CN109097374A - 一种铜绿假单胞菌工程菌株的制备方法、菌株及其应用 - Google Patents

一种铜绿假单胞菌工程菌株的制备方法、菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种铜绿假单胞菌工程菌株的制备方法、菌株及其应用，采用全局转录因子定向进化的全新调控策略，利用连续易错PCR技术对来源于耐辐射异常球菌中的全局转录因子IrrE进行突变，筛选得到的突变体导入铜绿假单胞菌PAO1中，能对细胞内的多个代谢途径和生理系统造成扰动，从而显著改善菌株由多个基因共同调控的复杂表型。本发明获得的四种突变菌株合成多个吩嗪类化合物的能力和接种微生物燃料电池后产生的功率密度比野生型IrrE重组菌株和野生型铜绿假单胞菌株均明显提高。上述突变株的获得对于铜绿假单胞菌在吩嗪类化合物生物合成及其微生物燃料电池领域的应用提供了新的思路和有价值的实验材料。

Description

一种铜绿假单胞菌工程菌株的制备方法、菌株及其应用
技术领域
本发明属于蛋白质工程和生物技术领域，涉及铜绿假单胞菌工程菌株的制备方法、菌株及其应用。
背景介绍
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)在自然界中分布广泛。吩嗪类化合物作为铜绿假单胞菌产生的主要次级代谢产物，具有抑菌谱广泛、毒性低、环境兼容性好等特点，目前该类化合物在生物防治和环境处理领域表现出巨大的应用潜力。例如，吩嗪-1-羧酸(PCA)能够抑制由真菌病原体引起的小麦全蚀病；吩嗪-1-甲酰胺能(PCN)对西红柿枯萎病等病原菌具有显著的抑制作用；1-羟基-吩嗪(1-OH-PHZ)对绿藻和蓝藻的生长具有一定的抑制作用，可应用于海洋的防污工作；绿脓菌素(PYO)具有降解石油烃的功能，可应用于清洁海洋污染。
大量文献证明，铜绿假单胞菌合成吩嗪类化合物的能力除了受到由多个基因组成的生物合成基因簇(phzA1B1C1D1E1F1G1(phzA1)和phzA2B2C2D2E2F2G2(phzA2))的调控之外，还受到胞内一些生理系统(如群体感应系统)和转录因子(如sigma因子)的影响。目前，利用分子生物学技术提高铜绿假单胞菌合成吩嗪类化合物的工作多是以单个基因为对象进行操作(如敲除或表达)，操作后提高的目标产物的种类也比较单一。
铜绿假单胞菌还是一种重要的模式产电微生物，将其接种微生物燃料电池后，能够将储存在有机物(包括废水中的有机污染物)中的化学能直接转化为电能。该系统与传统的燃料电池相比，具有能量转化率高、燃料来源多样、反应条件温和、经济和无污染等优点。产电微生物作为微生物燃料电池阳极的催化剂，是影响系统电能输出的关键因素。越来越多的研究表明，微生物的产电性能是非常复杂的表型，受到胞内多个生理过程(如生物膜形成)、代谢途径(中介体合成)和转录调控系统(如群体感应系统)的影响。目前，研究者多是以单个或多个产电相关的功能基因为对象进行操作(如敲除或表达)，在提高效果上存在一定的局限性。
IrrE是来源于极端微生物—耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)的转录因子，研究者发现，该转录因子在宿主细胞中发挥着全局调控作用，这暗示着它在改善受到多个基因调控的复杂表型方面表现出良好的应用潜力。目前，研究者将其进行异源表达已成功提高了一些模式微生物的环境压力耐受性，如大肠杆菌(Escherichia coli)对辐射、渗透压、热、盐和氧化压力的耐受性；运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)对乙醇和酸的耐受性；
定向进化属于蛋白质的非理性设计，不需要事先了解蛋白质的结构、催化机制、保守序列等因素，而是通过模拟自然进化机制为蛋白编码基因创造体外进化的条件，进而对目的蛋白进行分子改造。易错PCR技术是目前应用最广泛的定向进化方法之一，具有操作方便、快速、高效的优点。本发明采用全局转录因子定向进化的全新调控策略，利用连续易错PCR技术对来源于耐辐射异常球菌中的全局转录因子IrrE进行突变，筛选得到的突变体导入铜绿假单胞菌PAO1(美国典型培养物保藏中心ATCC15692)中，能对细胞内的多个代谢途径和生理系统造成扰动，显著提高菌株同时合成多个吩嗪类化合物的能力以及产电性能。
发明内容
本发明的目的是提供一种同时合成多个吩嗪类化合物的能力以及产电性能的铜绿假单胞菌工程菌株的制备方法及其菌株和用途。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现。
一种同时提高多个吩嗪类化合物产量和产电活性的铜绿假单胞菌工程菌株的制备方法，其特征在于：利用连续易错PCR方法对来源于耐辐射异常球菌中的全局转录因子IrrE进行突变，筛选得到的突变体导入铜绿假单胞菌PAO1中。
而且，连续易错PCR方法步骤如下：
(1)从耐辐射异常球菌R1菌体中提取总DNA，以耐辐射异常球菌R1基因组为模板，设计引物irrE-F和irrE-R进行PCR扩增，验证纯度回收目的基因；
(2)通过改变PCR反应条件中Mg2+浓度(3mM)和Mn2+浓度(0.1-0.4mM)的方法进行易错PCR；
(3)挑取含有pMD18T质粒的E.coli DH5α单菌落接入含有氨苄青霉素抗性的5mLLB液体培养基中，30℃～37℃，160～200r/min振荡培养12h，取1.5mL的培养液，10000r/min离心1min后收集菌体，进行质粒提取；
(4)利用限制性内切酶HindIII和EcoR I对提取的pMD18T质粒与回收得到的irrE易错PCR产物进行双酶切，按照载体与插入片段摩尔比例1：3，配制连接体系，使用T4连接酶，16℃连接过夜；
(5)将上述重组质粒导入E.coli DH5α感受态细胞并将转化液涂布在含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃培养约12h，挑取平板上长出来的单菌落接种于装有5mLLB液体培养基的试管中，液体培养基中含有100μg/mL氨苄青霉素，200r/min震荡培养12h，收集菌体并重提质粒，利用PCR和双酶切进行验证，将酶切得到的扩增产物片段回收，并作为模板进行第二轮和第三轮易错PCR；
(6)将第三轮易错PCR产物连接到pHERD20T质粒上，并导入到铜绿假单胞菌PAO1感受态细胞中，LB固体平板上长出来的转化子重提质粒后进行PCR和双酶切验证。
一种IrrE定向改造的高产吩嗪类物质和电活性突变体IrrEM1-59，所述突变体IrrEM1-59的基因序列SEQ ID NO:1所示。
一种IrrE定向改造的高产吩嗪类物质和电活性突变体IrrEM1-123，所述突变体IrrEM1-123的基因序列SEQ ID NO:2所示。
一种IrrE定向改造的高产吩嗪类物质和电活性突变体IrrEM2-39，所述突变体IrrEM2-39的基因序列SEQ ID NO:3所示。
一种IrrE定向改造的高产吩嗪类物质和电活性突变体IrrEM2-59，所述的突变体IrrEM2-59的基因序列SEQ ID NO:4所示。
铜绿假单胞菌工程菌株同时产多个吩嗪类化合物合成的方法，步骤如下：
(1)菌种活化：从斜面划取一环菌体接种于装有5mL LB液体培养基的试管中，30～37℃、160～200r/min过夜振荡培养，含质粒的菌株培养基中需要添加300μg/mL羧苄青霉素；
(2)诱导培养：将上述培养液以2％～10％(V/V)的接种量接种到装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，30℃～37℃160～200r/min振荡培养至OD600为0.6～1.0时添加0.5％～3.0％的L-阿拉伯糖作为诱导剂，继续振荡培养至菌体的对数期后期，含质粒的菌株培养基中需要添加300μg/mL的羧苄青霉素；
(3)吩嗪类物质的提取和检测：收集好的培养液置于离心杯中，5000r/min离心10min，取上清加入等体积氯仿，超声萃取30min后5000r/min离心5min，取氯仿层室温下挥干，重复上述萃取过程三次，向样品中加入2ml乙腈溶液，充分溶解后用0.22μm纤维素滤膜过滤后用于HPLC检测。
