CN111041020B

CN111041020B - 异柠檬酸裂合酶突变体、突变基因及其在制备维生素b12中的应用

Info

Publication number: CN111041020B
Application number: CN201911335895.3A
Authority: CN
Inventors: 张大伟; 董会娜
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2021-09-07
Anticipated expiration: 2039-12-23
Also published as: CN111041020A

Abstract

本发明公开一种异柠檬酸裂合酶突变体、突变基因及其在制备维生素B₁₂中的应用。在苜蓿中华根瘤菌中过表达的异柠檬酸裂合酶基因和突变基因的基因工程菌，其生产维生素B₁₂的能力得到了大幅提高，具有较大的应用推广价值。

Description

异柠檬酸裂合酶突变体、突变基因及其在制备维生素B12中的应用

技术领域：本发明属于生物技术领域，具体涉及到异柠檬酸裂合酶突变体、突变基因及其在制备维生素B₁₂中的应用。

背景技术：

维生素B₁₂(VB₁₂)又叫钴胺素，属于咕啉类化合物，是唯一含金属元素的维生素类化合物，是B族维生素发现最晚的大分子有机化合物。根据咕啉环上方的配基(R基团)种类不同，维生素B₁₂可分为：羟基钴胺素，脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素。维生素B₁₂参与了大量的生化反应过程包括DNA的合成和调控、脂肪酸的合成、氨基酸的代谢及能力的产生。

由于维生素B₁₂分子结构复杂，化学法人工合成需要消耗大量的人力与物力，而且合成周期长。在合成过程中对操作人员的要求过高，导致不能大量的生产。微生物发酵法目前是生产维生素B₁₂的最廉价的方法，能够大量生产并推广其使用。

目前，国内外针对维生素B₁₂生产菌生物合成维生素B₁₂的研究主要集中在发酵过程优化，主要涉及培养基包括碳氮源和金属离子的优化、甜菜碱的添加、鱼藤酮的添加，工艺条件包括pH和供氧的控制等。有文献报道通过在脱氮假单胞菌基因组上表达单拷贝的透明颤菌vgb 基因来增加细胞生产维生素B₁₂的能力(程立芳等,不同来源的尿卟啉原III转甲基酶在脱氮假单胞菌中的表达及其对生产维生素B12的影响.工业微生物，2017，第47卷第3期)。

异柠檬酸裂合酶(Isocitrate lyase，缩写ICL，EC 4.1.3.1)是以一种在乙醛酸循环中将异柠檬酸切割为乙醛酸和琥珀酸的酶。其产物再通过苹果酸合酶合成苹果酸，跳过了三羧酸循环(TCA循环)中脱去二氧化碳的两步。这一途径广泛存在于细菌、真菌与植物中。在催化过程中，异柠檬酸被去质子化，羟醛裂解导致琥珀酸酯和乙醛酸酯的释放。该反应机制的功能与糖酵解中的醛缩酶类似，在糖酵解中碳-碳键断裂并生成的新的醛类。在乙醛酸循环中，苹果酸合酶然后催化乙醛酸和乙酰辅酶A缩合形成苹果酸，因此循环可以继续进行。通过从 TCA循环转移异柠檬酸，ICL和苹果酸合酶在乙醛酸循环中的作用导致碳与2-碳化合物的净同化。因此，尽管TCA循环不产生净碳同化，但乙醛酸循环产生的中间体可用于合成葡萄糖 (通过糖异生)以及其他生物合成产物。因此使用ICL和苹果酸合酶的生物体能够从乙酸酯衍生的乙酰辅酶A或乙醇，脂肪酸或聚β-羟基丁酸酯的降解物中合成葡萄糖及其代谢中间体。目前尚未有异柠檬酸裂合酶基因aceA用于维生素B₁₂合成的报道。

发明内容：

本发明人对前期筛选出的高产维生素B₁₂的苜蓿中华根瘤菌CGMCC NO.9638菌株(CN104342390A)，通过对其进行诱变，获得一株产维生素B₁₂能力提高的诱变菌株。本发明作了进一步研究以发现对产维生素B₁₂能力有影响的基因。经过研究发现异柠檬酸裂合酶基因aceA和突变基因导入苜蓿中华根瘤菌中过表达，能够提高所述菌的产维生素B₁₂的能力。

首先，本发明提供一种异柠檬酸裂合酶的突变体，其特征在于，其多肽氨基酸序列在SEQ ID No.2所示原始序列的基础上具有下述突变：第195位氨基酸替换为S，或者第195位氨基酸替换为S并且第213位氨基酸替换为T。

优选地，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4或6所示。

其次，本发明提供如述的异柠檬酸裂合酶的突变体的编码基因。

优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示。

第三方面，本发明提供异柠檬酸裂合酶编码基因在制备维生素B₁₂中的应用。

具体地，通过含有所述编码基因的表达载体导入苜蓿中华根瘤菌中进行过表达，所述导入的编码基因位于质粒或染色体中。

优选地，所述苜蓿中华根瘤菌具有CGMCC NO.9638保藏号的菌株。

进一步地，所述异柠檬酸裂合酶编码基因编码具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽。

更优选地，所述异柠檬酸裂合酶的突变体编码基因具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3 或SEQ ID NO：5所示核苷酸序列。

