CN106554932A - 一种产生庆大霉素b的基因工程菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种庆大霉素B生产菌的构建方法，通过对庆大霉素产生菌进行基因工程改造，表达外源基因kanJ和kanK，催化JI-20A形成庆大霉素B，能够获得主组分为庆大霉素B的新菌株。本发明公开的庆大霉素B产生菌株的构建方法优点在于：菌株主要产生庆大霉素B，杂质产生少，便于提高庆大霉素B的纯度；庆大霉素B产量高，能够降低生产成本；与传统的菌种筛选相比，基因工程构建菌种目标明确、筛选工作量小，菌种遗传稳定性高，利于工业化生产。本发明是国内外首次公布利用基因工程方法获得庆大霉素B产生菌，利用本发明公布的方法获得的庆大霉素B在生产抗生素异帕米星领域具有极大的应用前景。

Description

一种产生庆大霉素B的基因工程菌及其构建方法

技术领域：

本发明属于生物技术和基因工程领域，涉及一种产生庆大霉素B的基因工程菌及其构建方法，具体涉及一种以基因工程构建产庆大霉素B菌株的方法。

背景技术：

异帕米星具有杀菌活性强、耐药性低、毒副作用小及良好的抗生素后效应等优势，在国内外广泛应用于各类细菌感染治疗。异帕米星是以庆大霉素B为原料，通过化学反应在庆大霉素N-1位引入异丝氨酸侧链而获得的半合成抗生素。

庆大霉素B是通过绛红小单孢菌(Micromonospora purpurea，又称绛红小单孢菌)发酵生产的，绛红小单孢菌和棘孢小单孢菌属于同一菌种，本专利称为绛红小单孢菌。然而庆大霉素B是在庆大霉素产生菌发酵过程中产生的中间代谢产物，野生型菌种庆大霉素B产量很低，而主要产生庆大霉素C1、C2、C2a、C1a等C族产物，这些结构类似的杂质种类多、产量高。目前国内外生产庆大霉素B的菌种是通过菌种突变筛选获得的，然而由于野生型菌种产生一系列的化学结构和生物活性均相似的产物，而无论是自发突变还是人工诱变，变异完全随机，缺乏快速的筛选模型和筛选方法，以及菌种本身的遗传特性限制，因此筛选到庆大霉素B产量高、而杂质产生少的菌株极为困难。由于庆大霉素B高产、而杂质组分不产生或产量低的菌种通过传统的筛选方法难以获得，严重制约了庆大霉素B以及异帕米星的生产，造成异帕米星价格居高不下。

发明内容：

本发明利用基因工程的方法能够表达庆大霉素B合成必须的目的基因kanJ和kanK，使小单孢菌代谢流向发生改变，快速获得主要产物为庆大霉素B的工程菌。这种庆大霉素B产生菌遗传稳定，庆大霉素B产量高、杂质产生少，适于工业化生产庆大霉素B。

本发明的目的是提供一种产生庆大霉素B的基因工程菌。

本发明的另一目的是提供产生庆大霉素B的基因工程菌的构建方法。

本发明的进一步目的是产生庆大霉素B的基因工程菌的应用。

本发明的产生庆大霉素B的基因工程菌的构建方法，主要步骤包括：

(1)kanJ和kanK表达载体的构建

本发明首先构建kanJ和kanK表达载体，载体可以是能够位点特异性整合入JI-20A产生菌基因组中的质粒，如pSET152；或者携带与绛红小单孢菌基因组有同源DNA片段、能够通过同源重组的方法插入基因组上的载体，如携带绛红小单孢菌同源DNA片段的pKC1139；也可以是含有小单孢菌复制子、能够在绛红小单孢菌中游离存在的载体，如pWHM3。

本发明将kanJ和kanK置于能在小单孢菌中启动转录的启动子下游，构建重组表达载体。启动子可以使用kanJ和kanK基因自身的启动子，也可以使用能够在放线菌中启动转录的其他基因的启动子，根据启动子序列和来源不同，可用的启动子有多种，如红霉素抗性基因启动子(PermE)，P_SF14等。

