CN103667274B - 一种多形汉逊酵母遗传操作策略及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多形汉逊酵母遗传操作策略及其应用。本发明公开的一种用于对多形汉逊酵母中目的基因进行敲除的DNA片段组，由DNA片段甲和DNA片段乙组成；沿着5’端至3’端的方向，DNA片段甲的结构为：目的基因5’端序列—m—mazF表达盒—抗性筛选标记基因表达盒部分片段A；沿着5’端至3’端的方向，DNA片段乙的结构为：抗性筛选标记基因表达盒部分片段B—n—目的基因3’端序列。本发明利用甲醇诱导的毒性蛋白mazF对mRNA的切割作用，达到无标记或无痕敲除的目的，为多形汉逊酵母遗传操作提供了极大便利。
Description
技术领域
本发明涉及一种多形汉逊酵母遗传操作策略及其应用。
背景技术
多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)是一类能以甲醇为唯一碳源和能源进行快速生长的甲醇营养型酵母，它除了和其他酵母菌一样具有与高等真核生物相似的基因表达调控和蛋白质翻译后修饰机制外，还具有独特的有利于外源蛋白高效表达的机制，如内源甲醇氧化酶(methanoloxidase)基因启动子MOXp是强诱导型启动子，对葡萄糖或甘油的阻遏不敏感，在葡萄糖或甘油限制或缺乏的条件下，能够被甲醇诱导启动外源基因的高效表达，因此细胞培养和蛋白表达可分时相控制，工艺过程的可控性好。多形汉逊酵母是一种耐热酵母，最适生长温度为37-43℃，因此生长速率快，有利于缩短大规模发酵的培养时间，而且为通过发酵温度变化实现蛋白表达控制提供了便利。它能够同时利用五碳糖和六碳糖，对环境胁迫的耐受性高，在简单廉价的培养基中可实现高密度发酵，并且其对表达蛋白的合适的糖基化修饰有利于提高蛋白的生物活性和稳定性。多形汉逊酵母内源的分泌型蛋白少，有利于外源蛋白的分离纯化。因此多形汉逊酵母是目前国际上公认的最理想的外源蛋白表达系统之一，在蛋白质结构功能的晶体学研究、蛋白质药物、高效生物催化剂、工农业生产过程中功能性蛋白的高效制备中发挥着非常重要的作用。
无论外源蛋白在多形汉逊酵母中的高效表达，还是多形汉逊酵母对五碳糖和六碳糖的高效利用和转化，都需要通过对宿主菌的遗传操作来实现。同时随着对多形汉逊酵母全基因组序列的不断揭示，需要对大量功能未知的基因进行遗传操作以研究和明确其功能及生物学意义。
在汉逊酵母遗传操作中常用的筛选标记主要有两种，一种是抗生素抗性基因，如KanMX6、zeoR等，另一种是营养缺陷互补标记，如URA3、TRP1等。然而，这种筛选标记存在很多局限性。首先，汉逊酵母菌株利用一种标记获得了抗生素抗性或者营养缺陷得到互补之后，这种标记就不能再次使用，限制了对多基因功能的研究和改造。另外，带有抗生素抗性基因的转基因菌株在实际应用过程中会存在潜在的危险。因此，建立简便高效的、具有反向筛选功能的遗传操作体系对多形汉逊酵母的功能基因组学、蛋白表达研究和代谢工程改造等具有非常重要的现实意义。
目前，在多形汉逊酵母中可应用的反向筛选标记主要是乳清苷5-磷酸脱羧酶基因URA3和5-磷酸核糖氨基苯甲酸异构酶基因TRP1，其中前者乳清苷5-磷酸脱羧酶能将5-氟乳清酸(5-FOA)转化为有毒物质，后者5-磷酸核糖氨基苯甲酸异构酶能将2-氨基-5-氟苯甲酸（5-FAA）转化为有毒物质，因此在5-FOA或5-FAA存在下迫使带有上述筛选标记的多形汉逊酵母细胞利用标记两侧的同向重复序列重组从而去掉URA3或TRP1，获得上述筛选标记丢失细胞，即进行反向筛选。但这种反向筛选方法只限定在ura3缺陷型或trp1缺陷型的汉逊酵母细胞中使用，同时假阳性比例较高，筛选效率低。
大肠杆菌的mazF基因编码产物能特异识别和切割mRNA的5'-ACA-3'序列，从而对细胞产生致死效应，它作为一种毒性蛋白是否可应用于多形汉逊酵母遗传操作中的反向筛选标记还没有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种多形汉逊酵母遗传操作策略及其应用。
