CN102994437B - 高产木质纤维素降解酶的链霉菌人工锌指蛋白突变菌株及其获得方法 - Google Patents
高产木质纤维素降解酶的链霉菌人工锌指蛋白突变菌株及其获得方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种高产木质纤维素降解酶的链霉菌人工锌指蛋白突变菌株及其获得方法，属于微生物生物技术领域。该菌株于2012年8月13日保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC No.6428。与不含有锌指蛋白的野生型出发菌株相比，该菌株的木聚糖酶活性提高11%，而且达到最高酶活的时间提前两天，最高酶活约为42.8U/mL。本发明还涉及获得该菌株的方法，利用该方法可提高多种生物酶的生产，即利用含有人工锌指蛋白基因的文库，通过遗传转化或结合转移等方法将该文库导入到各种生物酶生产菌株，并筛选酶活提高的突变体。
Description
技术领域
本发明涉及一种高产木质纤维素降解酶的链霉菌人工锌指蛋白突变菌株及其获得方法，属于微生物生物技术领域。
背景技术
基因表达调控的多种生物过程，如发育、分化和疾病等都受细胞内转录因子的调节完成。为实现细胞代谢的定向调控，可使用人工设计的转录因子，定向调控细胞内相关靶基因的表达。结合在特定基因启动子区域的人造转录因子（Artificial Transcription Factor,ATF）可以实现生物体内靶基因的表达调节，并且可根据需要实现不同强度的人为调节。人工转录因子的结构包括一个DNA结合域，一个转录调控域或效应区。其中DNA结合域负责结合特定的目标基因的启动子，而效应域可以实现上调或下调不同靶基因的表达。因此，可以设计人工的DNA结合域和效应区，创建所需要的人工转录因子。
锌指蛋白（Zinc finger protein,ZFP）是一类重要的转录因子，是指具有锌指结构的转录调控因子，在真核生物的胚胎发育、细胞分化、增强抗逆性、基因的表达调控等方面有重要作用。锌指结构是指在调节蛋白上的一个或多个依赖锌离子的DNA结合域，这个区域是由含有几个Cys残基的一小段氨基酸序列构成，其利用与锌离子结合进行自我折叠从而形成稳定的短的手指状结构。在锌指结构中，组氨酸和（或）半胱氨酸通过与锌的不同排列组合和疏水作用来组成并维持稳定的四面体结构。锌指结构既能与RNA和DNA结合，又能与DNA-RNA双链分子以及同类蛋白结合，在转录和翻译水平上调节和控制基因表达，因此在人工转录因子的构建中，锌指蛋白被认为是最有前途的DNA结合域。不同的蛋白结构对应不同的功能，根据锌指蛋白保守结构域的差异，可以将其分为C2H2（Cys2His2）型、C4（Cys4）型和C6（Cys6）型3个类群。C2H2型锌指是经典型锌指，是目前研究的最多、分布最广泛的锌指。酵母基因组中发现有55个锌指蛋白，其中31个属于C2H2型锌指。这些蛋白调节着胞内的众多代谢途径，包括糖的代谢、氨基酸代谢、呼吸作用、氮源利用以及对外界压力响应等。
目前，人工锌指蛋白文库技术已经成功应用于多个领域，筛选到多种优良表型，例如，细胞分化，逆境抗性，表面抗原及新型药物筛选。该技术与传统的过表达和敲除方法相比，细胞的致死率小，重复性好，适用范围从真核细胞到原核细胞。韩国汉城大学学者(参考文献见Park KS,et al.,NatureBiotechnology,2003，21:1208-1214)构建了人工锌指蛋白文库，转入酵母菌株中，获得了抗热激性和抗渗透性的突变菌株；转入大肠杆菌菌株内，获得了抗热激性，耐冷性和抗渗透性的表型，此外还获得了丁醇耐受性菌株，但目前还未有报道人工锌指蛋白文库技术在生物酶生产菌中的应用。