经研究证实，本发明异柠檬酸裂合酶基因和突变基因的基因工程菌生物安全(菌内过表达促进菌体的生长)，可以有效的提高苜蓿中华根瘤菌生产维生素B₁₂的能力，实验数据表明其中对于原始基因在苜蓿中华根瘤菌中过表达，可以提高产维生素B₁₂的能力达16.7％,，而突变基因在苜蓿中华根瘤菌中过表达能进一步提高产维生素B₁₂的能力即提高20％，尤其是具有两突变位点时提高达25.6％。

附图说明

图1：质粒载体pBBR-P21-aceA的图谱。

图2：不同苜蓿中华根瘤菌菌株发酵144h后的VB₁₂产量。

图3：不同苜蓿中华根瘤菌菌株发酵144h后的生物量。

图4：维生素B₁₂的标准曲线图。

具体实施方式

本发明的以下实施例和附图仅说明实现本发明的具体实施方案，这些方案和附图不可以理解为对本发明的限制，任何在不脱离本发明的原理和实质的情况下所做的任何改变，均落在本发明的保护范围之内。

本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。

培养基配方：

LB培养基(g/L)：氯化钠10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，固体培养基加琼脂粉15。

种子培养基(g/L)：蔗糖40，玉米浆20，甜菜碱5，(NH₄)₂SO₄ 1，(NH₄)₂HPO₄ 2，MnSO₄·H₂O 0.8，CoCl₂·6H₂O 0.02，MgO 0.3，DMBI 0.01，ZnSO₄·7H₂O 0.01，CaCO₃ 1.5,pH通过NaOH 控制在7.0～7.4。

发酵培养基(g/L)：蔗糖80，玉米浆30，甜菜碱15，(NH₄)₂SO₄ 2，MgSO₄ 1.5,K₂HPO₄0.75， CoCl₂·6H₂O 0.14,DMBI 0.075，ZnSO₄·7H₂O 0.08，CaCO₃ 1，pH通过NaOH控制在7.0～7.4。

维生素B₁₂的检测方法

(1)样品预处理

取1mL发酵液，加入8％的亚硝酸钠溶液和冰醋酸各0.25mL摇匀，置于95～100℃水浴中30-40min；待冷却至室温，在10000转离心1分钟，上层清液通过0.22μm膜

过滤器过滤至上样瓶中，再加20μl 2％的NaCN(w/v)至1mL的上清液中。亚硝酸钠溶液和冰醋酸的加入量可随发酵液的量进行相应调整。

(2)标准品的制备

配置梯度维生素B₁₂标准品(20mg/L，50mg/L，100mg/L，150mg/L)。

(3)HPLC检测条件

C18-250A柱(Agilent，4.6mmid 9×250mm，5μm)。流动相为70％有机相(乙腈)和30％无机相(乙酸钠水溶液)，吸收波长为361nm，柱温为35℃，流速0.8mL/min，进样量20μL。

(4)维生素B₁₂标准曲线的绘制

将不同浓度的标准品按上述条件进行HPLC检测，绘制峰面积A-VB₁₂浓度标准曲线。以测得的峰面积A为纵坐标，维生素B₁₂质量浓度C(mg/L)记为横坐标，绘制维生素B₁₂标准曲线。见图4，得回归方程y＝19.846x-80.857，R²＝0.999，吸收度与质量浓度呈良好的线性关系。液相结束后根据维生素B₁₂标准曲线计算样品产量。

实施例1：常压室温等离子体(ARTP)诱变时间的确定、突变体库的构建及高产菌种的获得

(1)致死率的测定

为了获得一个比较广的突变体库，对底盘细胞苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638进行了常压室温等离子体(ARTP)诱变。首先，对等离子诱变条件下CGMCCNO.9638的致死率进行测定。将种子用LB培养基培养至对数中期的CGMCCNO.9638细胞(OD₆₀₀＝1)用0.85％ NaCl溶液冲洗两遍，然后用0.85％NaCl溶液稀释成10⁸个细胞/mL的悬液。取10uL悬液均匀的涂布在铁片上，进行ARTP诱变，诱变时间分别为0s、5s、10s、15s、20s、25s，每个诱变时间点2个重复，每个时间点的涂板3个重复。诱变后将带有细胞的铁片置于1mL 无菌水中漩涡震荡洗下细胞，将细胞悬液10倍梯度稀释至10^-3，取稀释后的细胞悬液100μL 涂LB培养基平板，30℃培养72h后统计菌落数。根据下列公式计算不同诱变时间下的致死率，以诱变时间为横坐标，不同诱变时间下的致死率为纵坐标，绘制致死率曲线。致死率的计算公式为：致死率(％)＝[(诱变0s菌落数－诱变Ns菌落数)/诱变0s菌落数]×100％，其中 N＝5、10、15、20、25。

