CN102586165B

CN102586165B - 一株产阿泊拉霉素的工程菌及其应用

Info

Publication number: CN102586165B
Application number: CN201210036210.7A
Authority: CN
Inventors: 洪文荣; 林玉双
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2012-02-17
Filing date: 2012-02-17
Publication date: 2014-03-12
Anticipated expiration: 2032-02-17
Also published as: CN102586165A

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及一种灭活tobS1-C基因功能的产阿泊拉霉素的工程菌及其应用，所述工程菌为黑暗链霉菌（Streptomycestenebrarius）T103，已于2011年11月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.5516，所述的工程菌用于制备抗菌药物。本发明获得了主产阿泊拉霉素，不再产生氨甲酰妥布霉素的工程菌，简化了生产工艺、降低了生产成本，同时还方便了产品的质量控制。

Description

一株产阿泊拉霉素的工程菌及其应用

技术领域

本发明属于抗生素制药领域，涉及一种工程菌及其应用，具体地说，本发明涉及一株产阿泊拉霉素的工程菌及其应用。

背景技术

黑暗链霉菌（Streptomyces tenebrarius）是1967年美国礼莱公司研究人员从土壤中分离得到，该菌株能产生一组抗生素，称之为暗霉素复合物（Nebramycins），组分2：阿泊拉霉素、组分4：氨甲酰卡那霉素B和组分5：氨甲酰妥布霉素三个组分为主组分，在对各个因子进行生物学研究时发现这三个组分均有良好的抗菌作用，且都是重要的原料药。其中，阿泊拉霉素是一种对猪痢疾以及沙门氏菌病有效的畜用氨基糖苷类抗生素。阿泊拉霉素含有独特的辛二糖结构，对多种氨基糖苷钝化酶具有灭活作用，对氨基糖环上不同位置修饰后所得的衍生物，可增加母体的抗菌活性，是黑暗链霉菌产生的特色化合物。

目前，阿泊拉霉素的生产是从黑暗链霉菌发酵液中层析分离而得。由于暗霉素三个组分理化性质相近，要从发酵液中对该三种组分进行逐一分离，不但层析分离周期长，收率低，料耗大，污染严重，工艺复杂，而且产品质量不稳定。因此，长期困扰企业生产，阻碍了企业产品生产技术的升级换代，成了产业化生产的技术瓶颈，结果是生产成本高，环境污染严重，价格居高不下。

若能获得主产阿泊拉霉素的稳定菌，则以上所有问题将迎刃而解，其所带来的直接经济效益，间接社会效益和环境效益等是极其巨大的，更重要的是给清洁生产，安全用药，提供了可靠保障。

发明内容

本发明的目的在于提供一株主产阿泊拉霉素的工程菌及其应用。

本发明提供的一株产阿泊拉霉素的工程菌，所述工程菌为黑暗链霉菌（Streptomyces tenebrarius）T103，已于2011年11月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No. 5516。所述黑暗链霉菌（Streptomyces tenebrarius）T103是通过灭活妥布霉素生物合成基因簇中tobS1-C基因功能，且不产生氨甲酰妥布霉素。

本发明还提供了所述工程菌的发酵方法，具体方法为：菌株T103发酵前先用稀释平板法分离出产孢丰富的单菌落转接于斜面培养基，37℃培养3—7d，挖块接种于种子培养基，37℃摇床培养18 h，转速为180-350rpm；然后按1-10%接种量转接于发酵培养基，37℃摇床培养120 h，转速为250rpm；所述种子培养基：葡萄糖1-5g，玉米淀粉10-20g，黄豆饼粉5-30g，磷酸二氢钾0.5-1.0g，氯化钾1-5g，氯化钙0. 25-5.0g，硫酸镁0.5-5.0g，加自来水至1L；发酵培养基：葡萄糖10-30g，玉米粉10-30g，黄豆饼粉10-35g，硫酸镁1.0-11g，碳酸钙1-7g，鱼粉4-8g，硫酸锌0.1-0.5g，硫酸铵1-7g，玉米淀粉10-50g，淀粉酶0.01-0.50g，加自来水至1L，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0-7.2。

