CN109182309B - 一种耐热型氨肽酶及其高产毕赤酵母工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种耐热型氨肽酶及其高产毕赤酵母工程菌。本发明筛选获得耐热氨肽酶突变基因A‑2，将A‑2构建到pPIC9质粒上，并转化到毕赤酵母JC308，筛选得到高表达耐热氨肽酶的重组菌P‑2，其摇瓶发酵液氨肽酶酶活可达2200U/mL，较原始氨肽酶提高57.14％。P‑2所表达的耐热氨肽酶在80℃保温处理1h，突变体相对酶活力仍剩余85％左右，90℃处理1h，相对酶活仍存留45％以上，耐热性良好。

Description

一种耐热型氨肽酶及其高产毕赤酵母工程菌

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种耐热型氨肽酶及高产耐热氨肽酶的毕赤酵母工程菌。

背景技术：

氨肽酶是一类从多肽链的N端顺序水解氨基酸，使氨基酸逐个游离出来的酶，不仅能水解多肽，而且能水解完整的蛋白质分子。在许多生物中发现了各种性质的氨肽酶。它不仅存在于高等动物的胰脏、肠液中，也广泛分布于多种真菌、细菌和原生动物体内，一些真菌和细菌的种类还能向胞外分泌这种酶。

氨肽酶有很多种，不同的氨肽酶对N端氨基酸残基的水解能力表现具有差异性。同一种氨肽酶对不同的N端氨基酸残基的水解能力也不同。

根据不同氨肽酶对水解N端氨基酸残基专一性程度的不同，可以将氨肽酶分为两大类：一类氨肽酶对N端氨基酸残基专一性低，能水解几乎所有的氨基酸残基，如亮氨酰氨肽酶(LAP)、赖氨酰氨肽酶(Pep N)、苯丙氨酰氨肽酶(Pep M)；区分这类氨肽酶可依据它们对不同氨基酸残基的水解速度的快慢，如亮氨酰氨肽酶水解末端亮氨酸残基速度最快，而赖氨酰氨肽酶水解末端赖氨酸残基速度最快。另一类氨肽酶对N端氨基酸残基有严格的专一性，只能特异地水解某一种或几种氨基酸残基，如Pep A只能水解天冬酰氨和谷氨酰氨残基；其中包含一类很重要的脯氨肽酶，Pep X(水解末端第二位为脯氨酸残基的肽)、Pep P(水解末端脯氨酸残基)、Pep I(水解末端脯氨酸亚氨基)。

由于动植物中的氨肽酶含量低，提取成本高，所以通过微生物发酵生产氨肽酶既高效且低廉。产氨肽酶的微生物的种类很多，细菌、酵母、霉菌中通常都含有一定量的氨肽酶。但各种微生物中氨肽酶的含量和种类有很大的差异。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种耐热性提高的氨肽酶突变体及其毕赤酵母工程菌菌株。

所述氨肽酶突变体来自一株经紫外诱变获得的枯草芽孢杆菌CA23，将氨肽酶突变体编码基因A-2从CA23中克隆并构建重组质粒后，在毕赤酵母JC308中进行表达，从而获得毕赤酵母工程菌菌株。

在本发明中采用如下定义：

1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

2.氨肽酶突变体的标识

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体中突变的氨基酸。如Leu181Arg，表示位置181的氨基酸由野生型的Leu替换成Arg，位置的编号对应于SEQ IDNo.2中野生型氨肽酶的氨基酸序列编号；同样采用“原始碱基位置替换的碱基”来表示突变体中突变的碱基，位置的编号对应于SEQ ID No.1中野生型氨肽酶的核苷酸序列编号。