从表1中可知，诱变10s时的致死率为82.2％，诱变15s时的致死率达到95％以上，致死率为80％-90％时，诱变后发生正突变的概率最高，因此选择10s作为最终构建突变体库的诱变时间。

(2)突变体库的构建及筛选

取浓度为10⁸个/mL的细胞悬液10uL涂布于铁片上进行ARTP诱变，诱变时间为10s，共对3个铁片上的细胞进行诱变处理，诱变结束后，将这3个铁片上的细胞在含有1mL LB 培养基的1.5mL离心管中涡旋振荡重悬。将细胞悬液10倍梯度稀释至10^-3，取稀释后的细胞悬液100μL涂LB培养基平板，30℃培养72h，长出270个单菌落。

(3)突变株96深孔板发酵初筛

分别挑取平板上的所有单菌落接种于含有500uL的种子培养基的96深孔板中(每个孔板上包含6株对照菌株CGMCC NO.9638)，30℃、800rpm、80％湿度振荡培养36h后，按10％ (v/v)接种量转接含有450uL发酵培养基的96深孔板中，30℃、800rpm、80％湿度条件下振荡培养120h后检测维生素B₁₂产量。

(4)突变株96深孔板发酵复筛

将步骤(3)中产量排前30的株菌的单菌落(包含一个对照菌株CGMCC NO.9638)接种于含有500uL种子培养基的96深孔板中，30℃、800rpm、80％湿度振荡培养36h后，按 10％(v/v)接种量转接含有450uL发酵培养基的96深孔板中(每株菌3个平行)，30℃、800rpm、80％湿度条件下振荡培养120h后检测维生素B₁₂产量。

重复步骤(3)和(4)三次，最后获得一株高产维生素B₁₂的菌种SM*，96孔板中产量从50mg/L提高到80mg/L，是底盘菌株产量的1.6倍。

实施例2：突变菌株与出发菌株进行比较基因组分析

将菌种SM*和出发菌株CGMCC NO.9638送金唯智生物科技有限公司进行全基因组测序。通过比较两个菌株的全基因组序列发现异柠檬酸裂合酶编码基因aceA发生了点突变，其第583位核苷酸上含有突变，其所述突变是用T置换了C，第638位核苷酸上含有突变，其所述突变是用C置换了T。为了验证突变位点对维生素B₁₂产量的影响，我们将突变前和突变后的aceA基因在出发菌种CGMCC NO.9638中进行了过量表达。

实施例3：质粒载体的构建

pBBR-P21-aceA的构建：

分别利用表2的引物对P21-XbaI-F和P21-R，以Ensifer adhaerens Casida A(黏着剑菌) 基因组为模板，通过PCR扩增，引入XbaI酶切位点，得到启动子P21片段，经电泳验证，用限制性内切酶DpnI(NEB公司)在37℃处理30min，核酸电泳胶回收后，得到纯化的P21片段。P21启动子序列如SEQ ID No.7所示，并且记载在专利申请号为201910929398.X的专利文件中。

分别利用表2的引物对aceA-F和aceA-XhoI-R，以Ensifer adhaerens Casida A(黏着剑菌) 基因组为模板，通过PCR扩增，引入XhoI酶切位点，得到aceA片段，经电泳验证，DpnI 酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的aceA片段。aceA基因序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

然后，利用引物对P21-XbaI-F和aceA-XhoI-R，以纯化的P21片段和aceA片段为模板，通过融合PCR，得到P21-aceA片段(含XbaI和XhoI酶切位点)，经电泳验证，电泳胶回收后，得到纯化的P21-aceA片段。

将上述纯化的P21-aceA片段和pBBR1MCS2质粒分别用XbaI和XhoI进行双酶切，将P21-aceA片段的双酶切产物与pBBR1MCS2质粒双酶切的产物经过T4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，培养 16h后进行菌落PCR检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为 E.coli/pBBR-P21-aceA。用质粒试剂盒提取质粒pBBR-P21-aceA备用，质粒图谱如图1所示。

pBBR-P21-aceA(C583T)

以质粒pBBR-P21-aceA为模板，用引物对C583T-F/C583T-R进行反向PCR扩增，得到大小约7.4kb的片段DpnI酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的产物。取30ng纯化后的产物加入2μl 10*T4连接酶缓冲液(NEB公司)、1μl T4多核苷酸激酶(NEB公司)，补充蒸馏水至20μl，37℃反应30min，加入1μl T4连接酶(NEB公司)，室温反应2h得到连接产物。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，培养 16h后进行菌落PCR检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为 E.coli/pBBR-P21-aceA(C583T)。用质粒试剂盒提取质粒pBBR-P21-aceA(C583T)备用。其中，突变的aceA基因序列如SEQ ID No.3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

pBBR-P21-aceA(C583T，T638C)

