CN109897862A - 庆大霉素b生产菌及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于制药领域，提供了一种庆大霉素B生产菌及其制备方法和应用。所述庆大霉素B生产菌，其为棘孢小单孢菌Micromonospora echinosporaHS‑1520‑016‑89基因组中，genK基因被置换为genR和genS，且genR和genS由强启动子启动。本发明的庆大霉素B生产菌大幅度降低了庆大霉素C2b组分的生成，有效提高庆大霉素B产量，大幅度降低异帕米星的工业化生产成本。

Description

庆大霉素B生产菌及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于制药领域，涉及庆大霉素B的生产。

背景技术

异帕米星(Isepamicin)是在庆大霉素B结构的氨基上引入异丝氨酸半合成而来的新型氨基糖苷类抗生素。作为第二代氨基糖苷类抗生素，具有稳定的抗修饰酶作用的特性，杀菌活性强、毒副作用小，被广泛应用于各种细菌感染类疾病的治疗。

庆大霉素B(Gentamicin B)是由棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)产生的一种氨基糖苷类抗生素。通常情况下，棘孢小单孢菌主要产生庆大霉素C1、C1a、C2、C2a、C2b五种C组化合物，而庆大霉素B是伴随其产生的微量组分。关于庆大霉素B如何产生至今未有报道，而国内外庆大霉素B生产菌株的获得也主要是通过人工诱变和自然选育方式的传统选育模式。传统选育模式的筛选过程是完全随机的，无法有效控制杂质的产生，限制了庆大霉素B的生产水平的进一步提高。因此，在传统选育的基础上，有效借助代谢工程改造手段来定向提高庆大霉素B的产量并减少杂质，对异帕米星生产成本的降低至关重要。

发明内容

申请人在全基因组测序的基础上，经序列分析，在棘孢小单孢菌中发现了与庆大霉素B的合成密切相关的两个基因，分别命名为genR和genS，并进行了实验验证。

基于此，本发明的第一个目的是提供两个与庆大霉素B的合成相关的基因，所述基因分别为genR，其DNA序列如SEQ ID NO:1所示，和genS，其 DNA序列如SEQ ID NO:2所示。其中，genR和genS是棘孢小单孢菌中基因。进一步地，所述棘孢小单孢菌是Micromonosporaechinospora HS-1520-016-89，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉大学，保藏中心保藏编号为CCTCC NO:M 2018898；保藏时间为2018年12月17日。

在第二个方面，提供一种庆大霉素B生产菌的构建方法，所述方法以棘孢小单孢菌Micromonospora echinospora HS-1520-016-89为原始菌，以genR 和genS基因序列置换了原基因组上的genK基因序列，并以强启动子启动genR 和genS基因。genK基因序列信息来自基因组序列，其DNA序列如SEQ ID NO: 3所示。

优选地，采用基因同源重组技术将原基因组上的genK基因序列置换为 genR和genS基因序列。

优选地，所述genR基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，所述genS 基因的DNA序列如SEQ ID NO:2所示。

优选地，所述强启动子选自kasOp*、SRL37、gapdhp-KR、SPL39、rpsLp-cf、 SPL42。

优选地，genR基因由启动子kasOp*启动，genS基因由启动子SRL37启动。

优选地，所述方法包括：(1)构建基因工程改造质粒pYC001，所述质粒包含genK上游同源臂、kasOp*启动子、genR基因、SRL37启动子、genS基因和genK下游同源臂；(2)将所述质粒转化大肠杆菌；(3)混合培养转化的大肠杆菌和棘孢小单孢菌，得到接合转移的庆大霉素B生产菌。

在第三个方面，提供庆大霉素B生产菌，其为棘孢小单孢菌 Micromonosporaechinospora HS-1520-016-89基因组中，genK基因被置换为 genR和genS，且genR基因由启动子kasOp*启动，genS基因由启动子SRL37 启动。优选地，所述庆大霉素B生产菌由本发明的方法构建。

在第四个方面，提供本发明的庆大霉素B生产菌在生产庆大霉素B中的应用。更进一步地，提供本发明的庆大霉素B生产菌在生产以庆大霉素B为中间体的物质中的应用，所述物质如异帕米星。

在第五个方面，提供一种生产庆大霉素B的方法，包括使用本发明的庆大霉素B生产菌。

本发明发现了棘孢小单胞菌中与庆大霉素B生产相关的内源基因genR和 genS并对它们进行了基因功能的验证，证实了两者与庆大霉素B的合成密切相关。同时结合强启动子策略，快速构建了一种庆大霉素B的基因改良菌株，该菌株遗传稳定，大幅度降低了庆大霉素C2b组分的生成，有效提高庆大霉素B产量，大幅度降低异帕米星的工业化生产成本。

本发明涉及的棘孢小单孢菌Micromonospora echinospora HS-1520-016-89 已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉大学，保藏中心保藏编号为CCTCCNO:M 2018898；保藏时间为2018年12月17日，状态为存活。

附图说明

图1：genR和genS敲除菌株构建原理及PCR验证图。其中，A为genR 和genS的CRISPR/Cas9敲除菌株构建及验证原理图；B为重组菌株PCR验证琼脂糖凝胶电泳图。

