CN111849943B

CN111849943B - 一种内切木聚糖酶突变体s06h03及制备方法和应用

Info

Publication number: CN111849943B
Application number: CN202010676949.9A
Authority: CN
Inventors: 张蕊; 周峻沛; 黄遵锡; 黎孔月; 黄顺琼; 沈骥冬; 吴倩; 慕跃林
Original assignee: Yunnan Normal University
Current assignee: Yunnan Normal University
Priority date: 2020-07-14
Filing date: 2020-07-14
Publication date: 2022-06-24
Anticipated expiration: 2040-07-14
Also published as: CN111849943A

Abstract

本发明公开了一种内切木聚糖酶突变体S06H03及制备方法和应用。突变体S06H03的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其最适pH为5.0，最适温度为50℃。与野生酶相比，突变内切木聚糖酶S06H03在10.0mM的β‑Mercaptoethanol、Pb(CH₃COO)₂、CoCl₂、ZnSO₄和FeSO₄中的活性、在3.0‑30.0％(w/v)的NaCl中的活性、在5.0‑30.0％(w/v)Na₂SO₄中酶活性得到了改良。本发明的突变内切木聚糖酶S06H03可应用于高盐环境下食品加工和造纸等技术领域。

Description

一种内切木聚糖酶突变体S06H03及制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及蛋白质改造技术，具体为一种内切木聚糖酶突变体S06H03及制备方法和应用。

背景技术

半纤维素广泛存在于绿色植物细胞壁中，是一种丰富的可再生资源。木聚糖是半纤维素中第一大组分，由木糖苷以β-1,4连接而成。内切木聚糖酶可降解木聚糖主链结构，降解产物为木糖和/或低聚木糖。内切木聚糖酶已广泛应用于食品、饲料、造纸、制革、环保及能源等领域(Collins et al.FEMS Microbiol Rev,2005,29:3–23.)。

高盐环境下催化活性高的酶在工业技术领域具有更好的应用性。例如，在食品方面，耐盐的内切木聚糖酶可用于高盐稀态酱油发酵等；在纸浆漂白方面，木聚糖酶用来去除硫酸盐浆中的木质素残基(Walia et al.3Biotech,2017,7:11)。不同应用环境的高浓度盐离子的种类存在差异，高盐稀态酱油发酵中主要存在高浓度NaCl，而纸浆漂白主要存在高浓度Na₂SO₄。因此，开发耐NaCl和Na₂SO₄的木聚糖酶，有利于其在高盐环境下的食品加工和造纸工艺中的应用。

发明内容

本发明目的在于提供一种内切木聚糖酶突变体S06H03，该突变体可应用于高盐环境下食品加工和造纸等技术领域。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种内切木聚糖酶突变体S06H03，所述的突变体S06H03的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的氨基酸序列SEQ ID NO.1经修饰、缺失或添加一或几个氨基酸获得氨基酸序列，且保持只有90％的同源性的序列也在本发明的保护范围内。

在本发明另一方面，还提供了所述的内切木聚糖酶突变体S06H03的编码基因s06h03，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

与所述的编码基因s06h03编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列或其互补序列不同的核苷酸序列也在本发明的保护范围内。

在本发明的另一方面，还提供了包含携带有编码基因序列为SEQ ID NO.2的重组载体。

在本发明的另一方面，还提供了一种内切木聚糖酶突变体基因的工程菌，所述的工程菌含有具有SEQ ID NO.2所示基因的载体。

在本发明的另一方面，还提供了一种内切木聚糖酶突变体S06H03的制备方法，包括以下步骤：

1)将编码基因s06h03和表达载体pEasy-E2相连接，并将连接产物转化大肠杆菌BL21-Gold(DE3)，获得包含编码基因s06h03的重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组突变内切木聚糖酶表达；

