CN102220303B

CN102220303B - 一种具有蛋白酶抗性的木聚糖酶XynAHJ3及其基因

Info

Publication number: CN102220303B
Application number: CN201110142554A
Authority: CN
Inventors: 黄遵锡; 周峻沛; 董岩岩; 唐湘华; 李俊俊; 许波; 高雅洁; 潘璐
Original assignee: Yunnan Normal University
Current assignee: Yunnan Normal University
Priority date: 2011-05-30
Filing date: 2011-05-30
Publication date: 2012-10-24
Anticipated expiration: 2031-05-30
Also published as: CN102220303A

Abstract

本发明涉及一种木聚糖酶XynAHJ3及其基因。本发明提供了一种来源于列舍瓦里尔菌（Lechevalieriasp.）的木聚糖酶XynAHJ3，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，且本发明提供了编码上述木聚糖酶的编码基因xynAHJ3，木聚糖酶基因xynAHJ3的重组载体和木聚糖酶基因xynAHJ3的重组菌株。本发明的木聚糖酶具有以下性质：最适pH6.0，在pH12.0时仍具有25%以上的酶活；最适温度70℃，在20℃和80℃下都具有酶活性；经0.1MpH4.0–11.0缓冲液在37℃下处理1h，仍能保持90%以上的活性；良好的热稳定性、乙醇抗性、SDS抗性和蛋白酶抗性；较好的水解各种自然底物而不水解纤维素的能力；可作为一种添加剂应用于饲料、食品、酿酒、纺织及造纸行业。

Description

一种具有蛋白酶抗性的木聚糖酶 XynAHJ3 及其基因

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说是一种具有SDS、乙醇和蛋白酶抗性的木聚糖酶XynAHJ3及其基因。

背景技术

植物细胞壁主要是由木质素（18–30%）、纤维素（28–50%）及半纤维素（20–30%）等物质组成。半纤维素是由D-木糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖或D-半乳糖以直链或支链聚合而成的多糖。木聚糖是半纤维素中最丰富的一种多糖，其主链由吡喃木糖以β-1,4 糖苷键连接而成，侧链上具有阿拉伯糖、葡糖醛酸、乙醚、香豆酸和肉桂酸等。完全水解木聚糖需要多种酶的协同作用，包括内切-1,4-β-D-木聚糖酶（endo-1,4-β-D-xylanase，EC 3.2.1.8）和β-D-木糖苷酶（β-D-xylosidase，EC 3.2.1.37）等（Collins et al. FEMS Microbiol Rev, 2005, 29: 3–23.）。内切-1,4-β-D-木聚糖酶可随机地切割木聚糖的主链骨架，生成木糖或低聚木糖，被认为是最重要的木聚糖酶和半纤维素酶之一。

根据氨基酸序列同源性，木聚糖酶主要归类于糖苷水解酶第10、11、39、43、52、62和67家族；内切-1,4-β-D-木聚糖酶主要归类于糖苷水解酶第10和11家族，其广泛存在于细菌、放线菌及真菌等的基因组中（Finn et al. Nucleic Acids Res, 2008, 36: D281–D288.）。目前，对木聚糖酶的研究多集中于木聚糖酶的pH活性、pH稳定性、温度作用范围和热稳定性方面，还未见同时具有SDS、乙醇和蛋白酶抗性的木聚糖酶的报导。

内切-1,4-β-D-木聚糖酶在饲料、食品、酿酒、纺织及造纸等领域都具有应用价值。饲料中添加木聚糖酶，可显著降低木聚糖分子大小，从而改善饲料性能并消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用；造纸工业中添加木聚糖酶，可取代有毒的漂白用化学物质但仍能使纸张达到漂白效果；食品中添加木聚糖，可改善食品性能；酿酒过程中添加木聚糖，可提高发酵效率、改善酒的色泽并增加酒精的产率；纺织业中添加木聚糖酶，可辅助原料脱胶等（Beg et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2001, 56: 326–338.）。目前，同时具有乙醇抗性、SDS抗性和蛋白酶抗性的木聚糖酶还未曾报导。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有SDS、乙醇和蛋白酶抗性的木聚糖酶XynAHJ3。

