CN104004681A - 一种产庆大霉素C2a工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗生素制药领域，涉及一种主要产生庆大霉素C2a工程菌及其应用。通过分析绛红小单孢菌庆大霉素生物合成过程，结合生物信息学预测，定向改造庆大霉素生物合成代谢流，提高庆大霉素C2a这一组分的积累，同时大大降低其它组分C1a、C1、C2的积累。采用基因框内敲除的方法，灭活庆大霉素生物合成过程中的差向异构酶基因genB2，包括穿梭质粒pZB303的构建，pZB303转化至绛红小单孢菌G1008，筛选阻断工程菌，发酵生产，代谢产物检测和组分分析。本发明主产庆大霉素C2a，填补了国内外至今无法产业化生产庆大霉素C2a的空白，利用该工程菌生产C2a，工艺简单、成本低，在抗生素制药领域具有极大的应用前景。

Description

一种产庆大霉素C2a工程菌及其应用

技术领域

本发明属抗生素制药领域，涉及一种主产庆大霉素C2a【图1】工程菌及其应用。利用基因工程和微生物分子遗传学技术，阐明庆大霉素生物合成基因genB2（GenBank accession No.：AJ628149，genB2； AY524043.1，gntL；AJ575343.3，gacJ）的功能，并在绛红小单孢菌G1008中敲除genB2，获得一株主产庆大霉素C2a的工程菌，可用于工业化生产庆大霉素C2a。 

背景技术

微生物是生产药物的主要来源。利用绛红小单孢菌和棘孢小单孢菌来生产庆大霉素都是多组分复合物，如庆大霉素C1，C2，C1a，C2a和ABX族，导致临床使用的庆大霉素至今仍然是多组分复合物C1、C2、C1a和C2a。庆大霉素C族以2-脱氧链霉胺为核心，分别在4、6位上通过糖苷键连接绛红糖胺和加拉糖胺而成。因绛红糖胺C-6′上甲基化程度的差异，形成了C1、C1a、C2a和C2等不同组分。在C-6′位置上有甲基的为C1，而C1a、C2和C2a没有甲基，因此C1a、C2和C2a比C1多了一个游离氨基，而C2a与C2是一对立体差向异构体。多组分药物，特别是差向异构体药物，对临床用药非常不便，也非常不利。世界卫生组织，发达国家一直提倡临床治疗，采用单组份药物，特别是非差向异构体药物。科学家通过传统技术，现代技术，进行菌株选育，期望得到庆大霉素单组分产生菌，但困难重重，至今未能如愿以偿。 

随着基因工程技术的快速发展，新霉素和丁酰苷菌素生物合成过程已经基本阐明。庆大霉素生物合成基因的研究也逐步取得突破，不同产生菌中的生物合成基因簇被陆续克隆出来。至2012年，本课题组公布了绛红色小单孢菌G1008中的庆大霉素生物合成基因簇（GenBank accession No.：JQ975418），44181bp。随着小单孢菌分子遗传学操作体系的建立，庆大霉素系列单组份工程菌的构建逐步展开，并取得了实质性突破，为定向改造庆大霉素产生菌，获得单组份工程菌奠定了基础。 

发明人首次完成了主产庆大霉素C1a工程菌的构建，填补了国内外研究空白，申请了发明专利（201110331534.9；一株产庆大霉素C1a的工程菌及其应用），本发明是该授权专利的进一步延伸与深化，属系列性发明专利。 

庆大霉素的生物合成从X2开始，只对绛红糖胺进行修饰，通过对卡那霉素、妥布霉素和庆大霉素生物合成基因簇比较，推测genB1、genB2、genB3和genB4为B型的氨基转移酶基因，其中genB2可能与C-6′ 位差向异构化有关，即庆大霉素C2a转变成C2。本发明通过破坏绛红色小单孢菌G1008中基因genB2的功能，得到主产庆大霉素C2a工程菌。 

 发明内容

本发明通过微生物分子遗传学操作体系，借助基因工程技术，敲除庆大霉素生物合成中的关键基因genB2，防止庆大霉素C2a被进一步转化为庆大霉素C2，从而构建了一株主产庆大霉素C2a的工程菌，命名为绛红色小单孢菌（Micromonospora purpurea） GB102。该工程菌遗传性状稳定，不易发生回复突变。已于2014年4月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏地址为北京朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 9112。