以质粒pBBR-P21-aceA(C583T)为模板，用引物对T638C-F/T638C-R进行反向PCR扩增，得到大小约7.4kb的片段DpnI酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的产物。取30ng 纯化后的产物加入2μl 10*T4连接酶缓冲液(NEB公司)、1μl T4多核苷酸激酶(NEB公司)，补充蒸馏水至20μl，37℃反应30min，加入1μl T4连接酶(NEB公司)，室温反应2h得到连接产物。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，培养16h后进行菌落PCR检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为 E.coli/pBBR-P21-aceA(C583T，T638C)。用质粒试剂盒提取质粒pBBR-P21-aceA(C583T， T638C)备用。其中，突变的aceA基因序列如SEQ ID No.5所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

实施例4：含质粒载体菌株的构建

将实施例3中的4个质粒pBBR1MCS2、pBBR-P21-aceA、pBBR-P21-aceA(C583T)和pBBR-P21-aceA(C583T，T638C)按照如下方法转入苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638中：

(1)接种新活化的苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638、大肠杆菌(含有相应的质粒)以及辅助载体MT616，并分别在30℃和37℃的培养箱中振荡培养到OD值为1.0左右；

(2)无菌条件下分别将苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638的菌液、MT616和大肠杆菌的菌液各500μL转移至1.5mL无菌EP管中并在4℃，12,000rpm条件下离心1min。

(3)在无菌条件下弃掉上清液，并用1mL 0.85％的无菌生理盐水对沉淀进行悬浮。

(4)再次在4℃，12,000rpm条件下离心1min，并在无菌条件下去除上清。

(5)分别采用500μL新鲜的LB液体培养基对受体细胞、大肠杆菌和MT616的沉淀进行悬浮。

(6)分别取各2μL的三种菌液，滴在不添加抗性的LB固体培养基的同一位置，并小心将其混匀。分别将单一组分的菌液以及两两之间混合的菌液进行点样，用来作为试验对照组。

(7)待菌液自然风干后，在37℃培养箱中倒置培养约1天，至单菌落长出。

(8)挑取不同的单菌落在含有相应抗生素的平板上进行划线，将平板倒置于30℃培养箱中进行培养，直到菌落长出。同时对照组也需挑取不同的单菌落在含有相应抗生素的平板上进行划线。

(9)从抗性平板上挑取长出的克隆，进行菌落PCR验证。得到阳性苜蓿中华根瘤菌:SM/pBBR(对照菌)、SM/pBBR-P21-aceA(简写为SM1)、SM/pBBR-P21-aceA(C583T)(简写为SM2)、SM/pBBR-P21-aceA(C583T，T638C)(简写为SM3)。

实施例5：不同菌株评价

苜蓿中华根瘤菌的培养条件：

将对照菌、SM1、SM2和SM3菌株在无菌条件下用接种针在含100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，30℃恒温静置48h培养，获得单菌落。用接种针挑取单菌落于装有5mL含有100mg/L卡那霉素的LB液体培养基的试管中，30℃，200rpm培养36h。将种子培养基按照10％比例接种至含有100mg/L卡那霉素的30mL发酵培养基中(250ml摇瓶)。30℃震荡(220r/min)培养144h后收集菌体并检测产量。摇瓶发酵每个实验做3个平行。

不同苜蓿中华根瘤菌菌株产VB₁₂能力的比较

SM1、SM2和SM3三个菌株与对照菌相比生产维生素B₁₂的能力均得到提高(参见表3和图2)。其中SM1提高16.7％,，SM2提高20％，SM3提高25.6％。结果说明本发明中过量表达异柠檬酸裂合酶编码基因aceA和其突变基因的苜蓿中华根瘤菌菌株生产维生素B₁₂的能力得到显著提高。过量表达异柠檬酸裂合酶编码基因aceA和其突变基因的苜蓿中华根瘤菌菌株生长情况均有提高，说明aceA基因的过表达可以促进菌体的生长(见表3和图3)。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 异柠檬酸裂合酶突变体、突变基因及其在制备维生素B12中的应用