3)回收并纯化所表达的突变内切木聚糖酶S06H03；

4)活性测定。

在本发明的另一方面，所述的内切木聚糖酶突变体S06H03及其编码基因s06h03在食品制备和造纸中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明的有益效果为：

与野生酶相比，突变内切木聚糖酶S06H03的盐适应性发生了改变。纯化的突变酶S06H03、野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的最适pH分别为5.0、5.5和6.0，最适温度分别为50℃、50℃和75℃。在10.0mM的FeSO₄中，突变体S06H03的酶活力比野生酶rXynAGN16L的酶活力高46％；在10.0mM的β-Mercaptoethanol、Pb(CH₃COO)₂、CoCl₂、ZnSO₄和FeSO₄中，突变体S06H03的酶活力比野生酶rXynAHJ3的酶活力分别高16％、21％、28％、18％和35％。在3.0～30.0％(w/v)的NaCl中，突变体S06H03酶活力比野生酶rXynAGN16L酶活力高10％～34％，比rXynAHJ3酶活力高16～30％；在5.0～30.0％(w/v)的Na₂SO₄中，突变体S06H03酶活力比野生酶rXynAGN16L酶活力高3％-30％，比rXynAHJ3酶活力高1～23％。本发明的突变内切木聚糖酶S06H03可应用于高盐环境下食品加工和造纸等技术领域。

附图说明

图1是本发明在大肠杆菌中表达的重组内切木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突变体S06H03的SDS-PAGE分析，其中，CK：蛋白质Marker；

图2是本发明重组内切木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突变体S06H03在NaCl中的活性；

图3是本发明重组内切木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突变体S06H03在Na₂SO₄中的活性。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

试验材料和试剂

1、菌株及载体

大肠杆菌Escherichia coli BL21-Gold(DE3)和表达载体pEasy-E2购自北京全式金生物技术有限公司；节杆菌(Arthrobacter sp.)和列舍瓦里尔菌(Lechevalieria sp.)由云南师范大学提供。

2、酶类及其它生化试剂

DNA聚合酶及dNTP购自北京全式金生物技术有限公司，山毛榉木聚糖购自Sigma公司，玉米芯木聚糖购自上海源叶生物科技有限公司，易错PCR试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司，细菌基因组提取试剂盒购自GENE STAR公司，PopCulture^TM细胞裂解液购自德国默克集团有限公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基

LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000mL，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1突变文库的构建

1)按照GENE STAR公司细菌基因组提取试剂盒说明书提取节杆菌(Arthrobactersp.)和列舍瓦里尔菌(Lechevalieria sp.)基因组。

2)根据GenBank记录的节杆菌(Arthrobacter sp.)内切木聚糖酶核苷酸序列JQ863105(SEQ ID No.3)，设计引物5'GTGCAGC CGGAGGAAAAACG 3'和5'GATGAAGGCAGGATCCGGGGT 3'，以节杆菌(Arthrobacter sp.)基因组为模板进行PCR扩增，获得内切木聚糖酶基因xynAGN16L；另根据GenBank记录的列舍瓦里尔菌(Lechevalieriasp.)内切木聚糖酶核苷酸序列JF745868(SEQ ID No.4)，设计引物5'GTCTCGGCCCCGCCGGACGT 3'和5'GGCTC GCTTCGCCAGCGTGG 3'，以列舍瓦里尔菌(Lechevalieria sp.)基因组为模板进行PCR扩增，获得内切木聚糖酶基因xynAHJ3。

PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min 30sec，30个循环后72℃保温10min。

3)以上述PCR产物为模板，利用易错PCR试剂盒，按照试剂盒说明书进行基因突变。

4)用超声打断仪Biorupter对易错PCR产物进行超声随机打断，打断产物经2％琼脂糖凝胶电泳后切胶纯化。

5)纯化后的小片段DNA自身互为引物和模板进行DNA家族改组(DNA Familyshuffling)PCR，PCR反应参数为：96℃变性1min30sec；然后94℃变性30sec，依次65℃退火90sec、62℃退火90sec、59℃退火90sec、56℃退火90sec、53℃退火90sec、50℃退火90sec、47℃退火90sec、44℃退火90sec、41℃退火90sec，72℃延伸1min 30sec，35个循环后72℃保温7min。