图2：棘孢小单胞菌中启动子强度测定柱状图。

图3：genR和genS高效表达菌株构建原理及PCR验证图。其中A描述了实施例6的菌株改良所需的重组质粒pYC001以及重组菌株的构建过程；B为重组菌株PCR验证琼脂糖凝胶电泳图，其中，重组菌株1、2和3均为 HS-1520-016-89-pYC001，表示符合抗性筛选步骤中挑取的三个平行克隆，其中重组菌株3被用于后续研究；出发菌株为HS-1520-016-89；凝胶电泳图中不同的条带，其中2558bp的DNA条带表示成功进行基因替换菌株的扩增片段大小，2049bp则代表原始菌株PCR扩增条带大小。

图4：庆大霉素B的原始菌株及genR和genS系列工程菌株的发酵产物鉴定。其中，A为原始菌株与基因工程改良菌株系列的HPLC-CAD图谱比对，横坐标为时间(min)；B为各菌株庆大霉素B发酵水平，参照实施例3的方法，对各菌株的庆大霉素B产量进行测定而得。

图5：衍生化方法对C2b杂质鉴定的HPLC图，其中，A为原始菌株图谱， B为工程菌HS-1520-016-89-pYC001图谱。

具体实施方式

以下将结合具体实施方式详细说明本发明内容，但本发明的范围不限于此。

以下具体实施例中，如无具体说明，使用的试剂和仪器都是本领域常用试剂和仪器，可以通过商购的方式获得；所使用的方法为本领域常规方法，本领域技术人员根据实施例内容可以知道如何具体实现所述方法，并实现相应的结果。

本发明涉及高产庆大霉素B生产菌，其构建过程主要包括以下步骤：

(1)棘孢小单胞菌工业菌株的基因组测序及分析；

(2)内源基因genR和genS生物学功能验证，主要包括基因的敲除与回补，涉及敲除和回补质粒的构建、重组菌株的筛选和鉴定等；

(3)系列启动子在棘孢小单胞菌中启动强度的测定和强启动子的筛选；

(4)以kasOp*和SRL37启动子分别启动的genR和genS替换分支途径 genK，构建庆大霉素B高效表达菌株；

(5)基因工程改良菌株代谢产物的鉴定；所述的鉴定为采用电喷雾 (HPLC-CAD)和衍生化等分析代谢产物。

本发明中新报道与庆大霉素B合成密切相关内源基因genR和genS的 DNA序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。

以下实施例中所涉及的几种大肠杆菌和放线菌穿梭质粒均为本领域技术人员公知质粒，其中pCRISPR-Cas9质粒由武汉大学瞿旭东课题组提供，此质粒是2015年Sang YupLee课题组报道的适用于多种链霉菌的CRISPR/Cas9质粒(Tong et al.,2015)；pWHU77由武汉大学孙宇辉课题组提供，此质粒由 pIB139以硫链丝菌素和氨苄青霉素抗性替换阿泊拉霉素抗性得到(Guo et al., 2014)；棘孢小单胞菌原始菌株Micromonospora echinosporaHS-1520-016-89 来自海正药业的工业生产菌株，已保藏；酿酒酵母菌株CEN.PK2-1D购买自德国Scientific Research and Development GmbH的EUROSCARF，菌株编号为30000B。

实施例1：内源基因genR和genS的CRISPR/Cas9敲除质粒的构建

Primer 1:5’CATGCCATGGN₂₀GTTTTAGAGCTAGAAATAGC 3’

Primer 2:5’ACGCCTACGTAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCC 3’

Primer 3:5’AAGGCCGCTTTTGCGGGATCTCGTCGAAGGCACTAGAAG

GGCGGGTCACGGCGACCTGC 3’

Primer 4:5’GCGGCTTGGCACAACCACACGAAATGTGGGGAGAAGTC

CCG TCCGTTCCCCGGGCGGTC 3’

Primer 5:5’GCGGCTTGGCACAACCACACGAAATGTGGGGAGAAGTC

CCGT CCGTTCCCCGGGCGGTC 3’

Primer 6:5’CCGTCCGGGACCCGCGCGGTCGATCCCCGCATATAGGGG

TCA TGCGCTGGTCCCCGTCG 3’

Primer 7:5’TCGCCGCCGCTCTCGAAGAAG 3’

Primer 8:5’TCGGCTCGGGCATTCCCACGTTC 3’

棘孢小单孢菌Micromonospora echinospora HS-1520-016-89全基因组测序由武汉生物技术研究院平台使用PacBio RSII三代测序仪完成，使用1个SMRT (single-molecule real-time sequencing)细胞测序，产生的数据使用分层基因组组装方法(Hierarchical Genome Assembly Process，HGAP)组装。使用 GLIMMER 3.0预测蛋白编码序列(Protein-coding sequences，CDS)，使用 BLASTP同源比对预测蛋白功能(E-values<1e-5)。依据COG(orthologous groups)数据库中的生物学功能对每个基因进行注释。使用antiSMASH 3.0软件预测次级代谢产物合成基因簇。在基因组分析的基础上，得到了两个可能与庆大霉素B的合成密切相关的基因，分别命名为genR和genS。两者紧邻排列在庆大霉素合成基因簇下游28.692kb处。

