CN107603937B - 一种表达赖氨酸氨肽酶的重组大肠杆菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达赖氨酸氨肽酶的重组大肠杆菌及其构建方法，属于生物工程技术及基因工程领域。本发明对野生铜绿假单胞菌的氨肽酶基因进行了克隆，并首次在大肠杆菌中成功表达了重组赖氨酸氨肽酶。经过摇瓶优化后胞内最高酶活达到3.47U·mL^‑1，为优化前的1.37倍。利用全质粒PCR技术对赖氨酸氨肽酶编码基因的特定位点进行定向突变，通过删除位于非活性中心的PA结构域，获取热稳定性提高了约10％的突变赖氨酸氨肽酶。为进一步研究赖氨酸氨肽酶的特性、结构与功能关系等提供了基础。

Description

一种表达赖氨酸氨肽酶的重组大肠杆菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种表达赖氨酸氨肽酶的重组大肠杆菌及其构建方法，属于生物工程技术及基因工程领域。

背景技术

赖氨酸氨肽酶是氨肽酶的一类，能够通过水解蛋白质或多肽的氮末端释放出游离氨基酸，根据其切割赖氨酸残基效率最高而命名。赖氨酸是包括人在内的脊椎动物的必须氨基酸，需要从食物中获取，对于人体代谢水平的调节、钙离子的吸收和积累和增强体质等方面具有重要作用，缺乏赖氨酸会造成恶心呕吐、贫血、发育迟缓等症状，但是谷物中赖氨酸含量普遍偏低，故也被称为第一限制性氨基酸。

定向突变是相对于自然界中天然发生的基因突变、重组等不定向突变而言的，是指通过基因工程的操作手段控制生物体按照人类期望的方向发生变异，从而满足研究人员想要实现的结果。定向突变技术被广泛应用在生物学的各个领域：对于蛋白质工程学科，研究者可以通过该技术创造出自然界原本不存在的蛋白质；对于基因工程学科，人们通过将某些优良基因整合到其他受体内，合成的新品种能够更利于产生人类需要的物质；对于遗传育种学，科学工作者采取成熟的育种技术更有目的性地培养作物，使其发挥出更高的经济价值。在对酶蛋白的改造方面，应用定向突变技术能够获得酶学性质更好的蛋白质，降低工业成本提高生产效益。

因此，构建并定向改造一株能够稳定表达、遗传背景清晰的赖氨酸氨肽酶重组菌具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种构建所述大肠杆菌工程菌的方法，以大肠杆菌BL21为表达宿主，以pET-42a(+)为表达载体，表达核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的赖氨酸氨肽酶基因。主要包括以下步骤：

(1)根据来自铜绿假单胞菌的赖氨酸氨肽酶编码基因(SEQ ID NO.1)设计引物扩增SEQ ID NO.2所示的目的基因；扩增得到的氨肽酶基因两端含有酶切位点EcoRⅠ和XhoⅠ；

(2)将PCR产物连接到表达载体pET-42a(+)上，获得重组质粒；

(3)测序正确的重组载体热激转化E.coli BL21感受态细胞，筛选获取重组大肠杆菌。

本发明还提供一种应用所述大肠杆菌工程菌发酵生产赖氨酸氨肽酶的方法，主要包括以下步骤：

①挑取LB(含终浓度50μg·mL^-1的卡那霉素)平板上活化的菌落于40mL发酵培养基中，37℃、220rpm培养8h；

②向发酵液中加入终浓度0.5mmol·L^-1的诱导剂IPTG，转到16℃，240r·min^-1摇床中诱导产酶；

③将获得的发酵液，离心收集菌体沉淀，沉淀用Tris-HCl缓冲液洗涤2次后重悬，菌悬液经适当倍数稀释后利用超声破碎仪破碎细胞，破碎液离心后即得胞内粗酶液。

本发明对野生铜绿假单胞菌的氨肽酶基因进行了克隆，并首次在大肠杆菌中成功表达了重组赖氨酸氨肽酶。经过摇瓶优化后胞内最高酶活达到3.47U·mL^-1，为优化前的1.37倍。利用全质粒PCR技术对赖氨酸氨肽酶编码基因的特定位点进行定向突变，通过删除位于非活性中心的PA结构域，获取70℃下热稳定性提高了约10％的突变赖氨酸氨肽酶。本发明方法简单有效，构建的重组大肠杆菌能有效表达赖氨酸氨肽酶，且表达载体包含组氨酸标签，利于后期重组蛋白的纯化以及为进一步研究赖氨酸氨肽酶的特性、结构与功能关系等提供了基础。