本发明的再一目的是提供编码上述木聚糖酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明所述木聚糖酶XynAHJ3可得自列舍瓦里尔菌（Lechevalieria sp.），如Lechevalieria aerocolonigenes ATCC 23870。XynAHJ3的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

该酶总共含367个氨基酸，其中N端23个氨基酸为其预测的信号肽序列 “MRSARLVIALFAAVALSAPPASA”（SEQ ID NO. 2）。

因此，成熟的木聚糖酶XynAHJ3的理论分子量为38.9kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。

本发明的木聚糖酶XynAHJ3的最适pH值为6.0，在pH12.0时仍具有25%以上的酶活；经pH4.0–11.0的缓冲液处理1h，酶活剩余90%以上；最适温度为70℃，在20℃和80℃下都具有酶活性；在50℃下稳定，在60℃下的半衰期~60min；可水解各种底物（包括燕麦木聚糖、山毛榉木聚糖、桦木木聚糖、木薯粉、玉米粉、麸皮、豆粕、棉粕和菜粕）而不水解纤维素；经胰蛋白酶和蛋白酶K处理1h后，XynAHJ3仍能分别保持105.9%和99.7%的酶活；经80%和95%（v/v）的乙醇处理1h后，XynAHJ3仍能分别保持98.3%和36.4%的酶活；10mM及100mM的SDS未能使XynAHJ3失活。

本发明提供了编码上述木聚糖酶的基因xynAHJ3，该基因序列如 SEQ ID NO. 4所示。

DNA序列结构分析结果表明，木聚糖酶基因xynAHJ3编码信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。

木聚糖酶基因xynAHJ3编码成熟肽的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。

本发明通过PCR的方法分离克隆了木聚糖酶XynAHJ3的编码基因xynAHJ3，其全长1104bp，起始密码为ATG，终止密码为TGA。经BLAST比对，该木聚糖酶基因xynAHJ3编码的氨基酸序列与GenBank中Streptomyces ghanaensis ATCC 14672来源的潜在木聚糖酶（EFE67696）具有最高的一致性，为70.7%；与确证活性的Streptomyces thermocarboxydus HY-15来源木聚糖酶（ACJ64840）的一致性为64.0%。目前，同时具有乙醇抗性、SDS抗性和蛋白酶抗性的木聚糖酶还未曾报导。

本发明还提供了包含上述木聚糖酶基因xynAHJ3的重组载体，优选为pET-xynAHJ3。将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的木聚糖酶基因插入到质粒pET-28a（+）上的EcoRI和XhoI限制性酶切位点之间，得到重组大肠杆菌表达质粒pET-xynAHJ3。

本发明还提供了包含上述木聚糖酶基因xynAHJ3的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/xynAHJ3。

本发明的制备木聚糖酶XynAHJ3的方法按以下步骤进行：

1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；

3）回收并纯化所表达的木聚糖酶XynAHJ3。

其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21（DE3），得到重组菌株BL21(DE3)/xynAHJ3。

本发明的木聚糖酶XynAHJ3最适pH6.0，在pH12.0时仍具有25%以上的酶活；最适温度70℃，在20℃和80℃下都具有酶活性；经0.1M pH4.0–11.0缓冲液37℃处理1h，仍能保持90%以上的活性；良好的热稳定性、乙醇抗性、SDS抗性和蛋白酶抗性；较好的水解各种自然底物而不水解纤维素的能力。以上性质表明木聚糖酶XynAHJ3可作为一种添加剂应用于饲料、食品、酿酒、纺织及造纸行业。

附图说明

图1：在大肠杆菌中表达的重组木聚糖酶的SDS-PAGE分析，其中，M：低分子量蛋白质Marker；1：纯化的重组木聚糖酶；2：含有重组木聚糖酶基因的大肠杆菌培养上清液。