本发明所述的重组表达载体转化绛红小单孢菌。转化方法为本领域技术人员已知的技术方法，如接合转移、原生质体转化、电转化。

(2)表达菌株的筛选

转化子通过载体上携带的遗传标记进行筛选。对转化子进行基因水平验证，如PCR验证、DNA序列测定。从而筛选、验证转化子的正确性。

(3)kanJ和kanK基因工程菌株发酵培养

筛选获得的正确基因工程菌株发酵培养，培养条件同正常的绛红小单孢菌发酵条件相同，可以利用本领域技术人员已知的技术方法对发酵工艺进行优化以进一步提高庆大霉素B产量。

(4)发酵产物的分离与分析

发酵产物分离为发酵液经酸碱处理后离子交换树脂进行分离，也可通过大孔吸附树脂、硅胶等本领域技术人员已知的技术方法分离纯化。产物的分析鉴定采用生物显影、高效液相-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)和质谱(MS)核磁共振波谱(NMR)等方法分析产物。

本发明利用基因工程的方法能够表达催化庆大霉素B合成的外源基因，使绛红小单孢菌代谢流向发生改变，快速获得主要产物为庆大霉素B的工程菌。这种庆大霉素B产生菌遗传稳定，庆大霉素B产量高、杂质产生少，适于工业化生产庆大霉素B。

JI-20A是庆大霉素生物合成的中间代谢产物，结构与庆大霉素B极为相似，化学结构上唯一差别是JI-20A C-2’位为氨基，而庆大霉素B C-2’位为羟基。genP和genK均参与庆大霉素的生物合成，分别催化庆大霉素3’磷酸化和6’甲基化， 将这两个基因同时基因阻断，将获得JI-20A产生菌。利用本领域技术人员已知的技术方法，阻断基因genP和genK，构建JI-20A高产菌株。

由于庆大霉素C族以及JI-20A、JI-20B C-2’位均为氨基，而庆大霉素B C-2’位为羟基，已有实验证明KanJ和KanK能够催化卡那霉素C-2’位氨基脱氨、还原，最后形成羟基。因此使用JI-20A高产菌株作为庆大霉素B基因工程菌的出发菌株。本发明利用本领域技术人员已知的技术方法，将KanJ和KanK在JI-20A产生菌中表达，以催化JI-20A形成庆大霉素B。

基因在生物体内表达首先需要转录成mRNA，转录需要启动子，启动子可以使用基因自身的启动子，也可以使用能够在放线菌中启动转录的其他基因的启动子。

外源基因进入受体菌后，可以利用能在受体菌中独立复制的质粒而游离存在，也可以整合入受体菌基因组DNA而存在。而外源基因整合进受体菌基因组DNA可以通过载体上携带的同源DNA发生同源重组而整合进基因组DNA，也可以通过载体上携带的整合酶在基因组的特定的整合位点进行整合。

本发明使用的绛红小单孢菌(Micromonospora purpurea)。该菌株已于2015年07月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号：CGMCC No.11158。

附图说明：

图1：位点特异性整合型kanJK表达菌株KANJK菌株PCR验证图

M.λ-Hind III；2.KANJK1菌株PCR产物。

图2：位点特异性整合型kanJK表达菌株KANJK菌株发酵产物高效液相色谱图。

A：庆大霉素B对照品；B：出发菌株M.echinosporaΔKΔP发酵产物；C：基因工程菌发酵产物。

图3：位点特异性整合型kanJK表达菌株KANJK菌株发酵产物质谱图。

图4：位点特异性整合型kanJK表达菌株KANJK菌株发酵产物¹H核磁图。

图5：位点特异性整合型kanJK表达菌株KANJK菌株发酵产物¹³C核磁图。

图6：pKC1139JKP质粒及基因替换示意图。

图7：:基因替换型kanJK表达菌株EJK菌株发酵产物高效液相色谱图。

具体实施方案：

方案1：位点特异性整合型kanJ、kanK表达菌株的构建及产物分析

实施例1：kanJ和kanK表达质粒的构建

Primer 1：5'TTTGGATCCAGCGATGGCCCTTGCCGCTCC 3'

Primer 2：5'GCGAAGCTTCATCGGCCGAAATCACACCAG 3'

使用引物Primer 1和Primer 2，以卡那链霉菌总DNA为模板PCR克隆扩增出kanJ、kanK基因片段，片段连接pMD-18T载体，测序验证，发现KanJ有三个氨基酸突变：T20P，V257L，T277S；KanK有两个氨基酸突变：A49G，F245S。验证正确重组载体经BamHI和HindIII双酶切与经同样酶切的含启动子P_ermE*的pSPU241连接，转化大肠杆菌Top10感受态，筛选阳性克隆，命名为pJK241。质粒pJK241经BglⅡ酶切后，回收P_ermE*+kanJ、kanK片段，连入经BglⅡ酶切后去磷酸化的pEAP1(由pSET152改造而来，使用氨苄青霉素抗性替换安普霉素抗性，同时引入红霉素抗性)上，转化大肠杆菌Top10感受态，筛选阳性克隆，获得重组质粒pKANJK1。