6)以纯化的DNA家族改组PCR产物为模板，用内切木聚糖酶基因xynAHJ3和xynAGN16L扩增引物和反应条件进行序列全长扩增，扩增产物含突变序列和未突变序列。

7)将序列全长扩增产物和表达载体pEasy-E2相连接，并将连接产物转化大肠杆菌BL21-Gold(DE3)，经过夜培养，从转化平板中挑取单菌落于含有150μL液体LB培养液(含100μg mL^-1Amp)的96孔细胞培养板中，于37℃，快速振荡培养约16h后，每孔加入40％(w/w)的甘油50μL，混匀后于-70℃保存。

实施例2突变体的筛选

1)从保存突变文库的96孔细胞培养板中取2μL菌液，接种于含200μL/孔液体LB培养液(含100μg mL^-1Amp)的96深孔板中，于37℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀>1.0(约20h)，加入含2mM IPTG和100μg mL^-1Amp的200μL液体LB培养液，于20℃，160rpm过夜诱导。

2)诱导结束后加入40μL/孔的PopCulture^TM细胞裂解液，在25℃下，震荡裂解细胞30min。

3)取50μL含1.0％(w/v)山毛榉木聚糖的McIlvaine缓冲液(pH＝7.0)及50μL细胞裂解产物，在96深孔板中于70℃恒温箱中反应2h。反应结束后加入150μL DNS试剂终止反应，于140℃恒温箱中保温20min以上并冷却至室温，使用酶标仪读取OD_540nm的值，以只含有pEASY-E2空载体的E.coli BL21-Gold(DE3)菌株裂解液反应组作为对照。

4)取有内切木聚糖酶活性的突变体细胞裂解产物10μL，另取90μL含0.5％(w/v)山毛榉木聚糖的McIlvaine缓冲液(pH＝7.0)，加入10％(w/v)和25％(w/v)的NaCl，在96深孔板中于70℃恒温箱中反应10min。

5)反应结束后加入150μL DNS试剂终止反应，于140℃恒温箱中保温20min以上并冷却至室温，使用酶标仪读取OD_540nm的值，以不含NaCl的对应突变体裂解液反应组作为对照。

6)比较突变体与野生重组酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的酶活大小，获得在10％(w/v)和25％(w/v)NaCl中酶活提高的1个突变体，编号为S06H03，该突变体氨基酸序列如SEQID NO.1所示，其是两个野生酶的改组杂合体，该突变体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例3突变体S06H03及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的酶制备

将含突变体S06H03、野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的重组菌株以0.1％的接种量分别接种于LB(含100μg mL^-1Amp)培养液中，37℃快速振荡16h。

然后将此活化的菌液以1％接种量接种到新鲜的LB(含100μg mL^-1Amp)培养液中，快速振荡培养约2～3h(OD₆₀₀达到0.6～1.0)后，加入终浓度0.1mM的IPTG进行诱导，于20℃继续振荡培养约20h。12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的pH＝7.0Tris–HCl缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经13,000rpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTAAgarose和0～500mM的咪唑分别亲和和纯化目的蛋白。

SDS-PAGE结果(图1)表明，突变酶S06H03、野生酶rXynAG N16L和rXynAHJ3都获得了纯化，产物为单一条带。

实施例4突变体S06H03及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的纯化酶的性质测定

1)突变体S06H03及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的纯化酶的活性分析

活性测定方法采用3,5－二硝基水杨酸(DNS)法：将底物溶于缓冲液中，使其终浓度为0.5％(w/v)；反应体系含100μL适量酶液，900μL底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应10min，然后加1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min，冷却至室温后在540nm波长下测定OD值；1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生1μmol还原糖(以木糖计)所需的酶量。