敲除质粒以链霉菌中高效基因编辑质粒pCRISPR-Cas9为载体，使用sgRNAcas9.jar软件(No.2015R11L070897)预测适用的sgRNA 20nt靶向序列，并选择Riskevaluation为Best的一条序列(ccttcgcgatccaatgagca)，代入Primer 1(N₂₀：20nt靶向序列，即ccttcgcgatccaatgagca)设计引物。以pCRISPR-Cas9 为模板，使用引物Primer 1和Primer 2，PCR扩增得到完整的sgRNA，使用 NcoI和SnaBI双酶切sgRNA片段，与同样经NcoI和SnaBI酶切的 pCRISPR-Cas9载体连接，转化大肠杆菌DH10b感受态，得到的转化子进行菌落PCR验证，并提质粒进行酶切及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变，验证正确菌株保存甘油菌，并将其命名为 pCRISPR-Cas9-gRNA1。

以棘孢小单孢菌基因组DNA为模板，使用引物Primer 3和Primer 4扩增 genR和genS的上游同源臂，使用引物Primer 5和Primer 6扩增genR和genS 的下游同源臂，以扩增得到的上下游同源臂为模板，使用引物Primer 3和Primer 6进行OE-PCR连接，得到上下游同源臂连接片段。得到的连接片段与经StuI 消化的pCRISPR-Cas9-gRNA1质粒使用Gibson一步组装方法(2x Hieff Clone MultiS Enzyme Premix，Yeasen，中国)组装，后转化大肠杆菌DH10b感受态，得到的转化子进行菌落PCR验证，并提质粒进行PCR(使用引物Primer 7和Primer 8)、酶切及测序验证，验证正确菌株保存甘油菌，命名为 pCRISPR-Cas9-gRNA1-ΔRS，即得到含有完整gRNA和上下游同源臂的 CRISPR/Cas9敲除质粒。

实施例2：CRISPR/Cas9敲除质粒的接合转移及突变株获得

将构建好的质粒pCRISPR-Cas9-gRNA1-ΔRS转化入E.coli ET12567 (pUZ8002)中，挑取单克隆，于含有50μg/mL卡那霉素、25μg/mL氯霉素和 50μg/mL阿泊拉霉素的LB液体培养基中37℃培养过夜。将过夜培养菌液转接至含有如上抗性的LB液体培养基中培养至OD约0.6～0.8，取4mL菌液离心收集菌体。收集的菌体用等体积LB液体培养基洗涤三次后，用100μL LB 液体培养基重悬，得大肠杆菌悬浮液，备用。

将50mL培养至生长中期的棘孢小单孢菌Micromonospora echinospora HS-1520-016-89菌液离心，收集菌体并使用等体积LB液体培养基洗涤菌体两次，再用8mL LB液体培养基重悬。将悬浮液与上述大肠杆菌悬浮液等体积混合，均匀涂布于含有30mM Mg²⁺的ABB平板，30℃培养16～18h，使用阿泊拉霉素(25μg/mL)和甲氧啶(TMP，40μg/mL)覆盖平板，继续培养7d 左右，出现接合子。

将长出的接合子于含有阿泊拉霉素(50μg/mL)和TMP(50μg/mL)的平板培养基(玉米淀粉3％，酵母提取物0.5％，氯化钠0.2％，磷酸二氢钾0.01％，硝酸钾0.3％，碳酸钙0.6％，琼脂2.0％，pH7.2)上分离单菌落，将长出的单菌落点种于含硫链丝菌素(25μg/mL)的平板培养基上，30℃培养诱导Cas9 表达。长出的单菌落于无抗点种平板42℃进行松弛培养，松弛两代后将单菌落于含阿泊拉霉素抗性和无抗的点种平板分别进行同步点种，筛选丢失阿泊拉抗性的菌株。筛选菌株进行菌落PCR验证后，将正确的重组菌株保存甘油菌并命名为HS-1520-016-89-ΔRS。其中，PCR验证选取了8个重组菌株，并以质粒pCRISPR-Cas9-gRNA1-ΔRS和出发菌株Micromonospora echinospora HS-1520-016-89作为对照。

菌株的构建过程可参见图1A。图1B为菌株的鉴定结果，以原始菌株基因组为模板，采用验证引物对RS-YZ-F/R扩增可得到的PCR片段为2927bp，而重组菌株因为genR和genS被敲除，相应的扩增片段则只有1012bp；通过图1B可见，本发明使用CRISPR/Cas9体系进行重组菌株构建，可有效地缩短重组菌株获得周期，同时所得重组菌株PCR验证的阳性率达到90％以上。后续HS-1520-016-89-ΔRS功能验证等实验采用重组菌株1进行。

实施例3：genR和genS敲除突变株的生物学功能鉴定

从HS-1520-016-89-ΔRS甘油保存管中取100～200μL菌液涂布于分离平板，37℃培养4d后挑取单菌落在点种平板上点种，37℃培养7-10d。

每个单菌落取1/2进25mL装量/250mL摇瓶的种子培养基(玉米淀粉3％，黄豆饼粉1.5％，蛋白胨0.5％，硝酸钾0.03％，碳酸钙0.4％)，于34℃，250rpm 条件下培养36h。取种子培养液，以10％接种量进25mL装量/250mL摇瓶的发酵培养基(玉米淀粉4％，黄豆饼粉3％，蛋白胨0.5％，硝酸钾0.05％，碳酸钙0.6％，硫酸镁0.2％，氯化钴0.0008％)，于34℃，250rpm条件下培养5-7 d。