在本发明中，A-1表示野生型氨肽酶的编码基因，A-2表示氨肽酶突变体的编码基因，信息如下表。

所述氨肽酶突变体的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示；

所述氨肽酶突变编码基因A-2的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示；

用于表达所述氨肽酶的表达载体为pPIC9，用于所述表达载体转化的微生物宿主细胞为毕赤酵母JC308；

所述毕赤酵母工程菌是将氨肽酶突变编码基因A-2连接表达载体pPIC9，并在毕赤酵母JC308中表达所得；

本发明的实验步骤具体如下：

1、将氨肽酶突变体的编码基因A-2进行酶切，连接至表达载体pPIC9，得到重组载体；

2、将重组载体转化入毕赤酵母JC308中，得到新型氨肽酶的生产菌株JC308/pPIC9-A-2；

3、以JC308/pPIC 9-A-2为生产菌株发酵生产氨肽酶；

所述氨肽酶突变体的酶学性质如下：

(1)pH:pH 6.0-9.0酶活稳定，最适作用pH8.0。

(2)温度：60℃-80℃酶活稳定，最适作用温度为75℃。

(3)耐热性：该酶在80℃保温1h酶活仍残留85％以上，90℃保温1h酶活仍存留45％以上。

有益效果：

1、本发明公布了一种全新的氨肽酶突变体，该突变体具有酶活高，热稳定性好的特点。该突变体摇瓶发酵液酶活可达2200U/mL，较原始氨肽酶提高57.14％；

2、本发明获得的氨肽酶在80℃保温1h酶活仍残留85％以上，90℃保温1h酶活仍存留45％以上。

附图说明：

图1菌落PCR鉴定电泳图；

其中，M为Marker；1为菌落PCR产物；

图2氨肽酶最适pH曲线；

图3氨肽酶最适温度曲线；

图4氨肽酶温度稳定性曲线。

具体实施方式：

通过具体实施例对本发明作出更详尽的说明，仅作为举例说明，而不作为对本发明实施范围的限定。对于本领域技术人员，在本发明原理基础上还可做出的改进，这些改进也应视为本发明保护的范围。本实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可参照《分子克隆实验指南》。

实施例1氨肽酶基因A-2的获得

本公司保藏的一株能产氨肽酶的枯草芽孢杆菌LD02，经紫外诱变筛选得到一株具有耐热氨肽酶活性的菌株CA23，根据其突变基因A-2的核苷酸序列设计PCR引物，5'端加入酶切位点Xho I，3'端加入酶切位点Not I，通过PCR得到突变基因A-2，其核苷酸序列为SEQID No.3。引物序列如下：

A-2-F 5'-CCGCTCGAGATGAAGGTACCAAAAACAAT-3'(SEQ ID No.5)

A-2-R 5'-TTGCGGCCGCCTAGCCGTCAGAGCGGTCTT-3'(SEQ ID No.6)

此外，上述基因也可通过全序列合成的方法获得。

实施例2重组载体pPIC9-A-2的构建

分别对基因A-2和质粒pPIC9进行Xho I和Not I酶切，回收产物，将回收后的A-2和pPIC9按比例混合，用T4连接酶在16℃条件下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化产物涂布在LB(含氨苄霉素)固体平板上，37℃倒置培养过夜，挑取单菌落至LB液体培养基，37℃培养，菌液进行菌落PCR，电泳鉴定结果如图1，测序结果显示序列正确(SEQID No.3)，序列大小1.5kb。抽提重组质粒pPIC9-A-2待用。

实施例3重组质粒转化毕赤酵母

1.毕赤酵母JC308感受态细胞的制备

1)挑取毕赤酵母平板单菌落，接种于5mL的YPD培养基，30℃，220r/min振荡过夜；

2)取0.5mL的过夜培养的菌液，接种于50mL新鲜配制的YPD培养基，30℃，220r/min振荡培养，使OD600值达到1.3-1.5；

3)取上述培养液于4℃，3000r/min，离心5min；

4)弃去上清液，加入50mL冰上预冷的无菌水，振荡重悬菌体；

5)4℃，3000r/min，离心5min，弃去上清液，吸干管壁残余液体，加入25mL冰上预冷的无菌水，振荡重悬菌体；

6)4℃，3000r/min，离心5min，弃去上清液，吸干管壁残余液体，加入10mL冰上预冷的1mol/L的无菌山梨醇溶液，重悬菌体；

7)4℃，3000r/min，离心5min，弃去上清液，吸干管壁残余液体，加入1mL冰上预冷的1mol/L的无菌山梨醇溶液(预先加入甘油至终浓度15％)，振荡混匀。

