WO2013024909A1 - 내열성，광범위 ｐＨ，고활성 자일라나아제를 생산하는 신규 페니바실러스 ｓｐ．ＨＰＬ-３ 균주，이로부터 분리한 신규 자일라나아제 효소 및 이의 형질전환체를 이용한 이의 대량 생산 방법 - Google Patents

내열성，광범위 ｐＨ，고활성 자일라나아제를 생산하는 신규 페니바실러스 ｓｐ．ＨＰＬ-３ 균주，이로부터 분리한 신규 자일라나아제 효소 및 이의 형질전환체를 이용한 이의 대량 생산 방법 Download PDF

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WO2013024909A1
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xylanase
strain
seq
amino acid
acid sequence
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황인택
박노중
임희경
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한국화학연구원
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    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)

Definitions

  • the present invention relates to a novel genus of Penibacillus strain producing new xylanase, a novel xylanase enzyme isolated from the same, and a method for mass production thereof using a transformant thereof, and more specifically, the new xylanase enzyme Its high xylan degradation activity at high temperatures or a wide range of pH makes it useful in the biochemical industry, producing feedstocks, paper and detergent industries as well as biofuels and petroleum substitutes, special functional substances or biopolymers. have. Background Art
  • hydrolysis of xylan is mainly done by chemical method, which is converted into the form of decomposition products xylose and xyloligosaccharides by adding sulfuric acid to fiber-based biomass and steam-pressurizing at 130 ° C. Since various impurities are generated additionally, it requires purification technology thereof. In addition, a large amount of energy is consumed, and an expensive device capable of withstanding acid and high temperature is required, and the production cost is increased due to the disposal cost of waste generated at this time.
  • xylanase the main component of hemicellulose
  • the decomposition method of xylan by biological method using the enzyme that decomposes and xylates xylan into xylose is generally referred to as xylanase enzyme), which consumes less energy and generates less waste than chemical decomposition.
  • xylanase enzyme the decomposition method of xylan by biological method using the enzyme that decomposes and xylates xylan into xylose
  • Xylanase is not only required in the biorefinery (biochemical industry) process, but is also used for various purposes such as bleaching process of paper, improving feed efficiency, cleaning of fruit drinks, high quality of baking or using agricultural by-products. Can be. To date, it has been produced by a variety of microorganisms, especially in the paper industry, alkali or heat resistant xylanase has been isolated from various bacteria for use in the bleaching process (Tenkanen, M. et. Al., Enzyme.Microb. Techno 1, 14, 566-574, 1992), a number of xylanase producing bacteria without eel lulase activity have been reported to reduce the loss of eel lulose for papermaking.
  • the bacteria that produce xylanase include the genus Aeromonas G4e TO / 2as), genus Bacillus, genus, Genus Streptomyces (5 re / 7 a »yces), Aspergillus (? Genus, etc.), the characteristics of xylanase produced by bacteria vary, and the genes encoding these enzymes have been reported variously. have.
  • xylanase enzyme The domestic and foreign technical status of xylanase enzyme is the Trichoder sp. C-4 strains were selected but higher activity is required for industrialization (Sul et al., Appl Microbiol Biotechnol. 66 (1): 63-70, 2004). Dr. Kang Myung-kyu's team at Donghae University produces Cephalosporium sp. RYM-202 strains have been selected and studied for their use in the peel process (Kang, Myung-Kyu et al., Korean Journal of Environmental Biology, 17 (2): 191-198, 1999).
  • Bacillus finmis7 a basic strain, has been identified from wastewater generated after the pulp process (Pochih Chang, Biochemical and Biophysical Research Communications 319: 1017—1025, 2004).
  • This xylanase has a high activity in a wide range from ⁇ ) ⁇ 4 to pH 11, and has a high heat resistance to show a residual activity of about 70% of the initial activity even after 16 hours incubation at 62 ° C.
  • various strains have been discovered in many countries around the world, and their functions have been improved through directional evolution.
  • the patent for xylanase as a feed additive includes a patent for a novel Streptomyces genus WL-2 strain that produces xylanase (Korean Patent Publication No. 2001-0111986), a signal sequence of Bacillus subtilis endo xylanase.
  • Recombinant plasmid containing the gene and foreign protein using the same Patent for manufacturing method (Korean Patent Laid-Open No. 2000-0034279), genus Bacillus m- ⁇ Bacillus sp. AMX-4) patents on the novel xylanase gene encoding xylanase of the strain (Korean Patent Publication No. 2003-0085679) and the like.
  • the saccharification process of salulose using cellulase should be developed as well as the saccharification process of hemicellulose using xylanase.
  • the enzymatic glycosylation process using xylanase distinguishes the required enzyme characteristics according to the biomass pretreatment method.For biomass pretreatment using acid, acid-resistant glycosylation is required, but the present-day biomass using a paper and paper process or alkali Alkali-resistant glycosylase is required in the saccharification process after mass pretreatment. In addition, heat resistance may be required for the simultaneous process of saccharification and fermentation.
  • the inventors of the present invention in order to be able to expand domestically as well as to develop domestically in order to avoid or break down the intellectual property rights that all existing xylanases and strains producing them are oligopolized by developed countries.
  • the new Penibacillus sp. NPL-3 strain (Paenibacilhis sp. HPL-3) and the xylanases produced therefrom have been reported to have been reported in comparison with other xylanases.
  • Unit mM product / mg protein / min), heat resistance, the best in all of the optimum pH range was confirmed by the solid culture measurement method and / or liquid culture enzyme activity measurement method was completed.
  • Another object of the present invention to provide a strain for producing the xylanase.
  • Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding xylanase.
  • Another object of the present invention to provide a recombinant expression vector operably linked to the polynucleotide.
  • Another object of the present invention is to provide a transformant in which the recombinant expression vector is introduced into a host cell.
  • another object of the present invention is to provide a xylanase production method comprising the step of obtaining a crude enzyme solution by culturing the strain or the transformant in the medium and centrifugation.
  • Another object of the present invention is to provide a xylan degrading agent comprising the xylanase, the strain or the transformant.
  • Another object of the present invention to provide a composition for processing xylan in food containing the xylanase.
  • Another object of the present invention is a feed additive comprising the xylanase To provide.
  • Another object of the present invention to provide a composition for papermaking process comprising the xylanase.
  • another object of the present invention is to provide a xylan decomposition method comprising the step of adding the xylanase, the strain or the transformant to a fibrin-based biomass or xylan-containing solution.
  • another object of the present invention is to provide a feed manufacturing method comprising the step of adding the xylanase, the strain or the transformant to the feed material of the animal.
  • Another object of the present invention is to provide the xylanase, strain or transformant for use as a xylan digester.
  • Another object of the present invention is to provide the xylanase for use as a composition for xylan processing in food.
  • Another object of the present invention is to provide the xylanase for use as a feed additive.
  • Another object of the present invention is to provide the xylanase for use as a composition for papermaking process.
  • the present invention provides a xylanase having the following characteristics (a) to W):
  • the present invention also provides a strain for producing the xylanase.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding xylanase.
  • the present invention also provides a recombinant expression vector operably linked to the polynucleotide.
  • the present invention also provides a transformant in which the recombinant expression vector is introduced into a host cell.
  • the present invention provides a method for producing xylanase comprising culturing the strain or the transformant in a medium and then obtaining a crude enzyme solution by centrifugation.
  • the present invention also provides a xylan degrading agent comprising the xylanase, the strain or the transformant.
  • the present invention provides a composition for processing xylan in food comprising the xylanase.
  • the present invention also provides a feed additive comprising the xylanase.
  • the present invention also provides a composition for a papermaking process comprising the xylanase.
  • the present invention provides a xylan decomposition method comprising the step of adding the xylanase, the strain or the transformant to a fibrin-based biomass or xylan-containing solution.
  • the present invention provides a feed production method comprising the step of adding the xylanase, the strain or the transformant to the feed material of the animal.
  • the present invention also provides the xylanase, strain or transformant for use as a xylan digester.
  • the present invention also provides the xylanase for use as a composition for xylan processing in food.
  • the present invention also provides the xylanase for use as a feed additive.
  • the present invention provides the xylanase for use as a composition for papermaking process.
  • Penivacillus (/ 3 ⁇ 4ey2 / Z c /// t / s) sp.
  • HPL-3 and xylanase isolated from it show excellent xylan degrading activity at 60 ° C heat resistance and wide pH conditions (4-11), so it is well suited for the saccharification process of fibrous biomass as well as in feed industry, paper and detergent industry.
  • Petroleum substitute raw materials, special functional substances, biopolymers It can be usefully used to produce such raw materials.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of active cloning screening from 1,248 gDNA libraries.
  • Figure 3 is a diagram showing the results of 0RF analysis and each 0RF amino acid homology analysis.
  • Figure 4 shows the activity after separation and purification of xylanase from the transformant.
  • 5 is an optimal pH graph of xylanase activity.
  • the present invention provides xylanases having the following characteristics (a) to (d):
  • amino acid sequence of the xylanase of the present invention preferably includes any one of the following sequences, but is not limited thereto:
  • amino acid sequence having at least 70%, preferably at least 80%, most preferably at least 90% homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4;
  • One of the stringent conditions is 15 minutes of cleaning at 6 ° C SSC, 0.5% SDS at room temperature, 30 minutes of cleaning at 2 ° C SSC, 0.5% SDS at 45 ° C, and 0.2 ° SSC, 0.5% SDS at 50 ° C. Repeat the 30 minute wash twice. More preferred stringent conditions are to use higher temperatures than above. The other parts of the above stringent conditions are carried out in the same manner, but the last two 30 minutes are washed with 0.2 cm SSC, 0.5% SDS at 60 ° C. Another stringent condition is to wash with 0.1 kPa SSC, 0.1% SDS at 65 ° C for the last two times under the same stringent conditions. Those skilled in the art can clearly set these conditions in order to obtain the stringent conditions required.
  • the xylanase of the present invention exhibits maximum activity at pH 5 to pH 11, preferably at pH 6 to pH 10, more preferably at pH 6 to pH 9, and at 50 ° C to 60 ° C. Preferred but not limited to this.
  • strains with excellent xylan degradability were selected from the soil containing waste wood residues.
  • the inventors prepared a gDNA library to isolate a gene encoding an enzyme protein having xylanase activity from the strain, and then tested xylanase activity.
  • One clone was selected through the above experiment (see FIG. 2), and the nucleotide sequence of the inserted fragment DNA was analyzed.
  • the DNA fragment size was 6,956 bp (SEQ ID NO: 2), and contained 11 0RF in the range of 100 or more amino acids (see FIG. 3).