附图说明

图1赖氨酸氨肽酶(lap)重组子的PCR验证(M：2000bp Marker，1-4：目的基因)。

图2重组质粒pET42a-lap的双酶切验证。(M：10000bp Marker)。

图3重组赖氨酸氨肽酶的SDS-PAGE分析(M：蛋白分子量标准；1：实验组破碎液上清；2：对照组破碎液上清；3：实验组发酵液上清；4：对照组发酵液上清)。

图4重组大肠杆菌的生长产酶曲线。

图5诱导时机对赖氨酸氨肽酶产酶的影响。

图6Co²⁺添加量对产赖氨酸氨肽酶的影响。

图7突变酶与重组酶的温度稳定性对比曲线。

具体实施方式

所用培养基与溶液：

LB(g/L)：胰蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，pH 7.0；

发酵初始培养基(w/v)：0.5％葡萄糖，1.2％鱼粉蛋白胨，2.4％酵母浸膏，55mmol·L^-1K₂HPO₄·3H₂O，17mmol·L^-1KH₂PO₄，pH 7.2。接种前添加卡那霉素至终浓度50μg·mL^-1。

发酵优化培养基(w/v)：0.5％葡萄糖，2％鱼粉蛋白胨，3％酵母浸膏，55mmol·L^{- 1}K₂HPO₄·3H₂O，17mmol·L^-1KH₂PO₄，0.2mmol·L^-1CoCl₂，pH 7.5。接种前添加卡那霉素至终浓度50μg·mL^-1。

Tris-HCl缓冲液：称取适量的三羟甲基氨基甲烷(Tris)，用ddH₂O配制为终浓度50mmol·L^-1的溶液，通过滴加HCl调节pH。

T4DNA连接酶、限制性内切酶EcoR I和Xho I以及共用Buffer购自宝生物工程(大连)有限公司。

赖氨酸氨肽酶酶活测定方法：

以L-亮氨酸-对硝基苯胺为底物，2mL Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)和1mL底物的混合液中加入1mL稀释若干倍数的酶液，以加入1mL Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)代替酶液的作为空白对照，80℃水浴条件下反应10min，迅速将反应液置于冰上终止反应，利用分光光度计于405nm波长下检测反应液吸光值，以每分钟分解底物产生1μmol对硝基苯胺消耗的酶量定义为一个酶活单位U。

(其中Abs为405nm处吸光值)

实施例1表达赖氨酸氨肽酶的重组大肠杆菌的构建方法。

为实现赖氨酸氨肽酶基因在大肠杆菌中的表达，根据赖氨酸氨肽酶基因设计引物。

上游引物lap-s：5'CCGgaattcATGGTCAGCACCCCGCTTGGCCTGCCG 3'(小写字母表示EcoRΙ酶切位点)；

下游引物lap-a：5'CCGctcgagTTACTTGATGAAGTCGTGACC 3'(小写字母表XhoΙ酶切位点)；

以赖氨酸氨肽酶产生菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)NJ-814中提取的基因组DNA为模板，lap-s及lap-a为引物扩增序列如SEQ ID NO.1所示的目的基因。PCR体系为(50μL)：PrimerSTAR酶25μL；基因组DNA模板2μL；lap-s 2μL；lap-a 2μL；ddH₂O 19μL。PCR条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；72℃后延伸5min。

将扩增获得的目的基因与质粒pET-42a(+)用EcoR I及Xho I双酶切，双酶切体系如下：

双酶切体系(40μL)：目的基因/质粒30μL，限制性快切酶各2μL，双蒸水4μL，10×Buffer2μL。37℃双酶切反应3h，琼脂糖凝胶电泳35min后，胶回收目的条带。

将双酶切后的目的基因与载体按摩尔质量比8:1的比率混合，16℃过夜并转化E.coli BL21感受态细胞。涂布于LB(含终浓度50μg·mL^-1的卡那霉素)平板上培养12-16h。随机挑取若干株菌进行菌落PCR及双酶切验证，验证正确的进行序列测定，测序正确的即为重组质粒pET42a-lap。

大肠杆菌感受态细胞的制作：

(1)取-80℃甘油保藏的E.coil菌液划线LB固体平板，37℃恒温倒置培养24h；

(2)从平板上挑取单菌落接种于5mL LB液体培养基，37℃，220r·min^-1过夜培养；

(3)以1％接种量转接到50mL LB液体培养基，同样条件继续培养2～3h至OD₆₀₀达到0.5左右；

(4)无菌环境中将菌液转入50mL灭菌预冷的离心管，冰浴10min；

(5)菌液分装于2根离心管，置于冷冻离心机4℃，8000r·min^-1离心5min；

(6)弃尽上清，各用5mL冰水预冷过的0.1mol·L^-1无菌CaCl₂溶液吹打重悬菌体沉淀，冰浴30min；

(7)再次将离心管放到离心机4℃，8000r·min^-1离心5min，于超净工作台弃尽上清废液，各加2mL预冷的CaCl₂溶液再一次重悬菌体沉淀，所得即为感受态细胞；