在能源匮乏的当今社会，纤维素乙醇作为第二代生物燃料受到了广泛的重视，而纤维素乙醇生产的瓶颈正是如何高效的降解资源丰富的纤维素为可发酵糖。纤维素酶的生产成本目前仍然较高，限制了纤维素乙醇的大规模工业化生产，因此需要开发提高生产菌纤维素酶活的方法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种高产木质纤维素降解酶的链霉菌人工锌指蛋白突变菌株及其获得方法，从海洋放线菌这一独特的菌种出发，筛选到有羧甲基纤维素酶(CMCase)和木聚糖酶酶活的菌株，利用人工锌指蛋白文库这一新颖的全局细胞转录因子，来调控链霉菌纤维素酶的表达，最终筛选到纤维素降解酶酶活提高的突变菌株。
本发明采用的技术方案是：一株高产木质纤维素降解酶的链霉菌人工锌指蛋白突变菌株Streptomyces sp，所述菌株的登记入册编号为CGMCC No.6428，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年08月13日。
所述链霉菌人工锌指蛋白突变菌株，其基因组中含有能够提高纤维素降解酶活性的人工锌指蛋白基因，与不含有人工锌指蛋白基因的对照菌株相比，该菌株的木聚糖酶活性提高11%，而且达到最高酶活的时间提前两天，最高酶活约为42.8U/mL。
所述的高产木质纤维素降解酶的链霉菌人工锌指蛋白突变菌株的获得方法为：设计人工锌指蛋白表达载体，并通过遗传转化或者结合转移手段导入到受体细胞中，筛选酶活性提高的微生物突变体。具体步骤如下：
（1）用表达载体，如链霉菌表达载体pIB139连接插入片段约为800bp的锌指蛋白基因，构建人工锌指蛋白表达载体文库，人工锌指蛋白基因可为文献报道的人工合成基因（Nature Biotechnology,2003(21):1208-1214），也可为细胞内源的锌指蛋白基因通过随机突变得到的基因；
（2）将所获得的文库结合转移或转化至微生物酶生产菌种，如海洋链霉菌中，平板涂布，经鉴定文库合格后挑取平板上的单克隆于选择培养基，如木糖平板中培养；
（3）选择酶活提高的突变体，如透明圈更大的突变体进行再次的酶活验证，获得酶活提高的突变体。
本发明的有益效果是：本发明中的技术方法可以应用于工业酶生产菌株的基因工程改造，提高菌株产酶性能；本发明中的突变菌株木聚糖酶生产能力较强，是一株有望应用于工业生产的木聚糖酶生产菌株。
附图说明
图1是锌指蛋白文库DNA片段PCR产物琼脂糖电泳检测结果，箭头指示人工锌指蛋白基因片段。
图2是锌指蛋白文库质粒图谱。
图3是锌指蛋白文库突变菌株羧甲基纤维素酶降解能力比较结果。
图4是锌指蛋白文库个别突变菌株液体发酵生产木聚糖酶结果。
具体实施方式
实验材料和试剂
1.菌株：出发菌株链霉菌M8由本发明人从大连小平岛海泥样品中分离获得。
2.生化试剂：
木聚糖：山毛榉木聚糖、桦木木聚糖、燕麦木聚糖（美国SIGMA公司）；
羧甲基纤维素钠（CMC-Na，Solarbio公司）
Remazol Brilliant Blue(RBB，美国SIGMA公司)
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（Solarbio公司）；
测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；
TaKaRa rTaq（大连宝生物工程有限公司）；
10xPCR Buffer（大连宝生物工程有限公司）；
dNTP Mixture（大连宝生物工程有限公司）；
E.Z.N.A.TM琼脂糖凝胶回收试剂盒（OMEGA，USA）
XbaI、EcoRI限制性连接酶，DNA连接酶（大连宝生物工程有限公司）。
提取菌株基因组DNA试剂：
洗涤液：50mmol/L Tris,25mmol/L EDTA,0.1%PVP,pH=8.0。
裂解液：50mmol/L Tris,25mmol/L EDTA,1.2%PVP,3%SDS。
抽取液：10mmol/L Tris,1mmol/L EDTA,0.3mmol/L NaAC,pH=8.0。
提取液：苯酚：氯仿：异戊醇=25:24:1。
TE缓冲液：50mmol/L Tris，pH=8.0。
DNS试剂配方：
甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2mL 10%的NaOH中，用蒸馏水稀释至69mL，再加入6.9g NaHSO3；
