CN102373174B

CN102373174B - 一株产氨甲酰妥布霉素工程菌及其应用

Info

Publication number: CN102373174B
Application number: CN201110333833.6A
Authority: CN
Inventors: 洪文荣; 严绍德
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2011-10-28
Filing date: 2011-10-28
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2031-10-28
Also published as: CN102373174A

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及一种灭活aprH-aprM功能的主产氨甲酰妥布霉素的工程菌及其应用，所述工程菌为黑暗链霉菌HM106（△aprHM），已于2011年9月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCCNo.5246，所述的工程菌用于制备抗菌药物。本发明获得了主产氨甲酰妥布霉素的工程菌，简化了生产工艺、降低了生产成本，同时还方便了产品的质量控制。

Description

一株产氨甲酰妥布霉素工程菌及其应用

技术领域

本发明属于抗生素制药领域，涉及一种工程菌及其应用，具体地说，本发明涉及一株主产氨甲酰妥布霉素的工程菌，应用于抗生素制造。

背景技术

黑暗链霉菌（Streptomyces tenebrarius）是1967年美国礼莱公司研究人员从土壤中分离得到，该菌株能产生一组抗生素，称之为暗霉素复合物（Nebramycins），组分2（图1；阿伯拉霉素）、4（图2；氨甲酰卡那霉素B）、5’（图2；氨甲酰妥布霉素）为主组分，在对各个因子进行生物学研究时发现这三个组分均有良好的抗菌作用，且都是重要的原料药。多年来科研工作人员对黑暗链霉菌的研究，主要集中在传统常规诱变育种、基因工程育种和优化生产工艺等各方面，并取得了一些进展。二十世纪八十年代兴起的链霉菌基因工程研究，并融入到了抗生素生物合成基因的克隆、产量提高、组分改善及杂合抗生素生产等方面的研究，也取得不少进展。

妥布霉素是一种广谱高效抗生素，在体外对多种病原菌有抗菌活性，特别是那些对庆大霉素耐药的铜绿假单孢菌有效，而且妥布霉素的耳、肾毒性相对较低，是临床上广泛应用的抗菌药。目前，妥布霉素的生产方法是从黑暗链霉菌发酵液中经层析分离，去除阿伯拉霉素和卡那霉素B后，得到氨甲酰妥布霉素，再在碱性条件下，高温水解制备妥布霉素。由于阿伯拉霉素和卡那霉素B的结构和理化性质与氨甲酰妥布霉素相近，因此，在工业化生产中，要从发酵液中对该三种组分进行逐一分离，十分困难。不但层析分离周期长，收率低，料耗大，污染严重，工艺复杂，而且产品质量不稳定，因此，长期困扰企业生产，阻碍了企业产品生产技术的升级换代，成了产业化生产的技术瓶颈，结果是生产成本高，环境污染严重，价格居高不下。

若能获得主产氨甲酰妥布霉素的稳定菌，则以上所有问题将迎刃而解，其所带来的直接经济效益，间接社会效益和环境效益等是极其巨大的，更重要的是给清洁生产，安全用药，提供了可靠保障。

发明内容

本发明的目的在于提供一株不合成阿伯拉霉素，主产氨甲酰妥布霉素的工程菌，用于制备硫酸妥布霉素。

该工程菌为黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius) HM106（△aprHM）菌株，已于2011年9月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 5246。

本发明还提供了菌株HM106（△aprHM）的发酵方法，具体步骤如下：发酵前先用稀释平板法分离出产孢丰富的单菌落转接于斜面培养基，37℃培养5天，挖块接种于种子培养基，37℃摇床培养18 h，转速为180-350rpm；然后按10%接种量转接于发酵培养基，37℃摇床培养120 h，转速为250rpm；所述种子培养基：葡萄糖1-5g，玉米淀粉10-20g，黄豆饼粉5-30g，磷酸二氢钾0.5-1.0g，氯化钾1-5g，氯化钙0.5-5.0g，硫酸镁0.5-5.0g，加自来水至1L，发酵培养基：葡萄糖10-30g，玉米粉10-30g，黄豆饼粉10-30g，硫酸镁1.0-11g，碳酸钙1-7g，硫酸锌0.1-0.5g，硫酸铵1-7g，玉米淀粉10-50g，淀粉酶0.01-0.50g，加自来水至1L，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0-7.2。

所述的工程菌在制备抗菌药物中的应用。

菌株GK1101的筛选，主要包括以下几个步骤：

A. aprH-M基因置换质粒的构建；

B. 置换质粒转化黑暗链霉菌；

C. 转化子的筛选；

D. 工程菌组分的鉴定。

基因置换的方法是，采用PCR法分别获得aprH-M基因上下游长度约2000bp的片段，作为同源交换臂，将两者同时连接到穿梭载体上，如pKC1139等，在两个交换臂之间插入四环素抗性基因tet ^r，作为密码标记，交换臂外插入红霉素抗性等基因，如ermE，作为筛选标记，便于黑暗链霉菌DNA重组后工程菌的筛选，最终得到 pHM106。

