Val Arg Gly His Thr Leu Val Trp 65 70 75 80 His Gln Gln Leu Pro Ala Trp Ile Thr Ser Gly Ser Tyr Ala Trp Glu 85 90 95 Glu Trp Lys Asn Ile Leu Arg Glu His Val Met Ser Val Val Gly Arg 100 105 110 Tyr Lys Gly Gln Ile Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Ile Leu 115 120 125 Asp Asn Gly Ser Leu Arg Asp Asn Val Trp Phe Arg Asn Val Gly Pro 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atccaataat tggatgggat gtcgtaaatg aagttcttga tgataatggc 1500 agtttgagaa attcgaagtg gttgcaaatt attggacccg actatataga aaaagccttt 1560 gaatatgcac atgaagcgga tccatcgatg aagttgttta ttaatgatta caatatcgaa 1620 aataatggcg ttaaaactca agctatgtat gacttggtaa aaagattaaa gagtgaaggc 1680 gttcctatag atggaatagg gatgcaaatg cacataaata taaattccaa tatagataat 1740 ataaaagcat caatagaaaa actggcatcg ttaggcgttg aaatacaagt aactgaatta 1800 gatatgaaca tgaacggtaa tatatctaac gaagcattgc tcaagcaagc tagattgtat 1860 aaacaattat ttgacttatt taaagcagag aaacaatata taactgctgt agttttttgg 1920 ggagtttcag acgatgtaac ttggcttagc aagccaaatg ctccgctact ttttgataca 1980 aagttgcaag caaagccagc atactgggca atagtagatc cgaataaagc tacaccagac 2040 attcaatctg caaaggcttt ggaaggatca ccgacaatgg gtacaaatgt tgataactct 2100 tggaaacttg taaagccgtt atatgcaaat acttttgtag aagggtcggt cggagcaact 2160 gctgctgtta agtctatgtg ggatactaaa aacttgtatt tgttagtaca agtttcagac 2220 aataccccat ctagtaatga tggtattgag atttttgtag ataagaatga tgacaaatcc 2280 acttcttatg 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Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample <221> SIGNAL <222> (1)...(29) <400> 172 Met Glu Leu Lys Lys Ile Ser Arg Lys Gly Leu Pro Leu Val Phe Leu 1 5 10 15 Ser Leu Leu Leu Phe Ser Val Thr Gln Gln Ser Asn Ala Gln Thr Ile 20 25 30 Cys Ser Asn Gln Thr Gly Thr Asn Asn Gly Phe Phe Tyr Ser Phe Trp 35 40 45 Lys Asp Thr Gly Ser Ala Cys Met Thr Leu Gly Ser Gly Gly Asn Tyr 50 55 60 Asp Val Ser Trp Asn Leu Gly Ser Gly Asn Met Val Val Gly Lys Gly 65 70 75 80 Trp Ser Thr Gly Ser Ser Thr Arg Arg Val Gly Tyr Asn Ala Gly Ile 85 90 95 Trp Gln Pro Asn Gly Asn Ala Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp Thr Arg 100 105 110 Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Phe Arg 115 120 125 Pro Pro Gly Gly Thr Ser Ile Gly Ser Val Thr Thr Asp Gly Gly Thr 130 135 140 Tyr Gln Ile Tyr Arg Thr Gln Arg Val Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly 145 150 155 160 Ala Arg Thr Phe Tyr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Thr Ser Lys Arg Pro 165 170 175 Thr Gly Ser Asn Gln Thr Ile Thr Phe Ala Asn His Val Asn Ala Trp 180 185 190 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cagtatttca gtgttcctaa aagcactata 660 aaccaccgca ccagcggtac aatctctgtt tccaaacact ttgaagaatg ggaaaaagtc 720 ggcatgaaaa tggacggtcc cttatacgaa gtagcgatga aagttgaatc ctattctggc 780 aatgggaata gtaacggcaa tgctaaaatt acaaagaata ttttgaccat tggcggaaca 840 accacaactc aaagcagttc aagcggaggt tcaacggttc cagatgaatg tggcgaatat 900 aaaaagagtt tctgtggtgg cttgggatat ggaagcgtat attccaattt aaccgcaata 960 ccctcaacgg gcgactgctt atacatcgga gattttgaag taatccagcc agctttgaat 1020 tcaaccgttg ccataaacgg tgtggaaaat acctgcggaa gcgagtggtc agattgccct 1080 tacaatgata aacccgattc aaaaaaagat ggcggctatt atgtttatgt gaaaacaggc 1140 tcaattaaca attatgagaa taacggttgg caaaacattg tagctaaagc aaaaccggct 1200 tgcacaccac cttctagcag ttccggtgct gcaccaggtt cttcttcttc agacgaagaa 1260 gacccagagc caattttgaa aaatcgcatt cctataactc atttttccct tcaaacgctt 1320 agcgataaag ccttgcgcat agaagtaaat gctccaacta ttgtggacat ttttgacctg 1380 agagggaata aggttaaaag tttgaatgtt tacggttcgc aaagggttaa attatccctg 1440 ccgagcgggg tgtattttgc caaagtgcgc gggatgaaaa gcgttagatt tgtgttgagg 1500 taa 1503 <210> 174 <211> 500 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample <221> SIGNAL <222> (1)...(22) <400> 174 Leu Lys Lys Leu Ala Ala Ala Leu Ser Leu Ala Ile Thr Phe Ala Val 1 5 10 15 Pro Thr Ile Val Gln Ala Gln Gly Pro Thr Trp Thr Thr Ser Thr Ile 20 25 30 Gln Lys Tyr Asn Asn Tyr Asp Tyr Glu Leu Trp Asn Glu Asn Asn Gln 35 40 45 Gly Thr Val Ser Met Lys Leu Thr Gly Asp Asn Gly Thr Ala Ala Asn 50 55 60 Ala Val Gly Gly Thr Phe Glu Ser Thr Trp Ser Gly Thr Lys Asn Val 65 70 75 80 Leu Phe Arg Ser Gly Arg Lys Phe Thr Gly Thr Ser Gly Gln Ser Val 85 90 95 Asp Gly Gly Gly Ala Gly Lys Thr Ala Ser Ala Tyr Gly Asn Ile Ser 100 105 110 Ile Asn Phe Ala Ala Thr Trp Ser Ser Gly Asp Asp Val Lys Met Leu 115 120 125 Gly Val Tyr Gly Trp Ala Phe Tyr Ala Leu Pro Ser Val Pro Asp Lys 130 135 140 Gln Glu Asn Gly Thr Ser Thr Asn Phe Ser Asn Gln Ile Glu Tyr Tyr 145 150 155 160 Ile Ile Gln Asp Arg Gly Ser Tyr Asn Ser Ala Thr Gly Gly Thr Asn 165 170 175 Ser 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agctccagca gcggtggctg tcgggaaatg tgtaactggt acggacaggg tatgtatcct 1080 ctgtgtcaga acaccagcgg ttggggatgg gaaaataacc agaactgtat cggtcgccaa 1140 acctgtcaaa gtcagaacgg cggctccggg ggtgtggtga acagctgtgg taccagcagc 1200 tcttcgtcca gtagcacctc ctcatcgagc agttcaagtt cgtcgagtgg caccacgtca 1260 tcgtcctccg gaattcctgc agcccggggg atccactag 1299 <210> 178 <211> 432 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample <221> SIGNAL <222> (1)...(26) <400> 178 Met Lys Leu Leu Lys Thr His Arg Arg Ala Ile Ala Ala Ala Ala Leu 1 5 10 15 Ala Val Ala Thr Val Pro Ile Ala His Ala Gln Thr Leu Ser Ser Asn 20 25 30 Ala Thr Gly Thr Gln Asn Gly Tyr Tyr Tyr Ser Phe Trp Lys Asp Ser 35 40 45 Gly Asn Ala Thr Met Thr Leu Gly Ala Gly Gly Asn Tyr Ser Ser Ser 50 55 60 Trp Asn Ser Ser Thr Asn Asn Trp Val Gly Gly Lys Gly Trp Met Pro 65 70 75 80 Gly Thr Arg Arg Thr Val Thr Tyr Ser Gly Ser Tyr Ser Ala Ser Gly 85 90 95 Thr Ser Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Ile Glu 100 105 110 Tyr Tyr Ile Val 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gggaaacggc gggcaattta aagaatataa aaatatgtac 360 gcggatttca attacacaag gtcggggcgc ggcaccggcg gcagttattc ttatataggc 420 atttacggct gggcgagaaa cccgaacgcc gcgaacgagg aagacaggtt aatagaatac 480 tatattgtgg acgactggtt cgggaatcaa tggcagtccg acgacacccc cattaccaca 540 agaacaacag gaggctccgt attgggtacc attatagcgg acggcgcgtt ttacaacgtc 600 gtcaggaatg tgagaaccca aaagccttcg atagacggca tcaaaacatt cgcccaatac 660 ttcagcatac gccaaacacc gcgccaaagc gggacaatct ccatcaccga acatttcaaa 720 caatgggaaa gcatgggcct gaagctcgga aatatgtacg aggcaaaatt cctggtagaa 780 gccggcggcg gcaccggctg gctggagttt acgtatctta aactgacgca ggaagaaaaa 840 aaaagaaatt ag 852 <210> 180 <211> 283 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample <221> SIGNAL <222> (1)...(19) <400> 180 Met Lys Asn Trp Pro Gly Thr Gly Ile Ile Leu Leu Leu Ala Gly Gly 1 5 10 15 Leu Leu Ala Ala Cys Leu Thr Gly Lys Arg Gln Glu Gly Gln Lys Val 20 25 30 Asp Pro Asp Thr Gln Asn Glu Lys Leu Thr Gly Gly Thr Val Phe Thr 35 40 45 Ala Asn Ser Arg Gly 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ggggtaatgg cggaaaatat accgagtaca aaaatatgta tgcggatttt 360 agctacacta gatctggacg caacaccgcc ggtaattatt catatatagg gatttatggc 420 tgggctagaa atccaaatgc cgcaaaagaa gaagacaaat tgatagagta ttatattgtg 480 gaagattggt ttggcaatca atggcaagag gatagctcac ccattaccac taatacaaca 540 agtggaaccg tattgggaag ttttactata gatggcgcgg tttataatgt cgttagaaat 600 gtcagagtcc aacaaccttc gatagacgga accaaaacat tcacccaata cttcagcata 660 cgacaaacgc cccgacagag cgggacaatt tccattaccg ggcatttcag gcaatgggag 720 agcatgggtt tacagcttgg caatatgtac gaggcaaagt ttcttgttga agccggcggc 780 ggcacaggat ggctggaatt ttcatacctt aaattaacga tggaagacag cttaaggtaa 840 <210> 194 <211> 279 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample <221> SIGNAL <222> (1)...(21) <400> 194 Met Thr Lys Tyr Arg Leu Gly Ile Gly Ile Phe Ile Leu Leu Val Cys 1 5 10 15 Cys Phe Ser Ala Ala Cys Ile Val Pro Lys Gln Gln Glu Glu Gln Lys 20 25 30 Val Ala Pro Thr Glu Leu Thr Gly Ala Ile Thr Phe Thr Ala Asn Ser 35 40 45 Asn Gly Asn Lys Pro Leu Asn 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tattgttgcc 1080 atcaataaaa gcaacacagg agtcaaccaa aactttgttt tgcagaatgg atctgcttca 1140 aacgtatcta gatggatcac gagcagcagc agcaatctac aacctggaac gaatctcact 1200 gtatcaggca atcatttttg ggctcatctt ccagctcaaa gcgtgacaac atttgttgta 1260 aatcgttaa 1269 <210> 238 <211> 422 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample <221> SIGNAL <222> (1)...(32) <400> 238 Met Ile Pro Arg Ile Lys Lys Thr Ile Cys Val Leu Leu Val Cys Phe 1 5 10 15 Thr Met Leu Ser Val Met Leu Gly Pro Gly Ala Thr Glu Val Leu Ala 20 25 30 Ala Ser Asp Val Thr Val Asn Val Ser Ala Glu Lys Gln Val Ile Arg 35 40 45 Gly Phe Gly Gly Met Asn His Pro Ala Trp Ala Gly Asp Leu Thr Ala 50 55 60 Ala Gln Arg Glu Thr Ala Phe Gly Asn Gly Gln Asn Gln Leu Gly Phe 65 70 75 80 Ser Ile Leu Arg Ile His Val Asp Glu Asn Arg Asn Asn Trp Tyr Lys 85 90 95 Glu Val Glu Thr Ala Lys Ser Ala Val Lys His Gly Ala Ile Val Phe 100 105 110 Ala Ser Pro Trp Asn Pro Pro Ser Asp Met Val Glu Thr Phe Asn Arg 115 120 125 Asn Gly Asp Thr Ser Ala Lys 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tgcccagcat cttaacgatt tcgtaaccta catgagaaac 480 aatggcgtga atctctacgc gatttccgtc cagaacgagc ccgattatgc gcatgactgg 540 acgtggtgga ctccgcagga aatgcttcgc tttatgaaag aaaatgccgg atcgatcaac 600 agcagagtga tcgcaccgga atcgttccaa tatctgaaaa atatgtcgga cccgattcta 660 aatgatcccc aggcgcttgc caatatggat attcttggcg ctcatctgta cggtacccaa 720 gttagcaatt tcgcgtatcc actattcaaa caaaaaggag cgggaaaaga cctctggatg 780 accgaggtgt attacccgaa cagcgacaac aactcggcgg atcgctggcc cgaagccctg 840 gatgtgtctt accatatcca caatgcgatg gtagagggag attttcaagc ttatgtatgg 900 tggtatatcc gcagatccta tggtccaatg aaagaggacg gcacgatcag caaacgcggc 960 tacaatatgg ctcatttctc caagtttgtc cgtcccggct atgtcagggt ggatgcttcg 1020 aaaaatccag aaacgaacgt ttacgtatcc gcatataaag gcgacaacaa aatcgttatc 1080 gttgccataa accggaacaa ctccggggtc aatcagaact ttgtccttca gaatggatcc 1140 gtttcgcagg tatcaaggtg gatcacgagc agcagcagca atctccagcc aggaacgtct 1200 ctcaatgtaa cagggagcaa tttctgggct catcttcccg cgcaaagcgt tacgactttt 1260 gtgggtgaac tcggaaggta a 1281 <210> 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tacagcgact 300 ggtgggcaga tcccggcaag cagtacaaac caaaagagtg ggatcacctt catggagaac 360 ttctggaaag ggcggtgtat tcctacacga aactcgtgct gaatcatatg agaagaaacg 420 gtgcactgcc ggacatggtc caggtgggaa acgaggtgaa caacggcttt ctctggccgg 480 atggaatgat tgccggaaag gatgcaggag gattcgacgg attcacaaaa cttttgaagg 540 cggccatcaa agccgtcagg gaagttgatc ccgatatcaa gatagtcatt catttggcag 600 aaggtggaaa caactcactt ttcaggtggt tcttcgacga gatcacaaga agagacgtgg 660 attttgatgt gatcggtgta tcgtactatc cgtactggca tggtaccctg gatgacctga 720 agaacaacct gtacgacata gcgaaaagat acaacaaaga cgtgctcatc gttgaaacgg 780 cgtatgcctg gacactcgag gacggggacg gttaccccaa catcttcagt ggtgaagaga 840 tggagctcac gggtggttac aaagcaacgg ttcagggaca ggcaacgttc ttgagggatc 900 tcatagaagt ggtgaacagt gttcctgacg gtcacggtct tgggatcttc tattgggaag 960 gagactggat tcctgtgaaa ggagccggct ggaaaaccgg cgaaggaaat ccatgggaga 1020 atcaggccat gtttgatttc aatggaaatg ctctcccatc cctggatgtt ttcaagctcg 1080 tgaggacagt cactcctatg gaaataaaaa tcgaagagat tctgcctgtg gagatctcga 1140 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atcaaaatca agagcgtcaa ccttatcaag cacgacgact ccacagaacc ctgtagtctg 2520 aaagtggctt ggggttgtac tctcagcgac cagaactacg ccacgggcat cgaagacatt 2580 actatcactc ctgttcgtca tgacgatgga atcatctaca atctgagcgg acagcctgta 2640 acctctcctc agcgcggcat ctacatcctc aacggaaaga aaatcatcaa atag 2694 <210> 258 <211> 897 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample <400> 258 Met Ala Asp Ile Ser Thr Thr Pro Val Thr Ala Ser Thr Asp Ala Ala 1 5 10 15 Lys Asn Leu Tyr Ala Tyr Phe Leu Asp Gln Tyr Gly Lys Lys Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Val Met Ala Asn Val Asn Trp Asn Asn Thr Cys Ala Glu Lys 35 40 45 Val Tyr Lys Leu Thr Gly Lys Tyr Pro Ala Met Asn Cys Tyr Asp Phe 50 55 60 Ile His Ile Cys Phe Ser Pro Ala Asn Trp Ile Asp Tyr Thr Asp Ile 65 70 75 80 Thr Pro Ala Lys Glu Trp His Asp Ala Gly Gly Ile Val Gln Leu Met 85 90 95 Trp His Phe Asn Val Pro Lys Ser Gln Gly Ala Thr Asp Val Thr Cys 100 105 110 Thr Pro Ser Glu Thr Thr Phe Lys Ala Ser Asn Ala Leu Val Ser Gly 115 120 125 Thr Trp Glu Asn Lys Trp 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acatgaactc catagtggcc gaaaatgtaa tgaaaagtga ggtgcttcaa 240 cccagggaag gagagtttga ttttactctt gccgatcagt ttgttcaatt tggtatcgat 300 aacaatatgc atatagttgg ccataccctt atatggcatt cccaggcgcc acgatggttt 360 tttgtggatg agaacggaaa cgatgtgagc cccgaaattc tgaaacaaag aatgaaagac 420 catatttata ccgtagtagg ccgttataaa ggcaaaattc atggatggga tgtggtgaat 480 gagtgtataa atgacgatgg ttcgtggcgc aatagtaagt tttaccaaat tcttggtgaa 540 gattttgtta aatatgcatt ccagtttgca gctgaagccg atcccgatgc agagctttat 600 tacaatgatt attcgatgtt ccttccagga cgtagggaag gcgtaattaa gatggtgaga 660 aatctgcagg aacagggaat taaaattgat ggtattggga tgcagggcca cctgatgatt 720 gattatccac ccctcgaaga ttttgaaacg agtatactgg cttttgccga tctgggggtg 780 aatgtcatga taaccgaact cgatatatcc gttttgccat ttcctacccg caacgtgggc 840 gccgatgttt ctctgaacat tgcatacaat actgaattaa atccctaccc gaatggctta 900 cccgaagatg tagcgcagaa attacataat cggtgggtgg atctttttcg cctgttcatt 960 aaacaccacg ataaaattac ccgtgtaacc acttggggta cagccgatgc catgtcatgg 1020 aagaataact ggcccattcg tggacgtaca gattatccct tacttttcga tcgcgatttt 1080 cagcccaaac cctttgtcgc tgatataatt aaggaggcat tggcagccaa aagaaaatta 1140 taa 1143 <210> 260 <211> 380 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <221> SIGNAL <222> (1)...(24) <400> 260 Met Lys Lys Ile Arg Leu Leu Gln Gly Val Ser Leu Ala Met Ser Ile 1 5 10 15 Met Phe Leu Leu Ser Cys Gln Ala Gln Lys Pro Val Asp Ser Leu Lys 20 25 30 Glu Ala Phe Asp Gly Leu Phe Leu Ile Gly Thr Ala Met Asn Thr Pro 35 40 45 Gln Ile Thr Gly Gln Asp Thr Gln Thr Leu Glu Leu Ile Lys Lys His 50 55 60 Met Asn Ser Ile Val Ala Glu Asn Val Met Lys Ser Glu Val Leu Gln 65 70 75 80 Pro Arg Glu Gly Glu Phe Asp Phe Thr Leu Ala Asp Gln Phe Val Gln 85 90 95 Phe Gly Ile Asp Asn Asn Met His Ile Val Gly His Thr Leu Ile Trp 100 105 110 His Ser Gln Ala Pro Arg Trp Phe Phe Val Asp Glu Asn Gly Asn Asp 115 120 125 Val Ser Pro Glu Ile Leu Lys Gln Arg Met Lys Asp His Ile Tyr Thr 130 135 140 Val Val Gly Arg Tyr Lys Gly Lys Ile His Gly Trp Asp Val Val Asn 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gtggctcttc ctcgggtgct 720 aataccctgg tgattcgtgc tgtgggcacc tctggtaatg aattgctgcg tgtcaatgtg 780 ggtggtagcc ctgtgcagac attgagcctt tcgaccagtt ggcaggattt tactgtcaat 840 acggatgcaa cgggtgacat taacgtagag ttgtttaatg atcagggtca gggttatgag 900 gcgcgtatcg attatgtgct ggttaatggt gagacccgct acgcggccga tcagagttat 960 aacaccagtg cctgggacgg cgaatgtggg ggtggctctt ttacccagtg gatgcattgt 1020 gatggcatga ttggctttgg tgatatgacc ggcggcaatg ccggtggtgg cggttcttcg 1080 ggtggttctg gcgccaatac tctggtggtg cgtgctgtcg gcacttcagg taacgagcag 1140 ttgcgcgtga atgtgggcgg caacacgatt caaacactga acctgtcaag cagttggcaa 1200 gattttactg tcaataccga tgcctcgggc gatattaacg tagagctgtt taatgaccag 1260 ggtcagggct atgaggcgcg tattgattat gtgctggtta atggcgagac ccgctacgcg 1320 gctgaccaga gttataacac cagcgcctgg gatggcgaat gcgggggtgg ctcttttacc 1380 caatggatgc attgtgatgg catgattggt tttggtgata tgtcgggtgg tggttctgct 1440 gtgggtacaa gcagtagcgg taatgccggc agcaatacca gcagtgcctg ttactgtaat 1500 tggtatggca gtgtgatggc ttcttgtgaa aatcaggtga acggctgggg ttgggaaaat 1560 aatcaaagct gtattggtaa taatacctgt aataatcagg gcggtagcgg aggcgtggtg 1620 tgcaattaa 1629 <210> 262 <211> 542 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <221> SIGNAL <222> (1)...(26) <400> 262 Met Ile Asn Lys Ile Gly Lys Gly Phe Phe Ser Ala Phe Ile Cys Ala 1 5 10 15 Ala Ala Leu Ser Val Ser Thr Val Asn Ala Gln Gln Thr Val Thr Thr 20 25 30 Asn Thr Gln Gly Thr His Asp Gly Phe Phe Tyr Ser Phe Trp Lys Asp 35 40 45 Ser Gly Asp Ala Ser Phe Gly Leu Arg Glu Gly Gly Arg Tyr Thr Ser 50 55 60 Gln Trp Asn Thr Ser Thr Asn Asn Trp Val Gly Gly Lys Gly Trp Asn 65 70 75 80 Pro Gly Gly Arg Arg Val Val His Tyr Gln Gly Gln Tyr Asn Val Asp 85 90 95 Asn Ser Gln Asn Ser Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Ser Pro 100 105 110 Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Ile Glu Ser Tyr Gly Ser Tyr Asn Pro Ser 115 120 125 Asn Cys Thr Gln Gly Arg Gln Thr Tyr Gly Thr Phe Gln Ser Asp Gly 130 135 140 Ala Thr Tyr Glu Ile Val Arg Cys Gln Arg Val Gln Gln Pro Ser Ile 145 150 155 160 Asp Gly Thr Gln Thr Phe Tyr Gln Tyr Phe Ser Val Arg Gln Pro Lys 165 170 175 Lys Gly Phe Gly Ser Ile Ser Gly Thr Ile Thr Val Gly Asn His Phe 180 185 190 Asp Ala Trp Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Glu His Asp Tyr Met 195 200 205 Val Met Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Thr Gly Ser Ser Asp Ile Thr 210 215 220 Val Ser Glu Ile Thr Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ala 225 230 235 240 Asn Thr Leu Val Ile Arg Ala Val Gly Thr Ser Gly Asn Glu Leu Leu 245 250 255 Arg Val Asn Val Gly Gly Ser Pro Val Gln Thr Leu Ser Leu Ser Thr 260 265 270 Ser Trp Gln Asp Phe Thr Val Asn Thr Asp Ala Thr Gly Asp Ile Asn 275 280 285 Val Glu Leu Phe Asn Asp Gln Gly Gln Gly Tyr Glu Ala Arg Ile Asp 290 295 300 Tyr Val Leu Val Asn Gly Glu Thr Arg Tyr Ala Ala Asp Gln Ser Tyr 305 310 315 320 Asn Thr Ser Ala Trp Asp Gly Glu Cys Gly Gly Gly Ser Phe Thr Gln 325 330 335 Trp Met His Cys Asp Gly Met Ile Gly Phe Gly Asp Met Thr Gly Gly 340 345 350 Asn Ala Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Ala Asn Thr Leu 355 360 365 Val Val Arg Ala Val Gly Thr Ser Gly Asn Glu Gln Leu Arg Val Asn 370 375 380 Val Gly Gly Asn Thr Ile Gln Thr Leu Asn Leu Ser Ser Ser Trp Gln 385 390 395 400 Asp Phe Thr Val Asn Thr Asp Ala Ser Gly Asp Ile Asn Val Glu Leu 405 410 415 Phe Asn Asp Gln Gly Gln Gly Tyr Glu Ala Arg Ile Asp Tyr Val Leu 420 425 430 Val Asn Gly Glu Thr Arg Tyr Ala Ala Asp Gln Ser Tyr Asn Thr Ser 435 440 445 Ala Trp Asp Gly Glu Cys Gly Gly Gly Ser Phe Thr Gln Trp Met His 450 455 460 Cys Asp Gly Met Ile Gly Phe Gly Asp Met Ser Gly Gly Gly Ser Ala 465 470 475 480 Val Gly Thr Ser Ser Ser Gly Asn Ala Gly Ser Asn Thr Ser Ser Ala 485 490 495 Cys Tyr Cys Asn Trp Tyr Gly Ser Val Met Ala Ser Cys Glu Asn Gln 500 505 510 Val Asn Gly Trp Gly Trp Glu Asn Asn Gln Ser Cys Ile Gly Asn Asn 515 520 525 Thr Cys Asn Asn Gln Gly Gly Ser Gly Gly Val Val Cys Asn 530 535 540 <210> 263 <211> 1092 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <400> 263 atgaaaacta atcacccatt taaattcggg aaaaaaatat gtatggcatt ggctttgctg 60 gtgcttggca tacaggcttc aatcgcacag gaaatttgta ttaccagcgg cactgaccag 120 atcagagaaa ccacatccaa cggctatacc cacgaactat ggaatcagga cacccggggg 180 acggcctgta tgactattaa tgcaggcacc acttacagtg cgcggtggaa cggtgcattt 240 aactatttgg cccgccgtgg attggcctac gatggttcgt ccctcaccca tgctgaccgg 300 gggaaattca ccataaatta tgcctctaac tacaactgca acaatatgaa tgggctctct 360 tatttaagcg tgtacggatg gacgcgggat tttgccaagg aaaatgccaa tccggcagga 420 tcacaggctc atcaggaagc gctggtggaa tattacattg ttgaaaactg gtgcgactgg 480 aatgtttcac aagaccctaa cgcccagagt ctgggcaccc tgaatgttga tgggtcgatc 540 tatgatatgt atcgcacaga acggatcaac caaccttcta tcaggtgcgg tggtacctgc 600 gataattttt accaatactt cagcattcgc cgcaacacac gtaacagtgg caccattgat 660 gtcagcgctc atttcaacca gtgggaagca ttaaccggcg tccctatggg tggcctgcac 720 gaagtgatga tgaaggtcga aggctacaac tcaaacaatc aatccagtgg caatgtaagc 780 tttactcaat tgctcatgcg tgcccgcttc gaggatggcg ccattgtcga gaaccagaat 840 gcggtcggcc atgcgcacgg tggagaagcg gtgggagatg atcaccgccg tcttgccctg 900 ggccaggccc ttgaagcggg cgaacacctc ggcctcggcc ttggcgtcga gggcggcggt 960 gggttcgtcg agaatgatca actcggcgtc gcgcatatag gcgcgggcga tggctacctt 1020 ctgccactcg ccgcccgaga ggtcgcggcc ctgcttgaaa aggcgcccca attgctccag 1080 agaaacgggt ga 1092 <210> 264 <211> 363 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <221> SIGNAL <222> (1)...