CN115820610B

CN115820610B - 氨肽酶重组菌、氨肽酶及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115820610B
Application number: CN202211198204.1A
Authority: CN
Inventors: 张梁; 刘帆; 方亚坤; 辛瑜; 顾正华; 郭自涛
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-09-29
Filing date: 2022-09-29
Publication date: 2023-12-08
Anticipated expiration: 2042-09-29
Also published as: CN115820610A

Abstract

本发明公开了氨肽酶重组菌、氨肽酶及其制备方法和应用，属于生物制备技术领域。本发明通过氨肽酶祖先序列构建获得具有编码氨肽酶基因核酸序列，并通过该核苷酸序列构建含有该祖先序列基因的重组表达载体及重组菌，通过重组菌制备得到氨肽酶，并利用该重组氨肽酶制备L‑肌肽。本发明采用微生物酶法合成L‑肌肽，反应时间短、制备成本低，绿色、高效，具有广泛的应用前景。

Description

氨肽酶重组菌、氨肽酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物制备技术领域，尤其涉及氨肽酶重组菌、氨肽酶及其制备方法和应用。

背景技术

L-肌肽，是由β-丙氨酸和L-组氨酸组成的一种天然活性二肽，于1900年首次在牛肉中发现，在哺乳动物大脑、肌肉和其他组织中广泛存在，易溶于水、0.1M盐酸和0.1M氢氧化钠，在无水乙醇、三氯甲烷、乙腈等中几乎不溶。

研究表明，L-肌肽具有良好的pH缓冲性能，有很强的抗氧化能力，在抗衰老、促进伤口愈合，清除自由基等方面可以发挥很好的作用，对高血压、心脏病、老年性白内障、溃疡等都有治疗效果。相比于其他抗氧化剂，L-肌肽具有抗氧化能力强、无毒副作用、具多种生理活性等优点，因此在医药、保健、美容等领域具有广泛的应用前景。

目前，L-肌肽的生产方法主要有两种：化学合成法和生物合成法，采用化学合成法，需要对底物L-组氨酸和β-丙氨酸的活性基团进行保护或活化，并且化学合成反应步骤繁琐，反应条件剧烈，反应过程中副产物较多，反应工艺不够环保，因此未能受到人们重视。

采用微生物酶法合成L-肌肽，反应条件温和，绿色环保，具有良好的工业化应用前景。目前微生物酶法催化合成L-肌肽的研究相对较少，且所报道的研究中大多存在需添加ATP以及反应时间较长等缺点。氨肽酶催化生成L-肌肽是目前研究最广泛的用于生产L-肌肽的绿色方法，故本发明尝试通过将已报道的具有合成L-肌肽功能的氨肽酶基因进行祖先序列构建，以期获得酶活较高的氨肽酶基因。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了氨肽酶重组菌、氨肽酶及其制备方法和应用。本发明通过氨肽酶祖先序列构建获得具有编码氨肽酶基因核酸序列，并通过该核苷酸序列构建含有该祖先序列基因的重组表达载体及重组菌，通过重组菌制备得到氨肽酶，并利用该重组氨肽酶制备L-肌肽。本发明采用微生物酶法合成L-肌肽，反应时间短、制备成本低，绿色、高效，具有广泛的应用前景。

本发明的技术方案如下：

一种氨肽酶，所述氨肽酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

所述SEQ ID NO.3具体为：

MKRARLRDLGITIGRLPTGPYNAITDVPGVRVGHTTIIEDDPHVVNTGVTTILPQDGEVWEHHVFAGYFRFNGSGEMTGSHWLEESGLLSSPVIITNSFGVGACYDALVKYAAEQDPTAPFTLPVIAETFDGWLSDIGAMAVTPEHVREALENARSGPVAEGNVGGGTGMITMGFKAGTGTSSRVVEVEGEGYTVGALVQSNFGGARFLTINGVPVGRLIPADQVPVPWEEPPREDGSIIVIIATDAPLLPHQCKRLARRATLGVARTGGWGSNYSGDIFLAFSTGNRLPRQPEEPVYGLKMLPNEEMDPLFQGAVEATEEAILNAICMAETMKGRKGREVKALPLDRLKEILKRPGRR；