图2：重组木聚糖酶的最适pH。

图3：重组木聚糖酶的pH稳定性。

图4：重组木聚糖酶的最适温度。

图5：重组木聚糖酶的热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：列舍瓦里尔菌（Lechevalieria sp.）同文献报道菌种性质，如Lechevalieria aerocolonigenes ATCC 23870；大肠杆菌表达载体pET-28a（+）及菌株Escherichia coli BL21（DE3）购于Novagen公司。

2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶、DNA聚合酶、连接酶和dNTP购自TaKaRa公司；燕麦木聚糖、桦木木聚糖和山毛榉木聚糖购自Sigma公司；其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

3、培养基：

LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000ml，pH自然（约为7）。固体培养基在此基础上加2.0%（w/v）琼脂。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1：列舍瓦里尔菌木聚糖酶基因xynAHJ3的克隆

提取列舍瓦里尔菌基因组DNA：将液体培养2d的菌液离心取菌体，加入1mL溶菌酶，37℃处理60min，再加入裂解液，70℃水浴裂解60min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

根据糖苷水解酶第10家族的保守序列（G-H-T-L-[V/I/L]-W-H和W-D-V-V-N-E）设计合成了简并引物GH10F和GH10R（表1）。

以列舍瓦里尔菌总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，44℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环后72℃保温10min。得到一约153bp片段，将该片段回收后与pMD 18-T载体相连，然后送北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司测序。

根据测序得到的核甘酸序列，分别设计上游和下游TAIL-PCR特异性引物各二条：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般20–30nt，退火温度在60–70℃。并将它们分别命名为usp1和usp2（上游特异性引物）及dsp1和dsp2（下游特异性引物；表1）。

通过TAIL-PCR得到已知基因序列片段的侧翼序列，扩增产物送北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司测序。测序结果与已知基因序列片段相拼接，得到木聚糖酶基因xynAHJ3，该基因序列如 SEQ ID NO. 4所示。

实施例2：重组木聚糖酶XynAHJ3的制备

将表达载体pET-28a（+）进行双酶切（EcoRI和XhoI），同时将编码木聚糖酶的基因xynAHJ3进行双酶切（EcoRI和XhoI），将上述酶切的木聚糖酶基因xynAHJ3与表达载体pET-28a（+）相连接，获得含有木聚糖酶基因xynAHJ3的重组质粒pET-xynAHJ3并转化大肠杆菌BL21（DE3），获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/xynAHJ3。

取含有重组质粒pET-xynAHJ3的E. coli BL21（DE3）菌株和只含有pET-28a（+）空质粒的E. coli BL21（DE3）菌株，以0.1%的接种量接种于LB（含50µg/mL Kan）培养液中，37℃快速振荡16h。然后将此活化的菌液以1%接种量接种到新鲜的LB（含50µg/mL Kan）培养液中，快速振荡培养约2–3h（OD₆₀₀达到0.6–1.0）后，加入终浓度0.7mM的IPTG诱导，于20℃继续振荡培养约20h或26℃振荡培养约8h。12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的pH7.0 Tris-Hcl缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的初酶液经13,000rpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose纯化目的蛋白。SDS-PAGE结果（图1）表明，重组木聚糖酶在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带。

实施例3：重组木聚糖酶XynAHJ3的活性分析

酶活性测定方法采用3,5－二硝基水杨酸（DNS）法：将底物溶于0.1M缓冲液中，使其终浓度为0.5%（w/v）；反应体系含100μL适量酶液，900μL底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应10min，然后加1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min，冷却至室温后在540nm波长下测定OD值。1个酶活单位（U）定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生1µmol木糖所需的酶量。

