CN102559637B

CN102559637B - 一种具有低温活性的外切菊粉酶z2-5及其基因

Info

Publication number: CN102559637B
Application number: CN 201210062425
Authority: CN
Inventors: 黄遵锡; 彭沫溱; 周峻沛; 唐湘华; 李俊俊; 许波
Original assignee: Yunnan Normal University
Current assignee: Yunnan Normal University
Priority date: 2012-03-12
Filing date: 2012-03-12
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2032-03-12
Also published as: CN102559637A

Abstract

本发明涉及一种具有低温活性的外切菊粉酶Z2-5及其基因。来源于鞘氨醇杆菌（Sphingobacteriumsp.）的外切菊粉酶Z2-5的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，且本发明提供了编码上述外切菊粉酶的基因Z2-5，外切菊粉酶基因Z2-5的重组载体和外切菊粉酶基因Z2-5的重组菌株。本发明的外切菊粉酶具有以下性质：最适pH7；经0.1MpH9.0缓冲液在室温处理1h，仍能保持30%以上的活性；最适温度为40℃，在10℃和50℃下具有大约40%的酶活，在0℃下仍有大约10%的酶活；50℃处理1h仍能保持30%以上的酶活；能水解蔗糖及果聚糖等底物，属于果糖苷键水解的反应专一性。本发明的外切菊粉酶Z2-5可水解菊粉制备高果糖浆，用于食品行业中。

Description

一种具有低温活性的外切菊粉酶Z2-5及其基因

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说是一种具有低温活性的外切菊粉酶Z2-5及其基因。

背景技术

菊粉，又称菊糖，是一类天然果聚糖的混合物，它由果糖分子通过β-2,1糖苷键连接，聚合度从2-60，其终端为葡萄糖单位（ETTALI BIM et al. Appl Microbiol Biotechnol,1987,26: 13-20.）。它广泛存在于菊芋(Helianthus tuber osus)、牛蒡(Arctium) 、菊苣(Chicory intybus)等多种尚未开发利用的植物中（GoudaM K.Biological Sciences,2002,5(5): 589-593.）。

菊粉酶（Inulinase,EC3.2.1.7），学名β-2,1-D-果聚糖酶，又叫β-果聚糖酶，是一种能降解菊粉成果糖和低聚果糖的多糖水解酶。菊粉酶具有两种作用方式，一种为外切型，从非还原端逐个水解β-2,1糖苷键，生成一分子果糖和少一个果糖单位的果聚糖，最终生成果糖和葡萄糖；另一种为内切型，水解菊粉多糖链内部的β-2,1 糖苷键，产生降低了聚合度的低聚果糖。据不完全统计，产菊粉酶的丝状真菌有17属40余种，酵母菌有10属20余种，细菌有12属10余种（杨慧敏,贵州农业科学, 2004,32(3):83-84）。

外切菊粉酶可以菊芋作为原料发酵生产酒精，水解菊粉制备高果糖浆。高果糖浆（HFCS，High Fructose Corn Syrup），具有冷甜性，风味的不掩盖性，溶解度高，保健性好等特点，广泛应用于饮料，雪糕、冰淇淋，烘焙食品，罐头等食品中（张乐兴,广州食品工业科技,2003,19(1): 44-45）。以菊粉为原料，利用酸法和酶法皆可制备高果糖浆，酸法虽然产量高，成本低，但副产物多，色素重，分离精制困难。若利用菊粉酶制备果糖，其工艺简单，转化率高，产物纯，果糖含量可达90%以上。

具有低温活性的外切菊粉酶制剂可应用于低温生境和低温加工过程，但是，目前所报导的外切菊粉酶多为中温或高温酶，具有低温（0–20℃）活性的外切菊粉酶非常少。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有低温活性的外切菊粉酶Z2-5。

本发明的再一目的是提供编码上述外切菊粉酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明所述外切菊粉酶Z2-5可得自鞘氨醇杆菌（Sphingobacteriumsp.）。Z2-5的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

外切菊粉酶Z2-5总共含501个氨基酸，其中N端22个氨基酸为其预测信号肽序列“MIKLKKYGVLMLLLGVFGTSLA”，成熟的外切菊粉酶Z2-5含479个氨基酸。

