CN102586146A - 一种产生庆大霉素C1a的工程菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及一种主要产生庆大霉素C1a的工程菌及其构建方法，是利用基因阻断技术对庆大霉素产生菌棘孢小单孢菌中的6’-C-甲基转移酶基因gntK进行破坏，以阻断庆大霉素C1，C2和C2a的合成，使其主要产生庆大霉素C1a和少部分的庆大霉素C2b。原始菌株中C1a，C2，C2a和C1的含量分别为6.5%，45.3%，20.1%和27.1%，而阻断株中的C1a和C2b的含量分别为94.0%和6.0%。本发明通过框架内删除失活的方法破坏棘孢小单孢菌中gntK基因，包括gntK基因阻断质粒的构建，阻断质粒转化棘孢小单孢菌，双交换菌株的筛选以及发酵产物的分析。本发明所构建的工程菌，不含有任何抗性标记，通过连续传代，庆大霉素C1a产量非常稳定。

Description

一种产生庆大霉素C1a的工程菌及其构建方法

 

技术领域

本发明属于抗生素制药领域，涉及一种主要产生庆大霉素C1a组分的工程菌及其构建方法与应用，可以应用于抗生素制药领域，应用空间较大。具体涉及一种产生庆大霉素C1a的工程菌及其构建方法。

背景技术

小单孢菌是一属能产生多种具有临床价值抗生素的微生物，在先后报道的60种小单孢菌中，就有40多种产生抗生素，其中包括大环内酯类、氨基糖苷类、安莎类和蒽环类等等。小单孢菌不仅可以产生链霉菌所产生的抗生素，还产生庆大霉素(Gentamicin)、西索米星(Sisomicin)、阿司米星(Astromivin)等。小单孢菌有巨大的潜力，日益受到人们的重视。

庆大霉素(Gentamicin，GM)是由放线菌属绛红小单孢菌(Micromonospora purpurea)、棘孢小单孢菌（Micromonospora echinospora）发酵产生的氨基糖苷类广谱抗生素，对多种革兰阴性菌和阳性菌有较强的抗菌作用。1963年被美国人Weinstein首次发现，1969年被用于临床，它也是我国独立自主研制成功的广谱抗生素。

庆大霉素各组分在结构上很相近，由三个环状结构组成，分别为绛红糖胺，2-脱氧链霉胺和加拉糖胺。根据分子结构的差异可以分为庆大霉素C，庆大霉素A，庆大霉素B和庆大霉素X等。庆大霉素C是主组分，2-脱氧链霉胺分别在4、6位上通过苷键连接绛红糖胺和加拉糖胺。因绛红糖胺C6’上的甲基化程度不同，形成了C1、C2、C1a三个组分。庆大霉素不同组分的抗菌活性因它们与细菌核糖体的亲和力不同而异，最有效的成分为C1a，它的活性略高于C2，而C1与细菌核糖体的亲和力最弱。庆大霉素C1a组分可作为合成抗菌药物依替米星的前体药物，应用空间较大。

庆大霉素的生物合成基因簇已被克隆。根据抗性基因与合成基因连锁的规律，Unwin等用已报道的庆大霉素抗性基因grmA设计引物，以Micromonospora echinospora ATCC15835基因组质粒文库为模板进行PCR扩增，从1000个质粒中筛选到1个阳性克隆，包括38kb的外源片段，其中有28个完整的ORF。其中，gntE基因的功能已经被证实。

gntK基因编码产物与M.olivasterospora中的fms7基因产物有57%的同源性。Fms7催化福提霉素6’位甲基化，使KL1转变为KK1，所以推断gntK为6’-C位甲基化酶基因。同时，庆大霉素与西索米星的化学结构非常相似，推测它们有相似的生物合成路线和相似功能的基因。庆大霉素化学结构中比西索米星多6’-C位的甲基，而在它们生物合成基因的比对中发现，西索米星生物合成基因簇中没有与gntK相似的基因，所以推测gntK为6’-C甲基化酶基因。而庆大霉素C1a在6’-N位甲基转移酶的作用下继续合成庆大霉素C2b。