本发明的目的是提供一种主产庆大霉素C2a的工程菌及其应用。 

在产庆大霉素放线菌的基因组中灭活genB2基因，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。敲除基因的DNA序列为genB2的DNA序列。灭活genB2基因的方法包括基因敲除和基因置换。 

一种产庆大霉素C2a工程菌的制备方法，其特征是，主要包括以下步骤： 

(1)   灭活genB2同源重组质粒的构建；

(2)   灭活genB2同源重组质粒转化绛红小单孢菌；

(3)   灭活genB2单交换菌株的筛选；

(4)   灭活genB2基因工程菌的筛选；

(5)   灭活genB2基因工程菌代谢产物的鉴定。

 基因敲除的方法为PCR扩增genB2基因上下游序列大约2000bp的两个片段作为同源交换臂，按顺序连接到穿梭质粒pKC1139中，得到同源重组质粒pZB303。 

所述的转化方法为大肠杆菌ET12567/pUZ8002介导的接合转移方法。 

所述灭活genB2基因工程菌的筛选为先获得阿泊拉霉素抗性菌株，松弛培养后再从中筛选到阿泊拉霉素敏感菌株，再通过PCR验证得到genB2基因阻断工程菌。 

所述的鉴定为采用薄层层析法、高效液相分析和MS分析其代谢产物。 

一种产庆大霉素C2a工程菌在制备抗菌药物和抗生素药物中的应用。 

本发明通过框内敲除绛红色小单孢菌中genB2的DNA序列，灭活其功能，主要包括以下步骤： 

（1）    genB2同源重组质粒pZB303的构建；

基于PCR技术，分别获得genB2基因上下游序列，大约2000bp的两个片段，作为同源交换臂，按顺序连接到穿梭质粒pKC1139上，得到同源重组质粒pZB303【图2】。

（2）    genB2同源重组质粒转化绛红小单孢菌； 

质粒pZB303先转入E.coli.ET12567/pUZ8002，得到E.coli.ET12567/ pUZ8002/pZB303，然后通过E.coli.ET12567/pUZ8002/pZB303介导，转入绛红色小单孢菌。

（3）    genB2单交换菌株的筛选； 

以阿泊拉霉素抗性基因为筛选标记，获得阿泊拉霉素抗性菌株。

（4）    genB2基因敲除工程菌的筛选； 

单交换菌株于无抗生素平板培养三代后，从中筛得阿泊拉霉素敏感菌株，经PCR初检，提取染色体基因组，再通过PCR扩增其特定位点的genB2序列，并对所扩增的DNA测序，证明genB2 基因的DNA序列被敲除，基因被灭活，获得工程菌。

（5）    genB2基因阻断工程菌代谢产物结构确定； 

代谢产物分析：工程菌发酵液经酸碱处理，树脂吸附，洗脱液脱色，乙醇沉淀精制后，采用薄层色谱（TLC）法、高效液相色谱（HPLC）法和质谱（MS）法，对代谢产物结构进行确定。

 本发明的工程菌，主要产生庆大霉素C2a，在抗菌药物和抗生素制药领域，应用前景广阔。通过框内敲除genB2基因的618bp碱基序列，灭活其功能，得到一株主产庆大霉素C2a的工程菌。通过扩增genB2的上下游序列大约为2000bp作为同源交换臂，发生同源重组的概率大大提高，便于得到目的菌株。 

基因genB2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。 

本发明的优点在于：通过微生物分子遗传学技术，在国际上，首次通过生物学实验，而不是理论分析与预测，阐明了genB2基因的功能与庆大霉素C2a转化为庆大霉素C2有关。然后借助现代基因工程定向育种法，敲除庆大霉素生物合成的关键基因genB2，得到主产庆大霉素C2a工程菌。该工程菌遗传性状稳定，不易回复突变，产抗能力强，工艺简单，成本低，可应用于工业化生产，制备单组份庆大霉素C2a，填补国内外研究空白，具有巨大的潜在经济效益和社会效益。 

