CN105200002B

CN105200002B - 产西索米星绛红色小单孢工程菌及其构建和应用

Info

Publication number: CN105200002B
Application number: CN201510704189.7A
Authority: CN
Inventors: 洪文荣
Original assignee: Fuzhou City Gulou District Rongde Biological Science & Technology Co ltd
Current assignee: Fuzhou City Gulou District Rongde Biological Science & Technology Co ltd
Priority date: 2015-10-27
Filing date: 2015-10-27
Publication date: 2019-03-15
Anticipated expiration: 2035-10-27
Also published as: CN105200002A

Abstract

本发明提供一种产西索米星绛红色小单孢工程菌及其构建和应用，属于微生物制药领域，借助产庆大霉素的绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea)GB4408，阐明genB4基因功能。通过构建重组质粒pGB403，并将穿梭质粒pGB403转化E.coli ET12567（pUZ8002）得到接合转移供体菌E.coli ET12567（pGB403/pUZ8002），筛选接合子，获得产西索米星工程菌绛红色小单孢菌GB4408，其具有独特的高产西索米星生物合成潜力的遗传特性。本工程菌的构建，国内外未见报道，满足在制备西索米星抗生素药物中的应用。

Description

产西索米星绛红色小单孢工程菌及其构建和应用

技术领域

本发明属于微生物制药领域，涉及产西索米星绛红色小单孢工程菌及其构建和应用，本发明是利用分子生物学操作技术，阐明genB4基因的功能，通过构建重组质粒pGB403，并将穿梭质粒pGB403转化E.coli ET12567（pUZ8002）得到接合转移供体菌E.coli ET12567（pGB403/pUZ8002），筛选接合子，获得产西索米星工程菌绛红色小单孢菌GB4408，其具有独特的高产西索米星生物合成潜力的遗传特性，可以应用于西索米星制造。

背景技术

氨基寡糖是重要的抗感染药物，具有重要的临床应用价值，独特的抗菌活性。经半个多世纪的长期临床应用与考验，获得了良好信誉，经久不衰，成为抗感染药物的主要类别之一。大多数氨基寡糖药物含有二到四个糖基，每个糖基被一到两个氨基修饰，整个氨基寡糖分子的氨基必须在4-6个之间。氨基太少，抗感染活性偏低；氨基太多，毒性太大，满足不了临床安全性的要求。如卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素、西索米星，G418，G52，链霉素，核糖霉素，新霉素和利维霉素等，均满足这一基本规则。

西索米星，庆大霉素、G418和G52等氨基寡糖类抗生素，均由小单孢菌所产生。西索米星产生菌为伊纽小单孢菌；庆大霉素、G418和G52等主要为绛红色小单孢菌产生。绛红色小单孢菌产生的抗生素，生物合成潜力比伊纽小单孢菌高很多，所需原材料也相对普及，没有伊纽小单孢菌那么苛刻，因此相对成本较低，也便于生产调控与管理。但伊纽小单孢菌主产西索米星。因此，产业化生产西索米星仍然采用伊纽小单孢菌。如果能获得绛红色小单孢菌产生西索米星菌株，则有望获得更高产的西索米星，进一步大幅度降低生产成本，产生更大的经济效益和社会效益。

绛红小单孢菌是庆大霉素产生菌，主要组分为庆大霉素C族复合物：C1a、C1、C2和C2a等，此外还有G418、G52和西索米星等小组分。这为从绛红色小单孢菌人工构建产西索米星工程菌提供了生物学功能基础。随着分子生物学技术的发展，为从绛红色小单孢菌构建西索米星产生菌提供了可能。随着生物信息学和基因工程技术的快速发展，为基因工程定向育种奠定了基础。2012年我们公布了国内第一例庆大霉素生物合成基因簇，并在基因库登记（GenBank accession No.：JQ975418，44181bp）。同时建立了系统的绛红小单孢菌接合转移体系，为获得重要的庆大霉素生物合成代谢中间体，奠定了坚实基础。

尽管西索米星已经应用于临床，产业化生产也有几十年，但生产成本仍居高不下。如果能获得更高产，工艺要求更灵活，适应性更强的菌株，显然产业化产生的经济效益与社会效益将会更好。因此，从绛红色小单孢菌构建产西索米星工程菌就显得很有必要，很值得研究与开发。

但困难主要是，当前，国内外至今未能全部阐明庆大霉素、西索米星生物合成基因簇中的所有基因功能，更谈不上阐明它们的生物合成调控机制。因此，从绛红色小单孢菌构建产西索米星工程菌，也就成了国际性难题。