庆大霉素C1a最常采用的制备方法为从小诺霉素的发酵液中分离得到。该方法通常包括发酵，将发酵液经过过滤得到滤液，滤液经脱色浓缩、浓缩液用大孔吸附树脂吸附、用三种不同比例的乙醇－氨水进行洗脱、解析，解析液经浓缩、喷雾干燥得到庆大霉素C1a。这种方法存在不足之处，例如生产周期长（480小时/批）；生产工艺复杂，树脂吸附后需用混合溶液经过三次洗脱、解析才能得到庆大霉素C1a；混合洗脱剂和解析剂中的乙醇采用蒸馏塔回收，设备复杂，需消耗大量蒸汽；所用大孔吸附树脂的吸附量小；产品含量低（一般为85％－90％）；原材料消耗大，成本高。

另一种生产庆大霉素C1a的方法为筛选庆大霉素C1a高产菌株。通过诱变庆大霉素产生菌绛红小单孢菌，获得庆大霉素C1a高产菌株，通过分离纯化方法得到。但该方法对研究的菌株遗传背景研究不清晰，菌株发酵产物中仍然可能有庆大霉素其他C组分的存在。

发明内容

本发明通过基因工程的方法将负责庆大霉素生物合成C-6位甲基转移酶的编码基因阻断，从而使生产菌不能合成庆大霉素C组分。所得菌株产生的C1a含量高，且菌株遗传背景较清楚，不会发生回复突变。

本发明的目的是提供一种主要产生庆大霉素C1a组分的工程菌。

本发明的另一目的是提供该基因工程菌株的构建方法。

本发明的进一步目的是基因工程菌的应用。

本发明通过框架内删除失活的方法破坏绛红小单孢菌中的gntK基因，主要包括以下步骤：

（1）gntK基因阻断质粒的构建

本发明构建了一种重组穿梭质粒，其含有缺失348bp保守序列的gntK基因及其上下游部分序列。

本发明所述的重组穿梭质粒的骨架是pKC1139。

（2）阻断质粒转化绛红小单孢菌

将所述的重组穿梭质粒转化庆大霉素产生菌，得到转化子。所述的转化方法为接合转移，庆大霉素产生菌为绛红小单孢菌。

（3）双交换阻断株的筛选

双交换筛选是根据抗性表型，筛选获得同源基因双交换阻断突变株，对阻断变株在基因水平发生的DNA双交换进行PCR验证，从而筛选到组分发生变化的转化子。

（4）发酵产物的分析

发酵产物分析为原株和变株的发酵液经酸碱处理和上树脂柱除杂后采用薄层色谱TLC、生物显影、HPLC-ELSD和MS等方法分析其产物变化情况。

本发明主要产生的庆大霉素C1a组分可作为合成抗菌药物依替米星的前体药物，应用空间较大。本发明将绛红小单孢菌进行改造，敲除了gntK基因部分保守序列，得到了一种主要产生庆大霉素C1a的基因工程菌。本发明所构建的基因工程菌提高了庆大霉素C1a的产量。本发明的制备方法中双交换双臂的长度分别为1300bp和1500bp，双交换发生的几率较高，双交换结合子的筛选较快。

得到的庆大霉素C1a产生菌命名为Micromonospora purpurea gntK ^- ， 保藏编号：CGMCC NO.4838，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2011年5月9日。