2)突变体S06H03及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的纯化酶的pH活性和pH稳定性测定：

酶的最适pH测定：将酶液置于37℃下和pH＝4.0～12.0的缓冲液中进行酶促反应。酶的pH稳定性测定：将酶液置于pH＝3.0～12.0的缓冲液中，在37℃下处理1h，然后在pH＝7.0及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。缓冲液为：McIlvaine buffer(pH＝3.0～8.0)和0.1M glycine–NaOH(pH＝9.0～12.0)。以山毛榉木聚糖或玉米芯木聚糖为底物，反应10min，测定纯化的内切木聚糖酶的酶学性质。

结果表明：突变酶S06H03、野生纯化酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的最适pH分别为5.5、5.5和6.0；在pH＝5.5-10时，突变体S06H03、野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3稳定。

3)突变体S06H03及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的纯化酶的热活性及热稳定性测定：

酶的热活性测定：在pH＝7.0的缓冲液中，于0～90℃下进行酶促反应。酶的热稳定性测定：将同样酶量的酶液置于37℃处理0～60min后，在pH＝7.0及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以山毛榉木聚糖或玉米芯木聚糖为底物，反应10min，测定纯化的内切木聚糖酶的酶学性质。

结果表明：S06H03、rXynAGN16L和rXynAHJ3的最适温度分别为55℃、50℃和75℃，在70℃分别具有21.6％、17.7％和97.7％的酶活；rXynAHJ3在50℃时稳定，S06H03和rXynAGN16L在50℃时极不稳定。

4)不同金属离子及化学试剂对突变体S06H03及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的纯化酶活力的影响：

在酶促反应体系中加入10.0mM的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在37℃及pH＝7.0条件下，以山毛榉木聚糖或玉米芯木聚糖为底物测定酶活性。

结果如表1所示：10.0mM的HgCl₂可完全抑制S06H03、rXynAGN16L和rXynAHJ3；在10.0mM的FeSO₄中，突变体S06H03的酶活力比野生酶rXynAGN16L的酶活力高46％；在10.0mM的β-Mercaptoethanol、Pb(CH₃COO)₂、CoCl₂、ZnSO₄和FeSO₄中，突变体S06H03的酶活力比野生酶rXynAHJ3的酶活力分别高16％、21％、28％、18％和35％。

表1金属离子及化学试剂对突变体S06H03及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3活力的影响

5)突变体S06H03及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的纯化酶在NaCl和Na₂SO₄中的活性

酶在NaCl中的活性测定：在酶促反应体系中加入3.0～30.0％(w/v)NaCl，于pH7.0及37℃下进行酶促反应。以山毛榉木聚糖或玉米芯木聚糖为底物，反应10min，测定纯化的内切木聚糖酶的酶学性质。

结果表明：在3.0～30.0％(w/v)的NaCl中，突变体S06H03酶活力比野生酶rXynAGN16L酶活力高10％～34％，比rXynAHJ3酶活力高16～30％(图2)。

酶在Na₂SO₄中的活性测定：在酶促反应体系中加入3.0～30.0％(w/v)Na₂SO₄，于pH7.0及37℃下进行酶促反应。以山毛榉木聚糖或玉米芯木聚糖为底物，反应10min，测定纯化的内切木聚糖酶的酶学性质。

结果表明：在5.0～30.0％(w/v)的Na₂SO₄中，突变体S06H03酶活力比野生酶rXynAGN16L酶活力高3％-30％，比rXynAHJ3酶活力高1～23％(图3)。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 云南师范大学

<120> 一种内切木聚糖酶突变体S06H03及制备方法和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 362

<212> PRT

<213> 内切木聚糖酶突变体(S06H03)