实施例2：位点特异性整合型表达质粒的接合转移

表达质粒pKANJK1转化入E.coli ET12567(pUZ8002)中，筛选氨苄青霉素、氯霉素和卡那霉素的三抗菌株，从而获得用于接合转移实验并且实现基因表达的供体菌E.coli ET12567(pUZ8002，pKANJK1)。

供体菌经一、二级培养并且进行洗涤后与经过50℃热激活以及37℃预培养的M.purpurea△K△P单孢子悬液混合，均匀涂布于MS平板，28℃培养20～24h后用红霉素(20μg/ml)和PPA(50μg/ml)水溶液覆盖，28℃继续培养(具体方法见实验方法部分)。7d后，E.coli ET12567(pUZ8002，pKANJK1)与M.purpurea△K△P共同培养的平板上，有阳性克隆长出。

实施例3：kanJ和kanK表达菌株的获得

挑取转化子在含有红霉素(100μg/mL)的斜面培养基上37℃培养7d，挖块接种进行液体培养，提取其总DNA为模板，经引物kanJK-P1和kanJK-P2PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳验证，如图1所示，扩增出大小约为2kb的特异性条带，证明kanJ和kanK已经转入绛红小单孢菌中。为进一步验证PCR扩增产物为kanJ 和kanK，PCR产物凝胶回收后进行序列测定，与质粒上kanJ和kanK序列一致，证明获得了kanJ和kanK表达菌株，命名为KANJK1。

实施例4：kanJK基因表达菌株KANJK1发酵培养

取菌种划线接种于固体培养基斜面上，37℃培养7d。

固体培养基(％)：用于绛红小单孢菌的斜面孢子培养

取新鲜的kanJK基因表达菌株斜面，用接种铲铲取子斜面菌苔1cm×2cm接种于30mL种子培养基中，34℃培养36h，取3mL转种于30mL发酵培养基中，34℃培养120h。

种子培养基(％)：用于培养绛红小单孢菌种子培养

发酵培养基(％)：用于绛红小单孢菌发酵培养

实施例5：表达株发酵产物的分析

转化菌株孢子生长丰满后，经过36h的种子培养及120h的发酵培养后，收集发酵液，发酵液经酸碱预处理后收集上清液，上清液经弱酸性阳离子交换树脂D152静态吸附后，再使用2mol/L氨水洗脱，进行初步提取分离产物。提取的产物进行活性测定和生物显影正常后，用HPLC-ELSD分析产物组成，发酵产物液相结果如图2所示。

M.purpurea△K△P产物为JI-20A，液相保留时间为17min，而在导入质粒pKANJK1利用红霉素启动子表达kanJ、kanK基因后，产物出现了变化，在保留时间为12.5min出现新的物质，并且和庆大霉素B对照品保留时间一致，初步确定表达菌株产物为庆大霉素B。

实施例6：发酵产物的结构鉴定

为确定kanJK表达菌株产物为庆大霉素B，对相应产物分离纯化后进行质谱鉴定。根据质谱结果(图3)，正离子模式下分子离子峰为483.3，即其分子量为482，同时根据文献已报道的庆大霉素相关小组分分析，存在该分子量的物质可能是庆大霉素B。

为进一步确定产物结构，对其进行核磁分析(图4)。如表1所示，氢谱结果与文献一致，且在3.21ppm处存在6’-CH₂-NH₂的特征氢峰。表明产物为庆大霉素B。

表1 KanJK表达菌株中庆大霉素B的¹H核磁结果

同时对表达产物进行了13C核磁分析(图5)，如表2所示，产物与文献报道的庆大霉素B化学位移值有很好的相似性。证明产物为庆大霉素B。

表2 KanJK表达菌株中庆大霉素B的¹³C核磁结果

最终根据液相、质谱和核磁分析，证明利用卡那霉素生物合成基因kanJK与庆大霉素生物合成途径进行组合生物学方法，构建出产庆大霉素B的绛红小单孢菌株，产量为83μg/ml，比野生型菌株提高了9.7倍。同时证明KanJ和KanK中某些氨基酸位点发生突变后，KanJ和KanK仍然能够催化JI-20A形成庆大霉素B。