(29) <400> 264 Met Lys Thr Asn His Pro Phe Lys Phe Gly Lys Lys Ile Cys Met Ala 1 5 10 15 Leu Ala Leu Leu Val Leu Gly Ile Gln Ala Ser Ile Ala Gln Glu Ile 20 25 30 Cys Ile Thr Ser Gly Thr Asp Gln Ile Arg Glu Thr Thr Ser Asn Gly 35 40 45 Tyr Thr His Glu Leu Trp Asn Gln Asp Thr Arg Gly Thr Ala Cys Met 50 55 60 Thr Ile Asn Ala Gly Thr Thr Tyr Ser Ala Arg Trp Asn Gly Ala Phe 65 70 75 80 Asn Tyr Leu Ala Arg Arg Gly Leu Ala Tyr Asp Gly Ser Ser Leu Thr 85 90 95 His Ala Asp Arg Gly Lys Phe Thr Ile Asn Tyr Ala Ser Asn Tyr Asn 100 105 110 Cys Asn Asn Met Asn Gly Leu Ser Tyr Leu Ser Val Tyr Gly Trp Thr 115 120 125 Arg Asp Phe Ala Lys Glu Asn Ala Asn Pro Ala Gly Ser Gln Ala His 130 135 140 Gln Glu Ala Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Trp Cys Asp Trp 145 150 155 160 Asn Val Ser Gln Asp Pro Asn Ala Gln Ser Leu Gly Thr Leu Asn Val 165 170 175 Asp Gly Ser Ile Tyr Asp Met Tyr Arg Thr Glu Arg Ile Asn Gln Pro 180 185 190 Ser Ile Arg Cys Gly Gly Thr Cys Asp Asn Phe Tyr Gln Tyr Phe Ser 195 200 205 Ile Arg Arg Asn Thr Arg Asn Ser Gly Thr Ile Asp Val Ser Ala His 210 215 220 Phe Asn Gln Trp Glu Ala Leu Thr Gly Val Pro Met Gly Gly Leu His 225 230 235 240 Glu Val Met Met Lys Val Glu Gly Tyr Asn Ser Asn Asn Gln Ser Ser 245 250 255 Gly Asn Val Ser Phe Thr Gln Leu Leu Met Arg Ala Arg Phe Glu Asp 260 265 270 Gly Ala Ile Val Glu Asn Gln Asn Ala Val Gly His Ala His Gly Gly 275 280 285 Glu Ala Val Gly Asp Asp His Arg Arg Leu Ala Leu Gly Gln Ala Leu 290 295 300 Glu Ala Gly Glu His Leu Gly Leu Gly Leu Gly Val Glu Gly Gly Gly 305 310 315 320 Gly Phe Val Glu Asn Asp Gln Leu Gly Val Ala His Ile Gly Ala Gly 325 330 335 Asp Gly Tyr Leu Leu Pro Leu Ala Ala Arg Glu Val Ala Ala Leu Leu 340 345 350 Glu Lys Ala Pro Gln Leu Leu Gln Arg Asn Gly 355 360 <210> 265 <211> 996 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <400> 265 atgaacagct ccctcccctc cctccgcgat gtattcgcga atgatttccg catcggggcg 60 gcggtcaatc ctgtgacgat cgagatgcaa aaacagttgt tgatcgatca tgtcaacagt 120 attacggcag agaaccatat gaagtttgag catcttcagc cggaagaagg gaaatttacc 180 tttcaggaag cggatcggat tgtggatttt gcttgttcgc accgaatggc ggttcgaggg 240 cacacacttg tatggcacaa ccagactccg gattgggtgt ttcaagatgg tcaaggccat 300 ttcgtcagtc gggatgtgtt gcttgagcgg atgaaatgtc acatttcaac tgttgtacgg 360 cgatacaagg gaaaaatata ttgttgggat gtcatcaacg aagcggtagc cgacgaagga 420 gacgaattgt tgaggccgtc gaagtggcga caaatcatcg gggacgattt tatggaacaa 480 gcatttctct acgcttatga agctgaccca gatgcactgc ttttttacaa tgactataat 540 gaatgttttc cggaaaagag agaaaaaatt tttgcacttg tcaaatcgct gcgtgataaa 600 ggcattccga ttcatggcat cggcatgcag gcgcactgga gcctgacccg cccgtcgctt 660 gatgaaattc gtgcggcgat tgaacggtat gcgtcccttg gtgttgttct tcatattacg 720 gaactcgatg tatccatgtt tgaatttcac gatcgtcgaa ccgatttggc tgtcccgacg 780 aacgaaatga tcgaacagca agcagaacgg tatgggcaaa tttttgcttt gtttaaggag 840 tatcgcgatg ttattcaaag tgtcacattt tggggaattg ctgatgacca tacatggctc 900 gataactttc cagtgcacgg gagaaaaaac tggccgcttt tgttcgatga acagcataaa 960 ccgaaaccag ctttttggcg ggcagtgagt gtctga 996 <210> 266 <211> 331 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <400> 266 Met Asn Ser Ser Leu Pro Ser Leu Arg Asp Val Phe Ala Asn Asp Phe 1 5 10 15 Arg Ile Gly Ala Ala Val Asn Pro Val Thr Ile Glu Met Gln Lys Gln 20 25 30 Leu Leu Ile Asp His Val Asn Ser Ile Thr Ala Glu Asn His Met Lys 35 40 45 Phe Glu His Leu Gln Pro Glu Glu Gly Lys Phe Thr Phe Gln Glu Ala 50 55 60 Asp Arg Ile Val Asp Phe Ala Cys Ser His Arg Met Ala Val Arg Gly 65 70 75 80 His Thr Leu Val Trp His Asn Gln Thr Pro Asp Trp Val Phe Gln Asp 85 90 95 Gly Gln Gly His Phe Val Ser Arg Asp Val Leu Leu Glu Arg Met Lys 100 105 110 Cys His Ile Ser Thr Val Val 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Ala Val Ser Val 325 330 <210> 267 <211> 1956 <212> DNA <213> Bacteria <400> 267 atgaagcgta aggttaagaa gatggcagct atggcaacga gtataattat ggctatcatg 60 atcatcctac atagtatacc agtactcgcc gggcgaataa tttacgacaa tgagacaggc 120 acacatggag gctacgacta tgagctctgg aaagactacg gaaatacgat tatggaactt 180 aacgacggtg gtacttttag ttgtcaatgg agtaatatcg gtaatgcact atttagaaaa 240 gggagaaaat ttaattccga caaaacctat caagaattag gagatatagt agttgaatat 300 ggctgtgatt acaatccaaa cggaaattcc tatttgtgtg tttacggttg gacaagaaat 360 ccactggttg aatattacat tgtagaaagc tggggcagct ggcgtccacc tggagcaaca 420 cccaaaggaa ccatcacagt ggatggcggt acttatgaaa tatatgaaac tacccgggta 480 aatcagcctt ccatcgatgg aactgcgaca ttccaacaat attggagtgt tcgtacatcc 540 aagagaacaa gcggaacaat atctgtcact gaacatttta aacagtggga aagaatgggc 600 atgcgaatgg gtaagatgta tgaagttgct cttaccgttg aaggttatca gagcagtggg 660 tacgctaatg tatataagaa tgaaatcaga ataggtgcaa atccaactcc tgccccatct 720 caaagcccaa ttagaagaga tgcattttca ataatcgaag cggaagaata taacagcaca 780 aattcctcca ctttacaagt gattggaacg ccaaataatg gcagaggaat tggttatatt 840 gaaaatggta ataccgtaac ttacagcaat atagattttg gtagtggtgc aacagggttc 900 tctgcaactg ttgcaacgga ggttaatacc tcaattcaaa tccgttctga cagtcctatc 960 ggaactctac ttggtacctt atatgtaagt tctaccggca gctggaatac atatcaaacc 1020 gtatctacaa acatcagcaa aattaccggc gttcatgata ttgtattggt attctcaggt 1080 ccagtcaatg tggacaactt catatttagc agaagttcac cagtgcctgc acctggtgat 1140 aacacaagag acgcatattc tatcattcag gccgaggatt atgacagcag ttatggcccc 1200 aaccttcaaa tctttagctt accaggcggt ggcagcgcca ttggctatat tgaaaatggt 1260 tattccacta cctataataa cgttaatttc gccaacggct taagttctat aacagcaaga 1320 gttgccactc agatctcaac ttccattcag gtgagagcag gaggagcaac cggtacttta 1380 cttggtacaa tatatgttcc ttcgacaaat agttgggatt cttatcagaa tgtaactgcc 1440 aaccttagca atattacagg tgtgcatgat attacccttg tcttttcagg accagtgaat 1500 gtggactact tcgtatttac accagcaaat gtaaattcag ggcctacctc ccctgtcgga 1560 ggtacaagaa gtgcattttc caatattcaa gccgaagatt atgacagcag ttatggtccc 1620 aaccttcaaa tctttagctt accaggtggt ggcagcgcca ttggctatat tgaaaatggt 1680 tattccacta cctataaaaa tattgatttt ggtgacggcg caacgtccgt aacagcaaga 1740 gtagctaccc agaatgctac taccattcag gtaagattgg gaagtccatc gggtacatta 1800 cttggaacaa tttacgtggg gtccacagga agctttgata cttataggga tgtatccgct 1860 accattagta atactgcggg tgtaaaagat attgttcttg tattttcagg tcctgttaat 1920 gttgactggt ttgtattctc aaaatcagga acttaa 1956 <210> 268 <211> 651 <212> PRT <213> Bacteria <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(30) <400> 268 Met Lys Arg Lys Val Lys Lys Met Ala Ala Met Ala Thr Ser Ile Ile 1 5 10 15 Met Ala Ile Met Ile Ile Leu His Ser Ile Pro Val Leu Ala Gly Arg 20 25 30 Ile Ile Tyr Asp Asn Glu Thr Gly Thr His Gly Gly Tyr Asp Tyr Glu 35 40 45 Leu Trp Lys Asp Tyr Gly Asn Thr Ile Met Glu Leu Asn Asp Gly Gly 50 55 60 Thr Phe Ser Cys Gln Trp Ser Asn Ile Gly Asn Ala Leu Phe Arg Lys 65 70 75 80 Gly Arg Lys Phe Asn Ser Asp Lys Thr Tyr Gln Glu Leu Gly Asp Ile 85 90 95 Val Val Glu Tyr Gly Cys Asp Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu 100 105 110 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aaacatcctg tttcgcgccg gcaagaaatg ggggttcaac 300 agcaccacga cggcgcggtc ggtcggcgcc atcacgctcg atttcgctgc gacctggacc 360 tccagcgaca acgtgaaaat gctcggcatc tacggctggg cgtattaccc gtcgggaagc 420 gagccgacga aaacggaaag cggtcaaaac acgagctttt ccgatcagat cgagtattac 480 atcatccagg accgcggagg cttcaacccg ggttccggcg gcgtcaacgc caaaaagtac 540 ggcgaggccg tgatcgacgg aatcgcctat gacttttggg tggccgaccg gatcaaccag 600 cccatgctga caggaagagg caacttcaag caatacttca gcgttccacg gaacacgagc 660 agccaccggc aaagcggcat cgtcagcatt tcgaagcact ttgaggagtg ggacaaggcc 720 ggcatgaaga tgctggactg tccgctatac gaagtcgcga tgaaggtgga atcgtatacg 780 ggctcggcga atggcggcgg gtcggcgaac gtgacccgga atattctcac gctcggcggt 840 tcttccgcac cgacccctat cgcgcgcggc cccggccggt ccgccgaaag catgcgggtc 900 gccttcgttc aggaaagagt gctcaaggtc gcgcccgtcg acggaacccg cctgcaagtc 960 aaggtgcggg acgtgaaggg cgtgaaccgg gccgagttca atgccgcggg cgcggcaacg 1020 ttctcgttgt cccatgtccc cgcgggcccg tatttcctgg atgtgacggg gccggatgta 1080 agacagatca cgccgttcgt tttgcgataa 1110 <210> 270 <211> 369 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <400> 270 Met Gly Tyr Asn Arg Ile Ile Gln Ala Ile Arg Val Ser Lys Gly Asp 1 5 10 15 Val Leu Gly Val His Lys Val Phe Tyr Ala Ala Leu Ala Cys Val Ala 20 25 30 Met Gly Tyr Ser Glu Thr Trp Ala Gln Cys Ala Thr Trp Thr Arg Ser 35 40 45 Thr Ile Arg Asn Cys Glu Gly Ile Asp Tyr Glu Leu Trp Asn Gln Asn 50 55 60 Asn Arg Gly Thr Val Asn Met Glu Ile Thr Gly Asn Gly Thr Phe Ala 65 70 75 80 Ala Thr Trp Ser Gly Thr Glu Asn Ile Leu Phe Arg Ala Gly Lys Lys 85 90 95 Trp Gly Phe Asn Ser Thr Thr Thr Ala Arg Ser Val Gly Ala Ile Thr 100 105 110 Leu Asp Phe Ala Ala Thr Trp Thr Ser Ser Asp Asn Val Lys Met Leu 115 120 125 Gly Ile Tyr Gly Trp Ala Tyr Tyr Pro Ser Gly Ser Glu Pro Thr Lys 130 135 140 Thr Glu Ser Gly Gln Asn Thr Ser Phe Ser Asp Gln Ile Glu Tyr Tyr 145 150 155 160 Ile Ile Gln Asp Arg Gly Gly Phe Asn Pro Gly Ser Gly Gly Val Asn 165 170 175 Ala Lys Lys Tyr Gly Glu Ala Val Ile Asp Gly Ile Ala Tyr Asp Phe 180 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ctctgcacaa tctttttggc aactgcaaca 60 atgggagaaa acatgacact acaagaagcc tttgccgatc acttttatgt gggagccgcc 120 atcagccaac gcctttttca accagatcgc gccgaaacgc tgcaactggc cgcgcaccaa 180 ttcaacagca tcacagccga aaatgagatg aagtggcagt cgttaaatcc cactcctggc 240 gaataccgtt tcgaaaacgc cgataaattc gtccgctttg gtgtcgaaaa cgatatgtac 300 atcgttgggc acgttctctt ctggcacagc cagacacccg actggctctt caaggatgac 360 gacggtaact tcgtctcccg cgaagtctta ctcgaccgca tgcgcgccca cgtgcgcaat 420 cttgtccagc gctacggcaa ccatgtgcac gcctgggatg ttatcaatga aaccttcaat 480 gataatggtt ccttgcgcga cagcccatgg acgcaaatcc tcggcgagga attcatcgag 540 cacgccttcc ggattgccgg cgaggaactc cccccccatg tcgagctgct ctacaatgat 600 tattcgatga ccattcctgc caagcgcgat gctgttgctg aaatggttcg cgacctcata 660 gccaaaggca tccgcattga cggcgttggc atgcagggac attgggcacg gacccacccg 720 accatagcgg acatagaaaa aagcattctt gccttcgcag gaaccggcgt acaggtacac 780 atcactgagc tcgacatcga catgctgcca cgccatcccc agatgtttac tggtggtgca 840 gacaccatgt tgcgcctaca acaagatccc aaactcgacc cctacactga gggacttcca 900 gcggaagatc agcaggcatt ggcagaacgc tacgcaagca tcttccgttt attcttgaag 960 cacagcgatg ttattcgccg tgtcaccttc tggggggtca ccgatgccca cacctggctc 1020 aacaattggc ccatccgtgg ccgcaccagc catcccctgc tcttcgaccg ccagaacaac 1080 cccaaacccg ccttccacgc cgtcgtcaga ctgaagaccg aagactga 1128 <210> 272 <211> 375 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <221> SIGNAL <222> (1)...(22) <400> 272 Met Phe Ile His Asn Ser Ile Cys Ser Ala Leu Cys Thr Ile Phe Leu 1 5 10 15 Ala Thr Ala Thr Met Gly Glu Asn Met Thr Leu Gln Glu Ala Phe Ala 20 25 30 Asp His Phe Tyr Val Gly Ala Ala Ile Ser Gln Arg Leu Phe Gln Pro 35 40 45 Asp Arg Ala Glu Thr Leu Gln Leu Ala Ala His Gln Phe Asn Ser Ile 50 55 60 Thr Ala Glu Asn Glu Met Lys Trp Gln Ser Leu Asn Pro Thr Pro Gly 65 70 75 80 Glu Tyr Arg Phe Glu Asn Ala Asp Lys Phe Val Arg Phe Gly Val Glu 85 90 95 Asn Asp Met Tyr Ile Val Gly His Val Leu Phe Trp His Ser Gln Thr 100 105 110 Pro Asp Trp Leu Phe Lys Asp Asp Asp Gly Asn Phe Val Ser Arg 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cgtagttaac 600 gaggcgcacc caaatcacgc ccccgctcgc tatgcgcaga atgccttcgg caatgactgg 660 attaccgaag cgttcaaact ggcgcgccgg cactgcccca acgccatttt gatctacaac 720 gactataatt tcatcacttg ggataccgat gaaatcatgg cgctgattcg cccggctatc 780 gcagcagggg tagtggatgc ggtagggctg caggcgcata gcttgtatcc tgacgaatac 840 gctaacaaga tgtggagtgc cgctgaaata cagcagaagc tcgatctgat ctctaccctt 900 ggcgtgccga tgtatatttc ggaatatgat gtcgccaagt ccaatgacca agagcagttg 960 gcgattttca gcgagcagtt cccggtcctt tacgaacacc ccaatgtcgt aggtgtaacc 1020 ctctggggct atattgatgg agcgacgtgg cgcgccggct cgggcttgat tcgaaacggt 1080 cagcaccggc ccgccatgca atggctgctc gagtacttgg agaacaatcg atag 1134 <210> 274 <211> 377 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <221> SIGNAL <222> (1)...(74) <400> 274 Met Val Ser Ser Leu Ile Asn Ser Ser Tyr Ile Arg Leu Lys His Tyr 1 5 10 15 Ser Cys Ser Ser Leu Leu Leu Leu Thr Leu Ala Ala Cys Gly Gly Gln 20 25 30 Gln Pro Pro Pro Asp Thr Gly Ser Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser 35 40 45 Ser 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ataaattttt cctttatttc 300 gcgaacagcg gcggagggat tggcgttctg acagcagact cccccatcgg tccatggaca 360 gatcctatcg gaaaagcact cgtcacgcca aatacaccag ggatggctgg agttgtatgg 420 ctttttgatc ctgccgtttt tgtagatgat gacggcactg gttatctata tgccggcgga 480 ggtgttccag gcggttctaa tccaacgcag ggacaatggg cgaatcctaa aacagcaaga 540 gttctaaaac taggacctga tatgacaagt gtggtaggca gcgcatcaac cattgatgct 600 ccttttatgt ttgaagattc ggggatgcat aagtataacg gaacctatta ctattcctat 660 tgcatcaact ttggcggctc ccacccagca gataaaccac ctggtgagat cggttatatg 720 acgagctcaa gtccgatggg tccctttacg tatagagggc acttcctgaa aaatccgggt 780 gcatttttcg ggggaggcgg taataaccat catgctgtgt tcaattttaa aaacgagtgg 840 tatgtcgtgt atcataccca aacggtcagc tctgctttat acggatcagg aaaaggctac 900 agatctccgc atattaataa acttgtgcat aatgctgacg gctcccttcg agaagtcgca 960 gccaattttg aaggggttaa acagctttcc aacctgaatc cttatcagcg tgtagaagct 1020 gaaacattcg catggaatgg acgcattttg acagaggcat cttcagctcc aggcggaccg 1080 gtcaataacc agcatgtcac aaacattcaa aacggagatt gggtggctgc cagtaacgtc 1140 gatttcggat caaacggcgc gaggacattt aaagcgaatg tagcatcaaa tacaggcggg 1200 aaaatagaag tacgcctcgg aagtccagac ggcagactcg tcggaacact gaatgtccct 1260 tccacagggg gaacaaataa ctggcgagaa gtagaaacgg cagtaaatgg agcagcaggc 1320 gtgcacaacg tattttttgt ttttactgga acaggtgcaa atctatttca atttgattcc 1380 tggcagttta ctcaaaggta a 1401 <210> 276 <211> 466 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <400> 276 Met Gly Ala Asp Pro Phe Ala Leu Thr Tyr Asn Gly Arg Val Tyr Ile 1 5 10 15 Tyr Met Ser Ser Asp Asp Tyr Glu Tyr His Ser Asn Gly Thr Ile Lys 20 25 30 Asp Asn Ser Phe Ala Asn Leu Asn Arg Val Phe Val Ile Ser Ser Ala 35 40 45 Asp Met Val Asn Trp Thr Asp His Gly Ala Ile Pro Val Ala Gly Ala 50 55 60 Asn Gly Ala Asn Gly Gly Lys Gly Ile Ala Lys Trp Ala Gly Ala Ser 65 70 75 80 Trp Ala Pro Ser Ala Ala Val Lys Lys Ile Asn Gly Lys Asp Lys Phe 85 90 95 Phe Leu Tyr Phe Ala Asn Ser Gly Gly Gly Ile Gly Val Leu Thr Ala 100 105 110 Asp Ser Pro Ile Gly Pro Trp Thr Asp Pro Ile Gly 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accaaatggg aggctatcca tcccgaaccc 240 ggtgtctatg attttaaaga ggctgatgca ttcgtcgatt ttggccaaaa atataatatg 300 ttcatggtgg gtcatacact ggtttggcat agtcagacac cgcgctgggt cttcaaagac 360 gaaaatggcg cgttggtatc gcgcgaggta ctgttagagc ggatgcgcga ccacatccac 420 accgttgttg gccgctaccg tggacgtatt cacggctggg atgtcgtaaa cgaagccctc 480 aatgaagacg gttcgtacag agaaacactg tggtaccaaa taattggtac ggactatatt 540 cttaaagcat tcgaatttgc ccgggaggcc gatcccgacg ctgagctata ctataacgat 600 tactcgcttg agaacccctc aaagagagcc ggcgcgatgc gaattgttca atacctgcag 660 gaacatggtg ctccgattac tggggttgga acccaggggc atttcaccct cgactggccc 720 gaactttctg aaattgaaca gaccgtcatt gattttgcct cccttggtat ggatgtaatg 780 attaccgaat tggatatcga tgtactgcct cagccagacg attatactgg cgccgatgtg 840 aattttagcg cagagcttta cgacgaactg aacccatggc ccaacggcct tccaccggaa 900 attgaacagg aattggccaa tcgatatgcc gacatcttcg aaatctattt gcgtcatcgt 960 gataaagtta cgcgagtgtc tttttggggt gtcacagatg gcgactcgtg gaaaaataac 1020 tggcctgtgc caggtcgtac caactatccg ctcatttttg atcgaaactg gaagccaaaa 1080 cccgcttttt tctcgattgt tgatgcagcc agggaggcac tggattaa 1128 <210> 278 <211> 375 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <221> SIGNAL <222> (1)...(19) <400> 278 Met Arg Asn Thr Leu Ile Leu Leu Ile Pro Ala Leu Met Met Leu Ser 1 5 10 15 Cys Ser Ala Gly Asn Gln Asp Arg Val Pro Ser Leu His Ala Glu Phe 20 25 30 Ser Asp Ala Phe Leu Ile Gly Thr Ala Leu Asn Ser Glu Gln Ile Leu 35 40 45 Gly Arg Asp Thr Arg Gly Leu Glu Leu Ile Arg Thr His Phe Asn Ala 50 55 60 Ile Thr Pro Glu Asn Ile Thr Lys Trp Glu Ala Ile His Pro Glu Pro 65 70 75 80 Gly Val Tyr Asp Phe Lys Glu Ala Asp Ala Phe Val Asp Phe Gly Gln 85 90 95 Lys Tyr Asn Met Phe Met Val Gly His Thr Leu Val Trp His Ser Gln 100 105 110 Thr Pro Arg Trp Val Phe Lys Asp Glu Asn Gly Ala Leu Val Ser Arg 115 120 125 Glu Val Leu Leu Glu Arg Met Arg Asp His Ile His Thr Val Val Gly 130 135 140 Arg Tyr Arg Gly Arg Ile His Gly Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Leu 145 150 155 160 Asn Glu Asp Gly Ser Tyr Arg 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gtttgggcgt caaggtgatg 780 atctga 786 <210> 280 <211> 261 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <221> SIGNAL <222> (1)...(22) <400> 280 Met Leu Ser Pro Thr Arg Lys Leu Pro Pro Ala Ile Gly Leu Thr Phe 1 5 10 15 Leu Phe Ala Ala Ser Ala Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Asp Ala Phe 20 25 30 Ala Asp His Phe Leu Val Gly Ala Ala Leu Asn Glu Ser His Phe Ala 35 40 45 Glu His Asn Pro Ala His Ala Gly Leu Val Ala Ala Asn Phe Asn Ala 50 55 60 Ile Thr Ala Glu Asn Val Met Lys Trp Glu Ala Val His Pro Arg Pro 65 70 75 80 Gly Glu Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Asp Arg Phe Val Glu Phe Gly Glu 85 90 95 Lys Asn Gly Leu Phe Ile Val Gly His Thr Leu Ile Trp His Ser Gln 100 105 110 Thr Pro Ala Trp Val Phe Glu Asp Glu Asn Gly Ala Pro Leu Gly Arg 115 120 125 Glu Ala Leu Leu Glu Arg Met Arg Asp His Ile His Thr Val Ala Gly 130 135 140 Arg Tyr Arg Gly Arg Val Lys Gly Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Leu 145 150 155 160 Ala Glu Asp Gly Ser Leu Arg Asp Ser Pro Trp Arg Arg Ile Ile Gly 165 170 175 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420 gccgacggct ccaccgccct gcgcacctcc aactggaccc gcgtggtggg gcaggatttt 480 gtggcccgcg ccttcgagat cgccgataaa tacgcgcccg aagatgtgat gctctgctac 540 aacgattatt ccactcccta tgagcccaag ctcaccggca tcgtgaacct gctcaccgag 600 ctgacacagg agggtcatat cgacggctac ggcttccaga gccactacag tgtcggcgat 660 ccctccctgc aggcggtcga gaacgcgttc aaaaagatct ccgccctggg gctcaagctg 720 cgcgtgagcg agctggacat caaggtagat gccgacagcg agcccaaccg cgcccttcag 780 gccgaccggt atgaggccct gctgcgcatc tatatgaaat acggcgtcag cgccgtgcag 840 gtgtggggcg tatgcgacgg caccagctgg atcggcgcga gctatcccct cccctttgac 900 gccgggctgc gtcccaagcc ctccttcttc ggcatactcc gcgcccttga cgaacagaac 960 tga 963 <210> 282 <211> 320 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <400> 282 Met Gly Thr Cys Met Ser Gly Ala Asp Ser Arg Asn Pro Ala Arg Leu 1 5 10 15 Glu Leu Ile Arg Thr Gln Tyr Ser Ile Ile Thr Pro Glu Asn Glu Leu 20 25 30 Lys Pro Asp Ser Val Leu Asp Val Ala Ala Ser Arg Ala Leu Ala Lys 35 40 45 Glu Asp Asp Thr Ala Val Ala Val 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540 agtgatgtag aaggagaaga tggtgggagc tctatttcaa ggccaccggc tttacctttt 600 gaaactattg actttgaaga tcaaagttta agtggatttg agggacgagc aggcacggaa 660 acattgaccg ttacgaatga agcaaataga actcctggag gatcttatgc actaaaagtg 720 gaaaatagat ctcaaaattg gcatggacct tccttacgca tcgagaaata tattgattta 780 ggttacgaat atacaatttc tctatgggtt aaacttattt cacccacaag tgcacaaatt 840 cagctttcta cccaagtcgg aagtggaagt ggtgcgagtt ataacaatat tttaagtaaa 900 gtaattagtg ttgatgatgg atgggtactg tatgaaggaa agtatcgcta caatagttcg 960 ggaggggaat atttaacaat ttacgtagaa agcccaaaca atagtactgc atctttttac 1020 atcgatgata ttcgtttaat aaagagtgga gacccaatct ctgtacaaaa agatcttctc 1080 cctatcaaga gtgtttatga aggtgacttc ttagttggta gtgccgtatc agcgactgat 1140 ttagagggag agagactcga gcttctcaag ttgcattaca atagcataac agcggaaaac 1200 gccatgaaac ctagctattt acaacctact aaaggaaact ttaccttcga agcagcagat 1260 agtattgtaa ataaagccct agaagaagga atgaaagtac atggacatgt tctcgtatgg 1320 catcagcaga cacctgaatg gatgaccact agagaagatg gaagccctct cggcagggaa 1380 gaagcgttag aaaatctaaa aaatcacatt gaaacagtta tgaaacattt tggtgataga 1440 gtaatttcat gggatgttgt caatgaagct atcattgata atccacctaa tcctgataat 1500 tgggaggaat cattaagaaa atcaccatgg tactattcaa tcggttctga ttatgttgag 1560 caagcattcc gaattgcacg acaagttttg gacgaaaatg ggtgggatat taagctatat 1620 tacaatgatt acaatgaaga taatcaaaga aaagcacaag ccatttacca tatggtaaaa 1680 gagcttaatg aaaaatatgc acaagagcat cctggtaaaa gattaatcga tggaattgga 1740 atgcaagggc attacagtat acgaacaaat ccagataatg tgaaaatgtc attagaaaga 1800 tttatttccc ttggtgtgga agttagtatt actgaactcg atattcaagc tggaacggat 1860 aatcatctta cggaagaaca gtcaaaagca caagcatatt tatacgctaa attattcaaa 1920 atattcaaag aaaatgcatc gcatatctcc cgagttacgt tatggggatt aaatgatgcg 1980 gcaagttggc gtgcgtcaac aagtccattg ttatttgatc gaaatttaca ggccaaacca 2040 agttactatg cggtaattga tcctgataca tttatagaag aaaatcctac tgtgacagaa 2100 gagtcgcgga aagcaattgc tttgtatggt atccctgtaa ttgatggaag catcgattcc 2160 atttgggaaa gtgttcctta catccctatt gatcgttacc aaatggcgtg gcaaggagca 2220 agcggaactg ctaaagttct ttgggacgaa gggaatctgt atgtattagt acaagttaac 2280 gatgaccagt tagataagtc gagtacaaat ccttgggagc aggattcgat agaggtgttt 2340 gtggacgaaa ataatgcaaa aacatcgttt taccaagagg atgatggaca atatagagta 2400 aactttgaca acgaaacatc gtttaatcca ccaagcattg aaaatggatt tatgtccgaa 2460 actaatgtat ctgggactaa ttatgtggtg gagatgaaaa tccctttaag aagtatacaa 2520 ctaaaaaatg ggtctgaaat agggtttgat gttcaaatta atgatgggaa aaatggtgct 2580 cgtcagagtg tggctgcttg gaatgatacg actggaactg catatatgga tacatctgta 2640 ttcgggacac ttactctttt aaccacttta gataatgaaa atacaccagg cagcggcaca 2700 acaccaggta gtggcacaac accaggcagt ggcacaacac caggcagcag cacaacacca 2760 ggcagcggta caacaccagg tagcggcaca acaccaggca gtggcacaac accaggcagc 2820 ggcacaacac caggcagtgg cacaacacca ggcagtggca caacaccggg cagcggtaca 2880 acaccaggca gtggcacaac accaggcagt ggtacaacac cgggcagtgg cacaacacca 2940 gtgaagggtg aaaatggtac ggttgtttta cagccgaaag tagagacgaa agaaaaagac 3000 ggcaaagtag tagaaaaagt ggcaactatt tcaacaaatg aagttgaagc gattgtcaag 3060 gagctgtcga atgaaaataa acaagtcgtc gtctccctcg gctcgcttcc aaaaggtgta 3120 gccacaaaag tagatgtgcc agctacatta tttacacaag cggcaaataa acaagcagaa 3180 gcaacgattg tgagcgccag tgaacaagcg acgtacaaat tgccagtcaa agaagtgcag 3240 gcgtctcttg cgacgattgc ccggtcactc ggtgcaacga tagaacaagt tagcatctcg 3300 attgaaatga aagtgaacga tgcgccgtca ctacgtgtga aaccgttgtc tgatgcggta 3360 gagtttcatg tcgtggcgaa agcaaatgga aaggaacgcg tcatcgatcg gtttactcaa 3420 tatgtcgaac gcgaaatcgc gttaaagcaa tcggtcaacg ctagtcgtgc cattgcagtg 3480 cgcgtgaacg atgacggttc acttacccca gtaccgacaa cgtttgttgg caacaaagca 3540 gtcattaaat cgttgacgaa ctcgacgtat gttgttgtgg aaggaacaca tacatttagt 3600 gacatccaac cacattgggc gaaaggttat attgaaacac tcgcggcaaa acagcttgtc 3660 aaagggatga cggacacaac atatcgacca aatgatcgga tgacgcgcgc gcaatttgcg 3720 gtgttgctcg tacgggcgct aggattgccg agcgaaacgt atgacggtcg ctttgctgat 3780 gtgaagggaa cggagtggtt taacaagaac ggtgaattag cagcggcagt caagttcgga 3840 atcattcaag gaaaaacagc ttatatgttt gcgccgaatg agccaatcac tcgcgcacaa 3900 gcagctgtca tgatcgaacg ggcattgaaa ctttcgatcg ttggctatga tgaggcaaca 3960 agcgacaaaa cgaaaaaagt gacagatttc cgcgatgcaa aacaattgcc aacatgggca 4020 aaacaggcga ttgaagcagt ataccaagca ggcatcatgc aaggacgaga tagcggaaac 4080 tttgatccga caagccatgt gacgcgtgcc gaaatggcga aggtgttaat ggatatttta 4140 gagttgacaa aacttattta a 4161 <210> 284 <211> 1386 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <221> SIGNAL <222> (1)...