<400> 1

Val Ser Ala Pro Pro Asp Val Ser Gly His Lys Gln Thr Leu Arg Ser

1 5 10 15

Ala Ala Pro Lys Gly Phe His Ile Gly Thr Ala Val Ala Gly Gly Gly

20 25 30

His His Glu Asn Gln Pro Tyr Pro Asp Pro Phe Thr Ser Asp Ser Glu

35 40 45

Tyr Arg Lys Val Leu Ala Ala Glu Phe Asn Ser Val Ser Pro Glu Asn

50 55 60

Gln Ser Lys Trp Glu Phe Ile His Pro Glu Lys Asp Val Tyr Arg Phe

65 70 75 80

Thr Glu Met Asp Ala Ile Val Arg Ser Ala Gln Lys Asn Lys Gln Val

85 90 95

Val Arg Gly His Thr Leu Phe Trp His Ser Gln Asn Pro Gln Trp Leu

100 105 110

Glu Gln Gly Asn Phe Ser Lys Glu Glu Leu Arg Gly Ile Leu Lys Asp

115 120 125

His Val Gln Thr Val Val Gly Arg Tyr Ala Gly Lys Ile Gln Gln Trp

130 135 140

Asp Val Ala Asn Glu Ile Phe Asn Asp Asp Gly Thr Leu Arg Ala Thr

145 150 155 160

Glu Asn Ile Trp Leu Arg Glu Leu Gly Pro Asp Ile Ile Ala Asp Val

165 170 175

Phe Arg Trp Ala His Gln Ala Asp Pro Lys Ala Lys Leu Phe Phe Asn

180 185 190

Asp Phe Gly Val Glu Asp Ile Asn Ala Lys Ser Asp Ala Tyr Leu Glu

195 200 205

Leu Ile Pro Arg Leu Gln Ala Gln Gly Val Gln Val Asp Gly Phe Ala

210 215 220

Ile Gln Gly His Leu Ser Thr Arg Tyr Gly Phe Pro Ser Gly Leu Gln

225 230 235 240

Ala Asn Leu Gln Arg Phe Asp Asp Leu Gly Leu Glu Thr Ala Ile Thr

245 250 255

Glu Ile Asp Val Arg Met Asp Ile Ala Ala Gly Thr Glu Pro Thr Ala

260 265 270

Glu Gln Leu Glu Gln Gln Ala Asp Tyr Tyr Gln Arg Ala Leu Glu Ala

275 280 285

Cys Leu Ser Val Ala Asp Cys Asn Ser Phe Thr Ile Trp Gly Phe Thr

290 295 300

Asp Lys Tyr Ser Trp Val Pro Val Phe Phe Ala Gly Glu Gly Glu Ala

305 310 315 320

Thr Val Met Glu Glu Asp Phe Thr Arg Lys Pro Ala Tyr Phe Ala Leu

325 330 335

Arg Glu Thr Leu Lys Arg Pro Val Pro Lys Pro Asp Asp Gly Gly Pro

340 345 350

Ser Gln Pro Thr Pro Asp Pro Ala Phe Ile

355 360

<210> 2

<211> 1086

<212> DNA

<213> 内切木聚糖酶突变体(s06h03)