取第5d的发酵液，用6N浓硫酸调pH至2.0，振荡处理30min后离心取上清，进HPLC-CAD检测系统(Thermo Scientific)鉴定。检测方法如下：色谱柱： LP-C18(welch，250×4.6mm)；流动相：1.5％三氟乙酸水溶液(A相)和95％甲醇(B相)；分离梯度：0～12.5min 100％A相，流速 0.8mL/min；12.5～15.5min 50％A相和50％B相，流速1mL/min；15.5～23min 100％A相，流速1mL/min；电喷雾条件：雾化器温度35度，采样频率60Hz。

原始菌株HS-1520-016-89(WT)和敲除株HS-1520-016-89-ΔRS(ΔRS) 的HPLC-CAD图谱如图4A中所示。结果显示，对棘孢小单胞菌的内源基因 genR和genS进行敲除后，得到的突变株HS-1520-016-89-ΔRS相对于原始菌株而言，在庆大霉素B对应的出峰时间位置上基本没有相应的HPLC吸收峰。同时，以不同浓度的庆大霉素B绘制标准曲线，根据峰面积计算得到原始菌株的庆大霉素B效价为636μg/mL，而敲除株HS-1520-016-89-ΔRS的庆大霉素B效价为0，说明敲除株已经不产生庆大霉素B，这直接表明了genR和genS 两个内源基因对庆大霉素B的合成至关重要。

实施例4：genR和genS敲除菌株的回补验证

步骤(1)，构建了genR和genS回补质粒：

所用引物信息如下：

Primer 9:5’CGCCATATGATGTCATCAGGTCATCACTCGATC 3’

Primer 10:5’CGAGAATTCCTACGCGTCCGTGGGCGATC 3’

选择使用启动子ermE*和genS原有启动子分别作为回补构建genR和 genS的启动子，将其构建于pWHU77穿梭质粒上。使用引物Primer 9和Primer 10从棘孢小单孢菌基因组上扩增genR+genS原有启动子+genS片段，使用NdeI 和EcoRI双酶切所得片段和pWHU77质粒，酶连得到完整回补质粒，进行酶切及测序验证，将验证正确的转化子命名为pYC005。

步骤(2)，位点特异性整合型质粒的接合转移方法及突变株的获得：

将构建好的质粒pYC005转化入E.coli ET12567(pUZ8002)中，挑取单克隆，于含有50μg/mL卡那霉素、25μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃培养过夜，转接过夜培养菌液于含有同样抗性的LB 液体培养基中培养至OD约0.6～0.8，取4mL菌液离心收集菌体。收集的菌体用等体积LB液体培养基洗涤三次后，用100μL LB液体培养基重悬备用，得大肠杆菌悬浮液。

将50mL培养至生长中期的缺失突变株HS-1520-016-89-ΔRS菌液离心，收集菌体并使用等体积LB液体培养基洗涤菌体两次，再用8mL LB液体培养基重悬。将悬浮液与上述大肠杆菌悬浮液等体积混合，均匀涂布于含有30mM Mg²⁺的ABB平板，30℃培养16～18h后，使用硫链丝菌素(30μg/mL)和 TMP(40μg/mL)覆盖平板，继续培养7d左右，出现接合子。

将长出的接合子于含有硫链丝菌素(50μg/mL)和TMP(50μg/mL)的分离平板上分离单菌落；将长出的单菌落点种于含有硫链丝菌素(50μg/mL) 的点种平板。长起来的菌落进行菌落PCR验证，筛选含有genR序列的重组菌株。将筛选符合要求的接合子保存甘油管，命名为HS-1520-016-89-Δ RS-PYC005(简称ΔRS-PYC005)。

步骤3，回补菌株的功能鉴定

菌株摇瓶发酵及产量检测方法同实施例3，HS-1520-016-89-ΔRS-PYC005 菌株种子液中需添加30μg/mL的硫链丝菌素以维持菌株抗性。

实验结果：利用pWHU77位点整合型质粒为载体进行回补质粒构建，并进行回补菌株产量检测，得到突变株，进行发酵培养并检测了庆大霉素B的合成情况，如图4A和4B中所示。结果显示，对genR和genS两个基因进行回补后，菌株恢复了庆大霉素B的合成能力，这进一步说明了genR和genS 与庆大霉素B的合成密切相关。

实施例5：棘孢小单胞菌中启动子强度测定

表1：启动子强度测定中涉及的启动子序列及对应构建质粒

棘孢小单胞菌中启动子强度测定过程如下：

步骤1，突变株获得：

在实验室构建的链霉菌启动子文库中，选择其中的p2-GUS等12个组成型启动子质粒(表1，在pSET152(公知质粒，来源为：Bierman et al.,1992) 中插入不同启动子和gusA报告基因，启动子启动gusA表达)，同时以含有gusA 报告基因不加启动子的pSET152质粒作为对照。将上述质粒通过接合转移方法整合到棘孢小单胞菌Micromonospora echinosporaHS-1520-016-89基因组上，并利用菌液PCR扩增gusA基因来鉴定整合是否成功。将验证正确的菌株保存甘油菌，命名与对应质粒名称一致。