(28) <400> 284 Met Tyr Lys Ser Phe Val Lys Lys Val Ser Leu Val Leu Ser Thr Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Val Ser Ala Phe Pro Val Ser Tyr Ala Gln Met Asn Ser 20 25 30 Ile Pro Val Tyr Glu Glu Thr Phe Glu Asn Gln Gly Asn Tyr Val Gln 35 40 45 Ser Gly Gly Ala Thr Leu Thr Leu Val Lys Asn Lys Val Phe Ala Gly 50 55 60 Asn Glu Asp Gly Thr Ala Leu Tyr Ile Ser Asn Arg Ser Asn Asn Trp 65 70 75 80 Asp Gly Ala Asp Phe Arg Phe Thr Asp Leu Gly Leu Gln Asp Gly Lys 85 90 95 Thr Tyr Thr Ile Asn Ile Ile Gly Tyr Val Asp Glu Asn Glu Val Val 100 105 110 Pro Ser Gly Ala Gln Val Tyr Leu 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acaggctgga gaggcggtga gcctgtgggc 1500 ctgtgggacc agaattacaa ccgcaagtat gcgtacgcag gatttgcaaa cggacttaga 1560 gcgaaataa 1569 <210> 286 <211> 522 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <400> 286 Met Asn Arg Asn Thr Ser Pro Asp Phe Lys Leu Gly Ala Gly Val Thr 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Leu Asn Lys Gly Arg Gln Tyr Glu Val Ala Val Ala 20 25 30 Asn Leu Asp Glu Met Thr Ala Gly Asn Ala Met Lys Gln Ser Ser Val 35 40 45 Met Arg Pro Asp Gly Ser Met Asp Phe Thr Gln Val Arg Arg Phe Ile 50 55 60 Glu Glu Ala Glu Arg Val Gly Met Thr Val Tyr Gly His Thr Leu Ala 65 70 75 80 Trp His Ser Gln Gln Gln Asn Ala Tyr Leu Asn Gly Leu Ile Lys Gly 85 90 95 Lys Lys Thr Glu Val Glu Pro Gly Gln Glu Ser Glu Val Val Leu Leu 100 105 110 Gln Thr Asp Phe Asn Asp Gly Asn Val Thr Phe Asn Gly Trp Gly Asn 115 120 125 Asn Ser Ser Arg Thr Val Glu Asn Gly Ala Leu Lys Leu Thr Asn Pro 130 135 140 Ser Val Val Asn Ser Trp Glu Ala Gln Phe Ala Tyr Asp Phe Ser Glu 145 150 155 160 Ala Phe Glu Met Asp 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acaatttcgc ccgtgcgaac 1020 ggtattcctg taaaagcgca cactctggtg tggggcagtc agcaaccggg ttggattggc 1080 ggcttgagtg ccgctgagca gcgcgcggaa attgaagagt ggattcgcga ttactgcgca 1140 cgctacccgg atacggcgat gatcgatgtg gtgaatgaag ctctgccttc gcacgctccg 1200 gcaaactatg cggccaatgc atttggaagc gattggatca ctgaatcctt ccgtttggca 1260 cgtcagtact gtccggatgc cgtgctgatc tacaacgact ataacttcat gacctgggac 1320 accgatgcca tcattcagat gattcgccca gccgtgaact ccggttatgt cgatgcactg 1380 ggtcttcaag cgcacagcct gtattcccca caagtctgga ccgctcagca aatccagagc 1440 aaattggatc agatttccga gttgggcttg ccgctgtaca tctccgagta cgacatcgaa 1500 gcaacgaatg atcagactca gttacagtac atgcagatgc acttcccgat cttctacaac 1560 catcccaacg tggccggtat taccctttgg ggttatgttg tgggtgctac ctggcgtgat 1620 ggcactggcc tgatccaaag caatggtcag cagcgcccgg ccatgcagtg gttgatggag 1680 tatctaaacc gctaa 1695 <210> 288 <211> 564 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <221> SIGNAL <222> (1)...(23) <400> 288 Met Thr Ile His Leu Gln Lys Asn Leu 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atgaaatggg aggaaattca acccacggaa 240 ggcaactttg attttaaagc ggccgatcag ttggttgcgt ttgccgaaca acatcaaatg 300 tggatgatcg gccataccat tctgtggcat gaacaaaccc cagactgggt gtttcagggg 360 ctggatggca aacccgccag caagcagctg ctactggccc gcttgaccaa acatatccaa 420 acggtcgttg gccgttacca gggccgggtc aatggctggg atgtggtgaa tgaagcgctc 480 aatgaagatg gcagcctgcg cgataccccg tggcggcgca ttttgggtga tgattacatt 540 gccaccactt ttgcgttggt gcatcaggtc gaccctaaag ccaaactcta ttacaacgat 600 tacaacctgt ttaaaccgga aaaacgcgcc ggggtgctgc ggattatcca acaactgcag 660 caaaaaaatg tgcctattca tgccattggt gaacaagcgc attacggcct tgattcgcct 720 gcattcaaag acgttgaaga ttcgatcaac gcttttgctg ccaccggcct ggacgtgatg 780 ctaaccgaac tggagatttc agtattgccg tatccatccg gcatgacgca gggtgccgat 840 atcagtcagc atcaggaatt gcaggaacaa ctaaacccct atcgcgatgg tttgcccaaa 900 gccgtcgaac aagcctggca acaacggtat ctcgatttgt tttcgctgtt attacgccag 960 cagcaaaaac tgcatcgcgt gaccttctgg ggcttagatg atggccaaag ctggcgtaat 1020 aatttcccga tgcgcggtcg caccgattac ccactgctgt ttgatcgcaa gctgcaagcc 1080 aaaccgctgt taagcgcact gacggcatta gccgcagacc agactaaagc caagcccaaa 1140 atgaatcagc tgggctttgc gccgacttcg accaaactgt tgattgtgcc gggtcggcaa 1200 tcagtgcctt ttcatgtttt ggataccgag accggccaaa cggtgctgca aggccaaagt 1260 tcggcggcca ggttttggcc tgaatcgggg gaatgggtca gtgctgccga tttttctgcg 1320 gtgataactc ccggcaccta tcagatcaac atctcaggaa cgccgccaca aactgtcaag 1380 atccaggccg aaccctatgc cgcgctgcat gatgcggcaa tcaaagccta ttattttaac 1440 cgcgcctcgc tcacactgga gccaaagttt gccggacctt gggcacgcgc agcggggcat 1500 ccggatacca aagtacgggt gcatgcttct gctgcatcgg ccagcaggcc agaaggttat 1560 gagctcagcg ctgccaaagg ctggtatgac gccggtgact acaacaaata cgtggtgaat 1620 tccggcatta ccagttacac cctgttgcag gcctggcagg attttcctga gttttatcaa 1680 agccggacct ggaatattcc ggagtccggc aacgcggtac cggacattct cgacgaaacc 1740 ttatggaatc tgcagtggtt cagcgccatg caagacccaa acgacggggg cgtctatcac 1800 aagctgactg aactgaattt ttcggcaacc caaatgccgg accaagtgac agcagagcgt 1860 tatgtggtgc aaaaaaccac cgccgcggca ctgaatttcg ctgcggtgtt ggccaaagcc 1920 agtacggttt ttgccaaatt tgacgcccag ttgcccggcc tgtcgcaaca ataccgtcag 1980 caagcactgc tcgcctggca atgggcgcaa aaaaatccgc agcaaatcta tcaacaaccc 2040 aaagatgtcc acactggcgc ttatggtgac aaacaactgg ctgatgaatg ggcctgggct 2100 ggcgccgagc tgtatttatt gaccggcgag caaagttatc tgcagccact gttggcgctg 2160 gacacgccaa tcagtgcagc atcctgggcc agtgtcagcg ctttggggta tttttctttg 2220 gcttcggcga aacagcttga gcccgcacta cggcaacagg tacaacagaa aatccaacaa 2280 gccgccgcgc aaatcctgca ggaacatcaa acatccgcct atcaggtggc gatgaccaaa 2340 aacgattttg tctggggcag taatgcggtg gcaatgaata aagcgatgtt gttataccag 2400 gcgtggaaaa tagcgccaaa accggagctg ctacaggcga tgcaaggtct ggttgattac 2460 gttttggggc gcaacccgtt gcagcagtct tatgtcacag ggtttggcga gcaaagcccg 2520 cagcagatcc accaccgacc ttcggccgcc gatgccatca aagcgccggt accaggttgg 2580 ttagtcggtg gtgcacagcc gggtaagcag gataaatgca cttatgccgg cgctttaccc 2640 gctgtcggcg ctttacccgc tgccagcacc ttaccagcca ccacttatct tgatgactgg 2700 tgcagttacg ccaccaacga agtggcgatt aactggaatg 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acgacccaaa gaattgaaaa aacagatgct 1080 aatggccatg tgagatgtcc agcatttcac ggaacatatg aggttcgaat cggtaaagaa 1140 agtaaaatgt tgaaacagca gacgattgaa cttgattcaa atgaacaaac accgtttcaa 1200 ctagacgtga tcctgcctca agaaggatag 1230 <210> 292 <211> 409 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <400> 292 Met Val Lys Glu Arg Ser Phe Leu His His Ser Phe Asn Arg Gly Glu 1 5 10 15 Asn Gly Gln Asp Ser Leu Met Trp Lys Lys Glu Ala Asp Asp Arg Ile 20 25 30 Ser Glu His Arg Gln Arg Asp Leu Val Ile Asn Val Thr Asn Gly Glu 35 40 45 Lys Lys Pro Ile Ala Gly Ile Glu Val Glu Ile Lys Gln Ile Arg His 50 55 60 Glu Phe Ala Phe Gly Ser Ala Met Asn Asp Gln Val Leu Phe Asn Gln 65 70 75 80 Gln Tyr Ala Asp Phe Phe Val Lys Tyr Phe Asn Trp Ala Val Phe Glu 85 90 95 Asn Glu Ala Lys Trp Tyr Ala Asn Glu Pro Gln Arg Gly Arg Ile Thr 100 105 110 Tyr Glu Lys Ala Asp Ala Met Leu Asn Phe Ala Asp Arg His Gln Leu 115 120 125 Pro Val Arg Gly His Ala Leu Phe Trp Glu Val Glu Asp Ala Asn Pro 130 135 140 Ser Trp 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tataatgaat gttttccgga aaagagagaa aaaatttttg cacttgtcaa atcgctgcgt 600 gataaaggca ttccgattca tggcatcggg atgcaagcgc attggagttt gactcgcccg 660 tcgcttgatg aaattcgtgc ggccattgaa cgatatgcgt cccttggtgt tgttcttcat 720 attacggaac tcgatgtatc catgtttgaa tttcacgatc gtcgaaccga tttggcagct 780 ccaacgtcag aaatgatcga acggcaggca gagcggtatg ggcaaatttt tgctttgttt 840 aaggagtatc gcgatgttat tcaaagtgtc acattttggg gaattgctga tgaccataca 900 tggctcgata actttccagt gcacgggaga aaaaactggc cgcttttgtt cgatgaacag 960 cataaaccga aaccagcttt ttggcgggca gtgagtgtct ga 1002 <210> 294 <211> 333 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <400> 294 Met Lys Met Asn Ser Ser Leu Pro Ser Leu Arg Asp Val Phe Ala Asn 1 5 10 15 Asp Phe Arg Ile Gly Ala Ala Val Asn Pro Val Thr Ile Glu Met Gln 20 25 30 Lys Gln Leu Leu Ile Asp His Val Asn Ser Ile Thr Ala Glu Asn His 35 40 45 Met Lys Phe Glu His Leu Gln Pro Glu Glu Gly Lys Phe Thr Phe Gln 50 55 60 Glu Ala Asp Arg Ile Val Asp Phe Ala Cys Ser His Arg Met Ala 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tggaaccttt gaggcgacat ggagtggcac gatcaatgtt 300 ctattccgcg cgggtaaaaa atggggcaca tccagcacca gtacccccaa aaccatcggc 360 aatatctctc ttgaattcgc agcgacatgg agttcggtcg ataatgtgaa aatgcttggc 420 atctatggct gggcgtatta tccctcggga agcgaaccaa caaaaacgga aagcggtcaa 480 agcacgaact tttccaatca gattgagtat tacatcattc aagaccgcgg tagctataac 540 ccggcatccg gcggcaccaa cgccaaaaag tacggtgaag ggacgatcga cggaatcgcg 600 tatgattttt atgtcgccga ccgtatcggc caggccatgc tgacaggaac gggaaatttc 660 aaacagtact tcagcgtgcc gaagagcaca agcagtcaca ggcaaagcgg cacggtttcc 720 gtctccaaac attttgaggc ctgggaaaaa gcgggcatga agatgatgga ttgtcggtta 780 tacgaagtcg cgatgaaagt ggaatcgtat accggttccg cgaatggcaa cggctcggcg 840 aaagtgacca aaaatctcct cacgatcggc ggaagcagca gcaacgagtt tagtctcgta 900 acgaatgttt ctcctgccag cgcgggaacg gtgtccaaga gcccggacaa cgcatcctat 960 gccccgaacg cctccgttca gctcacggcg accccgaata ccggttggaa gtttgtgggc 1020 tgggaagggg acgcctcggg ttccacgagc ccaaccagcg ttaccatgag caaagacctc 1080 acggttacag cgaagtttga gctggtatcg gaagaaggca gcacaaacct gatccaggat 1140 ggcaacttcc cgagcggcag cgtaatctct acagatgacg gggcttcatg gaaactcgga 1200 caaggggaaa actggggaaa ttccgcagcc acaacgagcg tcagcaatgg aatcgcgaca 1260 gtcaatgtga caactgtcgg agcggaagct tatcaaccgc agcttgtaca gtacggtttg 1320 ggactcgaca tggacatgag ttacaaactt accttcaagg caagagccga tgcggcaagg 1380 aagattgaag ttgcgttcca gcaggcggtg gatccttggg ctggttatgc ttcccaggaa 1440 ttcgacctga ccacgaccga tcaggatttc gagttcgtat tcacgatgac caacgccagc 1500 gacccggcat cacagttcgc gttcaatctt ggccaggcga caggcgatgt ctatatcagt 1560 gatgttaaac tggtatacac gacaggcacc acacccatat cccgcaccat agtccgcggc 1620 aatacggcat tcgtctcggt aagtggcaga accctgaata tttcggcagt cgacgcgtcc 1680 acacttcaga tcaaggtagt agatataaac ggaaaggtaa gagcgaattt caacacggct 1740 ggtgcagcaa gtgtttcctt gtccaatatt cctgcgggcc agtacttcgt tggtatcaca 1800 ggcacaggca taaaacaaat ctcaccgatc gttttggaat aa 1842 <210> 298 <211> 613 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <400> 298 Met Arg Ser Gly Ala Phe 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<400> 299 atgtttttga gtctcaaaag agtggcggcg cttgtttgcg tcgccggtct cggcatctct 60 gcggcccaag cacagacctg cctgacctcg agtcaaaccg gcactaacaa cggcttctac 120 tattcgttct ggaaagacaa tcccggcacc gtgaatttct gtctgcagtc cggcggccgc 180 tacacctcca actggagcgg catcaacaac tgggtcggcg gaaagggatg gcagacgggt 240 tcccgcagag tggtgaacta ctcgggcagc ttcaattcgc ctggcaatgg gtacctgact 300 ctctatgggt ggaccaccaa tccgctcatc gagtactaca ttgtcgacaa ctggggcacg 360 tatcgtccgc cgggtgggca ggggttcatg ggcacggtga ccagcgatgg cgcgacgtat 420 gacgtctatc gcacgcagcg cgtcaatcag ccctgcatca ccggcagcag ttgcacgttc 480 tatcaatact ggagcgtgcg gcagtcgaag cggaccggtg gcacgatcac caccggcaac 540 cacttcgatg cctgggccag ctacggaatg aatctgggcg ctcacaacta ccagatcatg 600 gcgaccgagg gctatcaaag cagcggcagc tctgacatca cggtgagtga gggaagcagc 660 agcagtagca gcggtggtgg cagcagcacg agcagcagtg gcggcggcgg caccaagagc 720 ttcacggtcc gggcgcgcgg aaccgcgggt ggtgagtcca tcacgctgcg tgtgaacaat 780 cagaacgtgc agacctggac gctgggcacc agcatgacga actacacggc atcgacgtcg 840 ttgagcggtg gcatcaccgt ggcttacacg aacgacagtg gcaatcgcga cgtgcaggtg 900 gattacatca tcgtgaacgg ctcgacgcgt cagtcagaag cgcagagcta caacaccggg 960 ctctatgcca acggtagttg tggtggcggc tccaatagcg aatggatgca ttgcaacggc 1020 gccattggct acgggaatac gccgtag 1047 <210> 300 <211> 348 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <221> SIGNAL <222> (1)...(24) <400> 300 Met Phe Leu Ser Leu Lys Arg Val Ala Ala Leu Val Cys Val Ala Gly 1 5 10 15 Leu Gly Ile Ser Ala Ala Gln Ala Gln Thr Cys Leu Thr Ser Ser Gln 20 25 30 Thr Gly Thr Asn Asn Gly Phe Tyr Tyr Ser Phe Trp Lys Asp Asn Pro 35 40 45 Gly Thr Val Asn Phe Cys Leu Gln Ser Gly Gly Arg Tyr Thr Ser Asn 50 55 60 Trp Ser Gly Ile Asn Asn Trp Val Gly Gly Lys Gly Trp Gln Thr Gly 65 70 75 80 Ser Arg Arg Val Val Asn Tyr Ser Gly Ser Phe Asn Ser Pro Gly Asn 85 90 95 Gly Tyr Leu Thr Leu Tyr Gly Trp Thr Thr Asn Pro Leu Ile Glu Tyr 100 105 110 Tyr Ile Val Asp Asn Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Pro Gly Gly Gln Gly 115 120 125 Phe Met Gly Thr Val Thr Ser Asp Gly 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<400> 302 Met Phe Lys Phe Thr Lys Lys Phe Leu Val Gly Leu Thr Ala Ala Leu 1 5 10 15 Met Ser Met Ser Leu Phe Ser Ala Asn Ala Ser Ala Ala Asn Thr Asp 20 25 30 Tyr Trp Gln Asn Trp Thr Asp Gly Gly Gly Thr Val Asn Ala Val Asn 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Asn Tyr Ser Val Asn Trp Ser Asn Thr Gly Asn Phe 50 55 60 Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr Gly Ser Pro Phe Arg Thr Ile Asn 65 70 75 80 Tyr Asn Ala Gly Val Trp Ala Pro Asn Gly Asn Ala Tyr Leu Thr Leu 85 90 95 Tyr Gly Trp Thr Arg Ser Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Val Asp Ser 100 105 110 Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Val Tyr Ser 115 120 125 Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Val Tyr Thr Thr Thr Arg Tyr Asp Ala Pro 130 135 140 Ser Ile Asp Gly Asp Lys Thr Thr Phe Thr Gln Tyr Trp Ser Val Arg 145 150 155 160 Gln Ser Lys Arg Pro Thr Gly Ser Asn Ala Thr Ile Thr Phe Ser Asn 165 170 175 His Val Asn Ala Trp Lys Arg Tyr Gly Met Asn Leu Gly Ser Asn Trp 180 185 190 Ser Tyr Gln Val Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Arg Ser Ser Gly Ser Ser 195 200 205 Asn Val Thr 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gccggtcgct gttttacaac 780 gcgctgccgc ccgcgacaga agacgatatt cctgagtaca tccgcgttgc cttccaggcc 840 gctcgcgatg ccaacccgga catcgacctc tattacaatg attacgacaa taccgccaac 900 accaaccggc tgaacaaaac cctgcagatc gccgatgccc tggccgagga cgagctgatc 960 gacggtgtgg gattccagat gcacgtctat atgacgtacc cgagccttag tcacttccaa 1020 aacgcgtttc aagaagtggt tgatcgaggc ttgaaggtga agatcaccga gctggacgta 1080 tcggtggtca acccatacgg tcagagcact ccgccaccgc agcccgtcta cgatgaagcg 1140 ttggcaggcg cacagaaaaa gcggttctgc gatatcacca gagtctatct ggaaacggtt 1200 ccggctgagc ttcgcggcgg tctcactgtt tgggggcttg ccgacaacga aagctggttg 1260 atgcaacagt tcaggaacgc aacgggagcg aactacaccg acgtgtggcc gttgttgttc 1320 aacgccgacc tgtcagccaa acctacactc caaggcgtgg ccgatgctct gcagggtctc 1380 ccctgcacca ccgacctcga ctaa 1404 <210> 304 <211> 467 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <221> SIGNAL <222> (1)...(74) <400> 304 Met Thr Ile Lys Ala Trp Pro Gly Thr Ala Ala Ser Tyr Asn Thr Asn 1 5 10 15 Arg Gly Phe Ile Met Ser 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Leu Ser Ala Lys Pro 435 440 445 Thr Leu Gln Gly Val Ala Asp Ala Leu Gln Gly Leu Pro Cys Thr Thr 450 455 460 Asp Leu Asp 465 <210> 305 <211> 3705 <212> DNA <213> Bacteria <400> 305 atgaagagta ttgtaaacag agttgtatct atcgttacag ctttaataat gatttttggg 60 acatcactgc tttcacaaca cataagggca tttgctgatg acactaatac aaatctggtt 120 tctaatgggg actttgagac aggcacaatt gatggctgga ttaagcaagg taatcctaca 180 ttagaagtaa cgactgaaca agcaattggg caatacagta tgaaagttac gggtagaaca 240 cagacatatg aaggacctgc atatagcttt ttaggaaaaa tgcagaaagg tgaatcatat 300 aatgtatcgc ttaaagttag acttgtttct ggacaaaatt cttctaatcc ttttattacc 360 gtgactatgt ttagagaaga tgacaatggc aagcattatg atacaatagt ttggcaaaaa 420 caagtttctg aagattcatg gactactgta agcgggactt atacattaga ttatactgga 480 acattaaaaa cattatacat gtatgtagaa tcacccgatc caacgctgga atactatatt 540 gatgatgttg tagtgacacc acaaaatcca atacaagtag gaaatgtgat taccaatgga 600 acttttgaaa atggaaatac ttcaggatgg gttggaacag gctcatctgt tgttaaggca 660 gtgtatggag tggctcatag cggaggttat agtttattga cgacagggag aacagctaat 720 tggaatggtc ctagctatga tttgactggc aaaatagtac caggtcaaca atacaatgtt 780 gatttttggg tgaaatttgt taatggcaat gatacagaac aaataaaggc tactgttaaa 840 gcgacttcta acaaagacaa ttatatacaa gttaatgatt ttgtaaatgt aaataaaggc 900 gaatggacag aaataaaagg cagttttact ttacctgtga cagattacag cggtgtcagc 960 atctatgtag aatctcaaaa tcctacttta gagttttaca ttgatgattt ttctgtaata 1020 ggtgaaattt caaataatca gattacaata caaaatgata ttccggattt atattcagta 1080 ttcaaagatt atttccccat cggtgttgca gttgattcga gtagattaaa tgatgctgat 1140 ccacatgctc aattgactgc taaacatttt aatatgcttg ttgcagaaaa tgccatgaaa 1200 ccggaaagct tgcagcctac agagggaaac tttacctttg ataatgctga taagattgtt 1260 gattatgaaa tagcacataa tatgaagatg agaggtcata cattgctttg gcataatcag 1320 gttccggatt ggtttttcca ggacccatct gatccgtcta aaccagcttc aagggatctg 1380 ctgcttcaaa gattaagaac gcacataaca actgtgttag atcattttaa aacaaaatac 1440 ggttctcaaa atccaataat cggatgggat gttgtaaatg aggttcttga tgataatggc 1500 aatttaagaa attctaagtg gttacaaatt ataggacctg attatataga aaaagctttt 1560 gaatatgcgc atgaggcaga tccatctatg aaattgttta ttaatgatta caacatcgaa 1620 aataatggcg ttaaaacaca ggcaatgtat gatttagtga aaaagttaaa aagtgaaggt 1680 gtgcctataa acggaatagg catgcaaatg cacataagca taaattcaaa tatagacaat 1740 ataaaagctt ctatagaaaa acttgcatca ttaggtgtgg aaatacaggt aactgaatta 1800 gatatgaaca tgaatggtaa tgtatctaac gacgcattgc ttaagcaagc gagattgtat 1860 aaacaattat ttgacttatt taaagcagaa aaacaatata taactgctgt agttttttgg 1920 ggagtttcag atgatgtaag ttggcttagt aagccaaatg ctccactact ttttgattca 1980 aagttacagg caaagccagc atactgggca attgtagatc aaggcaaagc catacctgac 2040 attcaatctg caaaagcttt agaaggatca ccgacgattg gtgcaaatgt tgatagttct 2100 tggaaacttg taaaaccatt gtatgctaat acttatgtga aaggaactat tggagcaact 2160 gctgctgtta aatctatgtg ggatactaaa aacttatatt tgttagtaca agtttcagac 2220 aatactccat ctaataatga tggtatcgag atttttgtgg ataagaatga caacaaatct 2280 actacctatg aaagtgacga tgaacattat atagttaaga gggatggtac agggagttca 2340 aatattacaa agtatgtaat gtctaatgct gatggatatg tagcacagat agctattcca 2400 attgaagaca ttagtcctgt gctgaatgat aaaattggat ttgatatcag aataaatgat 2460 gaccaaggca gtggcaatat aaatgcgata acagtttgga atgattatac aaacagtcaa 2520 gatactaata cagcatattt tggagattta gtattatcaa aacctgcaca gattgcaaca 2580 gctatatatg gcactcctgt tattgacggt aaagtagatg gtatttggaa taatgctgaa 2640 gctatttcga caaatacatg ggtcttgggt tcaaatggtg ctactgcaac agcaaaaatg 2700 atgtgggacg ataaatatct ttatatattg gcagatgtaa cagataacaa tttaaataaa 2760 tccagtgtga atccttatga acaggattct gtggaagttt ttgtagatca gaataatgat 2820 aagacaactt attatgaaaa tgatgatggg cagtttagag ttaactatga taatgaacaa 2880 agttttggag gaagcactaa ttcaaatgga tttaagtcgg caacaagtct tacacaaaat 2940 ggatatattg tagaagaagc tattccttgg acgagtatta ctccgtcaaa tggtactatc 3000 atagggtttg acttgcaagt taacgatgca gatgaaaatg gtaagaggac aggtattgtc 3060 acatggtgtg atccaagcgg aaattcttgg caagatactt ctggatttgg aaacttgatg 3120 cttacaggta agccatctgg tgtccttaaa aaggttgtgg catttaatga cataaaagac 3180 aattgggcga aagacgtaat agaagtatta gcgtcaaggc acatagtaga 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agttgtcact tgcataagac cagcaggctc tggctgcgta 600 acttgcaacg gacaacaatt cgggcaagtc tttagcatac gccaaggcat gagaagcgaa 660 caacctaaaa catgcggaac aatctccatc aaaaagcact ttgaagaatg ggtaaaaatg 720 acaaccgaaa aaagcggaca atccccagct aaatatattt acgataaaac ttatgaatcc 780 aaatttttag cggaggcaca aggcggcact ggttggcttg aaaccacttt ccttaaattt 840 tctagaaacg gtgattgcgg cttcgatatt cctgatggtc atttcaccct tcaattagct 900 acctctccgt ctgagggcgg tactgtaagc agaaacccaa aggaatcttc ttatgcctcc 960 ggttcaactg taactctcac agccactccg gcagcaggtt ggaaatttgc cagttggagt 1020 ggtgatgcat gtcaaaccac aagcccattg acagtcacta tggacaaaaa caaggtaatc 1080 acagcgaaat ttacccccgt tgtagatctc aataaaaacc ttgttacaaa tggtactttc 1140 acgaataaag agagttggac ttttaatact ggttccagtt atggcaactc cgaaggaact 1200 tttgatgtgt caaacagcga aggcagaata aatgtgacga aaattggctc caacccgtgg 1260 gaaccacagc tcgttcaaaa tggcatcacc cttgttgaag gaatgaatta caaaataact 1320 tttgaagctt ctgcctctgc tgctcgaaaa ataggcttgg ttatacaaat ggcaggcggc 1380 gattatacca cttattttga aaaagatata gacttgactg cctcaaatca acaattttcg 1440 tatgaattca aaatgaatgc accaagcgat gaaagcggtc gtattgggtt taatcttggg 1500 caaacgactg gaaacgtcac tctaagcaaa atcacccttc attatttaga agaagattca 1560 cacgaaccgt ccgacaatcc ctgcgaagac ccaagtccaa ttttgaaaaa acgcatccct 1620 gcaactcatt tctcccttca aacgcttagc gacaaagcct tgcgcataga agtgaacgct 1680 ccaaccattg tggacatttt tgacctgaga gggaataaag ttaagagttt gaatgtctcc 1740 ggctcgcaaa cggttaaatt atccctgcca agcggagtgt attttgccaa agcacgtgga 1800 atgaaaagcg tcagatttgt gttgaggtaa 1830 <210> 310 <211> 609 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <221> SIGNAL <222> (1)...