实施例4：重组木聚糖酶XynAHJ3的性质测定

1、重组木聚糖酶XynAHJ3的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

酶的最适pH测定：将实施例2纯化的木聚糖酶XynAHJ3在37℃和pH4.0–12.0的缓冲液下进行酶促反应。酶的pH稳定性测定：将纯化的酶液置于pH3.0–12.0的0.1M缓冲液中，在37℃下处理1h以上，然后在pH6.0及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。缓冲液为：0.1M McIlvaine buffer（pH3.0–8.0），0.1M Tris-HCl（pH8.0–9.0）和0.1M glycine-NaOH（pH9.0–12.0）。以桦木木聚糖为底物，反应10min，测定纯化的XynAHJ3的酶学性质。结果表明：XynAHJ3的最适pH为6.0，在pH12.0时仍具有25%以上的酶活（图2）；经pH4.0–11.0的缓冲液处理1h，酶活剩余90%以上（图3）。

2、重组木聚糖酶XynAHJ3的最适温度及热稳定性测定方法如下：

酶的最适温度测定：在pH6.0的缓冲液中，于20–90℃下进行酶促反应。酶的热稳定性测定：将同样酶量的酶液置于设定的温度中（50℃，60℃或70℃）处理0–60min后，在pH6.0及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以桦木木聚糖为底物，反应10min，测定纯化的XynAHJ3的酶学性质。结果表明：XynAHJ3的最适温度为70℃，在20℃和80℃下都具有酶活性（图4）；60℃下XynAHJ3的半衰期~60min，70℃下很快失活（图5）。

3、重组木聚糖酶XynAHJ3的动力学参数测定方法如下：

酶的动力学参数一级反应时间测定：在pH6.0及70℃下，以0.5%桦木木聚糖为底物，依次在酶促反应的1–30min内终止反应并测定酶活性，计算出酶活性与反应时间的比值，若在一定时间内该比值保持稳定，则此时间为一级反应时间。用0.05–1.0%桦木木聚糖为底物，在pH6.0、70℃和一级反应时间下，根据Lineweaver-Burk方法测定Km、Vmax和kcat。经测定，在pH6.0及70℃下，XynAHJ3对桦木木聚糖的K _m、V _max和k _cat分别为0.84 mg⁻¹ ml⁻¹、400.00 mmol min⁻¹ mg⁻¹和299.73 s⁻¹。

4、不同金属离子及化学试剂对XynAHJ3酶活的影响测定方法如下：

在酶促反应体系中加入10mM的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在37℃、pH6.0条件下测定酶活性。结果（表2）表明，10mM的Ag⁺和Hg²⁺可完全抑制XynAHJ3；Fe³⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Pb²⁺及10%（v/v）乙醇对XynAHJ3的抑制较强；Zn²⁺、Co²⁺及Fe²⁺对XynAHJ3的抑制较弱（剩余酶活>60%）；β-mercaptoethanol可使XynAHJ3的酶活提高约0.3倍；其余金属离子和化学试剂对XynAHJ3的影响很小，10mM及100mM的SDS未能使XynAHJ3失活。

表2. 金属离子及化学试剂对重组木聚糖酶XynAHJ3活力的影响

Figure 2011101425541100002DEST_PATH_IMAGE002

5、木聚糖酶XynAHJ3的抗蛋白酶和乙醇能力

酶的蛋白酶抗性：用相当于重组酶10倍（w/w）的胰蛋白酶（pH7.5）和蛋白酶K（pH7.5）在37℃对重组酶处理1h，然后在pH6.0及37℃下进行酶促反应，以在蛋白酶对应pH缓冲液中但未加蛋白酶的酶液作为对照。经胰蛋白酶和蛋白酶K处理1h后，XynAHJ3仍能分别保持105.9%和99.7%的酶活。酶的乙醇抗性：用80%和95%（v/v）的乙醇在37℃对重组酶处理1h，然后在pH6.0及37℃下进行酶促反应，以未加乙醇的酶液（加去离子水代替乙醇）作为对照。经80%和95%（v/v）的乙醇处理1h后，XynAHJ3仍能分别保持98.3%和36.4%的酶活。

6、木聚糖酶XynAHJ3的底物特异性

在70℃ pH6.0条件下，XynAHJ3对0.5%（w/v）的燕麦木聚糖、山毛榉木聚糖和桦木木聚糖的比活分别为346.56、328.05和287.33 U mg⁻¹；在37℃ pH6.0条件下，XynAHJ3对1%（w/v）的木薯粉、玉米粉、麸皮、豆粕、棉粕和菜粕的比活分别为0.65、0.50、0.05、0.04、0.03和0.02 U mg⁻¹。