本发明提供的一种用于对多形汉逊酵母中目的基因进行敲除的DNA片段组，由DNA片段甲和DNA片段乙组成；
沿着5’端至3’端的方向，DNA片段甲的结构为：目的基因5’端序列—m—mazF表达盒—抗性筛选标记基因表达盒部分片段A；
沿着5’端至3’端的方向，DNA片段乙的结构为：抗性筛选标记基因表达盒部分片段B—n—目的基因3’端序列；
抗性筛选标记基因表达盒是用于筛选重组多形汉逊酵母菌的；
mazF表达盒能够在重组多形汉逊酵母菌中表达mazF蛋白；
抗性筛选标记基因表达盒部分片段A为抗性基因表达盒的一部分片段，不是完整的抗性筛选标记基因表达盒，其从抗性筛选标记基因表达盒的5’末端开始至抗性筛选标记基因表达盒的中间某个碱基处结束；抗性筛选标记基因表达盒部分片段B为抗性筛选标记基因表达盒的一部分片段，不是完整的抗性筛选标记基因表达盒，其从抗性筛选标记基因表达盒的中间某个碱基开始至抗性筛选标记基因表达盒3’末端结束；抗性筛选标记基因表达盒部分片段A的3’端与抗性筛选标记基因表达盒部分片段B的5’端有部分重叠序列，该部分重叠序列供DNA片段甲和DNA片段乙发生同源重组从而在汉逊酵母细胞内形成完整的抗性筛选标记基因表达盒；
mazF表达盒中的启动子是甲醇诱导的MOXp启动子；
mazF的氨基酸序列是如SEQIDNo.2所示；
m和n为如下中的任一种：
（1）m为CYC1TT序列，n为CYC1TT序列；
CYC1TT的序列如SEQIDNo.1中自5’末端起第13位至第383位核苷酸所示；
（2）m为空白序列，n为目的基因5’端上游序列；
（3）m为目的基因3’端下游序列，n为空白序列；
（4）m为空白序列，n为目的基因5’端序列；
（5）m为目的基因3’端序列，n为空白序列；
上述DNA片段组中，所述抗性筛选标记基因为Zeocin抗性基因。
上述任一所述的DNA片段组中，所述mazF表达盒的核苷酸序列如SEQIDNo.1中自5’末端起第443位至第2697位核苷酸所示；
所述抗性筛选标记基因表达盒部分片段A的核苷酸序列为如SEQIDNo.5中自5’末端起第3721位至第4469位核苷酸所示；
所述抗性筛选标记基因表达盒部分片段B的核苷酸序列为如SEQIDNo.5中自5’末端起第4209位至第4950位核苷酸所示。
一种敲除多形汉逊酵母中一个目的基因的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：将上述任一所述的DNA片段甲和DNA片段乙一起转入多形汉逊酵母中，通过所述抗性筛选标记进行抗性筛选获得重组酵母；将所述重组酵母进行甲醇诱导培养，得到目的重组菌，目的重组菌中所述目的基因被敲除、所述抗性筛选标记基因表达盒丢失、所述mazF表达盒丢失；
当m和n为上述（1）所述的序列时，所述目的重组菌中所述抗性筛选标记基因表达盒丢失、所述mazF表达盒丢失，所述目的基因的除5’端序列和3’端序列外的中间序列被所述CYC1TT序列取代，实现了所述目的基因的无筛选标记敲除；
当m和n为上述（2）所述的序列时，所述目的重组菌中所述目的基因中除3’端序列外的序列被敲除、所述抗性筛选标记基因表达盒丢失、所述mazF表达盒丢失，使所述目的基因失去活性，实现了所述目的基因的无痕敲除；
当m和n为上述（3）所述的序列时，所述目的重组菌中所述目的基因中除5’端序列外的序列被敲除、所述抗性筛选标记基因表达盒丢失、所述mazF表达盒丢失，使所述目的基因失去活性，实现了所述目的基因的无痕敲除；
当m和n为上述（4）所述的序列时，所述目的重组菌中所述目的基因的除5’端序列和3’端序列外的中间序列被敲除、所述抗性筛选标记基因表达盒丢失、所述mazF表达盒丢失，使所述目的基因失去活性，实现了所述目的基因的无痕敲除；
当m和n为上述（5）所述的序列时，所述目的重组菌中所述目的基因的除5’端序列和3’端序列外的中间序列被敲除、所述抗性筛选标记基因表达盒丢失、所述mazF表达盒丢失，使所述目的基因失去活性，实现了所述目标基因的无痕敲除。