附图说明

图1庆大霉素C2a的化学结构。 

图2 同源重组质粒pZB303及其酶切验证图。其中ZB1为上游交换臂，ZB2为下游交换臂；M：λ-EcoT14 I digest DNA Marker；1/2：pZB303 / XhoⅠ酶切。 

图3 敲除genB2基因的同源重组原理图，其中I：游离质粒pZB303； II：亲株G1008染色体组； III：GB102染色体组；PB1/PB2上游交换臂引物，PB3/PB4下游交换臂引物，PB5/PB6双交换验证引物。 

图4工程菌GB102 基因组的PCR验证图。M：marker DL5000；1：G1008/(PB5/PB6)；2：GB21/(PB5/PB6)；3：GB102/(PB5/PB6)。 

图5工程菌GB102代谢产物的TLC分析图，1：庆大霉素标准品；2：GB102代谢产物。 

图6工程菌GB102的代谢产物HPLC分析结果，保留时间：5.126min为C1； 11.579min为C1a；14.528min为C2a；16.886为C2；6.501min为过量衍生剂，14.502min为C2a。 

图7工程菌GB102的代谢产物质谱（MS）分析结果，亲株G1008主要为庆大霉素C1和C2；突变株GB102主要为庆大霉素C2a，只有微量庆大霉素C1和C1a。 

具体实施方式

实施例1： 

1、同源重组质粒pZB303的构建

根据2012年本研究室公布的绛红色小单孢菌G1008庆大霉素生物合成基因簇（GenBank accession No.：JQ975418，44181bp），设计genB2基因框内缺失的方案（图3），合成引物（PB1/PB2），用于扩增上游交换ZB1；引物（PB3/PB4）用于扩增下游交换臂ZB2。PB1（5′- TCTAGATGTAGAGCTCGTCCGCCGCCA -3′，XbaI），PB2（5′- AAGCTTAAGGTCCCCGGCGATCTGCTC -3′，HindⅢ），PB3（5′- AAGCTTAAGATGATCAGCACCCGCGAT C-3′，HindⅢ），PB4（5′- GAATTCAATGTGGAGAACGGAGCAGACAG -3′，EcoRI）。

以绛红小单孢菌G1008的基因DNA为模板，选择高保真酶Extaq为DNA聚合酶，设计PCR扩增反应体系和条件为：95℃预变性5min，94℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸1min，72℃保持10min，4℃保存。扩增genB2的上游序列为同源交换臂ZB1，克隆至pMD19-T，得到中间质粒pZB301（pMD19-T::ZB1）；同样，扩增genB2的下游序列作为同源交换臂ZB2，克隆至pMD-19T，得到中间质粒pZB302（pMD19-T::ZB2）. 

质粒pZB301经XbaⅠ/ HindⅢ双酶切，回收大小为1910bp的交换臂ZB1；质粒pZB302经HindⅢ/EcoRⅠ双酶切，回收大小为1990bp的交换臂ZB2；与此同时，穿梭质粒pKC1139也经XbaⅠ/EcoRⅠ双酶切，回收6500bp的载体片段。三个片段：载体、交换臂ZB1和ZB2经混合，T4DNA连接酶酶连，转化大肠杆菌top10感受态细胞，在含有阿泊拉霉素的LB平板上筛选阳性克隆，提取得到大小为10647bp的最终质粒pZB303 （pKC1139 :: ZB1-ZB2）。其酶切验证见图3，质粒pZB303存在三处XhoⅠ酶切位点，可将质粒切成5711bp、3126bp、1521bp三个片段，电泳条带与理论预测相符，测序结果证明正确。