  • E. coli 0RF9 (1620 bp, 539 aa) to confirm the xylanase activity was confirmed that the xylanase activity is excellent.
  • nucleotide sequence of the target DNA fragment of the transformant 0RF of the novel xylanase gene of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 was reconfirmed.
  • a transformant overexpressing a large amount of novel xylanase of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 was produced.
  • Examination of the enzyme activity of about 65 kD of novel xylanase (see FIG. 4) produced and isolated from the transformed E. coli confirmed that it exhibited maximum activity at a temperature of 50 ° C to 60 ° C at pH 4-11. (See FIGS. 5-6).
  • 74%, 28%, 12%, 46% were inhibited by I mM of Cu + 2, Zn + 2, Fe + 2, EDTA, etc. among the elements added as a heavy metal source, but they were not affected under 100 ⁇ It was shown to slightly increase enzyme activity (see Table 1).
  • the Km value indicating the substrate affinity was 0.2 (see FIG. 7), and most of the hydrolyzate products were xyloligomers.
  • the xylanase produced from the strain identified in the present invention is a novel xylanase different from the existing xylanase.
  • the present invention also provides a strain for producing the xylanase.
  • the strain may be, but is not limited to, prokaryotic cells including Escherichia coli, or eukaryotic cells including yeast, animal cells, and stromal cells, and the strain producing xylanase is HPP genus HPL deposited with accession number KCTC11987BP. -3 (Paenibacillus sp. HPL-3) is preferred, but any strain producing the xylanase of the present invention is included in the scope of the present invention.
  • strains with excellent xylan degradability were selected from the soil containing waste wood residues.
  • the selected strains were identified as gram positive bacilli, rod-shaped cells having a cell size of 1.1 and a cell length of 2.5 j to 4, and no motility bacilli without flagella (see FIG. 1).
  • the strain has a 16S rRNA as set forth in SEQ ID NO: 1, and the homology analysis of the rRNA results, genus CSH12-5 (Paenibacillus sp. CSH12-5 (GenBank accession No.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding xylanase.
  • the polynucleotide encoding the xylanase of the present invention preferably includes any one of the following sequences, but is not limited thereto:
  • nucleotide sequence having at least 70%, preferably at least 80%, most preferably at least 90% homology with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3;
  • an amino acid of a protein functionally identical to a protein comprising one or more amino acids in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, wherein said amino acid sequence is substituted, deleted, inserted and / or added, and comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4; Base sequences encoding sequences; And ,
  • a base sequence of a protein which is a DNA base sequence which is hybridized under stringent conditions with DNA comprising the base sequence of SEQ ID NO: 3, and which is functionally identical to the protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the present invention also provides a recombinant expression vector operably linked to the polynucleotide.
  • the present invention has revealed the nucleotide sequence of a novel gene encoding xylanase isolated from the genus HPL-3 strain of Penivacillus, it is possible to produce a recombinant vector containing the gene using conventional methods known in the art.
  • the recombinant vector of the present invention may use a commercially available vector, but is not limited thereto, and those skilled in the art may prepare and use a suitable recombinant vector.
  • the present invention also provides a transformant in which the recombinant expression vector is introduced into a host cell.
  • Host cells that can be used in the present invention is not limited, E. coli, It is preferable to select and use from the group consisting of prokaryotic cells including bacteria, yeast, animal cells, and prokaryotic cells, including coliform cells, more preferably using E. coli, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a method for producing xylanase comprising culturing the strain or the transformant in a medium and then centrifuging to obtain a crude enzyme solution.
  • the production method of the present invention may further comprise the step of purifying xylanase from the obtained crude enzyme solution.
  • the medium is preferably used by selecting the genus HPL-3 strain (KCTC11987BP) of the present invention or a medium suitable for the transformant of the present invention from a commercial medium known to those skilled in the art.
  • the present inventors use a specific resin binding vector for column chromatography when preparing a transformant as a method for increasing the purification efficiency while simplifying the purification process, and in the purification process, it is preferable to separate and separate only the enzyme bound to the resin.
  • Strict conditions include glutathione binding vector, calmodulin binding vector, maltose binding vector, and the resin for column sizing depends on the vector used. In the present invention, but only the results using the glutathione binding vector and the resin is not limited thereto.
  • the present invention also provides a xylan degrading agent comprising the xylanase, the strain or the transformant.
  • the xylan degrading agent of the present invention can be used as the xylan degrading agent as well as the xylanase produced by the strain or the transformant.
  • the present invention provides a composition for processing xylan in food comprising the xylanase.
  • the present invention also provides a feed additive comprising the xylanase.
  • the present invention provides a composition for the papermaking process comprising the xylanase to provide.
  • composition or feed additive of the present invention may include the same or similar components in addition to the xylanase of the present invention, and preferably contains 1 to 90% of the xylanase of the present invention as a whole composition or feed additive. It doesn't happen.
  • Xylanase of the present invention unlike the existing xylanase shows a high activity in a wide range of conditions (pH 5-11) and heat resistance temperature range (50 ⁇ 60 ° C) (see Figures 5 to 6), It can be used for new heat resistance, wide range pH and high activity xylanase.
  • the applications currently occupying the xylanase enzyme market can be broadly classified into food, feed and technology (Bedford and Morgana, World's Poultry Science Journal 52: 61-68, 1996). In the food (fruit and vegetable production, brewing and liquor production, bakery and confectionery) market, it is used for quality improvement through softening and refining efficiency of materials, decreasing viscosity, and increasing extraction and filtering efficiency.
  • the novel xylanase of the present invention can be usefully used for paper production and waste paper regeneration, feed addition and food quality improvement or decomposition of xylanase for industrial use, which is obvious to those skilled in the art.
  • the compositions can be formulated and formulated in a manner known to those skilled in the art.
  • the present invention provides a xylan decomposition method comprising the step of adding the xylanase, the strain or the transformant to a fibrin-based biomass or xylan-containing solution.
  • the amount of the strain, the transformant or the xylanase produced by the strain or the transformant can be adjusted by those skilled in the art.
  • the present invention is the xylanase, the strain or It provides a feed manufacturing method comprising the step of adding the transformant.
  • the amount of the strain, the transformant or the xylanase produced by the strain or the transformant may be adjusted by those skilled in the art.
  • the present invention also provides the xylanase, the strain or the transformant for use as a xylan digester.
  • the xylan degrading agent of the present invention can be used as the xylan degrading agent as well as the xylanase produced by the strain or the transformant.
  • the present invention also provides the xylanase for use as a composition for xylan processing in food.
  • the present invention also provides the xylanase for use as a feed additive.
  • the present invention provides the xylanase for use as a composition for papermaking process.
  • the xylanase preferably has the following characteristics (a) to (d) but is not limited thereto:
  • amino acid sequence of the xylanase preferably includes but is not limited to any one of the following sequences:
  • amino acid sequence having at least 70%, preferably at least 80% and most preferably at least homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4;
  • the xylanase of the present invention exhibits high activity in a wide range of conditions (pH 5-11) and a heat resistant temperature range (50 to 60 ° C.) (see FIGS. 5 to 6), It can be used as a novel heat resistant, broad pH and highly active xylanase for use as a xylan processing composition, feed additive or papermaking composition in foods.
  • the strain of the present invention was isolated from the soil containing the waste wood residue after mushroom cultivation collected from the middle of Garasan located in Dadae-ri, Namdae-myeon, Geoje-si, Gyeongsangnam-do. Soil samples were collected from 2 to 5 cm layers from the surface of the soil, and the soil was selected by passing through 2 ⁇ after air drying. 30 g of selected soil is added to 270 sterile saline solution (NaCl 8.0 g / £) and shaken with shaking incubator (37 ° C, 200 rpm) for about 20 minutes and left at room temperature for 30 minutes. Was precipitated to the bottom, and then the supernatant was transferred to a sterile container as a primary diluent.
  • the present inventors cultured the strain producing the highest activity xylanase isolated in Example 1 at 30 ° C and then performed Gram staining and spore staining to generate spores.
  • Pantoae agglomerans ZFJ-15 (Pantoea agglomerans ZFJ- 15; GenBank Stock No. EU931554) had 96.4% homology and 96.3% homology with the genus Penicacillus WPCB158 (Paenibacillus sp. WPCB158; GenBank Accession No. FJ006910), but no further homology was found.
  • This strain was named as HPL-3 strain of genus Penivacillus, and was deposited with Korea Biotechnology Research Institute on July 20, 2011. The accession number is KCTC11987BP.
  • the present inventors extracted the genomic DNA in order to isolate the gene encoding the enzyme protein having xylanase activity from the genus HPL-3 strain identified in Example 1 and Example 2, the gene of less than 5 kb A gDNA library with fragments was produced.
  • DNA fragments of 1-6 kb size were made by random cleavage of DNA extracted from the strain, and the size of the DNA fragments around 5 kb was obtained by selecting the size by electrophoresis on agarose gel. It was inserted into the pCB31 plasmid vector and transformed into E. coli DH10B cells. The thus prepared 1,248 clones of the library were tested for xylanase activity in solid or liquid conditions.
  • the xylanase activity (xylan degradability) of isolated strains, active clones, transformants, and purified enzymes was measured using one or both of the following two methods.
  • the first method was a solid culture measurement method.
  • the birch xylan (Fluka Bio Chemika. Co.) was 0.5-1 in LB medium.
  • Soft agar double medium containing the inoculation was inoculated with the strain was incubated overnight, and then the strain and the active clone forming a halo around the cultured colonies were selected by the Congo red staining the next day.
  • the base sequence of the fragment DNA inserted into the clone selected in Example 3-2 was analyzed.
  • the DNA fragment inserted into the plasmid was 6,956 bp (SEQ ID NO: 2), which was then subjected to NCBI's Blast P or Blast N program (/www.ncbi.nlm.nih.gov/).
  • ORF Open Reading Frame
  • 1 ng of GM3-SLX1 plasmid template is composed of a forward primer of SEQ ID NO: 5 (5'—CTCGAGATGGATACATTGAAGTTGTATGTG-3 ') and a primer pair consisting of a reverse primer of SEQ ID NO: 6 (5'-GGATCCCTATTCGTTGCTCCCC-3').
  • PCR amplification conditions were 5 minutes denaturation at 94 ° C using PCR Premix (GenetBio), followed by 30 seconds of denaturation at 94 ° C, 30 seconds at 55 ° C. Annealing, 30 minutes of extension at 72 ° C. was repeated 30 times, followed by a 7 minute extension at 72 ° C. and maintained at 4 ° C.