<130> 2019.11.15

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1290

<212> DNA

<213> Sinorhizobium meliloti

<400> 1

atgactgatt tttacaagct cgttcccagc gcaccgcaag gccgcttcga tggcgtcgat 60

cgcccctata ccgcagagac cgtgaagcgg ctgcgcgggt cggtcgagat ccgctattcg 120

ctggccgaaa tgggcgcgaa ccgcttgtgg aaactcattc acgaagacga cttcgtcaac 180

gcactcggcg cactttcggg caaccaggca atgcagatgg tgcgcgccgg cctgaaggcg 240

atctacctct ccggctggca ggtcgcagcc gatgccaaca ccgcttcggc catgtatccg 300

gaccagtcgc tctatccggc caatgccgcg cctgagcttg ccaagcgcat caatcgcacg 360

ctgcagcgcg ccgaccagat cgagacctca gaaggcaagg gcctttcggt cgacacctgg 420

ttcgcaccga tcgtcgctga cgccgaagcc ggtttcggcg gtccgctcaa cgccttcgag 480

atcatgaagg ccttcatcga ggcgggcgct gccggcgtcc actacgagga tcagcttgct 540

tcggagaaga agtgcggcca tctcggcggc aaggtgctga tcccgacggc agcccatatc 600

cgcaacctga acgcggcacg gcttgccgcc gacgtcatgg gcacgccgac gctggtcatc 660

gcccgcaccg atgcggaagc ggcaaagttg ctcacctccg acatcgacga gcgcgatcgc 720

cccttcgtcg actacgatgc cggccgcacg gtcgaaggct tctaccaggt gaagaacggg 780

cttgagccct gcattgcccg cgccatcgcc tatgcgccgc attgcgacct gatctggtgt 840

gagacctcca agccggacct ggaacaggcc cgcaagttcg ccgagggcgt gcacaaggcg 900

catccgggca agctgctcgc ctacaattgc tcgccgtcgt tcaactggaa aaagaacctc 960

gacgacgcga cgatcgccaa gttccagcga gagctgggcg cgatgggcta caagttccag 1020

ttcatcacgc ttgccggctt ccaccagctg aacttcggca tgttcgaact ggcgcgcggc 1080

tacaaggcac ggcagatggc cgcctattcg gagctgcagg aggcggaatt cgccgccgag 1140

gtcaacggct acaccgcgac caagcaccaa cgcgaagtcg gcaccggcta cttcgacgcc 1200

gtctcgatgg cgatcaccgg cggccagtcc tcgacaacag ccatgaagga atcgaccgag 1260

cacgatcaat tccgcccggc cgcagagtga 1290

<210> 2

<211> 429

<212> PRT

<213> Sinorhizobium meliloti

<400> 2

Met Thr Asp Phe Tyr Lys Leu Val Pro Ser Ala Pro Gln Gly Arg Phe

1 5 10 15

Asp Gly Val Asp Arg Pro Tyr Thr Ala Glu Thr Val Lys Arg Leu Arg

20 25 30

Gly Ser Val Glu Ile Arg Tyr Ser Leu Ala Glu Met Gly Ala Asn Arg

35 40 45

Leu Trp Lys Leu Ile His Glu Asp Asp Phe Val Asn Ala Leu Gly Ala

50 55 60

Leu Ser Gly Asn Gln Ala Met Gln Met Val Arg Ala Gly Leu Lys Ala

65 70 75 80

Ile Tyr Leu Ser Gly Trp Gln Val Ala Ala Asp Ala Asn Thr Ala Ser

85 90 95

Ala Met Tyr Pro Asp Gln Ser Leu Tyr Pro Ala Asn Ala Ala Pro Glu

100 105 110

Leu Ala Lys Arg Ile Asn Arg Thr Leu Gln Arg Ala Asp Gln Ile Glu

115 120 125

Thr Ser Glu Gly Lys Gly Leu Ser Val Asp Thr Trp Phe Ala Pro Ile

130 135 140

Val Ala Asp Ala Glu Ala Gly Phe Gly Gly Pro Leu Asn Ala Phe Glu

145 150 155 160

Ile Met Lys Ala Phe Ile Glu Ala Gly Ala Ala Gly Val His Tyr Glu

165 170 175

Asp Gln Leu Ala Ser Glu Lys Lys Cys Gly His Leu Gly Gly Lys Val