2、同源重组质粒转化绛红小单孢菌 

将重组质粒pZB303转化大肠杆菌ET12567/pUZ8002感受态细胞，在含有阿泊拉霉素、氯霉素和卡那霉素的LB平板上培养过夜，挑取抗性菌落，提取质粒，验证正确，得到大肠杆菌E.coli ET12567/（pUZ8002/pZB303）供体菌。培养供体E.coliET12567（pUZ8002/pZB303）转接到含相应抗生素的LB培养基中，37℃振荡培养；当OD600为0.6时收集菌体（约3~4h），并用新鲜的LB培养基洗涤2次，再用LB液体培养基重悬备用；将绛红色小单孢菌孢子悬浮于5mL pH8.0的0.05mol/L TES（2-[(三(羟甲基)甲基)氨基]-1-乙磺酸）缓冲液中，60℃水浴热激2min，待其冷却至室温后加入等体积预萌发培养基，37℃振荡（250r/min）培养3h；离心收集孢子并重悬于适量的无菌水中，在混合器上振荡打散孢子，按大约10⁸：10⁸与大肠杆菌细胞等量混合，涂布在绛红色小单孢菌平板培养基上，于37℃培养24h后，用含阿泊拉霉素和萘啶酸溶液覆盖，使两种抗生素的终浓度分别为50μ/mL 和25μ/mL，置37℃培养3-5天，直至长出接合子。

3、单交换菌株的筛选 

根据同源重组原理（图3），设计双交换筛选引物（PB5/PB6），若在genB2特定位点发生单交换，对菌株基因组PCR，可以扩增到1816bp和1156bp的两个片段，回复突变株或亲株可以扩增出1816bp的片段，而genB2阻断突变株只可以扩增出1156bp。设计阿泊拉霉素抗性基因引物（PA1/PA2）。PB5（5′- GCCCGATCGGAACGTGACG -3′），PB6（5′- TGCGCAACCTCCGGACCAC -3′），PA1（5′- CATTCTTCGCATCCCGCCTCTG -3′），PA2（5′-TCAGCGGTGGAGTGCAATGTCG -3′）。

将接合子转接到含有25μg/ml萘啶酸和50μg/ml阿泊拉霉素的平板培养基上，培养3代，彻底清除可能含有的大肠杆菌和绛红小单孢菌亲株。挑取其中长势较好的一株，命名为绛红小单孢菌GB21，简称为GB21。提取基因组DNA。用扩增阿伯拉霉素抗性基因引物（PA1/PA2）扩增到700bp左右条带；用双交换筛选引物（PB5/PB6）进行PCR扩增，获得1816bp和1156bp两个条带，与预测吻合。 

4、genB2基因阻断工程菌的筛选 

将绛红小单孢菌GB21转接斜面，松弛培养3代后，开始分离单菌落，直至第八代。单菌落影印到含50μg/ml阿泊拉霉素的抗性平板上和无抗生素的普通平板上。根据同源重组原理，单交换菌发生第二次重组之后，会失去阿泊拉霉素抗性基因，对阿泊拉霉素敏感。因此，在阿伯拉霉素平板上不长，而对应在普通平板上正常生长的菌株，可能为genB2缺失菌株或者回复突变株。

获得的其中一株阿泊拉霉素敏感型菌株，命名为绛红色小单孢菌GB102，简称GB102。提取基因组DNA，并以亲株G1008和单交换菌株GB21的基因组DNA作对照，用双交换筛选引物PB5/PB6进行PCR鉴定。PCR产物电泳检测见图4。GB102基因组只扩增到1156bp左右的片段，经测序，结果与预测吻合，因此，绛红小单孢菌GB102为genB2敲除工程菌。 

  

实施例2：

1、工程菌GB102的发酵

种子培养基：葡萄糖0.1%，玉米淀粉1.0%，玉米粉1.5%，蛋白胨0.2%，黄豆饼粉1.0%，KNO₃ 0.05%，CaCO₃ 0.5%，pH7.0。

发酵培养基：玉米淀粉6.0%，玉米粉1.0%，蛋白胨0.4%，黄豆饼粉2.0 %，KNO₃ 0.01%，(NH₄)₂SO₄ 0.1%，CaCO₃ 0.5%，淀粉酶0.025%，pH7.5。 

实例1中获得的绛红色小单孢菌GB102的发酵。工程菌GB102转接斜面培养基，在37℃下培养8-9天，待斜面生成丰厚孢子，用接种针刮取1㎝²孢子至种子培养基。在280rpm/min，37℃摇床培养28-36小时，深沉培养进入对数生长期时，按10%接种量转接于发酵培养基（装量为50mL/250mL三角瓶），37℃摇床发酵120 h(转速为280rpm)。 