铜绿假单胞菌工程菌株在微生物燃料电池的应用。
而且，产电方法如下：
(1)菌种活化：从斜面划取一环菌体接种于装有5mL LB液体培养基的试管中，30-37℃、160～200r/min过夜振荡培养，含质粒的菌株培养基中需要添加300μg/mL羧苄青霉素；
(2)诱导培养：将上述培养液以2％～10％(V/V)的接种量接种到装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，30℃～37℃，160～200r/min振荡培养至OD600为0.6～1.0时，添加0.5％～3.0％的L-阿拉伯糖作为诱导剂，继续振荡培养至菌体的对数期后期，含质粒的菌株培养基中需要添加300μg/mL的羧苄青霉素；
(3)产电活性检测：培养液经5000r/min离心5min后收集菌体，用阳极液重悬制备成OD600≈1.0～3.0的接种液，接入单室空气阴极MFCs的阳极室，进行产电活性的分析，其中，所用阳极液组成为(L-1)：蒸馏水1000mL中含有100mM PBS缓冲溶液(成分为：NH4Cl0.310g、KCl 0.130g、Na2HPO4·12H2O 4.576g、NaH2PO4·2H2O 2.452g，蒸馏水1000mL)、柠檬酸铁1g、葡萄糖1g，pH＝7.0～7.2。实验中，含质粒的菌株阳极液中添加300μg/mL羧苄青霉素和0.5％～3％的L-阿拉伯糖。
本发明的优点和积极效果如下：
本发明采用全局转录因子定向进化的全新调控策略，利用连续易错PCR技术对来源于耐辐射异常球菌中的全局转录因子IrrE进行突变，筛选得到的突变体导入铜绿假单胞菌PAO1(美国典型培养物保藏中心ATCC15692)中，能对细胞内的多个代谢途径和生理系统造成扰动，显著提高菌株同时合成多个吩嗪类化合物的能力以及产电性能。
本发明获得的四种突变株合成吩嗪类化合物的能力比野生型IrrE重组菌株分别提高了约5.43％～19.50％(吩嗪-1-羧酸，PCA)、2.19％～45.25％(吩嗪-1-甲酰胺，PCN)、1.45％～110.12％(1-羟基吩嗪，1-OHPHZ)、1.81％～111.43％(绿脓菌素，PYO)；接种微生物燃料电池后产生的功率密度比野生型IrrE重组菌株分别提高了2.13倍、0.89倍、0.13倍、0.06倍，上述突变株的获得对于铜绿假单胞菌在吩嗪类化合物生物合成及其微生物燃料电池领域的应用提供了新的思路和有价值的实验材料。
附图说明
图1为重组质粒pMD18-T-irrE(W)的构建流程图。
图2为利用酶标仪进行突变菌株筛选的结果。
图3A为四个正突变菌M1-59(1)、M1-123(2)、M2-39(3)、M2-59(4)的PCR凝胶图，图3B为上述四个正突变菌株双酶切结果图。
图4为突变菌株在最优条件下合成吩嗪类化合物的情况。
图5为突变菌株在最优条件下接种微生物燃料电池后产生的最大电压和功率密度。
具体实施方案
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
第一方面，本发明提供了一种铜绿假单胞菌工程菌株的制备方法，包括IrrE的定向进化、铜绿假单胞菌菌株库的构建和突变菌株的筛选。
作为优选方案，IrrE的定向进化主要采用连续易错PCR。主要步骤如下：
(1)从耐辐射异常球菌R1中提取总DNA。以耐辐射异常球菌R1基因组为模板，设计引物irrE-F和irrE-R进行PCR扩增。通过1％琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物的大小和纯度是否正确，之后使用PCR产物回收试剂盒回收目的基因。
(2)PCR反应体系：模板DNA2μl、PCR缓冲液5μl、Taq DNA聚合酶1μl、dATP 0.2μl、dGTP 0.2μl、dCTP 1μl、dTTP 1μl、上游引物1μl、下游引物1μl、MgCl23mM、MnCl20.1-0.4mM，补加ddH2O至50μl。
(3)PCR条件：预变性94℃5min、变性94℃30s，退火60℃30s，延伸72℃1min，循环30次，终延伸72℃10min。
(4)第一轮易错PCR的模板DNA来源于耐辐射异常球菌R1，第二次易错PCR的模板DNA采用上次突变率最高的PCR产物，第三次易错PCR的模板DNA采用第二次突变率最高的PCR产物。
作为优选方案，所述含有IrrE突变基因的铜绿假单胞菌菌株库的构建方法，具体步骤如下：
(1)第三轮易错PCR扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化后，用EcoRI和HindIII分别对易错PCR扩增产物和载体pHERD20T进行消化、连接，化转到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于LB(含有300μg/mL羧苄青霉素)的平板，37℃培养12h后，将平板上长出来的转化子转接到LB液体培养基中进行培养，收集培养液重提质粒，并通过PCR和双酶切进行鉴定。
(2)采用电击转化法将验证正确的突变质粒转入铜绿假单胞菌PAO1感受态细胞中，涂布于LB(含有300μg/mL羧苄青霉素)的平板，37℃培养12h后，将平板上长出来的转化子转接到LB液体培养基中进行培养，收集培养液重提质粒，并通过PCR和双酶切进行鉴定。鉴定正确的阳性转化子构成了含有IrrE突变基因的铜绿假单胞菌菌株库。
作为优选方案，所述的突变菌株的筛选，主要步骤如下：
(1)将上述菌株库中的转化子分别接种到24深孔板(124mm×82mm×45mm)中，每个孔含有2ml的LB培养基(含有1mM L-阿拉伯糖,300μg/mL羧苄青霉素)，37℃，200r/min振荡培养12h。取300μL的培养液加入到96微孔板(128mm×86mm×15mm)的微孔中，然后放置于薄层层析扫描仪下，打开白光光源，用连接于电脑的照相机进行拍照，利用Matlab软件对培养液的颜色进行图像数字分析。以绿色(G值)为指标进行初筛，那些G值小于野生型IrrE重组菌株的转化子将用于下一轮的复筛。
(2)将初筛得到的正向转化子分别接种于装有5mL LB液体培养基(含300μg/mL羧苄青霉素)的20mL试管中，37℃，200r/min振荡培养12h后，将上述培养液以2％的接种量接种到装有50mL LB液体培养基(含有300μg/mL羧苄青霉素)的250mL三角瓶中，37℃，200r/min振荡培养至OD600为0.8左右时，添加1％L-阿拉伯糖作为诱导剂，37℃，200r/min条件下诱导12h。取5mL培养液，加入3mL氯仿，充分振荡5min后，5000r/min离心5min弃上清。在下层氯仿萃取物中加入2mL 0.2mol/L的盐酸，充分振荡5min后，5000r/min离心5min。取200μL上清液加入96微孔板中(128mm×86mm×15mm)，利用酶标仪测定上清液在520nm处吸光度，计算绿脓菌素的含量。整个筛选过程中，以野生型IrrE重组菌株作为参比筛选得到正向突变菌株。
第二方面，本发明提供了多个铜绿假单胞菌工程菌株。
本发明提供了铜绿假单胞菌IrrE突变菌株M1-59，所述突变体IrrE1-59的氨基酸序列如SEQ ID：2所示。所述突变体IrrE1-59是野生型IrrE氨基酸序列SEQ ID:1的第73位氨基酸由甲硫氨酸变为亮氨酸，第83位氨基酸由苯丙氨酸变为丝氨酸，第153位氨基酸由天冬酰胺变为天冬氨酸，第273位氨基酸由谷氨酸变为赖氨酸，第302位氨基酸由苯丙氨酸变为甘氨酸。
本发明提供了所述突变体IrrE1-59的编码基因。
本发明提供了铜绿假单胞菌IrrE突变菌株M1-123,所述的突变体IrrE1-123的氨基酸序列如SEQ ID：3所示，所述的突变体IrrE1-123是野生型IrrE氨基酸序列SEQ ID:1的第73位氨基酸由甲硫氨酸变为亮氨酸，第113位氨基酸由苯丙氨酸变为丝氨酸，第284位氨基酸由赖氨酸变为精氨酸。
本发明提供了所述突变体IrrE1-123的编码基因。