一种敲除多形汉逊酵母中多个目的基因的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：
（1）敲除宿主多形汉逊酵母中的目的基因A：
按照上述方法敲除多形汉逊酵母中的目的基因A，将所得重组菌记作重组菌A；
（2）敲除宿主多形汉逊酵母中的目的基因B：
再将上述任一所述的DNA片段甲和DNA片段乙一起转入重组菌A中，通过所述抗性筛选标记进行抗性筛选获得重组酵母；将所述重组酵母进行甲醇诱导培养，得到目的重组菌，目的重组菌中所述目的基因B和目的基因A均被敲除、所述抗性筛选标记基因表达盒丢失、所述mazF表达盒丢失；
所述步骤（1）中的所述的方法中的DNA片段组与所述步骤（2）中的DNA片段组不同时含有CYC1TT序列。
上述方法中，所述CYC1TT的序列如SEQIDNo.1中自5’末端起第13位至第383位核苷酸所示。
本发明利用甲醇诱导的毒性蛋白mazF对mRNA的切割作用，在甲醇存在下对多形汉逊酵母菌株构成致死压力，在这种压力下迫使mazF-zeoR表达盒两侧的同向重复序列发生重组从而删除正向筛选标记zeoR和反向筛选标记mazF，达到无标记或无痕敲除的目的。
本发明提供的策略应用范围广，在野生型和各种营养缺陷型酵母宿主菌中均可使用，克服了目前已有反向筛选标记只限定在营养缺陷型酵母菌株中应用的弊端，为多形汉逊酵母遗传操作提供了极大便利。本发明同时利用了断裂正向筛选标记法，在同源臂为500-1000bp时，同源重组率达到50%，明显高于常规的15%的重组率，克服了多形汉逊酵母同源重组效率低、筛选效率低、工作量大的缺点。
附图说明
图1为重组质粒pMOXZ-mazF物理图谱。
图2为对照菌株HU11和HU11-M在不同培养基中的生长比较。
图3为重组质粒pEBCMMZC物理图谱。
图4为蛋白酶A基因PEP4无标记敲除菌株的PCR分析。
图5为蛋白酶A基因PEP4无痕敲除菌株的PCR分析。
图6为羧肽酶Y基因CPY无痕敲除菌株的PCR分析。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
KOD-Plus-NeoDNA聚合酶购自TOYOBO公司，产品目录号为KOD-401。
抗生素Zeocin购自Invitrogen公司，产品目录号为R25001。
pMOXZα-A载体在文献“ChenZY,WangZY,HeXP,GuoXN,LiWW,ZhangBR.UricaseproductionbyarecombinantHansenulapolymorphastrainharbouringCandidautilisuricasegene.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2008,79:545-554”中公开过，公众可从中国科学院微生物研究所获得。
多形汉逊酵母菌（Hansenulapolymorpha）HU11保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCCNo.1218，该菌株在专利号为ZL200410080517.2，发明名称为“一种重组多形汉逊酵母菌及其构建方法与应用”的专利中公开过。
实施例中用到的各种培养平板：
YEPD固体培养基：该培养基由溶质和溶剂组成；溶质为酵母粉、蛋白胨、葡萄糖和琼脂粉，溶剂为水；溶质的浓度如下：10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖和10g/L琼脂粉，自然pH。
YEPG固体培养基：该培养基由溶质和溶剂组成；溶质为酵母粉、蛋白胨、甘油和琼脂粉，溶剂为水；溶质的浓度如下：10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、10g/L琼脂粉和10mL/L甘油，自然pH。