附图说明

图1是gntK基因阻断质粒的构建过程；

图2是原菌株与敏感菌株PCR验证的电泳图谱

1.λ-DNA/ HindIII marker；2.原菌株；3.阻断株；

图3是基因工程菌发酵液的薄层色谱图

1为庆大霉素C1a标准品，2为庆大霉素标准品，3为原始菌株发酵液，4为基因工程菌株发酵液，5为庆大霉素C2b标准品。A为C1，B为C2，C为C1a，D为C2b；

图4是庆大霉素标准品和基因工程菌发酵液的HPLC-ELSD图谱；

A为庆大霉素标准品，B为原始菌发酵液，C为基因工程菌发酵液，D为C2b标准品

图5是庆大霉素C1a的质谱图。

具体实施方式

实施例1：gntK基因阻断质粒的构建

根据已经发表的Micromonospora echinospora 相应序列（GenBank登录号：AY524043）设计引物：

左臂上游引物：K1   5’ –TCCAAGCTTGTACCCTCGGAGCCGGTCTTGT-3’ 带有HindⅢ酶切位点； 

左臂下游引物：K2   5’ –TGCTCTAGACTGGGTTGCGTCTGCGTGAT -3’   带有XbaⅠ酶切位点；扩增1.3kb片段P1；

右臂上游引物：K3    5’ –TGCTCTAGACGGGTAGAACGGGTTGGTCC -3’  带有XbaⅠ酶切位点；

右臂下游引物：K4    5’ –CGGAATTCCAGCGTTGGCAATAATCATCAGC -3’带有EcoRⅠ酶切位点；扩增1.5kb片段P2。

以绛红小单孢菌总DNA为模板，PCR扩增1.3kb和1.5kb这两个片段，删除了基因内部348bp的保守序列，PCR反应的条件为：（1）95℃预变性5min；（2）解链95℃×90 s；退火 55℃×30 s；延伸 72℃×3 min；30个循环；（3）72℃×7 min。将PCR产物P1片段电泳回收，经HindIII和XbaI双酶切后，连入经同样双酶切后的pIJ2925上，转化大肠杆菌DH-5α感受态，筛选阳性克隆，获得重组质粒pMPK01。质粒pMPK01经XbaI和EcoRI双酶切后，电泳回收，与经过相同酶处理过的P2片段连接。连接产物转化大肠杆菌DH-5α感受态，筛选阳性克隆，获得重组质粒pMPK02。pMPK2删除了目的基因内部的348bp保守序列。质粒pMPK02经HindIII和EcoRI双酶切后，电泳回收P1+P2片段，连入经同样双酶切后的pKC1139上，转化大肠杆菌DH-5α感受态，筛选阳性克隆，获得重组质粒pMPK03。

实施例2：阻断质粒pMPK03转化绛红小单孢菌

将含有oriT的穿梭质粒转入大肠杆菌ET12567（pUZ8002）中，得到供体菌株大肠杆菌ET12567（pUZ8002，供体质粒）。将大肠杆菌ET12567（pUZ8002，供体质粒）单菌落，接种于3 ml LB培养基（加入作用浓度为25 μg/ml卡那霉素和氯霉素以及50 μg/ml 供体质粒对应的抗生素）中，37℃培养过夜，按0.2%转种到20 ml含三种抗生素的LB培养基中，37℃培养2.5~3.0 h，离心沉淀菌体，用新鲜的LB培养基洗涤两次，最后将菌体悬浮于约7.5 ml培养基中，镜检计数约为10⁸数量级。

制备绛红小单孢菌单孢子悬液，用2×YT培养基洗涤2次，溶解在一定体积2×YT中使单孢子浓度为10⁸，50℃热激活10 min，37℃水浴预培养2～3 h，冷却至室温。

将处理好的供体菌0.5 ml与绛红小单孢菌单孢子悬液0.5 ml于eppendorf管中混合，离心沉淀，用少量的残液悬浮后涂布在MS培养基上。28℃培养20~24 h，用800 μl含安普霉素（浓度度50 μg/ml）和吡哌酸（终浓度50 μg/ml）的水溶液覆盖。28℃继续培养144 h，平板上长出菌落。