所述SEQ ID NO.4具体为：

MPDTPGRERARIRELLPNLYLGRFPPGPRNSLTDVPGVLVSTQSIITPSDPKHHEVNTGVTTILPRKDWFESGCYAGIFRFNGSGEMTGSHWIEETGLLNSPIVITNSFGVGAAYNGVLEYAVRHHKDENGLADWFILPVVAETYDGWLSDIGAFAVTPEHVVEGIENASSDPVKEGNTGGGTGMICHGFKGGTGSSSRVVPGVKRDEKGEREQKEYTIGVLVQANYGRREDLRVGGVPVGRLLAEEGAAARGKKLGPAEPQKDGSIIVVIATDAPLLPIQLQRLAKRATVGLARVGGFGFNYSGDIFLAFSTASEIPRETTAGWTPTPLQPQEVLDDETINALFEAAADAVEEAIYNAICMAETTTGPQGRTVKALDLERLKEIMKRHAT。

进一步地，所述氨肽酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

所述SEQ ID NO.1具体为：

ATGAAGCGTGCCCGTCTGCGTGATCTGGGCATTACCATTGGCCGCCTGCCGACAGGTCCGTATAATGCTATTACCGATGTTCCGGGTGTGCGTGTGGGTCATACCACCATTATTGAAGATGATCCGCATGTGGTTAACACCGGCGTTACCACCATTCTGCCGCAGGATGGCGAAGTTTGGGAACATCATGTTTTTGCCGGTTATTTTCGTTTCAACGGTAGCGGTGAAATGACCGGCAGTCATTGGCTGGAAGAAAGTGGCCTGCTGAGTAGTCCGGTGATTATTACCAATAGCTTTGGCGTGGGCGCATGTTATGATGCACTGGTTAAATATGCCGCAGAACAGGACCCTACCGCACCGTTTACCCTGCCTGTGATTGCCGAAACCTTTGATGGCTGGCTGAGCGATATTGGTGCAATGGCTGTGACCCCGGAACATGTTCGTGAAGCCCTGGAAAATGCCCGCAGTGGTCCGGTTGCAGAAGGTAATGTGGGTGGCGGCACCGGAATGATTACAATGGGTTTTAAAGCAGGCACCGGCACCAGTAGCCGCGTTGTGGAGGTTGAAGGCGAAGGTTATACCGTTGGTGCCCTGGTGCAGAGCAATTTTGGCGGTGCCCGCTTTCTGACCATTAATGGTGTTCCGGTTGGCCGTCTGATTCCGGCAGATCAGGTTCCGGTGCCGTGGGAGGAACCTCCTAGAGAAGATGGTAGCATTATTGTTATCATCGCAACCGATGCCCCGCTGCTGCCTCATCAATGCAAACGTCTGGCCCGTCGTGCCACCTTAGGTGTTGCACGTACCGGCGGTTGGGGTAGTAATTATAGCGGCGATATTTTTCTGGCCTTTAGTACCGGCAATCGCCTGCCGCGTCAGCCTGAGGAGCCTGTGTATGGTCTGAAAATGCTGCCGAATGAAGAAATGGACCCTCTGTTTCAGGGCGCCGTTGAAGCAACCGAAGAAGCCATTCTGAATGCCATTTGCATGGCCGAAACCATGAAAGGCCGCAAAGGCCGTGAAGTGAAAGCACTGCCGCTGGATCGCCTGAAAGAAATTCTGAAACGTCCGGGCCGCCGCTAA；

