CN111718884B

CN111718884B - Bvg90_08615基因缺失的粘质沙雷氏菌工程菌

Info

Publication number: CN111718884B
Application number: CN202010617003.5A
Authority: CN
Inventors: 饶志明; 潘学玮; 杨套伟; 尤甲甲; 易敢峰; 付维来; 徐美娟; 张显; 邵明龙
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2020-06-30
Publication date: 2021-11-12
Anticipated expiration: 2040-06-30
Also published as: CN111718884A

Abstract

本发明公开了BVG90_08615基因缺失的粘质沙雷氏菌工程菌，属于生物技术领域。本发明提供了一株可高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌工程菌JNB5‑1ΔBVG90_08615，此粘质沙雷氏菌工程菌JNB5‑1ΔBVG90_08615是通过敲除粘质沙雷氏菌JNB5‑1中编码转录调控因子BVG90_08615的基因获得的，将此粘质沙雷氏菌工程菌JNB5‑1ΔBVG90_08615接种至LB液体培养基中发酵24h，即可使发酵液中灵菌红素的产量高达58.68mg/L，是野生型粘质沙雷氏菌JNB5‑1的1.15倍。

Description

BVG90_08615基因缺失的粘质沙雷氏菌工程菌

技术领域

本发明涉及BVG90_08615基因缺失的粘质沙雷氏菌工程菌，属于生物技术领域。

背景技术

灵菌红素(Prodigiosin，PG)是一类由微生物产生的次级代谢产物。研究发现，灵菌红素具有多种生物活性，包括：抗细菌、抗痢疾、抗肿瘤和免疫抑制等，因此，灵菌红素在医药开发等领域均具有巨大的应用价值。

目前，生产灵菌红素的方法主要有化学合成法和微生物发酵法。其中，化学合成法主要是通过串联共轭加成及高温脱氢的方法获得灵菌红素。但是，由于途径复杂且困难、产率低下，化学合成法难以实现大规模工业化生产。微生物发酵法则主要是通过微生物发酵获得灵菌红素。与化学合成法相比，微生物发酵法具有工艺相对简单、环境友好、条件温和和成本低等的优势。

然而，现有的生物法也仍存在一定的缺陷，其中，产量不高是阻碍微生物发酵法工业化进程最主要的缺陷。例如，Lee等人通过将Zooshikella ganghwensisKCTC12044^T接种至Marine broth 2216培养基中进行发酵以生产灵菌红素，但是，使用此方法发酵24h，仅可使发酵液中灵菌红素的产量达15.40mg/L(具体可见参考文献：Lee,J.S.,Kim,Y.S.,Park,S.,Kim,J.,Kang,S.J.,Lee,M.H.,etal.(2011).Exceptional production of bothprodigiosin and cycloprodigiosinas majormetabolic constituents by a novelmarine bacterium,Zooshikella rubidus S1-1.Appl.Environ.Microbiol.77,4967-4973.)；Lee等人通过将HahellachejuensisKCTC2396^T接种至Marinebroth2216培养基中进行发酵以生产灵菌红素，但是，使用此方法发酵24h，仅可使发酵液中灵菌红素的产量达28.10mg/L(具体可见参考文献：Lee,J.S.,Kim,Y.S.,Park,S.,Kim,J.,Kang,S.J.,Lee,M.H.,etal.(2011).Exceptional production of both prodigiosin andcycloprodigiosin as major metabolic constituents by a novel marine bacterium,Zooshikella rubidusS1-1.Appl.Environ.Microbiol.77,4967-4973.1)。

因此，急需找到一株可高产灵菌红素的微生物以克服上述缺陷。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一株可高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌工程菌。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一株粘质沙雷氏菌工程菌，所述粘质沙雷氏菌工程菌以粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)为宿主敲除编码转录调控因子BVG90_08615的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述转录调控因子BVG90_08615的氨基酸序列如SEQID No.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码转录调控因子BVG90_08615的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述粘质沙雷氏菌为粘质沙雷氏菌JNB5-1。

本发明还提供了一种生产灵菌红素的方法，所述方法为将上述粘质沙雷氏菌工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有灵菌红素的发酵液；将含有灵菌红素的发酵液进行分离，获得灵菌红素。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为28～30℃、转速为150～200rpm。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为30℃、转速为180rpm。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为LB液体培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为LB液体培养基；所述LB液体培养基的成分包含10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠。

本发明还提供了上述粘质沙雷氏菌工程菌或上述方法在生产灵菌红素中的应用。

[有益效果]