方案2：基因替换型kanJ、kanK表达菌株的构建及产物分析

实施例1：基因替换质粒的构建：

根据GenBank提供的序列信息，分别设计扩增genP基因上下游同源臂、红霉素抗性基因启动子和kanJK的引物。

Primer 3：5'-GCTCTAGATGCGCCGTCTTGTAGATCTCC-3'；

Primer 4：5'–TCCCCCGGGCGGCGACCGACGCCGG-3'；

Primer 5：5'-TCCCCCGGGTCCAGTCACACCAGCCCTGGCGCGGTG-3'；

Primer 6：5'-CCGGTTGGTAGGATCCAGCG ATGGCCCTTGCCGCTCCGCCC-3'；

Primer 7：5'-GGGCGGAGCGGCAAGGGCCATCGCTGGATCCTACCAACCGG-3’；

Primer 8：5’-GAACGACAGGGCCGGTGAAGGACGTCCATGCGAGTGTCCG-3’；

Primer 9：5’-CGGACACTCGCATGGACGTCCTTCACCGGCCCTGTCGTTC-3’；

Primer 10：5’-GCTCTAGAGCTGGCACGAGTGGCAGTTGGCG-3’；

在构建质粒替换基因时，使用引物Primer 3和引物Primer 4将基因替换的上游同源臂PCR扩增。使用Primer 9和Primer 10扩增下游同源臂。使用Primer5、Primer 6扩增kanJ和kanK。为了防止将kanJK替换上后不能正确表达或者表达强度不够，在其上游引入红霉素启动子(PermE*)，使用Primer7、Primer8扩增PermE*。使用融合PCR将PermE*、kanJK和下游同源臂三个片段融合。最后将两个片段经 Sma Ⅰ和Xba Ⅰ酶切，与经Xba Ⅰ酶切的质粒pKC1139连接，得到质粒pKC1139JKP。

实施例2：kanJ和kanK基因表达菌株的获得

将构建好的质粒转化至大肠杆菌ET12567,挑取阳性转化子。将大肠杆菌ET12567(pUZ8002，供体质粒)单菌落，接种于3mL LB培养基(加入作用浓度为25μg/mL卡那霉素和氯霉素以及50μg/mL供体质粒对应的抗生素)中，37℃培养过夜，按0.2％的比例转种到20mL新鲜的LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.4～0.6，离心沉淀菌体，用新鲜的LB培养基洗涤两次，最后将菌体悬浮于约5mL培养基中，镜检计数约为10⁸数量级。JI-20A产生菌单孢子悬液，用2×YT培养基洗涤2次，悬浮在一定体积2×YT中使单孢子浓度为10⁸，50℃热激活10min，37℃水浴预培养2～3h，冷却至室温。将处理好的供体菌0.5mL与JI-20A产生菌单孢子悬液0.5mL于eppendorf管中离心沉淀，用少量的2×YT悬浮后涂布在MS培养基上。28℃培养20～24h，每皿用1mL含安普霉素(培养基中终浓度50μg/mL)和吡哌酸(培养基中终浓度50μg/mL)的水溶液覆盖。28℃继续培养7d，平板上长出链霉菌菌落，接种于固体斜面培养基平板(Am 50μg/mL)上。

对长出的转化子进行单交换验证，得出单交换验证菌株后，再进行无药传代培养。分离单菌落后同时点种在含有安普霉素和不含安普霉素的固体平板上，挑选安普霉素敏感菌株，进行双交换验证，挑出双交换菌株，即成功替换菌株，命名为EJK，具体见图6。

实施例3：kanJK基因表达菌株发酵培养

取菌种划线接种于固体培养基斜面上，37℃培养7d。

固体培养基(％)：用于绛红小单孢菌的斜面孢子培养

取新鲜的kanJK基因表达菌株斜面，用接种铲铲取子斜面菌苔1cm×2cm接种于30mL种子培养基中，34℃培养36h，取3mL转种于30mL发酵培养基中，34℃培养120h。

种子培养基(％)：用于培养绛红小单孢菌种子培养

发酵培养基(％)：用于绛红小单孢菌发酵培养

实施例4：发酵产物分离

将发酵液用浓硫酸酸化，调至pH 2.0，搅拌30min，使结合在菌丝上的抗生素释放出来，然后10,000r/min，离心10min，上清液用2mol/L的氢氧化钠溶液调至pH 6.8，10,000r/min，离心10min，收集上清液。

