CN111690585B - rcsB基因缺失的重组粘质沙雷氏菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了rcsB基因缺失的重组粘质沙雷氏菌及其应用，属于生物技术领域。本发明提供了一株可高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌工程菌JNB5‑1ΔrcsB，此粘质沙雷氏菌工程菌JNB5‑1ΔrcsB是通过敲除粘质沙雷氏菌JNB5‑1中编码转录调控因子RcsB的基因获得的，将此粘质沙雷氏菌工程菌JNB5‑1ΔrcsB接种至LB液体培养基中发酵24h，即可使发酵液中灵菌红素的产量高达116.48mg/L，是野生型粘质沙雷氏菌JNB5‑1的2.28倍。

Description

rcsB基因缺失的重组粘质沙雷氏菌及其应用

技术领域

本发明涉及rcsB基因缺失的重组粘质沙雷氏菌及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

灵菌红素(Prodigiosin，PG)是一种具有3个吡咯环的甲氧基吡咯骨架结构类物质，可由沙雷氏菌属(Serratia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、河氏菌属(Hahella)、弧菌属(Vibrio)和海洋新细菌(Zooshikella rubidus)等合成。

灵菌红素能在铜离子的配合下破坏细胞的双链DNA，而癌细胞内的铜离子浓度远高于普通细胞(癌细胞内的铜离子浓度一般为普通细胞的3.5倍)；灵菌红素在pH为6.8的条件下表现出最有效的DNA破坏作用，而癌细胞相比起普通细胞具有更接近6.8的pH(普通细胞的pH在7.4左右，癌细胞的pH在6.8左右)；此外，灵菌红素还能促进细胞集结，阻止癌细胞对周遭组织的入侵或是远端转移。因此，灵菌红素能有效对抗一系列的癌细胞，例如肺，结肠，肾和乳房的癌细胞系。灵菌红素的抗癌活性使得其在医药领域具有极高的应用前景。

目前，生产灵菌红素的方法主要有化学合成法和微生物发酵法。其中，化学合成法主要是通过串联共轭加成及高温脱氢的方法获得灵菌红素。但是，由于途径复杂且困难、产率低下，化学合成法难以实现大规模工业化生产。微生物发酵法则主要是通过微生物发酵获得灵菌红素。与化学合成法相比，微生物发酵法具有工艺相对简单、环境友好、条件温和和成本低等的优势。

然而，现有的生物法也仍存在一定的缺陷，其中，产量不高是阻碍微生物发酵法工业化进程最主要的缺陷。例如，Lee等人通过将Zooshikella ganghwensis KCTC 12044^T接种至Marine broth 2216培养基中进行发酵以生产灵菌红素，但是，使用此方法发酵24h，仅可使发酵液中灵菌红素的产量达15.40mg/L(具体可见参考文献：Lee,J.S.,Kim,Y.S.,Park,S.,Kim,J.,Kang,S.J.,Lee,M.H.,etal.(2011).Exceptional production of bothprodigiosin and cycloprodigiosin as major metabolic constituents by a novelmarine bacterium,Zooshikella rubidus S1-1.Appl.Environ.Microbiol.77,4967–4973.)；Lee等人通过将Hahella chejuensis KCTC 2396^T接种至Marine broth 2216培养基中进行发酵以生产灵菌红素，但是，使用此方法发酵24h，仅可使发酵液中灵菌红素的产量达28.10mg/L(具体可见参考文献：Lee,J.S.,Kim,Y.S.,Park,S.,Kim,J.,Kang,S.J.,Lee,M.H.,etal.(2011).Exceptional production of both prodigiosin andcycloprodigiosin as major metabolic constituents by a novel marine bacterium,Zooshikella rubidus S1-1.Appl.Environ.Microbiol.77,4967–4973.1)。

因此，急需找到一株可高产灵菌红素的微生物以克服上述缺陷。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一株可高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌工程菌。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一株粘质沙雷氏菌工程菌，所述粘质沙雷氏菌工程菌以粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)为宿主敲除编码转录调控因子RcsB的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述转录调控因子RcsB的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码转录调控因子RcsB的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述粘质沙雷氏菌为粘质沙雷氏菌JNB5-1。