(8)向感受态细胞中加入等量冰水预冷的30％无菌甘油，充分混匀；

(9)将混合液以200μL每管的量分装到2mL无菌EP管中，-80℃低温保藏备用。

取上述感受态细胞与重组质粒pET42a-lap混合，进行热激转化，将转化液涂布于LB(含终浓度50μg·mL^-1的卡那霉素)平板，使具有卡那抗性的重组细胞生长形成菌落。。

实施例2重组大肠杆菌表达赖氨酸氨肽酶的方法

挑保藏的重组菌单菌落接种于5mL LB(含终浓度50μg·mL^-1的卡那霉素)培养基，37℃，220r·min^-1振荡过夜培养，再以1％的接种量转接于50mL发酵初始培养基中，同样条件振荡培养至OD₆₀₀达到0.6左右，加入终浓度为0.5mmol·L^-1的诱导剂IPTG，16℃，220r·min^-1低温诱导产酶。每诱导6h取1mL培养液，12000r·min^-1离心2min，将得到的发酵上清液和菌体沉淀分装于不同的EP管，菌体沉淀用1mL Tris-HCl缓冲液洗涤2次后重悬，菌悬液经适当倍数稀释后利用超声破碎仪破碎细胞。从发酵液上清中未测得胞外酶活，细胞破碎液中测得胞内酶活为2.54U·mL^-1。

实施例3重组大肠杆菌的摇瓶发酵条件优化：

(1)诱导温度：重组大肠杆菌发酵液加入诱导剂IPTG后，分别将发酵液转移到8℃、12℃、16℃、20℃、30℃、37℃，220r·min^-1摇床中诱导重组赖氨酸氨肽酶的表达，每12h取样检测，测定各组发酵液中达到稳定时的胞内酶活。

(2)诱导剂浓度：重组菌在37℃条件下摇床培养至OD₆₀₀达到0.6左右时，添加终浓度分别为0.1，0.5，1.0，1.5，2.0mmol·L^-1的诱导剂IPTG，转到16℃的摇床中诱导表达一段时间后取样测各组胞内酶活。

(3)诱导时机：将重组菌BLAP以1％的接种量转接到50mL发酵培养基，分别培养2h，4h，6h，8h，10h，12h后在培养基中添加终浓度0.5mmol·L^-1的诱导剂IPTG，再将培养液置于16℃摇床中诱导重组蛋白的表达，一段时间后取样测赖氨酸氨肽酶酶活。

(4)初始pH：考察了发酵液初始pH从6.0到9.0范围内各组发酵培养基的重组酶表达情况。

(5)Co²⁺添加量：配制含Co²⁺浓度分别为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mmol·L^-1的发酵培养基，经过相同的条件诱导一段时间后测定各组的酶活，考察其对氨肽酶酶活表达量的影响。

经过对产氨肽酶重组菌的摇瓶优化，结果表明诱导起始时间及Co²⁺添加量对发酵产酶具有重大影响。如图4所示，重组菌在6～24h处于快速生长期，在发酵培养基中培养72h后可以保证积累足够的菌体又可以使重组菌具有良好的活性。经过优化后，重组大肠杆菌的最终表达条件为：重组菌以2％的接种量在发酵优化培养基(0.5％葡萄糖，2％鱼粉蛋白胨，3％酵母浸膏，55mmol·L^-1K₂HPO₄，17mmol·L-1KH₂PO₄，0.2mmol·L-1CoCl₂，初始pH7.5，装液量40mL/250mL)中37℃，220r·min培养8h，然后向发酵液中加入终浓度0.5mmol·L^-1的诱导剂IPTG，转到16℃，240r·min^-1摇床中诱导产酶。优化后最高酶活达到3.47U·mL^-1，为优化前的1.37倍。

实施例4全质粒PCR定向突变：

以提取自重组菌BLAP的重组质粒pET42a-lap为模板，根据计划突变的目标位点设计一对突变引物(两条引物需要具有约2/3长度连续的互补碱基，并将突变位点设计在靠近引物3’端约1/3处)，引物序列如下：

lap-s：5'CCGgaattcATGGTCAGCACCCCGCTTGGCCTGCCG 3'(EcoRI酶切位点)

lap-a：5'CCGctcgagTTACTTGATGAAGTCGTGACC 3'(XhoI酶切位点)