  • the product amplified by PCR was purified using GENCLEAN II Kit (Q-Biogene), and recombinant DNA was generated using T4 ligase (RBC) in a pGEM-T-Easy vector.
  • the recombinant plasmid was transformed into E. coli JM109 to prepare a transgenic E. coli.
  • plasmid DNA was extracted using HiYield TM Plasmid Mini Kit (RBC) and digested with restriction enzymes I (NEB) and ⁇ ( ⁇ ). It was confirmed that the section was inserted.
  • the transformant showed xylanase activity.
  • the base sequence of the target DNA fragment of the transformant was confirmed to reconfirm 0RF of the novel xylanase gene of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • PCR was performed using primer pairs of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 using GM3-SLX1 plasmid as a template.
  • PCR reaction mixture and reaction conditions were the same as in Example 3-2.
  • the amplified product was purified, digested with 3 ⁇ 4oI (NEB) and I (NEB), and inserted into a protein overexpression vector pIVEX-GST (Roche) to produce a recombinant overexpression plasmid, which was transformed into E. co // BL2KRBC).
  • Xylanase overexpressing transgenic E. coli was prepared.
  • LB liquid medium 100 ampicillin / Addition
  • the harvested cells were suspended, ultrasonically crushed, and centrifuged at 10,000 g to separate the supernatant and precipitate, and the SDS PAGE confirmed that the target protein was overexpressed in the supernatant and had a molecular weight of about 65 M) (FIG. 4).
  • Example 3-4 The activity of xylanase overexpressed and isolated from the novel xylanase overexpressing transformed Escherichia coli prepared in Example 3-4 was investigated by the method of Example 3-2 for each pH, temperature and metal ion.
  • the pH adjustment of the semi-aqueous solution is pH 4-5 with citric acid complete solution, pH 6-8 with Phosphate complete solution, pH 7-9 with Tris / HCl complete solution, and glycine Sodium hydroxide (Glycine / NaOH) buffer solution was performed at pH 9-11.
  • As the metal ion 1 mM CaCl 2 , MgC12, MgCl 2 , CuCl 2 , ZnCl 2 , FeCl 3, etc.
  • novel xylanase showed a maximum activity at 50 ° C to 60 ° C at pH 4 ⁇ 11, as shown in FIG.
  • xylanase activity was inhibited to 74, 28, 12, 46% by 1 mM of heavy metal or additives such as Cu +2 , Zn +2 , Fe +2 , EDTA and the like.
  • IPTG isopropyl-D-thiogalactoside
  • IPTG isopropyl-D-thiogalactoside
  • the precipitate recovered by centrifugation of the culture solution at 10,000 rpm for 10 minutes was washed twice with PBS.
  • the washed precipitate was resuspended in PBS again, and the cells were crushed by using an ultrasonic crusher (Cosmo Bio Co., LTD), followed by centrifugation (12,000 rpm, 10 minutes) to recover the supernatant.
  • a glutathione-transferase column (GST binding resin column, Novagen) was used to purely separate the xylanase in the recovered supernatant.
  • Xylase pure separation attaches the prepared supernatant to a glutathione-transferase column (GST binding resin column, Novagen) equilibrated with a buffered buffer solution (50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl; pH 7.0). After treatment, factor Xa protease (NEB) was treated, and pure water was separated using a washed buffer solution (50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl; pH 7.0). The xylanase enzyme activity was measured from each sample recovered in the purification step, and the purification of the enzyme activity fraction was confirmed by SDS-PAGE. Protein content was measured using the Bradford method (Bradford, Sigma Aldrich), BSA (bovine serum albumin) was used as a standard protein.
  • xylanase activity was not changed even with xylanase state bound to the resin, it can be seen that it can be applied to a high efficiency conversion process through the enzyme immobilization method.
  • the enzyme purified by this method showed more than 5 times more activity than the enzyme before purification. Enzyme activity was 97.37, 124.19, 122.21, 124.61, 122.95, 103.27, and 96.08 units at pH5.0, pH6.0, pH7.0, pH8.0, pH9.0, pH 10.0, and pH 11.0 at 50 ° C, respectively.
  • the affinity value for the xylan substrate was 0.2, and most of the hydrolysis products were xylose and xyloligomer.
  • Xylanase activity against xylans (beech, oats, etc.) other than birch xylan was similar.
  • the novel xylanase of the present invention decomposes xylan, which is the main component of various cellulose biomass, with high activity over a wide range of ⁇ and heat resistance temperature ranges, and thus, xylan decomposers and plant solubles.
  • xylan decomposers and plant solubles Not only can be usefully used in the manufacture and development of feed additives or papermaking process composition, but also biochemistry through the development of biofuels, alternative raw materials, special functional substances and biopolymers by enzymatic saccharification process of biomass. Can contribute to the industry as a whole.
  • Microorganisms identified as I shall be deposited with the International Depositary. A request was made to convert the original deposit for the microorganism into a deposit under the Budapest Treaty.

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Abstract

본 발명은 신규 페니바실러스 속 균주, 이로부터 분리한 신규 단백질에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 자일라나아제를 생산하는 신규 페니바실러스 속 균주, 이로부터 분리한 고온 및 광범위 pH에서 고활성을 가지는 신규 자일라나아제 및 이의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 페니바실러스 속 HPL-3(Paenibacillus sp. HPL-3, KCTC11987BP) 균주 및 자일라나아제는 고온 또는 광범위 pH에서 높은 활성으로 다양한 섬유소 바이오매스의 주성분인 자일란을 분해함으로써 바이오 연료 및 대체원료, 특수기능물질, 바이오 폴리머, 식품 및 사료 등의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
내열성， 광범위 p H, 고활성 자일라나아제를 생산하는 신규 페니바실러스 s p. HP L-3 균주， 이로부터 분리한 신규 자일라나아제 효소 및 이의 형질전환체를 이용한 이의 대량 생산 방법
【기술분야】
본 발명은 신규 자일라나아제를 생산하는 신규 페니바실러스 속 균주， 이로부터 분리한 신규 자일라나아제 효소 및 이의 형질전환체를 이용한 이의 대량 생산 방법에 관한 것으로서， 더욱 구체적으로 상기 신규 자일라나아제 효소는 고온 또는 광범위 pH에서 높은 자일란 분해 활성을 나타내므로， 사료 산업， 제지 및 세제 산업 뿐만 아니라 바이오 연료 및 석유 대체원료， 특수기능물질 또는 바이오 폴리머의 원료를 생산하는 바이오 화학 산업 분야에 유용하게 이용될 수 있다. 【배경기술】
이산화탄소 방출저감 등 국제 환경규제에 대응하기 위하여 21세기를 살아가는 인류는 화석연료 대체자원 개발이라는 숙제를 안고 있으며， 지구온난화 및 석유자원 고갈에 대비하여 태양에너지， 풍력과 수력， 원자력， 바이오매스 등을 주요 대상으로 연구하고 있다. 이들 중에서 목질계 섬유소 바이오매스 원료를 당화하여 바이오연료와 화학원료를 생산하는 바이오리파이너리 공정에서는 목질계 원료 속에 포함되어 있는 15-30%의 자일란이 부산물로 생성되는 것을 피할 수 없으며， 현재까지 직접적인 이용이 불가능하기 때문에 대부분이 폐자원으로 처리되고 있는 실정이다.
현재까지 자일란의 가수분해는 화학적 방법으로 주로 이루어지고 있는데 섬유소계 바이오매스에 황산을 첨가하고 130°C에서 스팀 가압하여 분해하는 방법으로 분해 산물인 자일로스와 자일로올리고당의 형태로 전환되지만 과반응에 의한 여러 가지 불순물들이 부가적으로 생성되기 때문에 이의 정제기술을 필요로 한다. 또한 많은 양의 에너지를 소모할 뿐만 아니라 산 및 고온에 견딜 수 있는 고가의 장치가 필요하고， 또한 이때 발생하는 폐기물의 처리비용 등으로 인하여 생산단가가 높아지게 된다. 이에 반하여 자일라나아제 (헤미셀를로오스의 주성분인 자일란을 자일로스로 분해하여 당화하는 효소를 일반적으로 자일라나아제 효소로 통칭하고 있음)를 이용하는 생물학적 방법에 의한 자일란의 분해방법은 화학적 분해방법과 비교할 때 에너지의 소모가 적고 발생하는 폐기물 역시 소량일 뿐만 아니라， 그 처리가 용이하기 때문에 경제적으로도 매우 유리하다.
이와 같이 자일라나아제 (Xylanase)는 바이오리파이너리 (바이오화학산업 ) 공정에서 절실하게 요구될 뿐만 아니라 제지의 표백공정， 사료효율 개선， 과일음료의 청정화， 제빵의 고품질화 또는 농산 부산물 이용 등 다양한 용도로 활용될 수 있다. 지금까지 여러 가지 미생물에 의해 생산되었는데， 특히 제지산업에서는 표백공정에 웅용하기 위한 내알칼리성 또는 내열성 자일라나아제 (xylanase)가 여러 세균으로부터 분리되었고 (Tenkanen, M. et. al . , Enzyme. Microb. Techno 1 , 14, 566-574, 1992) , 셀를라제 (eel lulase)의 활성이 없는 자일라나아제 (xylanase) 생산균도 다수 보고되어 제지용 셀를라제 (eel lulose)의 손실을 줄이고자 하는 연구결과가 보고되어 있다 (Khashin, A. et. al . , Appl. Environ. Microbiol , 59, 1725-1730, 1993； Kosugi , A. et. al . , J. Bacteriol, 183, 7037-7043 , 2001) . 또한， 자일라나아제 (xylanase)를 처리하여 빵의 품질을 개선하거나 (Court in, C. M. et. al., J. Agric. Food. Chem, 47， 1870-1877， 1999) , β-자일로시다제 (β-xylosidase) 및 자일라나아제 (xylanase)의 유전자가 도입된 효모로서 농임산 부산물을 미생물이 이용할 수 있도록 당화시키는 연구가 보고되었다 (La Grange, D. C. et. al. , Ap l. Environ. Microbiol， 67， 5512-5519, 2001). 현재 사료산업에서는 자일라나아제 (xylanase)가 사료첨가용 효소로 시판되어 사용되고 있는데， 상기 효소는 곡물 사료 섭취시 헤미셀를로즈 (hemicel lulose)로 인한 가축의 장내의 점질도를 낮추어주는 기능을 함으로써 가축의 소화기 질병을 예방하고 사료효율을 향상시키는 것으로 알려져 있다 (McCracken, K. J. et. al., Br. Poult. Sci, 42， 638-642, 2001).