所述SEQ ID NO.2具体为：

ATGCCTGATACTCCCGGTCGTGAACGCGCTCGAATTCGGGAGTTATTGCCAAATCTTTATCTCGGCAGATTTCCGCCTGGACCCAGGAACTCTCTAACCGACGTTCCAGGGGTCCTGGTATCCACACAATCAATCATAACGCCGTCGGATCCTAAACATCACGAAGTGAATACTGGTGTTACCACAATTTTACCCCGTAAGGACTGGTTCGAGAGTGGCTGTTACGCCGGAATCTTTCGCTTCAACGGGAGCGGTGAAATGACGGGCTCTCATTGGATAGAGGAAACTGGATTGCTTAATTCCCCAATTGTCATCACCAACTCATTTGGGGTAGGTGCAGCGTATAATGGCGTGCTCGAGTACGCTGTTCGACACCATAAAGATGAAAACGGACTAGCCGACTGGTTCATACTGCCGGTCGTAGCAGAGACATATGATGGGTGGTTATCGGACATTGGTGCGTTTGCTGTGACGCCTGAACACGTTGTCGAGGGCATCGAAAATGCCAGTAGCGATCCCGTAAAGGAGGGAAACACTGGGGGTGGCACCGGAATGATATGCCATGGGTTCAAAGGTGGCACAGGATCTTCCTCACGGGTGGTTCCAGGGGTCAAGAGAGACGAAAAAGGTGAGAGGGAACAGAAGGAGTACACGATTGGCGTATTGGTGCAAGCAAATTATGGACGTCGCGAAGATCTTCGAGTTGGGGGTGTCCCGGTAGGCCGGCTCCTAGCGGAGGAAGGAGCTGCCGCAAGAGGGAAAAAGCTGGGTCCTGCGGAGCCCCAGAAAGACGGCTCGATCATAGTGGTTATTGCTACTGATGCCCCATTATTGCCGATCCAACTTCAGAGGCTCGCAAAGCGTGCGACCGTCGGACTAGCTCGCGTAGGGGGTTTTGGCTTCAACTACAGTGGAGACATATTTCTGGCCTTCAGCACAGCATCTGAAATTCCTCGAGAGACGACTGCGGGGTGGACCCCCACACCATTACAACCGCAGGAAGTGTTGGATGACGAGACGATCAATGCTCTTTTTGAAGCCGCAGCGGATGCTGTTGAGGAAGCCATATATAACGCAATTTGTATGGCGGAGACTACCACAGGTCCTCAAGGCCGGACGGTCAAAGCTCTCGACCTAGAAAGACTGAAGGAGATCATGAAAAGGCACGCCACTTAA；

一种重组表达载体，所述重组表达载体含有核苷酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示的氨肽酶基因，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

一种重组表达载体，表达含有编码上述的氨肽酶的重组表达载体。

一种重组菌，表达如上所述的重组表达载体的菌株。

一种重组表达载体的构建方法为：

(1)祖先序列构建：从NCBI中序列号为XP-033415514.1、3N5IA、WP_043062538.1的已知序列所编码的含氨肽酶基因的蛋白序列，将上述氨肽酶基因经过比对后，分别在序列相似度为20～40％、40～60％、60～80％、80～100％四个区间内选取14-15条序列，共筛选得到59条序列用于祖先序列的构建；

(2)祖先序列筛选：将筛选得到的祖先序列经过maff软件多序列比对，ProTest软件选择最优氨基酸替代模型，最后经PhyML最大似然法建树后获得系统发育树，如图3所示。将得到的系统发育树用于祖先序列构建，选取祖先序列中酶活较高的核苷酸序列；

(3)重组表达载体构建：将获得的祖先序列核苷酸序列经密码子优化，在基因片段5’、3’两端分别添加BamH I和Hind III两个酶切位点后于上海生工生物公司合成基因序列，如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，将合成基因序列与表达载体分别经过BamH I和Hind III酶切，将酶切后的目的片段和表达载体通过T4连接酶过夜连接，得到重组表达载体。

进一步地，所述表达载体为pET28(+)。

一种用所述重组表达载体构建的重组菌，所述重组菌中具有如SEQ ID NO.1或SEQID NO.2所示的核苷酸序列的重组表达载体。

一种重组菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)根据氨肽酶祖先序列重建技术挖掘出的氨基酸祖先序列进行密码子优化后，获得如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，将核苷酸序列与表达载体连接，得到所述的重组表达载体；

(2)将重组表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞，涂布于卡那霉素抗性平板(卡那霉素浓度为50μg/mL)，挑取在抗性平板上生长的菌落，接菌并提取质粒，将质粒送天霖生物科技有限公司测序，测序正确的即为构建好的重组菌。

进一步地，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。

进一步地，所述表达载体为pET28a(+)。

一种用所述重组菌制备的氨肽酶。

一种所述氨肽酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)将重组菌于16℃诱导、于LB液体培养基(LB培养基(1L)：酵母粉5g、胰蛋白胨10g、NaCl 10g)发酵24h后，于4℃、离心收集菌体，冰水浴超声破碎收集好的菌体，得到含有氨肽酶粗酶的破碎液。