8)分装100μL/管至无菌EP罐，-70℃冰箱冰冻保藏(新鲜制备的感受态细胞效果更佳)。

2.线性化质粒的转化

抽提得到的重组质粒pPIC9-A-2用Sal I进行单酶切，得到线性化质粒。取新鲜制备的(或-70℃冻存的)感受态细胞置于冰浴中，使其完全解冻。

1)将100μL感受态细胞移出至一新的无菌EP管中，加入10μL线性化质粒，轻吹混匀，吸出转移到0.2cm型的电穿孔转化杯中；

2)转化杯置于冰浴中5-10分钟，保持低温。

3)电穿孔转化电击条件：1500V，200Ω，25μF，放电时间5ms左右，一次电击。

4)电击后，马上在电击转化杯中加入1mL 4℃预冷的1mol/L的山梨醇溶液，用移液枪吹打均匀，置于冰浴中；

5)在超净工作台上无菌操作涂布MD培养基(1.34％YNB；4×10^-5％生物素；2％葡萄糖平板)，100-200μL/板，涂好的平板30℃倒置培养3-4天；

6)在MD平板上筛选得到两株重组菌，经菌落PCR得到目的序列，测序比对显示为目的基因A-2的核苷酸序列(SEQ ID No.3)，即所得菌株为含有pPIC9-A-2的重组菌，分别命名为P-1，P-2。

实施例4含有重组质粒pPIC9-A-2的酵母菌的诱导表达

BMGY培养基配方：1％酵母浸出物，2％蛋白胨，0.1mol/L pH6.0磷酸盐缓冲液，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，1％甘油。

BMMY培养基配方：1％酵母浸出物，2％蛋白胨，0.1mol/L pH6.0磷酸盐缓冲液，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，0.5％甲醇。

将重组菌P-1，P-2以及用同样方法以原始基因A-1构建的重组菌株pPIC9-A-1分别接种于装有30mL BMGY培养基的三角瓶中，30℃，220r/min培养至OD600为10左右，离心收集菌体，用35mL的BMMY诱导培养基重悬菌体，并在30℃，220r/min条件下继续培养48h，发酵液离心后测定上清中的氨肽酶酶活，结果如下表。

菌株	氨肽酶酶活/U·mL<sup>-1</sup>
		pPIC9-A-1	1412
P-1	2215
		P-2	2209

实施例5氨肽酶的酶学性质

酶活采用LNA(亮氨酸对硝基苯胺)法进行测定，酶活力定义：50℃，每分钟分解L-亮氨酸-对硝基苯胺产生1μmol的对硝基苯胺所需酶量即为一个酶活单位。

(1)最适作用pH

以实施例4所得P-2发酵液上清液为样品，以测得的氨肽酶最高酶活为基准，测定不同pH条件下的酶活力。由图2可知，该氨肽酶在pH范围6.0-9.0酶活稳定，最适作用pH8.0。

(2)最适作用温度

以实施例4所得P-2发酵液上清液为样品，测定不同温度下的酶活力，以测得的氨肽酶最高酶活为基准，计算相对酶活，结果如图3所示，P-2所产氨肽酶60℃-80℃酶活稳定，最适作用温度为75℃。

(3)热稳定性

以实施例4所得pPIC9-A-1和P-2发酵液上清液为样品，以不作处理的氨肽酶酶活为100％基准，样品分别在50℃-90℃下保温处理1h，测酶活，计算剩余酶活，从图4中可以看出，80℃时，突变体相对酶活剩余85％左右，90℃时，酶活仍存留45％以上，与原始基因A-1构建的重组菌pPIC9-A-1所产氨肽酶相比，热稳定性有很大提高，说明该重组菌P-2所产氨肽酶具有良好的耐热性。

序列表

<110> 山东隆科特酶制剂有限公司

<120> 一种耐热型氨肽酶及其高产毕赤酵母工程菌

<130> 1

<141> 2018-10-11

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1458

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌LD02()

<400> 1

atgagcggac acagccccac gcgcggggcc atgcaggtgg ccatgaacgg taaggcccgc 60

aaagaggcgg tgcagactgc ggctaaggaa ctcctcaagt tcgtgaaccg gagtccctct 120

cctttccatg ctgtggctga atgccgcaac cgccttctcc aggctggctt cagtgaactc 180

aaggagactg agaaatggaa tattaagccc gagagcaagt acttcatgac caggaactcc 240

tccaccatca tagcttttgc tgtagggggc cagtacgttc ctggcaatgg cttcagcctc 300

atcggggccc acacggacag cccctgcctc cgggtgaaac gtcggtctcg ccgcagccag 360

gtgggcttcc agcaagtcgg tgtggagacc tatggtggtg ggatctggag cacctggttt 420

gaccgtgacc tgactctggc tggacgcgtc attgtcaagt gccctacctc aggtcggctg 480

gagcagcagc tggtgcacgt ggagcggccc attcttcgca tcccacacct ggccatccat 540

ctgcagcgaa atatcaacga gaactttggg cccaacacag agatgcatct agtccccatt 600

cttgccacag ccatccagga ggagctggag aaggggactc ctgagccagg gcctctcaat 660

gctgtggatg agcggcacca ttcggtcctc atgtccctgc tctgtgccca tctggggctg 720

agccccaagg acatagtgga gatggagctc tgccttgcag acacccagcc tgcggtcttg 780

ggtggtgcct atgatgagtt catctttgct cctcggctgg acaatctgca cagctgcttc 840

tgtgccctgc aggccttgat agattcctgt gcaggccctg gctccctggc cacagagcct 900

cacgtgcgca tggtcacact ctatgacaac gaagaggtgg ggtctgagag tgcacaggga 960

gcacagtcac tgctgacaga gctggtgctg cggcggatct cagcctcgtg ccagcacccg 1020

acagccttcg aggaagccat acccaagtcc ttcatgatca gcgcagacat ggcccatgct 1080

gtgcatccca actacctgga caagcatgag gagaaccacc ggcctttatt ccacaagggc 1140

cccgtgatca aggtgaacag caagcaacgc tatgcttcaa acgcggtgtc agaggccctg 1200

atccgagagg tggccaacaa agtcaaggtc cccctgcagg atctcatggt ccggaatgac 1260

accccctgtg gaaccaccat tggacctatc ttggcttctc ggctggggct gcgggtgctg 1320

gatttaggca gcccccaact ggccatgcac tctatccggg agatggcctg caccacagga 1380

gtcctccaga ccctcaccct cttcaagggc ttctttgagc tgttcccttc tctaagccat 1440

aatctcttag tggattga 1458

<210> 2

<211> 485

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌LD02()

<400> 2

Met Ser Gly His Ser Pro Thr Arg Gly Ala Met Gln Val Ala Met Asn

1 5 10 15

Gly Lys Ala Arg Lys Glu Ala Val Gln Thr Ala Ala Lys Glu Leu Leu

20 25 30

Lys Phe Val Asn Arg Ser Pro Ser Pro Phe His Ala Val Ala Glu Cys

35 40 45

Arg Asn Arg Leu Leu Gln Ala Gly Phe Ser Glu Leu Lys Glu Thr Glu

50 55 60

Lys Trp Asn Ile Lys Pro Glu Ser Lys Tyr Phe Met Thr Arg Asn Ser

65 70 75 80

Ser Thr Ile Ile Ala Phe Ala Val Gly Gly Gln Tyr Val Pro Gly Asn

85 90 95

Gly Phe Ser Leu Ile Gly Ala His Thr Asp Ser Pro Cys Leu Arg Val

100 105 110

Lys Arg Arg Ser Arg Arg Ser Gln Val Gly Phe Gln Gln Val Gly Val

115 120 125

Glu Thr Tyr Gly Gly Gly Ile Trp Ser Thr Trp Phe Asp Arg Asp Leu

130 135 140

Thr Leu Ala Gly Arg Val Ile Val Lys Cys Pro Thr Ser Gly Arg Leu

145 150 155 160

Glu Gln Gln Leu Val His Val Glu Arg Pro Ile Leu Arg Ile Pro His

165 170 175

Leu Ala Ile His Leu Gln Arg Asn Ile Asn Glu Asn Phe Gly Pro Asn

180 185 190

Thr Glu Met His Leu Val Pro Ile Leu Ala Thr Ala Ile Gln Glu Glu

195 200 205

Leu Glu Lys Gly Thr Pro Glu Pro Gly Pro Leu Asn Ala Val Asp Glu

210 215 220

Arg His His Ser Val Leu Met Ser Leu Leu Cys Ala His Leu Gly Leu

225 230 235 240

Ser Pro Lys Asp Ile Val Glu Met Glu Leu Cys Leu Ala Asp Thr Gln

245 250 255

Pro Ala Val Leu Gly Gly Ala Tyr Asp Glu Phe Ile Phe Ala Pro Arg

260 265 270

Leu Asp Asn Leu His Ser Cys Phe Cys Ala Leu Gln Ala Leu Ile Asp

275 280 285

Ser Cys Ala Gly Pro Gly Ser Leu Ala Thr Glu Pro His Val Arg Met

290 295 300

Val Thr Leu Tyr Asp Asn Glu Glu Val Gly Ser Glu Ser Ala Gln Gly

305 310 315 320

Ala Gln Ser Leu Leu Thr Glu Leu Val Leu Arg Arg Ile Ser Ala Ser

325 330 335

Cys Gln His Pro Thr Ala Phe Glu Glu Ala Ile Pro Lys Ser Phe Met

340 345 350

Ile Ser Ala Asp Met Ala His Ala Val His Pro Asn Tyr Leu Asp Lys

355 360 365

His Glu Glu Asn His Arg Pro Leu Phe His Lys Gly Pro Val Ile Lys

370 375 380

Val Asn Ser Lys Gln Arg Tyr Ala Ser Asn Ala Val Ser Glu Ala Leu

385 390 395 400

Ile Arg Glu Val Ala Asn Lys Val Lys Val Pro Leu Gln Asp Leu Met

405 410 415

Val Arg Asn Asp Thr Pro Cys Gly Thr Thr Ile Gly Pro Ile Leu Ala

420 425 430

Ser Arg Leu Gly Leu Arg Val Leu Asp Leu Gly Ser Pro Gln Leu Ala

435 440 445

Met His Ser Ile Arg Glu Met Ala Cys Thr Thr Gly Val Leu Gln Thr

450 455 460

Leu Thr Leu Phe Lys Gly Phe Phe Glu Leu Phe Pro Ser Leu Ser His

465 470 475 480

Asn Leu Leu Val Asp

485

<210> 3

<211> 1458

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌CA23()

<400> 3

atgagcggac acagccccac gcgcggggcc atgcaggtgg ccatgaacgg taaggcccgc 60

aaagaggcgg tgcagactgc ggctaaggaa ctcctcaagt tcgtgaaccg gagtccctct 120

cctttccatg ctgtggctga atgccgcaac cgccttctcc aggctggctt cagtgaactc 180

aaggagactg agaaatggaa tattaagccc gagagcaagt acttcatgac caggaactcc 240

tccaccatca tagcttttgc tgtagggggc cagtacgttc ctggcaatgg cttcagcctc 300

atcggggccc acacggacag cccctgcctc cgggtgaaac gtcggtctcg ccgcagccag 360

gtgggcttcc agcaagtcgg tgtggagacc tatggtggtg ggatctggag cacctggttt 420

gaccgtgacc tgactctggc tggacgcgtc attgtcaagt gccctacctc aggtcggctg 480

gagcagcagc tggtgcacgt ggagcggccc attcttcgca tcccacacct ggccatccat 540

cggcagcgaa atatcaacga gaactttggg cccaacacag agatgcatct agtccccatt 600

cttgccacag ccatccagga ggagctggag aaggggactc ctgagccagg gcctctcaat 660

gctgtggatg agcggcacca ttcggtcctc atgtccctgc tctgtgccca tctggggctg 720

agccccaagg acatagtgga gatggagctc tgccttgcag acacccagcc tgcggtcttg 780

ggtggtgcct atgatgagtt catctttgct cctcggctgg acaatctgca cagctgcttc 840

tgtgccctgc aggccttgat agattcctgt gcaggccctg gctccctggc cacagagcct 900

cacgtgcgca tggtcacact ctatgacaac gaagaggtgg ggtctgagag tgcacaggga 960

gcacagtcac tgctgacaga gctggtgctg cggcggatct cagcctcgtg ccagcacccg 1020

acagccttcg aggaagccat acccaagtcc ttcatgatca gcgcagacat ggcccatgct 1080

gtgcatccca actacctgga caagcatgag gagaaccacc ggcctttatt ccacaagggc 1140

cccgtgatca aggtgaacag caagcaacgc tatgcttcaa acgcggtgtc agaggccctg 1200

atccgagagg tggccaacaa agtcaaggtc cccctgcagg atctcatggt ccggaatgac 1260

accccctgtg gaaccaccat tggacctatc ttggcttctc ggctggggct gcgggtgctg 1320

gatttaggca gcccccaact ggccatgcac tctatccggg agatggcctg caccacagga 1380

gtcctccaga ccctcaccct cttcaagggc ttctttgagc tgttcccttc tctaagccat 1440

aatctcttag tggattga 1458

<210> 4

<211> 485

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌CA23()

<400> 4

Met Ser Gly His Ser Pro Thr Arg Gly Ala Met Gln Val Ala Met Asn

1 5 10 15

Gly Lys Ala Arg Lys Glu Ala Val Gln Thr Ala Ala Lys Glu Leu Leu

20 25 30

Lys Phe Val Asn Arg Ser Pro Ser Pro Phe His Ala Val Ala Glu Cys

35 40 45

Arg Asn Arg Leu Leu Gln Ala Gly Phe Ser Glu Leu Lys Glu Thr Glu

50 55 60

Lys Trp Asn Ile Lys Pro Glu Ser Lys Tyr Phe Met Thr Arg Asn Ser

65 70 75 80

Ser Thr Ile Ile Ala Phe Ala Val Gly Gly Gln Tyr Val Pro Gly Asn

85 90 95

Gly Phe Ser Leu Ile Gly Ala His Thr Asp Ser Pro Cys Leu Arg Val

100 105 110

Lys Arg Arg Ser Arg Arg Ser Gln Val Gly Phe Gln Gln Val Gly Val

115 120 125

Glu Thr Tyr Gly Gly Gly Ile Trp Ser Thr Trp Phe Asp Arg Asp Leu

130 135 140

Thr Leu Ala Gly Arg Val Ile Val Lys Cys Pro Thr Ser Gly Arg Leu

145 150 155 160

Glu Gln Gln Leu Val His Val Glu Arg Pro Ile Leu Arg Ile Pro His

165 170 175

Leu Ala Ile His Arg Gln Arg Asn Ile Asn Glu Asn Phe Gly Pro Asn

180 185 190

Thr Glu Met His Leu Val Pro Ile Leu Ala Thr Ala Ile Gln Glu Glu

195 200 205

Leu Glu Lys Gly Thr Pro Glu Pro Gly Pro Leu Asn Ala Val Asp Glu

210 215 220

Arg His His Ser Val Leu Met Ser Leu Leu Cys Ala His Leu Gly Leu

225 230 235 240

Ser Pro Lys Asp Ile Val Glu Met Glu Leu Cys Leu Ala Asp Thr Gln

245 250 255

Pro Ala Val Leu Gly Gly Ala Tyr Asp Glu Phe Ile Phe Ala Pro Arg

260 265 270

Leu Asp Asn Leu His Ser Cys Phe Cys Ala Leu Gln Ala Leu Ile Asp

275 280 285

Ser Cys Ala Gly Pro Gly Ser Leu Ala Thr Glu Pro His Val Arg Met

290 295 300

Val Thr Leu Tyr Asp Asn Glu Glu Val Gly Ser Glu Ser Ala Gln Gly

305 310 315 320

Ala Gln Ser Leu Leu Thr Glu Leu Val Leu Arg Arg Ile Ser Ala Ser

325 330 335

Cys Gln His Pro Thr Ala Phe Glu Glu Ala Ile Pro Lys Ser Phe Met

340 345 350

Ile Ser Ala Asp Met Ala His Ala Val His Pro Asn Tyr Leu Asp Lys

355 360 365

His Glu Glu Asn His Arg Pro Leu Phe His Lys Gly Pro Val Ile Lys

370 375 380

Val Asn Ser Lys Gln Arg Tyr Ala Ser Asn Ala Val Ser Glu Ala Leu

385 390 395 400

Ile Arg Glu Val Ala Asn Lys Val Lys Val Pro Leu Gln Asp Leu Met

405 410 415

Val Arg Asn Asp Thr Pro Cys Gly Thr Thr Ile Gly Pro Ile Leu Ala

420 425 430

Ser Arg Leu Gly Leu Arg Val Leu Asp Leu Gly Ser Pro Gln Leu Ala

435 440 445

Met His Ser Ile Arg Glu Met Ala Cys Thr Thr Gly Val Leu Gln Thr

450 455 460

Leu Thr Leu Phe Lys Gly Phe Phe Glu Leu Phe Pro Ser Leu Ser His

465 470 475 480

Asn Leu Leu Val Asp

485

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

ccgctcgaga tgaaggtacc aaaaacaat 29

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

ttgcggccgc ctagccgtca gagcggtctt 30

Claims (7)

1.一种氨肽酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.如权利要求1 所述的一种氨肽酶突变体，其特征在于，所述突变体的编码基因为A-2，所述基因A-2的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。

3.包含权利要求2所述编码基因的质粒或重组菌。

4.如权利要求3所述的质粒，其特征在于，表达载体为pPIC9质粒。

5.如权利要求3所述的重组菌，其特征在于，宿主细胞为毕赤酵母JC308。

6.权利要求1所述氨肽酶突变体在水解N端氨基酸残基中的应用。

7.权利要求3所述质粒或重组菌在生产权利要求1所述氨肽酶突变体中的应用。

Images