本发明还提供了一种生产灵菌红素的方法，所述方法为将上述粘质沙雷氏菌工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有灵菌红素的发酵液；将含有灵菌红素的发酵液进行分离，获得灵菌红素。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为28～30℃、转速为150～200rpm。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为30℃、转速为180rpm。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为LB液体培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为LB液体培养基；所述LB液体培养基的成分包含10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠。

本发明还提供了上述粘质沙雷氏菌工程菌或上述方法在生产灵菌红素中的应用。

[有益效果]

本发明提供了一株可高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔrcsB，此粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔrcsB是通过敲除粘质沙雷氏菌JNB5-1中编码转录调控因子RcsB的基因获得的，将此粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔrcsB接种至LB液体培养基中发酵24h，即可使发酵液中灵菌红素的产量高达116.48mg/L，是野生型粘质沙雷氏菌JNB5-1的2.28倍。

附图说明

图1：粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔrcsB的PCR验证结果；其中，M为DNA Marker(2000bp)，1为以粘质沙雷氏菌JNB5-1基因组为模板的PCR结果，2为以粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔrcsB基因组为模板的PCR结果。

图2：粘质沙雷氏菌JNB5-1和粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔrcsB发酵生产灵菌红素的产量。

具体实施方式

下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1购自唯地生物公司；下述实施例中涉及的pUTmini质粒购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心；下述实施例中涉及的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)JNB5-1记载于文献“徐虹,徐美娟,杨套伟,等.温度对粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的影响[J].微生物学报,2014,54(5):517-524.”中，并且，申请人保证从申请日起二十年内向公众发放此菌株。

下述实施例中涉及的培养基和试剂如下：

LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠10g/L。

LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠10g/L、琼脂15g/L。

牛膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂20g/L。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

灵菌红素含量的测定：以酸性乙醇为空白对照，取发酵液溶解到酸性乙醇(pH3.0)中，得到样品；将样品做适度的稀释(50、250、1000倍)，得到稀释样品；将稀释样品密封放置8h(充分溶解灵菌红素)后3000r·min^-1离心10min，取上清；测定上清的A₅₃₅的值，根据标准曲线Y＝1.1936X-0.001计算得到发酵液中灵菌红素的含量；标准曲线Y＝1.1936X-0.001中，Y代表A₅₃₅值，X代表灵菌红素产量，单位mg/100mL。

实施例1：粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔrcsB的构建

具体步骤如下：

以粘质沙雷氏菌JNB5-1的基因组为模板，分别以RcsB-D-U-F/RcsB-D-U-R(SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4)和RcsB-D-D-F/RcsB-D-D-R(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)为引物，通过PCR扩增获得DNA片段RcsB-U(SEQ ID NO:7)和DNA片段RcsB-D(SEQ ID NO:8)；合成aacC3抗性基因(SEQ ID NO:9)；通过重叠延伸PCR将DNA片段RcsB-U、DNA片段RcsB-D与aacC3抗性基因依次相连，得到DNA片段RcsB-AacC3；将DNA片段RcsB-AacC3与经Kpn I酶切后的线性化pUTmini质粒经同源重组后进行连接，得到重组质粒pUTmini-rcsB；重组质粒pUTmini-rcsB转化大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1，得到转化产物1；将转化产物1涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL^-1硫酸安普霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子1；挑取转化子1接种至LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得大肠杆菌工程菌S17-1/pUTmini-rcsB；将大肠杆菌工程菌S17-1/pUTmini-rcsB和粘质沙雷氏菌JNB5-1分别接种至LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下培养16h，得到培养液；将培养液离心取菌体；将大肠杆菌工程菌S17-1/pUTmini-rcsB和粘质沙雷氏菌JNB5-1共同接种至牛膏蛋白胨固体培养基上进行共培养，通过接合转移的方式将大肠杆菌工程菌S17-1/pUTmini-rcsB中的重组质粒pUTmini-rcsB转化至粘质沙雷氏菌JNB5-1中，得到转化产物2；将转化产物2涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL^-1安普霉素和50μg·mL^-1克林霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12～24h，得到转化子2；挑取转化子2接种至LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养8～12h稳定遗传三代，得到培养液；提取培养液中转化子2的基因组DNA和粘质沙雷氏菌JNB5-1的基因组DNA，以RcsB-YZ-F/RcsB-YZ-R(SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11)为引物，通过PCR扩增单菌落中编码转录调控因子RcsB的基因rcsB(SEQ ID No.2)，扩增成功即获得粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔrcsB(PCR验证结果将图1)。