(2)将破碎液离心，获得含有氨肽酶的破碎上清液用于后续酶反应。

(3)将步骤(2)所得含重组酶的破碎上清液纯化，获得纯化产物后用于后续酶反应。

进一步地，步骤(1)中，所述离心的速度为10000-12000rpm，时间为2-10min，所述超声的功率200-300W，时间15-20min；步骤(2)中，所述离心的速度为10000-12000rpm，时间为8-15min。

进一步地，步骤(3)中，所述纯化的具体过程为：将步骤(2)得到的粗酶液上亲和层析柱柱进行后续纯化操作；然后用含不同浓度的盐离子缓冲溶液，具体为含不同咪唑浓度的Tris-HCl缓冲液梯度洗脱杂蛋白和目标蛋白，其中低浓度盐离子缓冲溶液(咪唑浓度为20-100mM)用以洗脱杂蛋白，高浓度盐离子缓冲溶液(咪唑浓度为150-300mM)用以洗脱目的蛋白。

本发明所构建的重组载体N端含有纯化标签(如His标签)，故可以用亲和层析柱柱进行纯化。

一种所述具有氨肽酶酶活的如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核酸序列及其所编码的蛋白，

包括如下a或b所述的蛋白质：

a具有所述氨肽酶基因的核酸序列所编码的蛋白；

b包含a所述蛋白序列中一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入后得到的能够催化β-丙氨酸甲酯和L-组氨酸合成L-肌肽的蛋白质。

a所述蛋白质可从曲霉来源氨肽酶祖先序列构建后人工合成获得。

用所述氨肽酶或重组菌合成的L-肌肽。

一种用重组菌合成L-肌肽的方法，包括如下步骤：以β-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-组氨酸为底物，用所述重组菌与底物β-丙氨酸甲酯盐酸盐、L-组氨酸进行催化反应合成L-肌肽。

一种用氨肽酶合成L-肌肽的方法，包括如下步骤：将β-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-组氨酸溶于缓冲溶液得到底物溶液，然后加入所述氨肽酶得到反应液，于15～60℃反应5-40min得到L-肌肽；所述缓冲溶液的pH为6～11；所述反应液中L-组氨酸的质量分数为1.55-2％，丙氨酸甲酯盐酸盐的质量分数为0.7-1％，酶的体积分数为2-5％。

所述方法中，当采用所制备的酶进行催化反应时，所述反应液中包括如下组分：20mM Tris-HCl缓冲液、50mMβ-丙氨酸甲酯盐酸盐、100mM L-组氨酸，200μl破碎后粗酶液或纯化后的酶液(控制酶液蛋白浓度>0.4mg/ml反应即可)。所述催化反应体系反应5-40min后加1M盐酸调反应液pH至3-4终止反应。

本发明有益的技术效果在于：

本发明所构建的氨肽酶，酶活性高，热稳定性及pH耐受性较好，以β-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-组氨酸为底物，β-丙氨酸甲酯盐酸盐为反应酰基供体，L-组氨酸为反应酰基受体，使用高浓度的酰基受体更佳有利于酶促反应向于肌肽合成方向进行，经新构建的氨肽酶催化合成L-肌肽，避免了常规化学方法中对化学基团的保护、脱保护步骤，酶促反应时无需额外添加ATP，节约反应成本，更佳经济，且本发明所述的制备L-肌肽的方法，反应体系简单，反应时间更短、反应条件温和，绿色、环保。

本申请所构建的氨肽酶具有较强的pH耐受能力、热稳定性较优，能适应复杂的环境，具有良好的工业开发、应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例2的酶反应产物GC-MS结果。

图2为本发明L-肌肽标品GC-MS结果。

图3为本发明实施例1最大似然法构建的系统发育树。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。以下的实施例便于更好的理解本发明，但不限于本发明。本领域技术人员不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。以下实施例中的方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到。

本申请所用宿主菌为可使重组表达载体稳定表达并实现自我复制到宿主菌，所用宿主菌为大肠杆菌，具体为E.coli BL21(DE3)，购自上海生工生物工程公司。

β-丙氨酸甲酯盐酸盐：上海阿拉丁生化科技股份有限公司CAS号：3196-73-4。

L-组氨酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，CAS号：72-00-1。

L-肌肽标品：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，CAS号：305-84-0。

实施例1：

有氨肽酶功能的祖先序列的筛选及重组表达载体的构建，包括如下步骤：

(1)从NCBI中筛选序列号为XP-033415514.1、3N5IA、WP_043062538.1的已知序列所编码的含氨肽酶基因的蛋白序列，将上述氨肽酶基因经过比对后，分别在序列相似度为20～40％、40～60％、60～80％、80～100％四个区间内选取15条序列，共筛选得到59条序列用于祖先序列的构建；