步骤2，突变株培养：

将甘油管菌液接种于含50μg/mL阿泊拉霉素的点种平板上，37℃培养。分离得到的单菌落再接种于10mL含50μg/mL阿泊拉霉素的TSB培养基中，于37℃，220rpm条件下培养66h。之后取3mL菌液转接至100mL无抗LB 液体培养基中，于34℃，220rpm条件下培养42h。

步骤3，GusA活性检测：

取40mL上述培养菌液离心收集菌体，60℃烘干48h，测定细胞干重；另取40mL培养菌液用于GusA活性检测，1,000rpm离心10min收集菌体，使用等体积无菌水洗涤一次，20mLGUS缓冲液1(50mM磷酸盐缓冲液 [pH7.0]，5mM DTT，0.1％Triton X-100)重悬菌体，800bar高压破碎10min。裂解产物使用GUS缓冲液1稀释至45mL，4℃条件下10,000rpm离心10 min，取离心上清液100μL加入100μL GUS缓冲液2(50mM磷酸盐缓冲液[pH7.0]，5mM DTT，0.1％Triton X-100，2mM PNDG)，使用酶标仪检测30min内37℃下415nm波长处的吸光度，计算其吸光度曲线斜率，记为 A415/min。

GusA酶活计算公式为：

(DW：细胞干重)。

实验结果，如图2中所示：

本实验中测定的12个启动子的强度由强到弱依次为： kasOp*>SRL37>gapdhp-KR>SPL39>rpsLp-cf>SPL42>ksaOp-rpsL-CF>rpsLp-TP >SRL39>hrdB>ermE*>2。

实施例6：GenR和GenS表达质粒的构建

表2：GenR和GenS表达质粒的构建中涉及的引物序列信息

注：表中基因组DNA指棘孢小单胞菌Micromonospora echinospora HS-1520-016-89基因组DNA。

选择使用kasOp*和SRL37分别作为genR和genS的启动子，以表2中引物、分别使用对应模板扩增带有60～80bp同源序列的上下游同源臂、启动子、表达目标基因、pOJ260载体(Bierman et al.,1992)以及酵母中复制元件(该元件包括复制子ori、酵母筛选标记URA3，来自于pRS426(来源于ATCC87333，购自Biovector))等片段，醋酸锂转化方法(参考DanielG.Gibson et al.,2008) 将所有片段转化至酵母菌CEN.PK2-1D中，利用酵母自身重组能力将所有片段组装成一个完整的质粒(质粒中基因片段的顺序与图示的质粒图一致，组装时片段末端彼此间有39bp的同源序列来进行同源重组保证构建顺序。)，提取酵母质粒，并转化至DH10b感受态，转化子提取质粒进行酶切及测序验证，将验证正确的转化子保存甘油菌并命名为pYC001。

实施例7：自杀型质粒的接合转移及改良菌株的获得

将构建好的质粒pYC001转化入E.coli ET12567(pUZ8002)中，挑取单克隆，于含有卡那霉素、氯霉素和阿泊拉霉素的LB中37℃培养过夜，同实施例6中方法分别培养和洗涤大肠杆菌和棘孢小单孢菌菌体，混合后菌体均匀涂布于含有30mM Mg²⁺的ABB平板，30℃培养16～18h后，使用阿泊拉霉素 (25μg/mL)和TMP(40μg/mL)覆盖平板，继续培养7d左右，出现接合子。

将长出的接合子于含有阿泊拉霉素(50μg/mL)和TMP(50μg/mL)的平板培养基(成分同实施例2)上分离单菌落，将长出的单菌落涂布于含有阿泊拉霉素(50μg/mL)的平板培养基，待长出菌落进行菌落PCR验证单交换，后将验证正确的单交换菌株进行无抗液体分离培养基传代松弛培养，并稀释涂板，得到的单菌落于阿泊拉霉素抗性和无抗点种平板同时涂布，筛选丢失阿泊拉霉素抗性的菌落，并进行菌落PCR验证，筛选正确的重组菌株保存甘油管并将其命名为HS-1520-016-89-pYC001。菌株构建过程如图3A所示，验证结果如图3B所示，并以出发菌株和质粒pYC001作为对照。重组菌株1、2和3 均为成功克隆菌株，其中重组菌株3被用于后续研究。

实施例8：庆大霉素B基因改良菌株的验证

HS-1520-016-89-pYC001菌株摇瓶发酵及产量检测方法同实施例3。实验结果如图4所示。进一步地，从庆大霉素B发酵产量上看，菌株 HS-1520-016-89-pYC001的产量达到了2792μg/mL，较原始菌株(WT)(636 μg/mL)提高了近4.4倍，远超现有的工业化生产水平，大幅度降低了成本；同时，图5A和B所示，衍生化方法的HPLC图谱也显示分支途径GenK的被替换之后，庆大霉素C组分中的C2b杂质也基本消失。上述结果表明新构建的基因改良菌株HS-1520-016-89-pYC001无论从发酵产量还是杂质方面较原始菌株都有了明显改善，具有很大的工业化应用潜力与价值。

衍生化方法如下：色谱柱：Shim pak CLC-ODS柱(150×6.0mm,5μm)；流动相：庚烷磺酸钠3g+甲醇680ml+水280ml+冰醋酸40ml(A相) 和56％甲醇(B相)；分离梯度：0～15min100％A相，15～23.5min 100％B相， 23.5～26min 100％A相，流速1mL/min；柱温40度，检测波长330nm。