지금까지 보고된 자일라나아제 생산 미생물 중 트리코더마 (r cAoGterra) 속 곰광이 균주들이 주로 이용되었는데， 이들의 효소 생산성은 자일라나아제를 생산하는 세균에 비해 대체로 우세하지만 주로 산성조건에서 최대 활성을 나타낸다 (Tenkanen et al . , Enzyme and Microbial Technology 14(7) :566-574, 1992) . 자일라나아제를 생산하는 세균으로는 애로모나스 G4e TO/2as) 속， 바실러스 속，
Figure imgf000004_0001
속， 스트렙토마이세스 (5 re/7 a»yces) 속， 아스퍼질루스 ( ？ 속 등이 있으며, 세균에 따라 생산하는 자일라나아제의 특성도 다양하며， 이들 효소를 암호화하는 유전자들도 다양하게 보고되어있다.
자일라나아제 효소에 대한 국내외 기술현황으로는 경희대 정대균 박사 팀에서 섬유소 분해효소를 생산하는 Trichoder sp. C-4 균주를 선별하였지만 산업화를 위해서는 더 높은 활성이 요구되고 있다 (Sul et al., Appl Microbiol Biotechnol. 66(1) :63-70, 2004) . 동해대 강명규 박사 팀에서 내알카리성 자일라나아제를 생산하는 Cephalosporium sp. RYM-202 균주를 선별하여 필프공정에 이용가능성을 연구하고 있다 (강명규 외， 한국환경생물학회지 17(2) :191-198， 1999) . KAIST의 김정회 교수 팀에서는 Bacillus 유래의 효소 (Endoxylanase)를 세포외부로 생산하는 재조합 균주인 ^c///issi/b /7/sDB104/pJHKJ4를 구축하였다 (Kim JH e a/.， J. Microbiol. Biotechnol. , 10(4) :551-553, 2000) . 국외의 경우 대만에서는 혐기성 곰광이 Neocallimastix patriciarum으—로추^ 유전자 복제된 자일라나아제가 방향적 효소진화 방법을 통하여 내염기성이 증가한 사례가 있으며 (Yew-Loom Chen et al., Can. J. Microbiol. 47(12)： 10881094, 2001) 최근에는 펄프공정 후 발생하는 폐수로부터 내염기성 균주인 Bacillus finmis7\ 분리 동정되었다 (Pochih Chang, Biochemical and Biophysical Research Communications 319:1017—1025， 2004) . 이 자일라나아제는 ί)Η 4부터 pH 11까지의 넓은 범위에서 높은 활성이 있으며， 62°C에서 16시간을 배양하여도 초기 활성의 70% 정도의 잔여활성을 보일 정도로 높은 내열성이 있다. 이와 같이 세계 여러 나라에서 다양한 균주를 발굴하고 방향진화적인 진화를 통하여 기능을 향상시키고 있다.
기존의 자일라나아제와 관련된 특허를 살펴보면 자일라나아제를 생산하는 균주를 동정한 후 이들 야생균주를 이용하거나 대장균 등을 이용한 재조합 균주를 만들어 자일라나아제를 생산하는 방법을 이용하고 있다 (국제공개특허 제 93/08275호， 국제공개특허 제 92/01793호， 국제공개특허 제 92/17573호， 대한민국 공개특허 제 10-0072225호， 대한민국 공개특허 제 10-02211204호， 대한민국 공개특허 제 10-04117기호). 또한 사료첨가제로서의 자일라나아제 관련 특허로는 자일라나아제를 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 속 WL-2 균주에 대한 특허 (대한민국 공개특허 제 2001-0111986호)， 고초균 유래 엔도 자일라나아제의 신호서열 유전자를 포함한 재조합 플라스미드 및 그를 이용한 외래단백질의 제조방법에 관한 특허 (대한민국 공개특허 제 2000-0034279호)， 바실러스 속 m- {Bacillus sp. AMX-4) 균주의 자일라나아제 (xylanase)를 코드화하는 신규한 자일라나아제 유전자에 관한 특허 (대한민국 공개특허 제 2003-0085679호) 등이 있다.
현재 알려진 국내의 자일라나아제 관련 특허로는 자일라나아제를 생산하는 신규한 스트랩토마이세스 속 WL-2 균주에 대한 특허 (대한민국 공개특허 2001-0111986), 고초균 유래 엔도자일라나아제의 신호서열 유전자를 포함한 재조합 플라스미드 및 그를 이용한 외래단백질의 제조방법에 관한 특허 (대한민국 공개특허 2000-0034279), 바실러스속 AMX-40 c///i/s sp. AMX-4) 균주의 자일라나아제 (xylanase)를 코드하는 신규한 자일라나아제 유전자 (대한민국 공개특허 2003-0085679) 및 신규한 패니바실러스 sp. HY-8 균주의 자일라나아제 (대한민국 공개특허 2007-0082329) 등이 있으나 명확한 효소활성에 대한 언급이 없거나 실제로 국내에서 여러 분야에 사용되지 못하고 있다. 그러나 앞으로 바이오매스 기반의 각종 부가가치 화합물 특히 고분자화합물 (플라스틱 등)의 중합 및 생산기술이 개발되고 있기 때문에 새로운 특성을 가지는 자일라나아제의 개발이 어느 때보다 시급하게 요구되고 있다.
바이오매스의 효율적인 활용을 위해서는 셀를라아제를 이용한 샐를로오스의 당화공정 개발은 물론 자일라나아제를 이용한 헤미셀를로오스의 당화공정 개발이 동시에 이루어져야 할 것이다. 자일라나아제를 이용하는 효소적 당화공정은 바이오매스의 전처리 방법에 따라 요구되는 효소의 특성이 구분되는데， 산을 이용한 바이오매스 전처리의 경우 내산성 당화효소가 요구되지만 현행 필프 및 제지공정이나 알칼리를 이용한 바이오매스 전처리 후 당화공정에서는 내알칼리성 당화효소가 요구된다. 또한 당화 및 발효 동시공정을 위해서는 내열성이 요구되기도 한다. 그러나 상품화된 자일라나아제는 산성 조건에 알맞은 것들이 대부분이기 때문에 알칼리 조건에서 활성을 가지는 자일라나아제의 개발이 요구되고 있다. 더욱 좋기로는 산성 및 알칼리조건 모두에서 활성이 높은 자일라나아제의 개발이 요구되고 있다. 따라서 산업에 직접적인 이용을 위해서는 기존의 자일라나아제가 아닌 신규의 미생물 및 효소 시스템을 탐색하여 높은 온도 및 ρΗ 조건하에서도 활성도를 유지하는 자일라나아제 유전자의 확보가 필요하며， 이를 통하여 기존의 특허 등으로 인해 발생하는 문제를 해결할 수 있을 것이다. 이에， 본 발명자들은 기존의 자일라나아제 및 이를 생산하는 균주들이 모두 선진 개발국들에 의해서 과점 되고 있는 지적재산권을 회피 또는 타파하기 위하여 국내에서 자체개발함은 물론 세계적으로 영역을 확대할 수 있게 하기 위하여， 신규한 자일라나아제를 개발하던 중， 신규 페니바실러스 속 nPL-3(Paenibacilhis sp. HPL-3) 균주 및 이로부터 생산된 자일라나아제가 다른 자일라나아제와 비교하여 지금까지 보고된 활성단위 (Unit = mM product /mg protein/min), 내열성， 최적 pH의 범위 모두에서 가장 우수한 것을 고체배양 측정방법 및 /또는 액체배양 효소활성 측정방법으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 고온 및 광범위 pH에서 높은 활성을 가지는 자일라나아제를 제공하는 것이다.
또한， 본 발명의 다른 목적은 상기 자일라나아제를 생산하는 균주를 제공하는 것이다.
또한， 본 발명의 다른 목적은 자일라나아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
또한， 본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 재조합 발현백터를 제공하는 것이다.
또한， 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 발현백터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공하는 것이다.
또한， 본 발명의 다른 목적은 배지에 균주 또는 상기 형질전환체를 배양한 후 원심분리하여 조효소액을 수득하는 단계를 포함하는 자일라나아제 생산 방법을 제공하는 것이다.
또한， 본 발명의 다른 목적은 상기 자일라나아제, 상기 균주 또는 상기 형질전환체를 포함하는 자일란 분해제를 제공하는 것이다.
또한， 본 발명의 다른 목적은 상기 자일라나아제를 포함하는 식품내 자일란 가공용 조성물을 제공하는 것이다.
또한， 본 발명의 다른 목적은 상기 자일라나아제를 포함하는 사료첨가제를 제공하는 것이다.
또한， 본 발명의 다른 목적은 상기 자일라나아제를 포함하는 제지공정용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 섬유소계 바이오매스 또는 자일란 함유액에 상기 자일라나아제， 상기 균주 또는 상기 형질전환체를 가하는 단계를 포함하는 자일란 분해 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 동물의 사료 재료에 상기 자일라나아제， 상기 균주 또는 상기 형질전환체를 가하는 단계를 포함하는 사료 제조 방법을 제공하는 것이다.
또한， 본 발명의 다른 목적은 자일란 분해제로 사용하기 위한 상기 자일라나아제， 균주 또는 형질전환체를 제공하는 것이다.
또한， 본 발명의 다른 목적은 식품내 자일란 가공용 조성물로 사용하기 위한 상기 자일라나아제를 제공하는 것이다.
또한， 본 발명의 다른 목적은 사료첨가제로 사용하기 위한 상기 자일라나아제를 제공하는 것이다.
아울러， 본 발명의 다른 목적은 제지공정용 조성물로 사용하기 위한 상기 자일라나아제를 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 (a) 내지 W)의 특징을 가지는 자일라나아제를 제공한다:
(a) SDS-PAGE상에서 분자량은 약 65 kDa;
(b) pH 5내지 pH 11에서 최대 활성 ;
(c) 50 내지 60°C에서 최대 활성; 및，
(d) 50 °C， pH 5내지 pH 11의 조건에서 95 unit/minmg, 60 °C， pH 6내지 pH 9의 조건에서 100 unit/minmg 이상 자일로스 생산.
또한， 본 발명은 상기 자일라나아제를 생산하는 균주를 제공한다.
또한， 본 발명은 자일라나아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또한， 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 재조합 발현백터를 제공한다. 또한， 본 발명은 상기 재조합 발현백터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공한다.