(2)将筛选得到的最先序列经过mafft软件进行序列比对，ProTest软件选择最优氨基酸替代模型，最后经PhyML最大似然法建树后获得祖先序列，祖先序列的系统发育树如图3所示。选取进化树节点bootstrap值大于50的祖先序列。

(3)将pET28a载体与祖先序列基因片段分别用BamHI、HindIII酶切后通过T4连接酶过夜连接，构建含祖先序列基因片段的重组表达载体，将其转化至大肠杆菌DE3感受态细胞后得到重组菌，分别进行发酵培养，培养液离心后收集菌体，破碎，收集破碎后的上清，加入底物丙氨酸甲酯盐酸盐与组氨酸，振荡反应后用高效液相色谱检测酶活。结果如下表1所示。

表1酶活较高的祖先序列

注：“+”表示酶活在0-10％；“++”表示酶活在10-20％；“+++”表示酶活大于40％。

考察每个祖先序列所得重组酶的酶活，选取祖先序列中酶活相对最高的核苷酸序列，如表1所示，Ancestral-39与Ancestral-51的酶活相对最高，将筛选到有氨肽酶酶活的Ancestral-39与Ancestral-51两个祖先序列分别进行合成(将筛选的祖先序列送至天霖生物科技公司合成)，在基因片段5’、3’两端分别添加BamH I和Hind III两个酶切位点后于上海生工生物公司合成基因序列，如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，然后将pET28a载体和合成的基因片段分别经BamH I和Hind III双酶切，酶切反应体系为50ul：载体20ul、10×酶反应buffer5ul，BamH I 3uL，Hind III 3uL，ddH₂O补足至50uL。胶回收目的片段，将酶切好的目的片段与pET28a表达载体以T4连接酶于连接，T4连接反应体系为20uL：目的基因3uL，载体片段2uL，10×酶反应buffer 2uL，T4连接酶2uL，ddH₂O补足至20uL，于16℃连接12h，得到构建好的含有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示祖先基因序列的重组表达载体。

实施例2重组酶粗酶及其合成L-肌肽的方法

利用含如SEQ ID NO.1所示祖先基因序列的重组表达载体构建重组菌，制备氨肽酶及L-肌肽。具体过程如下：

(1)重组菌的构建

取构建好的重组表达载体分别转化至200ul大肠杆菌DE3感受态细胞。具体转化方法如下：

S1取构建好的重组表达载体10uL分别转化至含200ul E.coli DE3感受态细胞的1.5mL EP管中，轻轻混匀。

S2将上述EP管于冰上静止放置30min；

S3将上述EP管置于42℃金属浴内准确热激90s；

S4将热激后的EP管转移至冰上放置5min；

S5每个EP管加入800uL无菌LB培养基，于37℃摇床培养60min；

S6于8000rpm离心60s，去除部分培养基(剩余150ul左右)，混匀。涂布于含终浓度为50ug/ml的卡那霉素LB固体抗性平板，于37℃培养箱培养12h-16h。

S7挑取测序验证正确后的阳性转化子接种至LB液体培养基(含100ug/ml卡那霉素)，获得重组菌，后保存于30％甘油，冻存于-70℃；

(2)重组氨肽酶的制备

将所得的重组菌接种于含100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜，后按1％的接种量转接于三角烧瓶中，于37℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，后加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG作为诱导剂，16℃诱导24h，将培养液离心，收集菌体细胞。

用Tris-HCl缓冲液洗涤两次，将菌体重悬，在冰浴中超声破碎(超声条件：300W，15min)，12000rpm离心10min收集上清，即为氨肽酶粗酶液，粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，重组蛋白在细胞中大部分以可溶的形式存在，另外有小部分蛋白以包涵体形式存在，较少的包涵体更有利于重组氨肽酶的分离纯化。