优选地，所述种子培养基：葡萄糖5g，玉米淀粉10g，黄豆饼粉15g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钾1g，氯化钙0.25g，硫酸镁5g，加自来水至1L；所述发酵培养基：葡萄糖15g，玉米粉20g，黄豆饼粉35g，硫酸镁11g，碳酸钙7g，鱼粉6g，硫酸锌0.1g，硫酸铵7g，玉米淀粉20g，淀粉酶0.5g，加自来水至1L，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0-7.2。

本发明还提供了所述的工程菌在制备抗菌药物中的应用。

菌株T103的筛选，主要包括以下几个步骤：

A. tobS1-C基因置换质粒的构建；

B. 置换质粒转化黑暗链霉菌；

C. 转化子的筛选；

D. 工程菌代谢产物组分的鉴定。

基因置换的方法是，采用PCR法分别获得tobS1-C基因上下游长度约1000bp的片段，作为同源交换臂，将两者同时连接到穿梭载体上，如pKC1139等，交换臂外插入红霉素抗性等基因，如ermE，作为筛选标记，便于黑暗链霉菌DNA重组后工程菌的筛选，最终得到置换质粒pSH6（图1）。

其中转化是以E.coli ET12657(pUZ8002)介导的结合转移方法。工程菌筛选过程是首先筛选红霉素抗性（ermE^R）菌株，获得单交换突变株（图1，II，III），无药（不含红霉素）传代后再从中筛选红霉素敏感（ermE^S）菌株，进一步筛选重组的转化子T103，获得双交换突变株（图1，V）。经发酵，采用薄层层析法（TLC法）对发酵代谢产物进行初步分析，锁定目标菌株，最后经HPLC-MS法对目标工程菌代谢产物的组分进行精确确认。

本发明得到的目标菌株为黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius) T103菌株，已于2011年11月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 5516。

本发明获得了一株精确阻断了妥布霉素生物合成，主产阿泊拉霉素的工程菌，大大简化了阿泊拉霉素的生产工艺，并降低生产成本，减少环境污染，同时提高了产品质量，达到了可大规模生产阿泊拉霉素的目标。

附图说明

图1是tobS1-C基因功能同源交换灭活示意图：

I：染色体上基因位置； II：与染色体上的B2端单交换； III：与染色体上的B1端单交换； IV：染色体上发生了回复突变；V：染色体上发生了双交换。

图2 pSH6构建流程图。

图3是亲株黑暗链霉菌Tt49与工程菌黑暗链霉菌T103发酵代谢产物的TLC比较分析结果：

1为阿泊拉霉素标准品AM；2为野生型菌株黑暗链霉菌Tt49的发酵代谢产物；3为突变株黑暗链霉菌T103发酵代谢产物；4为氨甲酰妥布霉素标准品TOB。

图4 是亲株黑暗链霉菌Tt49代谢产物的HPLC-MS分析图谱：

峰2对应分子量540.2，是阿泊拉霉素；峰4对应分子量为511.2，是氨甲酰妥布霉素。

图5是工程菌黑暗链霉菌T103代谢产物的HPLC-MS分析图谱。

峰2对应的分子量540.2，是阿泊拉霉素。未见分子量511.2的氨甲酰妥布霉素。

图6 是提取精制得到的阿泊拉霉素产品。峰3为阿泊拉霉素，分子量为540.3。

具体实施方式

实施例1：试剂来源：pMD19-T和限制性内切酶等购自TaKaRa公司，质粒pAGe（含抗性基因ermE）由上海医药工业研究所邵雷博士惠赠，质粒pBR322（含有四环素抗性基因）为本实验室保存。

本发明主要包括以下主要步骤：

1．构建tobS1-C基因置换质粒

以Piepersberg等公布的妥布霉素生物合成基因簇序列(GenBank Accession Number AJ810851)作为参考，确认出发菌株黑暗链霉菌Tt49（林玉双，洪文荣，林烨等．氨甲酰妥布霉素高产菌株选育及其发酵特性研究[J]．中国抗生素杂志，2008，33（7）：442-445）染色体DNA上妥布霉素生物合成基因簇的相似性。然后分别在tobS1-C基因上下游设计两对引物P1/P2和P3/P4，以黑暗链霉菌Tt49的总DNA（DNA提取方法见：白林泉. 链霉菌基因组中DNA大片段的基因置换与克隆[D]. 武汉：华中农业大学，1998.）为模板进行PCR扩增，获得两个片段B1和B2，其长度分别为1165 bp(tobS1基因上游DNA序列)和1200 bp(tobC基因下游DNA序列)，扩增产物依次克隆至pMD19-T上，得重组质粒pSH1和pSH2。