发明内容

本发明的目的在于提供产西索米星绛红色小单孢工程菌及其构建和应用，本发明通过研究绛红色小单孢菌系列genB相关结构基因的功能，阐明了与西索米星生物合成有关的关键基因genB4，结合传统育种方法，获得了代谢途径以庆大霉素C1a为主的出发菌株，在理论研究的基础上，成功构建了适合产业化的产西索米星绛红色小单孢工程菌。本研究成果国内外未见报道，取得了实用性效果，可以用于西索米星产业化生产。

为实现上述目标，本发明采用如下技术方案：

内容包括：通过阐明genB4基因功能。通过构建重组质粒pGB403，并将穿梭质粒pGB403转化E.coli ET12567（pUZ8002）得到接合转移供体菌E.coli ET12567（pGB403/pUZ8002），筛选接合子，获得产西索米星工程菌绛红色小单孢菌，该菌株命名为绛红小单孢菌GB4408（Micromonospora purpurea GB4408），已于2015年10月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保蒇，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.11483。

本发明阐明genB4基因功能为阻断从西索霉素到庆大霉素C1a的转化以及从威大霉素到庆大霉素C2的转化，其机制是参与庆大霉素绛红糖胺C4′和C5′的双脱氢作用。通过构建重组质粒pGB403，并将穿梭质粒pGB403转化E.coli ET12567（pUZ8002）得到接合转移供体菌E.coli ET12567（pGB403/pUZ8002），筛选接合子，获得产西索米星工程菌绛红色小单孢菌GB4408。

本发明通过构建重组质粒pGB403，并将穿梭质粒pGB403转化E.coli ET12567（pUZ8002）得到接合转移供体菌E.coli ET12567（pGB403/pUZ8002），筛选接合子，获得产西索米星工程菌绛红色小单孢菌，主要包括以下几个步骤：

A.阐明genB4基因功能；

B.构建敲除genB4基因穿梭载体；

C.穿梭载体导入绛红小单孢菌；

D.接合子的筛选；

E.产西索米星工程菌的鉴定。

本发明的优点在于：以绛红色小单孢菌生产西索米星，所需原材料来源方便，价廉，可以大大降低发酵生产成本；阻断了庆大霉素C1代谢途径的生物合成，彻底割除了这一代谢途径结构相似各组分的合成，方便西索米星的提取精制，大大降低了提取生产工序；无需层析分离，便能获得高纯度的西索米星，达到绿色环保型的现代化生产要求；经筛选获得了主产庆大霉素C1a的菌株，作为基因工程优化的出发菌株，经基因改造后，西索米星生产力仍然很高，满足产业化要求；在国际上，首次阐明了genB4基因的功能。

附图说明

图1：西索米星（sisomicin）化学结构式。

图2 质粒pGB403酶切电泳检测图， 1：DL 5000 Marker；2：XbaⅠ/EcoRⅠ；其中A图为pGB403质粒；B图为pGB403质粒酶切电泳检测图。

图3GB4408接合子的PCR检测鉴定: 1:DL5000 Marker; 2:G1008(P5/P6); 3:GB41(P5/P6); 4:GB4408(P5/P6)；其中A图为灭活genB4基因示意图；B图为敲除genB4基因的PCR检测图。

图4 GB4408代谢产物的HPLC检测结果：其中A图为出发菌株G1008代谢产物作对照；B图为GB4408代谢产物的HPLC检测结果。

图5 GB4408工程菌代谢产物质谱分析结果；其中A图为出发菌株G1008代谢产物作对照；B图为GB4408代谢产物的质谱检测结果。

图6 GbKB4发酵代谢产物质谱分析图；其中A图为GB4408代谢产物的质谱检测结果，作对照；B图为GbKB4工程菌代谢产物的质谱检测结果。

图7 GbKB4工程菌发酵代谢产物HPLC分析结果。

具体实施方式

实施例1

基因genB4功能的阐明：

以在Genebank登记的庆大霉素生物合成基因簇（登录号：JQ975418）为模板，利用生物信息学软件Vector NTI11.5设计两对引物，扩增genB4基因上下游序列作为同源交换臂：引物P1/P2用于扩增上游交换臂B41，引物P3/P4用于扩增下游交换臂B42。设计引物P5/P6用于genB4基因阻断突变株的检测。引物与扩增片段长度如图2所示，引物序列及其限制性酶切位点见表1。