SEQ ID No.1

genR基因序列(858bp)：

atgtcatcaggtcatcactcgatcttcgtcgatccgcaccggtcgccggacggtgcgcgacgactgaccgagg accaactcgaccacgcgctgaacctgctgcgggtcgagggggcagtgatcctgccgggagtcgtgccggcggaact ggtggcgcggctccgcgacacgatgttggcggatctcgcccggcgcgagcagccactgcccatcaacttcgtcaccg gtcacatccagcaggacccgccgccggtgcccgagctgctcttccccgaggtcctgttgaacgagtcggtctaccgg gtgaccaccgcgctgctcggaccggacgccaagaacgcggtctacagcggcaacatcaacctgccgggcagcggg gagcagccggtacacctcgacgaggggcacctctggcccgcgccgaccgagcacccgccgtacgcgctggaggtc gacattccgttgatcgacttcaccgtgcacaacggcaccaccgagtactggctcggcacccaccagctcaacccgga gggctggtacgacgactcgggccgggtcgagacggtggcactggagaagcgccgcgcggtccggccgccccagc agttcgccatccccgccgggtcggcggtcatccgggacgcccggttgtggcaccggggcacggtgaaccactcctc ctcgccccgcccgatggtggccatgacccactactgcgactggttcgaaaccccgccgatcgtcctgccgagcgcgg tgcggccgtggatcgaggcctcgccgtaccggacgagcgcggcgttcaccgacgagccgatcgaccacttgacgtc ggagcatgccttcgcgatccaatga

SEQ ID No.2

genS基因序列(945bp)：

gtggtccgtggactggtcgatgccggacacgacgtggtggtcgcccaccggggcgagaccgtcgccgatctg cccgtcggtgtgtcggtcgcccgggtcgaccggcacctcgacggggcgctggcggagctggtgtcgaccgtacgcc cggatgcggtggtggatctgacctgcgacgacggcgacgacggccggctcaccgtggccgcctgccggggagtcg accggttgctggtcgtctcctccgtcaacgctgccggcggcccgctgccgacgccggtgcacgagcgggtgacacct gctccggtgtccgattacggtcgcgacaagctcggcctggagcaggcggtccgggacagctggacgaccggggact cccgcgcgctcgtggtccggctcggaccggtgtaccggccgggcagcgggctcgacggtcagctcgccgaggaca cgtactggctcgggcaggcgctggccggtgagccggcggtcctggccgacgagggcgagcggtactggaacctgc tgcacgccgaggacgccggacgcgccttcgccgccctgctggccaacccggccgccgagcgggaactggtgctgg tcgcgtcccgacgcccgatccgctggcgtgacctgtaccggaccgtccactccgggctcggcctgtcgacgcggacc gtgtccgccccggcgcagtggctcgtcgaacaactcgacgacgacgagtggctccaggagacgtcactgtgggacc aggtctacgacctgagcctgctggaccggctggccccggactaccaggagcacgcgggcgacaaggagctggtgg cgaccgccgcgtggctggtcgaccagggcgagaccggggacccggagctgatcgcggagatctccggactcggtc gggcgtgggcggcccgcgacggatcgcccacggacgcgtag

SEQ ID No.3

genK基因序列(1917bp)：

atgaacgcgctggtggcagcgccttctgttacggaaggtaatcaagtgaaggttttcctcgtcaagccgccgatccgcggatgcatggtggaaatcggacgtcacgttccgatcgggctcgcctacgtctcgtcagcgctgc gcgccgcggggcacgagacggagattttcgactccctcgcctacaccgaggacaaccatgtcgtcccggac gcggagctgaccacgatcgagcgggccaagctggagcgccacccgcgctggcgacacatcatgcactggg gtgcccggacggagcgcatcgaggcggccctcgctgccagcggagcggacgtcgtcggcatctcctgcatg ttcaccccctactacgagagcgcctacgagctggcccggatggccaagcgggtcctgccgaacgcgaaggt gatccttggcggtcagcacggcaccgtcgccttcccgcacgtgctcgaggtgcccgagatcgacgcggtgat gctcggtgaggccgaggtgaccaccgtcgcgctgttggacgcgttcgccaccgggcggcccctgaccgagc tgctcggggtggccttccgctgtggcgaggggctctgcgactgccccacgcccggcacgccgcacatccgtc cccgcgcgcccttcgtcgccgacctggactccctggcgccgccggccgccgaccagctcgacttcgaccgc tacggcaacgcagtgaccctgatcaccagccggggatgtccgttctcctgctcgttctgcaccgtgcacgcca cggtcggcaagcagttccgggcccgtgacccgcagcgcgtggtcgacgagatcgagcactacgtcaacgtg cacggggtgcgccgcttcctggtggaggacgacaactccaccttcgacatcgagcgggtgcacgcgatctgt caggagatcgtccgacgtcagctcgacgtccggctcagcctgccgaacggcatgaccgtcgtgaagctgacc gaggacctggtggagagcatggtctcggccggcttcgacgatctcttcctcggcctggagaccaccgacgcg gcccggctgcgcaagatgcgcaaggggttcacctcgctggacaaggtctccgccggggtcgccctgttcga gaagttcgggctgacggcgagcgccgcgatcatcgtcgggctgcccgaccagagcctcgacgcgatcgtgc aggacgcggtgaacctggtgctggccggcgtcgagttctggaccaacccgttctacccgatctacggctcccc ggactaccagacctgtctgagccggggcatcgtcgacccgctgaccgaccccgccctgttcgaccagttcaa cttcgccttcgccaacggcgtcctggcggcggacgagctctacacggcctgggtgggcaccctcgccatggc gctgtggccgaagtacgtccttgagggggcggagcgccgcgagcaggggccggtctccgcggcggaggc cgccgcacgtctggtcgagcacagcatggcgcagctcgacccggagagcccggaggaactgccggccaccgtgcgggcgatccgggagaccgccgacgggctgctggcactcggccacccgctgggctgcgtctgcgtg atgcagcacgtcgcggacgcggacaagggcgccggcgccgaccagttctgccgcttcgccggtgacatgat cgctgcggccatcgcgctgtacagcggtcagccgcaggtcagcgcgcaggtcggagcgcagacggccgg agatgccgaagggtgctcgttcatggtccggcccaccggtgacgagcggatcggccggatccagcgccgct tcgtcgaattgctcgacgagaaccgtcgggatgccgaactggtcaccgccgaagcggttcccctctga。