20000升发酵罐生产，搅拌转速180转/分钟，通气量1：0.5~1.0  (M³ /M³·min)，培养基，培养温度，接种量比例，发酵时间等，类似于摇瓶发酵。 

2、代谢产物提取 

A、粗提

发酵液稀释后分别酸化、碱化后，用732-NH₄ ⁺树脂静态吸附4小时。收集吸附饱和树脂，用0.01M HCl溶液酸洗饱和树脂，再用无离子水洗涤至中性，再用0.01%氨水进行碱洗，当流出液达pH 9.0以上时，串联到等体积的711树脂柱上，收集树脱液。

B、精制、结晶 

洗脱液经薄膜浓缩到约300000ug/mL，用浓硫酸调至pH5.5~6.0，加5%活性炭脱色，透光度达92%以上，过滤去除固体物，得透明澄清溶液。在搅拌下，缓慢向浓缩液中滴加入95%以上乙醇，进行过夜结晶，之后经离心分离，85%乙醇溶液淋洗即得湿成品。经真空干燥（真空度500mmHg以上，温度60⁰C，干燥6小时），得代谢产物精制品。

3、代谢产物分析 

薄层色谱分析（TLC）：按照中华人民共和国药典（2010版），展开剂系统配制如下，氯仿：甲醇：氨水（25%）=1:1:1，配制15ml混合溶液，静置2h，取下层溶液作为展开剂。TLC检测结果见图5（1是庆大霉素标准品，2是GB102代谢产物），从中可以看出，工程菌GB102主产庆大霉素C2a，C2，少量C1a。

高效液相色谱分析（HPLC）：参照中国人民共和国药典2005版。用碳十八硅胶为填充剂；以水-冰醋酸-甲醇（25 : 5 : 70）配制的庚烷磺酸钠溶液（0.02mol/L）为流动相；检测波长为330nm. 取样品适量，加入适量的邻苯二甲醛和异丙醇，混匀后置于60℃水浴中加热15min，冷却，过滤，量取10μl注入高效液相色谱仪。HPLC分析结果见图6，庆大霉素标准品各组分的保留时间：C1（5.13min），C1a（11.58min），C2a（14.53min），C2（16.89min）；GB102的粗制样品则存在两个主峰，其中14.50min与C2a的保留时间一致，确定为C2a组分，而6.50min的峰为衍生剂的峰；在5.13min和11.58min存在微小峰，是微量的C1和C1a。C2（16.98min）则完全没检测到。 

质谱分析（MS）：安捷伦6520四级杆飞行时间串联质谱仪，参数设置：ESI ( + ), 100～800m/z；流速，8.0 L·min^-1；温度，350℃；喷雾器压力，2.07×105 Pa；Vcap 3500 V；碰撞电压，135 V.  MS检测结果见图7，主要分子量为464的物质，以及其双电荷峰232，对应于HPLC中主峰 C2a；少量的分子量为450和478物质，对应于HPLC中的C1a和C1。322.6为碎片峰。 

综合TLC、HPLC和MS分析结果表明，工程菌GB102主要积累庆大霉素C2a，微量C1a和C1，而检测不到C2。 

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。   

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  福州市鼓楼区荣德生物科技有限公司

 <120>  一种产庆大霉素C2a工程菌及其应用

 <130>  10

<160>  10   

 <170>  PatentIn version 3.3

 <210>  1

<211>  1245

<212>  DNA

<213>  基因genB2核苷酸序列

 <400>  1

atgattattg ccaacgctga cgggtgcacg ccgtacgagg tggcgcgggg tgtcaccatc     60

 

gtccgtggcg aaggcgccta cgtgtacgac gcggagggtc gaggcctcat cgacctctcc    120

 

aactccttcg gcagcgtgat gctcgggcac caggacccgg tggtcaccga agccgtgctg    180

 

aagacggtgc gctcgggcgt cccggcggcg gcctcgctcg acctgcagaa ccgcctggcc    240

 

gagcagatcg ccggggacct tcccggtgac cagcgggtgg cgttcttcaa gacgggcacc    300

 

gccgcgaccc gggccgccgc ctcggccgcg cgccaggtga ccggcaagcg gctcatcgcc    360

 