本发明通过PCR的方法分离克隆了外切菊粉酶Z2-5的编码基因Z2-5，其全长1506bp，起始密码为ATG，终止密码为TAA。该基因序列如 SEQID NO. 2所示。经BLAST比对，该外切菊粉酶基因Z2-5编码的氨基酸序列与GenBank中Sphingobacterium spiritivorum ATCC 33300来源的潜在外切菊粉酶（ZP_03966816.1）具有最高的一致性，为55%；与确证活性的Bacillus subtilis来源外切菊粉酶(CAA29137.1)的一致性为47%。

本发明还提供了包含上述外切菊粉酶基因Z2-5的重组载体，优选为pEASY-E1-Z2-5。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的外切菊粉酶基因插入到质粒pEASY-E1上，得到重组大肠杆菌表达质粒pEASY-E1-Z2-5。

本发明还提供了包含上述外切菊粉酶基因Z2-5的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/ Z2-5。

本发明制备外切菊粉酶Z2-5的方法按以下步骤进行：

1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组外切菊粉酶表达；

3）回收并纯化所表达的外切菊粉酶Z2-5。

其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)，得到重组菌株BL21(DE3)/ Z2-5。

本发明的外切菊粉酶Z2-5的最适pH7.0；经0.1M pH9.0缓冲液在室温处理1h，仍能保持30%以上的活性；最适温度为40℃，在10℃和50℃下具有大约40%的酶活，在0℃下仍有大约10%的酶活；50℃处理1h仍能保持30%以上的酶活；能水解蔗糖，果聚糖等底物，属于果糖苷键水解的反应专一性。以上性质表明外切菊粉酶Z2-5在食品行业有较好的应用潜力。

附图说明

图1：在大肠杆菌中表达的重组外切菊粉酶的SDS-PAGE分析，其中，M：低分子量蛋白质Marker；1：纯化的重组外切菊粉酶。

图2：重组外切菊粉酶的最适pH。

图3：重组外切菊粉酶的pH稳定性。

图4：重组外切菊粉酶的最适温度。

图5：重组外切菊粉酶的热稳定性。

图6：不同金属离子及化学试剂对Z2-5酶活的影响测定

表2：重组外切菊粉酶Z2-5的底物专一性

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.）同文献报道菌种性质，如中国普通微生物菌种保藏管理中心菌株CGMCC 1.6855；菌株Escherichia coli BL21(DE3)购于Novagen公司。

2、酶类及其它生化试剂： DNA聚合酶及dNTP购自TaKaRa公司；pEASY-E1购自北京全式金生物技术有限公司；菊粉购自Sigma公司；其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

3、培养基：

LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000ml，pH自然（约为7）。固体培养基在此基础上加2.0%（w/v）琼脂。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1：鞘氨醇杆菌外切菊粉酶Z2-5的克隆

提取鞘氨醇杆菌基因组DNA：将液体培养2d的菌液离心取菌体，加入1mL溶菌酶，37℃处理60min，再加入裂解液，70℃水浴裂解60min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

根据外切菊粉酶的保守氨基酸序列（H-N-W-M-N-D-P-N-G和R-D-P-K-V- F- W-H-E-Q-S ）设计合成了简并引物Inu32F和Inu32R（表1）。

以鞘氨醇杆菌总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，44℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环后72℃保温10min。得到一约430bp片段，将该片段回收后与pMD 18-T载体相连，然后送北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司测序。根据测序得到的核甘酸序列，设计热不对称交错PCR（简称TAIL-PCR）上游特异性引物4条，并将它们分别命名为usp1、usp2、usp3、usp4；另设计下游特异性引物2条，并将它们分别命名为dsp1、dsp2（表1）。特异性引物设计方向为需要扩增的未知区

表1. 外切菊粉酶Z2-5的克隆与表达引物

域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp4的位置设计在sp3的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度为21–23nt，以usp1、usp2、dsp1、dsp2为引物，退火温度为53℃；以usp1、usp2为引物，退火温度分别为60℃和50℃。通过TAIL-PCR得到已知基因序列片段的侧翼序列，扩增产物送北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司测序。测序结果与已知基因序列片段相拼接，得到外切菊粉酶基因Z2-5，该基因序列如 SEQ ID NO. 2所示。