本发明提供了一株可高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_08615，此粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_08615是通过敲除粘质沙雷氏菌JNB5-1中编码转录调控因子BVG90_08615的基因获得的，将此粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_08615接种至LB液体培养基中发酵24h，即可使发酵液中灵菌红素的产量高达58.68mg/L，是野生型粘质沙雷氏菌JNB5-1的1.15倍。

附图说明

图1：粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_08615的菌落PCR验证结果；其中，DNAMarker(2000bp)，1为以粘质沙雷氏菌JNB5-1基因组为模板的PCR结果，2为以粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_08615基因组为模板的PCR结果。

图2：粘质沙雷氏菌JNB5-1、粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_08615、粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_03840和粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_24040发酵生产灵菌红素的产量。

具体实施方式

下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1购自唯地生物公司；下述实施例中涉及的pUTmini质粒购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心；下述实施例中涉及的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)JNB5-1记载于文献“徐虹,徐美娟,杨套伟,等.温度对粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的影响[J].微生物学报,2014,54(5):517-524.”中，并且，申请人保证从申请日起二十年内向公众发放此菌株。

下述实施例中涉及的培养基和试剂如下：

LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠10g/L。

LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠10g/L、琼脂15g/L。

牛膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl5g/L、琼脂20g/L。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

灵菌红素含量的测定：以酸性乙醇为空白对照，取发酵液溶解到酸性乙醇(pH3.0)中，得到样品；将样品做适度的稀释(50、250、1000倍)，得到稀释样品；将稀释样品密封放置8h(充分溶解灵菌红素)后12000r·min^-1离心10min，取上清；测定上清的A₅₃₅的值，根据标准曲线Y＝1.1936X-0.001计算得到发酵液中灵菌红素的含量；标准曲线Y＝1.1936X-0.001中，Y代表A₅₃₅值，X代表灵菌红素产量，单位mg/100mL。

实施例1：粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_08615的构建

具体步骤如下：

以粘质沙雷氏菌JNB5-1的基因组为模板，分别以08615-D-U-F/08615-D-U-R(SEQID NO:3和SEQ ID NO:4)和08615-D-D-F/08615-D-D-R(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)为引物，通过PCR扩增获得DNA片段BVG90_08615-U(SEQ ID NO:7)和DNA片段BVG90_08615-D(SEQID NO:8)；合成aacC3抗性基因(SEQ ID NO:9)；通过重叠延伸PCR将DNA片段BVG90_08615-U、DNA片段BVG90_08615-D与aacC3抗性基因依次相连，得到DNA片段BVG90_08615-AacC3；将DNA片段BVG90_08615-AacC3与经KpnI酶切后的线性化pUTmini质粒经同源重组后进行连接，得到重组质粒pUTmini-BVG90_08615；重组质粒pUTmini-BVG90_08615转化大肠杆菌(Escherichiacoli)S17-1，得到转化产物1；将转化产物1涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL^-1硫酸铵普霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子1；挑取转化子1接种至LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得大肠杆菌工程菌S17-1/pUTmini-BVG90_08615；将大肠杆菌工程菌S17-1/pUTmini-BVG90_08615和粘质沙雷氏菌JNB5-1分别接种至LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下培养16h，得到培养液；将培养液离心取菌体；将大肠杆菌工程菌S17-1/pUTmini-BVG90_08615和粘质沙雷氏菌JNB5-1共同接种至牛膏蛋白胨固体培养基上进行共培养，通过接合转移的方式将大肠杆菌工程菌S17-1/pUTmini-BVG90_08615中的重组质粒pUTmini-BVG90_08615转化至粘质沙雷氏菌JNB5-1中，得到转化产物2；将转化产物2涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL^-1安普霉素和50μg·mL^-1克林霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12～24h，得到转化子2；挑取转化子2接种至LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养8～12h稳定遗传三代，得到培养液；提取培养液中转化子2的基因组DNA和粘质沙雷氏菌JNB5-1的基因组DNA，以08615-YZ-F/08615-YZ-R(SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11)为引物，通过PCR扩增单菌落中编码转录调控因子BVG90_08615的基因BVG90_08615，扩增成功即获得粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_08615(PCR验证结果将图1)。

参照与构建粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_11450同样的方法，构建粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_03840和JNB5-1ΔBVG90_24040；