本发明提供了铜绿假单胞菌IrrE突变菌株M2-39，所述的突变体IrrE2-39的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述的突变体IrrE2-39是野生型IrrE氨基酸序列SEQ ID NO:1的第73位氨基酸由甲硫氨酸变为亮氨酸，第230位氨基酸由苏氨酸变为丙氨酸，第302位氨基酸由苯丙氨酸变为甘氨酸。
本发明提供了所述突变体IrrE2-39的编码基因。
本发明提供了铜绿假单胞菌IrrE突变菌株M2-59,所述的突变体IrrE2-59的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述的突变体IrrEM2-59由氨基酸序列SEQ ID:1的IrrE第73位氨基酸由甲硫氨酸变为亮氨酸，第296位氨基酸由甘氨酸变为丙氨酸，第297位氨基酸由异亮氨酸变为丝氨酸，第298位氨基酸由缬氨酸变为色氨酸，第299位氨基酸丙氨酸变为脯氨酸，第300位氨基酸由缬氨酸变为丝氨酸，第301位氨基酸由丝氨酸变为缬氨酸，第302位氨基酸由苯丙氨酸变为丝氨酸，第303位氨基酸由谷氨酸变为丝氨酸。
本发明提供了所述突变体IrrE2-59的编码基因。
第三方面，本发明提供了铜绿假单胞菌工程菌株在生产多个吩嗪类化合物中的用途。
作为优选方案，所述的吩嗪类化合物的合成过程如下
(1)菌种活化：从斜面划取一环菌体接种于装有5mL LB液体培养基的试管中，30-37℃、160-200r/min过夜振荡培养，含质粒的菌株培养基中需要添加300μg/mL羧苄青霉素；
(2)诱导培养：将上述培养液以2％～10％(V/V)的接种量接种到装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，30℃～37℃160～200r/min振荡培养至OD600为0.6～1.0时添加0.5％～3.0％的L-阿拉伯糖作为诱导剂，继续振荡培养至菌体的对数期后期，含质粒的菌株培养基中需要添加300μg/mL的羧苄青霉素。
(3)吩嗪类物质的提取和检测：收集好的培养液置于离心杯中，5000r/min离心10min，取上清加入等体积氯仿，超声萃取30min后5000r/min离心5min，取氯仿层(下层)室温下挥干。重复上述萃取过程三次。向样品中加入2ml乙腈溶液，充分溶解后用0.22μm纤维素滤膜过滤后用于HPLC检测。
第四方面，本发明提供了铜绿假单胞菌工程菌株在微生物燃料电池中的应用。
作为优选方案，所述的微生物燃料电池运行的主要步骤如下
(1)菌种活化：从斜面划取一环菌体接种于装有5mL LB液体培养基的试管中，30-37℃、160-200r/min过夜振荡培养，含质粒的菌株培养基中需要添加300μg/mL羧苄青霉素；
(2)诱导培养：将上述培养液以2％～10％(V/V)的接种量接种到装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，30℃～37℃，160-200r/min振荡培养至OD600为0.6～1.0时，添加0.5％～3.0％的L-阿拉伯糖作为诱导剂，继续振荡培养至菌体的对数期后期，含质粒的菌株培养基中需要添加300μg/mL的羧苄青霉素。
(3)产电活性检测：培养液经5000r/min离心5min后收集菌体，用阳极液重悬制备成OD600≈1.0～3.0的接种液，接入单室空气阴极MFCs的阳极室，进行产电活性的分析。其中，所用阳极液组成为(L-1)：蒸馏水1000mL中含有100mM PBS缓冲溶液(成分为：NH4Cl0.310g、KCl 0.130g、Na2HPO4·12H2O 4.576g、NaH2PO4·2H2O 2.452g，蒸馏水1000mL)、柠檬酸铁1g、葡萄糖1g，pH＝7.0～7.2。实验中，含质粒的菌株阳极液中添加300μg/mL羧苄青霉素和0.5％～3％的L-阿拉伯糖。
具体的操作方式如下
实施例1
用于易错PCR模板的重组质粒pMD18-T-irrE(W)的构建。具体过程包括：
使用G-细菌基因组DNA提取试剂盒从耐辐射异常球菌R1菌体中提取总DNA。以耐辐射异常球菌R1基因组为模板,根据irrE基因设计引物5’端的引物为irrE-F,3’端的引物为irrE-R。本发明中所涉及到的引物序列如表1所示。
表1本实验所用的引物
以引物irrE-F和irrE-R对irrE基因进行克隆，反应采取r-Taq聚合酶进行扩增，体系为50μL，PCR反应体系为表2所示。PCR扩增条件为94℃预变性5min；94℃30s、58℃30s、72℃1min，30个循环；72℃10min。
表2 PCR反应体系
反应结束后，将PCR产物进行0.1％的琼脂糖凝胶电泳，对目的片段进行胶回收。将回收得到的产物和pMD18-T分别用EcoR I和HindIII进行双酶切，并通过T4连接酶连接构建重组质粒pMD18-T-irrE(W)，具体构建流程见图1。
实施例2
易错PCR方法构建IrrE突变文库，具体过程包括：
(1)以实施例1中构建的质粒pMD18-T-irrE(W)为模板，通过加入Mn2+扰动随机引入突变，易错PCR体系为模板DNA2μl、PCR缓冲液5μl、Taq DNA聚合酶1μl、dATP 0.2μl、dGTP0.2μl、dCTP 1μl、dTTP 1μl、上游引物1μl、下游引物1μl、MgCl23mM、MnCl2分别为0.1、0.2、0.3、0.4mM，补加ddH2O至50μl。PCR条件：预变性94℃5min、变性94℃30s，退火60℃30s，延伸72℃1min，循环30次，终延伸72℃10min。
(2)将上述4个不同Mn2+条件下扩增得到的PCR产物分别收集，与经过EcoR I，HindIII酶切的pMD18-T载体用T4连接酶进行连接反应。将连接好的片段转化至大肠杆菌DH5α，涂布含有氨苄青霉素的LB平板，37℃倒置培养，待平板上出现转化子后，随机挑取转化子并进行测序，将突变率最高的转化子的质粒作为模板进行第二轮易错PCR，具体步骤同上。将第二轮易错PCR产物中测序突变率最高的转化子作为模板进行第三轮易错PCR，具体步骤同上。
实施例3
含有IrrE突变基因的铜绿假单胞菌菌株库的构建
将实施例2中的第三轮易错PCR扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化后，用EcoRI和HindIII分别对易错PCR扩增产物和载体pHERD20T进行消化、连接，化转到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于LB(含有300μg/mL羧苄青霉素)的平板，37℃培养12h后，将平板上长出来的所有转化子刮取后制备成菌悬液，并转接到LB(含有300μg/mL羧苄青霉素)液体培养基中进行培养，收集培养液重提质粒，并通过PCR和双酶切进行鉴定。
采用电击转化法将验证正确的突变质粒转入铜绿假单胞菌PAO1感受态细胞中，涂布于LB(含有300μg/mL羧苄青霉素)的平板，37℃培养12h后，将平板上长出来的转化子转接到LB液体培养基中进行培养，收集培养液重提质粒，并通过PCR和双酶切进行鉴定。鉴定正确的阳性转化子构成了含有IrrE突变基因的菌株库。实验中，以含有重组质粒pHERD20T-irrE(W)的野生型IrrE重组菌株作为对照菌株。
实施例4
高产绿脓菌素的突变株的高通量筛选
将实施例3中获得的菌株库中的突变株分别接种于装有2mL LB液体培养基(含有300μg/mL羧苄青霉素和1％L-阿拉伯糖)的24深孔板(124mm×82mm×45mm)中，37，200r/min振荡培养12h，然后把培养液加入到96孔板(128mm×86mm×15mm)中，放置于薄层层析扫描仪器中，打开白光光源，用连接于电脑的照相机对96孔板进行拍照，利用Matlab软件对培养液的颜色进行图像数字分析，以绿色(G值)为指标进行筛选。配置不同浓度的绿脓菌素标品，利用上述方法对溶液的图像进行数据分析，那些G值小于野生型IrrE重组菌株的转化子将用于下一轮的复筛。