上清液中加入D152大孔离子交换树脂(100ml发酵液加10ml树脂)，37℃，振荡3h，弃去上清。将树脂用蒸馏水洗涤两遍，加入2mol/L氨水(100ml发酵液加5ml氨水)，37℃，振荡2.5h，真空干燥除去氨。

实施例5：发酵产物高效液相(HPLC-ELSD)分析

液相分析，色谱柱为ODS C₁₈柱(Diamonsil)，流动相为0.2mol/L三氟乙酸，流速为0.6mL/min，柱温28℃。如附图7所示，M.echinosporaΔKΔP JK菌株发酵产物与庆大霉素B对照品对比，发现保留时间一致，初步确定该未知物质为庆大霉素B。

通过高效液相(HPLC-ELSD)对庆大霉素进行定量，kanJK表达菌株M.echinosporaΔKΔP JK菌株产物中JI-20A产量降低，而庆大霉素B产量达到了大幅提高，出发菌株中庆大霉素B低于检测限，而kanJK表达菌株中庆大霉素B产量达到780μg/mL，比原始菌株庆大霉素B产量提高了92倍。

SEQUENCE LISTING

<110> 沈阳药科大学

<120> 一种产生庆大霉素B的基因工程菌及其构建方法

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 285

<212> PRT

<213> 绛红小单孢菌（Micromonospora purpurea）

<400> 1

Met Ala Leu Ala Ala Pro Pro Gly Glu Leu Thr Leu Ala Leu Thr Pro

1 5 10 15

Asp Asp Lys Thr Leu Asp Pro Ala Ser Leu Asp Arg Ala Leu Ala Ile

20 25 30

Leu Ala Glu His Gly Ile Leu Val Leu Thr Gly Met Leu Arg Thr Arg

35 40 45

Leu Thr Asp Gln Leu Arg Thr Ala Met Leu Asp Asp Leu Pro Glu Val

50 55 60

Leu Arg Gln Gln Asp Val Pro Thr Asn Phe Val Pro Gly His Val Gln

65 70 75 80

Gln Asp Pro Pro Val Arg Glu Ser Leu Leu Phe Pro Asp Val Leu Leu

85 90 95

Asn Pro Val Val Tyr Gln Ile Thr His Ala Val Leu Gly Ala Asp Ala

100 105 110

Arg Asn Ala Val Tyr Ser Gly Asn Met Asn Leu Pro Gly Ser His Glu

115 120 125

Gln Pro Val His Leu Asp Glu Pro His Leu Trp Pro Gly Ile Ser His

130 135 140

Pro Pro Tyr Cys Leu Cys Val Asp Val Pro Leu Ile Asp Phe Thr Leu

145 150 155 160

Glu Asn Gly Ser Thr Glu Tyr Trp Pro Gly Ser His Val Leu Asn Pro

165 170 175

Asp Glu Cys Tyr Asp Glu Arg Gly Cys Val Leu Pro Ala Glu Leu Glu

180 185 190

Arg Arg Arg Ala Val Ala Pro Pro Val Arg Phe Pro Ile Pro Val Gly

195 200 205

Ser Val Val Ile Arg Asp Gly Arg Leu Trp His Arg Gly Val Pro Asn

210 215 220

Leu Ser Ala Ala Pro Arg Pro Leu Leu Ala Met Thr His Tyr Thr Glu

225 230 235 240

Trp Phe Asp Met Pro Pro Ile Gln Leu Pro Asp Thr Val Lys Ser Trp

245 250 255

Val Asp Gly Ser Asp Arg His Thr His Ala His Phe Val Ala Gly Asp

260 265 270

Val Asp His Leu Thr Gly Asp His Pro Phe Ala Val Arg

275 280 285

<210> 2

<211> 316

<212> PRT

<213> 绛红小单孢菌（Micromonospora purpurea）

<400> 2

Met Gly Val Val Arg Ala Leu Asn Ala Ala Arg His His Val Val Val

1 5 10 15

Ala Ser Arg Gly Tyr Ser Pro Ala Leu Leu Pro Glu Gly Val Arg Ala

20 25 30