表1 基因genB4 功能研究相关引物

1重组质粒pGB403的构建

提取绛红色小单孢菌G1008基因组DNA，作为模板。PCR扩增genB4上下游交换臂B41和B42。将两条交换臂分别克隆至pMD19-T载体，得到中间质粒pGB401和pGB402。质粒pGB401用Hind Ⅲ和EcoRⅠ酶切，回收1963bp片段；质粒pGB402用Hind Ⅲ和XbaⅠ酶切，回收2019 bp片段；pKC1139用XbaⅠ和EcoRⅠ酶切，回收6446 bp片段。将以上三个片段酶连，酶连样转化Top10感受态细胞，筛选阳性克隆子，最终获得重组质粒pGB403。用EcoRⅠ和XbaⅠ对pGB403进行酶切，理论上可以获得6446bp和3994bp两条带。酶切样经电泳，检测到有两条带，与理论预测相符，最后通过测序，证明质粒pGB403为目标质粒(图2)。

2 GB4408菌株的构建

将重组质粒pGB403转化E.coli ET12567（pUZ8002）得到接合转移供体菌E.coliET12567（pGB403/pUZ8002）。以绛红色小单孢菌的孢子作为接合转移受体菌。按照接合转移方法，将孢子悬液与供体菌混合，稀释涂布于平板培养基后，37℃培养约10h，用含安普霉素和萘啶酸的水溶液覆盖，继续培养一周，直至在平板上长出接合子。

选取一株长势较好的接合子，提取基因组DNA，用P5/P6引物进行PCR扩增检测。得到两条片段，分别为1241bp和512bp，证明其为单交换工程菌。PCR产物电泳检测结果与预期相符（图3B），表明重组质粒pGB403已成功整合到绛红色小单孢菌G1008，命名为小单孢菌GB41。质粒pGB403与G1008同源重组示意图见图3A。

将单交换菌株GB41于37℃、不含抗生素的斜面上松弛培养3代，然后分离单菌落，通过单菌落影印点板方法进行筛选。从408株菌株中获得2株在抗性平板上不长，在无药平板上正常生长的单菌落，选取其中一株长势良好的菌株，提取基因组DNA，利用双交换鉴定引物P5/P6进行PCR检测。结果检测到512bp和1241bp的片段，认为是双交换工程菌，如图3B。将该菌株命名为绛红色小单孢菌GB4408，简称GB4408。将PCR产物进行测序，结果证明GB4408工程菌确实为目标工程菌。

菌株代谢产物分析

GB4408的发酵液经732-NH₃ ⁺树脂吸附，5%氨水解析，乙醇沉淀等处理后，获得粗制样品，进行TLC分析，与标准品相比，结果是不再合成庆大霉素C1、C1a、C2等庆大霉素C族组分，转而合成其它庆大霉素中间体。

对GB4408代谢产物进行HPLC分析，检测结果见图4，庆大霉素标准品各组分的保留时间分别为：C1（5.98min），C1a（14.58min），C2a（18.57min），C2（21.05min）；GB4408的粗制样品存在3个主峰，保留时间分别为7.68min、18.72min和20.12min，与庆大霉素标准品的保留时间无一相符。进一步证明GB4408的代谢产物没有庆大霉素C族组分。

GB4408代谢产物的组分，经MS分析，结果见图5。主要离子峰有4个，分别为448.3（西索霉素）、462.3（威大霉素）、476.3（威大霉素C6′位甲基化产物）、497.3（G418）四种组分。231.6和249.1分别为威大霉素和G418的双电荷峰，322.2为碎片峰。

4 基因genB4功能的阐明

以上结果说明，genB4基因的失活，阻断了从西索霉素到庆大霉素C1a的转化以及从威大霉素到庆大霉素C2的转化，推测genB4基因参与庆大霉素绛红糖胺C4′和C5′的双脱氢作用。

实施例2

庆大霉素C1a高产菌株选育

以庆大霉素产生菌G1008为出发菌株，经紫外线诱变，单菌落分离纯化，发酵，提取，代谢产物结构确定等检测，确定庆大霉素C1a组分逐步提高的突变株。经48代、三年多的定向育种，得到了主产庆大霉素C1a亚出发菌株绛红色小单孢菌Gb，供下一步基因重组使用，构建产单组份西索米星工程菌。

实施例3

GbKB4工程菌的构建

按照类似实施例1的方法，将质粒pFD306（本研究系列专利：201110331534.9）导入供体菌，得到供体菌E.coli ET12567/（pFD306/pUZ8002）。将供体菌与绛红色小单孢菌Gb的孢子进行接合转移，7天后，在MS平板上长出接合子，挑取长势良好的一株，命名为GbK。将其转接至小单孢菌种子培养基，松弛培养4代后开始分离单菌落，并影印到含50µ/mL安普霉素和不含抗生素的平板上，筛选获得工程菌GbK（△genK），提取其基因组DNA，用引物P5/P6进行PCR验证，电泳检测和DNA测序，确认为目标工程菌。