将初筛出得到的转化子通过酶标仪测定进行吩嗪类物质的复筛，具体方法：取5mL菌液，加入3mL氯仿，振荡5min，5000r/min离心5min，去掉上清，在下层氯仿萃取物中加入2mL 0.2mol/L的盐酸，振荡5min，5000r/min离心5min；取上清液200μL于样品板(96孔板)，通过酶标仪测定上清液在520nm处吸光度，根据标准曲线，计算得到绿脓菌素的含量。由图2可知，酶标仪检测PYO含量筛选得到的排序最高的前四位菌株分别为M2-59(29.5mg/L/OD600)、M2-39(25.2mg/L/OD600)、M1-123(24.8mg/L/OD600)和M1-59(23.2mg/L/OD600)，与野生型IrrE重组菌株(Control)中PYO含量(22.6mg/L/OD600)相比，分别提高了29％、12％、10％、3％。
实施例5
四株突变菌株合成吩嗪类化合物能力的分析
将上述筛选得到的4株突变菌株和2个对照菌株(野生型IrrE重组菌株和野生型PAO1菌株)分别接种到装有5mL LB液体培养基的试管中，30℃、160r/min过夜振荡培养。以2％的接种量将过夜培养后的菌液接种到装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，30℃、160r/min振荡培养。当OD600≈0.6时(约3h)加入3％的L-阿拉伯糖诱导培养约8h。试验中含质粒的菌株培养基中需要添加300μg/mL的羧苄青霉素。收集培养好的菌液置于离心杯中，5000r/min离心10min，取上清加入等体积氯仿，超声30min后5000r/min离心5min，取氯仿层(下层)室温下挥干。重复上述过程三次。加入2ml乙腈溶液，充分溶解后用0.22μm纤维素滤膜过滤，HPLC测定样品中吩嗪类物质含量。检测条件如下：
液相色谱仪：Agilent Technologies 1260 Infinity Series
紫外检测器：Agilent Technologies 1200 Infinity Series
色谱柱：Agela C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；
流动相：A液：含0.1％乙酸的水溶液；B液：含0.1％乙酸的乙腈溶液；
梯度洗脱：0～2min内B液比例由0％逐渐增加到15％
2～22min内B液比例由15％逐渐增加到100％
22～30min内B液比例由100％逐渐降低到0％
流速：1.0mL/min；
波长：250nm(PCN、PCA)、262nm(1-OHPHZ)、280nm(PYO)
柱温：30℃
进样体积：10μL。
四个突变菌株M2-59、M2-39、M1-123、M1-59生产吩嗪-1-羧酸(PCA)、吩嗪-1-甲酰胺(PCN)、1-羟基吩嗪(1-OHPHZ)和绿脓菌素(PYO)的能力比野生型IrrE重组菌株分别提高了4.26％～17.69％、1.34％～39.76％、0.75％～96.87％、0.85％～107.36％，比野生型菌株PAO1分别提高了1.75％～17.36％、0.27％～62.33％、1.32％～96.34％和13.72％～126.32％。
实施例6
四株突变菌株在最优条件下合成吩嗪类化合物的能力
将上述筛选得到的4株突变菌株和2个对照菌株(野生型IrrE重组菌株和野生型PAO1菌株)分别接种到装有5mL LB液体培养基的试管中，37℃、200rpm过夜振荡培养。以10％的接种量将过夜培养后的菌液接种到装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，37℃、200r/min振荡培养。当OD600≈1.0时(约3h)加入1％的L-阿拉伯糖诱导培养约12h。试验中含质粒的菌株培养基中需要添加300μg/mL的羧苄青霉素。收集培养好的菌液置于离心杯中，5000r/min离心10min，取上清加入等体积氯仿，超声30min，5000r/min离心5min，取氯仿层(下层)室温下挥干。重复上述过程三次。加入2ml乙腈溶液，充分溶解后用0.22μm纤维素滤膜过滤，HPLC测定样品中吩嗪类物质含量。检测条件如下：
液相色谱仪：Agilent Technologies 1260 Infinity Series
紫外检测器：Agilent Technologies 1200 Infinity Series
色谱柱：Agela C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；
流动相：A液：含0.1％乙酸的水溶液；B液：含0.1％乙酸的乙腈溶液；
梯度洗脱：0～2min内B液比例由0％逐渐增加到15％
2～22min内B液比例由15％逐渐增加到100％
22～30min内B液比例由100％逐渐降低到0％
流速：1.0mL/min；
波长：250nm(PCN、PCA)、262nm(1-OHPHZ)、280nm(PYO)
柱温：30℃
进样体积：10μL。
如图4所示，四个突变菌株M2-59、M2-39、M1-123、M1-59生产吩嗪-1-羧酸(PCA)、吩嗪-1-甲酰胺(PCN)、1-羟基吩嗪(1-OHPHZ)和绿脓菌素(PYO)的能力比野生型IrrE重组菌株分别提高了约5.43％～19.50％、2.19％～45.25％、1.45％～110.12％、1.81％～111.43％，比野生型菌株PAO1分别提高了2.73％～19.56％、0.44％～77.51％、1.77％～114.27％和15.44％～140.41％。
实施例7
四株突变株接入MFCs中的产电性能分析
将上述筛选得到的4株突变菌株和2个对照菌株(野生型IrrE重组菌株和野生型PAO1菌株)分别接种到装有5mL LB液体培养基的试管中，30℃、160r/min过夜振荡培养。以2％的接种量将过夜培养后的菌液接种到装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，30℃、160r/min振荡培养。当OD600≈0.6时(约3h)加入3％的L-阿拉伯糖诱导培养约8h。试验中含质粒的菌株培养基中需要添加300μg/mL的羧苄青霉素。上述培养液经5000r/min离心5min收集菌体，用阳极液重悬后制备成OD600＝1.0的接种液，接入单室空气阴极MFCs的阳极室，观察输出电压的变化情况。其中，所用阳极液组成为(L-1)：100mM PBS缓冲溶液(成分为：NH4Cl 0.310g、KCl 0.130g、Na2HPO4·12H2O 4.576g、NaH2PO4·2H2O 2.452g，蒸馏水1000mL)、柠檬酸铁1g、葡萄糖1g，pH＝7.0，蒸馏水1000mL。实验中，含质粒的菌株阳极液中添加300μg/mL羧苄青霉素和0.5％～3％的L-阿拉伯糖。结果表明，四株突变株M2-59、M2-39、M1-123和M1-59接种微生物燃料电池后产生的电压分别为389mV、322mV、182mV、210mV，比野生型IrrE重组菌株(203mV)分别提高了91.62％、58.62％、11.53％和3.44％，比野生型菌株PAO1(151mV)分别提高了157.61％、、113.24％、20.53％和39.07％。
实施例8
四株突变株在最优条件下的产电性能
将上述筛选得到的4株突变菌株和2个对照菌株(野生型IrrE重组菌株和野生型PAO1菌株)分别接种到装有5mL LB液体培养基的试管中，37℃、200r/min过夜振荡培养。取10％的接种量将过夜培养后的菌液接种到装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，37℃200r/min振荡培养。当OD600＝1.0时(约3h)时加入1％的L-阿拉伯糖诱导培养约12h。试验中含质粒的菌株培养基中需要添加300μg/mL的羧苄青霉素。上述培养液经5000r/min离心5min收集菌体，用阳极液重悬后制备成OD600＝3.0的接种液，接入单室空气阴极MFCs的阳极室，观察输出电压的变化情况，并待系统达到稳定后测定功率密度和计算系统内阻。其中，所用阳极液组成为(L-1)：100mM PBS缓冲溶液(成分为：NH4Cl 0.310g、KCl 0.130g、Na2HPO4·12H2O 4.576g、NaH2PO4·2H2O 2.452g，蒸馏水1000mL)、柠檬酸铁1g、葡萄糖1g，pH＝7.2，蒸馏水1000mL。实验中，含质粒的菌株阳极液中添加300μg/mL羧苄青霉素和1％的L-阿拉伯糖。