以质粒pAGe为模板，P5和 P6为引物，扩增得到红霉素抗性基因（ermE），克隆到pMD19-T上，得到重组质粒，命名为pSH3。

pSH1经HindIII/XbaI双酶切，回收交换臂B1片段，与pKC1139经HindIII/XbaI双酶切回收的大片段进行连接，筛选得到阳性克隆子，命名为pSH4。

pSH2经XbaI/BamHI双酶切，回收交换臂B2片段，与pSH4经XbaI/BamHI双酶切回收的大片段进行连接，筛选得到阳性克隆子，命名为pSH5。

pSH3经EcoRI单酶切后回收红霉素抗性基因（ermE）（1748bp），插入pSH5的EcoRI位点，筛选得到目标重组阳性克隆子，命名为pSH6。构建策略见图2。

表1 实施例所涉及的引物

Figure 2012100362107100002DEST_PATH_IMAGE001

^aRestriction enzyme site are indicated by single underlines.

2．置换质粒pSH6转化黑暗链霉菌Tt-49

将置换质粒pSH6导入E.coli ET12567 (pUZ8002)中，得到供体菌E.coli ET12567 (pUZ8002，pSH6)。然后通过结合转移的方法转化黑暗链霉菌Tt49（林玉双，洪文荣，林烨，等．氨甲酰妥布霉素高产菌株选育及其发酵特性研究[J]．中国抗生素杂志，2008，33（7）：442-445）孢子，37℃培养18h后，用含红霉素和萘啶酸（终浓度分别为50μg／mL和25μg／mL）的水溶液覆盖，37℃继续培养4-5天长出转化子，将所获得的ermE^R转化子在含有红霉素(50μg／mL)的斜面培养基上37℃培养，筛选红霉素抗性转化子，挑取一株命名为黑暗链霉菌TE49（∷pSH6）。

3．双交换菌株筛选与发酵代谢产物变化的定性检测

将黑暗链霉菌TE49（∷pSH6）在不含抗生素的平板上连续传三代后，挑取单菌落分别点种到无药平板和含药(红霉素50μg/mL)平板，筛选到28个红霉素敏感erm ^S菌株。分别提取其染色体，以该染色体作为模板，设计双交换验证引物（P7/P8）进行PCR验证后，得到1株双交换菌株，命名为黑暗链霉菌T103（△tobS1C）。对该菌株进行发酵，过滤收集发酵液，滤液通过硅胶GF₂₅₄薄层层析发现，该菌株能正常产生阿泊拉霉素，但未检测到氨甲酰妥布霉素（图3）。该滤液通过HPLC-MS定性检测，其HPLC-MS图谱见图5，峰2为阿泊拉霉素，分子量为540.2，同样未检测到氨甲酰妥布霉素、氨甲酰卡那霉素B组分；亲株黑暗链霉菌Tt49代谢产物的HPLC-MS图谱见图4，峰2是阿泊拉霉素，分子量为540.2；峰3和峰4是氨甲酰妥布霉素，分子量为511.2。比较图4和图5可以看出，工程菌T103不再产生氨甲酰妥布霉素，主要产生阿泊拉霉素。

实施例2：黑暗链霉菌T103代谢产物阿泊拉霉素的制备

本发明提供的工程菌T103可直接用于生产阿泊拉霉素，工程菌经发酵后提取代谢产物，制备阿泊拉霉素，作为抗菌药物。

1.黑暗链霉菌T103工程菌的发酵培养

种子培养基：葡萄糖5g，玉米淀粉10g，黄豆饼粉15g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钾1g，氯化钙0. 5g，硫酸镁5g，加自来水至1L。

发酵培养基：葡萄糖15g，玉米粉20g，黄豆饼粉35g，硫酸镁11g，碳酸钙7g，鱼粉6g，硫酸锌0.1g，硫酸铵7g，玉米淀粉20g，淀粉酶0.5g，加自来水至1L，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0-7.2。