实施例3：双交换阻断株的筛选

将28℃培养长出的转化子传加药平板于37℃培养，因为阻断质粒在42℃都不能复制，只有通过同源交换整合到染色体上之后接合子才会生长，表现为安普霉素抗性，说明接合子都发生了单交换整合。将单交换菌株在无药平板上传三代，挑350个单菌落分别点种到含药和无药的平板上，筛选出2株安普霉素敏感的菌株，提取这两株菌的总DNA，PCR验证，其中一株与对照一样大，说明其发生了单交换的脱落；另一株的片段比对照小，说明其发生了双交换，将这株菌命名为M.purpurea gntK ^- 。

实施例4：发酵产物的分析

（1）    绛红小单孢菌基因工程菌的摇瓶发酵

将绛红小单孢菌斜面用挖块法接种于30mL种子培养基中，34℃摇床培养32-36h，10%转种于30mL发酵培养基中，34℃摇床培养120h。

种子培养基：可溶性淀粉1.0，黄豆饼粉1.5，葡萄糖0.1，碳酸钙0.3，硝酸钾0.05；pH6.8

发酵培养基：可溶性淀粉5.0，黄豆饼粉3.5，硫酸铵0.05，蛋白胨0.2，葡萄糖1.5，硝酸钾0.05，碳酸钙0.6，氯化铵0.1，玉米粉1.5，氯化钴10μg/mL；pH7.5

（2）    发酵液处理

用浓硫酸调节发酵液pH到1.5，搅拌酸化30min，然后10000r/min离心10min，取上清并用2mol氢氧化钠调pH至6.8，10000r/min离心10min，取上清备用。

（3）    D152型树脂除杂

将处理好的树脂装柱，用蒸馏水洗柱。然后将处理好的发酵液上柱，控制低流速，吸附后用蒸馏水洗脱至无色，用2mol的氨水解吸，用部分收集器收集。将有活性的解吸液合并。

（4）    薄层色谱分析

氯仿-甲醇-氨水（1：1：1）混合振摇，上相饱和，下相展开。

通过薄层色谱和生物显影分析，可以发现与原始菌株相比，阻断株的组分发生了变化。

（5）    HPLC-ELSD分析

色谱柱为ODS C₁₈柱（Diamonsil），流动相为0.2mol/L三氟醋酸-甲醇（92：8），流速为每分钟0.6ml，用蒸发光检测器检测。原始菌株和阻断株各组分的保留时间，峰面积和相对含量如下表：

表一   庆大霉素各组分标准品的保留时间

	C1a	C2	C2b	C2a	C1
						保留时间（min）	12.115	16.529	18.450	21.305	24.894

表二  原始菌株各组分的保留时间，峰面积和相对含量

	C1a	C2	C2a	C1
					保留时间（min）	12.218	16.383	21.227	24.885
峰面积（响应面积）	310189	2171061	962436	1345588
					相对含量（%）	6.5	45.3	20.1	27.1

表三  阻断株各组分的保留时间，峰面积和相对含量

	C1a	C2b
			保留时间（min）	12.186	18.791
峰面积（响应面积）	1939228	123159
			相对含量（%）	94.0	6.0

（6）    质谱分析

收集液相色谱峰的流出液，用冷冻干燥的方法浓缩，质谱测定分子量。

         SEQUENCE LISTING

 

<110>  沈阳药科大学

 

<120>  一种产生庆大霉素C1a的工程菌及其构建方法

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  1917

<212>  DNA

<213>  Micromonospora purpurea gntK-

 

<400>  1

atgaacgcgc tggtggcagc gccttctgtt acggaaggta atcaagtgaa ggttttcctc       60

 

gtcaagccgc cgatccgcgg atgcatggtg gaaatcggac gtcacgttcc gatcgggctc      120

 

gcctacgtat cgtcagcgct gcgcgccgcg ggccatgaga cggagatttt cgactccctc      180

 

gcctacaccg aggacaacca cgtcgtcccg gacgcggagc tgaccacgat cgagcgggcc      240

 

aagctggagc gccacccgcg ctggcggcac atcatgcact ggggcgcccg gacggagcgc      300

 

atcgaggctg ccctcgccgc cagcgaggcg gacgtcgtcg gcatctcctg catgttcacc      360

 