实施例2：灵菌红素的生产

具体步骤如下：

以粘质沙雷氏菌JNB5-1为对照，挑取实施例1获得的粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔrcsB的单菌落接种至LB液体培养基(含有50μg·mL^-1安普霉素和50μg·mL^-1克林霉素)中，于37℃、180rpm的条件下振荡培养至对数生长期初期(OD₆₀₀＝0.6)，得到种子液；将种子液以4％(v/v)接种量接种至LB液体培养基中，于30℃、180rpm的条件下发酵24h，获得发酵液。

发酵过程中，间隔2h检测发酵液中灵菌红素的含量(检测结果见图2)，结果表明：发酵24h时，粘质沙雷氏菌JNB5-1发酵获得的发酵液中灵菌红素的产量为51.01mg/L，粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔrcsB发酵获得的发酵液中灵菌红素的产量为116.48mg/L，是野生型粘质沙雷氏菌JNB5-1的2.28倍。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> rcsB基因缺失的重组粘质沙雷氏菌及其应用

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 216

<212> PRT

<213> 粘质沙雷氏菌

<400> 1

Met Asn Asn Leu Asn Val Ile Ile Ala Asp Asp His Pro Ile Val Leu

1 5 10 15

Phe Gly Ile Arg Lys Ser Leu Glu Gln Ile Glu Trp Val Asn Val Val

20 25 30

Gly Glu Phe Glu Asp Ser Thr Ala Leu Ile Asn Asn Leu Ser Lys Leu

35 40 45

Asp Ala Asn Val Leu Ile Thr Asp Leu Ser Met Pro Gly Asp Lys Tyr

50 55 60

Gly Asp Gly Ile Thr Leu Ile Lys Tyr Ile Lys Arg His Tyr Pro Gln

65 70 75 80

Leu Ser Ile Ile Val Leu Thr Met Asn Asn Asn Pro Ala Ile Leu Ser

85 90 95

Ala Val Leu Asp Leu Asp Ile Glu Gly Ile Val Leu Lys Gln Gly Ala

100 105 110

Pro Thr Asp Leu Pro Lys Ala Leu Ala Ala Leu Gln Lys Gly Lys Lys

115 120 125

Phe Thr Pro Glu Ser Val Ser Lys Leu Leu Glu Lys Ile Ser Ala Ser

130 135 140

Gly Tyr Gly Asp Lys Arg Leu Ser Pro Lys Glu Ser Glu Val Leu Arg

145 150 155 160

Leu Phe Ala Glu Gly Phe Leu Val Thr Glu Ile Ala Lys Lys Leu Asn

165 170 175

Arg Ser Ile Lys Thr Ile Ser Ser Gln Lys Lys Ser Ala Met Met Lys

180 185 190

Leu Gly Val Glu Asn Asp Ile Ala Leu Leu Asn Tyr Leu Ser Ser Val

195 200 205

Ser Met Thr Pro Leu Asp Lys Asp

210 215

<210> 2

<211> 651

<212> DNA

<213> 粘质沙雷氏菌

<400> 2

atgaataacc tgaacgtaat tattgctgat gaccatccta tcgtactgtt tggcatccgg 60

aagtcacttg agcaaattga atgggtgaat gtcgttgggg agttcgaaga ctcaaccgca 120

ctgatcaaca atctgtccaa gctggacgcc aacgtgctga tcaccgatct gtcgatgccg 180

ggtgacaagt atggcgacgg catcacgctg attaaataca tcaagcgcca ctatccgcag 240

ttgtcgatca tcgtgctgac catgaacaac aacccggcga tcctgagcgc ggtattggat 300

ctggatatcg aaggcatcgt gctgaaacaa ggcgcgccga ccgatctgcc gaaggcgctg 360

gccgccctgc aaaaaggcaa gaagttcacg ccggaaagcg tctccaaact gctggagaag 420

atcagcgcca gcggctatgg cgacaaacgc ctgtcgccga aagagagcga agtgctgcgt 480

ctgttcgccg aaggtttcct ggtgaccgaa atcgccaaga aactcaaccg cagcatcaaa 540

accatcagca gccagaagaa atcggcgatg atgaagctgg gcgtcgaaaa cgacatcgcc 600

ctgctcaact acctctcgtc cgtcagcatg acgccgttgg acaaagacta a 651

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctaggccga attcgagctc ggtaccctct ggttatcgac catgagccc 49

<210> 4

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg gtgacttccg gatgccaaac 60

ag 62

<210> 5

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgcgaagaa tgcgatgccg ctcgccagtc gattggctga agactaaagc ccgcctcacg 60

<210> 6

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggattacagc cggatccccg ggtacctggc gatctgcgag aagttgg 47