(3)重组酶粗酶催化合成L-肌肽

将步骤(3)所得的粗酶液加到含有50mMβ-丙氨酸甲酯盐酸盐和100mM L-组氨酸的缓冲溶液中，催化β-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-组氨酸合成肌肽。(5mL反应体系加量：0.5Mβ-丙氨酸甲酯盐酸盐：500ul，0.2M L-组氨酸：1.5mL,氨肽酶液：100uL，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲液1.9mL)，将上述反应体系置于25℃反应10min后加入1M盐酸调反应体系pH＝3-4，终止反应。

取上述反应液，稀释后送高效液相色谱-质谱(GC-MS)检测产物生成。

采用L-肌肽标品作为参考，L-肌肽标品的GC-MS结果如图2所示。

粗酶酶活的测定：根据上述产物生成情况进行酶活计算，每分钟生成1umol肌肽视为一个酶活力单位。

粗酶酶活的计算：将反应产物稀释25倍后送GC-MS检测，后采用MassLynx软件对L-肌肽产物峰进行积分，根据产物峰面积计算产物浓度，最终可得本实施例制备的粗酶酶活为80U。

实施例3：重组酶的纯化及催化反应

利用含如SEQ ID NO.1所示祖先基因序列的重组表达载体构建重组菌，制备氨肽酶及L-肌肽。重组菌的构建同实施例2，氨肽酶的制备如下：

S1：将重组菌接种于接种于含100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜，按1％的接种量转接于三角烧瓶中，于37℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.6，后加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG作为诱导剂，16℃诱导24h后，将培养液离心，收集细胞，后用pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤两次后重悬，在冰浴中超声破碎。

S2：破碎液12000rpm离心20min，收集上清，得粗酶液。

S3：将上述破碎后离心得到的粗酶液上样到镍柱进行纯化(本发明的蛋白含组氨酸标签，故可以采用镍柱对粗酶蛋白进行纯化)，酶纯化缓冲液配方为：A液：Tris-HCl缓冲液(20mM，pH＝8.0)，含有20mM咪唑、20mM Tris-HCl、500mM NaCl；B液：Tris-HCl缓冲液(20mM,pH＝8.0)，含有500mM咪唑、20mM Tris-HCl、500mM NaCl。纯化的具体方法为：首先用A液洗脱杂蛋白，随后用梯度咪唑洗脱目标蛋白，将纯化后的样品经SDS-PAGE检测，根据检测结果收集纯化后的蛋白质，超滤浓缩。

将超滤浓缩后的酶液进行酶催化反应合成L-肌肽，步骤如下：

S1：将超滤后的酶液加到含有50mMβ-丙氨酸甲酯盐酸盐和100mM L-组氨酸的缓冲溶液中，催化β-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-组氨酸合成肌肽。具体为：

5mL反应体系：0.5Mβ-丙氨酸甲酯盐酸盐500ul，0.2M L-组氨酸：2.5mL,pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液1.9mL，纯化后的酶液100ul(酶液蛋白浓度为0.5mg/ml)

S2：所述缓冲溶液为pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液；

S3：将S1中的反应体系在25℃反应10min后可用1M盐酸调节反应pH＝3-4,以终止反应。

上述反应结束后，取S3反应液，经高效液相色谱检测产物生成。

高效液相色谱检测条件如下：

固定相：NH₂色谱柱；流动相：50mM磷酸二氢钾水溶液-乙腈(磷酸二氢钾和乙腈的体积比为35：65，水溶液用磷酸调至pH＝4.0)；流速：0.7ml/min；进样量：10ul；紫外检测波长：215nm；采用L-肌肽标准品作为参考。

根据上述L-肌肽生成情况对纯化后的酶液进行合成方向的酶活测定；每分钟生成1umol肌肽视为一个酶活力单位。纯酶的酶活为140U，肌肽产量为32mM。

实施例4

利用含如SEQ ID NO.2所示祖先基因序列的重组表达载体构建重组菌，制备氨肽酶及L-肌肽。其中，L-肌肽合成中所用酶为粗酶液，重组表达载体、重组菌、制备氨肽酶及L-肌肽的方法同实施例2，不同仅在于所用的祖先序列。

实施例5

利用含如SEQ ID NO.2所示祖先基因序列的重组表达载体构建重组菌，制备氨肽酶及L-肌肽。其中，L-肌肽合成中所用酶为纯化后的酶，重组表达载体、重组菌、制备氨肽酶及L-肌肽的方法同实施例3，不同仅在于所用的祖先序列。