序列表

<110> 浙江海正药业股份有限公司

<120> 庆大霉素B生产菌及其制备方法和应用

<130> DBP1F182642ZX

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 858

<212> DNA

<213> 棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)

<400> 1

atgtcatcag gtcatcactc gatcttcgtc gatccgcacc ggtcgccgga cggtgcgcga 60

cgactgaccg aggaccaact cgaccacgcg ctgaacctgc tgcgggtcga gggggcagtg 120

atcctgccgg gagtcgtgcc ggcggaactg gtggcgcggc tccgcgacac gatgttggcg 180

gatctcgccc ggcgcgagca gccactgccc atcaacttcg tcaccggtca catccagcag 240

gacccgccgc cggtgcccga gctgctcttc cccgaggtcc tgttgaacga gtcggtctac 300

cgggtgacca ccgcgctgct cggaccggac gccaagaacg cggtctacag cggcaacatc 360

aacctgccgg gcagcgggga gcagccggta cacctcgacg aggggcacct ctggcccgcg 420

ccgaccgagc acccgccgta cgcgctggag gtcgacattc cgttgatcga cttcaccgtg 480

cacaacggca ccaccgagta ctggctcggc acccaccagc tcaacccgga gggctggtac 540

gacgactcgg gccgggtcga gacggtggca ctggagaagc gccgcgcggt ccggccgccc 600

cagcagttcg ccatccccgc cgggtcggcg gtcatccggg acgcccggtt gtggcaccgg 660

ggcacggtga accactcctc ctcgccccgc ccgatggtgg ccatgaccca ctactgcgac 720

tggttcgaaa ccccgccgat cgtcctgccg agcgcggtgc ggccgtggat cgaggcctcg 780

ccgtaccgga cgagcgcggc gttcaccgac gagccgatcg accacttgac gtcggagcat 840

gccttcgcga tccaatga 858

<210> 2

<211> 945

<212> DNA

<213> 棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)

<400> 2

gtggtccgtg gactggtcga tgccggacac gacgtggtgg tcgcccaccg gggcgagacc 60

gtcgccgatc tgcccgtcgg tgtgtcggtc gcccgggtcg accggcacct cgacggggcg 120

ctggcggagc tggtgtcgac cgtacgcccg gatgcggtgg tggatctgac ctgcgacgac 180

ggcgacgacg gccggctcac cgtggccgcc tgccggggag tcgaccggtt gctggtcgtc 240

tcctccgtca acgctgccgg cggcccgctg ccgacgccgg tgcacgagcg ggtgacacct 300

gctccggtgt ccgattacgg tcgcgacaag ctcggcctgg agcaggcggt ccgggacagc 360

tggacgaccg gggactcccg cgcgctcgtg gtccggctcg gaccggtgta ccggccgggc 420

agcgggctcg acggtcagct cgccgaggac acgtactggc tcgggcaggc gctggccggt 480

gagccggcgg tcctggccga cgagggcgag cggtactgga acctgctgca cgccgaggac 540

gccggacgcg ccttcgccgc cctgctggcc aacccggccg ccgagcggga actggtgctg 600

gtcgcgtccc gacgcccgat ccgctggcgt gacctgtacc ggaccgtcca ctccgggctc 660

ggcctgtcga cgcggaccgt gtccgccccg gcgcagtggc tcgtcgaaca actcgacgac 720

gacgagtggc tccaggagac gtcactgtgg gaccaggtct acgacctgag cctgctggac 780

cggctggccc cggactacca ggagcacgcg ggcgacaagg agctggtggc gaccgccgcg 840

tggctggtcg accagggcga gaccggggac ccggagctga tcgcggagat ctccggactc 900

ggtcgggcgt gggcggcccg cgacggatcg cccacggacg cgtag 945

<210> 3

<211> 1917

<212> DNA

<213> 棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)