agctgcggtt accacgggta cgacctgatg tgggagttca ccccgccggg ccagcccaac    420

 

tccgaggacg tgctgcactg ctaccacctg ccggagctga tcgaccaggt cctcgacaag    480

 

cacgccaacg aactggccgc cgtgatcatc gcgccggact acatccacgt ctcgccggag    540

 

tacatcgccg acctgttcga acggtgcgag cgggtcgggg tggtcaccat cgccgacgag    600

 

gtgaagcacg gttaccgtct ccggcagggc gcctcggtca ccgaggcgag cgtcgtggcg    660

 

gacatgtaca cgtacgccaa ggggatcagc aacggctggc cgctctcctg cgtggccggc    720

 

gacgagcggt tcctgaagcc gctggccgag ttcgtctcga ccctcacctt cgaggcaccc    780

 

agcttcgcgg cggcctcggc gaccctcgac cggctggccg agctggacgt ccaggcgcag    840

 

ctggccatcg acggtgcccg gttcgtgtcc gaggcggcca agatgatcag cacccgcgat    900

 

ctgccgatcg agatggccgg caccggggcc gcgttccagt tcgtctgtgc tccggaggtg    960

 

gaggaggtcc tcctgccgca cgccctggcc gaggggctca tcctcgaacc gtccgaccag   1020

 

cagtacccgt ccgcgtgctt ccgcggcgag gtggtcgacg aggcgctcga ccggctcgac   1080

 

cgcgcgctga ccacgatggc cgccgcgcgg cccgacctgg tcggacgcga ggtgacccag   1140

 

ctcgaccggg tcaacgcggc cttctgccag atggacggcc tgccgggccg gccggacggc   1200

 

tggagcctcg accagtgcgt ggagtacgtg accgctcagc tctga                   1245

 <210>  2

<211>  414

<212>  PRT

<213>  基因genB2编码的氨基酸序列

 <400>  2

 Met Ile Ile Ala Asn Ala Asp Gly Cys Thr Pro Tyr Glu Val Ala Arg

1               5                   10                  15     

 Gly Val Thr Ile Val Arg Gly Glu Gly Ala Tyr Val Tyr Asp Ala Glu

            20                  25                  30         

Gly Arg Gly Leu Ile Asp Leu Ser Asn Ser Phe Gly Ser Val Met Leu

        35                  40                  45             

Gly His Gln Asp Pro Val Val Thr Glu Ala Val Leu Lys Thr Val Arg

    50                  55                  60                 

Ser Gly Val Pro Ala Ala Ala Ser Leu Asp Leu Gln Asn Arg Leu Ala

65                  70                  75                  80 

 

 

Glu Gln Ile Ala Gly Asp Leu Pro Gly Asp Gln Arg Val Ala Phe Phe

                85                  90                  95     

Lys Thr Gly Thr Ala Ala Thr Arg Ala Ala Ala Ser Ala Ala Arg Gln

            100                 105                 110        

Val Thr Gly Lys Arg Leu Ile Ala Ser Cys Gly Tyr His Gly Tyr Asp

        115                 120                 125            

Leu Met Trp Glu Phe Thr Pro Pro Gly Gln Pro Asn Ser Glu Asp Val

    130                 135                 140                

Leu His Cys Tyr His Leu Pro Glu Leu Ile Asp Gln Val Leu Asp Lys

145                 150                 155                 160

His Ala Asn Glu Leu Ala Ala Val Ile Ile Ala Pro Asp Tyr Ile His

                165                 170                 175    

Val Ser Pro Glu Tyr Ile Ala Asp Leu Phe Glu Arg Cys Glu Arg Val

            180                 185                 190        

Gly Val Val Thr Ile Ala Asp Glu Val Lys His Gly Tyr Arg Leu Arg

        195                 200                 205            

Gln Gly Ala Ser Val Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Asp Met Tyr Thr