(20) <400> 310 Met Lys Lys Leu Thr Ile Ala Leu Ser Leu Ala Ile Thr Phe Ala Ala 1 5 10 15 Pro Val Phe Ala Thr Asp Ala Cys Leu Gln Asn Thr Gln Leu Asn Ala 20 25 30 Thr Ala Gln Gly Ala Gln Thr Trp Thr Gly Lys Lys Gly Ala Thr Thr 35 40 45 Leu Gly Gly Ser Gly Asp Asp Ala Tyr Gly Val Glu Thr Trp Thr Glu 50 55 60 Ala Gly Gly Asp Ala Thr Lys Phe Thr Trp Phe Gly Pro Asn Gln Gly 65 70 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agttatacag tttctctgtt tgttcgtcac agtgaccaaa aacctcaaag attttcagta 360 tatgcatatg taaaagattc agcaagtgaa aaatatattc cagttgtaga taaagttgca 420 gttcctaatt attggaagca actggttggt aaattcacaa tcaacacttc aaatccagtc 480 caaaagattc agctgcttgt ctgtgttcct acaaataaat cattggaatt ttttatcgat 540 agcgtattaa ttgcaagtag tgcaggagca acatctggag ttgtaaaatc cacaaatttt 600 gaaagcggta caacagaagg ctggcaagca aggggaacag gttctgttgc tcagattagt 660 gttgtttcta cagtagctca ttcaggtagt aaaagtttgt atgtgacagg gcgagttcaa 720 acgtggcaag gtgcacaaat agatttgaca agtttgttag agaagggtaa agaatatcag 780 ttttctgtgt gggtatatca ggatagtgga agcgaccaaa agctgacact gaccatggaa 840 aggaaaaatg cagatggaag tacaaattat gatacaataa aatggcagca aacagtttca 900 agcaatacat gggtagagct aacaggttca tatacagtac ctgcaacagc aacacaacta 960 atattctaca ttgaatcacc caatgctacc ctaagctttt atattgatga ttttactgct 1020 gttgataaaa atgcaccagt tgtagcgcct ggaattataa aatcagccac atttgaaagc 1080 ggtacaacag aagactggca agcaagaggg acaggagtga ccgtttctgt tgttaacaca 1140 gtggcacata ctgggagcaa gagtttgtat gtgacaggga gaagtcaaaa ttggcatggt 1200 gcagaaattg atctgacaaa tgtgctagag aagggcaagg aatatcaatt ttctgtgtgg 1260 gtatatcagg atagtggaag cgatcagaag ctgacattga ccatgcaaag gaaaaatgca 1320 gataacacaa cagattatga ttctataaaa tatcagcaga cagtagcaac aaatacatgg 1380 gtagagctaa caggttcata tacagtgccg acaacagcca cccagttaat tttatatgtt 1440 gaagctgcag atactaccct aagcttttat attgatgatt ttactgctgt tgataaaaac 1500 ccagaggtaa taccaacagt atcgagagta ccagaatggg aaattccttc actctttgag 1560 cagtatacga attatttcag cattggtgtg gcaataccat ataaagtact tacaaatcca 1620 accgaaaagg caatggtact caaacatttc aacagtataa cagctgagaa tgaaatgaaa 1680 cctgatgcta ttcaaaagac agaagggaat tttacattta atgttgcaga ccaatacgta 1740 gattttgcac agcaaaatag aattggaatc agaggtcaca ctcttgtttg gcatcagcaa 1800 acaccaaatt ggttcttcca gcatagtgat ggtactccgc ttgatccaag caatcctgct 1860 gacaaacaac ttctacgcga tagattaaga acgcatatcc aaacacttgt tggaagatac 1920 gcagggaaaa tttatgcatg ggatgttgta aacgaggcaa ttgacgagaa ccagccagat 1980 ggatacagaa 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cgctaacaac tcacgtcgcc 60 gccgctgacc ccgcgccacc cgccaccggc cccgccatcg acttccgggc cgaactccag 120 cccatcgacg gattcggctt ctccatggcc ttccagcggg ccgacctgct gcacggcgcg 180 cgcggcctca gccccgccaa gcggcgcgag gtgctcgacc tgctgctcga caaggagagg 240 ggcgcgggcc tgtcgatcct gcgcctgggc atcgggtcgt cgaccgaccg ggtctacgac 300 cacatgccga cgatcctgcc gaccgatccc ggcgggccgg acgccccgcc gaagtacgtc 360 tgggacggct gggacggcgg ccaggtctgg ctcgccaagg aggccaaggc gtacggcgtc 420 aagcggttct tcgccgacgc ctggagcgcg ccggccttca tgaagaccaa cggcagcgag 480 aacgacggcg gcgagctccg gcccgaatgg cgccaggcct acgcgaacta cctcgtcaag 540 tacgcgaagt tctaccaacg ggaaggcatc ccgatcaccg acctggggtt caccaacgaa 600 cccgactggg cggcgaccta cgcctcgatg cgtttcaccc cgcagcaggc cgtcgacttc 660 ctcaaggtgc tcgggccgac cgtccgcgcg tccggactga agaccggcgt cgtctgctgc 720 gacgcggcgg gctgggaccg gcaggtcgcc tacaccgagg ccatcgaggc ggaccccgag 780 gccgccaagg ccgtgcggac cgtcaccggc caccgctaca gcggtccgac cacggtcccg 840 cagcccaccg acaagcgggt ctggatgtcg gagtggtcac cggacggcac cacctggaac 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atcactgagc ttgatgtgag catgtacggt 900 tggccgccgc gcgcttaccc gacgtatgac gccattccaa aacaaaagtt tttggatcag 960 gcagcgcgct atgatcgttt gttcaaactg tatgaaaagt tgagcgataa aattagcaac 1020 gtcaccttct ggggcatcgc cgacaatcat acgtggctcg acagccgtgc ggatgtgtac 1080 tatgacgcca acgggaatgt tgtggttgac ccgaacgctc cgtacgcaaa agtggaaaaa 1140 gggaaaggaa aagatgcgcc gttcgttttt ggaccggatt acaaagtcaa acccgcatat 1200 tgggctatta tcgaccacaa atag 1224 <210> 316 <211> 407 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <221> SIGNAL <222> (1)...(28) <400> 316 Met Arg Asn Val Val Arg Lys Pro Leu Thr Ile Gly Leu Ala Leu Thr 1 5 10 15 Leu Leu Leu Pro Met Gly Met Thr Ala Thr Ser Ala Lys Asn Ala Asp 20 25 30 Ser Tyr Ala Lys Lys Pro His Ile Ser Ala Leu Asn Ala Pro Gln Leu 35 40 45 Asp Gln Arg Tyr Lys Asn Glu Phe Thr Ile Gly Ala Ala Val Glu Pro 50 55 60 Tyr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Asp Val Gln Met Leu Lys Arg His Phe 65 70 75 80 Asn Ser Ile Val Ala Glu Asn Val Met Lys Pro Ile Ser Ile Gln Pro 85 90 95 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cgaaatcaag gccacggcct atatcaactg ggaatggcgc 240 gagtggtccg accgcctcgg cttccgctgg cacaactggg gcgacgcccg catcgagggc 300 aacgcccttg ttcgtgatcg ctgggtgcag gaactctccc accccatcta tctccacgcg 360 gcgcgcgacg gatcttgtcc gctgccgcca atcaccgccc tcccatccgc gaccccgtcg 420 ctccagaccg tgttccagga ccatttcctg atgggtgctg ccttgaatgt gaggcagttc 480 accgaaaacg acgcaaccaa gaccgctctc atcaagaagc aattcaacac catcacgccc 540 gagaatgttc tcaagtgggg gccggttcat cctgagccca accggttcaa cttcgaatcc 600 accgatcgtt acgtggactt tggtgtgaag aaccggatgt tcatcgtcgg ccacaccctc 660 gtctggcacc accagacacc cgcctgggtg tttcaagatt cccaaggcca gccgctcgac 720 cgggatggac tgctcaatcg cttgagcaac cacatccaca cggtggttgg acgctacaag 780 ggccgcatcc acgggtggga tatggtgaac gaggccttga acgatgacgg caccctccgc 840 cctagccaat ggcttaaaat catcggcccc gactacattg ccaaagcgtt tgcccttgcc 900 cacgccgccg accctgccgc tgaactgtat tacaacgatt acagtctcga tcatcccgcc 960 aagtgtgctg gtgcgatcgc gctggtgaag cagctccaga cgaatggcat atccattgcc 1020 gggattggca cgcagaccca cgtcggactc aacggacctt ccccccagtc ggtggatgat 1080 tcattgacgg cctttggcca gctcggcgtg aaggtcatgg ttaccgaact cgacgttgat 1140 gtgctgcccg ccgccagcca aaatcaaaac gcggatctca accagcccgc cttgtccaat 1200 cccgccctca atcccgccct caatccctat cccgatgggc tgccgcaagc cgtccaggac 1260 aaactggccg ctcgctatgc ggaactcttc gccgtgttcg tcaagcacgc cgacaaaatc 1320 agccgcgtca cgttctggtg cgtcaccgac ggcgactcct ggctgaacaa ctggcccgtg 1380 cgtggccgcg tcaactatcc gctgctgttc gaccgtgcca gccagcccaa gcccgccttc 1440 gatgcggtca ttcgcgtcgc caaggacccg ccgacggttt cgcacaatct caccccgctc 1500 cacgatgcgg cgcgggtcct ggtcaatccg cacaagggct ggtaccacca ctacccggac 1560 aatcacatca acaagtatga gatcgcccgc gatgccgacc tgacggaa 1608 <210> 322 <211> 536 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <400> 322 Met Asp Trp Trp Asp Val Asp Ile Phe Ser Ala Lys Glu Ile Thr His 1 5 10 15 Pro Gln Leu Ala Thr Phe Leu Asp Ala Ser Arg Asp His Arg Lys Pro 20 25 30 Val Met Ile Gly Glu Met Thr Pro Arg His Val Gly Val Ile Glu Gly 35 40 45 Gln Lys Cys 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tgattcgtta tattcatcaa atattagcgg cgatggatga ccagcatttc 540 gctgcagaat tgtcagctga gtgtcaatgg ccaatctttg attggatttg ccaattcgag 600 tctacttttt ctattcgcta taccggtgag gttattcaaa ctttacctat ttacctcgca 660 ttgttccaaa gacggtgggc tagaggcaaa tttgtgcaaa tggacgagca agaaaaagaa 720 gtgctaaggt caatgcggga ataccagatt gctgatcatc tcgttagacg aattgaaaac 780 gtttccgaaa tatctattcc cgatgacgag gtttgttatt tgacgaccca tttactcagt 840 tttcgagttg cagatgacaa gcaaatcgat cataacgatg acatcactac tttgaaacga 900 atcattcgac atatggtgga tgattttcaa acttatgcct gtgtacaatt caagcgtcgc 960 gaagagttgg aaaaaaattt attggttcat atgaagcctg cctattatcg actgaaatac 1020 ggttttcatc tgcaaaacga tctgaccgaa tcggtcaaag cgaactatca agatttattt 1080 accttaacga aaaaagtcgt ccatcattta gaaagtgtag ttggccagcc ggtcagcgac 1140 gatgaaattg cttatatcgc catgcatttt ggcggatggt tggacagaga gggggtgtcg 1200 gttccagtac ggaaaaaggt gttgatcgtc tgcgagagcg ggattggaac atcgcgaatg 1260 ttgcaaaaac aattggatca acgctacaaa aacgagttca cgattggtgc ggcagtagaa 1320 ccttatcaac tacaaaatga aaaagacgta caaatgctaa agcgccactt caacagcatt 1380 gttgccgaga acgtaatgaa accgatcagc attcaacctg aggaaggaaa attcaatttt 1440 gaacaagcgg atcgaattgt gaagttcgct aaggcaaatg gcatggatat tcgcttccat 1500 acactcgttt ggcacagcca agtacctcaa tggttctttc ttgacaagga aggcaagcca 1560 atggttaatg aaacagatcc agtgaaacgt gaacaaaata aacaactgct gttaaaacga 1620 cttgaaactc atattaaaac gatcgtcgag cggtacaaag atgacattaa gtactgggac 1680 gttgtaaatg aggttgtggg ggacgacgga aaactgcgca actctccatg gtatcaaatc 1740 gccggcatcg attatattaa agtggcattc caaacagcga gaaaatatgg cggcaacaag 1800 attaaacttt atatcaatga ttacaatacc gaagtggaac caaagcgaag cgctctttat 1860 aacttggtga agcaattaaa agaagagggc gttcctattg acggcatcgg ccatcaatcc 1920 cacattcaaa tcggctggcc ttctgaagca gaaatcgaga aaacgattaa catgttcgcc 1980 gctctcggct tagacaacca aatcactgag cttgatgtga gcatgtacgg ttggccgccg 2040 cgcgcttacc cgacgtatga cgccattcca aaacaaaagt ttttggatca ggcagcgcgc 2100 tatgatcgtt tgttcaaact gtatgaaaag ttgagcgata aaattagcaa cgtcaccttc 2160 tggggcatcg ccgacaatca tacgtggctc gacagccgtg cggatgtgta ctatgacgcc 2220 aacgggaatg ttgtggttga cccgaacgct ccgtacgcaa aagtggaaaa agggaaagga 2280 aaagatgcgc cgttcgtttt tggaccggat tacaaagtca aacccgcata ttgggctatt 2340 atcgaccaca aatag 2355 <210> 324 <211> 784 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <400> 324 Met Met Leu Asn Ala Arg Cys Ile Gln Leu Met Lys Leu Leu Leu Arg 1 5 10 15 Ser Ser Leu Tyr Leu Thr Ala Asp Lys Leu Ala Gln Ser Leu Asn Val 20 25 30 Ser Lys Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Ile Gln Lys Thr Asn Glu Trp Leu 35 40 45 His His Glu Gly Leu Lys Pro Ile Gln Tyr Ala Arg Gly Leu Gly Phe 50 55 60 Arg Leu Asp Asp Glu Val Lys Gln Glu Ile Thr Thr Lys Trp Asn Thr 65 70 75 80 Leu Gln Pro Ala Arg His Tyr Thr Tyr Gln Ser Trp Glu Arg Lys Ala 85 90 95 Trp Ile Gly Leu Trp Ile Leu Thr Arg Val His Pro Leu Tyr Leu Ser 100 105 110 Asp Phe Leu Glu Lys Leu His Val Ser Arg Ser Thr Leu Leu Asn Asp 115 120 125 Ile Lys Glu Leu Lys Glu Asp Trp Gln Ser Phe Gln Leu Arg Leu Ser 130 135 140 Phe His Arg 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720 cacatgagcc tgtcacatcc ggatttcgcg gagttcgaaa aatccataat cgaatacgcc 780 aagttggggg tgaaggtgca cgttaccgaa ctggatatcg acgtgttgcc actggcgtgg 840 aacctgagtg cggaaatttc caatcgcttt gaataccgcc cagagatgga tccttatcgc 900 gaaggtttgc ccgccaaagt cgaggaggag ctagcggctc gttacgaggc gctgtttaaa 960 atcctgctgc gtcatcgcga caaaattgag cgtgtgacca cttggggcac caacgactca 1020 gagacctggt taaatggctt ccccattccg gggcgcatga attacccaat gctgttcgat 1080 cgtaataacc agcccaagtt ggcctatcac cggctgctgg cactcaaaca aaagaaaagt 1140 cagtaa 1146 <210> 326 <211> 381 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <221> SIGNAL <222> (1)...(27) <400> 326 Met Thr Ile Ser Arg Arg Lys Phe Met Trp Gly Thr Ala Ala Leu Leu 1 5 10 15 Ala Thr Thr Gln Leu Lys Thr Arg Ala Leu Ala Ala Ala Met Ala Ser 20 25 30 Thr Gly Ile Lys Asp Ala Phe Lys Gly Asp Phe His Ile Gly Thr Ala 35 40 45 Ile Ser Asn Ala Thr Leu Gln Asn Gln Asp Ala Thr Met Leu Asp Leu 50 55 60 Ile Lys Arg Glu Phe Asn Ala Ile Thr Ala Glu Asn Cys Met Lys Trp 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cattgactgg catattttaa atgacggcaa tccaaatcaa 420 aataaagaga aggcgaagga attctttaag gaaatgtcga gcctttacgg aagcacacca 480 aacgttattt atgaaattgc taatgaaccg aacggtgatg taaattggaa gcgcgatatc 540 aaaccgtatg cggaggaagt gatttccgtt atccgtaaaa atgacccgga taacatcatt 600 attaccggaa ctggcacttg gagtcaggat gtcaatgatg ctgctgatga tcagcttaag 660 gatgcaaacg tcatgtacgc gcttcatttt tatgcaggta cacacggcca gtatttaagg 720 gataaagccg attatgcgct cagcaaagga gcgccgattt ttgtaacgga atgggggacg 780 agtgacgctt ccggaaatgg cggggtcttc cttgaccagt cgagggaatg gctgaattat 840 ctcgacaaca agaaaatcag ctgggtaaac tggaaccttt ctgataagca ggaatcttcc 900 tcagctttaa agccgggggc atctaaaaca ggcggctggc cgttatcaga tttatccgct 960 tcagggacat ttgtaaggga aaagatccgt ggctcccaac attcgactga agacagatct 1020 gagacaccaa agcaagataa acccgtacag gaaaacagcc tatctgtgca atacagaaca 1080 ggggatggaa gtgtgaacag caaccaaatc cgtcctcaga tccatgtgaa aaacaacagc 1140 aagaccaccg ttaatttaaa aaatgtaact gtccgctact ggtataacac gaaaaacaaa 1200 ggccaaaact tcgactgtga ctacgcgaag atcggatgca gcaatgtgac gcacaagttt 1260 gtgacattac aaaaacctgt aaaaggtgca gatgcctatc tggaacttgg gtttaaaaac 1320 gggacactgt caccgggagc aaacactgga gaaatccaaa ttcgtcttca caatgaggat 1380 tggggcaatt attcacaaat cggggattat tctttttctc agtcaaatac gtttaaagat 1440 acaaaaaaaa tcacattata taataacgga aaactaattt ggggaactga acccaaatag 1500 <210> 328 <211> 499 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <221> SIGNAL <222> (1)...(29) <400> 328 Met Lys Arg Ser Val Ser Ile Phe Ile Ala Cys Leu Val Met Thr Val 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Gly Val Ala Ala Pro Glu Ala Ser Ala Ala Gly Ala 20 25 30 Lys Thr Pro Val Ala Leu Asn Gly Gln Leu Ser Ile Lys Gly Thr Gln 35 40 45 Leu Val Asn Gln Asn Gly Lys Ser Val Gln Leu Lys Gly Ile Ser Ser 50 55 60 His Gly Leu Gln Trp Phe Gly Asp Tyr Val Asn Lys Asp Ser Leu Lys 65 70 75 80 Trp Leu Arg Asp Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr 85 90 95 Thr Ala Glu Gly Gly Tyr Ile Glu Asn Pro Ser Val Lys Asn Lys Val 100 105 110 Lys Glu Ala Val Glu Ala Ala Lys Glu Leu Gly Ile Tyr Val Ile Ile 115 120 125 Asp Trp His Ile Leu Asn Asp Gly Asn Pro Asn Gln Asn Lys Glu Lys 130 135 140 Ala Lys Glu Phe Phe Lys Glu Met Ser Ser Leu Tyr Gly Ser Thr Pro 145 150 155 160 Asn Val Ile Tyr Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asp Val Asn Trp 165 170 175 Lys Arg Asp Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Ser Val Ile Arg 180 185 190 Lys Asn Asp Pro Asp Asn Ile Ile Ile Thr Gly Thr Gly Thr Trp Ser 195 200 205 Gln Asp Val Asn Asp Ala Ala Asp Asp Gln Leu Lys Asp Ala Asn Val 210 215 220 Met Tyr Ala Leu His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln Tyr Leu Arg 225 230 235 240 Asp Lys Ala Asp Tyr Ala Leu Ser Lys Gly Ala Pro Ile Phe Val Thr 245 250 255 Glu Trp Gly Thr Ser Asp Ala Ser Gly Asn Gly Gly Val Phe Leu Asp 260 265 270 Gln Ser Arg Glu Trp Leu Asn Tyr Leu Asp Asn Lys Lys Ile Ser Trp 275 280 285 Val Asn Trp Asn Leu Ser Asp Lys Gln Glu Ser Ser Ser Ala Leu Lys 290 295 300 Pro Gly Ala Ser Lys Thr Gly Gly Trp Pro Leu Ser Asp Leu Ser Ala 305 310 315 320 Ser Gly Thr Phe Val Arg 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tgtactggca 60 ttgtttttgc tgttggcggc ggtggcgctc ccgtctgtgg gggctgcgcc gcaggggccg 120 cgcctgcgcg atgtggcggg cgacatttta gtgggttacg cctccagaaa cgatttctgg 180 aacatgtctg actcagccca atacacagaa gttgcccgca ctgagttcaa cttcatgacg 240 cccgaaaacg ccatgaagtg ggacgccatt catcccgcgc aaaactcata cagttttgcc 300 caggccgacc ggcacgtgca gtttgcccag gccaacaaca tggccgtgca tggacatgcc 360 ctcgtgtggc acagccaaaa tccaggctgg ctgaccaatg gcaactggtc ccgcagccaa 420 ttgatcaaca tcatgaacga ccacattgac acggtcgccg gccgttatgc aggtgaggtg 480 ctggtgtggg acgtggtcaa tcaggcgttt aatgaggatg gaacttatcg cagcaccatc 540 tggtacaacg ggatcggaca ggaatatatc gacctggcct ttacccgcgc ccgcgccgcc 600 gatcctcatg ccaaactcat ttacaacgat tacaacattg gctggttaaa cagtaagtcg 660 aatggcgtct acaacatggc cgccgatatg gtcaggcgcg gtgtgcccat cgacggcgtt 720 ggtttccaga tgcacctgga acggggcggc gtcagcggca gcagtctggc gagcaacatg 780 cagcgtttcg ccgatttggg attggaagtt tacatcaccg aattggacgt gcgcattccc 840 caaaacccaa cccagcagga tttgcaggct caggcggcag tttaccaaac ggtgacgaat 900 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gagcaattta accccccatg gctgaaaacg 480 ctgccaccag agcaactgcg ggctgccgtc aagaaccatg ccatgacggt gtgtcgccat 540 taccgcgggc gaatcaatga atttgatgtc aataatgaaa tgctccacgg taactttttc 600 cgcagtcgtt tgggaaacgg catagttaaa gagatgttcg agtggtgccg cgagggtaac 660 cccgaggccg tcctttatgt gaacgactac ggcattattg agggcgatcg cctcgacgac 720 tacgtgcagc agattcgcga tttactgggg caaggggttc ccattggtgg cattggcatt 780 caagcccatt tggaatatcc cttggatgca gccaagatga aacgcgccct tgataccctt 840 gcccaattca acctgcccct aaaaatcact gaagttagtg tcagccttgc cgacgagcag 900 cagcaggcgg agacactgcg ccaaatctac cgcattggtt ttgcccatcc agccgtcaaa 960 gagatcctcc tgtggggatt ttgggaaggc aaccactggc gaccccaagc aggactgtac 1020 cgtcgcgact tttccgccaa acctgctgcc gaagcctatc gacaactcct ctttcaggag 1080 tggtggacca ccagcaacgg caaaactaat gccgatgggc gctggcagac ccgcggctat 1140 gcggggcgct atcgcctcac agtaacggcc aacggccaga ccattaaccg cgacattgac 1200 ctaccagact tggagagaac cgtgaccgta caattcccat ga 1242 <210> 332 <211> 413 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <221> SIGNAL <222> (1)...(28) <400> 332 Met Phe Lys Gly Leu Arg Tyr Leu Leu Leu Leu Cys Leu Ser Ala Gly 1 5 10 15 Leu Val Phe Ala Cys Ala Pro Arg Ser Val Thr Ala Pro Pro Asp Gly 20 25 30 Leu Ser Gly Gln Ile Arg Leu Leu Arg Gln Gly Thr Leu Thr Val Leu 35 40 45 Val Gln Asn Ala Gln Gly Gln Pro Ile Ala Asn Ala Lys Val Val Ala 50 55 60 Ala Gln Gln Thr His Ala Phe Pro Phe Gly Val Ala Leu Asp Thr Ala 65 70 75 80 Met Phe Glu Pro Ser Pro Pro Pro Ala Ala Asn Trp Tyr Arg Asn Thr 85 90 95 Ala Arg Gln Asn Phe Asn Ala Ala Val His Glu Asn Ala Leu Lys Trp 100 105 110 Tyr Ala Leu Glu Pro Glu Gln Gly Lys Leu Asp Phe Thr Met Ala Asp 115 120 125 Arg Ile Leu Ala Trp Ser Glu Ala Gln Gly Trp Pro Met Arg Gly His 130 135 140 Thr Leu Phe Trp Glu Val Glu Gln Phe Asn Pro Pro Trp Leu Lys Thr 145 150 155 160 Leu Pro Pro Glu Gln Leu Arg Ala Ala Val Lys Asn His Ala Met Thr 165 170 175 Val Cys Arg His Tyr Arg Gly Arg Ile Asn Glu Phe Asp Val Asn Asn 180 185 190 Glu Met Leu His Gly Asn Phe 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atcccttgaa gatttcgaaa ccagtttgct tgcctttgcc 780 gatctgggtg tacatgttat gatcactgag cttgatgtat ctgtacttcc ttttcctacc 840 cgcaacctcg gtgctgatgt atctctaaac atagcttaca acactgaact gaacccctat 900 cccgatggat tgcctgatga tgtggcccaa aaacttcatg atcgctggct cgatatatat 960 cgtttattta taaaacatca cgacaagatc acccgtgtta ctacctgggg tacagccgat 1020 ggtatgtcat ggaagaacaa ctggcccatt cgtggacgca cagactttcc tttattattc 1080 gaccgcgatt ttcaacccaa accggtagta gctgatatta tcaaagaagc attggctgca 1140 aagagaaaat ag 1152 <210> 334 <211> 383 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <221> SIGNAL <222> (1)...(30) <400> 334 Met Lys Arg Gln Phe Ile Gly Arg Leu Arg Leu Val Thr Ile Leu Ser 1 5 10 15 Ile Ile Val Ile Met Gly Cys Ala Ser Asn Lys Ser Asp Gln Asn Val 20 25 30 Asp Asn Leu Lys Asp Ala Phe Asp Gly Leu Phe Leu Ile Gly Thr Ala 35 40 45 Met Asn Thr Pro Gln Ile Thr Gly Gln Asp Thr Arg Thr Leu Glu Leu 50 55 60 Ile Lys Lys His Met Asn Ser Ile Val Ala Glu Asn Val Met Lys Ser 65 70 75 80 Gly 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tacgtcaagc tccccgcggg cacctcgccg 420 cgcaagttcc agctggcggt tctcacccgt tatctcgaag gcaaccagac cagggacaaa 480 gaggactcca tctcggacga ggtggaggtg accgccgata cctggaccaa ggtcgagggc 540 gagtacgtct tcgacccggc ggccatcggc gcctacgtct acccctacct caagggcgac 600 cccgcagggg cctatgcccc ctatctcatc gatgatttca agatcaccac gatcgccccc 660 gcccccaaga agaccgccgc taccgccgcg gcaaaagagg cagaagagcc cttaatcgag 720 accgatatac catccttaaa agacgtctgc gcgtcctact tcgagatcgg cgcggccatc 780 gagccatatg agttattctc caagccccac gatcagctgc tccggaaaca tttcaacacc 840 gttggttga 849 <210> 336 <211> 282 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <221> SIGNAL <222> (1)...(50) <400> 336 Met Ile Pro Arg Ile Val Leu Ala Val Arg Ile Ser Pro Thr Phe Leu 1 5 10 15 Ser Pro Gln Lys Gly Val Ile Lys Met Ile Lys Arg Ala Phe Met Ile 20 25 30 Thr Leu Ala Ala Phe Leu Leu Leu Phe Ala Leu Asn Ser Leu Pro Ile 35 40 45 His Ala Gly Ala Glu Gly Gly Glu Glu Lys Phe Thr Pro Lys Val Ile 50 55 60 Val Glu His Gly Phe Glu Asn Asn 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tcatgaagcc cgcctccatc cagccatcgg aggggtattt caactggacc 300 gaagcggaca agatcgtgaa ctacgccaaa gcccacggga tgaagctccg cttccatacc 360 ctcgtctggc ataatcaggt cccggattgg ttcttcgcgg gtaacgacaa aacccgcctt 420 ttgcagcgct tggagaatca tatccggact atcattaaaa gatatggcga taaggtcgac 480 tattgggacg tggtgaacga agtaatagac gacaacggcg gtatgcgaaa cagcaagtgg 540 taccagatca ccgggaagga ctacatcaag accgccttcc gggtggcaga cgacgagctc 600 aggaagaatg ggtggaggaa agaaggtcgt cagctctata tcaacgacta caacacccat 660 aacccaacga agagagaggg gatctggcgc ttgatccaag agctccgggc ggaagggatt 720 cccgtcgacg gagtaggcca ccagacgcat atcaatatcg aatggccgcc cgtaagccag 780 atcgtggaat cgatccgctt cttcggcgaa aaaggcctcg ataaccaggt gaccgagctg 840 gatgtgagca tctatacgaa tgacaaggat tcacatggta gttatcaggc catcccgcag 900 gaagtcttca tcaagcaggg taatcgctac aaggaactct ttgaagggct aaaaagtgta 960 aaaaactacc tcagcaacgt caccttctgg ggcatggcgg acgatcatac ctggctgaac 1020 cgttggccca tcgaacggcc cgatgctcct cttcctttcg atatctatct caaggccaag 1080 ccggcgtatt gggggatcgt 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accatctagg tgagagcccg gattccgccc cgatccgggc cactccgcgt 1740 gccgcgggcg agttacaaac gaatctcgtg cttcagtacc gctccgctga tggagataac 1800 aactatcaaa tgaagcctca gttcacgatc aagaacgcag gcaaagtgcc catcccgtta 1860 agcgagctga cgatccgcta ctatttcacg ccggagagca cgcagccggt ggataccagg 1920 atcgactggg cccaattcgg agcagagcat gtccagacga cggtcgttcc gccatccgat 1980 gccgcggcgc acgcctatgt cgagctcagc ttcctggagt cggcaggggc catcccttcc 2040 gatacgacat taggcaatat tcagctgcgc atctttaaca gcgatggctc ttcgttcgat 2100 aaaacgaacg attattcctt cgacccgacg aaaaaggctt atacggcgtg ggagaaggtc 2160 acgctttatc ggaacgggga actggtttgg gggatagagc cttggggcgc gaagtaa 2217 <210> 344 <211> 738 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <400> 344 Met Val Glu His Glu Ala Glu Leu His Asp Tyr Arg Glu Arg Ile Cys 1 5 10 15 Glu Val Ala Trp Gln Phe Ala Gly Pro Gly Gly Arg Glu Gly Lys Ala 20 25 30 Asp Phe Ala Gly Asn Gln Gln Leu Ala Val Leu Lys Met Lys Leu Ser 35 40 45 Arg Gly Arg Gly His Gly Val Leu Lys Arg Ala Gly 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tcaaagccat cgcggatcgc ggtctgaaag ttaaaatttc tgagctcgat 600 gttcctgtta acaaccctta cggaaccact aatttcccgc aatacagcag ttttaccgcg 660 gaagccgccg agctgcagaa gcagcgctac aagggcatta tgcaagcgta ccttgataac 720 gtaccggcca acctgcgtgg tggtttcacc gtgtggggcg tttgggatgg cgatagctgg 780 atcatgacgt tcagccagta caccaacgct aacgccaacg actggccact gttgttcacc 840 gggccgtag 849 <210> 346 <211> 282 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <400> 346 Met Lys Met Thr Tyr Met His Pro Ala Glu Asp Thr Tyr Ser Phe Gly 1 5 10 15 Gln Ala Asp Gln Leu Val Asn Trp Ala Lys Ala Asn Gly Ile Gly Val 20 25 30 His Gly His Thr Leu Val Trp His Ser Glu Tyr Gln Val Pro Asn Trp 35 40 45 Met Lys Asn Tyr Ser Gly Asp Ala Thr Ala Phe Gln Thr Met Leu Asn 50 55 60 Thr His Val Lys Thr Val Ala Glu His Phe Ala Gly Glu Leu Asp Ser 65 70 75 80 Trp Asp Val Val Asn Glu Val Leu Glu Pro Gly Ser Asn Gly Cys Trp 85 90 95 Arg Glu Asn Ser Leu Phe Tyr Gln Lys Leu Gly Lys Asp Phe Val Ala 100 105 110 Asn Ala Phe Arg Ala Ala 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aaattcctac ctggccttgt acggctggac ccgcagcccg 300 ctgattgaat actacgtgat cgaaagctac ggctcctaca acccggcatc ctgctctggc 360 ggtaccaata tgggtagctt ccagagtgat ggcgcgacct acgatgtgcg ccgttgccag 420 cgcgtgcaac agccatccat cgatggcacc caaaccttct accaatattt cagcgtgcgc 480 aatccgaaaa aaggcttcgg ccaaatttcc ggcaccatca cctttgctaa ccacgcagcc 540 ttttgggcga gcaagggcat gaacctgggt gcccataact atcaagtaat ggcgaccgag 600 ggttatcaaa gtaccggcag ttccgatatc acagtgagtg aaggccccat caacggcggc 660 accagcagca cgcccccggt aacaaccagc agcagtgcca gctcagtggc aacgggcggt 720 ggtaacaccg gtagtggcgt agtggtgcgc gcgcgcggcg tcgcgggcgg cgagcatatt 780 aacctgcgta tcggtggcaa taccgtcgcc agctggaacc tcaccaccag cttccaggat 840 ctcagctaca gcggcaccgc gtcgggcgat atccaggtgc aatatgacaa cgacggcggc 900 agccgcgatg tcgtagtgga ttacatccgc gttaacggcg aaacccgcca ggcggaggat 960 atgagctaca acaccgcctt gtacgcgaat ggttcctgcg gtggcggcgg caattccgaa 1020 ctgatgcact gcaatggcgt gatcggtttt ggctacacct atgattgctt cagcggcaac 1080 tgctccggcg gcagcacggg gggtggcaac actggcacca gcagcagcgc ggcgagcgcc 1140 ggtggtggca acagcaactg ctccggctat gttggtatta ctttcgacga tggcccaacc 1200 gctaacactc ccaccctggt taacctgttg aagcaaaaca acctgacgcc ggtaacctgg 1260 ttcaaccagg gcaacaacgt ggttgccaat gccaattaca tggcccagca attgagcgtt 1320 ggtgaagtac ataaccacag ctacagccat ccgcaaatgg gcagcatgac ctaccaacag 1380 gtttatgacg agttgaaccg tgccaaccag gctatccaaa ccgcgggtgc acccaagcca 1440 accctgttcc gcccacctta tggcaccgtt aactccacca tccaacaagc ggcccaggcc 1500 ttgggtttgc gggtgatcac ctgggatgtg gattcgcaag actggaatgg cgccactgcc 1560 tcggccatcg ccagcgcagc taaccgcctg acaaacggcc aggtaatcct gatgcacgac 1620 ggcagctaca ccaacaccaa tgccgctatt gcccagatcg cctccagcct gcgcgccaag 1680 ggcttgtgcc cgggtcgtat cgatccggca accggccgag ccgttgctcc tgcgggtggc 1740 aatactggcg gcggtactgt gtcaagcagc actcgcagca gcactccggt agtggtaagc 1800 agcagccgta gcagcagtag tgttgccgct ggcggcgcct gccaatgcaa ttggtggggc 1860 acccgttacc cgatctgtac gtccactgcc agtggttggg gttgggagaa caaccgcagc 1920 tgtatcacca ccagcacctg taacagtcag ggccctggcg gtggtggggt agtgtgtaac 1980 taa 1983 <210> 354 <211> 660 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <221> SIGNAL <222> (1)...