实施例6

以祖先酶序列SEQ ID NO.1构建的重组载体得到的氨肽酶为对象(实施例3)，研究温度、pH值对酶活的影响。

(1)温度对氨肽酶酶活的影响。

取200ul纯酶，蛋白浓度为1mg/ml，加入到9.8ml含有50mMβ-丙氨酸甲酯盐酸盐和100mM L-组氨酸的缓冲溶液中，分别在不同温度(如下表2所示)下，反应10min，用高效液相色谱分析测定产物生成率。结果如表2所示。

表2氨肽酶在不同温度下反应的酶活

由表2可知，该酶在45℃表现出最高活性，将该温度下的活性定义为100％，温度超过55℃时，酶活迅速下降，所制备的酶在15-55℃均有较好酶活及稳定性。。

(2)pH对氨肽酶酶活的影响。

测定酶活温度为45℃，取200ul纯酶，蛋白浓度为1mg/ml，加入到9.8ml含有50mMβ-丙氨酸甲酯盐酸盐和100mM L-组氨酸的缓冲溶液中，分别在不同pH(4-11)下，反应10min，用高效液相色谱分析测定产物生成率，结果如表3所示。

表3氨肽酶在不同pH条件下反应的酶活。

由表3可知，在pH＝9的Tris-HCl缓冲液中，氨肽酶的相对活性最高，定义为100％。乙酸-乙酸钠缓冲液对酶活的影响较大，在PB缓冲液及甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中的相对酶活相比Tris-HCl缓冲液弱，且酶在碱性环境中的相对酶活更优。

实施例7

考察实施例5构建的氨肽酶的酶活受pH及温度的影响。结果表明通过祖先序列重建得到的祖先酶蛋白酶最适反应温度为45℃，最适反应pH为9.0，在碱性环境下仍能保持较高的酶活力，能够抵御复杂的生存环境，这一优势也为其后期适应复杂的工业化生产条件奠定了基础。

图1-2分别为酶反应液LC-MS检测结果图以及L-肌肽标品LC-MS检测结果图。由图可知，酶反应产物质谱结果与L-肌肽标品质谱结果一致，表明本发明所述的氨肽酶祖先酶成功催化底物L-组氨酸和β-丙氨酸甲酯盐酸盐生成了目标产物L-肌肽。

本发明通过祖先序列构建筛选得到了可以催化底物L-组氨酸和β-丙氨酸甲酯盐酸盐生成L-肌肽的祖先酶基因，与已有蛋白相比，筛选的到的祖先酶蛋白有更强的pH耐受性，更能适应复杂的环境，同时，得到的氨肽酶的酶活可达140U，催化生产L-肌肽的产量为32mM，具有良好的工业应用前景。

上述实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能够理解和使用发明。熟悉本领域的技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并将在此说明的一般原理应用到其他实施例中。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的修改和改进都应在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种氨肽酶，其特征在于，所述氨肽酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

2.一种编码权利要求1所述氨肽酶的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于，含权利要求2所述核苷酸的重组表达载体。

4.一种重组菌，其特征在于，含权利要求3所述重组表达载体的菌株。

5.一种构建权利要求4所述重组菌的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

根据氨肽酶祖先序列重建技术挖掘出的祖先序列进行密码子优化后，获得如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，将核苷酸序列与表达载体连接，得到如权利要求3所述的重组表达载体；将重组表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞，获得重组菌。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述表达载体为pET28a(+)。

8.一种权利要求1所述氨肽酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将权利要求4所述重组菌于16℃诱导、发酵24h后，离心收集菌体，冰水浴超声破碎收集菌体，得到含有氨肽酶粗酶的破碎液；

(2)将破碎液离心获得含有氨肽酶的上清液，即粗酶液；

(3)将步骤(2)所得含氨肽酶的上清液纯化，获得氨肽酶。

9.根据权利要求8所述的氨肽酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，发酵所用培养基为LB液体培养基，每升培养基包括如下组分：酵母粉5g、胰蛋白胨10g、NaCl 10g；所述离心的速度为10000-12000rpm，时间为2-10min，所述超声的功率200-300W，时间15-20min；步骤(2)中，所述离心的速度为10000-12000rpm，时间为8-15min。