乙液：称取255g酒石酸钾钠，加入至300mL 10%NaOH中，再向其中加入880mL1%3,5-二硝基水杨酸溶液；
将甲乙两液相混即得到黄色DNS试剂，贮存于棕色试剂瓶中。在常温下，放置7-10天后使用，半年内有效。
3.培养基（每1L体积计算）
Bennett固体培养基：葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母粉1g，牛肉膏1g，琼脂20g，pH7.0。
ISP4固体培养基：可溶性淀粉10g，K2HPO4·3H2O 1g，MgSO4·7H2O 1g，NaCl 1g，(NH4)2SO4 2g,CaCO3 2g,FeSO4·7H2O 1mg,MnCl2 1mg,ZnSO4·7H2O 1mg,pH 7.0RBB-木聚糖固体培养基：含有0.2%RBB-木聚糖的ISP4固体培养基。
刚果红固体培养基：(NH4)2SO4 2g；MgSO4 0.5g；K2HPO4 1g；NaCl 0.5g；CMC-Na20g；琼脂20g。将培养过的平板置于1g/L的刚果红溶液中1小时，再用1mol/L的NaCl溶液冲洗至流出液为无色。
TSB液体培养基：胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3.0g，葡萄糖2.5g，K2HPO4·3H2O2.5g，NaCl 5g，pH 7.0。
MS固体培养基：甘露醇20g，豆粉20g，琼脂20g。
木聚糖酶产酶培养基：K2HPO4·3H2O 1.11g，KH2PO4 3.65g，(NH4)2NO3 3g，MgSO4·7H2O2.2g，CaCl2 0.3g，葡萄糖1.5g，蛋白胨2.5g，牛肉膏3g，山毛榉木聚糖10g，pH 6.5。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1 海洋链霉菌锌指蛋白文库构建
本发明涉及的人工锌指为Cys2His2型锌指，构建方法参考NatureBiotechnology,2003,21:1208-1214，包含三个锌指结构域，由韩国ToolGen公司提供；表达载体骨架为pIB139，构建方法参考J MolMicrobiol Biotechnol4(4):417-426，由pSET152中插入ermE强启动子构成。锌指蛋白文库中，人工锌指部分包含锌指结构域与GAL4转录因子激活域，其示意图如图2。通过改变人工锌指的序列，可以获得多种含有人工锌指的DNA片段，这些片段可以人工合成，也可以通过突变方法获得。本发明中的锌指蛋白DNA片段通过聚合酶链式反应（PCR）从酵母锌指蛋白文库的pRS316-CYC-lib-Gal4载体上获得，并通过EcoRI和XbaI的位点连接入pIB139表达载体。该载体的表达启动子为ermE，抗生素选择标记为安普霉素（Apramycin）。
1.锌指蛋白与转录激活域DNA片段的获得：
锌指蛋白与转录激活域DNA的PCR引物序列：
P1：5’-ACGGTCTAGAGTGTGCTGCAATTCT-3’
P2：5’-ACTTGAATTCTGCGGCCCACTAGAT-3’
PCR反应条件如表1所示：
表1 PCR反应条件
PCR反应体系如表2所示：
表2PCR反应体系
2.构建大肠杆菌锌指蛋白文库：
对PCR产物电泳检测（图1），得到一条大小约800bp左右的目的条带。对目的条带回收，具体的回收步骤依照OMEGA公司的凝胶回收试剂盒说明书。利用EcoRI和XbaI限制性内切酶酶切PCR扩增产物与质粒pIB139，利用表3中的10μL连接反应体系在16℃下反应5h。
表3连接反应体系
3.锌指蛋白文库向大肠杆菌中的转化
1）用无菌铂丝直接蘸取冻存的大肠杆菌XL1-Blue在琼脂平板表面划线接种，37℃过夜培养。
2）将单菌落转移至含有100mL LB培养基的100mL三角瓶中，37℃，200r/min强烈震荡培养3h，使菌液的OD600达到0.2-0.4.