由图5可知，四个突变株M2-59、M2-39、M1-123和M1-59接种微生物燃料电池后产生的电压分别为450mV、403mV、258mV、203mV，比野生型IrrE重组菌株(203mV)分别提高了122.77％、99.51％、27.72％和0.42％，比野生型菌株PAO1(151mV)分别提高了198.01％、166.89％、70.66％和34.44％。四个突变株M2-59、M2-39、M1-123和M1-59接种微生物燃料电池后产生的功率密度分别达到了175mW/m2、106mW/m2、63mW/m2和59.5mW/m2，比野生型IrrE重组菌株(56mW/m2)分别提高了2.13倍、0.89倍、0.13倍、0.06倍，比野生型菌株PAO1(32.7mW/m2)分别提高了4.4倍、2.2倍、0.93倍和0.82倍。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种铜绿假单胞菌工程菌株的制备方法、菌株及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 982
<212> DNA
<213> 菌株M1-59的突变IrrE基因序列(Unknown)
<400> 1
atgcccagtg ccaacgtcag ccccccttgc ccctctgggg taaggggcgg ggggatgggg 60
ccaaaagcta aagctgaagc ctccaagccc cacccccaaa tccctgttaa gctcccattc 120
gtgaccgccc ccgacgccct cgccgccgcc aaagccaggt gcgcgacctg gcggcggcct 180
acgtggcggc cctgcccgga cgcgacaccc acagccgatg gcgggggtgc ccggcgtaga 240
cctcaaattc atgccgctcg gctggcgcgt cggggcgttc gaccccgagc acaacgtcat 300
cctcatcaac tcggcggccc gccccgaacg ccagcgcttc accctcgccc acgaaatcgg 360
gcacgcgatt ttactcggcg acgacgacct gctctccgac atccacgacg cctacgaggg 420
cgagcggctc gaacaggtca tcgaaacgct gtgcaacgtg gcggcggcgg cgattttgat 480
gcccgaaccc gtcatcgcgg aaatgctgga acgcttcggc cccaccgggc gcgccctcgc 540
cgaactcgcc aagcgggccg aagtcagcgc gtcgtcggcg ctctacgccc tgaccgagca 600
gaccccggtg cccgtcatct acgcggtctg cgcgccgggc aagcctccgc gtgagcaggc 660
cgcaagcgac gaggacgctg gcccaagcac agaaaaagtc ctgacggtcc gcgccagcag 720
ctcgacgcgg ggcgtcaagt acaccctggc gagcggcacg ccggtacccg ccgaccaccc 780
ggcggcgctt gccctcacca cgggcatgga agtgcgcgag gaaagctacg tgccctttcg 840
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<210> 2
<211> 982
<212> DNA
<213> 菌株M1-123的突变IrrE基因序列(Unknown)
<400> 2
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<210> 3
<211> 982
<212> DNA
<213> 菌株M2-39的突变IrrE基因序列(Unknown)
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<210> 4
<211> 982
<212> DNA
<213> 菌株M2-59的突变IrrE基因序列(Unknown)
<400> 4
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gtgaccgccc ccgacgccct cgccgccgcc aaagccaggt gcgcgacctg gcggcggcct 180
acgtggcggc cctgcccgga cgcgacaccc acagccgatg gcgggggtgc ccggcgtaga 240
cctcaaattc atgccgctcg gctggcgcgt cggggcgttc gaccccgagc acaacgtcat 300
cctcatcaac tcggcggccc gccccgaacg ccagcgcttc accctcgccc acgaaatcgg 360
gcacgcgatt ttactcggcg acgacgacct gctctccgac atccacgacg cctacgaggg 420
cgagcggctc gaacaggtca tcgaaacgct gtgcaacgtg gcggcggcgg cgattttgat 480
gcccgaaccc gtcatcgcgg aaatgctgga acgcttcggc cccaccgggc gcgccctcgc 540
cgaactcgcc aagcgggccg aagtcagcgc gtcgtcggcg ctctacgccc tgaccgagca 600
gaccccggtg cccgtcatct acgcggtctg tgcgccgggc aagcctccgc gtgagcaggc 660
cgcaagcgac gaggacgctg gcccaagcac agaaaaagtc ctgacggtcc gcgccagcag 720
ctcgacgcgg ggcgtcaagt acaccctggc gagcggcacg ccggtacccg ccgaccaccc 780
ggcggcgctt gccctcgcca cgggcatgga agtgcgcgag gaaagctacg tgccctttcg 840
ctcgggccgg aaaatgaagg cggaggtgga cgcctacccg tcgcgcggca tcgtggccgt 900
cagtttcgag ttcgaccccg cccgcctggg ccgcaaggac agcgagcagg ccgaccggga 960
cgagccgcag gacgctgcat ag 982
<210> 5
<211> 320
<212> PRT
<213> 野生型IrrE氨基酸序列(Unknown)
<400> 5
Val Pro Ser Ala Asn Val Ser Pro Pro Cys Pro Ser Gly Val Arg Gly
1 5 10 15
Gly Gly Met Gly Ala Lys Ala Glu Ala Ser Lys Pro His Pro Gln Ile
20 25 30
Pro Val Lys Leu Pro Phe Val Thr Ala Pro Asp Ala Leu Ala Ala Ala
35 40 45
Lys Ala Arg Met Arg Asp Leu Ala Ala Ala Tyr Val Ala Ala Leu Pro
50 55 60
Gly Arg Asp Thr His Ser Leu Ala Gly Val Pro Gly Val Asp Leu Lys