180 185 190

Leu Ile Pro Thr Ala Ala His Ile Arg Asn Leu Asn Ala Ala Arg Leu

195 200 205

Ala Ala Asp Val Met Gly Thr Pro Thr Leu Val Ile Ala Arg Thr Asp

210 215 220

Ala Glu Ala Ala Lys Leu Leu Thr Ser Asp Ile Asp Glu Arg Asp Arg

225 230 235 240

Pro Phe Val Asp Tyr Asp Ala Gly Arg Thr Val Glu Gly Phe Tyr Gln

245 250 255

Val Lys Asn Gly Leu Glu Pro Cys Ile Ala Arg Ala Ile Ala Tyr Ala

260 265 270

Pro His Cys Asp Leu Ile Trp Cys Glu Thr Ser Lys Pro Asp Leu Glu

275 280 285

Gln Ala Arg Lys Phe Ala Glu Gly Val His Lys Ala His Pro Gly Lys

290 295 300

Leu Leu Ala Tyr Asn Cys Ser Pro Ser Phe Asn Trp Lys Lys Asn Leu

305 310 315 320

Asp Asp Ala Thr Ile Ala Lys Phe Gln Arg Glu Leu Gly Ala Met Gly

325 330 335

Tyr Lys Phe Gln Phe Ile Thr Leu Ala Gly Phe His Gln Leu Asn Phe

340 345 350

Gly Met Phe Glu Leu Ala Arg Gly Tyr Lys Ala Arg Gln Met Ala Ala

355 360 365

Tyr Ser Glu Leu Gln Glu Ala Glu Phe Ala Ala Glu Val Asn Gly Tyr

370 375 380

Thr Ala Thr Lys His Gln Arg Glu Val Gly Thr Gly Tyr Phe Asp Ala

385 390 395 400

Val Ser Met Ala Ile Thr Gly Gly Gln Ser Ser Thr Thr Ala Met Lys

405 410 415

Glu Ser Thr Glu His Asp Gln Phe Arg Pro Ala Ala Glu

420 425

<210> 3

<211> 1290

<212> DNA

<213> Sinorhizobium meliloti

<400> 3

atgactgatt tttacaagct cgttcccagc gcaccgcaag gccgcttcga tggcgtcgat 60

cgcccctata ccgcagagac cgtgaagcgg ctgcgcgggt cggtcgagat ccgctattcg 120

ctggccgaaa tgggcgcgaa ccgcttgtgg aaactcattc acgaagacga cttcgtcaac 180

gcactcggcg cactttcggg caaccaggca atgcagatgg tgcgcgccgg cctgaaggcg 240

atctacctct ccggctggca ggtcgcagcc gatgccaaca ccgcttcggc catgtatccg 300

gaccagtcgc tctatccggc caatgccgcg cctgagcttg ccaagcgcat caatcgcacg 360

ctgcagcgcg ccgaccagat cgagacctca gaaggcaagg gcctttcggt cgacacctgg 420

ttcgcaccga tcgtcgctga cgccgaagcc ggtttcggcg gtccgctcaa cgccttcgag 480

atcatgaagg ccttcatcga ggcgggcgct gccggcgtcc actacgagga tcagcttgct 540

tcggagaaga agtgcggcca tctcggcggc aaggtgctga tctcgacggc agcccatatc 600

cgcaacctga acgcggcacg gcttgccgcc gacgtcatgg gcacgccgac gctggtcatc 660

gcccgcaccg atgcggaagc ggcaaagttg ctcacctccg acatcgacga gcgcgatcgc 720

cccttcgtcg actacgatgc cggccgcacg gtcgaaggct tctaccaggt gaagaacggg 780

cttgagccct gcattgcccg cgccatcgcc tatgcgccgc attgcgacct gatctggtgt 840

gagacctcca agccggacct ggaacaggcc cgcaagttcg ccgagggcgt gcacaaggcg 900

catccgggca agctgctcgc ctacaattgc tcgccgtcgt tcaactggaa aaagaacctc 960

gacgacgcga cgatcgccaa gttccagcga gagctgggcg cgatgggcta caagttccag 1020

ttcatcacgc ttgccggctt ccaccagctg aacttcggca tgttcgaact ggcgcgcggc 1080

tacaaggcac ggcagatggc cgcctattcg gagctgcagg aggcggaatt cgccgccgag 1140

gtcaacggct acaccgcgac caagcaccaa cgcgaagtcg gcaccggcta cttcgacgcc 1200