其中转化是以E.coli ET12657(pUZ8002)介导的结合转移方法。过程是首先筛选红霉素抗性（ermE^R）菌株，无药（不含红霉素）传代后再从中筛选红霉素敏感（ermE^S）菌株，如何进一步筛选重组的转化子HM106。经发酵，采用薄层层析法（TLC法）对发酵代谢产物进行初步分析，锁定目标菌株，最后经HPLC-MS法对目标工程菌代谢产物的组分进行精确确认。

本发明获得了一株精确阻断了阿伯拉霉素生物合成，主产氨甲酰妥布霉素的工程菌，大大简化了妥布霉素的生产工艺，并降低生产成本，减少环境污染，同时提高了产品质量。可用于大规模生产妥布霉素。

附图说明

图1为阿伯拉霉素的结构式。

图2为氨甲酰卡那霉素B、氨甲酰妥布霉素的结构式。

图3为aprH-M基因功能同源交换灭活示意图；

其中I：染色体上基因位置； II：与染色体上的JHB1侧单交换； III：与染色体上的JHB2侧单交换； IV：染色体上发生了回复突变；V：:染色体上发生了双交换。

图4为 pHM106构建流程图。

图5为亲株黑暗链霉菌Tt-49与工程菌黑暗链霉菌HM106发酵代谢产物的TLC比较分析结果；

其中1为妥布霉素标准品与安普霉素标准品混合物；2为黑暗链霉菌HM106发酵代谢产物；3为野生型菌株黑暗链霉菌Tt-49的发酵代谢产物。A为妥布霉素，B为安普霉素。

图6 为亲株黑暗链霉菌Tt-49代谢产物的HPLC-MS分析图谱；峰5对应分子量540.3，是阿伯拉霉素；峰6对应分子量为511.1，是氨甲酰妥布霉素。

图7为工程菌黑暗链霉菌HM106代谢产物的HPLC-MS分析图谱；峰8对应的分子量511.1的是氨甲酰妥布霉素，未见分子量540.3的阿伯拉霉素。

图8 为提取精制得到的硫酸妥布霉素产品；峰2对应的分子量为468.1，为妥布霉素，峰1对应的分子量为511.1，为少量氨甲酰妥布霉素。

具体实施方式

实施例1：

试剂来源：pMD19-T和限制性内切酶购自TaKaRa公司，质粒pAGe（含抗性基因ermE）由上海医药工业研究所邵雷博士惠赠，质粒pBR322（含有四环素抗性基因）为本实验室保存。

本发明主要包括以下主要步骤：

1．构建aprH-M基因置换质粒

以Piepersberg等公布的安普霉素（又称阿伯拉霉素）生物合成基因簇序列( GenBank Accession Number AJ629123)作为参考，确认出发菌株黑暗链霉菌Tt-49（林玉双，洪文荣，林烨等．氨甲酰妥布霉素高产菌株选育及其发酵特性研究[J]．中国抗生素杂志，2008，33（7）：442-445）染色体DNA上阿伯拉霉素生物合成基因簇的存在。然后分别在aprH-M基因上下游设计两对引物SD1/ SD2和SD3/ SD4，以黑暗链霉菌Tt-49的总DNA（DNA提取方法见：白林泉. 链霉菌基因组中DNA大片段的基因置换与克隆[D]. 武汉：华中农业大学，1998.）为模板进行PCR扩增，获得两个片段JHB1和JHB2，其长度分别为1982bp和2029bp，扩增产物依次克隆至pMD19-T上，得重组质粒pHM102。

以质粒pBR322为模板，以T1和T2为引物扩增得到四环素抗性基因（tet ^r），克隆到pMD19-T上，得重组质粒，命名为pMT11；以质粒pAGe为模板，E1和E2为引物，扩增得到红霉素抗性基因（ermE），克隆到pMD19-T上，得到重组质粒，命名为pME12。

pMT11经XbaI单酶切后，回收四环素抗性基因（tet ^r）（1308bp），插入pHM102的XbaI位点，得到重组质粒，命名为pHM103。

pHM103经EcoRI/BglⅡ双酶切，回收5295bp片段，与pKC1139经EcoRI/BamHI 双酶切，回收的大片段进行连接，筛选得到阳性克隆子，命名为pHM105；

pME12经EcoRI单酶切后回收红霉素抗性基因（ermE）（1746bp），插入pHM105的EcoRI位点，筛选得到目标重组阳性克隆子，命名为pHM106。构建策略见图4。