<400> 2

gtctcggccc cgccggacgt gagcggccac aaacagacgt tgcgctcggc agcgcccaag 60

ggtttccaca tcggcacggc cgtcgcgggc ggcggccacc acgagaacca gccgtacccg 120

gaccccttca cctcggacag cgagtaccgg aaggtgctgg ccgccgagtt caactcggtc 180

tcgcccgaga accagtcgaa gtgggaattc atccacccgg aaaaggatgt ctaccgcttc 240

acggaaatgg acgccattgt ccgctccgcc caaaaaaaca agcaggtggt gcgcggccac 300

accctctttt ggcacagcca gaatcctcag tggctggagc agggaaactt ctccaaagaa 360

gaactgcgcg gaatcctcaa agaccacgtc cagactgtag tgggcaggta cgccggcaaa 420

atccagcagt gggacgtcgc caacgaaatc ttcaatgatg acggaaccct gcgcgccacc 480

gagaacattt ggcttcgtga actgggcccg gacatcattg ccgacgtttt ccgctgggcg 540

caccaggccg accccaaggc gaagctgttc ttcaatgatt tcggcgttga ggacattaat 600

gccaagagtg atgcctacct cgaactcatc ccccggcttc aggcacaggg cgtgcaggtt 660

gacgggtttg ccatccaggg ccatctgagc acccgctacg gtttcccttc agggctgcag 720

gccaacctgc agcgctttga cgacctgggg ctggaaaccg ccattacgga aatagacgtc 780

cgcatggata ttgcagccgg cacggagccg acggccgagc agcttgagca gcaggcggac 840

tactaccagc gcgcccttga ggcctgcctg tccgttgcag actgcaattc gttcaccatt 900

tggggcttca cggacaagta ctcgtgggtt ccggtcttct ttgccggcga gggcgaggcg 960

acagtcatgg aggaagactt cacgcgcaag cctgcctact ttgccctgcg ggaaacactg 1020

aagcgtccgg tgccgaagcc cgacgacggc ggcccgtccc agccaacccc ggatcctgcc 1080

ttcatc 1086

<210> 3

<211> 3639

<212> DNA

<213> 节杆菌(Arthrobacter sp.)