gtctcgatgg cgatcaccgg cggccagtcc tcgacaacag ccatgaagga atcgaccgag 1260

cacgatcaat tccgcccggc cgcagagtga 1290

<210> 4

<211> 429

<212> PRT

<213> Sinorhizobium meliloti

<400> 4

Met Thr Asp Phe Tyr Lys Leu Val Pro Ser Ala Pro Gln Gly Arg Phe

1 5 10 15

Asp Gly Val Asp Arg Pro Tyr Thr Ala Glu Thr Val Lys Arg Leu Arg

20 25 30

Gly Ser Val Glu Ile Arg Tyr Ser Leu Ala Glu Met Gly Ala Asn Arg

35 40 45

Leu Trp Lys Leu Ile His Glu Asp Asp Phe Val Asn Ala Leu Gly Ala

50 55 60

Leu Ser Gly Asn Gln Ala Met Gln Met Val Arg Ala Gly Leu Lys Ala

65 70 75 80

Ile Tyr Leu Ser Gly Trp Gln Val Ala Ala Asp Ala Asn Thr Ala Ser

85 90 95

Ala Met Tyr Pro Asp Gln Ser Leu Tyr Pro Ala Asn Ala Ala Pro Glu

100 105 110

Leu Ala Lys Arg Ile Asn Arg Thr Leu Gln Arg Ala Asp Gln Ile Glu

115 120 125

Thr Ser Glu Gly Lys Gly Leu Ser Val Asp Thr Trp Phe Ala Pro Ile

130 135 140

Val Ala Asp Ala Glu Ala Gly Phe Gly Gly Pro Leu Asn Ala Phe Glu

145 150 155 160

Ile Met Lys Ala Phe Ile Glu Ala Gly Ala Ala Gly Val His Tyr Glu

165 170 175

Asp Gln Leu Ala Ser Glu Lys Lys Cys Gly His Leu Gly Gly Lys Val

180 185 190

Leu Ile Ser Thr Ala Ala His Ile Arg Asn Leu Asn Ala Ala Arg Leu

195 200 205

Ala Ala Asp Val Met Gly Thr Pro Thr Leu Val Ile Ala Arg Thr Asp

210 215 220

Ala Glu Ala Ala Lys Leu Leu Thr Ser Asp Ile Asp Glu Arg Asp Arg

225 230 235 240

Pro Phe Val Asp Tyr Asp Ala Gly Arg Thr Val Glu Gly Phe Tyr Gln

245 250 255

Val Lys Asn Gly Leu Glu Pro Cys Ile Ala Arg Ala Ile Ala Tyr Ala

260 265 270

Pro His Cys Asp Leu Ile Trp Cys Glu Thr Ser Lys Pro Asp Leu Glu

275 280 285

Gln Ala Arg Lys Phe Ala Glu Gly Val His Lys Ala His Pro Gly Lys

290 295 300

Leu Leu Ala Tyr Asn Cys Ser Pro Ser Phe Asn Trp Lys Lys Asn Leu

305 310 315 320

Asp Asp Ala Thr Ile Ala Lys Phe Gln Arg Glu Leu Gly Ala Met Gly

325 330 335

Tyr Lys Phe Gln Phe Ile Thr Leu Ala Gly Phe His Gln Leu Asn Phe

340 345 350

Gly Met Phe Glu Leu Ala Arg Gly Tyr Lys Ala Arg Gln Met Ala Ala

355 360 365

Tyr Ser Glu Leu Gln Glu Ala Glu Phe Ala Ala Glu Val Asn Gly Tyr

370 375 380

Thr Ala Thr Lys His Gln Arg Glu Val Gly Thr Gly Tyr Phe Asp Ala

385 390 395 400

Val Ser Met Ala Ile Thr Gly Gly Gln Ser Ser Thr Thr Ala Met Lys

405 410 415

Glu Ser Thr Glu His Asp Gln Phe Arg Pro Ala Ala Glu

420 425

<210> 5

<211> 1290

<212> DNA

<213> Sinorhizobium meliloti

<400> 5

atgactgatt tttacaagct cgttcccagc gcaccgcaag gccgcttcga tggcgtcgat 60

cgcccctata ccgcagagac cgtgaagcgg ctgcgcgggt cggtcgagat ccgctattcg 120

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atctacctct ccggctggca ggtcgcagcc gatgccaaca ccgcttcggc catgtatccg 300