(18) <400> 354 Met Val Cys Ser Ala Ala Leu Gly Ala Thr Ala Val Ser Ala Gln Thr 1 5 10 15 Leu Ser Asn Asn Ser Thr Gly Thr Asn Asn Gly Phe Tyr Tyr Thr Phe 20 25 30 Trp Lys Asp Ser Gly Ser Ala Thr Met Thr Leu Ala Ala Gly Gly Arg 35 40 45 Tyr Thr Ser Gln Trp Thr Asn Asn Thr Asn Asn Trp Val Gly Gly Lys 50 55 60 Gly Trp Asn Pro Gly Asn Ser Thr Arg Val Ile Ser Tyr Ser Gly Asn 65 70 75 80 Tyr Gly Val Ser Asn Ser Gln Asn Ser Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp 85 90 95 Thr Arg Ser Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Ile Glu Ser Tyr Gly Ser 100 105 110 Tyr Asn Pro Ala Ser Cys Ser Gly Gly Thr Asn Met Gly Ser Phe Gln 115 120 125 Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Asp Val Arg Arg Cys Gln Arg Val Gln Gln 130 135 140 Pro Ser Ile Asp Gly Thr Gln Thr Phe Tyr Gln Tyr Phe Ser Val Arg 145 150 155 160 Asn Pro Lys Lys Gly Phe Gly Gln Ile Ser Gly Thr Ile Thr Phe Ala 165 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gacgtggtaa atgaggctat agacccgagc caaccggatg gcatgaggag gagcaaatgg 540 taccagatca ccgggaagga ctacatcaag accgccttcc gggtggcaga cgacgagctc 600 aggaagaatg ggtggaggaa agaaggtcgt cagctctata tcaacgacta caacacccat 660 gatccgacga agagagagta catctggcgc ttgatcgatg agcttcaaac ggaagggatt 720 cccgtcgacg gagtaggcca ccagacgcat atcaatatcg aatggccgcc cgtaaaccag 780 atcgtggact cgatccgctt cttcggggaa aaaggcctcg ataaccaggt gaccgagctg 840 gatgtgagca tatatacgga tagatccagt tcctacggga gttaccaagc gatcccgcag 900 gaagtcttca tcaagcaggg taatcgctac aaggaactct ttgaagggct aaaaagtgta 960 aaaaactacc tcagcaacgt caccttctgg ggcatggcgg acgatcatac ctggctgaac 1020 cattggccca tcgaacggcc cgatgctcct cttcctttcg atatctatct caaggccaag 1080 ccggcgtatt gggggatcgt ggatgctttg aagctttcgc ggtga 1125 <210> 356 <211> 374 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <221> SIGNAL <222> (1)...(21) <400> 356 Met Lys Arg Thr Ile Phe Leu Arg Leu Leu Ala Gly Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Ala Ala Ala Leu Ala Ala Gly Gly 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gtctggtgga gcggcatttt aatgcgatta caccagagaa cattacaaaa 240 tggggaccga tacatccggc gccgggcgaa tataatttcg gaccggccga ccggtttgtt 300 gaattcggtg aagcccacga catgttcatg ataggccata cgcttgtatg gcacagccag 360 acgcccggat gggtattcga ggatgaagcc ggaaatccgc tcggccgcga cgagctcatc 420 gaacgcatgc gcgatcatat ccataccgtc gtcggacggt accggggtag aatacacgca 480 tgggacgtcg tcaacgaagc gttgaatgaa gacggaaccc tgcgggaatc cccctggtac 540 cgtatcatcg gcgaggatta cctgttgaaa gcgttcgagt tcgcgcatga agcggacccg 600 gatgccgagc tgtactataa cgattattct ctcgaaaatc ccgccaagcg ggcgggggcg 660 gtacgcctgg tccggtacct gcaggagaac ggggcgccga tacacgggat cggtacccag 720 ggacactact ctcttgactg gccatcgctc gacgagatcg aaagaaccat caccgatttc 780 gccgcgttgg acgtggacgt catggttacc gaacttgaaa tcgacgtcct cccttccgcg 840 ttcgagtatc agggggccga tattgcgatg cgggcggaac tcgaagagcg gttgaatccg 900 tatcccgacg aactgccggc cgaggtcgat gaagcgctta cacagcggta tcgggacatc 960 ttcgaggtat ttctgcggca cagcgacgtt cttacgcgcg taacgttctg gggggtgacc 1020 gatggagatt cgtggaagaa taactggccg gtaccgggaa ggacgaatta tccgctgctg 1080 ttcgaccgcg aatggcagcc aaaaccagca ttttattccg tgatcgaagt tgcggatgag 1140 atgctgaatg aataa 1155 <210> 358 <211> 384 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <221> SIGNAL <222> (1)...(25) <400> 358 Met Asn Asn Phe Arg Asn Thr Phe Leu Ile Val Val Val Leu Ala Val 1 5 10 15 Val Val Gly Val Leu Pro Ala Cys Glu Ala Gly Pro Pro Glu Asn Thr 20 25 30 Ser Ser Ser Leu Gln Glu Ala Tyr Ala Asp Val Phe Leu Ile Gly Thr 35 40 45 Ala Leu Asn Leu Ala Gln Ile Asp Gly Arg Asp Glu Gln Gly Val Arg 50 55 60 Leu Val Glu Arg His Phe Asn Ala Ile Thr Pro Glu Asn Ile Thr Lys 65 70 75 80 Trp Gly Pro Ile His Pro Ala Pro Gly Glu Tyr Asn Phe Gly Pro Ala 85 90 95 Asp Arg Phe Val Glu Phe Gly Glu Ala His Asp Met Phe Met Ile Gly 100 105 110 His Thr Leu Val Trp His Ser Gln Thr Pro Gly Trp Val Phe Glu Asp 115 120 125 Glu Ala Gly Asn Pro Leu Gly Arg Asp Glu Leu Ile Glu Arg Met Arg 130 135 140 Asp His Ile His Thr Val Val Gly Arg Tyr Arg Gly Arg 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gtcggccgag ggcgactggt ccgcgatcgt gaccgaccgc 720 acctcgcacg gccacggcct gcgcctggac gtcacggaca tcatggacgc gggcgtcacg 780 tacgagatca gcgcccaggt gaagttcgcc gggaccggtg gtccgggcaa catctggctg 840 agccaggagc tggtcgtgga cgggggtagc acctacggca ccgtcctcca ggtccctggc 900 gtcacctcga cagcctggac gcagatcacc acgaactacg tcacgccgac ggccgaccag 960 ctgttcctct acttcgagac gaactggccg gacggcatcg aggacgactt cctcctcgac 1020 gacgtccgca tccgtgtcgc ccctcgggcg atcatccagg aggacctcac tccgctgatg 1080 gacacgctgg acgtgcccat gggtgtcgcg atcgaccagc gtgagacctc cggcagcctc 1140 gcggacctcc tgctgctgca cttcgaccag gtcacggccg agaaccacat gaagccggag 1200 gcgtggtacg acgcggcggg caacttccgc atccacccgc aggcccgcgc catcatggac 1260 ttcgcggcgg agaacgacct gcgcgtcttc ggtcacgtcc tggtgtggca cggccagacc 1320 ccggacttct tcttcacgca cgcggacggc accccgctga cctcgagcga ggccgaccag 1380 gcgatcctgc gcgaccgcat gcgcacgcac atcttcaacg tcgccgaggc cctctccgag 1440 tggggcgagt acggcggcga caacccgctc gtggcctggg acgtcgtcaa cgaggtcgtc 1500 tccgacagcg gcgagcacag cgacggcctg cgccgtagcc gctggtacga cgtgctgggc 1560 gaggagttca tcgacctggc gttcatctac gcgaaccagg cgttcaacgg tgagttcgcc 1620 gctgacgacg ccaaccaccc ggtcacgctc ttcatcaacg actacaacac cgagcagtcc 1680 ggcaagcaga accggtacgc cgcgctcatc gaccgcctca tcgagcgcga ggtcccgatc 1740 gacgccgtgg ggcaccagtt ccacgtcagc ctggccatgc ccatcgcgaa cctgcgcggc 1800 gccctcgagc gcttccagga caccgggctg atccagggcg tcaccgagct cgacgtcacc 1860 gtcggcaaca acccgaccga ggcgctgctc gtcgagcagg gctactacta ccgggacgcc 1920 ttccggctgt tccgtgagtt cacggaggac ctctactcgg tcaccgtgtg gggtctcacc 1980 gacgaccgca gctggcgcag cgctcaggcg ccgctgctgt tcgacgcggg cctgcaggcc 2040 aagccggcct actacggcgc catcgacgcc gacctggacg cacgcgtgcg tgcggcctac 2100 gtgttcgccg aggacatcgc cctcgacgag gccgcgctga cgagccccac ctgggaccgt 2160 ctgccgctgc accagatcga cggggccggc gagttccagc tccgctgggc ggccgaccac 2220 ctcacggtgt tcgtccacgt caccgacggt gacgaggtcg agatcgtgct cggcgacgag 2280 acctacacgg tctcgtcgga cggcgagggc gacctggacg cggtcaccgc ggccggggag 2340 aacggctcct ggaccgctgt ggtccgcgtg 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tcaaagccat cggcgaagat 660 tacatcgccg aagccttccg cgccgcgcac gccgccgacc ccgacgcgat tttgatttat 720 aacgattaca acatcgaact gggctacaaa cggcccaaag cgctgcaact cctaaaatcg 780 ctcattgacc agaaagtgcc gattcacgcc gtgggcattc agggtcactg gcgcatggac 840 aacccgaact tcgccgaagt ggaacaggcc atcaaagagt tttcggcgct ggggttgaaa 900 gtcatgatca ccgaactcga catcggcgtg ctgccgacgc gttatcaggg cgcggatatt 960 tcagcgaccg aaaccatgac gcccgaacag cgcgccgtga tgaaccccta tacggacgga 1020 ttgccggacg atgtggcgca aaagcacgcc gagcgctatc gccaggcgtt tgagatgttc 1080 ctgcggcaca aagacaaaat cagtcgtgtg acattttggg gtgtggacga cggcacttcg 1140 tggctgaacg gtttcccggt gcgcggccgc accgattatc cgctgctatt tgatcgtcag 1200 ggcaagccaa aacccgcctt tttcgcggtg caaaacgcgg cgatgggcgc aacagcgcaa 1260 ccgagcgcca gcgctcccgc aacgcatggc gccgctcctg catccaccaa cattcgcggc 1320 gccgagtttc ctcgcgtgga aagcgacggg cgggtgacgt ttcgcatcaa agcgcctgac 1380 gcgcaaaaag tgcaatttga tttaggtaag ccttacgacg ccacccgcga cgccgagggc 1440 aactggacgg cgaccacaga gccacaagtg cccggcttcc attattattt tttgattgtc 1500 gatggagtgc gcgtggccga cccggcgagc gaaacctttt acggtgcggg ccgccagatg 1560 agcggcatcg aaattcccga tcccgacagc gcgttttatt cgccgcaaaa cgtgccgcat 1620 ggcgaagtgc gcgaacgctg gtatttttcc aacaccacgc aggcgtggcg gcgcatcttc 1680 atttatacgc cgccgggtta cgacaccgat caggccatgc gttttcctgt gctgtatttg 1740 cagcacggcg gtggcgaaga cgaacgcggc tggcccaatc aggggcgcgt gagctttatc 1800 atggacaatc tcatcgcgca gggcaaagcc aaaccgatgc tggtggtgat ggagcaaggc 1860 tatgcgcgca agcccgatga accgcaggtg ccgctgcgcc cgcccggaag caacgccgga 1920 gcgatgccgc ccgactttaa tcgcatgttc gccacgctgg gcgaagtgtt caccaaagac 1980 ctgattccgt ttattgacgc aaattaccgc accaaaaccg agcgcgaaaa ccgcgcgatg 2040 gccggacttt cgatgggtgg aatgcaaagt ttcatcatcg gcctggcgaa caccgatcta 2100 ttcgcgcacc tcggcggttt cagcggcgcg ggtggtggtt ttggcggcgg cgccttcgac 2160 gccaaaaccg cgcacggcgg tgtgatggcc gatgccgatg ccttcaacaa aaaagttcgc 2220 acgatgtttc tcagcatcgg cactgccgag aacgagcgtt ttcagagcag cgtgcgcggt 2280 taccgcgacg cgctgaccaa agcgggcatc aaaaccacgt tctacgaatc gcccggcact 2340 tcgcacgagt ggctgacatg gcgccgcagc ctgcgcgaat tcgcgccgct cttgtttcaa 2400 gaggccaaca cgcagatcga gcgcggcccc aatgcccgcc cgattgcgcc gcagccgatt 2460 gttcttggcc cgggcgacaa gcccgccttc cctccggcgc cctccggttt cgatgcgcgg 2520 cgcgatggca ttccgcacgg cgaaattaaa cttgtggaat acccttctgc cacggtcggc 2580 accacgcgca agatgcaggt ctatacgccg ccgggctaca acccgcaaga agaatatccc 2640 gtgctctatt tgctgcacgg catcggcggc gacgagtggg aatggaaaaa tggcggcacg 2700 cccgaagtga ttctcgacaa cctctacgct gagaagaaac tccagccgat gatcgtggtg 2760 atgcccaatg ggcgcgcgca aaaagacgac cgtcctatcg gcaacgtgtt cgcttccgct 2820 ccggcgtttg cgacgtttga gaaagatttg ctgaacgaca ttatcccctt tgttgagaag 2880 aattacccga ccaaaaccgg cccgcaaaat cgcgctttgg ccggtctttc gatgggcggc 2940 gggcaatctc tcaactttgg cctcggcaac ctcgacacct tcgcgtgggt tggcggcttt 3000 tcgtccgcgc ccaacacgcg cagcggcgca agtctactgg ccaatcccga cgacgccaaa 3060 aagaagctga agctgctgtg ggtttcgtgc ggcgataaag acaatttgat gtttatcagc 3120 cagcgcacgc accgttatct tgccgagaat aacgtgccgc acatctggca 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cacctatgag 420 atatacagaa ctcagcgtgt aaaccagcca tctattcagg ggaatactac tttctatcag 480 tattggagcg ttagaacctc taaaagggcc actggaagca atgctaccat caccttccag 540 aaccacgtaa atgcttgggc aagtaggggt tggaacttgg gagctcatag ctatcaggta 600 ctggctaccg agggttatca gagcagcgga agttcaaata ttactgtttg ggaaggtggt 660 tcaagtggag gttcttcagg tggaagcacc ggaggcagca ctggaggtgg atcacacgag 720 atcattgtaa gagcccgtgg tgtagtaggt tcagagcaaa ttaggcttag ggttggcaat 780 acaaccgttg caacttggac ccttactacc ggttataggg actatagggc tactacctca 840 gctactggtg gtattctggt agagtacttc aatgatagcg gcaaccgtga tgttcagatt 900 gattacatta gggtaaacgg ctcaactcgt caatctgaga acatgtcgta caatacaggg 960 gtatggcaga atggctcatg cggcggctcc aatagcgagt ggctacactg caacggagct 1020 attggctacg gcgatgtggt tactggcaga tcaaccgctg ttgaggaagc atttactgct 1080 gccgaggatt gtggctgtga acctaaggca accctattcc ccaaccctgc tggcagtacc 1140 ctcagtatta tgctagacag gcaaccctat ggcgatgtaa gtattagaat atataatacg 1200 gtaggtgcag ttgttcgcac catcaacaat ccagacctac tcactgaggt tgatgtcagt 1260 gcattaaatt ctggaatcta ctttgtagag cttaggtccg aaggacatgt aagcaactac 1320 aaatttatta aaaagtag 1338 <210> 368 <211> 445 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <221> SIGNAL <222> (1)...(23) <400> 368 Met Lys Arg Ile Gly Leu Leu Phe Met Ala Leu Ala Leu Thr Ala Phe 1 5 10 15 Met Ala Gln His Ser Ser Ala Gln Arg Ile Cys Asn Asn Gln Thr Gly 20 25 30 Thr His Gly Gly Phe Tyr Tyr Thr Trp Trp Ser Asp Gly Gly Gly Ser 35 40 45 Ala Cys Ile Thr Met Gly Asp Gly Gly Asn Tyr Ser Thr Gln Trp Ser 50 55 60 Asn Thr Gly Asn Phe Val Gly Gly Lys Gly Trp Ser Thr Gly Arg Ser 65 70 75 80 Asn Arg Val Ile Ser Tyr Asn Ala Gly Asn Trp Ser Pro Ser Gly Asn 85 90 95 Ala Tyr Leu Cys Leu Tyr Gly Trp Thr Thr Asn Pro Leu Val Glu Tyr 100 105 110 Tyr Val Val Asp Ser Trp Gly Ser Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr Ser 115 120 125 Gln Gly Thr Val Asn Thr Asp Gly Gly Thr Tyr Glu Ile Tyr Arg Thr 130 135 140 Gln Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile Gln Gly Asn Thr Thr Phe Tyr Gln 145 150 155 160 Tyr Trp Ser Val Arg 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gccttcgatc 480 gatggcaccc agactttcta ccaatacttc agcgtgagaa atccgaaaaa agggtttggg 540 aacatttctg gcaccatcac ctttgctaac cacgtaaact actggagaag cagagggatg 600 aatcttggta accacgatta ccaagttctc gctactgaag gctacagaag cacgggttct 660 tctgacctca ccatcagcca aggcgcaagc aacaacggcg gtggcggcag tagctcaagt 720 gctccatctg ctgggggcgg tagcaagaca atcgtcgtgc gggcacgcgg gactaccgga 780 caagagcaaa tccgtttgcg ggtgaacaac actattgttc agacctggac cttgtccacc 840 accatgcgcg actacaccgt caacactaac ttggcaggcg ggtcattggt tgaatacttc 900 aatgacagcg gcaaccgcga cgtccaagtt gattacatca gcgtaaatgg caatgttcgc 960 caatccgaaa accaaaccta caacaccggt gtctaccaga acggtgcgtg tggcggcggt 1020 aacggccgga gcgagtggct ccattgcaac ggtgcaatcg ggtacggcga tatctaa 1077 <210> 370 <211> 358 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <221> SIGNAL <222> (1)...(27) <400> 370 Met Lys Ser Phe Ile Thr Gly Lys Lys Ile Ala Ala Gly Leu Ile Thr 1 5 10 15 Ala Ala Ala Leu Ser Ala Ser Met Val Ser Ala Gln Thr Leu Thr Ser 20 25 30 Asn 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300 gcattcggcc tcggccagac ccagctgcag gacctgatga tcagccagtt cagcatcctg 360 acccctgaaa acgaactgaa accggacagc gtgcttgatg tccagacgag taaaaaactg 420 gcggcagaag acgaaaccgc ggtggcgatc aggctgaacg ccgcaacgcc gctgctgaag 480 ttcgcgcaga agaacggcat caaagtgcac ggccatgtgc tggtatggca cagccagacg 540 ccggaagctt tcttccatga aggatacgat accaagaaac cctatgtgac gagagaggtt 600 atgctcggcc gcctggaaaa ctatatccgt gaagtgctga cgcagacaga ggaacagttc 660 ccgggcgtga tcgtcagctg ggacgtcgtg aacgaggcga tcgacgacgg tactcactgg 720 ctgcggaaga cttccagctg gtacaaagtc gtcggcgagg atttcctgaa cagggctttt 780 gaatacgcca ggaaatacgc cgcggagggc gtgctgctgt actacaacga ttacagcacg 840 gcaaattcgg ctaaactgat gggcatcacg aagctgctga agcagctgat tccagacggg 900 aatatcgacg gctacggatt ccagatgcac catgacctcg gctggccgag catcgacctt 960 atggcggcag ctgtgaagca gattgccggc ctggggctga aactgcgcgt cagcgaactg 1020 gatatcggcg tatccaagaa caatcaggaa aactatgaca aacaggccaa acgctacaag 1080 gaaatgctga acctgatgct gcagtacgcg gaccagacgg aagccgtgca ggtctggggc 1140 ctgacggaca acatgagctg gagaaccggc aaatacccgc tgctgttcga cagcgcggca 1200 aaaccgaaaa aggcgttctt cgcggtgatt gaagccgcag aggaa 1245 <210> 372 <211> 415 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <400> 372 Met Thr Gly Ile Ala Arg Lys Gly Val Trp Ser Val Ile Ser Gly Thr 1 5 10 15 Phe Thr Ala Gly Asp Tyr Asp Ser Tyr Leu Leu Tyr Val Glu Thr Gln 20 25 30 Asp Gln Gly Gly Gly His Pro Thr Leu Ser Phe Glu Ile Arg Asn Phe 35 40 45 Arg Leu Thr Ala Pro Glu Gly Ile Ala Pro Pro Lys Ala Thr Glu Glu 50 55 60 Pro Ala Asp Ala Ala Glu Ala Thr Pro Val Pro Ala Leu Ser Glu Ile 65 70 75 80 Pro Gly Leu Lys Asp Val Tyr Ala Asp Tyr Phe Asp Phe Gly Ala Ala 85 90 95 Ala Pro Gln Tyr Ala Phe Gly Leu Gly Gln Thr Gln Leu Gln Asp Leu 100 105 110 Met Ile Ser Gln Phe Ser Ile Leu Thr Pro Glu Asn Glu Leu Lys Pro 115 120 125 Asp Ser Val Leu Asp Val Gln Thr Ser Lys Lys Leu Ala Ala Glu Asp 130 135 140 Glu Thr Ala Val Ala Ile Arg Leu Asn Ala Ala Thr Pro Leu Leu Lys 145 150 155 160 Phe Ala Gln Lys Asn Gly Ile 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gggagagcgt ggcggtatgg aatgatacca cgggcaattc atttcaggat 1500 acctcaggtt acggggtact gcggttagta aaaaagtaa 1539 <210> 374 <211> 512 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Obtained from an environmental sample. <400> 374 Met Ile Gly Cys Val Met Ser Pro Pro Glu Ala Gly Ser Pro Arg Phe 1 5 10 15 Asp Leu Leu Thr Arg His Phe Asn Val Ile Thr Ala Glu Asn Ala Met 20 25 30 Lys Pro Ala Ser Leu Gln Arg Glu Lys Gly Val Phe Thr Phe Glu Gln 35 40 45 Ala Asp Met Met Val Asp Ala Val Leu Glu Arg Gly Leu Lys Ile His 50 55 60 Gly His Thr Leu Ala Trp His Gln Gln Ser Pro Glu Trp Met Asn His 65 70 75 80 Glu Gly Ile Ser Arg Asp Glu Ala Val Glu Asn Leu Thr Val His Ala 85 90 95 Lys Thr Ala Ala Ala His Phe Arg Gly Arg Val Ile Ser Trp Asp Val 100 105 110 Leu Asn Glu Ala Ile Ile Asp Asn Pro Pro Asn Pro Gly Asp Trp Arg 115 120 125 Ala Ser Leu Arg Gln Ser Pro Trp Tyr Lys Ala Ile Gly Pro Asp Tyr 130 135 140 Val Glu Leu Val Phe Lys Ala Ala Arg Glu Ala Asp Pro Glu Ala Lys 145 150 155 160 Leu Tyr Tyr Asn Asp Tyr Asn Leu Asp 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tgcttatttg gctctttatg ggtggacgag aaattcactc 240 atagaatatt acgtcgttga tagctggggg acttatagac ctactggaac ttataaaggc 300 actgtgacta gtgatggagg gacttatgac atatacacga ctacacgaac caacgcacct 360 tccattgacg gcaataatac aactttcacc cagttctgga gtgttaggca gtcgaagaga 420 ccgattggta ccaacaatac catcaccttt agcaaccatg ttaacgcctg gaagagtaaa 480 ggaatgaatt tggggagtag ttggtcttat caggtattag caacagaggg ctatcaaagt 540 agtgggtact ctaacgtaac ggtctggtaa 570 <210> 376 <211> 189 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated polypeptide <400> 376 Met Ala Leu Met Ala Ser Thr Phe Tyr Trp His Leu Trp Thr Asp Gly 1 5 10 15 Ile Gly Thr Val Asn Ala Thr Asn Gly Ser Asp Gly Asn Tyr Ser Val 20 25 30 Ser Trp Ser Asn Cys Gly Asn Phe Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr 35 40 45 Gly Ser Ala Thr Arg Val Ile Asn Tyr Asn Ala His Ala Phe Ser Val 50 55 60 Val Gly Asn Ala Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Ser Leu 65 70 75 80 Ile Glu Tyr Tyr Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly 85 90 95 Thr Tyr 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aactttcacc cagttctgga gtgttaggca gtcgaagaga 420 ccgattggta ccaacaatac catcaccttt agcaaccatg ttaacgcctg gaagagtaaa 480 ggaatgaatt tggggagtag ttggtcttat caggtattag caacagaggg ctatcaaagt 540 agtgggtact ctaacgtaac ggtctggtaa 570 <210> 378 <211> 189 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated polypeptide <400> 378 Met Ala Leu Met Ala Ser Thr Phe Tyr Trp His Leu Trp Thr Asp Gly 1 5 10 15 Ile Gly Thr Val Asn Ala Thr Asn Gly Ser Asp Gly Asn Tyr Ser Val 20 25 30 Ser Trp Ser Asn Cys Gly Asn Phe Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr 35 40 45 Gly Ser Ala Thr Arg Val Ile Asn Tyr Asn Ala His Ala Phe Ser Val 50 55 60 Val Gly Asn Ala Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu 65 70 75 80 Ile Glu Tyr Tyr Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly 85 90 95 Thr Tyr Lys Gly Thr Val Thr Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr 100 105 110 Thr Thr Thr Arg Thr Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asn Asn Thr Thr 115 120 125 Phe Thr Gln Phe Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Pro Ile Gly Thr 130 135 140 Asn Asn Thr Ile Thr Phe Ser Asn His Val Asn Ala Trp Lys Ser Lys 145 150 155 160 Gly Met Asn Leu Gly Ser Ser Trp Ser Tyr Gln Val Leu Ala Thr Glu 165 170 175 Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Tyr Ser Asn Val Thr Val Trp 180 185 <210> 379 <211> 570 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated polynucleotide. <400> 379 atggccctta tggcttcgac attctactgg cacaattgga ctgatggtat agggacagta 60 aatgctacca atggatctga tggcaattac agcgtttcat ggtcaaattg cgggaatttt 120 gttgttggta aaggctggac taccggatca gcaactaggg taataaacta taatgcccac 180 gccttttcgc cggtgggtaa tgcttatttg gctctttatg ggtggacgag aaattcactc 240 atagaatatt acgtcgttga tagctggggg acttatagac ctactggaac ttataaaggc 300 actgtgacta gtgatggagg gacttatgac atatacacga ctacacgaac caacgcacct 360 tccattgacg gcaataatac aactttcacc cagttctgga gtgttaggca gtcgaagaga 420 ccgattggta ccaacaatac catcaccttt agcaaccatg ttaacgcctg gaagagtaaa 480 ggaatgaatt tggggagtag ttggtcttat caggtattag caacagaggg ctatcaaagt 540 agtgggtact ctaacgtaac ggtctggtaa 570 <210> 380 <211> 189 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated polypeptide. <400> 380 Met Ala Leu Met Ala Ser Thr Phe Tyr Trp His Asn Trp Thr Asp Gly 1 5 10 15 Ile Gly Thr Val Asn Ala Thr Asn Gly Ser Asp Gly Asn Tyr Ser Val 20 25 30 Ser Trp Ser Asn Cys Gly Asn Phe Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr 35 40 45 Gly Ser Ala Thr Arg Val Ile Asn Tyr Asn Ala His Ala Phe Ser Pro 50 55 60 Val Gly Asn Ala Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Ser Leu 65 70 75 80 Ile Glu Tyr Tyr Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly 85 90 95 Thr Tyr Lys Gly Thr Val Thr Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr 100 105 110 Thr Thr Thr Arg Thr Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asn Asn Thr Thr 115 120 125 Phe Thr Gln Phe Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Pro Ile Gly Thr 130 135 140 Asn Asn Thr Ile Thr Phe Ser Asn His Val Asn Ala Trp Lys Ser Lys 145 150 155 160 Gly Met Asn Leu Gly Ser Ser Trp Ser Tyr Gln Val Leu Ala Thr Glu 165 170 175 Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Tyr Ser Asn Val Thr Val Trp 180 185