<400> 3

atgaaggttc cgcgtttatt aaccgctctg gctgtaacct cggcgctgct gctgccggcg 60

gttccggcgc ttgccgtgca gccggaggaa aaacgtcctc cgggccagtc caaacaggac 120

acgctgcgcc gtgcagcccc caaagacttc aagattggtt ccgccgttgc gggcggaggc 180

catcatgagg cccaggacta ccccgatcct tttacgttcg ataaggaata ccgccggcaa 240

ctggccgccg agttcaattc ggtgtcaccg gagaaccagt cgaagtggga attcatccac 300

ccggaaaagg atgtctaccg cttcacggaa atggacgcca ttgtccgctc cgcccaaaaa 360

aacaagcagg tggtgcgcgg ccacaccctc ttttggcaca gccagaatcc tcagtggctg 420

gagcagggaa acttctccaa agaagaactg cgcggaatcc tcaaagacca cgtccagact 480

gtagtgggca ggtacgccgg caaaatccag cagtgggacg tcgccaacga aatcttcaat 540

gatgacggaa ccctgcgcgc caccgagaac atttggcttc gtgaactggg cccggacatc 600

attgccgacg ttttccgctg ggcgcacgag gccgacccca aggccaagct gttcttcaat 660

gatttcggcg ttgaggacat taatgccaag agtgatgcct acctcgaact catcccccgg 720

cttcaggcac agggcgtgca ggttgacggg tttgccatcc agggccatct gagcacccgc 780

tacggtttcc cttcagggct gcaggccaac ctgcagcgct ttgacgacct ggggctggaa 840

actgccatta cggaaataga cgtccgcatg gatattgcag ccggcacgga gccgacggcc 900

gagcagcttg agcagcaggc ggactactac cagcgcgccc ttgaggcctg cctgtccgtt 960

gcagactgca attcgttcac catttggggc ttcacggaca agtactcgtg ggttccggtc 1020

ttctttgccg gcgagggcga ggcgacagtc atggaggaag acttcacgcg caagcctgcc 1080

tactttgccc tgcgggaaac actgaagcgt ccggtgccga agcccgacga cggcggcccg 1140

tcccagccaa ccccggatcc tgccttcatc cccggcggcg ccgccaaccc gacagcgacg 1200

ccgatcgcag catcccgcgg caccggcaac tccgtggcgc tcaccttcga tgacgggccc 1260

gagcccggcg aaaccacagc tgtcctcgat ttcctcaagg acaagggcat cactgccacc 1320

ttctgcgtca tcggagcgaa catccaggcc cccggcggag ccgagctggt gaagcgcatg 1380

gtcgaggagg gccacacgct gtgcaaccac ggcaccacgt atgcggacat gggttcgtgg 1440

acccaggaac agattaaggc cgacctggtg gaaaacctcc gcatcatccg tgaagccgcc 1500

ggcacgcctg atctgcaggt cccctatttc cgggcaccga acggaagctg gggagtcacg 1560

ggcgaagtag ccgcagcgct tggtatgcag ccgctgggcc tgggcaatgt catctttgac 1620

tgggacggca atgacctcag cgaagccacc ctcacggcaa acctccgtgc cgcgttcacc 1680

cccggcgcgg tggtgctggc gcacgtcggc ggcggtgacc ggaccaacac agtgaaggca 1740

gttacgacgg tcgtgaccga aaagctcgcc caggggtgga cgttcgccct tccgcagggc 1800

ggtgccccgg aggaaccttc cggcggtgtg ccctcggact tcgagaccgg aaccgacggc 1860

tggaccgcgc gcggggactc agtggcggtc aacctcagct ccgacgcccg caccggatcc 1920

ggaagcctgc tggtcacgaa ccggacccag gactggcacg gtgccgcact cgacgtcacg 1980

ggcgccctac cggtcggctc ggccgtaaag atgtccgtct gggccaagct cgcccccggg 2040

cagcagccgg cggcactgaa aatgtccgtt cagcgggaca acggcggcgg gagtgcctat 2100

gaaggcgttg ccggagccgg ggcttcggtc accgccgacg gctggaccga acttgccggg 2160

acttacaccc tcggcgcagc agcggacaaa gcccaggtgt acatcgaagg tgctgtcggc 2220

gtggggttcc tgctcgatga cttcagcctc gccgcatatg ttgagcctcc ccttcaggag 2280

gacatacccg ggttgaaaga cgtccttggc ctgcagggca tcgagcacgt gggagcagca 2340

atcgacgcac gcgagacagc gggcaccgca gcgaacctcc tgcggaaaca cttcaatgcc 2400

ttcactcccg agaacgccgg caggcccgag agcgtgcagc cggtggaggg tcagttcacc 2460

cttacccagc tggaccagct gctggacttc gcagccgcca acaatgtcaa ggtgtacgga 2520

catgtgctgg tctggcattc ccagacccct gagtggttct tcaaggacgg gacccgggac 2580

ctgaccggca accggtccga ccgggcgctg ctgagggcac gcatggaggc acatatcaag 2640

ggcatcgcag atcacatcaa tgcccgctac ccggaggggg acagccccat ttgggcctgg 2700

gacgttgtca acgagaccat tgcggacggt gacacggcca acccgcacga catgcgggac 2760