序列表

<110> 云南师范大学

<120> 一种具有蛋白酶抗性的木聚糖酶XynAHJ3及其基因

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 367

<212> PRT

<213> 列舍瓦里尔菌（Lechevalieria sp.）

<400> 1

Met Arg Ser Ala Arg Leu Val Ile Ala Leu Phe Ala Ala Val Ala Leu

1 5 10 15

Ser Ala Pro Pro Ala Ser Ala Val Ser Ala Pro Pro Asp Val Ser Gly

20 25 30

His Lys Gln Thr Leu Arg Ser Ala Ala Pro Lys Gly Phe His Ile Gly

35 40 45

Thr Ala Val Ala Gly Gly Gly His His Glu Asn Gln Pro Tyr Pro Asp

50 55 60

Pro Phe Thr Ser Asp Ser Glu Tyr Arg Lys Val Leu Ala Ala Glu Phe

65 70 75 80

Asn Ser Val Ser Pro Glu Asn Gln Met Lys Trp Glu Tyr Ile His Pro

85 90 95

Glu Arg Gly Arg Tyr Asn Phe Gly Met Ala Asp Ala Ile Val Arg Phe

100 105 110

Ala Lys Gln Asn Arg Gln Val Val Arg Gly His Thr Leu Met Trp His

115 120 125

Ser Gln Asn Pro Glu Trp Leu Glu Gln Gly Asp Phe Thr Ala Ala Glu

130 135 140

Leu Arg Glu Ile Leu Arg Glu His Ile Met Thr Val Val Gly Arg Tyr

145 150 155 160

Lys Gly Lys Val Gln Gln Trp Asp Val Ala Asn Glu Ile Phe Thr Asp

165 170 175

Ala Gly Ala Leu Arg Thr Thr Glu Asn Ile Trp Ile Arg Glu Leu Gly

180 185 190

Pro Gly Ile Val Ala Asp Ala Phe Arg Trp Ala His Gln Ala Asp Pro

195 200 205

Lys Ala Lys Leu Phe Phe Asn Asp Tyr Asn Val Glu Ser Val Asn Ala

210 215 220

Lys Ser Asp Ala Tyr Tyr Ala Leu Ile Lys Glu Leu Arg Ala Ala Gly

225 230 235 240

Val Pro Val His Gly Phe Ser Ala Gln Ala His Leu Ser Leu Asp Tyr

245 250 255

Gly Phe Pro Asp Asp Leu Glu Arg Asn Leu Lys Arg Phe Ala Asp Leu

260 265 270

Arg Leu Glu Thr Ala Ile Thr Glu Leu Asp Val Arg Met Thr Leu Pro

275 280 285

Ala Ser Gly Val Pro Thr Ala Ala Gln Leu Gln Gln Gln Ala Asp Tyr

290 295 300

Tyr Gln Arg Thr Leu Ala Ala Cys Leu Lys Val Arg Thr Cys Lys Ser

305 310 315 320

Phe Thr Ile Trp Gly Phe Thr Asp Lys Tyr Ser Trp Val Pro Val Phe

325 330 335

Phe Gln Gly Gln Gly Ala Ala Thr Val Met Trp Asn Asp Phe Gly Arg

340 345 350

Lys Gln Ala Tyr Tyr Ala Leu Arg Ser Thr Leu Ala Lys Arg Ala

355 360 365

<210> 2

<211> 23

<212> PRT

<213> 列舍瓦里尔菌（Lechevalieria sp.）

<400> 2

Met Arg Ser Ala Arg Leu Val Ile Ala Leu Phe Ala Ala Val Ala Leu

1 5 10 15

Ser Ala Pro Pro Ala Ser Ala

20

<210> 3

<211> 344

<212> PRT

<213> 列舍瓦里尔菌（Lechevalieria sp.）

<400> 3

Val Ser Ala Pro Pro Asp Val Ser Gly His Lys Gln Thr Leu Arg Ser

1 5 10 15

Ala Ala Pro Lys Gly Phe His Ile Gly Thr Ala Val Ala Gly Gly Gly