将实例1中步骤3获得的基因工程菌黑暗链霉菌T103进行摇瓶发酵。发酵前先用稀释平板法分离出产孢丰富的单菌落转接于斜面培养基，37℃培养5天，挖块接种于种子培养基（装量为30mL／250mL三角瓶），37℃摇床培养18 h(转速为250rpm)。按10%接种量转接到发酵培养基（装量为50mL/250mL三角瓶），37℃摇床培养120 h(转速为250rpm)。

2.代谢产物提取精制

A、粗提

将上述发酵液加10%自来水稀释，再加入盐酸，酸化至pH2.0~3.0，充分搅拌4小时；然后用氢氧化钠溶液回调至pH5.0~6.5，投入732NH₄ ⁺树脂静态吸附6~8小时。树脂投放量按5万u/mL左右计算。收集吸附饱和树脂，用自来水漂洗干净（无漂浮菌丝体为止）。饱和树脂装柱，用两倍饱和树脂体积的0.5M HCl溶液酸洗饱和树脂，再用无离子水洗涤至中性，然后改用0.01%氨水进行碱洗，当流出液达pH 9.0左右时，串联到等体积的711树脂柱上，改用4%的氨水进行洗脱，氨水用量为饱和树脂体积的8~10倍，洗脱时间控制在8~10小时，收集洗脱液，浓缩到原体积的1/10，然后于100℃水解4小时，过滤，得水解液。

B、精制与结晶

水解液用硫酸调至pH5.5~6.0（浓度控制在25~30万单位/mL），活性炭脱色至透光度达92%以上，在搅拌下，缓慢向浓缩液中滴加入95%以上乙醇，进行结晶，时间3~4小时，之后经固液分离，85%乙醇溶液淋洗干净，即得湿成品。湿成品经真空干燥（真空度500mmHg以上，温度600℃，干燥6小时），即得硫酸阿泊拉霉素成品，收率80%以上。经HPLC-MS分析，与阿泊拉霉素同质，其结果见图6。

<110> 福州大学

<120> 一株产阿泊拉霉素的工程菌及其应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aagcttggag ctggtcggca aggt 24

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttctagatcg gtcgtgatct cctca 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tctagatgct catcgtggac ggcca 25

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggatccttga ggcagacggg gtcg 24

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaattcccta ggcctattaa tattcc 26

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaattcatag ttctagaggt accagc 26

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gagcgcctac tacttctccg g 21

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttcggagaag gcgtgcac 18

Claims

1.一株产阿泊拉霉素的工程菌，其特征在于，所述工程菌为黑暗链霉菌（Streptomyces tenebrarius）T103，已于2011年11月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No. 5516。

2.一种如权利要求1所述的工程菌的发酵方法，其特征在于，菌株T103发酵前先用稀释平板法分离出产孢丰富的单菌落转接于斜面培养基，37℃培养3—7d，挖块接种于种子培养基，37℃摇床培养18 h，转速为180-350rpm；然后按1-10%接种量转接于发酵培养基，37℃摇床培养120 h，转速为250rpm；所述种子培养基：葡萄糖1-5g，玉米淀粉10-20g，黄豆饼粉5-30g，磷酸二氢钾0.5-1.0g，氯化钾1-5g，氯化钙0.5-5.0g，硫酸镁0.5-5.0g，加自来水至1L；发酵培养基：葡萄糖10-30g，玉米粉10-30g，黄豆饼粉10-35g，硫酸镁1.0-11g，碳酸钙1-7g，鱼粉4-8g，硫酸锌0.1-0.5g，硫酸铵1-7g，玉米淀粉10-50g，淀粉酶0.01-0.50g，加自来水至1L，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0-7.2。

3.根据权利要求2所述的工程菌的发酵方法，其特征在于，所述种子培养基：葡萄糖5g，玉米淀粉10g，黄豆饼粉15g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钾1g，氯化钙0. 5g，硫酸镁5g，加自来水至1L；所述发酵培养基：葡萄糖15g，玉米粉20g，黄豆饼粉35g，硫酸镁11g，碳酸钙7g，鱼粉6g，硫酸锌0.1g，硫酸铵7g，玉米淀粉20g，淀粉酶0.5g，加自来水至1L，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0-7.2。

4.如权利要求1所述的工程菌在制备抗菌药物中的应用。