进行全质粒PCR扩增出突变的重组质粒。PCR反应条件为：98℃预变性5min；94℃变性1min，60℃退火延伸5min，25个循环。扩增后的PCR产物利用DpnⅠ消除模板质粒，消化结束后转化E.coli JM109，长出的菌落经液体培养后提取质粒，送检上海生工测序。将测序结果中符合预期的突变质粒转化E.coli BL21，诱导突变基因的表达，以未突变的重组赖氨酸氨肽酶为对照，考察突变对赖氨酸氨肽酶活性和酶学性质的影响，结果显示，70℃处理1h后的残留酶活比未突变重组酶高10％左右，突变酶的热稳定性得到提高。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种表达赖氨酸氨肽酶的重组大肠杆菌及其构建方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1611

<212> DNA

<213> 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ）

<400> 1

atgagcaaca agaacaatct cagatacgca ctcggcgccc tcgccctctc ggtttccgcc 60

gcatccctgg cggcaccttc ggaagcgcaa cagttcaccg agttctggac gcccggcaaa 120

cccaacccgt cgatctgcaa atcgccgttg ctggtcagca ccccgcttgg cctgccgcgc 180

tgcctgcaag ccagcaacgt ggtcaagcgc ctgcagaagc tggaggacat cgccagtctc 240

aacgacggca accgcgccgc cgccacgccg ggctaccagg cctccgtcga ctacgtgaag 300

cagaccctgc agaaagccgg ctacaaggtc agcgtgcagc ccttcccgtt caccgcctac 360

tacccgaaag gcccgggtag cctgagcgcc accgtgccgc agccggtcac ctacgaatgg 420

gagaaggatt tcacctacct gtcgcagacc gaggcaggcg acgtcaccgc caaggtggtc 480

ccggtggacc tgtccctcgg cgccggcaac acctccacca gcggttgcga ggcggaagac 540

ttcgccaact tcccggccgg ctcgatcgcg ctgatccagc gcggcacctg caacttcgag 600

cagaaggccg agaacgccgc ggccgccggc gccgccgggg tgatcatctt caaccagggc 660

aacaccgacg accgcaaggg cctggagaac gtcaccgtgg gcgagtccta cgagggcggc 720

atcccggtga tcttcgccac ctacgacaac ggcgtggcct ggtcgcagac cccggacctg 780

cagttgcacc tggtggtcga cgtggtacgc aagaagaccg agacctacaa cgtggtcgcc 840

gagacccgtc gcggcaaccc gaacaacgtg gtgatggtcg gcgcgcacct cgactcggtg 900

ttcgaaggcc ccggtatcaa cgacaacggt tcgggcagcg ccgcccaact ggagatggcc 960

gtgctgctgg ccaaggcgct gccggtcaac aaggtgcgct tcgcctggtg gggcgccgag 1020

gaagccggcc tggtgggctc gacccactac gtgcagaacc tcgccccgga agagaagaag 1080

aagatcaagg cctacctgaa cttcgacatg atcggctcgc cgaacttcgg caacttcatc 1140

tatgacggcg acggttccga cttcggcctc cagggtccgc ccggctcggc cgccatcgag 1200

cgcctgttcg aagcctactt ccgcctgcgc ggccagcaat cggaaggcac cgagatcgac 1260

ttccgctccg actacgccga gttcttcaac agcggcatcg ccttcggcgg cctgttcacc 1320

ggcgccgagg gcctgaagac cgaagagcag gcgcagaagt acggcggcac cgccggcaag 1380

gcctacgacg agtgctacca cagcaagtgc gacggcatcg ccaacatcaa ccaggacgcc 1440

ctggagatcc acagcgacgc catggccttc gtgaccagtt ggctgtcgct gtcgaccaag 1500

gtggtcgacg atgagatcgc cgccgccggc cagaaagcac aatcgcggtc gctgcagatg 1560

cagaagagcg ccagccagat cgaacgctgg ggtcacgact tcatcaagta a 1611

<210> 2

<211> 1461

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggtcagca ccccgcttgg cctgccgcgc tgcctgcaag ccagcaacgt ggtcaagcgc 60