实施例2：重组外切菊粉酶Z2-5的制备

以Z2-5InuEF和Z2-5InuER为引物对（表1），鞘氨醇杆菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，45℃退火30sec，72℃延伸2min，40个循环后72℃保温5min，25℃保温3min。PCR结果得到外切菊粉酶基因Z2-5编码成熟肽的核苷酸序列。将编码外切菊粉酶的基因Z2-5编码成熟肽的核苷酸序列与表达载体pEASY-E1相连接，获得含有外切菊粉酶基因Z2-5的重组质粒pEASY-E1-Z2-5并转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/ Z2-5。

取含有重组质粒pEASY-E1-Z2-5的E. coli BL21（DE3）菌株和只含有pEASY-E1空质粒的E. coli BL21(DE3)菌株，以0.1%的接种量接种于LB（含50μg/mL Amp）培养液中，37℃快速振荡16h。然后将此活化的菌液以1%接种量接种到新鲜的LB（含50μg/mL Amp）培养液中，快速振荡培养约2–3h（OD₆₀₀达到0.6–1.0）后，加入终浓度0.7mM的IPTG诱导，于20℃继续振荡培养约20h或26℃振荡培养约8h。12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的pH7.0 Tris-Hcl缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的初酶液经12,000rpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose纯化目的蛋白。SDS-PAGE结果（图1）表明，重组外切菊粉酶在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带。

实施例3：纯化的重组外切菊粉酶Z2-5的性质测定

1、重组外切菊粉酶Z2-5的活性分析

实施例2纯化的重组外切菊粉酶Z2-5的活性测定方法采用3,5－二硝基水杨酸（DNS）法：将底物溶于0.1M缓冲液中，使其终浓度为0.5%（w/v）；反应体系含100μL适量酶液，900μL底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应10min，然后加1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min，冷却至室温后在540nm波长下测定OD值。1个酶活单位（U）定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生1μmol还原糖所需的酶量。

2、重组外切菊粉酶Z2-5的最适pH和pH稳定性的测定：

酶的最适pH测定：将外切菊粉酶Z2-5在37℃下和0.1M pH4.0-9.0的缓冲液中进行酶促反应。酶的pH稳定性测定：将纯化的酶液置于0.1MpH4.0-10.0的缓冲液中，在室温下处理1h以上，然后在pH7.0及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。缓冲液为0.1M pH4.0-5.0的醋酸–醋酸钠缓冲液，0.1M pH5.0-8.0的柠檬酸–磷酸氢二钠缓冲液，0.1M pH8.0-9.0的甘氨酸–氢氧化钠缓冲液。以菊粉为底物，反应10min，测定纯化的Z2-5的酶学性质。结果表明：Z2-5的最适pH为7.0（图2）；经pH5.0-10.0的缓冲液处理1h，酶活剩余约30%（图3）。

3、重组外切菊粉酶Z2-5的最适温度及热稳定性测定：

酶的最适温度测定：在pH7.0的缓冲液中，于0-60℃下进行酶促反应。酶的热稳定性测定：将同样酶量的酶液置于设定的温度中（30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃）处理1h后，在pH7.0及40℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以菊粉为底物，反应10min，测定纯化的Z2-5的酶学性质。结果表明：Z2-5的最适温度为40℃，在0℃下有约10%的酶活，在10℃和20℃下分别具有大约40%和60%的酶活（图4）；45℃耐受1h酶活剩余约80%，50℃耐受1h酶活剩余30%左右（图5）。

4、重组外切菊粉酶Z2-5的动力学参数测定：

酶的动力学参数一级反应时间测定：在pH7.0及40℃下，以0.3%菊粉为底物，依次在酶促反应的1-15min内终止反应并测定酶活性，计算出酶活性与反应时间的比值，若在一定时间内该比值保持稳定，则此时间为一级反应时间。用0.07-1.25mM菊粉为底物，在pH7、40℃和一级反应时间下，根据Lineweaver-Burk方法测定K_m、V_max。经测定，在pH7及40℃下，Z2-5对菊粉的K_m、V_max分别为1.4 mM、138.9 U/mg。