ccctactacg agagcgccta cgagctggcc cggatggcga agcgcgtcct gccgaacgcg      420

 

aaggtgatcg ttggcggtca gcacggcacc gtcgccttcc cgcacgtgct cgaggtgccc      480

 

gaggtcgacg cggtgatgct cggtgaggcc gaggtgacca cggtcgcgct gctggacgcg      540

 

ttcgccaccg ggcggcccct gaccgagctg ctcggggtgg ccttccgctg tggcgagggg      600

 

ctctgcgagt gcgccacgcc cggcacgccg cacatccgtc cccgtgcgcc cttcgtcgcc      660

 

gacctcgact ccctcgcgcc gccggccgcc gaccagctcg acttcgaccg gtacggcaac      720

 

gcggtcaccc tgatcaccag ccggggctgc ccgttctcgt gctcgttctg cacggtgcac      780

 

gccacggtcg gcaagcagtt ccgggcccgt gacccgcagc gcgtggtcga cgagatcgag      840

 

cactacgtca acgtgcacgg ggtgcgccgc ttcctggtgg aggacgacaa cttcaccttc      900

 

gacatcgagc gggtgcacgc catctgccag gagatcgtcc gccgtaagct cgacgtccgg      960

 

ctcagcctgc cgaacgggat gaccgtcgtg aagctcaccg aggacctggt ggagagcatg     1020

 

gtctcggccg gcttcgacga cctcttcctc gggctggaga ccaccgacgc ggcccggctg     1080

 

cgcaagatgc gcaaggggtt cacctcgctg gacaaggtct ccgccggggt cgccctgttc     1140

 

gagaagttcg ggctgacggc gagcgccgcg atcatcgtcg ggctgcccga ccagagcctc     1200

 

gacgcgatcg tgcaggacgc ggtcaacctg gtgctggccg gggtcgagtt ctggaccaac     1260

 

ccgttctacc cgatctacgg ctccccggac taccagacct gtctgacccg gggcatcgtc     1320

 

gacccgctga ccgaccccgc cctgttcgac cagttcaact tcgccttcgc caacggtgtc     1380

 

ctggccgcgg acgagctcta cacggcctgg gtggggaccc tcgccatggc gctgtggccg     1440

 

aagtacgtcc ttgagggggc ggagcgccgc gagcaggggc cggtctcggc ggcggaggcc     1500

 

ggcgcacgtc tggtcgagca cagcatggcg cagctcgacc cggagagccc ggaggaactg     1560

 

ccggccaccg tgcgggcgat ccgggagtcc gccgacggac tgctggcact ggggcacccg     1620

 

ctgggttgcg tctgcgtgat gcagcacgtc gcggacgccg acaagggggc cggcgccgac     1680

 

cagttctgcc gcttcgccgg tgacatgatc gctgcggcca tcgcgctgta cagcggtcag     1740

 

ccgcaggtca gcgcgcaggt cggagcgcag acggccggag atgccgaagg gtgctcgttc     1800

 

atggtccggc ccaccggtga cgagcggatc ggccggatcc agcgccgctt cgtcgagctg     1860

 

ctcgacgaga accgccggga ggccgaactg gtgaccgccg aggcggtttc ccactga        1917

 

 

<210>  2

<211>  638

<212>  PRT

<213>  Micromonospora purpurea gntK-

 

<400>  2

 

Met Asn Ala Leu Val Ala Ala Pro Ser Val Thr Glu Gly Asn Gln Val

1               5                   10                  15     

 

 

Lys Val Phe Leu Val Lys Pro Pro Ile Arg Gly Cys Met Val Glu Ile

            20                  25                  30         

 

 

Gly Arg His Val Pro Ile Gly Leu Ala Tyr Val Ser Ser Ala Leu Arg

        35                  40                  45             

 

 

Ala Ala Gly His Glu Thr Glu Ile Phe Asp Ser Leu Ala Tyr Thr Glu

    50                  55                  60                 

 

 