Claims (215)

  1. 약 100개 이상의 잔기로 이루어진 영역에 걸쳐 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117, 서열 번호 119, 서열 번호 121, 서열 번호 123, 서열 번호 125, 서열 번호 127, 서열 번호 129, 서열 번호 131, 서열 번호 133, 서열 번호 135, 서열 번호 137, 서열 번호 139, 서열 번호 141, 서열 번호 143, 서열 번호 145, 서열 번호 147, 서열 번호 149, 서열 번호 151, 서열 번호 153, 서열 번호 155, 서열 번호 157, 서열 번호 159, 서열 번호 161, 서열 번호 163, 서열 번호 165, 서열 번호 167, 서열 번호 169, 서열 번호 171, 서열 번호 173, 서열 번호 175, 서열 번호 177, 서열 번호 179, 서열 번호 181, 서열 번호183, 서열 번호 185, 서열 번호 187, 서열 번호 189, 서열 번호 191, 서열 번호 193, 서열 번호 195, 서열 번호 197, 서열 번호 199, 서열 번호 201, 서열 번호 203, 서열 번호 205, 서열 번호 207, 서열 번호 209, 서열 번호 211, 서열 번호 213, 서열 번호 215, 서열 번호 217, 서열 번호 219, 서열 번호 221, 서열 번호 223, 서열 번호 225, 서열 번호 227, 서열 번호 229, 서열 번호 231, 서열 번호 233, 서열 번호 235, 서열 번호 237, 서열 번호 239, 서열 번호 241, 서열 번호 243, 서열 번호 245, 서열 번호 247, 서열 번호 249, 서열 번호 251, 서열 번호 253, 서열 번호 255, 서열 번호 257, 서열 번호 259, 서열 번호 261, 서열 번호 263, 서열 번호 265, 서열 번호 267, 서열 번호 269, 서열 번호 271, 서열 번호 273, 서열 번호 275, 서열 번호 277, 서열 번호 279, 서열 번호 281, 서열 번호 283, 서열 번호 285, 서열 번호 287, 서열 번호 289, 서열 번호 291, 서열 번호 293, 서열 번호 295, 서열 번호 297, 서열 번호 299, 서열 번호 301, 서열 번호 303, 서열 번호 305, 서열 번호 307, 서열 번호 309, 서열 번호 311, 서열 번호 313, 서열 번호 315, 서열 번호 317, 서열 번호 319, 서열 번호 321, 서열 번호 323, 서열 번호 325, 서열 번호 327, 서열 번호 329, 서열 번호 331, 서열 번호 333, 서열 번호 335, 서열 번호 337, 서열 번호 339, 서열 번호 341, 서열 번호 343, 서열 번호 345, 서열 번호 347, 서열 번호 349, 서열 번호 351, 서열 번호 353, 서열 번호 355, 서열 번호 357, 서열 번호 359, 서열 번호 361, 서열 번호 363, 서열 번호 365, 서열 번호 367, 서열 번호 369, 서열 번호 371, 서열 번호 373, 서열 번호 375, 서열 번호 377 또는 서열 번호 379의 서열에 대해 50% 이상의서열 동일성을 보유하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 또는 재조합 핵산으로서, 상기 핵산은 자일라나제 활성을 보유하는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화하고, 상기 서열 동일성은 서열 비교 알고리즘에 의한 분석 또는 시각 검사를 통해 결정한 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열 동일성은 약 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63% 또는 64% 이상인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  3. 제1항에 있어서, 상기 서열 동일성은 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117, 서열 번호 119, 서열 번호 121, 서열 번호 123, 서열 번호 125, 서열 번호 127, 서열 번호 129, 서열 번호 131, 서열 번호 133, 서열 번호 135, 서열 번호 137, 서열 번호 139, 서열 번호 141, 서열 번호 143, 서열 번호 145, 서열 번호 147, 서열 번호 149, 서열 번호 151, 서열 번호 153, 서열 번호 155, 서열 번호 157, 서열 번호 159, 서열 번호 161, 서열 번호 163, 서열 번호 165, 서열 번호 167, 서열 번호 169, 서열 번호 171, 서열 번호 173, 서열 번호 175, 서열 번호 177, 서열 번호 179, 서열 번호 181, 서열 번호 183, 서열 번호 185, 서열 번호 187, 서열 번호 189, 서열 번호 191, 서열 번호 193, 서열 번호 195, 서열 번호 197, 서열 번호 199, 서열 번호 201, 서열 번호 203, 서열 번호 205, 서열 번호 207, 서열 번호 209, 서열 번호 211, 서열 번호 213, 서열 번호 215, 서열 번호 217, 서열 번호 219, 서열 번호 221, 서열 번호 223, 서열 번호 225, 서열 번호 227, 서열 번호 229, 서열 번호 231, 서열 번호 233, 서열 번호 235, 서열 번호 237, 서열 번호 239, 서열 번호 241, 서열 번호 243, 서열 번호 245, 서열 번호 247, 서열 번호 249, 서열 번호 251, 서열 번호 253, 서열 번호 255, 서열 번호 257, 서열 번호 259, 서열 번호 261, 서열 번호 263, 서열 번호 265, 서열 번호 267, 서열 번호 269, 서열 번호 271, 서열 번호 273, 서열 번호 275, 서열 번호 277, 서열 번호 279, 서열 번호 281, 서열 번호 283, 서열 번호 285, 서열 번호 287, 서열 번호 289, 서열 번호 291, 서열 번호 293, 서열 번호 295, 서열 번호 297, 서열 번호 299, 서열 번호 301, 서열 번호 303, 서열 번호 305, 서열 번호 307, 서열 번호 309, 서열 번호 311, 서열 번호 313, 서열 번호315, 서열 번호 317, 서열 번호 319, 서열 번호 321, 서열 번호 323, 서열 번호 325, 서열 번호 327, 서열 번호 329, 서열 번호 331, 서열 번호 333, 서열 번호 335, 서열 번호 337, 서열 번호 339, 서열 번호 341, 서열 번호 343, 서열 번호 345, 서열 번호 347, 서열 번호 349, 서열 번호 351, 서열 번호 353, 서열 번호 355, 서열 번호 357, 서열 번호 359, 서열 번호 361, 서열 번호 363, 서열 번호 365, 서열 번호 367, 서열 번호 369, 서열 번호 371, 서열 번호 373, 서열 번호 375, 서열 번호 377 또는 서열 번호 379의 서열에 대해 약 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  4. 제1항에 있어서, 상기 서열 동일성은 약 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150개 이상의 잔기로 이루어진 영역, 전장 유전자 또는 전사체에 걸친 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  5. 제1항에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117, 서열 번호 119, 서열 번호 121, 서열 번호 123, 서열 번호 125, 서열 번호 127, 서열 번호 129, 서열 번호 131, 서열 번호 133, 서열 번호 135, 서열 번호 137, 서열 번호 139, 서열 번호 141, 서열 번호 143, 서열 번호 145, 서열 번호 147, 서열 번호 149, 서열 번호 151, 서열 번호 153, 서열 번호 155, 서열 번호 157, 서열 번호 159, 서열 번호 161, 서열 번호 163, 서열 번호 165, 서열 번호 167, 서열 번호 169, 서열 번호 171, 서열 번호 173, 서열 번호 175, 서열 번호 177, 서열 번호 179, 서열 번호 181, 서열 번호 183, 서열 번호 185, 서열 번호 187, 서열 번호 189, 서열 번호 191, 서열 번호 193, 서열 번호 195, 서열 번호 197, 서열 번호 199, 서열 번호 201, 서열 번호 203, 서열 번호 205, 서열 번호 207, 서열 번호 209, 서열 번호 211, 서열 번호 213, 서열 번호 215, 서열 번호 217, 서열 번호 219, 서열 번호 221, 서열 번호 223, 서열 번호 225, 서열 번호 227, 서열 번호 229, 서열 번호 231, 서열 번호 233, 서열 번호 235, 서열 번호 237, 서열 번호 239, 서열 번호 241, 서열 번호 243, 서열 번호245, 서열 번호 247, 서열 번호 249, 서열 번호 251, 서열 번호 253, 서열 번호 255, 서열 번호 257, 서열 번호 259, 서열 번호 261, 서열 번호 263, 서열 번호 265, 서열 번호 267, 서열 번호 269, 서열 번호 271, 서열 번호 273, 서열 번호 275, 서열 번호 277, 서열 번호 279, 서열 번호 281, 서열 번호 283, 서열 번호 285, 서열 번호 287, 서열 번호 289, 서열 번호 291, 서열 번호 293, 서열 번호 295, 서열 번호 297, 서열 번호 299, 서열 번호 301, 서열 번호 303, 서열 번호 305, 서열 번호 307, 서열 번호 309, 서열 번호 311, 서열 번호 313, 서열 번호 315, 서열 번호 317, 서열 번호 319, 서열 번호 321, 서열 번호 323, 서열 번호 325, 서열 번호 327, 서열 번호 329, 서열 번호 331, 서열 번호 333, 서열 번호 335, 서열 번호 337, 서열 번호 339, 서열 번호 341, 서열 번호 343, 서열 번호 345, 서열 번호 347, 서열 번호 349, 서열 번호 351, 서열 번호 353, 서열 번호 355, 서열 번호 357, 서열 번호 359, 서열 번호 361, 서열 번호 363, 서열 번호 365, 서열 번호 367, 서열 번호 369, 서열 번호 371, 서열 번호 373, 서열 번호 375, 서열 번호 377 또는 서열 번호 379의 서열을 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  6. 제1항에 있어서, 상기 핵산은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40,서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 48, 서열 번호 50, 서열 번호 52, 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 58, 서열 번호 60, 서열 번호 62, 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108, 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116, 서열 번호 118, 서열 번호 120, 서열 번호 122, 서열 번호 124, 서열 번호 126, 서열 번호 128, 서열 번호 130, 서열 번호 132, 서열 번호 134, 서열 번호 136, 서열 번호 138, 서열 번호 140, 서열 번호 142, 서열 번호 144, 서열 번호 146, 서열 번호 148, 서열 번호 150, 서열 번호 152, 서열 번호 154, 서열 번호 156, 서열 번호 158, 서열 번호 160, 서열 번호 162, 서열 번호 164, 서열 번호 166, 서열 번호 168, 서열 번호 170, 서열 번호 172, 서열 번호 174, 서열 번호 176, 서열 번호 178, 서열 번호 180, 서열 번호 182, 서열 번호 184, 서열 번호 186, 서열 번호 188, 서열 번호 190, 서열 번호 192, 서열 번호 194, 서열 번호 196, 서열 번호 198, 서열 번호 200, 서열 번호 202, 서열 번호 204, 서열 번호 206, 서열 번호 208, 서열 번호 210, 서열 번호 212, 서열 번호 214, 서열 번호 216, 서열 번호 218, 서열 번호 220, 서열 번호 222, 서열 번호 224, 서열 번호 226, 서열 번호 228, 서열 번호 230, 서열 번호 232, 서열 번호 234, 서열 번호 236, 서열 번호 238, 서열 번호 240, 서열 번호 242, 서열 번호 244, 서열 번호246, 서열 번호 248, 서열 번호 250, 서열 번호 252, 서열 번호 254, 서열 번호 256, 서열 번호 258, 서열 번호 260, 서열 번호 262, 서열 번호 264, 서열 번호 266, 서열 번호 268, 서열 번호 270, 서열 번호 272, 서열 번호 274, 서열 번호 276, 서열 번호 278, 서열 번호 280, 서열 번호 282, 서열 번호 284, 서열 번호 286, 서열 번호 288, 서열 번호 290, 서열 번호 292, 서열 번호 294, 서열 번호 296, 서열 번호 298, 서열 번호 300, 서열 번호 302, 서열 번호 304, 서열 번호 306, 서열 번호 308, 서열 번호 310, 서열 번호 312, 서열 번호 314, 서열 번호 316, 서열 번호 318, 서열 번호 320, 서열 번호 322, 서열 번호 324, 서열 번호 326, 서열 번호 328, 서열 번호 330, 서열 번호 332, 서열 번호 334, 서열 번호 336, 서열 번호 338, 서열 번호 340, 서열 번호 342, 서열 번호 344, 서열 번호 346, 서열 번호 348, 서열 번호 350, 서열 번호 352, 서열 번호 354, 서열 번호 356, 서열 번호 358, 서열 번호 360, 서열 번호 362, 서열 번호 364, 서열 번호 366, 서열 번호 368, 서열 번호 370, 서열 번호 372, 서열 번호 374, 서열 번호 376, 서열 번호 378 또는 서열 번호 380의 서열을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  7. 제1항에 있어서, 상기 서열 비교 알고리즘은 BLAST 버젼 2.2.2 알고리즘이며, 이때 필터링 세팅은 blastall-p blastp-d "nr pataa" -F F로 설정하고, 모든 다른 옵션은 디폴트로 설정하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  8. 제1항에 있어서, 상기 자일라나제 활성은 내부 β-1,4-자일로시드 결합의 가수분해를 촉진하는 것을 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  9. 제8항에 있어서, 상기 자일라나제 활성은 엔도-1,4-베타-자일라나제 활성을 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  10. 제1항에 있어서, 상기 자일라나제 활성은 더 적은 분자량의 자일로즈와 자일로-올리고머를 생성하기 위한 자일란의 가수분해를 촉진하는 것을 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  11. 제10항에 있어서, 상기 자일란은 아라비노자일란을 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  12. 제11항에 있어서, 상기 아라비노자일란은 수용성 아라비노자일란을 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  13. 제12항에 있어서, 상기 수용성 아라비노자일란은 반죽 또는 빵류 제품을 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  14. 제1항에 있어서, 상기 자일라나제 활성은 1,4-β-글리코시드-결합된 D-자일로피라노즈를 포함하는 다당류를 가수분해하는 것을 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  15. 제1항에 있어서, 상기 자일라나제 활성은 헤미셀룰로즈를 가수분해하는 것을 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  16. 제15항에 있어서, 상기 자일라나제 활성은 목재 또는 종이 펄프 또는 종이 제품내 헤미셀룰로즈를 가수분해하는 것을 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합핵산.
  17. 제8항에 있어서, 상기 자일라나제 활성은 사료 또는 식품 중 자일란의 가수분해를 촉진하는 것을 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  18. 제17항에 있어서, 상기 사료 또는 식품은 곡물이 주성분인 동물 사료, 맥아즙 또는 맥주, 우유 또는 유제품, 과일 또는 채소를 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  19. 제1항에 있어서, 상기 자일란 활성은 미생물 세포 또는 식물 세포중 자알린의 가수분해를 촉진하는 것을 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  20. 제1항에 있어서, 상기 자일라나제 활성은 열안정성인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  21. 제20항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 약 37℃∼약 95℃, 또는 약 55℃∼약 85℃, 또는 약 70℃∼약 75℃, 또는 약 70℃∼약 95℃, 또는 약 90℃∼약 95℃의 온도를 포함하는 조건 하에서 자일라나제 활성을 보유하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  22. 제1항에 있어서, 상기 자일라나제 활성은 내열성인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  23. 제22항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 약 37℃∼약 95℃, 또는 약 55℃∼약 85℃, 또는 약 70℃∼약 75℃, 또는 약 90℃∼약 95℃ 범위의 온도에 노출후 자일라나제 활성을 보유하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합
  24. 엄격한 조건 하에서 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51,서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117, 서열 번호 119, 서열 번호 121, 서열 번호 123, 서열 번호 125, 서열 번호 127, 서열 번호 129, 서열 번호 131, 서열 번호 133, 서열 번호 135, 서열 번호 137, 서열 번호 139, 서열 번호 141, 서열 번호 143, 서열 번호 145, 서열 번호 147, 서열 번호 149, 서열 번호 151, 서열 번호 153, 서열 번호 155, 서열 번호 157, 서열 번호 159, 서열 번호 161, 서열 번호 163, 서열 번호 165, 서열 번호 167, 서열 번호 169, 서열 번호 171, 서열 번호 173, 서열 번호 175, 서열 번호 177, 서열 번호 179, 서열 번호 181, 서열 번호 183, 서열 번호 185, 서열 번호 187, 서열 번호 189, 서열 번호 191, 서열 번호 193, 서열 번호 195, 서열 번호 197, 서열 번호 199, 서열 번호 201, 서열 번호 203, 서열 번호 205, 서열 번호 207, 서열 번호 209, 서열 번호 211, 서열 번호 213, 서열 번호 215, 서열 번호 217, 서열 번호 219, 서열 번호 221, 서열 번호 223, 서열 번호 225, 서열 번호 227, 서열 번호 229, 서열 번호 231, 서열 번호 233, 서열 번호 235, 서열 번호 237, 서열 번호 239, 서열 번호 241, 서열 번호 243, 서열 번호 245, 서열 번호 247, 서열 번호 249, 서열 번호 251, 서열 번호 253, 서열 번호 255, 서열 번호257, 서열 번호 259, 서열 번호 261, 서열 번호 263, 서열 번호 265, 서열 번호 267, 서열 번호 269, 서열 번호 271, 서열 번호 273, 서열 번호 275, 서열 번호 277, 서열 번호 279, 서열 번호 281, 서열 번호 283, 서열 번호 285, 서열 번호 287, 서열 번호 289, 서열 번호 291, 서열 번호 293, 서열 번호 295, 서열 번호 297, 서열 번호 299, 서열 번호 301, 서열 번호 303, 서열 번호 305, 서열 번호 307, 서열 번호 309, 서열 번호 311, 서열 번호 313, 서열 번호 315, 서열 번호 317, 서열 번호 319, 서열 번호 321, 서열 번호 323, 서열 번호 325, 서열 번호 327, 서열 번호 329, 서열 번호 331, 서열 번호 333, 서열 번호 335, 서열 번호 337, 서열 번호 339, 서열 번호 341, 서열 번호 343, 서열 번호 345, 서열 번호 347, 서열 번호 349, 서열 번호 351, 서열 번호 353, 서열 번호 355, 서열 번호 357, 서열 번호 359, 서열 번호 361, 서열 번호 363, 서열 번호 365, 서열 번호 367, 서열 번호 369, 서열 번호 371, 서열 번호 373, 서열 번호 375, 서열 번호 377 또는 서열 번호 379를 포함하는 핵산에 하이브리드화하는 서열을 포함하며, 자일라나제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  25. 제24항에 있어서, 상기 핵산은 길이가 약 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 이상의 잔기이거나, 유전자 또는 전사체의 전체 길이인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  26. 제24항에 있어서, 상기 엄격한 조건은 약 65℃의 온도에서 약 15분 동안 0.2X SSC 중에서 세척하는 단계를 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  27. 자일라나제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 동정하기 위한 핵산 프로브로서, 상기 프로브는 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117, 서열 번호 119, 서열 번호 121, 서열 번호 123, 서열 번호 125, 서열 번호 127, 서열 번호 129, 서열 번호 131, 서열 번호 133, 서열 번호 135, 서열 번호 137, 서열 번호 139, 서열 번호 141, 서열 번호 143, 서열 번호 145, 서열 번호 147, 서열 번호 149, 서열 번호 151, 서열 번호 153, 서열 번호 155, 서열 번호 157, 서열 번호 159, 서열 번호 161, 서열 번호 163, 서열 번호 165, 서열 번호167, 서열 번호 169, 서열 번호 171, 서열 번호 173, 서열 번호 175, 서열 번호 177, 서열 번호 179, 서열 번호 181, 서열 번호 183, 서열 번호 185, 서열 번호 187, 서열 번호 189, 서열 번호 191, 서열 번호 193, 서열 번호 195, 서열 번호 197, 서열 번호 199, 서열 번호 201, 서열 번호 203, 서열 번호 205, 서열 번호 207, 서열 번호 209, 서열 번호 211, 서열 번호 213, 서열 번호 215, 서열 번호 217, 서열 번호 219, 서열 번호 221, 서열 번호 223, 서열 번호 225, 서열 번호 227, 서열 번호 229, 서열 번호 231, 서열 번호 233, 서열 번호 235, 서열 번호 237, 서열 번호 239, 서열 번호 241, 서열 번호 243, 서열 번호 245, 서열 번호 247, 서열 번호 249, 서열 번호 251, 서열 번호 253, 서열 번호 255, 서열 번호 257, 서열 번호 259, 서열 번호 261, 서열 번호 263, 서열 번호 265, 서열 번호 267, 서열 번호 269, 서열 번호 271, 서열 번호 273, 서열 번호 275, 서열 번호 277, 서열 번호 279, 서열 번호 281, 서열 번호 283, 서열 번호 285, 서열 번호 287, 서열 번호 289, 서열 번호 291, 서열 번호 293, 서열 번호 295, 서열 번호 297, 서열 번호 299, 서열 번호 301, 서열 번호 303, 서열 번호 305, 서열 번호 307, 서열 번호 309, 서열 번호 311, 서열 번호 313, 서열 번호 315, 서열 번호 317, 서열 번호 319, 서열 번호 321, 서열 번호 323, 서열 번호 325, 서열 번호 327, 서열 번호 329, 서열 번호 331, 서열 번호 333, 서열 번호 335, 서열 번호 337, 서열 번호 339, 서열 번호 341, 서열 번호 343, 서열 번호 345, 서열 번호 347, 서열 번호 349, 서열 번호 351, 서열 번호 353, 서열 번호 355, 서열 번호 357, 서열 번호 359, 서열 번호 361, 서열 번호 363, 서열 번호 365, 서열 번호367, 서열 번호 369, 서열 번호 371, 서열 번호 373, 서열 번호 375, 서열 번호 377 또는 서열 번호 379를 포함하는 서열의 10개 이상의 연속 염기를 포함하고 결합 또는 하이브리드화에 의해 핵산을 동정하는 것인 핵산 프로브.
  28. 제27항에 있어서, 상기 프로브는 약 10∼50, 약 20∼60, 약 30∼70, 약 40∼80, 약 60∼100 또는 약 50∼150개의 연속 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 핵산 프로브.
  29. 자일라나제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 동정하기 위한 핵산 프로브로서, 상기 프로브는 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117, 서열 번호 119, 서열 번호 121, 서열 번호 123, 서열 번호 125, 서열 번호 127, 서열 번호 129, 서열 번호 131, 서열 번호 133, 서열 번호 135, 서열 번호 137, 서열 번호 139, 서열 번호 141, 서열 번호 143, 서열 번호 145, 서열 번호 147, 서열 번호 149, 서열 번호 151, 서열 번호 153, 서열 번호 155, 서열 번호 157, 서열 번호 159, 서열 번호 161, 서열 번호 163, 서열 번호 165, 서열 번호 167, 서열 번호 169, 서열 번호 171, 서열 번호 173, 서열 번호 175, 서열 번호 177, 서열 번호 179, 서열 번호 181, 서열 번호 183, 서열 번호 185, 서열 번호 187, 서열 번호 189, 서열 번호 191, 서열 번호 193, 서열 번호 195, 서열 번호 197, 서열 번호 199, 서열 번호 201, 서열 번호 203, 서열 번호 205, 서열 번호 207, 서열 번호 209, 서열 번호 211, 서열 번호 213, 서열 번호 215, 서열 번호 217, 서열 번호 219, 서열 번호 221, 서열 번호 223, 서열 번호 225, 서열 번호 227, 서열 번호 229, 서열 번호 231, 서열 번호 233, 서열 번호 235, 서열 번호 237, 서열 번호 239, 서열 번호 241, 서열 번호 243, 서열 번호 245, 서열 번호 247, 서열 번호 249, 서열 번호 251, 서열 번호 253, 서열 번호 255, 서열 번호 257, 서열 번호 259, 서열 번호 261, 서열 번호 263, 서열 번호 265, 서열 번호 267, 서열 번호 269, 서열 번호 271, 서열 번호 273, 서열 번호 275, 서열 번호 277, 서열 번호 279, 서열 번호 281, 서열 번호 283, 서열 번호 285, 서열 번호 287, 서열 번호 289, 서열 번호 291, 서열 번호 293, 서열 번호 295, 서열 번호 297, 서열 번호 299, 서열 번호 301, 서열 번호 303, 서열 번호 305, 서열 번호 307, 서열 번호 309, 서열 번호 311, 서열 번호 313, 서열 번호 315, 서열 번호317, 서열 번호 319, 서열 번호 321, 서열 번호 323, 서열 번호 325, 서열 번호 327, 서열 번호 329, 서열 번호 331, 서열 번호 333, 서열 번호 335, 서열 번호 337, 서열 번호 339, 서열 번호 341, 서열 번호 343, 서열 번호 345, 서열 번호 347, 서열 번호 349, 서열 번호 351, 서열 번호 353, 서열 번호 355, 서열 번호 357, 서열 번호 359, 서열 번호 361, 서열 번호 363, 서열 번호 365, 서열 번호 367, 서열 번호 369, 서열 번호 371, 서열 번호 373, 서열 번호 375, 서열 번호 377 또는 서열 번호 379의 서열에 대해 50% 이상의 서열 동일성을 보유하는 핵산 서열의 약 10개 이상의 연속 잔기를 포함하는 핵산을 포함하며, 상기 서열 동일성은 서열 비교 알고리즘 또는 시각 검사를 통해 결정된 것인 핵산 프로브.
  30. 제29항에 있어서, 상기 프로브는 약 10∼50, 약 20∼60, 약 30∼70, 약 40∼80, 약 60∼100 또는 약 50∼150개 이상의 연속 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 핵산 프로브.
  31. 자일라나제 할성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 증폭하기 위한 증폭 프라이머 쌍으로서, 상기 프라이머 쌍은 제1항 또는 제24항의 서열 또는 이의하위서열을 포함하는 핵산을 증폭시킬 수 있는 것인 증폭 프라이머 쌍.
  32. 제31항에 있어서, 상기 다수의 증폭 프라이머 서열 쌍은 상기 서열의 약 10∼50개의 연속 염기 또는 상기 서열의 약 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 이상의 연속 염기를 포함하는 것인 증폭 프라이머 쌍.
  33. 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117, 서열 번호 119, 서열 번호 121, 서열 번호 123, 서열 번호 125, 서열 번호 127, 서열 번호 129, 서열 번호 131, 서열 번호 133, 서열 번호 135, 서열 번호 137, 서열 번호 139, 서열 번호 141, 서열 번호 143, 서열 번호 145, 서열 번호 147, 서열 번호 149, 서열 번호 151, 서열 번호 153, 서열 번호 155, 서열 번호 157, 서열 번호 159, 서열 번호 161, 서열 번호 163, 서열 번호 165, 서열 번호 167, 서열 번호 169, 서열 번호 171, 서열 번호 173, 서열 번호 175, 서열 번호 177, 서열 번호179, 서열 번호 181, 서열 번호 183, 서열 번호 185, 서열 번호 187, 서열 번호 189, 서열 번호 191, 서열 번호 193, 서열 번호 195, 서열 번호 197, 서열 번호 199, 서열 번호 201, 서열 번호 203, 서열 번호 205, 서열 번호 207, 서열 번호 209, 서열 번호 211, 서열 번호 213, 서열 번호 215, 서열 번호 217, 서열 번호 219, 서열 번호 221, 서열 번호 223, 서열 번호 225, 서열 번호 227, 서열 번호 229, 서열 번호 231, 서열 번호 233, 서열 번호 235, 서열 번호 237, 서열 번호 239, 서열 번호 241, 서열 번호 243, 서열 번호 245, 서열 번호 247, 서열 번호 249, 서열 번호 251, 서열 번호 253, 서열 번호 255, 서열 번호 257, 서열 번호 259, 서열 번호 261, 서열 번호 263, 서열 번호 265, 서열 번호 267, 서열 번호 269, 서열 번호 271, 서열 번호 273, 서열 번호 275, 서열 번호 277, 서열 번호 279, 서열 번호 281, 서열 번호 283, 서열 번호 285, 서열 번호 287, 서열 번호 289, 서열 번호 291, 서열 번호 293, 서열 번호 295, 서열 번호 297, 서열 번호 299, 서열 번호 301, 서열 번호 303, 서열 번호 305, 서열 번호 307, 서열 번호 309, 서열 번호 311, 서열 번호 313, 서열 번호 315, 서열 번호 317, 서열 번호 319, 서열 번호 321, 서열 번호 323, 서열 번호 325, 서열 번호 327, 서열 번호 329, 서열 번호 331, 서열 번호 333, 서열 번호 335, 서열 번호 337, 서열 번호 339, 서열 번호 341, 서열 번호 343, 서열 번호 345, 서열 번호 347, 서열 번호 349, 서열 번호 351, 서열 번호 353, 서열 번호 355, 서열 번호 357, 서열 번호 359, 서열 번호 361, 서열 번호 363, 서열 번호 365, 서열 번호 367, 서열 번호 369, 서열 번호 371, 서열 번호 373, 서열 번호 375, 서열 번호 377 또는 서열 번호 379의 대략 최초 (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 이상의 잔기로 나타낸 서열을 보유하는 제1 요소 및 상기 제1 요소의 상보성 스트랜드의 대략 최초 (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 이상의 잔기로 나타낸 서열을 보유하는 제2 요소를 포함하는 증폭 프라이머 쌍.
  34. 제33항의 증폭 프라이머 쌍을 이용하는 폴리뉴클레오티드의 증폭에 의해 생성된, 자일라나제를 암호화하는 핵산.
  35. 제34항에 있어서, 상기 증폭은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의한 것인 자일라나제를 암호화하는 핵산.
  36. 제34항에 있어서, 상기 핵산은 유전자 라이브러리의 증폭에 의해 생성된 것인 자일라나제를 암호화하는 핵산.
  37. 제34항에 있어서, 상기 유전자 라이브러리는 환경 라이브러리인 자일라나제를 암호화하는 핵산.
  38. 제34항의 자일라나제를 암호화하는 핵산에 의해 암호화된 분리된 자일라나제 또는 재조합 자일라나제.
  39. 제1항 또는 제24항의 핵산 서열 또는 이의 하위서열을 증폭킬 수 있는 증폭 프라이머 서열 쌍을 이용하여 주형 핵산을 증폭시키는 단계를 포함하는, 자일라나제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 증폭 방법.
  40. 제1항 또는 제24항의 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 발현 카세트.
  41. 제1항 또는 제24항의 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터.
  42. 제1항 또는 제24항의 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 클로닝 비히클로서, 상기 클로닝 비히클은 바이러스 벡터, 플라스미드, 파지, 파지미드, 코스미드, 포스미드, 박테리오파지 또는 인공 염색체를 포함하는 것인 클로닝 비히클.
  43. 제42항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터를 포함하는 것인 클로닝 비히클.
  44. 제42항에 있어서, 박테리아 인공 염색체(BAC), 플라스미드, 박테리오파지 P1-유도된 벡터(PAC), 효모 인공 염색체(YAC) 또는 포유류 인공 염색체(MAC)를 포함하는 것인 클로닝 벡터.
  45. 제1항 또는 제24항의 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 형질전환 세포.
  46. 제40항의 발현 카세트를 포함하는 형질전환 세포.
  47. 제40항에 있어서, 상기 세포는 박테리아 세포, 포유류 세포, 진균 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 식물 세포인 형질전환 세포.
  48. 제1항 또는 제24항의 서열을 포함하는 트랜스게닉 비인간 동물.
  49. 제48항에 있어서, 상기 동물은 마우스인 트랜스게닉 비인간 동물.
  50. 제1항 또는 제24항의 서열을 포함하는 트랜스게닉 식물
  51. 제50항에 있어서, 상기 식물이 옥수수 식물, 사탕수수 식물, 감자 식물, 토마토 식물, 밀 식물, 오일시드 식물, 평자씨 식물, 대두 식물, 쌀 식물, 보리 식물, 잔디 또는 담배 식물인 트랜스게닉 식물.
  52. 제1항 또는 제24항의 서열을 포함하는 트랜스게닉 종자.
  53. 제52항에 있어서, 상기 종자는 옥수수 종자, 밀 낟알, 오일시드, 평자씨, 대두 종자, 종려 종자, 해바라기씨, 참깨씨, 쌀, 보리, 땅콩 또는 담배 식물 종자인 트랜스게닉 종자.
  54. 엄격한 조건 하에서 제1항 또는 제24항의 서열 또는 이의 하위서열에 상보적이거나, 또는 하이브리드화할 수 있는 핵산 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  55. 제49항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 길이가 약 10∼50, 약 20∼60, 약 30∼70, 약 40∼80 또는 약 60∼100개의 염기인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  56. 엄격한 조건 하에서 제1항 또는 제24항의 서열에 상보적이거나, 또는 하이브리드화할 수 있는 핵산 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 세포에 투여하거나, 또는 세포 내에서 발현시키는 단계를 포함하는, 세포 내에서 자일라나제 메세지의 번역을 억제하는 방법.
  57. 제1항 또는 제24항의 서열의 하위서열을 포함하는 이본쇄 억제성 RNA(RNAi) 분자.
  58. 제52항에 있어서, 상기 RNAi는 길이가 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24, 25개 이상의 이중 뉴클레오티드인 이본쇄 억제성 RNA(RNAi) 분자.
  59. 이본쇄 억제성 RNA(RNAi)를 세포에 투여하거나, 또는 세포 내에서 발현시키는 단계를 포함하는, 세포 내에서 자일라나제의 발현을 억제하는 방법으로서, 상기 RNA는 제1항 또는 제24항의 서열의 하위서열을 포함하는 것인 방법.