3）将1.25mL细菌培养液转入离心管，于冰上放置10min。
4）于4℃用4000r/min离心10min。
5）弃上清，将离心管倒置1min，以使最后残留的痕量培养液流尽。
6）各加入150μL冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬细胞，同4,5步处理后，用100μL冰预冷的CaCl2溶液重悬细胞，作为大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞。
7）向感受态细胞中加入DNA溶液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰上放置30min。
8）将离心管放到预加温到42℃的水浴中，放置1min。
9）迅速将离心管转移到冰浴中，冷却5min。
10）加入900μL在37℃预热的LB液体培养基，混匀，转到37℃摇床上，200r/min温育45min。
11）从菌液中取出100μL涂布到含有安普霉素的LB琼脂平板上，于37℃恒温培养箱中培养12-16h后，挑取长出的单菌落，提取质粒送至上海生工生物有限公司测序验证。
12）收集平板上菌落，接种于LB液体培养基中过夜培养。提取质粒按照上述方法再次转化至大肠杆菌ET12567中，进行去甲基化。得到的质粒即是放线菌锌指蛋白表达文库，并为向出发菌种M8转化质粒做好准备。
构建的放线菌锌指蛋白文库质粒图谱如图2所示，其中在SphI与BamHI之间是放线菌来源的红霉素强启动子，在XbaI与NotI之间插入本发明中的人工锌指蛋白序列，NotI与EcoRI之间插入GAL4激活域序列，该质粒上的抗生素标记为安普霉素。此外，表达载体pIB139上还带有整合组件，能够将锌指蛋白序列整合到出发菌株基因组内，进行稳定的遗传表达。
实施例2将锌指蛋白表达文库转化至出发菌株M8中
1)将含有锌指蛋白文库的大肠杆菌ET12567以1：100比例加入到含有25μg mL-1卡那霉素，25μg mL-1氯霉素和50μg mL-1安普霉素的LB培养基中，30℃下180rpm培养至OD600 0.4-0.6。
2)取出适量的培养菌液并用等体积LB培养基洗涤2次以除去培养基的抗生素并重悬于0.1倍体积的LB培养基中。
3)将含有约108个出发菌株孢子的冻存液加入至500μL2×YT培养基中，然后在50℃下热激10分钟，冷却至室温。
4)将500μL大肠杆菌ET12567菌液与0.5mL热激后的孢子溶液混合，低速离心后除去80%上清液，用移液枪吹打均匀剩余菌液。
5)将10Mm MgCl2涂布到MS固体平板上，并开盖风干1h。将剩余菌液均匀涂布到平板上，30℃下培养16-20小时。
6)培养后将含有0.5mg萘啶酸与1mg安普霉素的1ml无菌水均匀涂布到平板表面，然后再30℃下继续培养至平板表面长出放线菌单菌落。
7)将生长出的单菌落转至ISP4培养基（含有1mg萘啶酸与1mg安普霉素）上，连续传代3次，获得的单菌落为锌指蛋白突变菌株。
实施例3 利用RBB-木聚糖平板初筛木聚糖酶增产的突变菌株
1.RBB-木聚糖的合成
1）将2g RBB染料和2g木聚糖加入到60ml去离子水中。
2）置于60℃水浴中溶解后，匀速搅拌并逐滴滴入20ml 33.8g/L乙酸钠溶液。
3）加入20ml 75g/LNaOH溶液并置于室温中匀速搅拌90分钟。
4）向反应体系中加入2倍体积的96%乙醇，然后真空过滤回收RBB-木聚糖沉淀。
5）利用1L混合溶液（含有660ml乙醇,330ml去离子水,1.35g乙酸钠)清洗RBB-木聚糖沉淀至滤出液为无色。
6）再用100ml 75%乙醇和50ml丙酮洗涤RBB-木聚糖。
7）80℃烘干RBB-木聚糖24小时。
2.筛选纤维素降解酶增产的突变菌株
将锌指蛋白突变菌株的单菌落转移至含有0.2%的RBB-木聚糖的ISP4平板，在30℃下培养24h，并测定透明圈的直径。由于菌落直径对透明圈直径影响很大，所以选择透明圈直径与菌落直径之比作为初筛指标。透明圈的比较结果见表4，黑体代表酶活提高的突变体。其中，突变菌株A29，B11，B32，C10，B1与出发菌株的透明圈相比有较大提高，因此作为初筛出的菌株，进行进一步液体酶活发酵比较。
将锌指蛋白突变菌株的单菌落转移至刚果红平板，在30下培养6天后，透明圈直径大小代表菌株纤维素酶降解能力。透明圈图片如图3所示，突变菌株B32的纤维素酶降解能力与出发菌株相比提高。
表4．锌指蛋白文库突变菌株透明圈大小比较结果
实施例4 测定发酵液中木聚糖酶酶活