또한， 본 발명은 배지에 균주 또는 상기 형질전환체를 배양한 후 원심분리하여 조효소액을 수득하는 단계를 포함하는 자일라나아제 생산 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 자일라나아제， 상기 균주 또는 상기 형질전환체를 포함하는 자일란 분해제를 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 자일라나아제를 포함하는 식품내 자일란 가공용 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 자일라나아제를 포함하는 사료첨가제를 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 자일라나아제를 포함하는 제지공정용 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 섬유소계 바이오매스 또는 자일란 함유액에 상기 자일라나아제， 상기 균주 또는 상기 형질전환체를 가하는 단계를 포함하는 자일란 분해 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 동물의 사료 재료에 상기 자일라나아제， 상기 균주 또는 상기 형질전환체를 가하는 단계를 포함하는 사료 제조 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 자일란 분해제로 사용하기 위한 상기 자일라나아제， 균주 또는 형질전환체를 제공한다.
또한， 본 발명은 식품내 자일란 가공용 조성물로 사용하기 위한 상기 자일라나아제를 제공한다.
또한, 본 발명은 사료첨가제로 사용하기 위한 상기 자일라나아제를 제공한다. 아을러， 본 발명은 제지공정용 조성물로 사용하기 위한 상기 자일라나아제를 제공한다.
【유리한 효과】
본 발명의 신규 균주인 페니바실러스 (/¾ey2/Z c///t/s) sp. HPL-3 및 이로부터 분리한 자일라나아제는 60°C 내열성 및 넓은 pH 조건 (4-11)에서 우수한 자일란 분해활성을 나타내므로 사료 산업， 제지 및 세제 산업에서는 물론 섬유질계 바이오매스의 당화공정에 활용되어 석유 대체원료， 특수기능물질， 바이오 폴리머 등의 원료를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 선발균주의 전자현미경 사진이다.
도 2는 1，248개 gDNA라이브러리로부터 활성클론 선별 결과를 나타낸 도이다. 도 3은 0RF분석 및 각 0RF 아미노산 상동성 분석 결과를 나타낸 도이다. 도 4는 형질전환체로부터 자일라나아제를 분리정제 후 활성을 나타낸 도이다.
도 5는 자일라나아제 활성의 최적 pH그래프이다.
도 6은 자일라나아제 활성의 최적 온도 그래프이다.
도 7은 자일라나아제 분리정제 후 효소특성 (kinetics)이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하， 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 하기 (a) 내지 (d)의 특징을 가지는 자일라나아제를 제공한다:
(a) SDS-PAGE상에서 분자량은 약 65 kDa;
(b) pH 5내지 pH 11에서 최대 활성 ;
(c) 50 내지 60°C에서 최대 활성 ; 및，
(d) 50 °C, pH 5내지 pH 11의 조건에서 95 unit/minmg, 60°C， pH 6내지 pH 9의 조건에서 100 unit/minmg 이상 자일로스 생산.
본 발명의 자일라나아제의 아미노산 서열은 하기의 서열 중 어느 하나를 포함하는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다:
a) 서열번호 4로 기재되는 아미노산서열;
b)서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열과 70%이상， 바람직하게는 80%이상, 가장 바람직하게는 90% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열;
c) 서열번호 3에 기재된 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열;
d) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환， 결실, 삽입 및 /또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며， 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 아미노산 서열; e) 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 흔성화 되는 DNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열이며， 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 아미노산 서열. 상기 엄격한 조건은 흔성화 후 세정 시에 결정된다. 엄격한 조건 중의 하나는 상온에서 6 士 SSC, 0.5% SDS로 15분 세정한 뒤 45°C에서 2 士 SSC, 0.5% SDS로 30분간의 세정하고， 50°C에서 0.2 土 SSC, 0.5% SDS로 30분간의 세정을 두 번 반복한다. 더 바람직한 엄격한 조건은 상기보다 더 높은 온도를 이용하는 것이다. 상기 엄격한 조건의 다른 부분은 동일하게 수행하되 마지막의 두 번의 30분은 60°C에서 0.2 士 SSC, 0.5% SDS로 세정한다. 또 다른 엄격한 조건은 상기 엄격한 조건에서 마지막 두 번올 65°C에서 0.1 土 SSC, 0.1% SDS로 세정하는 것이다. 당업자라면 필요한 엄격한 조건을 얻기 위하여 이러한 조건을 명백히 설정할 수 있다.
본 발명의 자일라나아제는 pH 5 내지 pH 11， 바람직하게는 pH 6 내지 pH 10， 더욱 바람직하게는 pH 6 내지 pH 9에서 최대 활성을 나타내고, 50°C 내지 60°C에서 최대 활성올 나타내는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서， 경남 거제시 남부면 다대리에 위치한 가라산 증턱에서 채취한 버섯재배 후 폐목재 잔여물이 포함된 토양으로부터 자일란 분해능이 뛰어난 균주를 선별하였다.
또한， 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 상기 균주로부터 자일라나아제 활성을 가지는 효소 단백질을 암호화하는 유전자를 분리하기 위하여 gDNA 라이브러리를 제작한 후, 자일라나아제 활성을 시험하였다. 상기 실험을 통해 1개의 클론을 선별하였고 (도 2 참조)， 삽입된 절편 DNA의 염기서열을 분석하였다. 분석 결과 DNA 절편의 크기는 6,956 bp이었고 (서열번호 2)， 아미노산 100개 이상의 범위에 11개의 0RF를 포함하였다 (도 3 참조). 본 발명자들은 상기 0RF중 유전자가 암호화하는 단백질의 상동성 검색결과 엔도 -1,4-베타-자일라나아제 [endo-l,4-beta-xylanase(GenBank 접근 번호: YP_001817989)와 48% 상동성을 가지는 0RF9(1620 bp, 539 aa)를 대장균에 형질전환하여 자일라나아제 활성을 확인한 결과 자일라나아제 활성이 우수함을 확인하였다. 또한， 상기 형질전환체의 목적 DNA 절편의 염기서열을 확인하여 서열번호 3으로 기재된 염기서열의 신규 자일라나아제 유전자의 0RF를 재확인하였다.
본 발명의 구체적인 실시예에서， 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열의 신규 자일라나아제를 대량으로 생산하기 위하여 과발현하는 형질전환체를 제작하였다. 형질전환 대장균으로부터 생산， 분리정제한 약 65 kD의 신규 자일라나아제 (도 4 참조)의 효소 활성을 조사한 결과 pH 4-11에서， 온도 50°C 내지 60°C에서 최대 활성을 나타냄을 확인하였다 (도 5 내지 도 6 참조). 또한 중금속 원으로 첨가한 여러 가지 원소들 중에서 I mM의 Cu+2, Zn+2, Fe+2, EDTA등에 의해서 74%， 28%, 12%, 46% 저해되었지만 100 μΜ 이하에서는 영향을 받지 않거나 효소활성을 다소 증가시키는 것으로 나타났다 (표 1 참조). 아울러， 반웅특성 (Enzyme Kinetics)을 분석한 결과， 기질친화력을 나타내는 Km 값은 0.2이었고 (도 7 참조)， 가수분해 산물은 대부분이 자일로올리고머였다.
따라서 서열분석 및 활성분석 결과 본 발명에서 동정한 균주로부터 생산되는 자일라나아제는 기존의 자일라나아제와 다른 신규한 자일라나아제임을 확인하였다. 또한， 본 발명은 상기 자일라나아제를 생산하는 균주를 제공한다.
상기 균주는 대장균을 포함한 원핵세포 또는， 효모， 동물세포 및 곤층세포를 포함하는 진핵세포일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며， 상기 자일라나아제를 생산하는 균주는 수탁번호 KCTC11987BP로 기탁된 페니바실러스 속 HPL-3(Paenibacillus sp. HPL-3)인 것이 바람직하나， 본 발명의 자일라나아제를 생산하는 균주라면 모두 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 경남 거제시 남부면 다대리에 위치한 가라산 중턱에서 채취한 버섯재배 후 폐목재 잔여물이 포함된 토양으로부터 자일란 분해능이 뛰어난 균주를 선별하였다. 상기 선별된 균주를 동정한 결과， 그람 양성 간균이며， 1.1 의 세포크기와 2.5 j 내지 4 의 세포길이를 갖는 막대형이며， 편모를 가지지 않은 운동성 없는 간균이었다 (도 1 참조). 상기 균주는 서열번호 1로 기재되는 16S rRNA를 가지며， rRNA에 대한 상동성 분석 결과， 페니바실러스 속 CSH12-5(Paenibacillus sp. CSH12-5(GenBank 등록번호 EF694701) 균주와 95.0 )， 페니바실러스 대전엔시스 (T)[Paenibacillus dae j eonens i s (T) (GenBank 등록번호 AM141; AF391124)]와 95.7% 상동성이 있음을 확인하였으나 그 이상 일치하는 상동성은 검색되지 않았기 때문에， 본 발명의 상기 균주를 페니바실러스 속
HPL-3(Paenibacillus sp. HPL-3)으로 명명하였고， 한국생명공학연구원에 2011년 7월 20일자로 기탁하였으며， 기탁번호는 KCTC11987BP이다. 또한， 본 발명은 자일라나아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 자일라나아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하기의 서열 중 어느 하나를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
a) 서열번호 3에 기재된 염기 서열;
b) 서열번호 3에 기재된 염기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상， 가장 바람직하게는 90% 이상 상동성을 가지는 염기 서열;
c) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열;
d) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환， 결실， 삽입 및 /또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며， 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열; 및，
e) 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 흔성화 되는 DNA 염기 서열이며， 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 염기 서열. 또한， 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 재조합 발현백터를 제공한다.
본 발명은 페니바실러스 속 HPL-3 균주로부터 분리한 자일라나아제를 코딩하는 신규한 유전자의 염기서열을 밝혔으므로 당업계 공지된 통상의 방법을 이용하면 상기 유전자를 포함하는 재조합 백터를 제작할 수 있다. 본 발명의 재조합 백터는 상용화된 백터를 이용할 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며， 당업자가 적합한 재조합 백터를 제조하여 이용하는 것도 무방하다. 또한， 본 발명은 상기 재조합 발현백터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공한다.
본 발명에서 사용할 수 있는 숙주세포는 한정된 것은 아니나， 대장균， 박테리아를 포함한 원핵세포， 효모， 동물세포， 곤층세포를 포함하는 원핵세포로 이루어진 군으로부터 선택하여 이용하는 것이 바람직하며， 대장균을 이용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한， 본 발명은 배지에 균주 또는 상기 형질전환체를 배양한 후 원심분리하여 조효소액을 수득하는 단계를 포함하는 자일라나아제 생산 방법올 제공한다.