表1 实施例所涉及的引物

^aRestriction enzyme site are indicated by single underlines and box

2．置换质粒pHM106转化黑暗链霉菌Tt-49

将置换质粒pHM106导入E.coli ET12567 (pUZ8002)中，得到供体菌E.coli ET12567 (pUZ8002，pHM106)。然后通过结合转移的方法转化黑暗链霉菌Tt-49（林玉双，洪文荣，林烨，等．氨甲酰妥布霉素高产菌株选育及其发酵特性研究[J]．中国抗生素杂志，2008，33（7）：442-445）孢子，37℃培养18h后用含红霉素和萘啶酸（终浓度分别为50μg／mL和25μg／mL）的水溶液覆盖，37℃继续培养4-5天长出转化子，将所获得的ermE^R转化子在含有红霉素(50μg／mL)的斜面培养基上37℃培养，筛选红霉素抗性转化子，挑取一株命名为黑暗链霉菌Tt-49 (pHM106)。

3．双交换菌株筛选与发酵代谢产物变化的定性检测

将erm ^R转化子黑暗链霉菌Tt-49 (pHM106)在不含抗生素的平板上连续传三代后，挑取单菌落分别点种到无药平板和含药(红霉素50μg/mL)平板，筛选到3个erm ^S菌株。经提取染色体作为模板，设计双交换验证引物进行PCR验证后，得到1株双交换菌株，命名为黑暗链霉菌HM106（△aprHM），以下简称黑暗链霉菌HM106。对该菌株进行发酵，过滤收集发酵液，滤液通过硅胶GF₂₅₄薄层层析发现，该菌株能正常产生氨甲酰妥布霉素，但未检测到安普霉素（图5）。滤液通过HPLC-MS定性检测，工程菌黑暗链霉菌HM106代谢产物的HPLC-MS图谱见图7；亲株黑暗链霉菌Tt-49代谢产物的HPLC-MS图谱见图6。从图6与图7的比较可以看出，工程菌HM106不再产生阿伯拉霉素，主要产生氨甲酰妥布霉素。

实施例2：黑暗链霉菌HM106代谢产物妥布霉素的制备

本发明提供的工程菌HM106可直接用于生产妥布霉素，工程菌经发酵后提取代谢产物，制备妥布霉素，作为抗菌药物。

1.黑暗链霉菌HM106工程菌的发酵培养

种子培养基：葡萄糖5g，玉米淀粉10g，黄豆饼粉15g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钾1g，氯化钙0.25g，硫酸镁5g，加自来水至1L。

发酵培养基：葡萄糖15g，玉米粉20g，黄豆饼粉35g，硫酸镁11g，碳酸钙7g，鱼粉6g，硫酸锌0.1g，硫酸铵7g，玉米淀粉20g，淀粉酶0.5g，加自来水至1L，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0-7.2。

将实例1中步骤3获得的基因工程菌黑暗链霉菌HM106进行摇瓶发酵。发酵前先用稀释平板法分离出产孢丰富的单菌落转接于斜面培养基，37℃培养5天，挖块接种于种子培养基（装量为30mL／250mL三角瓶），37℃摇床培养18 h(转速为250rpm)。按10%接种量转种于发酵培养基（装量为50mL/250mL三角瓶），37℃摇床培养120 h(转速为250rpm)。

2.代谢产物提取精制

A、粗提

将上述发酵液加10%自来水稀释，再加入盐酸，酸化至pH2.0~3.0，充分搅拌4小时；然后用氢氧化钠溶液回调至pH5.0~6.5，投入732NH₄ ⁺树脂静态吸附6~8小时。树脂投放量按5万u/mL左右计算。收集吸附饱和树脂，用自来水漂洗干净（无漂浮菌丝体为止）。饱和树脂装柱，用两倍饱和树脂体积的0.5M HCl溶液酸洗饱和树脂，再用无离子水洗涤至中性，然后改用0.01%氨水进行碱洗，当流出液达pH 9.0以上时，串联到等体积的711树脂柱上，改用4%的氨水进行洗脱，氨水用量为饱和树脂体积的8~10倍，洗脱时间控制在8~10小时，收集洗脱液，浓缩到原体积的1/10，然后于100℃水解4小时，过滤，得水解液。

B、精制与结晶

水解液用硫酸调至pH5.5~6.0（浓度控制在25~30万单位/mL）．活性炭脱色至透光度达92%以上，在搅拌下，缓慢向浓缩液中滴加入95%以上乙醇，进行结晶，时间3—4小时，之后经固液分离，85%乙醇溶液淋洗即得湿成品。湿成品经真空干燥（真空度500mmHg以上，温度600C，干燥6小时），即得硫酸妥布霉素成品，收率80%以上。经HPLC-MS分析，与妥布霉素同质，其结果见图8。

<110> 福州大学

<120> 一株产氨甲酰妥布霉素工程菌及其应用

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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aagcttagat ctttgcgcag gaccagcccg tcgatc 36

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<212> DNA

<213> 人工序列

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Claims

1.一株主产氨甲酰妥布霉素的工程菌，其特征在于，所述工程菌为黑暗链霉菌（Streptomyces tenebrarius）HM106△aprHM，其灭活阿伯拉霉素生物合成基因簇中aprH-aprM功能，已于2011年9月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No. 5246。

2.如权利要求1所述的工程菌在制备抗菌药物中的应用。