5、不同金属离子及化学试剂对Z2-5酶活的影响测定：

在酶促反应体系中加入10mM的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在40℃、pH7.0条件下测定酶活性。结果（图6）表明，10mM的Hg²⁺可完全抑制Z2-5；Fe³⁺，Pb²⁺，Cu²⁺对Z2-5的抑制较强；EDTA，K⁺，Na⁺对Z2-5的抑制较弱；Fe²⁺和Mn²⁺可使Z2-5的酶活分别提高大约1.5倍和2倍。

6、重组外切菊粉酶Z2-5的底物专一性：

用0.1M pH7.0的柠檬酸–磷酸氢二钠缓冲液配制0.5%（w/v）菊粉、蔗糖、果聚糖及淀粉，在pH7.0及40℃下测定酶活力，结果Z2-5对四种底物都有酶活，以菊粉为底物的酶活是以蔗糖为底物的0.097倍，说明Z2-5属于果糖苷键水解的反应专一性（表2）。

表2

SEQUENCE LISTING

<110> 云南师范大学

<120> 一种具有低温活性的外切菊粉酶Z2-5及其基因

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 501

<212> PRT

<213> 鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.）

<400> 1

Met Ile Lys Leu Lys Lys Tyr Gly Val Leu Met Leu Leu Leu Gly Val Phe Gly Thr Ser

1 10 20

Leu Ala Gln Thr Gly Gln His Lys Gln Gly Asp Pro Glu Glu Lys Tyr Arg Pro Leu Tyr

21 30 40

His Phe Thr Pro Gln Gln Gly Trp Met Asn Asp Pro Asn Gly Leu Val Tyr Leu Asp Gly

41 50 60

Asn Tyr His Leu Phe Phe Gln His Asn Pro Glu Lys Pro Val Trp Gly Pro Met His Trp

61 70 80

Gly His Ala Ile Ser Lys Asp Leu Ile His Trp Asp Glu Gln Lys Ile Ala Leu Tyr Pro

81 90 100

Asp Ser Leu Gly Thr Ile Phe Ser Gly Ser Ala Val Ile Asp Lys Asp Asn Thr Ala Gly

101 110 120

Phe Gly Lys Gly Ala Met Val Ala Ile Phe Thr His His Asn His Gln Glu Glu Asp Arg

121 130 140

Lys Thr Gly Leu His Gln Asn Gln Ser Leu Ala Tyr Ser Leu Asp Lys Gly Leu Thr Trp

141 150 160

Thr Lys Tyr Lys Gly Asn Pro Val Leu Pro Asn Pro Gly Ile Trp Asp Phe Arg Asp Pro

161 170 180

Lys Val Met Trp His Val His Ser Gln Arg Trp Ile Met Thr Leu Ala Thr Lys Asp Cys

181 190 200

Ile Thr Phe Tyr Ser Ser Lys Asp Leu Lys Thr Trp Gln Lys Glu Ser Glu Phe Gly Lys

201 210 220

Glu Val Gly Ala His Gly Gly Val Trp Glu Cys Pro Asp Leu Ile Pro Met Asp Tyr Lys

221 230 240

Gly Thr Thr Lys Trp Val Leu Leu Val Ser Ile Asn Pro Gly Gly Pro Asn Gly Gly Ser

241 250 260

Val Thr Gln Tyr Phe Val Gly Asp Phe Asp Gly His Gln Phe Arg Thr Thr Asp Thr Lys

261 270 280

Ile Lys Trp Leu Asp Trp Gly Pro Asp Asn Tyr Ala Gly Val Thr Trp Ser Asn Leu Gly

281 290 300

Asp Arg Gln Leu Met Ile Gly Trp Met Ser Asn Trp Gln Tyr Ala Asn Val Val Pro Thr

301 310 320

Thr Lys Trp Arg Ser Ser Ser Thr Ile Pro Arg Val Leu Ser Leu Gly Lys Val Gly Gln

321 330 340

Ser Phe Tyr Val Ala Ser Thr Val Pro Lys Glu Ile Glu Thr Ala Phe Arg Pro Leu Lys

341 350 360

Lys Tyr His Gly Gly Gly Thr Lys Glu Val Ser Phe Glu Gln His Leu Pro Gln Ala Tyr

361 370 380

Arg Leu Asp Leu Lys Asp Leu Lys Gln Gln Ala Phe Lys Val Ile Leu Ser Asn Glu Ser

381 390 400

Gly Asp Glu Leu Val Ile Gly Tyr Arg Glu Asp Gln Asn Ala Tyr Tyr Ile Asp Arg Ser