본 발명의 생산 방법은 상기 수득된 조효소액에서 자일라나아제를 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 배지는 본 발명의 페니바실러스 속 HPL-3 균주 (KCTC11987BP) 또는 본 발명의 형질전환체에 적합한 배지를 당업자에게 공지된 상용 배지 중에서 선별하여 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명자들은 정제과정을 단순화시키면서 정제효율을 높이기 위한 방법으로 형질전환체를 제작할 때 컬럼크로마토그래피를 위한 특정 레진 결합 백터를 사용하고， 정제과정에서는 레진에 결합된 효소만을 선별분리를 하는 것이 바람직하다. 엄격한 조건으로는 글루타치온 결합백터, 칼모들린 결합백터， 말토스 결합백터 등을 사용할 수 있으며， 컬럼 층진용 레진은 사용 백터에 따라 결정된다. 본 발명에서는 글루타치온 결합백터와 레진을 사용한 결과만을 제시하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 또한， 본 발명은 상기 자일라나아제， 상기 균주 또는 상기 형질전환체를 포함하는 자일란 분해제를 제공한다.
본 발명의 자일란 분해제는 상기 균주 또는 상기 형질전환체에서 생산하는 자일라나아제뿐만 아니라 상기 균주 또는 상기 형질전환체를 직접 자일란 분해제로 사용할 수 있다. 또한， 본 발명은 상기 자일라나아제를 포함하는 식품내 자일란 가공용 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 자일라나아제를 포함하는 사료첨가제를 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 자일라나아제를 포함하는 제지공정용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물 또는 사료첨가제는 본 발명의 자일라나아제 외에 동일하거나 유사한 성분을 포함할 수 있으며， 본 발명의 자일라나아제를 전체 조성물 또는 사료첨가제 중 1 내지 90%로 함유하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 자일라나아제는 기존의 자일라나아제와 달리 넓은 범위의 조건 (pH 5-11) 및 내열성 온도범위 (50~60 °C)에서 높은 활성을 나타내므로 (도 5 내지 도 6 참조),새로운 내열성， 광범위 pH및 고활성 자일라나아제의 용도로 이용될 수 있다. 현재 자일라나아제 효소시장을 점유하고 있는 용도는 크게 식품， 사료 및 기술로 분류할 수 있다 (Bedford and Morgana, World's Poultry Science Journal 52:61-68, 1996). 식품 (과일 및 야채생산， 양조 및 주류생산， 제빵 및 제과)시장에서는 재료의 연화 및 정제효율 개선, 점도감소， 추출 및 여과 효율증대 등을 통한 품질향상에 활용되고 있다. 사료시장에서는 돼지， 가금류， 반추동물 등의 사료의 비전분 탄수화물의 감소， 장내 점도개선， 단백질 및 전분의 소화흡수율 증대 등에 이용되고 있다 (Kuhad and Singh, Crit. Rev. Biotechnol. 13, 151-172, 1993). 아울러 기술적으로는 제지공정에서 생물학적 백화공정， 염소소비의 감소， 기계적인 제지공정 단축을 통한 에너지 감소， 탈묵효과， 전분과 글루텐의 분리， 재생가능 연료 (바이오에탄올) 및 화학원료생산 등에 활용되고 있다.
그러므로 본 발명의 신규 자일라나아제는 용지 생산 및 폐지 재생, 사료 첨가 및 식품의 품질 향상 또는 산업상 사용하는 자일라나아제의 분해에 유용하게 이용될 수 있으며 이는 당업자에게 자명하다. 상기 조성물들은 당업자에게 공지된 방법으로 제형화 되고 제제화될 수 있다. 또한， 본 발명은 섬유소계 바이오매스 또는 자일란 함유액에 상기 자일라나아제， 상기 균주 또는 상기 형질전환체를 가하는 단계를 포함하는 자일란 분해 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서， 상기 균주， 상기 형질전환체 또는 상기 균주 또는 상기 형질전환체가 생산하는 자일라나아제의 첨가량은 당업자에 의해 조정될 수 있다. 또한， 본 발명은 동물의 사료 재료에 상기 자일라나아제， 상기 균주 또는 상기 형질전환체를 가하는 단계를 포함하는 사료 제조 방법을 제공한다. 상기 방법에 있어서， 상기 균주, 상기 형질전환체 또는 상기 균주 또는 상기 형질전환체가 생산하는 자일라나아제의 첨가량은 당업자에 의해 조정될 수 있다. 또한， 본 발명은 자일란 분해제로 사용하기 위한 상기 자일라나아제， 상기 균주 또는 상기 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 자일란 분해제는 상기 균주 또는 상기 형질전환체에서 생산하는 자일라나아제뿐만 아니라 상기 균주 또는 상기 형질전환체를 직접 자일란 분해제로 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 식품내 자일란 가공용 조성물로 사용하기 위한 상기 자일라나아제를 제공한다.
또한， 본 발명은 사료첨가제로 사용하기 위한 상기 자일라나아제를 제공한다. 아울러， 본 발명은 제지공정용 조성물로 사용하기 위한 상기 자일라나아제를 제공한다.
상기 자일라나아제는 하기 (a) 내지 (d)의 특징을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
(a) SDS-PAGE상에서 분자량은 약 65 kDa;
(b) pH 5 내지 pH 11에서 최대 활성;
(c) 50 내지 60°C에서 최대 활성; 및，
(d) 50 °C, pH 5내지 pH 11의 조건에서 95 unit/minmg, 60°C , pH 6내지 pH 9의 조건에서 100 unit/minmg 이상 자일로스 생산.
상기 자일라나아제의 아미노산 서열은 하기의 서열 중 어느 하나를 포함하는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다:
a) 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열;
b)서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열과 70%이상， 바람직하게는 80%이상 가장 바람직하게는 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열;
c) 서열번호 3에 기재된 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열;
d) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환， 결실， 삽입 및 /또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며， 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 아미노산 서열; 및
e) 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 흔성화 되는 DNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열이며， 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 아미노산 서열. 본 발명의 자일라나아제는 기존의 자일라나아제와 달리 넓은 범위의 조건 (pH 5-11) 및 내열성 온도범위 (50~60°C)에서 높은 활성을 나타내므로 (도 5 내지 도 6 참조)， 식품내 자일란 가공용 조성물， 사료첨가제 또는 제지공정용 조성물로 사용하기 위한 새로운 내열성, 광범위 pH 및 고활성 자일라나아제로서 이용될 수 있다.
[실시예]
이하， 본 발명올 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>균주분리 및 선별
<1-1>균주분리
본 발명의 균주는 경남 거제시 남부면 다대리에 위치한 가라산 중턱에서 채취한 버섯재배 후 폐목재잔여물이 포함된 토양으로부터 분리하였다. 상기 토양의 표층으로부터 2~5 cm 층에서 토양시료를 채취, 풍건 후 2 匪 채를 통과시켜 토양을 정선하였다. 정선된 토양 30 g을 270 의 멸균된 생리식염수 (NaCl 8.0 g/£ )에 넣어서 진탕배양기 (37°C, 200 rpm)로 약 20분간 진탕 후 상온에 30분 정도 방치하여 굵은 토양입자 및 불순물 등을 바닥으로 침전시킨 후 상청액을 멸균된 용기로 옮겨 1차 회석액으로 하였다. 이것을 잘 교반한 후 10 을 취하여 90 의 생리식염수에 넣어 2차 희석액 100 을 제조하고， 2차 희석액을 층분히 교반하면서 위와 같은 방법으로 10 을 취하여 901 의 생리식염수에 넣어 3차 회석액 100 m£을 제조하였다. 이후 동일한 방법으로 6차 희석액까지 제조하였다. 균주 분리용 TSA(Tryptic Soy Agar, Difco Co.) 배지에 3， 4， 5 및 6차 회석액을 0.25 씩 3회 반복으로 분주한 후， 균일하게 도말하여 37°C 평상인큐베이터에서 2일간 배양 후 형성된 미생물의 콜로니를 선발하였다. 이때 콜로니의 모양， 크기， 색상 등 여러 가지 요인을 고려하여 분리하며， 분리된 콜로니는 다시 TSA 배지에서 계대 배양하여 순수한 균주를 분리하였고 이것을 모 균주로 사용하기 위하여 -70°C에 보관하였다. <1-2>균주선별
순수하게 분리된 균주들 중에서 자일라나아제 활성을 가지는 활성 균주 선별은 TSA 배지에 자작나무 자일란 (Fluka Bio Chemika. C으)이 0.5-1.0% 함유된 소프트 아가 더블 배지를 만들고 균주를 접종하여 하룻밤 배양한 후 다음날 Congo-red염색법 (Theater RM, PJ. Wood. Appl Environ Microbiol 43, 777-780, 1982； Beguin P. Analytical Biochemistry, 131(2) :333-336, 1983)을 통해 배양된 콜로니 주변에 투명환 (Halo)을 형성하는 균주 및 활성클론을 선별하였다. 선별된 균주의 자일란 분해능을 다시 한 번 측정하여 재현성을 확인하였고， 그 중 자일란 분해 능력이 가장 우수한 균주를 선발하여 자일라나아제를 생산하는 미생물로 최종 선발하였다.
<실시예 2>균주동정
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 분리한 가장 높은 활성을 지닌 자일라나아제를 생산하는 균주를 30°C에서 배양한 후 그람 염색 (Gram Staining) 및 포자 염색 (Spore Staining)을 실시한 결과， 포자를 생성하는 그람양성 간균으로 확인되었다. 전자현미경으로 그 형태를 관찰한 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이 1.1 의 세포크기와 2.5 m내지 4 /zm의 세포길이를 갖는 막대형 (rod) 이었으며 편모를 가지지 않는 운동성이 없는 간균으로 나타났다. 또한， 균주의 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 서열번호 1로 기재되는 1,234 bp의 rDNA를 얻은 후 유전자은행 정보자료 (GenBank database)를 검색한 결과， 판토애 아글로메란스 ZFJ-15(Pantoea agglomerans ZFJ-15; GenBank 등톡번호 EU931554) 균주와 96.4%의 상동성이 있고 페니바실러스 속 WPCB158(Paenibacillus sp. WPCB158; GenBank 등록번호 FJ006910)과 96.3%가 일치함을 확인하였으나 그 이상 일치하는 상동성은 검색되지 않았기 때문에， 본 균주를 페니바실러스 속 HPL-3 균주로 명명하였고， 한국생명공학연구원에 2011년 7월 20일자로 기탁하였으며， 기탁번호는 KCTC11987BP이다. <실시예 3>신규자일라나아제 분리
<3-1>페니바실러스균주의 유전자라이브러리제작및 활성검정
본 발명자들은 상기 실시예 1과 실시예 2에서 분리 동정한 페니바실러스 속 HPL-3 균주로부터 자일라나아제 활성을 가지는 효소 단백질을 암호화하는 유전자를 분리하기 위하여 게놈 DNA를 추출 후 5 kb 이하 크기의 유전자 조각을 가지는 gDNA 라이브러리를 제작하였다. 라이브러리의 제작은 균주로부터 추출한 DNA를 무작위 절단방법을 통하여 1~6 kb 크기의 DNA 조각들을 만들고， 아가로스 젤에서 전기영동으로 크기를 선발하여 원하는 5 kb 전후 크기의 DNA 조각을 확보하였다. 이를 pCB31 플라스미드 백터에 삽입 후 E. coli DH10B 세포에 형질전환시켰다. 이렇게 제작된 라이브러리 1,248개의 클론을 고상 또는 액상 조건에서 자일라나아제 활성을 시험하였다.