20 25 30

His His Glu Asn Gln Pro Tyr Pro Asp Pro Phe Thr Ser Asp Ser Glu

35 40 45

Tyr Arg Lys Val Leu Ala Ala Glu Phe Asn Ser Val Ser Pro Glu Asn

50 55 60

Gln Met Lys Trp Glu Tyr Ile His Pro Glu Arg Gly Arg Tyr Asn Phe

65 70 75 80

Gly Met Ala Asp Ala Ile Val Arg Phe Ala Lys Gln Asn Arg Gln Val

85 90 95

Val Arg Gly His Thr Leu Met Trp His Ser Gln Asn Pro Glu Trp Leu

100 105 110

Glu Gln Gly Asp Phe Thr Ala Ala Glu Leu Arg Glu Ile Leu Arg Glu

115 120 125

His Ile Met Thr Val Val Gly Arg Tyr Lys Gly Lys Val Gln Gln Trp

130 135 140

Asp Val Ala Asn Glu Ile Phe Thr Asp Ala Gly Ala Leu Arg Thr Thr

145 150 155 160

Glu Asn Ile Trp Ile Arg Glu Leu Gly Pro Gly Ile Val Ala Asp Ala

165 170 175

Phe Arg Trp Ala His Gln Ala Asp Pro Lys Ala Lys Leu Phe Phe Asn

180 185 190

Asp Tyr Asn Val Glu Ser Val Asn Ala Lys Ser Asp Ala Tyr Tyr Ala

195 200 205

Leu Ile Lys Glu Leu Arg Ala Ala Gly Val Pro Val His Gly Phe Ser

210 215 220

Ala Gln Ala His Leu Ser Leu Asp Tyr Gly Phe Pro Asp Asp Leu Glu

225 230 235 240

Arg Asn Leu Lys Arg Phe Ala Asp Leu Arg Leu Glu Thr Ala Ile Thr

245 250 255

Glu Leu Asp Val Arg Met Thr Leu Pro Ala Ser Gly Val Pro Thr Ala

260 265 270

Ala Gln Leu Gln Gln Gln Ala Asp Tyr Tyr Gln Arg Thr Leu Ala Ala

275 280 285

Cys Leu Lys Val Arg Thr Cys Lys Ser Phe Thr Ile Trp Gly Phe Thr

290 295 300

Asp Lys Tyr Ser Trp Val Pro Val Phe Phe Gln Gly Gln Gly Ala Ala

305 310 315 320

Thr Val Met Trp Asn Asp Phe Gly Arg Lys Gln Ala Tyr Tyr Ala Leu

325 330 335

Arg Ser Thr Leu Ala Lys Arg Ala

340

<210> 4

<211> 1104

<212> DNA

<213> 列舍瓦里尔菌（Lechevalieria sp.）

<400> 4

atgaggtcgg ctcgtctggt catcgctttg ttcgctgccg tggcgttgtc ggcgccaccg 60

gcttcggcgg tctcggcccc gccggacgtg agcggccaca aacagacgtt gcgctcggca 120

gcgcccaagg gtttccacat cggcacggcc gtcgcgggcg gcggccacca cgagaaccag 180

ccgtacccgg accccttcac ctcggacagc gagtaccgga aggtgctggc cgcggagttc 240

aactcggtct cgcccgagaa ccagatgaag tgggagtaca tccacccgga gcgcggccgg 300

tacaacttcg gcatggccga cgccatcgtc cggttcgcca agcagaaccg gcaggtggtc 360

cgcgggcaca ccctgatgtg gcacagccag aacccggagt ggctggagca gggcgacttc 420

accgcggccg aactgcgcga gatcctgcgc gagcacatca tgaccgtggt cggccggtac 480

aagggcaagg tccagcagtg ggacgtggcc aacgagatct tcaccgacgc cggcgctctg 540

cggaccacgg agaacatctg gatccgtgaa ctcggtccgg gcatcgtggc ggacgcgttc 600