划线接种菌株于ISP4固体培养基上，在30℃下培养3-5天。待孢子生长良好时，用1000μL的枪头尾圆端取4块菌落接种于TSB液体培养基中，于30℃下转速170rpm培养48h，进行种子培养。吸取培养好的种子培养基，以5%的接种量接入50mL木聚糖酶产酶培养基中，在转速为200rpm，温度为30℃条件下培养。每24小时取样一次，测定木聚糖酶酶活。
将上述的发酵液于8000rpm下离心10min，收集上清液作为粗酶液。粗酶液经过适当稀释，精确吸取粗酶液0.2mL（每个样品3支平行试管），加底物（1%山毛榉木聚糖）1.8mL。混合后于60℃水浴中反应5min，反应结束后迅速加入DNS液3.0mL终止反应，然后在沸水中煮沸5min，取出后冷却至室温。加入蒸馏水至25mL，摇匀。于540nm下测定OD值，根据木糖标准曲线换算木糖含量。空白对照，底物1.8mL于60℃水浴中处理5min后加入DNS试剂3.0mL，再向其中加入0.2mL稀释后的粗酶液，其它处理与样品一致。以空白对照为参比测定样品吸光度A。1个酶活单位（U）定义为在上述的条件下，每分钟释放出1μmol木糖所需的酶量。
5株锌指蛋白突变菌株与出发菌株M8同时进行摇瓶液体发酵，图4结果表明，菌株B32与B11的木聚糖酶产量得到了较大提高，在产酶量最高点处（第8天），与出发菌株相比分别提高11.2%和10.5%，而其他菌株B1，C10，A29未见增长。菌株B32与B11在发酵初期（4-6天）产酶量急剧提高，并在发酵中后期保持稳定，约为42.8U/mL与41.6U/mL。根据菌株生长速度与形态，选择本发明中菌株B32作为进一步检测锌指序列的目标菌株。
实施例5 提取海洋链霉菌B32基因组DNA，获取并测序其基因组中的锌指蛋白片段
提取菌株B32基因组DNA：
1)将菌株B32接种于50mL的TSB液体培养基中，在30℃下转速170rpm培养72小时，此时正处于对数生长期。收集发酵液1mL，8000r/min离心5min后弃上清液，洗涤液清洗菌体，离心后重复一次清洗。
2)向洗涤后的菌体中，加入100μL裂解液悬浮菌体，100℃煮沸15min后冷却至室温。
3)加入65℃预热好的抽提液0.5ml，轻微震荡。
4)加等体积Tris饱和酚/氯仿溶液，强烈震荡1min，10000r/min离心5min，小心吸取上清液，转移至干净的离心管。
5)向上清液中加入等体积的异丙醇，轻轻倒转混合两次，-20℃静置2小时。
6)12000r/min离心5min，70%的乙醇洗涤一次，10000r/min离心5min，开口挥发至无醇味，干燥后溶于20μLTE缓冲液中，制得粗DNA。
锌指蛋白片段的获得：
锌指蛋白PCR验证引物如下：
P3：5’-GCGAGAGGTGCGGGGAG-3‘
P2：5’-ACTTGAATTCTGCGGCCCACTAGAT-3‘
PCR反应条件与反应体系同（表1,2），获得的PCR扩增产物由上海生工生物工程公司进行测序，测序结果见说明书附图序列1。
本发明菌株B32基因组中所整合的锌指蛋白序列是三锌指结构，根据基因测序结果与Genebank上序列比对，三锌指结构域翻译如下：锌指1（RDER1，氨基酸序列59-83），YVCDVEGCTWKFARSDELNRHKKRH；锌指2（QSHT，氨基酸序列89-111），YKCEECGKAFRQSSHLTTHKIIH；锌指3（RDER1，氨基酸序列117-141），YVCDVEGCTWKFARSDELNRHKKRH。其中，锌指结构1与3相同。将锌指蛋白氨基酸序列与BLAST数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）中已知序列进行比对，本发明菌株B32基因组中的锌指蛋白结构域1的氨基酸序列与短尾负鼠来源的锌指蛋白534（Genebank号：ADB77888.1）的氨基酸序列相似性达到71%；锌指蛋白结构域2的氨基酸序列与黑猩猩来源的锌指蛋白681（Genebank号：XP 524195.2）的氨基酸序列相似度达到100%；锌指蛋白结构域3序列同结构域1。根据已有文献报道，本发明中的三部分锌指蛋白结构域所识别基因序列位点为：5’-GCG-M（A/C）GA-GCG-3’。
Claims (1)
1.一株高产木质纤维素降解酶的链霉菌人工锌指蛋白突变菌株（Streptomyces sp.），其特征在于：所述菌株的登记入册编号为CGMCC No.6428，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年08月13日。
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