Val Arg Leu Glu Arg Thr Glu Pro Asp Ala Tyr Thr Arg Leu Val Ala

35 40 45

Ala Glu Lys Pro Asp Ala Val Ile Asp Leu Thr Cys His Asp Ala Ala

50 55 60

Asp Ala Ala Val Thr Leu Arg Ala Cys Ala Gly Val Asp Arg Val Val

65 70 75 80

Val Val Ser Ser Val Thr Ala Ala Gly Pro Ala Thr Thr Thr Pro Val

85 90 95

Thr Glu Ala Thr Ala Ala Pro Pro Leu Ser Glu Tyr Gly Ile Asp Lys

100 105 110

Leu Ala Val Glu Glu Thr Val Arg Ala Ala Trp Ala Asp Gly Thr Ser

115 120 125

Gln Ala Leu Leu Val Arg Leu Gly Ala Val Tyr Arg Leu Gly Ala Asp

130 135 140

Leu Asp Gly Gln Leu Ala Glu Asp Gly Cys Trp Leu Ala His Ala Ala

145 150 155 160

Ala Gly Ala Pro Ala Val Leu Ala Asp Asp Gly Ala Ala Arg Trp Asn

165 170 175

Leu Leu His Ala Asp Asp Ala Gly Ala Ala Leu Ala Glu Leu Leu Ala

180 185 190

Asn Asp Arg Ala Arg Gly Val Leu Val His Leu Ala Ser Arg His Pro

195 200 205

Leu Pro Trp Arg Glu Leu Tyr Glu Arg Val His His Ala Leu Gly Arg

210 215 220

Pro Phe Asn Pro Val Ser Val Pro Ala Glu Trp Ala Ala Glu Gln Leu

225 230 235 240

Glu Asp Ala Glu Phe Leu Ala Glu Thr Ser Arg Trp Asp Gln Val Phe

245 250 255

Asp Leu Gly Leu Leu Asp Arg Leu Ala Pro Ser Tyr Gln Glu Arg Gly

260 265 270

Gly Pro Ser Arg Val Thr Glu Val Ala Leu Trp Leu Ile Arg Gln Gly

275 280 285

Arg Val Gly Asp Ala Glu Leu Gly Ala Glu Ile Gln Glu Leu Pro Ala

290 295 300

Arg Leu Ala Ala Val Arg Thr Ala Pro Gly Leu Val

305 310 315

Claims (13)

1.一种产生庆大霉素B的菌，其特征是由庆大霉素产生菌中表达卡那霉素生物合成酶KanJ和KanK获得。

2.权利要求书1所述表达酶KanJ为具有与本专利所述KanJ（SEQ NO：1）序列相似性大于90%的酶。

3.权利要求书1所述表达酶KanJ为具有与本专利所述KanJ（SEQ NO：1）有相同序列的酶。

4.权利要求书1所述表达酶KanK为具有与本专利所述KanK（SEQ NO：2）序列相似性大于90%的酶。

5.权利要求书1所述表达酶KanK为具有与本专利所述KanK（SEQ NO：2）有相同序列的酶。

6.如权利要求1所述的产生庆大霉素B的菌的构建方法，其特征在于，将kanJ和kanK置于能在小单孢菌中启动转录的启动子下游，构建重组表达载体。

7.如权利要求6所述的产生庆大霉素B的菌的构建方法，其特征在于，所述的载体为能够位点特异性整合入产生菌基因组中的质粒或者携带与绛红小单孢菌基因组有同源DNA片段、能够通过同源重组的方法插入基因组上的载体。

8.如权利要求1所述的产生庆大霉素B的菌的构建方法，其特征在于，所述产生菌为产生庆大霉素C1、庆大霉素C1a、庆大霉素C2、庆大霉素C2a、JI-20A、JI-20B中一种或一种以上产物的菌种。

9.如权利要求7所述的产生庆大霉素B的菌的构建方法，其特征在于，所述能够位点特异性整合入产生菌基因组中的质粒为pSET152；所述携带与绛红小单孢菌基因组有同源DNA片段、能够通过同源重组的方法插入基因组上的载体，为携带绛红小单孢菌同源DNA片段的pKC1139。

10.一种转化子，其特征在于，含有权利要求6所述的重组载体。

11.如权利要求10所述的转化子，其特征在于，所述转化子的宿主细胞为大肠杆菌ET12567。

12.权利要求1所述的产生庆大霉素B的菌在合成抗菌药物中的应用。

13.权利要求1所述的产生庆大霉素B的菌在产生庆大霉素B中的应用。