gaccagtcgc tctatccggc caatgccgcg cctgagcttg ccaagcgcat caatcgcacg 360

ctgcagcgcg ccgaccagat cgagacctca gaaggcaagg gcctttcggt cgacacctgg 420

ttcgcaccga tcgtcgctga cgccgaagcc ggtttcggcg gtccgctcaa cgccttcgag 480

atcatgaagg ccttcatcga ggcgggcgct gccggcgtcc actacgagga tcagcttgct 540

tcggagaaga agtgcggcca tctcggcggc aaggtgctga tctcgacggc agcccatatc 600

cgcaacctga acgcggcacg gcttgccgcc gacgtcacgg gcacgccgac gctggtcatc 660

gcccgcaccg atgcggaagc ggcaaagttg ctcacctccg acatcgacga gcgcgatcgc 720

cccttcgtcg actacgatgc cggccgcacg gtcgaaggct tctaccaggt gaagaacggg 780

cttgagccct gcattgcccg cgccatcgcc tatgcgccgc attgcgacct gatctggtgt 840

gagacctcca agccggacct ggaacaggcc cgcaagttcg ccgagggcgt gcacaaggcg 900

catccgggca agctgctcgc ctacaattgc tcgccgtcgt tcaactggaa aaagaacctc 960

gacgacgcga cgatcgccaa gttccagcga gagctgggcg cgatgggcta caagttccag 1020

ttcatcacgc ttgccggctt ccaccagctg aacttcggca tgttcgaact ggcgcgcggc 1080

tacaaggcac ggcagatggc cgcctattcg gagctgcagg aggcggaatt cgccgccgag 1140

gtcaacggct acaccgcgac caagcaccaa cgcgaagtcg gcaccggcta cttcgacgcc 1200

gtctcgatgg cgatcaccgg cggccagtcc tcgacaacag ccatgaagga atcgaccgag 1260

cacgatcaat tccgcccggc cgcagagtga 1290

<210> 6

<211> 429

<212> PRT

<213> Sinorhizobium meliloti

<400> 6

Met Thr Asp Phe Tyr Lys Leu Val Pro Ser Ala Pro Gln Gly Arg Phe

1 5 10 15

Asp Gly Val Asp Arg Pro Tyr Thr Ala Glu Thr Val Lys Arg Leu Arg

20 25 30

Gly Ser Val Glu Ile Arg Tyr Ser Leu Ala Glu Met Gly Ala Asn Arg

35 40 45

Leu Trp Lys Leu Ile His Glu Asp Asp Phe Val Asn Ala Leu Gly Ala

50 55 60

Leu Ser Gly Asn Gln Ala Met Gln Met Val Arg Ala Gly Leu Lys Ala

65 70 75 80

Ile Tyr Leu Ser Gly Trp Gln Val Ala Ala Asp Ala Asn Thr Ala Ser

85 90 95

Ala Met Tyr Pro Asp Gln Ser Leu Tyr Pro Ala Asn Ala Ala Pro Glu

100 105 110

Leu Ala Lys Arg Ile Asn Arg Thr Leu Gln Arg Ala Asp Gln Ile Glu

115 120 125

Thr Ser Glu Gly Lys Gly Leu Ser Val Asp Thr Trp Phe Ala Pro Ile

130 135 140

Val Ala Asp Ala Glu Ala Gly Phe Gly Gly Pro Leu Asn Ala Phe Glu

145 150 155 160

Ile Met Lys Ala Phe Ile Glu Ala Gly Ala Ala Gly Val His Tyr Glu

165 170 175

Asp Gln Leu Ala Ser Glu Lys Lys Cys Gly His Leu Gly Gly Lys Val

180 185 190

Leu Ile Ser Thr Ala Ala His Ile Arg Asn Leu Asn Ala Ala Arg Leu

195 200 205

Ala Ala Asp Val Thr Gly Thr Pro Thr Leu Val Ile Ala Arg Thr Asp

210 215 220

Ala Glu Ala Ala Lys Leu Leu Thr Ser Asp Ile Asp Glu Arg Asp Arg

225 230 235 240

Pro Phe Val Asp Tyr Asp Ala Gly Arg Thr Val Glu Gly Phe Tyr Gln

245 250 255

Val Lys Asn Gly Leu Glu Pro Cys Ile Ala Arg Ala Ile Ala Tyr Ala

260 265 270

Pro His Cys Asp Leu Ile Trp Cys Glu Thr Ser Lys Pro Asp Leu Glu

275 280 285

Gln Ala Arg Lys Phe Ala Glu Gly Val His Lys Ala His Pro Gly Lys

290 295 300

Leu Leu Ala Tyr Asn Cys Ser Pro Ser Phe Asn Trp Lys Lys Asn Leu

305 310 315 320

Asp Asp Ala Thr Ile Ala Lys Phe Gln Arg Glu Leu Gly Ala Met Gly

325 330 335

Tyr Lys Phe Gln Phe Ile Thr Leu Ala Gly Phe His Gln Leu Asn Phe

340 345 350

Gly Met Phe Glu Leu Ala Arg Gly Tyr Lys Ala Arg Gln Met Ala Ala

355 360 365

Tyr Ser Glu Leu Gln Glu Ala Glu Phe Ala Ala Glu Val Asn Gly Tyr

370 375 380

Thr Ala Thr Lys His Gln Arg Glu Val Gly Thr Gly Tyr Phe Asp Ala

385 390 395 400

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405 410 415

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420 425

<210> 7

<211> 1000

<212> DNA

<213> Ensifer adhaerens

<400> 7

caaacagacc gggatatgcg ggtattcttc cgccgcgccg aggatgaggt ggcgcaggaa 60

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tcgctatctc cctttggata ctcggtgcaa cctatgcggc gcaccacaaa aacaatccgg 300

ccgttgaacc gcacgaaatg catcgatggc aaagtcgatg gccggctttt tcgtgcggcg 360

tgacggcgcg cgcgaattgg tcgcgcccac cgaagtcagg cgcacaatag ttcatcgaag 420

tggtttgaca accgggcaaa aggcaggttg ccagaggtcg aaactcgctt caatcgattt 480

tactgtggac tggatgcaac accttcagtg tgaagtgttt tcactttctg gtggtgcctg 540

agaggagggg gagtcgaggg cagtggatgc aaccattggg cgctgatttt gtctgttaca 600

ccatcgtggt ggatgccctg tcggaaacag tctgtcgaca ggaggtgaac gtcccgcaag 660

aagattgcgg caacgcccct ctttctttgc gcagattacg taaactgccg ctaaaattca 720

caaactttgc atcgcggatg attcgaggct caatccggcc gacaaaaagc gcggacctaa 780

aacgttgcag tagatttcgc aaaaatgccc tgttcacgtc atatgcccgt cgcaaaggcg 840

acgaaaagaa tcgcaaacaa aatacaacct atgggatagg ccgattcccc tcctatagat 900

aaagatgcag acagccgcag aatccgcctt gcgttcgcga acgatttgcg cttctctcct 960

gcgatcacaa acccaaaaca aggggaagga gagaaacaaa 1000

Claims

1.一种异柠檬酸裂合酶的突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：6所示。

2.如权利要求1所述的异柠檬酸裂合酶的突变体的编码基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：5所示。

4.一种异柠檬酸裂合酶编码基因在制备维生素B₁₂中的应用，其特征在于，所述异柠檬酸裂合酶编码基因编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，将含有所述编码基因的表达载体导入苜蓿中华根瘤菌中进行过表达。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述苜蓿中华根瘤菌为保藏号CGMCC NO：9638的菌株。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述异柠檬酸裂合酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示。

8.如权利要求4到7任一项所述的应用，其特征在于，所述编码基因位于质粒中。