ctgcagaagc tggaggacat cgccagtctc aacgacggca accgcgccgc cgccacgccg 120

ggctaccagg cctccgtcga ctacgtgaag cagaccctgc agaaagccgg ctacaaggtc 180

agcgtgcagc ccttcccgtt caccgcctac tacccgaaag gcccgggtag cctgagcgcc 240

accgtgccgc agccggtcac ctacgaatgg gagaaggatt tcacctacct gtcgcagacc 300

gaggcaggcg acgtcaccgc caaggtggtc ccggtggacc tgtccctcgg cgccggcaac 360

acctccacca gcggttgcga ggcggaagac ttcgccaact tcccggccgg ctcgatcgcg 420

ctgatccagc gcggcacctg caacttcgag cagaaggccg agaacgccgc ggccgccggc 480

gccgccgggg tgatcatctt caaccagggc aacaccgacg accgcaaggg cctggagaac 540

gtcaccgtgg gcgagtccta cgagggcggc atcccggtga tcttcgccac ctacgacaac 600

ggcgtggcct ggtcgcagac cccggacctg cagttgcacc tggtggtcga cgtggtacgc 660

aagaagaccg agacctacaa cgtggtcgcc gagacccgtc gcggcaaccc gaacaacgtg 720

gtgatggtcg gcgcgcacct cgactcggtg ttcgaaggcc ccggtatcaa cgacaacggt 780

tcgggcagcg ccgcccaact ggagatggcc gtgctgctgg ccaaggcgct gccggtcaac 840

aaggtgcgct tcgcctggtg gggcgccgag gaagccggcc tggtgggctc gacccactac 900

gtgcagaacc tcgccccgga agagaagaag aagatcaagg cctacctgaa cttcgacatg 960

atcggctcgc cgaacttcgg caacttcatc tatgacggcg acggttccga cttcggcctc 1020

cagggtccgc ccggctcggc cgccatcgag cgcctgttcg aagcctactt ccgcctgcgc 1080

ggccagcaat cggaaggcac cgagatcgac ttccgctccg actacgccga gttcttcaac 1140

agcggcatcg ccttcggcgg cctgttcacc ggcgccgagg gcctgaagac cgaagagcag 1200

gcgcagaagt acggcggcac cgccggcaag gcctacgacg agtgctacca cagcaagtgc 1260

gacggcatcg ccaacatcaa ccaggacgcc ctggagatcc acagcgacgc catggccttc 1320

gtgaccagtt ggctgtcgct gtcgaccaag gtggtcgacg atgagatcgc cgccgccggc 1380

cagaaagcac aatcgcggtc gctgcagatg cagaagagcg ccagccagat cgaacgctgg 1440

ggtcacgact tcatcaagta a 1461

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccggaattca tggtcagcac cccgcttggc ctgccg 36

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccgctcgagt tacttgatga agtcgtgacc 30

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccggaattca tggtcagcac cccgcttggc ctgccg 36

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccgctcgagt tacttgatga agtcgtgacc 30

Claims (7)

1.一株重组表达耐热赖氨酸氨肽酶的大肠杆菌工程菌，其特征在于，表达核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的赖氨酸氨肽酶基因，以大肠杆菌BL21为表达宿主，以pET-42a(+)为表达载体。

2.一种构建权利要求1所述大肠杆菌工程菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）设计引物扩增SEQ ID NO.2所示的目的基因；扩增得到的氨肽酶编码基因两端分别引入酶切位点EcoRⅠ和XhoⅠ；

（2）将PCR产物连接到表达载体pET-42a(+)上，获得重组质粒；

（3）测序正确的重组载体热激转化E.coli BL21感受态细胞，获取重组大肠杆菌。

3.应用权利要求1所述大肠杆菌工程菌发酵生产赖氨酸氨肽酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）挑取活化的菌落于40 mL发酵培养基中，37℃、220 rpm培养8 h使OD₆₀₀达到0.6；所述发酵培养基的组分为：0.5％葡萄糖，2％鱼粉蛋白胨，3％酵母浸膏，55 mmol·L^-1K₂HPO₄·3H₂O，17 mmol·L^-1 KH₂PO₄，0.2 mmol·L^-1 CoCl₂，pH 7.5；

（2）向发酵液中加入终浓度0.5 mmol·L^-1的诱导剂IPTG，转到16℃，240 r·min^-1摇床中诱导产酶；

（3）将获得的发酵液，离心收集菌体沉淀，沉淀用Tris-HCl缓冲液洗涤2次后重悬，菌悬液经适当倍数稀释后利用超声破碎仪破碎细胞，破碎液离心后即得胞内粗酶液。

4.一种赖氨酸氨肽酶基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.一种赖氨酸氨肽酶，其特征在于，编码所述赖氨酸氨肽酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

6.权利要求5所述赖氨酸氨肽酶在制备赖氨酸中的应用。

7.权利要求1所述大肠杆菌工程菌在制备赖氨酸中的应用。

Images