65 70 75 80
Phe Pro Leu Gly Trp Arg Asp Gly Ala Phe Asp Pro Glu His Asn Val
85 90 95
Ile Leu Ile Asn Ser Ala Ala Arg Pro Glu Arg Gln Arg Phe Thr Leu
100 105 110
Ala His Glu Ile Gly His Ala Ile Leu Leu Gly Asp Asp Asp Leu Leu
115 120 125
Ser Asp Ile His Asp Ala Tyr Glu Gly Glu Arg Leu Glu Gln Val Ile
130 135 140
Glu Thr Leu Cys Asn Val Ala Ala Ala Ala Ile Leu Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Ile Ala Glu Leu Glu Arg Phe Gly Pro Thr Gly Arg Ala Leu Ala Glu
165 170 175
Leu Ala Lys Arg Ala Glu Val Ser Ala Ser Ser Ala Leu Tyr Ala Leu
180 185 190
Thr Glu Gln Thr Pro Val Pro Val Ile Tyr Ala Val Cys Ala Pro Gly
195 200 205
Lys Pro Pro Arg Glu Gln Ala Ala Ser Asp Glu Asp Ala Gly Pro Ser
210 215 220
Thr Glu Lys Val Leu Thr Val Arg Ala Ser Ser Ser Thr Arg Gly Val
225 230 235 240
Lys Tyr Thr Leu Ala Ser Gly Thr Pro Val Pro Ala Asp His Pro Ala
245 250 255
Ala Leu Ala Leu Ala Thr Gly Glu Val Arg Glu Glu Ser Tyr Val Pro
260 265 270
Phe Arg Ser Gly Arg Lys Lys Ala Glu Val Asp Ala Tyr Pro Ser Arg
275 280 285
Gly Ile Val Ala Val Ser Phe Glu Phe Asp Pro Ala Arg Leu Gly Arg
290 295 300
Lys Asp Ser Glu Gln Ala Asp Arg Asp Glu Pro Gln Asp Ala Ala Gln
305 310 315 320
<210> 6
<211> 320
<212> PRT
<213> 菌株M1-59突变的IrrE氨基酸序列(Unknown)
<400> 6
Val Pro Ser Ala Asn Val Ser Pro Pro Cys Pro Ser Gly Val Arg Gly
1 5 10 15
Gly Gly Met Gly Pro Lys Ala Lys Ala Glu Ala Ser Lys Pro His Pro
20 25 30
Gln Ile Pro Val Lys Leu Pro Phe Val Thr Ala Pro Asp Ala Leu Ala
35 40 45
Ala Ala Lys Ala Arg Met Arg Asp Leu Ala Ala Ala Tyr Val Ala Ala
50 55 60
Leu Pro Gly Arg Asp Thr His Ser Leu Ala Gly Val Pro Gly Val Asp
65 70 75 80
Leu Lys Ser Pro Leu Gly Trp Arg Asp Gly Ala Phe Asp Pro Glu His
85 90 95
Asn Val Ile Leu Ile Asn Ser Ala Ala Arg Pro Glu Arg Gln Arg Phe
100 105 110
Thr Leu Ala His Glu Ile Gly His Ala Ile Leu Leu Gly Asp Asp Asp
115 120 125
Leu Leu Ser Asp Ile His Asp Ala Tyr Glu Gly Glu Arg Leu Glu Gln
130 135 140
Val Ile Glu Thr Leu Cys Asp Val Ala Ala Ala Ala Ile Leu Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Ile Ala Glu Leu Glu Arg Phe Gly Pro Thr Gly Arg Ala Leu
165 170 175
Ala Glu Leu Ala Lys Arg Ala Glu Val Ser Ala Ser Ser Ala Leu Tyr
180 185 190
Ala Leu Thr Glu Gln Thr Pro Val Pro Val Ile Tyr Ala Val Cys Ala
195 200 205
Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Gln Ala Ala Ser Asp Glu Asp Ala Gly
210 215 220
Pro Ser Thr Glu Lys Val Leu Thr Val Arg Ala Ser Ser Ser Thr Arg
225 230 235 240
Gly Val Lys Tyr Thr Leu Ala Ser Gly Thr Pro Val Pro Ala Asp His
245 250 255
Pro Ala Ala Leu Ala Leu Ala Thr Gly Glu Val Arg Lys Glu Ser Tyr
260 265 270
Val Pro Phe Arg Ser Gly Arg Lys Lys Ala Glu Val Asp Ala Tyr Pro
275 280 285
Ser Arg Gly Ile Val Ala Val Ser Leu Gly Phe Asp Pro Ala Arg Ile
290 295 300
Pro Pro Pro Leu Thr Pro Glu Gly Gln Gly Gly Leu Thr Gln Ala Leu
305 310 315 320
<210> 7
<211> 320
<212> PRT
<213> 菌株M1-123突变的IrrE氨基酸序列(Unknown)
<400> 7
Val Pro Ser Ala Asn Val Ser Pro Pro Cys Pro Ser Gly Val Arg Gly
1 5 10 15
Gly Gly Met Gly Pro Lys Ala Lys Ala Glu Ala Ser Lys Pro His Pro
20 25 30
Gln Ile Pro Val Lys Leu Pro Phe Val Thr Ala Pro Asp Ala Leu Ala
35 40 45
Ala Ala Lys Ala Arg Met Arg Asp Leu Ala Ala Ala Tyr Val Ala Ala
50 55 60
Leu Pro Gly Arg Asp Thr His Ser Leu Ala Gly Val Pro Gly Val Asp
65 70 75 80
Leu Lys Phe Pro Leu Gly Trp Arg Asp Gly Ala Phe Asp Pro Glu His
85 90 95
Asn Val Ile Leu Ile Asn Ser Ala Ala Arg Pro Glu Arg Gln Arg Ser
100 105 110
Thr Leu Ala His Glu Ile Gly His Ala Ile Leu Leu Gly Asp Asp Asp