<3-2>자일라나아제 활성시험
분리된 균주， 활성클론， 형질전환체 및 분리 정제된 효소 등의 자일라나아제 활성 (자일란 분해능력 ) 측정은 다음과 같은 2가지 방법 중 하나 또는 모두를 사용하였다. 첫 번째 방법은 고체배양 측정방법으로 LB 배지에 자작나무 자일란 (Fluka Bio Chemika. Co.)이 0.5-1. 함유된 소프트 아가더블 배지를 만들고 균주를 접종하여 하룻밤 배양한 후 다음날 콩고레드 염색법을 통해 배양된 콜로니 주변에 투명환 (halo)을 형성하는 균주 및 활성클론을 선별하였다. 두 번째 방법은 액체배양 효소활성 측정방법으로 DNS(3,5-dinitrosalicylic acid)정량법 (Mi 1 ler G.L. Anal Chem 31, 426-428, 1959)을 사용하였고， 구체적으로는 50 ^의 효소용액에 50 ^의 기질용액 (2% 자작나무 자일란이 포함된 50 mM Tris-HCl, pH 7.0)을 넣고 50°C에서 20분간 반응시킨 후 200 ^의 DNS 용액을 첨가한 다음 90°C에 5분간 처리한 후 흡광도 540 ran에서 측정하였다. 효소의 1유니트 (unit)는 1분 동안에 1 mg의 자일라나아제가 1 μιηοΐ의 환원당 (자일로스)을 생산하는 효소활성으로 규정하였다. 액체배양 및 고체배양 활성시험을 통하여 상위 1개 클론 GM3-SLX1을 선발하였다 (도 2).
<3-3>자일라나아제 활성클론선발및 유전자분석
실시예 3-2에서 선발된 클론에 삽입된 절편 DNA의 염기서열을 분석하였다. 염기서열을 분석한 결과 플라스미드에 삽입된 DNA 절편의 크기는 6，956 bp (서열번호 2)이었고， 이를 NCBI의 Blast P또는 Blast N 프로그램 (//www. ncbi .nlm.nih.gov/)을 통해 암호화되어 있는 전사 해독틀 (ORF, Open Reading Frame)을 분석하였다. 분석된 ORF 중 아미노산 100개 이상의 크기를 갖는 0RF 11개를 SLX-01, SLX-02, SLX-03, SLX-04, SLX-05, SLX-06, SLX-07, SLX-08, SLX-09, SLX-010, SLX-011이라 이름 붙였다. 상기 0RF 중 유전자가 암호화하는 단백질의 상동성 검색결과 엔도 -1， 4-베타-자일라나아제 [endo— 1， 4-bet a-xy 1 anase( AJ006646) ]와 48% 상동성을 가지는 SLX-09(서열번호 3)를 표적으로 하여 그 염기서열을 바탕으로 과 Baniil 제한효소 인식부위를 첨가한 프라이머를 제작한 뒤 PCR 증폭 후 pGEM-T-Easy 백터 (Promega) 백터에 삽입하여 재조합 플라스미드를 제작하였다.
구체적으로， GM3-SLX1 플라스미드 주형 1 ng을 서열번호 5(5'— CTCGAGATGGATACATTGAAGTTGTATGTG-3')로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 6(5'-GGATCCCTATTCGTTGCTCCCC-3')로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머쌍 (10 pmol)과 흔합한 뒤， PCR증폭 조건은 PCR Premix(GenetBio)를 사용하여 94°C에서 5분간의 변성 (Denaturation)을 수행한 후 94°C에서 30초의 변성， 55°C에서 30초의 결합 (Annealing), 72°C에서 1분의 연장 (Extension)을 30회 반복한 후 마지막으로 72°C에서 7분간 연장으로 마무리하고 4°C에서 유지한 뒤 반응을 종결하였다. PCR을 통해 증폭된 산물을 GENCLEAN II Kit(Q-Biogene)올 사용하여 정제하였고， pGEM-T-Easy 백터에 T4 리가아제 (RBC)를 사용하여 재조합 DNA를 만들었다. 상기 재조합된 플라스미드를 E. coli JM109에 형질전환시켜 유전자 형질전환 대장균을 제작하였다. 상기 형질전환체를 LB 액체 배지에서 배양한 후 HiYield™ Plasmid Mini Kit(RBC)를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하여 제한효소 I(NEB)과 ΜΠ(ΝΕΒ)로 절단하였고， 이를 전기영동하여 목적하는 DNA 절편이 삽입되어 있음을 확인하였다. 또한， 상기 형질전환체를 실시예 3-2에서와 같이 액상의 조건에서 자일라나아제 활성을 시험한 결과 자일라나아제 활성을 보임을 확인하였다.
상기 형질전환체의 목적 DNA 절편의 염기서열을 확인하여 서열번호 4로 기재된 염기서열의 신규 자일라나아제 유전자의 0RF를 재확인하였다.
<3-4>자일라나아제 과발현체 제작 (pIVEX"GST-PX3) 상기 신규 자일라나아제를 과발현하는 형질전환체를 제작하기 위하여，
GM3-SLX1 플라스미드를 주형으로 하여 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반웅액과 반응조건은 상기 실시예 3-2와 동일하였다. 증폭된 산물을 정제하여 ¾oI(NEB)과 I(NEB)으로 절단한 뒤， 단백질 과발현백터 pIVEX-GST(Roche)에 삽입시켜 재조합 과발현 플라스미드를 제작하였고， 이를 E. co// BL2KRBC)에 형질전환하여 자일라나아제 과발현 형질전환 대장균을 제작하였다. 제작된 과발현 형질전환 대장균올 배양하여 플라스미드 DNA 추출 후 상기 제한효소를 이용하여 절단한 뒤 전기영동을 통해 백터와 목적 DNA가 성공적으로 재조합되었는지 확인하였고， 확인된 균체를 LB 액체 배지에서 (100 앰피실린 / 첨가) 18시간 배양시킨 (37°C, 250 rpm, A600=1.0) 후 새로운 LB 액체 배지에 재접종하여 A600 흡광도 값이 0.4-0.6일 때 1 mM의 IPTG를 처리하고 3시간 더 배양 후 균체를 수확하였다. 수확된 균체를 현탁시켜 초음파 분쇄 후 10,000 g에서 원심분리하여 상청액과 침전물로 분리하였고， SDS PAGE를 통하여 목적한 단백질이 상청액에 과발현됨과 분자량이 약 65 M)임올 확인하였다 (도 4).
<3-5>자일라나아제 활성발현 조건 분석
실시예 3-4에서 제작한 신규 자일라나아제 과발현 형질전환 대장균으로부터 과발현 및 분리된 자일라나아제의 활성을 pH, 온도 및 금속이온별로 실시예 3-2의 방법으로 조사하였다. 반웅용액의 pH 조절은 시트릭산 (Citric acid) 완층용액으로 pH 4-5, 인산 (Phosphate) 완층용액으로 pH 6-8, 트리스 /염산 (Tr is/HCl ) 완층용액으로 pH 7-9 ， 글라이신 /수산화나트륨 (Glycine/NaOH)완충용액으로 pH 9~11로 수행하였다. 금속이온으로는 1 mM의 CaCl2, MgC12, MgCl2, CuCl2, ZnCl2, FeCl3 등을 첨가하여 자일라나아제 활성에 미치는 영향을 조사하였고， 기타 NaCl, LiCl, KC1, NH4C1 , EDTA, CsCl2, 2-ME(2-Mercaptoethanol ) , DTT(Dithiothreitol), PMSF(Penyl methyl sul fonyl fluoride), 아세트산염， 푸르푸랄 (furfural) 등의 염을 첨가하여 자일라나아제 활성발현에 미치는 영향을 조사하였다.
그 결과， 도 5에 나타난 바와 같이 신규 자일라나아제는 pH 4~11에서， 도 6에서 나타난 바와 같이 50°C 내지 60°C에서 최대 활성을 나타내었다. 또한, 표 1에 나타난 바와 같이 1 mM의 Cu+2, Zn+2, Fe+2, EDTA 등의 중금속 또는 첨가물에 의해서 자일라나아제 활성이 각각 74, 28， 12, 46%로 저해되었다. 【표 1]
Figure imgf000022_0001
<실시예 4> 신규 자일라나아제의 대량 생산
서 열번호 4로 기 재되는 신규 자일라나아제를 암호화하는 유전자 (서 열번호 3)를 포함하는 pIVEX GST-xylanase 재조합 백터 (Bioprogen Co., Ltd. , Korea)를 대장균 BL21-Go 1 d ( DE ) ( St r at agene , USA)에 형질전환 시킨 후 ampici 11 in이 첨가 (50 ； «g/m£)된 액체배지 (LB 25 g/L)에 접종하여 0.D.600 값이 0.4-0.6이 될 때까지 37°C에서 150 rpm으로 교반 배양하였다. 목표 단백질의 대장균 세포내 발현을 유도하기 위하여， 상기 현탁액에 IPTG(isopropyl-D-thiogalactoside)를 최종 농도 1 mM이 되도록 첨가한 후에 3시간 더 배양하였다. 배양액을 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 회수한 침전물을 PBS로 2회 세척하였다. 세척된 침전물을 다시 PBS에 재현탁 후 초음파 파쇄기 (Cosmo Bio Co., LTD)를 이용하여 균체를 파쇄한 후， 원심분리 (12,000 rpm, 10분)하여 상청액을 회수하였다. 회수한 상청액 속의 자일라나아제를 순수분리하기 위해 글루타치온에스-트렌스퍼레이즈 컬럼 (GST binding resin column, Novagen)을 사용하였다. 이때 자일나아제 순수분리는 준비된 상청액을 완충용액 (Washing buffer solution ； 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl； pH 7.0)으로 평형화된 글루타치온에스-트렌스퍼레이즈 컬럼 (GST binding resin column, Novagen)에 부착 시킨 후, factor Xa protease(NEB)를 처리하고， 완층용액 (Washing buffer solution; 50 mM Tris-HCl , 100 mM NaCl； pH 7.0)을 이용하여 순수분리하였다. 정제 단계에서 회수한 각각의 시료로부터 자일라나아제 효소 활성을 측정 하였으며， 효소 활성 분획의 정제여부를 SDS-PAGE로 확인하였다. 단백질 함량은 브래드포드 방법 (Bradford, Sigma Aldrich)을 이용하여 측정하였고， 표준 단백질로는 BSA(bovine serum albumin)를 사용하였다.