401 410 420

Lys Ser Gly Glu Val Ser Phe Asn Gly Glu Phe Pro Lys Ile Ala Leu Ala Gln Arg Pro

421 430 440

Leu Asn Lys Gly Ala Leu Ser Phe Ser Leu Tyr Val Asp Val Ser Ser Val Glu Leu Phe

441 450 460

Ala Asp Glu Gly Leu Thr Val Met Thr Ser Leu Phe Phe Pro Asn Lys Pro Ile Thr Lys

461 470 480

Leu Arg Ile Val Gly Asp Lys Lys Leu Glu Phe Gln Glu Ile Gly Ile Ser Ala Phe Lys

481 490 500

Arg

501

<210> 2

<211> 1506

<212> DNA

<213> 鞘氨醇杆菌（Sphingobacteriumsp.）

<400> 2

1 atgataaaat taaagaaata cggtgtttta atgctcctgc taggtgtttt tggtacaagt

61 ctggcacaga cgggacagca taaacaagga gatcccgaag agaagtatcg cccactttac

121 cattttacac cacagcaggg ttggatgaac gatcccaatg gactggttta tctggacggt

181 aattatcatc ttttttttca gcataatccc gaaaaacccg tttgggggcc tatgcattgg

241 ggccatgcga tcagtaaaga tttaatccat tgggacgagc agaagatcgc attgtacccc

301 gatagtttgg ggactatttt ctccggtagt gctgtaatcg ataaagataa cacggcaggt

361 tttggaaaag gtgctatggt cgccattttt acccatcaca atcatcagga agaggatcga

421 aaaacaggat tgcatcaaaa tcaaagtttg gcttatagtt tggacaaggg ccttacctgg

481 acaaagtata aaggcaatcc ggtattgcca aaccctggta tatgggattt cagagatcca

541 aaggtgatgt ggcatgtgca tagccagcgt tggattatga ccttggctac aaaagattgt

601 attactttct attcttccaa agatttgaaa acatggcaga aggaaagtga gtttggcaaa

661 gaggtggggg cccatggtgg tgtctgggaa tgccctgatc ttatccccat ggattacaaa

721 ggaactacaa aatgggtttt gttggtgagc atcaatccag gtggacccaa cggtggctcg

781 gtgacacaat attttgtggg tgactttgat gggcatcagt tccgaacaac ggatactaaa

841 ataaagtggt tggattgggg acccgataac tatgccggcg taacctggag taacctaggg

901 gataggcaac tgatgattgg ctggatgagc aactggcaat atgccaatgt ggttcctacc

961 acaaaatggc gttcctcctc aaccatacct cgtgttttat ctttaggaaa agttggacag

1021 tcgttctacg ttgcgagtac tgtgcccaaa gaaattgaaa ccgcatttcg tccactaaaa

1081 aaataccatg gcggtggaac gaaggaagtt tcgttcgagc aacatctccc acaagcgtac

1141 cgtttggacc tcaaagattt gaagcagcag gcttttaaag tcatcttatc gaatgaatct

1201 ggcgacgagt tggttattgg ttatcgtgaa gaccaaaatg cctattatat tgatcgttct

1261 aagtccggtg aagtgtcttt taatggagaa tttccaaaga tagcgttggc ccaacggccg

1321 ctaaataagg gagcactttc tttcagtttg tatgttgatg tgagctctgt ggaacttttt

1381 gcagacgagg ggctaacggt aatgaccagt ttattttttc cgaacaagcc gataaccaag

1441 ctgcgtatcg tgggagataa aaagttggag tttcaggaaa tcggtatttc tgcatttaag

1501 agataa

Claims

1.一种具有低温活性的外切菊粉酶Z2-5，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1中的第23-501位所示。

2、一种编码权利要求1所述的具有低温活性外切菊粉酶Z2-5的外切菊粉酶基因Z2-5，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2中的67-1503位所示。

3、一种包含权利要求2所述的外切菊粉酶基因Z2-5的重组载体。

4、一种包含权利要求2所述的外切菊粉酶基因Z2-5的重组菌株。