115 120 125
Leu Leu Ser Asp Ile His Asp Ala Tyr Glu Gly Glu Arg Leu Glu Gln
130 135 140
Val Ile Glu Thr Leu Cys Asn Val Ala Ala Ala Ala Ile Leu Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Ile Ala Glu Leu Glu Arg Phe Gly Pro Thr Gly Arg Ala Leu
165 170 175
Ala Glu Leu Ala Lys Arg Ala Glu Val Ser Ala Ser Ser Ala Leu Tyr
180 185 190
Ala Leu Thr Glu Gln Thr Pro Val Pro Val Ile Tyr Ala Val Cys Ala
195 200 205
Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Gln Ala Ala Ser Asp Glu Asp Ala Gly
210 215 220
Pro Ser Thr Glu Lys Val Leu Thr Val Arg Ala Ser Ser Ser Thr Arg
225 230 235 240
Gly Val Lys Tyr Thr Leu Ala Ser Gly Thr Pro Val Pro Ala Asp His
245 250 255
Pro Ala Ala Leu Ala Leu Ala Thr Gly Glu Val Arg Glu Glu Ser Tyr
260 265 270
Val Pro Phe Arg Ser Gly Arg Arg Lys Ala Glu Val Asp Ala Tyr Pro
275 280 285
Ser Arg Gly Ile Val Ala Val Ser Phe Glu Phe Asp Pro Ala Arg Leu
290 295 300
Gly Arg Lys Asp Ser Glu Gln Ala Asp Arg Asp Glu Pro Gln Thr Leu
305 310 315 320
<210> 8
<211> 320
<212> PRT
<213> 菌株M2-39突变的IrrE氨基酸序列(Unknown)
<400> 8
Val Pro Ser Ala Asn Val Ser Pro Pro Cys Pro Ser Gly Val Arg Gly
1 5 10 15
Gly Gly Met Gly Pro Lys Ala Lys Ala Glu Ala Ser Lys Pro His Pro
20 25 30
Gln Ile Pro Val Lys Leu Pro Phe Val Thr Ala Pro Asp Ala Leu Ala
35 40 45
Ala Ala Lys Ala Arg Met Arg Asp Leu Ala Ala Ala Tyr Val Ala Ala
50 55 60
Leu Pro Gly Arg Asp Thr His Ser Leu Ala Gly Val Pro Gly Val Asp
65 70 75 80
Leu Lys Phe Pro Leu Gly Trp Arg Asp Gly Ala Phe Asp Pro Glu His
85 90 95
Asn Val Ile Leu Ile Asn Ser Ala Ala Arg Pro Glu Arg Gln Arg Phe
100 105 110
Thr Leu Ala His Glu Ile Gly His Ala Ile Leu Leu Gly Asp Asp Asp
115 120 125
Leu Leu Ser Asp Ile His Asp Ala Tyr Glu Gly Glu Arg Leu Glu Gln
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Val Ile Glu Thr Leu Cys Asn Val Ala Ala Ala Ala Ile Leu Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Ile Ala Glu Leu Glu Arg Phe Gly Pro Thr Gly Arg Ala Leu
165 170 175
Ala Glu Leu Ala Lys Arg Ala Glu Val Ser Ala Pro Ser Ala Leu Tyr
180 185 190
Ala Leu Thr Glu Gln Thr Pro Val Pro Val Ile Tyr Ala Val Cys Ala
195 200 205
Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Gln Ala Ala Ser Asp Glu Asp Ala Gly
210 215 220
Pro Ser Ala Glu Lys Val Leu Thr Val Arg Ala Ser Ser Ser Thr Arg
225 230 235 240
Gly Val Lys Tyr Thr Leu Ala Ser Gly Thr Pro Val Pro Ala Asp His
245 250 255
Pro Ala Ala Leu Ala Leu Ala Thr Gly Glu Val Arg Glu Glu Ser Tyr
260 265 270
Val Pro Phe Arg Ser Gly Arg Lys Lys Ala Glu Val Asp Ala Tyr Pro
275 280 285
Ser Arg Gly Ile Val Ala Val Ser Phe Gly Phe Asp Pro Ala Arg Leu
290 295 300
Gly Arg Arg Thr Ala Ser Ser Arg Pro Gly Arg Ala Gln Thr Leu His
305 310 315 320
<210> 9
<211> 320
<212> PRT
<213> 菌株M2-59突变的IrrE氨基酸序列(Unknown)
<400> 9
Val Pro Ser Ala Asn Val Ser Pro Pro Cys Pro Ser Gly Val Arg Gly
1 5 10 15
Gly Gly Met Gly Pro Lys Ala Lys Ala Glu Ala Ser Lys Pro His Pro
20 25 30
Gln Ile Pro Val Lys Leu Pro Phe Val Thr Ala Pro Asp Ala Leu Ala
35 40 45
Ala Ala Lys Ala Arg Met Arg Asp Leu Ala Ala Ala Tyr Val Ala Ala
50 55 60
Leu Pro Gly Arg Asp Thr His Ser Leu Ala Gly Val Pro Gly Val Asp
65 70 75 80
Leu Lys Phe Pro Leu Gly Trp Arg Asp Gly Ala Phe Asp Pro Glu His
85 90 95
Asn Val Ile Leu Ile Asn Ser Ala Ala Arg Pro Glu Arg Gln Arg Phe
100 105 110
Thr Leu Ala His Glu Ile Gly His Ala Ile Leu Leu Gly Asp Asp Asp
115 120 125
Leu Leu Ser Asp Ile His Asp Ala Tyr Glu Gly Glu Arg Leu Glu Gln
130 135 140