<210> 7

<211> 1040

<212> DNA

<213> 粘质沙雷氏菌

<400> 7

ctctggttat cgaccatgag cccgagcacc ctgaccgcct gattttccaa atcaacgaca 60

ccggctccgg catctccaac gaagagatca gcaaccttaa ctatccgttc ctcagccaga 120

cgctggtgga tcgcttcaac cacggttccg gcctcacgtt cttcctgtgc aatcagttgt 180

gcaagaagct taacggccag ttggacattc gcagcaaggt ggatatcggc actcgctaca 240

ccattcgcgt cgccatggag atggagaaaa aagagccgca ggagcaggaa aagctgctcg 300

acggcgtcac cgccttgctg gacgttacgt cggatgaagt gcgcggcatc gtgactcgtc 360

tgctgcaggc ctacggcgcc gactgcctcg tcgccgaaga tcgcgcggtc aaccgcgatt 420

atgacgtgct gctgaccgat aacccgcagc gcgccgatga ttacaccctg ttgctggcga 480

ccgatgaacc gggctggcaa gcgctggata aacgctacat tcgggtgaac tataatctga 540

acggcgcttt aatcgacgcc gtgctgatgc tgatcgaaca gcaaatggcc gcgctggaac 600

aggaagaaag cccgctttca ttgagttcag aagatatcca actctatgaa aaacaattga 660

aatcaagtga ttactatggg ctgtttgtcg atacagtacc cgacgatgtc aaaaaactgt 720

atactgaggc gggcagcagt gatttcaatg cgctgtcaca aaccgcacac cgcctgaaag 780

gcgtgtttgc catgttaaat ctgcttcccg gcaagcagct gtgcgaatcg ttagaacagc 840

gcatcgcaga aggtgatgcg cccgagatcg agaataacat cagtcagatt gattttttcg 900

tcagcagact gctgaagcaa ggtagccaac aacatgaata acctgaacgt aattattgct 960

gatgaccatc ctatcgtact gtttggcatc cggaagtcac cgcggaaccc ctatttgttt 1020

atttttctaa atacattcaa 1040

<210> 8

<211> 992

<212> DNA

<213> 粘质沙雷氏菌

<400> 8

atgcgaagaa tgcgatgccg ctcgccagtc gattggctga agactaaagc ccgcctcacg 60

gcaggttaac gccaaacagg cacggcatcc gccgtgcctg tttgcttttc agacctcgct 120

gcggttgtag cgtacccgtt ggctgtaata tgccagcgtc tgctccagcg tctccagcgt 180

gaccggcttc gacaggcaat tatccatgcc cgcctcgagg cagcgctgtt tctcttccgc 240

caacgcgttc gccgtcacgc caatcaccgg cgcactgaac tgcatctgcc gcagggtctg 300

cgtcagacga tagccgtcca tgttcggcat attgacgtcg gtcagcacaa tatcaacatg 360

gtgctgtttc agcacgccga gcgcgtcgac gccatcattg gcggtcacca cctgataccc 420

cagcgacccc agctgatcgg aaagcaggcg acggttgatc ggatgatcgt caaccaccag 480

cagataaata tcgccgttgt ccgccgcact ggccttggcg ggcaccggca gttgcaccag 540

cgcctctgcc gcgccgtggc cgacgccgaa caaccggttg attaaggtca gcgtttcacg 600

cggcgtagag gtgctgtgca tccaatagcc cggccgggtt tcctgcgatg gaccgatatg 660

ttcggtggag aattggatct gagccagcag cggcgtgttc atcatcagcg ggtaatcgct 720

gagcatcacc tcgccggcgg cggtatcctg cccgtcatag cgctggatat cggcgccgta 780

gccgcccaga atcgccatca ggtaactttc caggcgctga ttgcggatat ccagccacag 840

ccgccggccc tgccaggtat cgctggcctg cgggatcggg aactgggcgt taaacaatgg 900