Asp Asn His Val Val Pro Asp Ala Glu Leu Thr Thr Ile Glu Arg Ala

65                  70                  75                  80 

 

 

Lys Leu Glu Arg His Pro Arg Trp Arg His Ile Met His Trp Gly Ala

                85                  90                  95     

 

 

Arg Thr Glu Arg Ile Glu Ala Ala Leu Ala Ala Ser Glu Ala Asp Val

            100                 105                 110        

 

 

Val Gly Ile Ser Cys Met Phe Thr Pro Tyr Tyr Glu Ser Ala Tyr Glu

        115                 120                 125            

 

 

Leu Ala Arg Met Ala Lys Arg Val Leu Pro Asn Ala Lys Val Ile Val

    130                 135                 140                

 

 

Gly Gly Gln His Gly Thr Val Ala Phe Pro His Val Leu Glu Val Pro

145                 150                 155                 160

 

 

Glu Val Asp Ala Val Met Leu Gly Glu Ala Glu Val Thr Thr Val Ala

                165                 170                 175    

 

 

Leu Leu Asp Ala Phe Ala Thr Gly Arg Pro Leu Thr Glu Leu Leu Gly

            180                 185                 190        

 

 

Val Ala Phe Arg Cys Gly Glu Gly Leu Cys Glu Cys Ala Thr Pro Gly

        195                 200                 205            

 

 

Thr Pro His Ile Arg Pro Arg Ala Pro Phe Val Ala Asp Leu Asp Ser

    210                 215                 220                

 

 

Leu Ala Pro Pro Ala Ala Asp Gln Leu Asp Phe Asp Arg Tyr Gly Asn

225                 230                 235                 240

 

 

Ala Val Thr Leu Ile Thr Ser Arg Gly Cys Pro Phe Ser Cys Ser Phe

                245                 250                 255    

 

 

Cys Thr Val His Ala Thr Val Gly Lys Gln Phe Arg Ala Arg Asp Pro

            260                 265                 270        

 

 

Gln Arg Val Val Asp Glu Ile Glu His Tyr Val Asn Val His Gly Val

        275                 280                 285            

 

 

Arg Arg Phe Leu Val Glu Asp Asp Asn Phe Thr Phe Asp Ile Glu Arg

    290                 295                 300                

 

 

Val His Ala Ile Cys Gln Glu Ile Val Arg Arg Lys Leu Asp Val Arg

305                 310                 315                 320

 

 

Leu Ser Leu Pro Asn Gly Met Thr Val Val Lys Leu Thr Glu Asp Leu

                325                 330                 335    

 

 

Val Glu Ser Met Val Ser Ala Gly Phe Asp Asp Leu Phe Leu Gly Leu

            340                 345                 350        

 

 

Glu Thr Thr Asp Ala Ala Arg Leu Arg Lys Met Arg Lys Gly Phe Thr

        355                 360                 365            

 

 

Ser Leu Asp Lys Val Ser Ala Gly Val Ala Leu Phe Glu Lys Phe Gly

    370                 375                 380                

 

 

Leu Thr Ala Ser Ala Ala Ile Ile Val Gly Leu Pro Asp Gln Ser Leu

385                 390                 395                 400

 

 

Asp Ala Ile Val Gln Asp Ala Val Asn Leu Val Leu Ala Gly Val Glu

                405                 410                 415    

 

 

Phe Trp Thr Asn Pro Phe Tyr Pro Ile Tyr Gly Ser Pro Asp Tyr Gln

            420                 425                 430        

 

 

Thr Cys Leu Thr Arg Gly Ile Val Asp Pro Leu Thr Asp Pro Ala Leu

        435                 440                 445             

 

 

Phe Asp Gln Phe Asn Phe Ala Phe Ala Asn Gly Val Leu Ala Ala Asp

    450                 455                 460                

 

 

Glu Leu Tyr Thr Ala Trp Val Gly Thr Leu Ala Met Ala Leu Trp Pro

465                 470                 475                 480

 

 