其中，构建粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_03840所用的引物为03840-D-U-F/03840-D-U-R(SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13)和03840-D-D-F/03840-D-D-R(SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15)；构建粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_03840所用的DNA片段为BVG90_03840-U和BVG90_03840-D(SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17)；

构建粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_24040所用的引物为24040-D-U-F/24040-D-U-R(SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19)和24040-D-D-F/24040-D-D-R(SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21)；构建粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_24040所用的DNA片段为BVG90_24040-U和BVG90_24040-D(SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23)。

实施例2：灵菌红素的生产

具体步骤如下：

以粘质沙雷氏菌JNB5-1为对照，分别挑取实施例1获得的粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_08615、JNB5-1ΔBVG90_03840和JNB5-1ΔBVG90_24040的单菌落接种至LB液体培养基(含有50μg·mL^-1安普霉素和50μg·mL^-1克林霉素)中，于37℃、180rpm的条件下振荡培养至对数生长期初期(OD₆₀₀＝0.6)，得到种子液；将种子液以4％(v/v)接种量接种至LB液体培养基中，于30℃、180rpm的条件下发酵24h，获得发酵液。

发酵过程中，间隔2h检测发酵液中灵菌红素的含量(检测结果见图2)，结果表明：发酵24h时，粘质沙雷氏菌JNB5-1发酵获得的发酵液中灵菌红素的产量为51.01mg/L，粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_08615发酵获得的发酵液中灵菌红素的产量为58.68mg/L，是野生型粘质沙雷氏菌JNB5-1的1.15倍，而粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_03840和JNB5-1ΔBVG90_24040发酵获得的发酵液中灵菌红素的产量分别仅有49.45mg/L和50.16mg/L，分别为野生型粘质沙雷氏菌JNB5-1的0.97倍和0.98倍。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> BVG90_08615基因缺失的粘质沙雷氏菌工程菌

<160> 23

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 64

<212> PRT

<213> 粘质沙雷氏菌

<400> 1

Met Glu Lys Lys Thr Ala Arg Leu Thr Val Leu Ile Asp Pro Asp Lys

1 5 10 15

Lys Lys Ala Leu Glu Glu Leu Cys Leu Gln Gln Asp Val Thr Pro Ser

20 25 30

Gln Val Val Arg Gln Leu Ile Arg Asp Tyr Leu His Lys His Gln Val

35 40 45

Asp Tyr Pro Ser Gln Pro Thr His Ala Asn Pro Arg Val Glu Ser Asn

50 55 60

<210> 2

<211> 195

<212> DNA

<213> 粘质沙雷氏菌

<400> 2

tcaattgctc tcgactcgcg gattggcgtg ggtcggctgg ctgggataat ccacctgatg 60

tttgtgcaga taatcgcgga tcagctgacg caccacctgg gaaggggtga cgtcctgctg 120

caggcacagc tcttccaggg ctttcttctt gtccgggtca atcagcaccg ttagccgcgc 180

cgttttcttt tccat 195

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

taggccgaat tcgagctcgg taccgcaggt aagcgccgaa atagc 45

<210> 4

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cgagagcaat tgaacggcgg 60

<210> 5

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgaagaatgc gatgccgctc gccagtcgat tggctgacca tcaggatcct ccagagaatg 60