cgctgggcgc accaggccga ccccaaggcg aagctgttct tcaacgacta caacgtcgaa 660

agcgtcaacg cgaagagcga cgcgtactac gcgctgatca aggagctgcg cgccgcgggt 720

gtgcccgtgc acggcttctc cgcccaggcg cacctcagcc tggactacgg cttcccggac 780

gacctggagc gcaacctgaa gcggttcgcc gacctccggc tggagaccgc gatcaccgag 840

ctcgacgtgc ggatgaccct gcccgcgagc ggcgtgccga cggcggccca gctgcagcag 900

caggccgact actaccagcg cacgctcgcg gcctgcctga aggtcaggac ctgcaagtcg 960

ttcaccatct ggggcttcac cgacaagtac tcgtgggtgc cggtcttctt ccaggggcag 1020

ggtgcggcca cggtgatgtg gaacgacttc ggtcgcaagc aggcgtacta cgcgctgcgg 1080

tccacgctgg cgaagcgagc ctga 1104

<210> 5

<211> 69

<212> DNA

<213> 列舍瓦里尔菌（Lechevalieria sp.）

<400> 5

atgaggtcgg ctcgtctggt catcgctttg ttcgctgccg tggcgttgtc ggcgccaccg 60

gcttcggcg 69

<210> 6

<211> 1032

<212> DNA

<213> 列舍瓦里尔菌（Lechevalieria sp.）

<400> 6

gtctcggccc cgccggacgt gagcggccac aaacagacgt tgcgctcggc agcgcccaag 60

ggtttccaca tcggcacggc cgtcgcgggc ggcggccacc acgagaacca gccgtacccg 120

gaccccttca cctcggacag cgagtaccgg aaggtgctgg ccgcggagtt caactcggtc 180

tcgcccgaga accagatgaa gtgggagtac atccacccgg agcgcggccg gtacaacttc 240

ggcatggccg acgccatcgt ccggttcgcc aagcagaacc ggcaggtggt ccgcgggcac 300

accctgatgt ggcacagcca gaacccggag tggctggagc agggcgactt caccgcggcc 360

gaactgcgcg agatcctgcg cgagcacatc atgaccgtgg tcggccggta caagggcaag 420

gtccagcagt gggacgtggc caacgagatc ttcaccgacg ccggcgctct gcggaccacg 480

gagaacatct ggatccgtga actcggtccg ggcatcgtgg cggacgcgtt ccgctgggcg 540

caccaggccg accccaaggc gaagctgttc ttcaacgact acaacgtcga aagcgtcaac 600

gcgaagagcg acgcgtacta cgcgctgatc aaggagctgc gcgccgcggg tgtgcccgtg 660

cacggcttct ccgcccaggc gcacctcagc ctggactacg gcttcccgga cgacctggag 720

cgcaacctga agcggttcgc cgacctccgg ctggagaccg cgatcaccga gctcgacgtg 780

cggatgaccc tgcccgcgag cggcgtgccg acggcggccc agctgcagca gcaggccgac 840

tactaccagc gcacgctcgc ggcctgcctg aaggtcagga cctgcaagtc gttcaccatc 900

tggggcttca ccgacaagta ctcgtgggtg ccggtcttct tccaggggca gggtgcggcc 960

acggtgatgt ggaacgactt cggtcgcaag caggcgtact acgcgctgcg gtccacgctg 1020

gcgaagcgag cc 1032

Claims

1.一种木聚糖酶XynAHJ3，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

2.一种编码权利要求1所述的木聚糖酶XynAHJ3的木聚糖酶基因xynAHJ3，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。

3.一种包含权利要求2所述木聚糖酶基因xynAHJ3的重组载体。

4.一种包含权利要求2所述木聚糖酶基因xynAHJ3的重组菌株。