    210                 215                 220                

Tyr Ala Lys Gly Ile Ser Asn Gly Trp Pro Leu Ser Cys Val Ala Gly

225                 230                 235                 240

Asp Glu Arg Phe Leu Lys Pro Leu Ala Glu Phe Val Ser Thr Leu Thr

                245                 250                 255    

Phe Glu Ala Pro Ser Phe Ala Ala Ala Ser Ala Thr Leu Asp Arg Leu

            260                 265                 270        

 Ala Glu Leu Asp Val Gln Ala Gln Leu Ala Ile Asp Gly Ala Arg Phe

        275                 280                 285            

Val Ser Glu Ala Ala Lys Met Ile Ser Thr Arg Asp Leu Pro Ile Glu

    290                 295                 300                

Met Ala Gly Thr Gly Ala Ala Phe Gln Phe Val Cys Ala Pro Glu Val

305                 310                 315                 320

Glu Glu Val Leu Leu Pro His Ala Leu Ala Glu Gly Leu Ile Leu Glu

                325                 330                 335    

 

 

Pro Ser Asp Gln Gln Tyr Pro Ser Ala Cys Phe Arg Gly Glu Val Val

            340                 345                 350        

Asp Glu Ala Leu Asp Arg Leu Asp Arg Ala Leu Thr Thr Met Ala Ala

        355                 360                 365             

Ala Arg Pro Asp Leu Val Gly Arg Glu Val Thr Gln Leu Asp Arg Val

    370                 375                 380                

Asn Ala Ala Phe Cys Gln Met Asp Gly Leu Pro Gly Arg Pro Asp Gly

385                 390                 395                 400

Trp Ser Leu Asp Gln Cys Val Glu Tyr Val Thr Ala Gln Leu

                405                 410                

 

<210>  3

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  3

tctagatgta gagctcgtcc gccgcca                                         27

 

<210>  4

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  4

aagcttaagg tccccggcga tctgctc                                         27

<210>  5

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  5

aagcttaaga tgatcagcac ccgcgat                                         27

<210>  6

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  6

gaattcaatg tggagaacgg agcagacag                                       29

<210>  7

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  7

gcccgatcgg aacgtgacg                                                  19

<210>  8

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  8

tgcgcaacct ccggaccac                                                  19

  

<210>  9

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  9

cattcttcgc atcccgcctc tg                                              22

<210>  10

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  10

tcagcggtgg agtgcaatgt cg                                              22

Claims (10)

1.一种产庆大霉素C2a工程菌，其特征在于：所述工程菌为绛红色小单孢菌GB102，该菌株已于2014年4月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No. 9112。

2.根据权利要求1所述的一种产庆大霉素C2a工程菌，其特征在于，在产庆大霉素放线菌的基因组中灭活genB2基因，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，敲除基因的DNA序列为genB2的DNA序列。

4.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，灭活genB2基因的方法包括基因敲除和基因置换。

5.一种如权利要求1所述的一种产庆大霉素C2a工程菌的制备方法，其特征是，主要包括以下步骤：

(1)灭活genB2同源重组质粒的构建；

(2)灭活genB2同源重组质粒转化绛红小单孢菌；

(3)灭活genB2单交换菌株的筛选；

(4)灭活genB2基因工程菌的筛选；

(5)灭活genB2基因工程菌代谢产物的鉴定。

6.根据权利要求5所述工程菌的制备方法，其特征是，基因敲除的方法为PCR扩增genB2基因上下游序列大约2000bp的两个片段作为同源交换臂，按顺序连接到穿梭质粒pKC1139中，得到同源重组质粒pZB303。

7.根据权利要求5所述的一种产庆大霉素C2a工程菌的制备方法，其特征是，所述的转化方法为大肠杆菌ET12567/pUZ8002介导的接合转移方法。

8.根据权利要求5所述工程菌制备方法，其特征是，所述灭活genB2基因工程菌的筛选为先获得阿泊拉霉素抗性菌株，松弛培养后再从中筛选到阿泊拉霉素敏感菌株，再通过PCR验证得到genB2基因阻断工程菌。

9.根据权利要求5所述的一种产庆大霉素C2a工程菌的制备方法，其特征在于：所述的鉴定为采用薄层层析法、高效液相分析和MS分析其代谢产物。

10.一种如权利要求1所述的一种产庆大霉素C2a工程菌在制备抗菌药物和抗生素药物中的应用。