按照以上类似敲除△genK的方法，将质粒pGB403导入供体菌E.coli ET12567，得到供体菌E.coli ET12567/（pGB403/pUZ8002）。将供体菌ET12567/（pGB403/pUZ8002）与GbK（△genK）的孢子进行接合转移，7天后，在MS平板上长出接合子，挑取长势良好的一株，命名为GbKB4-1。将其转接至小单孢菌种子培养基，松弛培养4代后开始分离单菌落，并影印到含50µ/mL安普霉素和不含抗生素的平板上，筛选获得绛红色小单孢工程菌GbKB4（简称GbKB4），提取其基因组DNA，用引物P5/P6进行PCR检测，DNA测序，结果与理论推测吻合，为目标工程菌。

实施例4：

工程菌发酵及产物提取分析

1 工程菌GbKB4的发酵

种子培养基：葡萄糖0.5%，玉米淀粉1.0%，玉米粉1.5%，蛋白胨0.2%，黄豆饼粉1.0%，KNO₃ 0.05%，CaCO₃ 0.5%，pH7.0。

发酵培养基：淀粉6.0%，玉米粉1.0%，蛋白胨0.4%，花生饼粉2.0 %，NaNO₃ 0.01%，NH₄Cl 0.1%，CaCO₃ 0.5%，pH7.5。

绛红色小单孢菌GbKB4的发酵。工程菌GbKB4转接斜面培养基，在37℃下培养10天，待斜面孢子成熟，用接种针刮取1cm²孢子至种子培养基。在280rpm/min条件下，37℃摇床上，培养40小时，深沉培养进入对数生长期时，按5%接种量转接于发酵培养基（装量为40mL/250mL三角瓶），35℃摇床发酵120 h(转速为280rpm)。

20000升发酵罐生产，搅拌转速180转/分钟，通气量1：0.5~0.8 (M³ /M³·min)，培养基，培养温度，接种量比例，发酵时间等，类似于摇瓶发酵，放罐发酵单位达到1728 μ/ml。

2 代谢产物提取

A、粗提

发酵液稀释后酸化，碱回调到pH6.8后，用732-NH₄ ⁺树脂静态吸附4小时。收集吸附饱和树脂，用0.01M HCl溶液酸洗饱和树脂，再用无离子水洗涤至中性，再用pH7.5氨水进行碱洗，碱洗体积不少于饱和树脂体积的12倍。然后串联到等体积的711树脂柱上，收集树脱液。

组分分析，采用质谱检测，结果见图6。与GB4408代谢产物不同，GbKB4工程菌主要离子峰为448[M+H]⁺、470[M+Na]⁺、486[M+K]⁺与西索霉素分子量同质。次要离子峰为483[M+H]⁺与中间代谢产物庆大霉素X2同质。242[M+H]⁺为庆大霉素X2双电荷峰，其它峰为碎片峰。

B、精制

洗脱液经薄膜浓缩到约300000ug/mL，用浓硫酸调至pH5.5~6.0，加5%活性炭脱色，透光度达92%以上，过滤去除固体物，得透明澄清溶液。在搅拌下，缓慢向浓缩液中滴加95%以上乙醇，进行过夜结晶，之后经离心分离，85%乙醇溶液淋洗即得湿成品。经真空干燥（真空度500mmHg以上，温度60⁰C，干燥6小时），得代谢产物精制品。

工程菌GbKB4代谢产物分析

工程菌GbKB4发酵代谢产物，经HPLC分析，结果见图7。参照检测庆大霉素所使用的流动相进行分析，西索霉素出峰的保留时间为18.64min，确认为西索霉素。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州市鼓楼区荣德生物科技有限公司

<120> 产西索米星绛红色小单孢工程菌及其构建和应用

<130> 6

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gaattccgaa caccatgcat cagcag 26

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aagcttgttg atgttcgacg tggtgc 26

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<212> DNA

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aagcttaacg tcgtaccgta gtcccg 26

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<211> 26

<212> DNA

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tctagaggtc ggtttcgggt acaacg 26

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<212> DNA

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<400> 5

ttccgcccgg atcagttctg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgacggacc tgtcgggcaa 20

Claims

1.产西索米星绛红色小单孢工程菌，其特征在于：所述工程菌为绛红小单孢菌GB4408（Micromonospora purpurea GB4408），已于2015年10月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保蒇，保藏编号为CGMCC No.11483。

2.如权利要求1所述的产西索米星绛红色小单孢工程菌在制备西索米星抗生素药物中的应用。