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

attacagccg gatccccggg taccgccacc gacaccatca gcc 43

<210> 7

<211> 572

<212> DNA

<213> 粘质沙雷氏菌

<400> 7

taggccgaat tcgagctcgg taccgcaggt aagcgccgaa atagcctttg ccgtagtgcg 60

cgcgctcgcc gggttcgcct tcactgctgc cgcccgccag cagaccggcg gcgtaggcgc 120

gtttaaccgc cagctcgtcg gcggcgagaa aggccagcat gctgccgttg ccggcgctgg 180

cgggctgtct gtcgaagggt tggtaggcgt aaaaacgcgg cagcgtttgg cctggcatca 240

cccagcagcg ggcggcgggg ccgccgtccg gcgtcacttc ccgccgttgt aaacccaatg 300

gcaacagaat ggcgtcgtag aacgcggcgg cggcatccag atcgctgacg ccgacggtaa 360

tatggctgaa catggcgcgt ttcctttccc aagagagaat aatgaacgcc taaaacagta 420

gcagcgatat cgcaggatgg acagaccgcc gtggaggatt cggattaggg acgcgcgcag 480

ggggaagcgc gcttcacggt ttgcggggca ggccgccgtt caattgctct cgcgcggaac 540

ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aa 572

<210> 8

<211> 565

<212> DNA

<213> 粘质沙雷氏菌

<400> 8

cgaagaatgc gatgccgctc gccagtcgat tggctgacca tcaggatcct ccagagaatg 60

atgactgaat gataatacca tgtggacgaa gcggccagcc agaccgcgtc gccgctcgtt 120

cttagcggaa atgcagccgt tctatcttgc gtgacaggta gccgagttcg cagttgaaca 180

gctcgccgct gccggcggcc agcgtgcgaa gcgtgctgag cggcaacgtc acctgggccg 240

gcgtggcgta aatgatcacg ttgccgctgg gggcgacgca aaacaatacg gtgccgaata 300

tccggtgcag gctgtggtac agcaggctgt tctcatcggg cagatcgtgg taattgagca 360

ccagccagcc cccgtcgttc agccgcgcgg cgcagttttc caggaatgtc tgggtgcctt 420

gctgcggatc catggcgaac gccgaataga gatcggagaa aatcagatcg taacgcgtct 480

cggcgggcgg gcgcacaaag tccatggcgt cggcggtacg caggctgatg gtgtcggtgg 540

cggtacccgg ggatccggct gtaat 565

<210> 9

<211> 909

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga 60

caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgtc atcagcggtg 120

gagtgcaatg tcgtgcaata cgaatggcga aaagccgagc tcatcggtca gcttctcaac 180

cttggggtta cccccggcgg tgtgctgctg gtccacagct ccttccgtag cgtccggccc 240

ctcgaagatg ggccacttgg actgatcgag gccctgcgtg ctgcgctggg tccgggaggg 300

acgctcgtca tgccctcgtg gtcaggtctg gacgacgagc cgttcgatcc tgccacgtcg 360

cccgttacac cggaccttgg agttgtctct gacacattct ggcgcctgcc aaatgtaaag 420

cgcagcgccc atccatttgc ctttgcggca gcggggccac aggcagagca gatcatctct 480

gatccattgc ccctgccacc tcactcgcct gcaagcccgg tcgcccgtgt ccatgaactc 540

gatgggcagg tacttctcct cggcgtggga cacgatgcca acacgacgct gcatcttgcc 600

gagttgatgg caaaggttcc ctatggggtg ccgagacact gcaccattct tcaggatggc 660

aagttggtac gcgtcgatta tctcgagaat gaccactgct gtgagcgctt tgccttggcg 720

gacaggtggc tcaaggagaa gagccttcag aaggaaggtc cagtcggtca tgcctttgct 780

cggttgatcc gctcccgcga cattgtggcg acagccctgg gtcaactggg ccgagatccg 840

ttgatcttcc tgcatccgcc agaggcggga tgcgaagaat gcgatgccgc tcgccagtcg 900

attggctga 909

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atcagtccaa gtggcccatc ttc 23

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gcttcaaaac tcaacccatt gagcag 26