  60. (i) 약 100개 이상의 잔기로 이루어진 영역에 걸쳐 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117, 서열 번호 119, 서열 번호 121, 서열 번호 123, 서열 번호 125, 서열 번호 127, 서열 번호 129, 서열 번호 131, 서열 번호 133, 서열 번호 135, 서열 번호 137, 서열 번호 139, 서열 번호 141, 서열 번호143, 서열 번호 145, 서열 번호 147, 서열 번호 149, 서열 번호 151, 서열 번호 153, 서열 번호 155, 서열 번호 157, 서열 번호 159, 서열 번호 161, 서열 번호 163, 서열 번호 165, 서열 번호 167, 서열 번호 169, 서열 번호 171, 서열 번호 173, 서열 번호 175, 서열 번호 177, 서열 번호 179, 서열 번호 181, 서열 번호 183, 서열 번호 185, 서열 번호 187, 서열 번호 189, 서열 번호 191, 서열 번호 193, 서열 번호 195, 서열 번호 197, 서열 번호 199, 서열 번호 201, 서열 번호 203, 서열 번호 205, 서열 번호 207, 서열 번호 209, 서열 번호 211, 서열 번호 213, 서열 번호 215, 서열 번호 217, 서열 번호 219, 서열 번호 221, 서열 번호 223, 서열 번호 225, 서열 번호 227, 서열 번호 229, 서열 번호 231, 서열 번호 233, 서열 번호 235, 서열 번호 237, 서열 번호 239, 서열 번호 241, 서열 번호 243, 서열 번호 245, 서열 번호 247, 서열 번호 249, 서열 번호 251, 서열 번호 253, 서열 번호 255, 서열 번호 257, 서열 번호 259, 서열 번호 261, 서열 번호 263, 서열 번호 265, 서열 번호 267, 서열 번호 269, 서열 번호 271, 서열 번호 273, 서열 번호 275, 서열 번호 277, 서열 번호 279, 서열 번호 281, 서열 번호 283, 서열 번호 285, 서열 번호 287, 서열 번호 289, 서열 번호 291, 서열 번호 293, 서열 번호 295, 서열 번호 297, 서열 번호 299, 서열 번호 301, 서열 번호 303, 서열 번호 305, 서열 번호 307, 서열 번호 309, 서열 번호 311, 서열 번호 313, 서열 번호 315, 서열 번호 317, 서열 번호 319, 서열 번호 321, 서열 번호 323, 서열 번호 325, 서열 번호 327, 서열 번호 329, 서열 번호 331, 서열 번호 333, 서열 번호 335, 서열 번호 337, 서열 번호 339, 서열 번호 341, 서열 번호343, 서열 번호 345, 서열 번호 347, 서열 번호 349, 서열 번호 351, 서열 번호 353, 서열 번호 355, 서열 번호 357, 서열 번호 359, 서열 번호 361, 서열 번호 363, 서열 번호 365, 서열 번호 367, 서열 번호 369, 서열 번호 371, 서열 번호 373, 서열 번호 375, 서열 번호 377 또는 서열 번호 379의 서열에 대해 50% 이상의 서열 동일성을 보유하거나(이때, 상기 서열 동일성은 서열 비교 알고리즘에 의한 분석 또는 시각 검사를 통해 결정한 것임) 또는
    (ii) 약 100개 이상의 잔기로 이루어진 영역에 걸쳐 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117, 서열 번호 119, 서열 번호 121, 서열 번호 123, 서열 번호 125, 서열 번호 127, 서열 번호 129, 서열 번호 131, 서열 번호 133, 서열 번호 135, 서열 번호 137, 서열 번호 139, 서열 번호 141, 서열 번호143, 서열 번호 145, 서열 번호 147, 서열 번호 149, 서열 번호 151, 서열 번호 153, 서열 번호 155, 서열 번호 157, 서열 번호 159, 서열 번호 161, 서열 번호 163, 서열 번호 165, 서열 번호 167, 서열 번호 169, 서열 번호 171, 서열 번호 173, 서열 번호 175, 서열 번호 177, 서열 번호 179, 서열 번호 181, 서열 번호 183, 서열 번호 185, 서열 번호 187, 서열 번호 189, 서열 번호 191, 서열 번호 193, 서열 번호 195, 서열 번호 197, 서열 번호 199, 서열 번호 201, 서열 번호 203, 서열 번호 205, 서열 번호 207, 서열 번호 209, 서열 번호 211, 서열 번호 213, 서열 번호 215, 서열 번호 217, 서열 번호 219, 서열 번호 221, 서열 번호 223, 서열 번호 225, 서열 번호 227, 서열 번호 229, 서열 번호 231, 서열 번호 233, 서열 번호 235, 서열 번호 237, 서열 번호 239, 서열 번호 241, 서열 번호 243, 서열 번호 245, 서열 번호 247, 서열 번호 249, 서열 번호 251, 서열 번호 253, 서열 번호 255, 서열 번호 257, 서열 번호 259, 서열 번호 261, 서열 번호 263, 서열 번호 265, 서열 번호 267, 서열 번호 269, 서열 번호 271, 서열 번호 273, 서열 번호 275, 서열 번호 277, 서열 번호 279, 서열 번호 281, 서열 번호 283, 서열 번호 285, 서열 번호 287, 서열 번호 289, 서열 번호 291, 서열 번호 293, 서열 번호 295, 서열 번호 297, 서열 번호 299, 서열 번호 301, 서열 번호 303, 서열 번호 305, 서열 번호 307, 서열 번호 309, 서열 번호 311, 서열 번호 313, 서열 번호 315, 서열 번호 317, 서열 번호 319, 서열 번호 321, 서열 번호 323, 서열 번호 325, 서열 번호 327, 서열 번호 329, 서열 번호 331, 서열 번호 333, 서열 번호 335, 서열 번호 337, 서열 번호 339, 서열 번호 341, 서열 번호343, 서열 번호 345, 서열 번호 347, 서열 번호 349, 서열 번호 351, 서열 번호 353, 서열 번호 355, 서열 번호 357, 서열 번호 359, 서열 번호 361, 서열 번호 363, 서열 번호 365, 서열 번호 367, 서열 번호 369, 서열 번호 371, 서열 번호 373, 서열 번호 375, 서열 번호 377 또는 서열 번호 379의 서열에 대해 50% 이상의 서열 동일성을 보유(이때, 상기 서열 동일성은 서열 비교 알고리즘에 의한 분석 또는 시각 검사를 통해 결정한 것임)하는 핵산에 의해 암호화되거나, 또는 엄격한 조건 하에서 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117, 서열 번호 119, 서열 번호 121, 서열 번호 123, 서열 번호 125, 서열 번호 127, 서열 번호 129, 서열 번호 131, 서열 번호 133, 서열 번호 135, 서열 번호 137, 서열 번호 139, 서열 번호 141, 서열 번호 143, 서열 번호 145, 서열 번호 147, 서열 번호149, 서열 번호 151, 서열 번호 153, 서열 번호 155, 서열 번호 157, 서열 번호 159, 서열 번호 161, 서열 번호 163, 서열 번호 165, 서열 번호 167, 서열 번호 169, 서열 번호 171, 서열 번호 173, 서열 번호 175, 서열 번호 177, 서열 번호 179, 서열 번호 181, 서열 번호 183, 서열 번호 185, 서열 번호 187, 서열 번호 189, 서열 번호 191, 서열 번호 193, 서열 번호 195, 서열 번호 197, 서열 번호 199, 서열 번호 201, 서열 번호 203, 서열 번호 205, 서열 번호 207, 서열 번호 209, 서열 번호 211, 서열 번호 213, 서열 번호 215, 서열 번호 217, 서열 번호 219, 서열 번호 221, 서열 번호 223, 서열 번호 225, 서열 번호 227, 서열 번호 229, 서열 번호 231, 서열 번호 233, 서열 번호 235, 서열 번호 237, 서열 번호 239, 서열 번호 241, 서열 번호 243, 서열 번호 245, 서열 번호 247, 서열 번호 249, 서열 번호 251, 서열 번호 253, 서열 번호 255, 서열 번호 257, 서열 번호 259, 서열 번호 261, 서열 번호 263, 서열 번호 265, 서열 번호 267, 서열 번호 269, 서열 번호 271, 서열 번호 273, 서열 번호 275, 서열 번호 277, 서열 번호 279, 서열 번호 281, 서열 번호 283, 서열 번호 285, 서열 번호 287, 서열 번호 289, 서열 번호 291, 서열 번호 293, 서열 번호 295, 서열 번호 297, 서열 번호 299, 서열 번호 301, 서열 번호 303, 서열 번호 305, 서열 번호 307, 서열 번호 309, 서열 번호 311, 서열 번호 313, 서열 번호 315, 서열 번호 317, 서열 번호 319, 서열 번호 321, 서열 번호 323, 서열 번호 325, 서열 번호 327, 서열 번호 329, 서열 번호 331, 서열 번호 333, 서열 번호 335, 서열 번호 337, 서열 번호 339, 서열 번호 341, 서열 번호 343, 서열 번호 345, 서열 번호 347, 서열 번호349, 서열 번호 351, 서열 번호 353, 서열 번호 355, 서열 번호 357, 서열 번호 359, 서열 번호 361, 서열 번호 363, 서열 번호 365, 서열 번호 367, 서열 번호 369, 서열 번호 371, 서열 번호 373, 서열 번호 375, 서열 번호 377 또는 서열 번호 379의 서열에 하이브리드화할 수 있는 핵산에 의해 암호화된 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드.
  61. 제60항에 있어서, 상기 서열 동일성은 일정 영역에 걸쳐 약 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 또는 100%인 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드.
  62. 제60항에 있어서, 상기 서열 동일성은 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050개 이상의 잔기로 이루어진 영역 또는 효소의 전체 길이에 걸친 것인 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드.
  63. 제60항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 48, 서열 번호 50, 서열 번호 52, 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 58, 서열 번호 60, 서열 번호 62, 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108, 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116, 서열 번호 118, 서열 번호 120, 서열 번호 122, 서열 번호 124, 서열 번호 126, 서열 번호 128, 서열 번호 130, 서열 번호 132, 서열 번호 134, 서열 번호 136, 서열 번호 138, 서열 번호 140, 서열 번호 142, 서열 번호 144, 서열 번호 146, 서열 번호 148, 서열 번호 150, 서열 번호 152, 서열 번호 154, 서열 번호 156, 서열 번호 158, 서열 번호 160, 서열 번호 162, 서열 번호 164, 서열 번호 166, 서열 번호 168, 서열 번호 170, 서열 번호 172, 서열 번호 174, 서열 번호 176, 서열 번호 178, 서열 번호 180, 서열 번호 182, 서열 번호 184, 서열 번호 186, 서열 번호 188, 서열 번호 190, 서열 번호 192, 서열 번호 194, 서열 번호 196, 서열 번호 198, 서열 번호 200, 서열 번호 202, 서열 번호 204, 서열 번호 206, 서열 번호 208, 서열 번호 210, 서열 번호 212, 서열 번호 214, 서열 번호 216, 서열 번호 218, 서열 번호 220, 서열 번호 222, 서열 번호 224, 서열 번호 226, 서열 번호 228, 서열 번호 230, 서열 번호 232, 서열 번호 234, 서열 번호236, 서열 번호 238, 서열 번호 240, 서열 번호 242, 서열 번호 244, 서열 번호 246, 서열 번호 248, 서열 번호 250, 서열 번호 252, 서열 번호 254, 서열 번호 256, 서열 번호 258, 서열 번호 260, 서열 번호 262, 서열 번호 264, 서열 번호 266, 서열 번호 268, 서열 번호 270, 서열 번호 272, 서열 번호 274, 서열 번호 276, 서열 번호 278, 서열 번호 280, 서열 번호 282, 서열 번호 284, 서열 번호 286, 서열 번호 288, 서열 번호 290, 서열 번호 292, 서열 번호 294, 서열 번호 296, 서열 번호 298, 서열 번호 300, 서열 번호 302, 서열 번호 304, 서열 번호 306, 서열 번호 308, 서열 번호 310, 서열 번호 312, 서열 번호 314, 서열 번호 316, 서열 번호 318, 서열 번호 320, 서열 번호 322, 서열 번호 324, 서열 번호 326, 서열 번호 328, 서열 번호 330, 서열 번호 332, 서열 번호 334, 서열 번호 336, 서열 번호 338, 서열 번호 340, 서열 번호 342, 서열 번호 344, 서열 번호 346, 서열 번호 348, 서열 번호 350, 서열 번호 352, 서열 번호 354, 서열 번호 356, 서열 번호 358, 서열 번호 360, 서열 번호 362, 서열 번호 364, 서열 번호 366, 서열 번호 368, 서열 번호 370, 서열 번호 372, 서열 번호 374, 서열 번호 376, 서열 번호 378 또는 서열 번호 380의 서열을 보유하는 것인 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드.
  64. 제60항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 자일라나제 활성을 보유하는 것인 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드.
  65. 제64항에 있어서, 상기 자일라나제 활성은 내부 β-1,4-자일로시드 결합의 가수분해를 촉진하는 것을 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  66. 제65항에 있어서, 상기 자일라나제 활성은 엔도-1,4-베타-자일라나제 활성을 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  67. 제64항에 있어서, 상기 자일라나제 활성은 더 적은 분자량의 자일로즈와 자일로-올리고머를 생성하기 위한 자일란의 가수분해를 촉진하는 것을 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  68. 제67항에 있어서, 상기 자일란은 아라비노자일란을 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  69. 제68항에 있어서, 상기 아라비노자일란은 수용성 아라비노자일란을 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  70. 제69항에 있어서, 상기 수용성 아라비노자일란은 반죽 또는 빵류 제품을 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  71. 제64항에 있어서, 상기 자일라나제 활성은 1,4-β-글리코시드-결합된 D-자일로피라노즈를 포함하는 다당류를 가수분해하는 것을 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  72. 제64항에 있어서, 상기 자일라나제 활성은 헤미셀룰로즈를 가수분해하는 것을 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  73. 제72항에 있어서, 상기 자일라나제 활성은 목재 또는 종이 펄프 또는 종이 제품내 헤미셀룰로즈를 가수분해하는 것을 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합핵산.
  74. 제73항에 있어서, 상기 자일라나제 활성은 사료 또는 식품 중 자일란의 가수분해를 촉진하는 것을 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  75. 제74항에 있어서, 상기 사료 또는 식품은 곡물이 주성분인 동물 사료, 맥아즙 또는 맥주, 우유 또는 유제품, 과일 또는 채소를 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  76. 제64항에 있어서, 상기 자일란 활성은 미생물 세포 또는 식물 세포중 자알린의 가수분해를 촉진하는 것을 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  77. 제64항에 있어서, 상기 자일라나제 활성은 열안정성인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  78. 제77항에 있어서 상기 폴리펩티드는 약 1℃∼약 5℃, 약 5℃∼약 15℃, 약 15℃∼약 25℃, 약 25℃∼약 37℃, 약 37℃∼약 95℃, 약 55℃∼약 85℃, 약 70℃∼약 95℃, 약 70℃∼약 75℃ 또는 약 90℃∼약 95℃의 온도를 포함하는 조건 하에서 자일라나제 활성을 보유하는 것인 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드.
  79. 제64항에 있어서, 상기 자일라나제 활성은 내열성인 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드.
  80. 제79항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 약 1℃∼약 5℃, 약 5℃∼약 15℃, 약 15℃∼약 25℃, 약 25℃∼약 37℃, 약 37℃∼약 95℃, 약 55℃∼약 85℃, 약 70℃∼약 75℃ 또는 약 90℃∼약 95℃ 범위의 온도에 노출 후 자일라나제 활성을 보유하는 것인 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드.
  81. 제60항의 폴리펩티드를 포함하고, 신호 서열 또는 프리프로 서열이 결여된 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드.
  82. 제60항의 폴리펩티드를 포함하고, 이종 신호 서열 또는 이종 프리프로 서열을 보유하는 것인 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드.
  83. 제64항에 있어서, 상기 자일라나제 활성은 약 37℃에서 단백질 1 mg당 약 100∼약 1000 유닛, 단백질 1 mg당 약 500∼약 750 유닛, 단백질 1 mg당 약 500∼약 1200 유닛 또는 단백질 1 mg당 약 750∼약 1000 유닛 범위의 특이 활성을 포함하는 것인 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드.
  84. 제79항에 있어서, 상기 내열성은 고온으로 가열한 후 37℃에서 자일라나제의 특이 활성의 1/2 이상을 보유하는 것인 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드.
  85. 제79항에 있어서, 상기 내열성은 고온으로 가열한 후 37℃에서 단백질 1 mg 당 약 500∼약 1200 유닛 범위의 특이 활성을 보유하는 것인 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드.
  86. 제60항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함하는 것인 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드.
  87. 제86항에 있어서, 상기 글리코실화는 N-연결 글리코실화인 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드.
  88. 제87항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 피. 파스토리스(P. pastoris) 또는 에스. 폼브(S. pombe)에서 발현된 후 글리코실화되는 것인 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드.
  89. 제64항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 약 pH 6.5, pH 6.0, pH 5.5, pH 5.0, pH 4.5 또는 pH 4.0을 포함하는 조건 하에서 자일라나제 활성을 보유하는 것인 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드.
  90. 제64항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 약 pH 7.5, pH 8. 0, pH 8.5, pH 9, pH 9.5, pH 10 또는 pH 10.5를 포함하는 조건 하에서 자일라나제 활성을 보유하는 것인 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드.
  91. 제60항의 폴리펩티드를 포함하는 단백질 제제로서, 상기 단백질 제제는 액체, 고체 또는 젤을 포함하는 것인 단백질 제제.
  92. 제60항의 폴리펩티드 및 제2 도메인을 포함하는 이종이량체.
  93. 제92항에 있어서, 상기 제2 도메인은 폴리펩티드이고, 상기 이종이량체는 융합 단백질인 이종이량체.
  94. 제92항에 있어서, 상기 제2 도메인은 에피토프 또는 태그인 이종이량체.
  95. 제60항의 폴리펩티드를 포함하는 동종이량체.
  96. 제60항의 서열 또는 이의 하위서열을 포함하는, 고정화된 폴리펩티드.
  97. 제96항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 세포, 금속, 수지, 중합체, 세라믹, 유리, 마이크로전극, 흑연 입자, 비드, 젤, 플레이트, 어레이 또는 모세관 위에 고정화된 것인 고정화된 폴리펩티드.
  98. 제60항의 고정화된 폴리펩티드를 포함하는 어레이.
  99. 제1항 또는 제24항의 고정화된 핵산을 포함하는 어레이.
  100. 제60항의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 재조합 항체.
  101. 제100항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체인 분리된 항체 또는 재조합 항체.
  102. 제60항의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 하이브리도마.
  103. (a) 제100항의 항체를 제공하는 단계;
    (b) 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 제공하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)의 샘플과 상기 단계 (a)의 항체를, 상기 항체가 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합함으로써 자일라나제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 동정할 수 있는 조건하에서 접촉시키는 단계
    를 포함하는 자일라나제 활성을 보유하는 폴리펩티드의 분리 또는 동정 방법.
  104. 비인간 동물에게, 체액성 면역 반응을 생성함으로써 항자일라나제 항체를 제조하기에 충분한 양으로 제1항 또는 제24항의 핵산 또는 이의 하위서열을 투여하는 단계를 포함하는, 항자일라나제 항체의 제조 방법.
  105. 비인간 동물에게, 체액성 면역 반응을 생성함으로써 항자일라나제 항체를 제조하기에 충분한 양으로 제60항의 폴리펩티드 또는 이의 하위서열을 투여하는 단계를 포함하는, 항자일라나제 항체의 제조 방법.
  106. (a) 제1항 또는 제24항의 서열을 포함하고, 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산을 제공하는 단계; 및
    (b) 폴리펩티드의 발현이 가능한 조건 하에서 상기 단계 (a)의 핵산을 발현시켜 재조합 폴리펩티드를 생성하는 단계
    를 포함하는, 재조합 폴리펩티드의 제조 방법.
  107. 제106항에 있어서, 상기 단계 (a)의 핵산을 이용하여 숙주 세포를 형질전환시키고, 이어서 상기 단계 (a)의 핵산을 발현시킴으로써 형질전환된 세포 내에서 재조합 폴리펩티드를 생성하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  108. (a) 제64항의 폴리펩티드를 제공하는 단계;
    (b) 자일라나제 기질을 제공하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)의 기질과 상기 폴리펩티드를 접촉시키고, 반응 생성물 양의 증가 또는 기질 양의 감소를 검출하는 단계로서, 상기 반응 생성물 양의 증가 또는 기질 양의 감소는 자일라나제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 검출하는 것인 단계
    를 포함하는, 자일라나제 활성을 보유하는 폴리펩티드의 동정 방법.
  109. (a) 제64항의 폴리펩티드를 제공하는 단계;
    (b) 테스트 기질을 제공하는 단계;
    (c) 상기 단계 (a)의 폴리펩티드와 상기 단계 (b)의 테스트 기질을 접촉시키고 반응 생성물 양의 증가 또는 기질 양의 감소를 검출하는 단계로서, 상기 반응생성물 양의 증가 또는 기질 양의 감소는 자일라나제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 검출하는 것인 단계
    를 포함하는, 자일라나제 기질의 동정 방법.
  110. (a) 핵산의 폴리펩티드로의 번역이 가능한 조건 하에서 제1항 또는 제24항의 서열을 보유하는 핵산 또는 상기 서열을 포함하는 벡터를 발현시키는 단계;
    (b) 테스트 화합물을 제공하는 단계;
    (c) 상기 테스트 화합물과 상기 폴리펩티드를 접촉시키는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (b)의 테스트 화합물이 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 지 여부를 결정하는 단계
    를 포함하는, 테스트 화합물이 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 지 여부를 결정하는 방법.
  111. (a) 제60항의 폴리펩티드를 제공하는 단계;
    (b) 테스트 화합물을 제공하는 단계;
    (c) 상기 폴리펩티드와 상기 테스트 화합물을 접촉시키는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (b)의 테스트 화합물이 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 지 여부를 결정하는 단계
    를 포함하는, 테스트 화합물이 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 지 여부를 결정하는 방법.
  112. (a) 제64항의 폴리펩티드를 제공하는 단계;
    (b) 테스트 화합물을 제공하는 단계;
    (c) 상기 단계 (a)의 폴리펩티드와 상기 단계 (b)의 테스트 화합물을 접촉시키고 자일라나제 활성을 측정하는 단계로서, 테스트 화합물의 부재 하에서의 활성과 비교한 테스트 화합물 존재 하에서 측정된 자일라나제 활성의 변화가, 테스트 화합물이 자일라나제 활성을 조절하는 지 여부에 대한 결정을 제공하는 단계
    를 포함하는, 자일라나제 활성 조절제의 동정 방법.
  113. 제112항에 있어서, 상기 자일라나제 활성은 자일라나제 기질을 제공하고, 기질의 감소량 또는 반응 생성물의 증가량, 또는 기질의 증가량 또는 반응 생성물의 감소량을 검출함으로써 측정하는 것인 방법.
  114. 제113항에 있어서, 테스트 화합물 부재시 기질 또는 반응 생성물의 양과 비교한 테스트 화합물 존재시 기질의 감소량 또는 반응 생성물의 증가량은 자일라나제 활성의 활성제로서 테스트 화합물을 동정하는 것인 방법.
  115. 제113항에 있어서, 테스트 화합물 부재시 기질 또는 반응 생성물의 양과 비교한 테스트 화합물 존재시 기질의 증가량 또는 반응 생성물의 감소량은 자일라나제 활성의 활성제로서 테스트 화합물을 동정하는 것인 방법.
  116. 프로쎄서 및 데이타 저장 장치를 포함하는 컴퓨터 시스템으로서, 상기 데이타 저장 장치에는 폴리펩티드 서열 또는 핵산 서열이 저장되어 있고, 상기 폴리펩티드 서열은 제60항의 서열을 포함하고, 제1항 또는 제24항의 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드인 컴퓨터 시스템.
  117. 제115항에 있어서, 서열 비교 알고리즘, 및 저장된 하나 이상의 참조 서열을 보유하는 데이타 저장 장치를 더 포함하는 것인 컴퓨터 시스템.
  118. 제117항에 있어서, 상기 서열 비교 알고리즘은 다형태를 나타내는 컴퓨터 프로그램을 포함하는 것인 컴퓨터 시스템.
  119. 제117항에 있어서, 상기 서열내의 하나 이상의 특징을 확인하는 확인자를 더 포함하는 것인 컴퓨터 시스템.
  120. 저장된 폴리펩티드 서열 또는 핵산 서열을 보유하는 컴퓨터 판독가능한 매체로서, 상기 폴리펩티드 서열은 제60항의 폴리펩티드 또는 제1항 또는 제24항의 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드를 포함하는 것인 컴퓨터 판독가능한 매체.
  121. (a) 서열 내의 하나 이상의 특징을 확인하는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열을 판독하는 단계로서, 상기 서열은 폴리펩티드 서열 또는 핵산 서열을 포함하고, 상기 폴리펩티드 서열은 제60항의 폴리펩티드 또는 제1항 또는 제24항의 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드를 포함하는 것인 단계; 및
    (b) 상기 컴퓨터 프로그램을 이용하여 상기 서열 내의 하나 이상의 특징을 확인하는 단계
    를 포함하는, 서열내의 특징을 확인하는 방법.
  122. (a) 서열을 비교하는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 제1 서열 및 제2 서열을 판독하는 단계로서, 상기 제1 서열은 폴리펩티드 서열 또는 핵산 서열을 포함하고, 상기 폴리펩티드 서열은 제60항의 폴리펩티드 또는 제1항 또는 제24항의 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드를 포함하는 것인 단계; 및
    (b) 상기 컴퓨터 프로그램을 이용하여 상기 제1 서열 및 제2 서열 사이의 차이를 결정하는 단계
    를 포함하는, 제1 서열과 제2 서열의 비교 방법.
  123. 제122항에 있어서, 상기 제1 서열과 제2 서열 사이의 차이를 결정하는 단계는 다형태를 확인하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  124. 제123항에 있어서, 서열내의 하나 이상의 특징을 확인하는 확인자를 더 포함하는 것인 방법.
  125. 제124항에 있어서, 컴퓨터 프로그램을 이용하여 상기 제1 서열을 판독하는 단계 및 상기 서열내의 하나 이상의 특징을 확인하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  126. (a) 제31항 또는 제33항의 증폭 프라이머 서열 쌍을 제공하는 단계;
    (b) 환경 샘플로부터 핵산을 분리하거나 환경 샘플을 처리하여 샘플내의 핵산이 하이브리드화를 위해 상기 증폭 프라이머 쌍에 접근가능하도록 하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)의 핵산과 상기 단계 (a)의 증폭 프라이머 쌍을 조합하고, 환경 샘플로부터 핵산을 증폭함으로써 환경 샘플로부터 자일라나제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 분리 또는 회수하는 단계
    를 포함하는, 환경 샘플로부터 자일라나제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 분리 또는 회수 방법.
  127. 상기 증폭 프라이머 서열 쌍의 각각의 요소가 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117, 서열 번호 119, 서열 번호 121, 서열 번호 123, 서열 번호 125, 서열 번호 127, 서열 번호 129, 서열 번호 131, 서열 번호 133, 서열 번호 135, 서열 번호 137, 서열 번호 139, 서열 번호 141, 서열 번호 143, 서열 번호 145, 서열 번호 147, 서열 번호 149, 서열 번호 151, 서열 번호 153, 서열 번호 155, 서열 번호 157, 서열 번호 159, 서열 번호 161, 서열 번호 163, 서열 번호 165, 서열 번호 167, 서열 번호 169, 서열 번호 171, 서열 번호 173, 서열 번호 175, 서열 번호 177, 서열 번호 179, 서열 번호 181, 서열 번호 183, 서열 번호 185, 서열 번호 187, 서열 번호 189, 서열 번호 191, 서열 번호 193, 서열 번호 195, 서열 번호 197, 서열 번호 199, 서열 번호 201, 서열 번호 203, 서열 번호 205, 서열 번호 207, 서열 번호 209, 서열 번호 211, 서열 번호 213, 서열 번호 215, 서열 번호 217, 서열 번호 219, 서열 번호 221, 서열 번호 223, 서열 번호 225, 서열 번호 227, 서열 번호 229, 서열 번호 231, 서열 번호 233, 서열 번호 235, 서열 번호 237, 서열 번호 239, 서열 번호 241, 서열 번호 243, 서열 번호 245, 서열 번호 247, 서열 번호 249, 서열 번호 251, 서열 번호 253, 서열 번호 255, 서열 번호 257, 서열 번호 259, 서열 번호 261, 서열 번호 263, 서열 번호 265, 서열 번호 267, 서열 번호 269, 서열 번호 271, 서열 번호273, 서열 번호 275, 서열 번호 277, 서열 번호 279, 서열 번호 281, 서열 번호 283, 서열 번호 285, 서열 번호 287, 서열 번호 289, 서열 번호 291, 서열 번호 293, 서열 번호 295, 서열 번호 297, 서열 번호 299, 서열 번호 301, 서열 번호 303, 서열 번호 305, 서열 번호 307, 서열 번호 309, 서열 번호 311, 서열 번호 313, 서열 번호 315, 서열 번호 317, 서열 번호 319, 서열 번호 321, 서열 번호 323, 서열 번호 325, 서열 번호 327, 서열 번호 329, 서열 번호 331, 서열 번호 333, 서열 번호 335, 서열 번호 337, 서열 번호 339, 서열 번호 341, 서열 번호 343, 서열 번호 345, 서열 번호 347, 서열 번호 349, 서열 번호 351, 서열 번호 353, 서열 번호 355, 서열 번호 357, 서열 번호 359, 서열 번호 361, 서열 번호 363, 서열 번호 365, 서열 번호 367, 서열 번호 369, 서열 번호 371, 서열 번호 373, 서열 번호 375, 서열 번호 377 또는 서열 번호 379의 서열 또는 이의 하위서열의 약 10∼50개 이상의 연속 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  128. (a) 제1항 또는 제24항의 서열 또는 이의 하위서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 제공하는 단계;
    (b) 환경 샘플로부터 핵산을 분리하거나 환경 샘플을 처리하여 상기 샘플내의 핵산이 하이브리드화를 위해 상기 단계 (a)의 폴리뉴클레오티드 프로브에 접근가능하도록 하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)의 분리된 핵산 또는 처리된 환경 샘플과 상기 단계 (a)의폴리뉴클레오티드 프로브를 조합하는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (a)의 폴리뉴클레오티드 프로브와 특이적으로 하이브리드화하는 핵산을 분리하여 환경 샘플로부터 자일라나제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 분리 또는 회수하는 단계
    를 포함하는, 환경 샘플로부터 자일라나제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 분리 또는 회수 방법.
  129. 제127항 또는 제128항에 있어서, 상기 환경 샘플은 물 샘플, 액체 샘플, 토양 샘플, 공기 샘플 또는 생물학적 샘플을 포함하는 것인 방법.
  130. 제129항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 박테리아 세포, 원생동물 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 식물 세포, 진균 세포 또는 포유류 세포로부터 유래한 것인 방법.
  131. (a) 제1항 또는 제24항의 서열을 포함하는 주형 핵산을 제공하는 단계; 및
    (b) 상기 주형 서열내의 하나 이상의 뉴클레오티드를 변형, 결실 또는 첨가하거나, 또는 상기 변형, 결실 또는 첨가를 조합하여 주형 핵산의 변이체를 생성하는 단계
    를 포함하는, 자일라나제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 변이체의 생성 방법.
  132. 제131항에 있어서, 상기 변이체 핵산을 발현시켜 변이체 자일라나제 폴리펩티드를 생성하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  133. 제131항에 있어서, 상기 변형, 첨가 또는 결실은 에러-프론 PCR, 셔플링, 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발법, 어셈블리 PCR, 성별 PCR 돌연변이유발법, 생체내 돌연변이유발법, 카세트 돌연변이유발법, 반복 앙상블 돌연변이유발법, 지수 앙상블 돌연변이유발법, 부위 특이성 돌연변이유발법, 유전자 재어셈블리, 유전자 위치 포화 돌연변이유발법(GSSM(상표명)), 합성 연결 재어셈블리(SLR) 및 이의 조합을 포함하는 방법에 의해 도입하는 것인 방법.
  134. 제131항에 있어서, 상기 변형, 첨가 또는 결실은 재조합, 반복 서열 재조합, 포스포티오에이트-변형된 DNA 돌연변이유발법, 우리실-함유 주형 돌연변이유발법, 갭핑된 이중체 돌연변이유발법, 점 부정합 수복 돌연변이유발법, 수복-결여 숙주 균주 돌연변이유발법, 화학적 돌연변이유발법, 방사원성 돌연변이유발법, 결실 돌연변이유발법, 제한-선택 돌연변이유발법, 제한-정제 돌연변이유발법, 인공 유전자 합성, 앙상블 돌연변이유발법, 키메라 핵산 다량체 생성 및 이의 조합을 포함하는 방법에 의해 도입하는 것인 방법.
  135. 제131항에 있어서, 상기 방법은 주형 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드의 활성이나 안정성과는 변경된 또는 상이한 활성 또는 변경된 또는 상이한 안정성을 보유하는 자일라나제가 생성될 때까지 되풀이하여 반복하는 것인 방법.
  136. 제135항에 있어서, 상기 변이체 자일라나제 폴리펩티드는 내열성이고, 고온에서 노출후 일부 활성을 보유하는 것인 방법.
  137. 제135항에 있어서, 상기 변이체 자일라나제 폴리펩티드는 주형 핵산에 의해 암호화된 자일라나제와 비교시 증가된 글리코실화를 보유하는 것인 방법.
  138. 제135항에 있어서, 상기 변이체 자일라나제 폴리펩티드는 고온 하에서 자일라나제 활성을 보유하며, 상기 주형 핵산에 의해 암호화된 자일라나제는 고온 하에서 불활성인 것인 방법.
  139. 제131항에 있어서, 상기 방법은 주형 핵산의 코돈 사용 용법과는 변경된 코돈 사용 용법을 보유하는 자일라나제 암호 서열이 생성될 때까지 되풀이하여 반복하는 것인 방법.
  140. 제131항에 있어서, 상기 방법은 주형 핵산 보다 더 높거나 또는 더 낮은 수준의 메세지 발현 수준 또는 안정성을 보유하는 자일라나제 유전자가 생성될 때까지 되풀이하여 반복하는 것인 방법.