Val Ile Glu Thr Leu Cys Asn Val Ala Ala Ala Ala Ile Leu Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Ile Ala Glu Leu Glu Arg Phe Gly Pro Thr Gly Arg Ala Leu
165 170 175
Ala Glu Leu Ala Lys Arg Ala Glu Val Ser Ala Ser Ser Ala Leu Tyr
180 185 190
Ala Leu Thr Glu Gln Thr Pro Val Pro Val Ile Tyr Ala Val Cys Ala
195 200 205
Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Gln Ala Ala Ser Asp Glu Asp Ala Gly
210 215 220
Pro Ser Thr Glu Lys Val Leu Thr Val Arg Ala Ser Ser Ser Thr Arg
225 230 235 240
Gly Val Lys Tyr Thr Leu Ala Ser Gly Thr Pro Val Pro Ala Asp His
245 250 255
Pro Ala Ala Leu Ala Leu Ala Thr Gly Glu Val Arg Glu Glu Ser Tyr
260 265 270
Val Pro Phe Arg Ser Gly Arg Lys Lys Ala Glu Val Asp Ala Tyr Pro
275 280 285
Ser Arg Ala Ser Trp Pro Ser Val Ser Ser Ser Thr Pro Pro Ala Trp
290 295 300
Ala Ala Gly Thr Ala Ser Ser Arg Pro Gly Arg Ala Ala Gly Arg Cys
305 310 315 320

Claims (10)

1.一种同时提高多个吩嗪类化合物产量和产电活性的铜绿假单胞菌工程菌株的制备方法，其特征在于：利用连续易错PCR方法对来源于耐辐射异常球菌中的全局转录因子IrrE进行突变，筛选得到的突变体导入铜绿假单胞菌PAO1中。
2.根据权利要求1所述的同时提高多个吩嗪类化合物产量和产电活性的铜绿假单胞菌工程菌株的制备方法，其特征在于：连续易错PCR方法步骤如下：
(1)从耐辐射异常球菌R1菌体中提取总DNA，以耐辐射异常球菌R1基因组为模板，设计引物irrE-F和irrE-R进行PCR扩增，验证纯度回收目的基因；
(2)通过改变PCR反应条件中Mg2+浓度(3mM)和Mn2+浓度(0.1-0.4mM)的方法进行易错PCR；
(3)挑取含有pMD18T质粒的E.coli DH5α单菌落接入含有氨苄青霉素抗性的5mL LB液体培养基中，30℃～37℃，160～200r/min振荡培养12h，取1.5mL的培养液，10000r/min离心1min后收集菌体，进行质粒提取；
(4)利用限制性内切酶HindIII和EcoR I对提取的pMD18T质粒与回收得到的irrE易错PCR产物进行双酶切，按照载体与插入片段摩尔比例1：3，配制连接体系，使用T4连接酶，16℃连接过夜；
(5)将上述重组质粒导入E.coli DH5α感受态细胞并将转化液涂布在含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃培养约12h，挑取平板上长出来的单菌落接种于装有5mL LB液体培养基的试管中，液体培养基中含有100μg/mL氨苄青霉素，200r/min震荡培养12h，收集菌体并重提质粒，利用PCR和双酶切进行验证，将酶切得到的扩增产物片段回收，并作为模板进行第二轮和第三轮易错PCR；
(6)将第三轮易错PCR产物连接到pHERD20T质粒上，并导入到铜绿假单胞菌PAO1感受态细胞中，LB固体平板上长出来的转化子重提质粒后进行PCR和双酶切验证。
3.一种IrrE定向改造的高产吩嗪类物质和电活性突变体IrrEM1-59，其特征在于：所述突变体IrrEM1-59的基因序列SEQ ID NO:1所示。
4.一种IrrE定向改造的高产吩嗪类物质和电活性突变体IrrEM1-123，其特征在于：所述突变体IrrEM1-123的基因序列SEQ ID NO:2所示。
5.一种IrrE定向改造的高产吩嗪类物质和电活性突变体IrrEM2-39，其特征在于：所述突变体IrrEM2-39的基因序列SEQ ID NO:3所示。
6.一种IrrE定向改造的高产吩嗪类物质和电活性突变体IrrEM2-59，其特征在于：所述的突变体IrrEM2-59的基因序列SEQ ID NO:4所示。
7.权利要求1的方法构建的铜绿假单胞菌工程菌株同时产多个吩嗪类化合物合成的方法，其特征在于：
(1)菌种活化：从斜面划取一环菌体接种于装有5mL LB液体培养基的试管中，30～37℃、160～200r/min过夜振荡培养，含质粒的菌株培养基中需要添加300μg/mL羧苄青霉素；
(2)诱导培养：将上述培养液以2％～10％(V/V)的接种量接种到装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，30℃～37℃160～200r/min振荡培养至OD600为0.6～1.0时添加0.5％～3.0％的L-阿拉伯糖作为诱导剂，继续振荡培养至菌体的对数期后期，含质粒的菌株培养基中需要添加300μg/mL的羧苄青霉素；
(3)吩嗪类物质的提取和检测：收集好的培养液置于离心杯中，5000r/min离心10min，取上清加入等体积氯仿，超声萃取30min后5000r/min离心5min，取氯仿层室温下挥干，重复上述萃取过程三次，向样品中加入2ml乙腈溶液，充分溶解后用0.22μm纤维素滤膜过滤后用于HPLC检测。
8.权利要求1的方法构建的铜绿假单胞菌工程菌株在微生物燃料电池的应用。
9.根据权利要求8所述的铜绿假单胞菌工程菌株在微生物燃料电池的应用，其特征在于：产电方法如下：
(1)菌种活化：从斜面划取一环菌体接种于装有5mL LB液体培养基的试管中，30-37℃、160～200r/min过夜振荡培养，含质粒的菌株培养基中需要添加300μg/mL羧苄青霉素；
(2)诱导培养：将上述培养液以2％～10％(V/V)的接种量接种到装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，30℃～37℃，160～200r/min振荡培养至OD600为0.6～1.0时，添加0.5％～3.0％的L-阿拉伯糖作为诱导剂，继续振荡培养至菌体的对数期后期，含质粒的菌株培养基中需要添加300μg/mL的羧苄青霉素；
(3)产电活性检测：培养液经5000r/min离心5min后收集菌体，用阳极液重悬制备成OD600≈1.0～3.0的接种液，接入单室空气阴极MFCs的阳极室，进行产电活性的分析，其中，所用阳极液组成为(L-1)：蒸馏水1000mL中含有100mM PBS缓冲溶液(成分为：NH4Cl 0.310g、KCl 0.130g、Na2HPO4·12H2O 4.576g、NaH2PO4·2H2O 2.452g，蒸馏水1000mL)、柠檬酸铁1g、葡萄糖1g，pH＝7.0～7.2。实验中，含质粒的菌株阳极液中添加300μg/mL羧苄青霉素和0.5％～3％的L-阿拉伯糖。
10.一种筛选高产吩嗪类化合物的铜绿假单胞菌菌株的方法，其特征在于：步骤如下：
将菌株分别接种到24深孔板中，每个孔含有2ml的LB培养基，LB培养基含有1mM L-阿拉伯糖,300μg/mL羧苄青霉素，37℃，200r/min振荡培养12h；
取300μL的培养液加入到96微孔板的微孔中，然后放置于薄层层析扫描仪下，打开白光光源，用连接于电脑的照相机进行拍照，利用Matlab软件对培养液的颜色进行图像数字分析，以绿色G值为指标进行初筛，那些G值小于野生型IrrE重组菌株的转化子将用于下一轮的复筛。
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