그 결과， 글루타치온 레진 컬럼크로마토그래피 법으로 간편하게 다량의 자일라나아제를 생산할 수 있었다. 또한 레진에 결합된 자일라나아제 상태로도 자일라나아제 활성이 변화되지 않는 특성을 보여주었기 때문에 효소고정화 방법을 통한 고효율 전환공정에 적용할 수 있음을 알 수 있다. 상기 방법에 의해 정제된 효소는 정제하기 전의 효소보다 5배 이상의 활성을 나타내었다. 효소활성은 50°C에서 pH5.0, pH6.0, pH7.0, pH8.0, pH9.0, pH 10.0，및 pH 11.0에서 각각 97.37， 124.19, 122.21, 124.61, 122.95, 103.27, 및 96.08 unit으로 나타나 매우 넓은 pH 적용성을 나타내었다. 또한 60°C에서도 pH 5.0， pH 6.0, pH 7.0， pH 8.0, pH 9.0， pH 10.0, 및 pH 11.0에서 각각 26.93， 105.19, 123.56, 120.95, 112.25, 29.89, 및 22.76 unit(l분당 1 mg의 효소가 생산하는 자일로스 μΜ 량)의 내열성과 고활성을 모두 나타내었다. <실시예 5>대량생산된 신규자일라나아제의 효소특성
효소의 특성올 알아보기 위하여 정제된 자일라나아제를 시험관에 넣고 다양한 양의 자작나무 자일란을 포함하는 50mMTris-Hcl(pH7.0)완층용액을 넣었다. 반응 흔합물을 50°C에서 20분간 반웅시켜서 효소반웅 속도 (Lineweaver-Burk)를 알아보았다.
그 결과， 도 7에서 나타난 바와 같이 자일란 기질에 대한 친화도 값은 0.2이었고， 가수분해 산물은 대부분이 자일로스 및 자일로올리고머 이었다. 자작나무 자일란 이외의 자일란 (너도밤나무, 귀리 등)에 대한 자일라나아제 활성도 유사하였다.
【산업상 이용가능성】
상기와 같이， 본 발명의 신규한 자일라나아제는 기존의 자일라나아제와 달리 광범위한 ρΗ 및 내열성 온도 범위에서 높은 활성으로 다양한 섬유소 바이오매스의 주성분인 자일란을 분해하므로， 자일란 분해제, 및 식물 가용용， 사료첨가제용 또는 제지공정용 조성물의 제조 및 개발에 유용하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라， 바이오매스의 효소적 당화공정에 의하여 바이오 연료， 대체원료， 특수기능물질 및 바이오 폴리머의 개발을 통한 바이오 화학 산업 전반에 기여할 수 있다.
Figure imgf000025_0001
기탁된미 *J률또는기타생률학적튤질의표시사
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2011.0?.20 CTC U98?Bf
C추가적 표시사항 (기^사항이 었 Α¾ 로계 *) ¾1도의 추가 쾌이지 계속 ᄆ
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□ 해 용지 ¾국제에화 함제 ¾수되¾움 □ ¾해 ■§·지는국계 *원 3*함제 수되았움: 담당관 담당관
Fit» ( y 1W¾ «pdW Iwi iy 2004) 번 역 문 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한
부다페스트 조약 국제 서식
규칙 7.1에 의한
원기탁에 대한수탁증
TO： 황 인 택
대한민국 대전시 유성구 과학로 141
한국화학연구원
I. 미생물의 특징 기탁자가 부여한 특정표시 국제기탁기관이 부여한수탁번호
Paenibacillus sp. HPL-3 KCTC 11987BP
Π. 과학적 성질 및 /또는 분류학상 위치
I 로 특정된 미생물은
[ X ] 과학적 성질
[ ] 분류학상 위치로 기재하였다 (적용되는 부분에 표시한다). m. 수탁 국제기탁기관은 I 로 특정되는 미생물을 2011년 7월 20일에 수탁하였다.
IV. 수탁전환의 청구
I 로 특정된 미생물은 국제기탁기관 에 수탁되 ¾고. 동 미생물에 대한 원기탁을 부다페스트 조약에 의한 기탁으로의 전환 청구가 접수되었다.
V. 국제기탁기관 명칭 ： 한국생명공학연구소유전자은행
(KCTC) 국제 기탁 기관을 대표할 권한이 있는 자의 서명
주소 ： 한국생명공학연구원
KRIBB (305-806)
담당자 ： 이 정 숙
대한민국
날 짜 ： 2011년 7월 28일
대전시 유성구 과학로 111
BP/4 형식 (KCTC 제 17형식) 6
Of MICIWOCUjA.N h R)K I IU- !RfWfi Of 1 주 PROC tXii
INTERNATIONAL FORM
RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSIT
issued pursuant to Rule 7.1 O HVUWMG, in l&ek
iConea Ftesearch Institute crf C emiraJ Technology
141 Gajeong-fo, Yuseong-gu. aejeon 305-500
Republic of Korea
1 . IDE TIHCATO OF THE λ-UCROORGA lS
Idendiication reference given by the Accession number given by the
DEPOSITOR: INTERNATIONAL DEPOSITARY
AUTHOWTY:
Pa nibacttkis sp. HPL-3
KCTC 11987BP
Π SCIEKT1FIC DESCRIPTION ANirVOR PRnPOSKD TASO OMIC DESIGNATION
The microorganism identified under I above was accompanied by"
[ X ] a scientific descriptio
[ a ro osed taxonomic desiffrxation
(Mtirk with a cross where applicable)
Figure imgf000027_0001
I:»rrti ΒΓ·'4 UxC 1-i.nn IT sot tmx

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1]
하기 (a) 내지 (d)의 특징을 가지는 자일라나아제:
(a) SDS-PAGE 상에서 분자량은 약 65 kDa;
(b) pH 5 내지 pH 11에서 최대 활성 ;
(c) 50 내지 60°C에서 최대 활성 ; 및，
(d) 50 °C , H 5내지 pH 11의 조건에서 95 unit/minmg, 60°C， pH 6내지 pH 9의 조건에서 100 unit/minmg 이상 자일로스 생산.
【청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 자일라나아제는 하기의 서열 중 어느 하나를 가지는 것을 특징으로 하는 자일라나아제:
a) 서열번호 4로 기재되는 아미노산서열;
b) 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열과 70% 이상 상동성을 가지는 아미노산서열;
c) 서열번호 3에 기재된 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열;
d) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환， 결실， 삽입 및 /또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며， 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 아미노산 서열; 및,
e) 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 흔성화 되는 DNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열이며， 서열번호 4에 기재된 아미노산서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 아미노산 서열.
【청구항 3】
제 1항의 자일라나아제를 생산하는 균주.
【청구항 4】
제 3항에 있어서， 상기 균주는 수탁번호 KCTC11987BP로 기탁된 페니바실러스 속 iPL-3(Paenibacnhjs sp. HPL-3)인 것올 특징으로 하는 균주.
【청구항 5]
제 1항의 자일라나아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
【청구항 6】
제 5항에 있어서， 상기 폴리뉴클레오티드는 하기의 서열 중 어느 하나를 가지는 것을 특징으로 하는 유전자:
a) 서열번호 3에 기재된 염기 서열;
b) 서열번호 3에 기재된 염기 서열과 95%상동성을 가지는 염기 서열;
c) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열;
d) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환， 결실， 삽입 및 /또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며， 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열;
e) 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 흔성화 되는 DNA 염기 서열이며， 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 염기 서열.
【청구항 7】
제 5항의 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 재조합 발현백터.
【청구항 8】
제 7항의 재조합 발현백터를 숙주세포에 도입한 형질전환체.
【청구항 9】
제 8항에 있어서， 상기 숙주세포는 대장균을 포함한 원핵세포 또는， 효모， 동물세포 및 곤층세포를 포함하는 진핵세포인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
【청구항 10】
배지에 제 3항의 균주 또는 제 8항의 형질전환체를 배양한 후 원심분리하여 조효소액을 수득하는 단계를 포함하는 자일라나아제 생산 방법 .
【청구항 111
제 10항에 있어서 , 상기 수득된 조효소액에서 자일라나아제를 정 제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 생산 방법 .
【청구항 12]
제 1항의 자일라나아제， 제 3항의 균주 또는 제 8항의 형질전환체를 포함하는 자일란 분해제 .
【청구항 13]
제 1항의 자일라나아제를 포함하는 식품내 자일란 가공용 조성물 .
【청구항 14】
제 1항의 자일라나아제를 포함하는 사료첨가제 .
【청구항 15】
제 1항의 자일라나아제를 포함하는 제지공정용 조성물 .
【청구항 16】
섬유소계 바이오매스 또는 자일란 함유액에 제 1항의 자일라나아제， 제 3항의 균주 또는 제 8항의 형 질전환체를 가하는 단계를 포함하는 자일란 분해 방법 .
【청구항 17]
제 16항에 있어서， 재생 가능 연료 또는 화학 원료의 생산 공정에 이용되는 것을 특징으로 하는 자일란 분해 방법 .
【청구항 18]
동물의 사료 재료에 제 1항의 자일라나아제， 제 3항의 균주 또는 제 8항의 형 질전환체를 가하는 단계를 포함하는 사료 제조 방법 .
【청구항 19】
자일란 분해제로 사용하기 위한 제 1항의 자일라나아제， 제 3항의 균주 또는 제 8항의 형질전환체 .
【청구항 20】
식품내 자일란 가공용 조성물로 사용하기 위한 제 1항의 자일라나아제 . 【청구항 21】
사료첨가제로 사용하기 위한 제 1항의 자일라나아제. 【청구항 22]
제지공정용 조성물로 사용하기 위한 제 1항의 자일라나아제.
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DATABASE GENBANK 23 February 2011 (2011-02-23), "xylanase KRICT PX3 [Paenibacillus terrae HPL-003]", accession no. DX97440 *

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