  141. (a) 제1항 내지 제24항의 서열을 포함하는 자일라나제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 제공하는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)의 핵산에서 바람직하지 않은 코돈 또는 덜 바람직한 코돈을 확인하고, 이를 대체된 코돈과 동일한 아미노산을 암호화하는 바람직한 코돈 또는 통상적으로 사용되는 코돈으로 대체함으로써 핵산을 숙주 세포 내에서 그의 발현을 증가시키도록 변형시키는 단계로서, 이때 바람직한 코돈은 숙주 세포의 유전자 내의 암호 서열에서 과도하게 나타나는 코돈이며, 바람직하지 않은 코돈 또는 덜 바람직한 코돈은 숙주 세포 내의 유전자 내의 암호 서열에서 과소하게 나타나는 코돈인 단계
    를 포함하는, 숙주 세포 내에서 자일라나제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 발현을 증가시키기 위한 상기 핵산내 코돈의 변형 방법.
  142. (a) 제1항 또는 제24항의 서열을 포함하는 자일라나제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 제공하는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)의 핵산내의 코돈을 확인하고, 이를 대체된 코돈과 동일한 아미노산을 암호화하는 상이한 코돈으로 대체함으로써 자일라나제를 암호화하는 핵산내의 코돈을 변형시키는 단계
    를 포함하는, 자일라나제 폴리펩티드를 암호화하는 핵산내의 코돈 변형 방법.
  143. (a) 제1항 또는 제24항의 서열을 포함하는 자일라나제 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 제공하는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)의 핵산에서 바람직하지 않은 코돈 또는 덜 바람직한 코돈을 확인하고, 이를 대체된 코돈과 동일한 아미노산을 암호화하는 바람직한 코돈 또는 통상적으로 사용되는 코돈으로 대체함으로써 핵산을 숙주 세포 내에서 그의 발현을 증가시키도록 변형시키는 단계로서, 이때 바람직한 코돈은 숙주 세포의 유전자 내의 암호 서열에서 과도하게 나타나는 코돈이며, 바람직하지 않은 코돈 또는 덜 바람직한 코돈은 숙주 세포 내의 유전자 내의 암호 서열에서 과소하게 나타나는 코돈인 단계
    를 포함하는, 숙주 세포 내에서 자일라나제 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 발현을 증가시키기 위한 상기 핵산내 코돈의 변형 방법.
  144. (a) 제1항 또는 제24항의 서열을 포함하는 자일라나제 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 제공하는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)의 핵산에서 하나 이상의 바람직한 코돈을 확인하고, 이를 대체된 코돈과 동일한 아미노산을 암호화하는 바람직하지 않은 코돈 또는 덜 바람직한 코돈으로 대체함으로써 핵산을 숙주 세포 내에서 그의 발현을 증가시키도록 변형시키는 단계로서, 이때 바람직한 코돈은 숙주 세포의 유전자 내의 암호 서열에서 과도하게 나타나는 코돈이며, 바람직하지 않은 코돈 또는 덜 바람직한 코돈은숙주 세포 내의 유전자 내의 암호 서열에서 과소하게 나타나는 코돈인 단계
    를 포함하는, 숙주 세포 내에서 자일라나제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 발현을 감소시키기 위한 상기 핵산내 코돈의 변형 방법.
  145. 제144항에 있어서, 상기 숙주 세포는 박테리아 세포, 진균 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 식물 세포 또는 포유류 세포인 방법.
  146. (a) 제1 활성 부위 또는 제1 기질 결합 부위를 암호화하는 제1 핵산을 제공하는 단계로서, 상기 제1 핵산 서열은 엄격한 조건 하에서 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117, 서열 번호 119, 서열 번호 121, 서열 번호123, 서열 번호 125, 서열 번호 127, 서열 번호 129, 서열 번호 131, 서열 번호 133, 서열 번호 135, 서열 번호 137, 서열 번호 139, 서열 번호 141, 서열 번호 143, 서열 번호 145, 서열 번호 147, 서열 번호 149, 서열 번호 151, 서열 번호 153, 서열 번호 155, 서열 번호 157, 서열 번호 159, 서열 번호 161, 서열 번호 163, 서열 번호 165, 서열 번호 167, 서열 번호 169, 서열 번호 171, 서열 번호 173, 서열 번호 175, 서열 번호 177, 서열 번호 179, 서열 번호 181, 서열 번호 183, 서열 번호 185, 서열 번호 187, 서열 번호 189, 서열 번호 191, 서열 번호 193, 서열 번호 195, 서열 번호 197, 서열 번호 199, 서열 번호 201, 서열 번호 203, 서열 번호 205, 서열 번호 207, 서열 번호 209, 서열 번호 211, 서열 번호 213, 서열 번호 215, 서열 번호 217, 서열 번호 219, 서열 번호 221, 서열 번호 223, 서열 번호 225, 서열 번호 227, 서열 번호 229, 서열 번호 231, 서열 번호 233, 서열 번호 235, 서열 번호 237, 서열 번호 239, 서열 번호 241, 서열 번호 243, 서열 번호 245, 서열 번호 247, 서열 번호 249, 서열 번호 251, 서열 번호 253, 서열 번호 255, 서열 번호 257, 서열 번호 259, 서열 번호 261, 서열 번호 263, 서열 번호 265, 서열 번호 267, 서열 번호 269, 서열 번호 271, 서열 번호 273, 서열 번호 275, 서열 번호 277, 서열 번호 279, 서열 번호 281, 서열 번호 283, 서열 번호 285, 서열 번호 287, 서열 번호 289, 서열 번호 291, 서열 번호 293, 서열 번호 295, 서열 번호 297, 서열 번호 299, 서열 번호 301, 서열 번호 303, 서열 번호 305, 서열 번호 307, 서열 번호 309, 서열 번호 311, 서열 번호 313, 서열 번호 315, 서열 번호 317, 서열 번호 319, 서열 번호 321, 서열 번호323, 서열 번호 325, 서열 번호 327, 서열 번호 329, 서열 번호 331, 서열 번호 333, 서열 번호 335, 서열 번호 337, 서열 번호 339, 서열 번호 341, 서열 번호 343, 서열 번호 345, 서열 번호 347, 서열 번호 349, 서열 번호 351, 서열 번호 353, 서열 번호 355, 서열 번호 357, 서열 번호 359, 서열 번호 361, 서열 번호 363, 서열 번호 365, 서열 번호 367, 서열 번호 369, 서열 번호 371, 서열 번호 373, 서열 번호 375, 서열 번호 377 또는 서열 번호 379의 서열 또는 이의 하위서열에 하이브리드화하는 서열을 포함하고, 상기 핵산 서열은 자일라나제 활성 부위 또는 자일라나제 기질 결합 부위를 암호화하는 것인 단계;
    (b) 제1 핵산 내의 다수의 표적화된 코돈에서 자연 발생하는 아미노산 변이체를 암호화하는 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 세트를 제공하는 단계; 및
    (c) 돌연변이유발된 각각의 아미노산 코돈에서 일정 범위의 아미노산 변이를 활성 부위 암호화하거나 또는 기질 결합 부위 암호화하는 변이체 핵산 세트를 생성하는 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 세트를 이용하여 다수의 변형된 자일라나제 활성 부위 또는 기질 결합 부위를 암호화하는 핵산 라이브러리를 생성하는 단계
    를 포함하는, 다수의 변형된 자일라나제 활성 부위 또는 기질 결합 부위를 암호화하는 핵산 라이브러리의 생성 방법으로서, 상기 변형된 활성 부위 또는 기질 결합 부위는 제1 활성 부위 또는 제1 기질 결합 부위를 암호화하는 서열을 포함하는 제1 핵산으로부터 유래하는 것인 방법.
  147. 제145항에 있어서, 최적화된 유도 진화 시스템, 유전자 부위-포화 돌연변이유발법(GSSM; 상표명) 또는 합성 연결 재어셈블리(SLR)를 포함하는 방법에 의해 상기 단계 (a)의 제1 핵산을 돌연변이유발시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  148. 제145항에 있어서, 에러-프론 PCR, 셔플링, 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발법, 어셈블리 PCR, 성별 PCR 돌연변이유발법, 생체내 돌연변이유발법, 카세트 돌연변이유발법, 반복 앙상블 돌연변이유발법, 지수 앙상블 돌연변이유발법, 부위 특이성 돌연변이유발법, 유전자 재어셈블리, 유전자 위치 포화 돌연변이유발법(GSSM(상표명)), 합성 연결 재어셈블리(SLR) 및 이의 조합을 포함하는 방법에 의해 상기 단계 (a)의 제1 핵산 또는 변이체를 돌연변이유발시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  149. 제145항에 있어서, 재조합, 반복 서열 재조합, 포스포티오에이트-변형된 DNA 돌연변이유발법, 우리실-함유 주형 돌연변이유발법, 갭핑된 이중체 돌연변이유발법, 점 부정합 수복 돌연변이유발법, 수복-결여 숙주 균주 돌연변이유발법, 화학적 돌연변이유발법, 방사원성 돌연변이유발법, 결실 돌연변이유발법, 제한-선택 돌연변이유발법, 제한-정제 돌연변이유발법, 인공 유전자 합성, 앙상블 돌연변이유발법, 키메라 핵산 다량체 생성 및 이의 조합을 포함하는 방법에 의해 상기 단계 (a)의 제1 핵산 또는 변이체를 돌연변이유발시키는 것인 방법.
  150. (a) 소분자를 합성 또는 변형시킬 수 있는 다수의 생합성 효소를 제공하는단계로서, 상기 효소중 하나는 제1항 또는 제24항의 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화된 자일라나제 효소를 포함하는 것인 단계;
    (b) 상기 단계 (a)의 효소중 하나 이상을 위한 기질을 제공하는 단계; 및
    (c) 일련의 생촉매 반응에 의해 소분자를 생성하기 위해 다수의 생촉매 반응을 용이하게 하는 조건 하에서 상기 효소와 상기 단계 (b)의 기질을 반응시키는 단계
    를 포함하는, 소분자의 제조 방법.
  151. (a) 제64항의 폴리펩티드 또는 제1항 또는 제24항의 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드를 포함하는 자일라나제 효소를 제공하는 단계;
    (b) 소분자를 제공하는 단계; 및
    (c) 자일라나제 효소에 의해 촉진되는 효소 반응을 용이하게 하는 조건 하에서 상기 단계 (a)의 효소와 상기 단계 (b)의 소분자를 접촉시켜 자일라나제 효소 반응에 의해 소분자를 변형시키는 단계
    를 포함하는, 소분자의 변형 방법.
  152. 제151항에 있어서, 상기 단계 (a)의 효소를 위한 다수의 소분자 기질을 포함하여 자일라나제 효소에 의해 촉진된 하나 이상의 효소 반응에 의해 생성된 변형된 소분자 라이브러리를 생성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  153. 제151항에 있어서, 상기 효소에 의한 다수의 생촉매 반응을 용이하게 하는 조건 하에서 다수의 추가 효소를 포함하여 다수의 효소 반응에 의해 생성된 변형된 소분자 라이브러리를 형성하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  154. 제153항에 있어서, 상기 라이브러리를 테스트하여 소정 활성을 나타내는 특정 변형된 소분자가 상기 라이브러리 내에 존재하는 지 여부를 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  155. 제154항에 있어서, 상기 라이브러리를 테스트하는 단계는 소정 활성을 보유하는 특정 변형된 소분자의 존재 또는 부재에 대해 변형된 소분자의 일부분을 테스트하고 소정 활성의 특정 변형된 소분자를 생성하는 하나 이상의 특이적인 생촉매 반응을 확인함으로써 상기 라이브러리내 다수의 변형된 소분자의 일부분을 생성하기 위해 사용된 생촉매 반응중 하나를 제외한 모두를 전체적으로 제거하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  156. (a) 제64항의 폴리펩티드 또는 제1항 또는 제24항의 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드를 포함하는 자일라나제 효소를 제공하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)의 서열로부터 다수의 아미노산 잔기를 결실시켜 자일라나제 효소의 기능적 단편을 결정하는 단계
    를 포함하는, 자일라나제 효소의 기능적 단편의 결정 방법.
  157. 제156항에 있어서, 상기 자일라나제 활성은 자일라나제 기질을 제공하고 기질의 감소량 또는 반응 생성물의 증가량을 검출함으로써 측정하는 것인 방법.
  158. (a) 세포의 유전 조성물을 변형하여 변형된 세포를 제조하는 단계로서, 상기 유전 조성물은 제1항 또는 제24항의 서열을 포함하는 핵산을 세포에 첨가함으로써 변경되는 것인 단계;
    (b) 상기 변형된 세포를 배양하여 다수의 변형된 세포를 생성하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b) 세포 배양을 실시간으로 모니터링함으로써 상기 세포의 하나 이상의 대사 매개변수를 측정하는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (c)의 데이타를 분석하여 측정된 매개변수가 유사한 조건 하에서 변형되지 않은 세포의 필적하는 측정치와 상이한지 여부를 결정함으로써, 실시간 대사 플럭스 분석을 이용하여 세포 내에서 조작된 표현형을 확인하는 단계
    를 포함하는, 실시간 대사 플럭스 분석을 이용하는 신규 또는 변형된 표현형의 전체 세포 조작 방법.
  159. 제158항에 있어서, 상기 세포의 유전 조성물은 세포내 서열의 결실 또는 서열의 변형 또는 유전자 발현의 녹아웃을 포함하는 방법에 의해 변경되는 것인 방법.
  160. 제158항에 있어서, 새롭게 조작된 표현형을 포함하는 세포를 선택하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  161. 제160항에 있어서, 선택된 세포를 배양함으로써 새롭게 조작된 표현형을 포함하는 신규한 세포 균주를 생성하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  162. 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 48, 서열 번호 50, 서열 번호 52, 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 58, 서열 번호 60, 서열 번호 62, 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108, 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116, 서열 번호 118, 서열 번호 120, 서열 번호 122, 서열 번호 124, 서열 번호 126, 서열 번호 128, 서열 번호 130, 서열 번호 132, 서열 번호 134, 서열 번호 136, 서열 번호 138, 서열 번호 140, 서열 번호 142, 서열 번호 144, 서열 번호 146, 서열 번호 148, 서열 번호150, 서열 번호 152, 서열 번호 154, 서열 번호 156, 서열 번호 158, 서열 번호 160, 서열 번호 162, 서열 번호 164, 서열 번호 166, 서열 번호 168, 서열 번호 170, 서열 번호 172, 서열 번호 174, 서열 번호 176, 서열 번호 178, 서열 번호 180, 서열 번호 182, 서열 번호 184, 서열 번호 186, 서열 번호 188, 서열 번호 190, 서열 번호 192, 서열 번호 194, 서열 번호 196, 서열 번호 198, 서열 번호 200, 서열 번호 202, 서열 번호 204, 서열 번호 206, 서열 번호 208, 서열 번호 210, 서열 번호 212, 서열 번호 214, 서열 번호 216, 서열 번호 218, 서열 번호 220, 서열 번호 222, 서열 번호 224, 서열 번호 226, 서열 번호 228, 서열 번호 230, 서열 번호 232, 서열 번호 234, 서열 번호 236, 서열 번호 238, 서열 번호 240, 서열 번호 242, 서열 번호 244, 서열 번호 246, 서열 번호 248, 서열 번호 250, 서열 번호 252, 서열 번호 254, 서열 번호 256, 서열 번호 258, 서열 번호 260, 서열 번호 262, 서열 번호 264, 서열 번호 266, 서열 번호 268, 서열 번호 270, 서열 번호 272, 서열 번호 274, 서열 번호 276, 서열 번호 278, 서열 번호 280, 서열 번호 282, 서열 번호 284, 서열 번호 286, 서열 번호 288, 서열 번호 290, 서열 번호 292, 서열 번호 294, 서열 번호 296, 서열 번호 298, 서열 번호 300, 서열 번호 302, 서열 번호 304, 서열 번호 306, 서열 번호 308, 서열 번호 310, 서열 번호 312, 서열 번호 314, 서열 번호 316, 서열 번호 318, 서열 번호 320, 서열 번호 322, 서열 번호 324, 서열 번호 326, 서열 번호 328, 서열 번호 330, 서열 번호 332, 서열 번호 334, 서열 번호 336, 서열 번호 338, 서열 번호 340, 서열 번호 342, 서열 번호 344, 서열 번호 346, 서열 번호 348, 서열 번호350, 서열 번호 352, 서열 번호 354, 서열 번호 356, 서열 번호 358, 서열 번호 360, 서열 번호 362, 서열 번호 364, 서열 번호 366, 서열 번호 368, 서열 번호 370, 서열 번호 372, 서열 번호 374, 서열 번호 376, 서열 번호 378 또는 서열 번호 380의 잔기 1∼14, 1∼15, 1∼16, 1∼17, 1∼18, 1∼19, 1∼20, 1∼21, 1∼22, 1∼23, 1∼24, 1∼25, 1∼26, 1∼27, 1∼28, 1∼29, 1∼30, 1∼31, 1∼32, 1∼33, 1∼34, 1∼35, 1∼36, 1∼37, 1∼38, 1∼40, 1∼41, 1∼42, 1∼43 또는 1∼44의 서열로 구성되거나, 또는 표 4의 서열로 구성된 분리된 신호 서열 또는 재조합 신호 서열.
  163. 적어도 제162항의 서열을 보유하는 신호 펩티드(SP)를 포함하는 제1 도메인, 및 적어도 이종 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함하는 제2 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩티드로서, 상기 이종 폴리펩티드 또는 펩티드는 신호 펩티드(SP)와 자연 결합하지 않는 것인 키메라 폴리펩티드.
  164. 제163항에 있어서, 상기 이종 폴리펩티드 또는 펩티드는 자일라나제가 아닌 것인 키메라 폴리펩티드.
  165. 제163항에 있어서, 상기 이종 폴리펩티드 또는 펩티드는 상기 신호 펩티드(SP) 또는 자일라나제 촉매 도메인(CD)의 아미노 단부, 카르복시 단부 또는 이들 양 단부인 키메라 폴리펩티드.
  166. 키메라 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 또는 재조합 핵산으로서, 상기 키메라 폴리펩티드는 적어도 제162항의 서열을 보유하는 신호 펩티드(SP)를 포함하는 제1 도메인 및 적어도 이종 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함하는 제2 도메인을 포함하고, 상기 이종 폴리펩티드 또는 펩티드는 상기 신호 펩티드(SP)와 자연적으로 결합되지 않는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  167. 자일라나제 폴리펩티드의 내열성 또는 열안정성의 증가 방법으로서, 상기 방법은 자일라나제를 글리코실화시켜 자일라나제의 내열성 또는 열안정성을 증가시키는 단계를 포함하고, 이때 상기 폴리펩티드는 제60항의 폴리펩티드 또는 제1항 또는 제24항의 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드의 30개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 것인 방법.
  168. 제1항 또는 제24항의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 발현시키는 단계를 포함하는, 세포 내에서 재조합 자일라나제를 과다발현시키는 방법으로서, 상기 과다발현은 고활성 프로모터, 2시스트론성 벡터를 이용하거나 또는 상기 벡터의 유전자 증폭에 의해 수행하는 것인 방법.
  169. (a) 이종 핵산 서열을 세포 내로 도입시켜 형질전환된 식물 세포를 형성하는 단계로서, 상기 이종 핵산 서열은 제1항 또는 제24항의 서열을 포함하는 것인 단계; 및
    (b) 상기 형질전환된 세포로부터 트랜스게닉 식물을 생성하는 단계
    를 포함하는, 트랜스게닉 식물의 제조 방법.
  170. 제169항에 있어서, 상기 단계 (a)는 식물 세포 원형질체의 전기적천공법 또는 미세주입법에 의해 이종 핵산 서열을 도입하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  171. 제169항에 있어서, 상기 단계 (a)는 DNA 입자 투하 또는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 숙주를 이용하여 식물 조직에 직접적으로 이종 핵산 서열을 도입하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  172. (a) 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종 핵산 서열로 식물 세포를 형질전환하는 단계로서, 상기 이종 핵산 서열은 제1항 또는 제24항의 서열을 포함하는 것인 단계;
    (b) 상기 이종 핵산 서열이 식물 세포 내에서 발현하는 조건 하에서 식물을 성장시키는 단계
    를 포함하는, 식물 세포 내에서 이종 핵산 서열의 발현 방법.
  173. (a) 제64항의 자일라나제 활성을 보유하는 폴리펩티드 또는 제1항 또는 제24항의 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드를 제공하는 단계;
    (b) 자일란을 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 및
    (c) 자일라나제가 자일란을 함유하는 조성물을 가수분해, 분해 또는 붕괴시키는 조건 하에서 상기 단계 (a)의 폴리펩티드와 상기 단계 (b)의 조성물을 접촉시키는 단계
    를 포함하는, 자일란을 함유하는 조성물의 가수분해, 분해 또는 붕괴 방법.
  174. 제173항에 있어서, 상기 조성물은 식물 세포, 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 동물 세포를 포함하는 것인 방법.
  175. 제64항의 폴리펩티드를 포함하는 반죽 또는 빵류 제품.
  176. 반죽을 컨디셔닝하기에 충분한 조건 하에서 제64항의 하나 이상의 폴리펩티드와 반죽 또는 빵류 제품을 접촉시키는 단계를 포함하는, 반죽 컨디셔닝 방법.
  177. 제64항의 폴리펩티드를 포함하는 음료.
  178. 음료의 점도를 감소시키기에 충분한 조건 하에서 음료 또는 음료 전구체에 제64항의 하나 이상의 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는, 음료 제조 방법.
  179. 제178항에 있어서, 상기 음료 또는 음료 전구체는 맥아즙 또는 맥주인 방법.
  180. 제64항의 폴리펩티드를 포함하는, 식품, 사료 또는 영양보조식품.
  181. 제64항의 폴리펩티드의 30개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 자일라나제 효소를 함유하는 영양보조식품을 제조하는 단계; 및
    동물에게 상기 영양보조식품을 투여하여 동물에 의해 소화된 사료 또는 식품내에 함유된 자일란의 이용을 증가시키는 단계
    를 포함하는, 동물 사료내 영양보조식품으로서 자일라나제의 이용 방법.
  182. 제181항에 있어서, 상기 동물은 인간인 방법.
  183. 제181항에 있어서, 상기 동물은 인간인 방법.
  184. 제181항에 있어서, 상기 동물은 반추동물 또는 단위동물인 방법
  185. 제181항에 있어서, 상기 자일라나제 효소는 박테리아, 효모, 식물, 곤충, 진균 및 동물로 구성되는 군으로부터 선택되는 유기체 내에서 자일라나제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 제조하는 것인 방법.
  186. 제185항에 있어서, 상기 유기체는 에스. 폼브(S. pombe), 에스. 세레비재(S.cerevisiae), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 슈도모나스종(Pseudomonassp.) , 이. 콜라이(E. coli), 스트렙토마이세스종(Streptomycessp.), 바실러스종(Bacillussp.) 및 락토바실러스종(Lactobacillussp.)으로 구성되는 군으로부터 선택하는 것인 방법.
  187. 열안정성 재조합 자일라나제 효소를 포함하는 식용 효소 전달 매트릭스.
  188. 제187항에 있어서, 제64항의 폴리펩티드를 포함하는 식용 효소 전달 매트릭스.
  189. 과립성 식용 담체와 열가소성 재조합 자일라나제 효소를 포함하는 펠릿 형태의 식용 효소 전달 매트릭스를 제조하는 단계로서, 상기 펠릿은 그 내부에 함유된 자일라나제 효소를 수성 매체 내에 용이하게 분산시키는 것인 단계; 및
    상기 식용 효소 전달 매트릭스를 동물에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 동물에게 자일라나제 보조식품을 전달하는 방법.
  190. 제189항에 있어서, 상기 재조합 자일라나제 효소는 제64항의 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
  191. 제189항에 있어서, 상기 과립성 식용 담체는 곡물 배아(grain germ), 오일을제거한 곡물 배아, 건초, 알팔파, 티모시, 콩껍질, 해바라기씨 밀 및 밀 미드(wheat midd)로 구성되는 군으로부터 선택한 담체를 포함하는 것인 방법.
  192. 제189항에 있어서, 상기 식용 담체는 오일을 제거한 곡물 배아를 포함하는 것인 방법
  193. 제189항에 있어서, 상기 자일라나제 효소는 펠릿화 조건에서 열안정성을 제공하기 위해 글리코실화하는 것인 방법.
  194. 제189항에 있어서, 상기 전달 매트릭스는 곡물 배아 및 자일라나제를 포함하는 혼합물의 펠릿화에 의해 형성하는 것인 방법.
  195. 제189항에 있어서, 상기 펠릿화 조건은 스팀 적용을 포함하는 것인 방법.
  196. 제189항에 있어서, 상기 펠릿화 조건은 약 80℃ 이상의 온도를 약 5분 동안 적용하는 과정을 포함하고, 상기 효소는 효소 1 mg 당 350 유닛 이상 내지 약 900 유닛의 특이 활성을 보유하는 것인 방법.
  197. 자일라나제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 서열 및 신호 서열을 포함하는 분리된 핵산 또는 재조합 핵산으로서, 상기 핵산은 제1항의 서열을 포함하는 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  198. 제197항에 있어서, 상기 신호 서열은 다른 자일라나제 또는 비자일라나제 효소로부터 유래한 것인 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  199. 자일라나제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 핵산 또는 재조합 핵산으로서, 상기 서열은 신호 서열 및 제1항의 서열을 포함하는 핵산을 함유하지 않는 것인 분리된 핵산 분자 또는 재조합 핵산 분자.
  200. 하기 돌연변이중 하나 이상을 함유하는 서열 번호 189의 서열을 포함하는 분리된 핵산 또는 재조합 핵산: 위치 22∼24의 뉴클레오티드는 TTC, 위치 31∼33의 뉴클레오티드는 CAC, 위치 34∼36의 뉴클레오티드는 TTG, 위치 49∼51의 뉴클레오티드는 ATA, 위치 31∼33의 뉴클레오티드는 CAT, 위치 67∼69의 뉴클레오티드는 ACG, 위치 178∼180의 뉴클레오티드는 CAC, 위치 190∼192의 뉴클레오티드는 TGT, 위치 190∼192의 뉴클레오티드는 GTA, 위치 190∼192의 뉴클레오티드는 GTT, 위치 193∼195의 뉴클레오티드는 GTG, 위치 202∼204의 뉴클레오티드는 GCT, 위치 235∼237의 뉴클레오티드는 CCA, 또는 위치 235∼237의 뉴클레오티드는 CCC.
  201. 제200항의 서열을 포함하는 핵산 서열의 제조 방법으로서, 서열 번호 189중의 돌연변이는 유전자 부위 포화 돌연변이유발법(GSSM; 상표명)에 의해 얻는 것인방법.
  202. 하기 돌연변이중 하나 이상을 함유하는 서열 번호 190을 포함하는 아미노산을 포함하는 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드: 아미노산 위치 8의 아스파르트산은 페닐알라닌, 아미노산 위치 11의 글루타민은 히스티딘, 아미노산 위치 12의 아스파라긴은 루신, 아미노산 위치 17의 글리신은 이소루신, 아미노산 위치 23의 트레오닌은 야생형 코돈 이외의 코돈에 의해 암호화된 트레오닌, 아미노산 위치 60의 글리신은 히스티딘, 아미노산 위치 64의 프롤린은 시스테인, 아미노산 위치 64의 프롤린은 발린, 아미노산 위치 65의 세린은 발린, 아미노산 위치 68의 글리신은 이소루신, 아미노산 위치 68의 글리신은 알라닌, 또는 아미노산 위치 79의 발린은 프롤린.
  203. 목재 또는 목제품과 제64항의 폴리펩티드를 접촉시키는 단계를 포함하는, 목재 또는 목제품중 리그닌 감소 방법.
  204. 제64항의 폴리펩티드를 포함하는 세정 조성물.
  205. 제64항의 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물.
  206. 제64항의 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는, 자일란을 포함하는 미생물을 동물로부터 제거하거나 동물을 보호하는 방법.
  207. 제206항에 있어서, 상기 미생물은 박테리아인 방법.
  208. 제205항에 있어서, 상기 박테리아는 살모넬라인 방법.
  209. 하기 서열 변이중 하나 이상 또는 모두를 포함하는 서열 번호 189의 서열을 포함하는 분리된 핵산 또는 재조합 핵산: 위치 22∼24의 뉴클레오티드는 TTC, 위치 22∼24의 뉴클레오티드는 TTT, 위치 31∼33의 뉴클레오티드는 CAC, 위치 31∼33의 뉴클레오티드는 CAT, 위치 34∼36의 뉴클레오티드는 TTG, 위치 34∼36의 뉴클레오티드는 TTA, 위치 34∼36의 뉴클레오티드는 CTC, 위치 34∼36의 뉴클레오티드는 CTT, 위치 34∼36의 뉴클레오티드는 CTA, 위치 34∼36의 뉴클레오티드는 CTG, 위치 49∼51의 뉴클레오티드는 ATA, 위치 49∼51의 뉴클레오티드는 ATT, 위치 49∼51의 뉴클레오티드는 ATC, 위치 178∼180의 뉴클레오티드는 CAC, 위치 178∼180의 뉴클레오티드는 CAT, 위치 190∼192의 뉴클레오티드는 TGT, 위치 190∼192의 뉴클레오티드는 TGC, 위치 190∼192의 뉴클레오티드는 GTA, 위치 190∼192의 뉴클레오티드는 GTT, 위치 190∼192의 뉴클레오티드는 GTC, 위치 190∼192의 뉴클레오티드는 GTG, 위치 193∼195의 뉴클레오티드는 GTG, 위치 193∼195의 뉴클레오티드는 GTC, 위치 193∼195의 뉴클레오티드는 GTA, 위치 193∼195의 뉴클레오티드는 GTT, 위치 202∼204의 뉴클레오티드는 ATA, 위치 202∼204의 뉴클레오티드는 ATT, 위치 202∼204의 뉴클레오티드는 ATC, 위치 202∼204의 뉴클레오티드는 GCT, 위치 202∼204의 뉴클레오티드는 GCG, 위치 202∼204의 뉴클레오티드는 GCC, 위치 202∼204의 뉴클레오티드는 GCA, 위치 235∼237의 뉴클레오티드는 CCA, 위치 235∼237의 뉴클레오티드는 CCC, 또는 위치 235∼237의 뉴클레오티드는 CCG.
  210. 하기 서열 변이중 하나 이상 또는 모두를 포함하는 서열 번호 190의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드: 아미노산 위치 8의 아스파르트산은 페닐알라닌, 아미노산 위치 11의 글루타민은 히스티딘, 아미노산 위치 12의 아스파라긴은 루신, 아미노산 위치 17의 글리신은 이소루신, 아미노산 위치 23의 트레오닌은 야생형 코돈 이외의 코돈에 의해 암호화된 트레오닌, 아미노산 위치 60의 글리신은 히스티딘, 아미노산 위치 64의 프롤린은 시스테인, 아미노산 위치 64의 프롤린은 발린, 아미노산 위치 65의 세린은 발린, 아미노산 위치 68의 글리신은 이소루신, 아미노산 위치 68의 글리신은 알라닌, 또는 아미노산 위치 79의 세린은 프롤린임.
  211. 표 1 또는 표 2에 기재된 서열 변이중 하나 이상 또는 모두를 포함하는 서열 번호 189의 서열을 포함하는 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  212. 제211항의 핵산에 의해 암호화된 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드.
  213. 하기 서열 변이중 하나 이상 또는 모두를 포함하는 서열 번호 379의 서열을 포함하는 분리된 핵산 또는 재조합 핵산: 위치 22∼24의 뉴클레오티드는 TTC, 위치 31∼33의 뉴클레오티드는 CAC, 위치 49∼51의 뉴클레오티드는 ATA, 위치 178∼180의 뉴클레오티드는 CAC, 위치 193∼195의 뉴클레오티드는 GTG, 위치 202∼204의 뉴클레오티드는 GCT임.
  214. D8F, Q11H, G17I, G60H, S65V 및/또는 G68A 서열 변이중 하나 이상 또는 모두를 포함하는 서열 번호 380의 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드.
  215. 제210항 또는 제214항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 열안정성 자일라나제 활성을 보유하는 것인 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드.
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