<210> 12

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

taggccgaat tcgagctcgg taccgcaact gctgttgctg accg 44

<210> 13

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg aacctcaggt cggcagtctc 60

<210> 14

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

atgcgaagaa tgcgatgccg ctcgccagtc gattggctga gttttccggc tgtcggccg 59

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

attacagccg gatccccggg tacccggtgg ccaacatgca gaaa 44

<210> 16

<211> 1064

<212> DNA

<213> 粘质沙雷氏菌

<400> 16

taggccgaat tcgagctcgg taccgcaact gctgttgctg accgtggcgg tgctggtggt 60

gtccgccggc agcctggcgc acagcgcctg gatcaacctg gcgggcatcg cgctttcgct 120

ggtgctgatg gcctggctga tgaagcgtga agcgcacgcg cgcgcccgcc tgttgccgca 180

tggcgcattg cggcgcggct catcgctggc ggcgttgtac atcacgaccg cgttgctggt 240

gatcggcatg accagcgaaa tcttcgtgcc ctatttcctg cagctgctgc acggtcagtc 300

gccgctgatc tccggctata tcgccgccgc catggccgcc ggctggacgc tgtccgagat 360

cctcagctcc ggctggcgtg gggcgggcat tcgccgggcg atcgtcagcg ggccgctgtt 420

tgtgctggta ggcctgctgg cactggcgat cctgatgccg acgccgtccg gcggccactg 480

gcaggcgctg gcgccgatcg tcattgcgct attgctggtg ggattcggca tcggcttcgg 540

ttggccgcac ctgctgacgc gcattttgca ggtggcgcct gaagcggaca aagatatcgc 600

cggcgcttca attaccacgg tgcagctgtt cgccaccgca ttcggcgcgg cgctggccgg 660

gatgatcgtc aatctggcgg ggctgaacga tccgggcggc gcgacgggcg cggcatcggc 720

ggcgcgttgg ctgttcctgg cgttcgcgct ggcgccgctg ctggcggtat tcagcgcctg 780

gcgctgcgcg gcgatcgcgc cgccgggggc cgaaacggga aattttgtac aaaccccgcc 840

ctcgcgcgag agctagaacg cttctcctca cctggtgatg ttcgcggtga tccaggcgtt 900

attcctgcgc gacattttaa aatccgcttg ctatatctct aatttgagat tatttctctt 960

atatgggatt tttaagcgga gtatgaacga tggataacgg tttggagact gccgacctga 1020

ggttcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaa 1064

<210> 17

<211> 1064

<212> DNA

<213> 粘质沙雷氏菌

<400> 17

atgcgaagaa tgcgatgccg ctcgccagtc gattggctga gttttccggc tgtcggccgg 60

cgactgcctg cgctaccgcc tgttcggcgc ctcccgtttc catgtccccg gcgatgagcc 120

ggcccattac accctcgtta tctgcaggcc atagccatga ttgaattgca acagtgggac 180

gccgacgcgg cgcaaagcgc cattgccgac ttggccgaga tgctgcacgc cagcgtggcg 240

cacggcgcca gcatcggttt tgtcatgccc tttacgcagg aacaggcgca ggcattttgg 300

caggggttgc tgccggccat cgcgcgggga gagcgtgcga tgctggtggc gctcgcgaac 360

ggccggccgg tcggcaccgt gcaactgtta ctggcgatgc cggacaacgg ccgccaccgc 420

gcggaagtgg tcaagctgat ggtgcacccg caggcgcggc ggcagggcgt cgcccggttg 480

ttgatgcaag aagtgcaggc gctggcggcg cgtcattgcc gcagcctgtt ggtgctggat 540

actctgagcg gcagcgcggc gcaggggctg taccgtcaat tggggttcga ggcggcgggc 600

gacatcccgc aatacgcccg cgccagcgac ggcggggcgt tggaggccac ctgctatatg 660

tacaaactgc tgtgaggctt agcgcccgcg ccaggccttg atcgcctgtt ggcgcacctg 720

cagcttctgt tgcggcgtca gcttgttgta gtcgcgagcc aggccgcttt cccaatcgcc 780

gtacagcggg ttgggcagca cgatgaattc ggtgccgaac ttgccctgat tctcgctgac 840

gaacgcccgg cgctgcgcat tgtcctggtg gtaagtcgcg gcgccgaagt cgttcaggtt 900

gtcgcctgcg tacaccacga tgtcatagcc ggcttgtttg atggcgtcga agcgcgcctg 960

cttattggag gtatcggtgc tgagcagcac ggttttttcc gacatgccgg tgaatccgag 1020

tttctgcatg ttggccaccg ggtacccggg gatccggctg taat 1064

<210> 18

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

taggccgaat tcgagctcgg tacccgggca ttataacgaa gacggca 47

<210> 19

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg gacggtggcg ctggatct 58

<210> 20

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

atgcgaagaa tgcgatgccg ctcgccagtc gattggctga atatccagac agtggcgggg 60

<210> 21

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

attacagccg gatccccggg taccccagtt gccccagggt aaaact 46

<210> 22

<211> 1064

<212> DNA

<213> 粘质沙雷氏菌

<400> 22