aatgcgaatg ctgaacaagc tgcccagccc cggttcggac tcgacggaga cgtcgccgtc 960

catcaggttg accaacttct cgcagatcgc ca 992

<210> 9

<211> 909

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga 60

caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgtc atcagcggtg 120

gagtgcaatg tcgtgcaata cgaatggcga aaagccgagc tcatcggtca gcttctcaac 180

cttggggtta cccccggcgg tgtgctgctg gtccacagct ccttccgtag cgtccggccc 240

ctcgaagatg ggccacttgg actgatcgag gccctgcgtg ctgcgctggg tccgggaggg 300

acgctcgtca tgccctcgtg gtcaggtctg gacgacgagc cgttcgatcc tgccacgtcg 360

cccgttacac cggaccttgg agttgtctct gacacattct ggcgcctgcc aaatgtaaag 420

cgcagcgccc atccatttgc ctttgcggca gcggggccac aggcagagca gatcatctct 480

gatccattgc ccctgccacc tcactcgcct gcaagcccgg tcgcccgtgt ccatgaactc 540

gatgggcagg tacttctcct cggcgtggga cacgatgcca acacgacgct gcatcttgcc 600

gagttgatgg caaaggttcc ctatggggtg ccgagacact gcaccattct tcaggatggc 660

aagttggtac gcgtcgatta tctcgagaat gaccactgct gtgagcgctt tgccttggcg 720

gacaggtggc tcaaggagaa gagccttcag aaggaaggtc cagtcggtca tgcctttgct 780

cggttgatcc gctcccgcga cattgtggcg acagccctgg gtcaactggg ccgagatccg 840

ttgatcttcc tgcatccgcc agaggcggga tgcgaagaat gcgatgccgc tcgccagtcg 900

attggctga 909

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atcagtccaa gtggcccatc ttc 23

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gacccggctg gaaacccag 19

Claims (10)

1.一株粘质沙雷氏菌工程菌，其特征在于，所述粘质沙雷氏菌工程菌以粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)为宿主敲除编码转录调控因子RcsB的基因。

2.如权利要求1所述的一株粘质沙雷氏菌工程菌，其特征在于，所述转录调控因子RcsB的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.如权利要求1或2所述的一株粘质沙雷氏菌工程菌，其特征在于，所述编码转录调控因子RcsB的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.如权利要求1-3任一所述的一株粘质沙雷氏菌工程菌，其特征在于，所述粘质沙雷氏菌为粘质沙雷氏菌JNB5-1。

5.一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1-4任一所述的粘质沙雷氏菌工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有灵菌红素的发酵液；将含有灵菌红素的发酵液进行分离，获得灵菌红素。

6.如权利要求5所述的一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述发酵的温度为28～30℃、转速为150～200rpm。

7.如权利要求5或6所述的一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述发酵的温度为30℃、转速为180rpm。

8.如权利要求5-7任一所述的一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述发酵培养基为LB液体培养基。

9.如权利要求8所述的一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述发酵培养基为LB液体培养基；所述LB液体培养基的成分包含10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠。

10.权利要求1-4任一所述的粘质沙雷氏菌工程菌或权利要求5-9任一所述的方法在生产灵菌红素中的应用。

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