agccgctggt tccaggtcct cggtgaacgt tttgtcgatg atgccttccg tctcgcggac 2820

aagtacttcc cggaggcaaa gctcttcatc aacgactaca acaccgagat gccccagaaa 2880

cgggccgact atctcgagct gattcgtgcc ctggaagccc ggggcgtacc catcgacggc 2940

gtgggccacc aggcgcacgt cgacgtggca cgtccggtgc agtggctcga ggactcgatc 3000

aaggccgttg agaaggtcaa tcctgacctg atgcaggcga tcactgagct cgacgtgaac 3060

gcgtccaccg agaatcaggg cgcggacgtg gacggtgccc cggtggatcc gtaccagccg 3120

gcattcggga acgacgggga cgccgccgcg gaagtcggat actactaccg cgacttgttc 3180

gccatgctgc gcaagcacag ttcggctatt gattcggtga ccgtctgggg catcagcaac 3240

gcccgcagct ggctgcggac ctggccgatg gcccggccct gggagcagcc gcttccattc 3300

gacgatgatc tgcaggctgc accggcctac tggggaatcg tggatcccgc gaaactgccg 3360

gcccggcctg ccgacgtgct ggcaccccgc atcgccgatc agccggacgt ggtggccttt 3420

tcaaagcgcg ccggacgggt gaaggtggct tacccgttgc cctcggcgat cgacaccctc 3480

gacggcaaag tgccggtgga ctgttctccg cgccgcggca gcacctttgc cgtggggacc 3540

actgcggtca cctgcacggc cacggatgcc gccggcaaca cgaggaccag cagcttcgac 3600

gtggtggtga agaagcaccg gcaccacgga aggcactga 3639

<210> 4

<211> 1104

<212> DNA

<213> 列舍瓦里尔菌(Lechevalieria sp.)

<400> 4

atgaggtcgg ctcgtctggt catcgctttg ttcgctgccg tggcgttgtc ggcgccaccg 60

gcttcggcgg tctcggcccc gccggacgtg agcggccaca aacagacgtt gcgctcggca 120

gcgcccaagg gtttccacat cggcacggcc gtcgcgggcg gcggccacca cgagaaccag 180

ccgtacccgg accccttcac ctcggacagc gagtaccgga aggtgctggc cgcggagttc 240

aactcggtct cgcccgagaa ccagatgaag tgggagtaca tccacccgga gcgcggccgg 300

tacaacttcg gcatggccga cgccatcgtc cggttcgcca agcagaaccg gcaggtggtc 360

cgcgggcaca ccctgatgtg gcacagccag aacccggagt ggctggagca gggcgacttc 420

accgcggccg aactgcgcga gatcctgcgc gagcacatca tgaccgtggt cggccggtac 480

aagggcaagg tccagcagtg ggacgtggcc aacgagatct tcaccgacgc cggcgctctg 540

cggaccacgg agaacatctg gatccgtgaa ctcggtccgg gcatcgtggc ggacgcgttc 600

cgctgggcgc accaggccga ccccaaggcg aagctgttct tcaacgacta caacgtcgaa 660

agcgtcaacg cgaagagcga cgcgtactac gcgctgatca aggagctgcg cgccgcgggt 720

gtgcccgtgc acggcttctc cgcccaggcg cacctcagcc tggactacgg cttcccggac 780

gacctggagc gcaacctgaa gcggttcgcc gacctccggc tggagaccgc gatcaccgag 840

ctcgacgtgc ggatgaccct gcccgcgagc ggcgtgccga cggcggccca gctgcagcag 900

caggccgact actaccagcg cacgctcgcg gcctgcctga aggtcaggac ctgcaagtcg 960

ttcaccatct ggggcttcac cgacaagtac tcgtgggtgc cggtcttctt ccaggggcag 1020

ggtgcggcca cggtgatgtg gaacgacttc ggtcgcaagc aggcgtacta cgcgctgcgg 1080

tccacgctgg cgaagcgagc ctga 1104

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtgcagccgg aggaaaaacg 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gatgaaggca ggatccgggg t 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtctcggccc cgccggacgt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggctcgcttc gccagcgtgg 20

Claims

1.一种内切木聚糖酶突变体S06H03，其特征在于，所述的突变体S06H03的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的内切木聚糖酶突变体S06H03的编码基因s06h03，其特征在于，所述的编码基因s06h03的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的编码基因s06h03。

4.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求2所述的编码基因s06h03。

5.权利要求1所述的内切木聚糖酶突变体S06H03的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将权利要求2所述的编码基因s06h03和表达载体pEasy-E2相连接，并将连接产物转化大肠杆菌BL21-Gold(DE3)，获得包含编码基因s06h03的重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组突变内切木聚糖酶表达；

3)回收并纯化所表达的突变内切木聚糖酶S06H03。

6.权利要求1所述的内切木聚糖酶突变体S06H03或权利要求2所述的编码基因s06h03在食品制造和造纸中的应用。