<400> 3

atgaacgcgc tggtggcagc gccttctgtt acggaaggta atcaagtgaa ggttttcctc 60

gtcaagccgc cgatccgcgg atgcatggtg gaaatcggac gtcacgttcc gatcgggctc 120

gcctacgtct cgtcagcgct gcgcgccgcg gggcacgaga cggagatttt cgactccctc 180

gcctacaccg aggacaacca tgtcgtcccg gacgcggagc tgaccacgat cgagcgggcc 240

aagctggagc gccacccgcg ctggcgacac atcatgcact ggggtgcccg gacggagcgc 300

atcgaggcgg ccctcgctgc cagcggagcg gacgtcgtcg gcatctcctg catgttcacc 360

ccctactacg agagcgccta cgagctggcc cggatggcca agcgggtcct gccgaacgcg 420

aaggtgatcc ttggcggtca gcacggcacc gtcgccttcc cgcacgtgct cgaggtgccc 480

gagatcgacg cggtgatgct cggtgaggcc gaggtgacca ccgtcgcgct gttggacgcg 540

ttcgccaccg ggcggcccct gaccgagctg ctcggggtgg ccttccgctg tggcgagggg 600

ctctgcgact gccccacgcc cggcacgccg cacatccgtc cccgcgcgcc cttcgtcgcc 660

gacctggact ccctggcgcc gccggccgcc gaccagctcg acttcgaccg ctacggcaac 720

gcagtgaccc tgatcaccag ccggggatgt ccgttctcct gctcgttctg caccgtgcac 780

gccacggtcg gcaagcagtt ccgggcccgt gacccgcagc gcgtggtcga cgagatcgag 840

cactacgtca acgtgcacgg ggtgcgccgc ttcctggtgg aggacgacaa ctccaccttc 900

gacatcgagc gggtgcacgc gatctgtcag gagatcgtcc gacgtcagct cgacgtccgg 960

ctcagcctgc cgaacggcat gaccgtcgtg aagctgaccg aggacctggt ggagagcatg 1020

gtctcggccg gcttcgacga tctcttcctc ggcctggaga ccaccgacgc ggcccggctg 1080

cgcaagatgc gcaaggggtt cacctcgctg gacaaggtct ccgccggggt cgccctgttc 1140

gagaagttcg ggctgacggc gagcgccgcg atcatcgtcg ggctgcccga ccagagcctc 1200

gacgcgatcg tgcaggacgc ggtgaacctg gtgctggccg gcgtcgagtt ctggaccaac 1260

ccgttctacc cgatctacgg ctccccggac taccagacct gtctgagccg gggcatcgtc 1320

gacccgctga ccgaccccgc cctgttcgac cagttcaact tcgccttcgc caacggcgtc 1380

ctggcggcgg acgagctcta cacggcctgg gtgggcaccc tcgccatggc gctgtggccg 1440

aagtacgtcc ttgagggggc ggagcgccgc gagcaggggc cggtctccgc ggcggaggcc 1500

gccgcacgtc tggtcgagca cagcatggcg cagctcgacc cggagagccc ggaggaactg 1560

ccggccaccg tgcgggcgat ccgggagacc gccgacgggc tgctggcact cggccacccg 1620

ctgggctgcg tctgcgtgat gcagcacgtc gcggacgcgg acaagggcgc cggcgccgac 1680

cagttctgcc gcttcgccgg tgacatgatc gctgcggcca tcgcgctgta cagcggtcag 1740

ccgcaggtca gcgcgcaggt cggagcgcag acggccggag atgccgaagg gtgctcgttc 1800

atggtccggc ccaccggtga cgagcggatc ggccggatcc agcgccgctt cgtcgaattg 1860

ctcgacgaga accgtcggga tgccgaactg gtcaccgccg aagcggttcc cctctga 1917

Claims (10)

1.庆大霉素B生产菌的构建方法，所述方法以棘孢小单孢菌Micromonosporaechinospora HS-1520-016-89为原始菌，以genR和genS基因序列置换了原基因组上的genK基因序列，并以强启动子启动genR和genS基因，其中，所述genR基因的DNA序列如SEQ IDNO:1所示，所述genS基因的DNA序列如SEQ ID NO:2所示，所述genK基因的DNA序列如SEQ IDNO:3所示。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其中，所述强启动子选自kasOp*、SRL37、gapdhp-KR、SPL39、rpsLp-cf、SPL42。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其中，genR基因由启动子kasOp*启动，genS基因由启动子SRL37启动。

4.根据权利要求3所述的构建方法，包括：(1)构建基因工程改造质粒，所述质粒包含genK上游同源臂、kasOp*启动子、genR基因、SRL37启动子、genS基因和genK下游同源臂；(2)将所述质粒转化大肠杆菌；(3)混合培养转化的大肠杆菌和棘孢小单孢菌Micromonosporaechinospora HS-1520-016-89，得到接合转移的庆大霉素B生产菌。

5.庆大霉素B生产菌，其为棘孢小单孢菌Micromonospora echinospora HS-1520-016-89基因组中，genK基因被置换为genR和genS，且genR和genS由强启动子启动。

6.根据权利要求5所述的庆大霉素B生产菌，由权利要求1～4任一项所述的方法构建。

7.权利要求5或6所述的庆大霉素B生产菌在生产庆大霉素B中的应用。

8.权利要求5或6所述的庆大霉素B生产菌在生产以庆大霉素B为中间体的物质中的应用。

9.一种生产庆大霉素B的方法，包括使用权利要求5或6所述的庆大霉素B生产菌。

10.与庆大霉素B的合成相关的基因，所述基因为genR，其DNA序列如SEQ ID NO:1所示，和genS，其DNA序列如SEQ ID NO:2所示。