taggccgaat tcgagctcgg tacccgggca ttataacgaa gacggcaagc gcgactatca 60

gcgccaactg tacgccggtt tcaaggacga tcgttacggc accctgacct atggccatca 120

atacggcatc tattattcgg tggtcggcat taaaagcgac gtctgggata acgatggcca 180

tgcgggcggc accggcatcg gcatttccgg cgactatgac ggtggcaata aaccgaaaaa 240

cagcatcaaa tacaccaatg atttcgggcc ggtcacgctg tacgccaact atttattgcc 300

ggaagacgat ctgcacaccg cggataacct gatttaccgc cgcaagggcg gtggcgggct 360

gggcttcgat tataaggtga cgaaggattt caccttcagc gcggcctaca gttataccga 420

cgcgaagatc aaagacaatc tgtaccacga acaggattat caccagcagc tgtccggcac 480

cgcgttaacc tggcagccga acaactggta catcgtcggc accgccagct attacaaaga 540

ttatgtgccg agcacccgcc agcgcacgct gtcgcacttc ttcgccggtg acggctacgg 600

gctggaaggc ttcgtcggtt atacctttaa tatcgacaag ccgttcctca aatccgtcca 660

gccttatgtg gcggcggact cgctgcggct gaagggagac gaggcgtatc acgccaacca 720

cgtctatctt ggcgcgggca ccaccatcgg ttacggtctg tcggtgtatg tggagcgcac 780

gctggccaac agcagcgaca atgagccgga ttccacctgg ataacggtgt tctacgattt 840

ctgattttca cctgctccaa gccggcgctt gcgccggctt tttcacatgg tgatcgcgcc 900

gcccagggtt tctccagagg cgttgcgctc cgccaggtag cgcgccggcg gtttgcccac 960

cgcctttctg aacatggtga cgaagccgct ggcgctctcg tagcccagat ccagcgccac 1020

cgtccgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaa 1064

<210> 23

<211> 1064

<212> DNA

<213> 粘质沙雷氏菌

<400> 23

atgcgaagaa tgcgatgccg ctcgccagtc gattggctga atatccagac agtggcgggg 60

gatctgtact ttcatgagaa tagttctcaa tttggcggaa ttgaaaagta ttatgtcctg 120

attgcgcaat gcggtctagc accggtgccg ataaagtaag cgccagtcct aaaccctttc 180

gcgaggaaac tgattatgtc attggatacc gccgattttc cgctggtgtg gatgcgccga 240

aacgggcgcg atacccaggc cgagctggcc gaattcagcg cgctgctggc gcgcgccgaa 300

ccttttgttc tgatcaccga ccgcagcgtc ggcgatgaag aagaagaaca tgaccgcgat 360

gctcgcaccc aggtggcgct gtggaaacgc gataaccgcg aggcgctgaa gcggtgggtg 420

aaaggcatga tcatgctgga gccggacgac gccaaacgcg cggcggcgga agaattcgcc 480

gaatacggcg ccaaattctg gggctatccg gtgctggtgg ccgccaatga agccgcaggc 540

cgggtattgg cgcagacgtt attgatcaaa taaggggaac accatgcacc agcaacaggt 600

gattgaacag ctgctggcct ggatcgagca gagcctggat cagccgctga cgctggacga 660

catcgccgcc aagtccggct actccaaatg gcatttgcag cggatgttca agcagcatac 720

cggccatatt ctcggcacct acgcgcgccg cagaaggctg accgccgccg cgcgtgaact 780

gcgcctgacc ggcaccagcg tggcctgcat cgccgatact taccagttcg attcgcagca 840

gaccttcacc cgttgcttcc gcaagcagtt cggtctgccg ccggccagct atcgtcgcag 900

ccaggattgg tcgagctatg gcctgcagcc gccgctgcgc ctgaccgaag cgccattgcc 960

gcaggccgat atcgtgacgc tgcccgccat gcagttggtg ggccataccc agcgccgcag 1020

ttttaccctg gggcaactgg ggtacccggg gatccggctg taat 1064

Claims

1.一株粘质沙雷氏菌工程菌，其特征在于，所述粘质沙雷氏菌工程菌以粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)为宿主敲除编码转录调控因子BVG90_08615的基因。

2.如权利要求1所述的一株粘质沙雷氏菌工程菌，其特征在于，所述转录调控因子BVG90_08615的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.如权利要求1或2所述的一株粘质沙雷氏菌工程菌，其特征在于，所述编码转录调控因子BVG90_08615的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.如权利要求1-3任一所述的一株粘质沙雷氏菌工程菌，其特征在于，所述粘质沙雷氏菌为粘质沙雷氏菌JNB5-1。

5.一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1-4任一所述的粘质沙雷氏菌工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有灵菌红素的发酵液；将含有灵菌红素的发酵液进行分离，获得灵菌红素。

6.如权利要求5所述的一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述发酵的温度为28～30℃、转速为150～200rpm。

7.如权利要求5或6所述的一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述发酵的温度为30℃、转速为180rpm。

8.如权利要求5-7任一所述的一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述发酵培养基为LB液体培养基。

9.如权利要求8所述的一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述发酵培养基为LB液体培养基；所述LB液体培养基的成分包含10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠。

10.权利要求1-4任一所述的粘质沙雷氏菌工程菌或权利要求5-9任一所述的方法在生产灵菌红素中的应用。