Lys Tyr Val Leu Glu Gly Ala Glu Arg Arg Glu Gln Gly Pro Val Ser

                485                 490                 495    

 

 

Ala Ala Glu Ala Gly Ala Arg Leu Val Glu His Ser Met Ala Gln Leu

            500                 505                 510        

 

 

Asp Pro Glu Ser Pro Glu Glu Leu Pro Ala Thr Val Arg Ala Ile Arg

        515                 520                 525            

 

 

Glu Ser Ala Asp Gly Leu Leu Ala Leu Gly His Pro Leu Gly Cys Val

    530                 535                 540                

 

 

Cys Val Met Gln His Val Ala Asp Ala Asp Lys Gly Ala Gly Ala Asp

545                 550                 555                 560

 

 

Gln Phe Cys Arg Phe Ala Gly Asp Met Ile Ala Ala Ala Ile Ala Leu

                565                 570                 575    

 

 

Tyr Ser Gly Gln Pro Gln Val Ser Ala Gln Val Gly Ala Gln Thr Ala

            580                 585                 590        

 

 

Gly Asp Ala Glu Gly Cys Ser Phe Met Val Arg Pro Thr Gly Asp Glu

        595                 600                 605            

 

 

Arg Ile Gly Arg Ile Gln Arg Arg Phe Val Glu Leu Leu Asp Glu Asn

    610                 615                 620                

 

 

Arg Arg Glu Ala Glu Leu Val Thr Ala Glu Ala Val Ser His

625                 630                 635            

 

 

Claims (15)

1.一种基因工程菌，其特征是，该菌株主要产生庆大霉素C1a组分，将该基因工程菌命名为Micromonospora purpurea gntK ^- ，其保藏编号为：CGMCC NO.4838。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征是，在野生菌株基因组中阻断gntK基因。

3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征是，构建基因工程菌的野生菌株，为庆大霉素产生菌绛红小单胞菌或荆棘小单胞菌。

4.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征是，阻断基因的序列如SEQ ID No.1所示，基因相应的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

5.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征是，阻断gntK基因的方法包括基因阻断和基因替换。

6.一种如权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征是，主要包括以下步骤：

（1）gntK基因阻断质粒的构建；

（2）gntK基因阻断质粒转化绛红小单孢菌；

（3）gntK基因双交换阻断株的筛选；

（4）gntK基因阻断变株发酵产物的分析。

7.根据权利要求6所述的基因工程菌的构建方法，其特征是，通过框架内删除失活构建阻断质粒，该方法为PCR分别获得gntK基因上下游片段1.3kb和1.5kb，删除gntK基因内部348bp的保守序列，将两个片段同时连接到pIJ2925上，再通过HindⅢ，EcoRⅠ双酶切将这两个片段连接到穿梭载体pKC1139上。

8.根据权利要求6所述的基因工程菌的构建方法，其特征是，所述的双交换阻断株的筛选是根据抗性表型，筛选获得同源基因双交换阻断突变株，对阻断突变株在基因水平发生的DNA双交换进行PCR验证，从而筛选到组分发生变化的转化子。

9.根据权利要求6所述的基因工程菌的构建方法，其特征是，所述的发酵产物分析为变株和原株的发酵液经酸碱处理和上树脂柱除杂后采用薄层色谱TLC、生物显影、HPLC-ELSD和MS分析其产物变化情况。

10.一种重组载体，其特征是，含有大肠杆菌和链霉菌复制起点，含有权利要求7中删除后缺失部分保守序列的gntK基因的温敏型质粒。

11.一种转化子，其特征是，含有权利要求10所述的重组载体。

12.如权利要求11所述的转化子，其特征在于，所述的转化子的宿主细胞是大肠杆菌ET12567。

13.权利要求1所述的基因工程菌在合成抗菌药物中的应用。

14.权利要求1所述的基因工程菌在产生庆大霉素C1a组分中的应用。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，包括将权利要求8所述的转化子与产庆大霉素的绛红小单孢菌接合，挑选接合子。

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