YEPM固体培养基：该培养基由溶质和溶剂组成；溶质为酵母粉、蛋白胨、甲醇和琼脂粉，溶剂为水；溶质的浓度如下：10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、5ml/L甲醇和10g/L琼脂粉，自然pH。
以上培养基的液体培养基由不添加其中的琼脂粉制成，其余成分以及浓度相同。
pEasyBlunt购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CB101。
pEasyBluntSimple购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CB111。
大肠杆菌JM109购自宝生物工程(大连)有限公司，产品目录号为D9022。
实施例1、大肠杆菌毒性蛋白mazF的表达及其生物学功能分析
一、重组质粒pMOXZ-mazF的构建
（一）根据大肠杆菌JM109毒性蛋白基因mazF序列(GenBankAccessNo.U00096.2)，设计并合成如下引物：
引物1：5’-CGGAAGCTTATGGTAAGCCGATACGTAC-3’；
(下划线部分为HindⅢ酶切识别位点)
引物2：5’-CCCTCTAGAAGTAACACTACCCAATCAGT-3’。
(下划线部分为XbaⅠ酶切识别位点)
（二）提取大肠杆菌JM109基因组DNA，以基因组DNA为模板，以引物1和引物2进行PCR扩增。
PCR反应体系：基因组DNA50ng，引物1终浓度0.3μmol/L，引物2终浓度0.3μmol/L，KOD-Plus-NeoDNA聚合酶1μL，10×KODbuffer5μL，2mMdNTPs5μL，25mMMg2+2μL，用去离子水将体系补至50μL，混匀。
PCR反应条件：94℃5分钟，循环1次；94℃30秒，56℃30秒，68℃20秒，30个循环；68℃10分钟，循环1次。
（三）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物大小约为350bp，与预期大小一致。序列分析表明扩增到的PCR产物与GenBank中mazF序列一致性为100%。
（四）用HindⅢ和XbaⅠ双酶切mazF基因，得到基因片段；用HindⅢ和XbaⅠ双酶切pMOXZα-A载体，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒pMOXZ-mazF。将重组质粒pMOXZ-mazF测序，测序结果正确。
重组质粒pMOXZ-mazF的物理图谱如图1所示。
图1中，pMOXZ-mazF用mazF基因序列替换了载体pMOXZα-A上的α信号肽分泌序列(α-MF)，mazF上游含有强诱导型启动子MOXp，在甲醇诱导下可以启动mazF的高效表达，除了mazF表达盒外，pMOXZ-mazF还含有Zeocin抗性基因zeoR表达盒，可以作为在大肠杆菌和酵母中的通用筛选标记，pMOXZ-mazF的其他元件与载体pMOXZα-A相同，其中CYC1terminator为CYC1TT。
mazF表达盒的序列如SEQIDNo.1中自5’末端起第443位至第2697位核苷酸所示。
mazF基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1中自5’末端起第1970位至第2305位所示，mazF蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。
zeoR表达盒的序列如SEQIDNo.1中自5’末端起第2712位至第3882位核苷酸所示。
Zeocin抗性基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1中自5’端起第3196位至第3570位所示，Zeocin蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。
二、重组菌HU11-M的构建
（一）用SphⅠ酶切重组质粒pMOXZ-mazF，得到4.2kb的线性化DNA片段，将此片段转化多形汉逊酵母菌HU11，在含有100μg/mLZeocin的YEPD培养基平板上筛选重组菌转化子。
（二）将步骤（一）平板上长出的转化子单菌落分别接于无菌水中混匀，室温静置4小时，同时以宿主菌多形汉逊酵母菌HU11为对照，分别接种于含0、100、200、400、600μg/mLZeocin的YEPD平板上，37℃静置培养48h。
结果显示，所有步骤（一）平板上长出的单菌落以及对照菌HU11（多形汉逊酵母菌HU11）在不含Zeocin的YEPD平板上均正常生长。在含有Zeocin的YEPD平板上，对照菌HU11不能生长，挑取的100个转化子单菌落中，仅有3个不能在100μg/mLZeocin的YEPD平板生长，其他转化子均可在含400μg/mLZeocin的YEPD培养基平板上正常生长，将此种重组菌命名为HU11-M。
（三）以引物1和引物2对对照菌HU11、不能在100μg/mLZeocin的YEPD平板上生长的3个转化子单菌落以及HU11-M进行菌落PCR，结果表明，对照菌HU11和不能在100μg/mLZeocin的YEPD平板上生长的3个转化子单菌落均没有目的条带的产生，而从HU11-M菌落中均能扩增出约350bp的DNA片段，该片段序列与mazF基因序列一致。
三、mazF基因在多形汉逊酵母中的表达及其功能分析
（一）将对照菌HU11、不能在100μg/mLZeocin的YEPD平板上生长的3个转化子单菌落、及HU11-M接种于无菌水中。室温静置4h后，分别将各菌接种在YEPD、YEPG和YEPM平板上，37℃培养48h。
结果表明，对照菌HU11和3个不能在100μg/mLZeocin的YEPD平板上生长的转化子单菌落在YEPD、YEPG和YEPM平板上均能正常生长。HU11-M在YEPD和YEPG平板上正常生长，而在YEPM平板上的生长被抑制。
说明在甲醇的诱导下，启动子MOXp启动了mazF基因的表达，其表达产物mazF蛋白对酵母细胞产生了毒性，抑制了HU11-M的生长，所以HU11-M在YEPM平板上的生长被抑制，而对照菌HU11和3个不能在100μg/mLZeocin的YEPD平板上生长的3个转化子由于没有携带mazF基因，所以能在YEPM平板（即甲醇存在的条件）上正常生长。
（二）将菌株HU11-M和对照菌株HU11在2mlYEPD液体培养基中培养16小时，5000rpm离心5分钟，分别收集菌体，用无菌水洗两次，然后分别重新悬浮于2ml无菌水中。从菌悬液中各取100μL分别转接于40mLYEPD、YEPG和YEPM液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养，通过检测OD600考察各菌株在不同培养基中的细胞活力。
结果如图2所示。
图2表明，菌株HU11-M和对照菌株HU11在YEPD和YEPG培养基中均正常生长，而且生长速率没有明显差异；但在YEPM培养基中，对照菌株HU11能生长，而重组菌株HU11-M的生长完全被抑制。
以上结果表明在启动子MOXp的调控下，mazF基因在多形汉逊酵母中得到了可诱导的功能性表达，对多形汉逊酵母产生了细胞毒性，为反向筛选系统的建立奠定了基础，初步证明了mazF基因可以作为多形汉逊酵母基因敲除过程中的反向筛选标记。
实施例2、mazF表达盒和zeoR表达盒在基因无标记敲除中的应用
一、重组质粒pEBCMMZC的构建
（一）根据载体pMOXZα-A上的CYC1TT序列，设计如下引物：
引物3：5'-ATCCAATTGTGACACGTCCGAC-3'；
引物4：5'-CCTTTTTACGGTTCCTGGCC-3'。
（二）以pMOXZα-A为模板，以引物3和引物4进行PCR，扩增得到CYC1TT片段。
PCR反应体系：pMOXZα-A50ng，引物3终浓度0.3μmol/L，引物4终浓度0.3μmol/L，KOD-Plus-NeoDNA聚合酶1μL，10×KODbuffer5μL，2mMdNTPs5μL，25mMMg2+2μL，用去离子水将体系补至50μL，混匀。
PCR反应条件：94℃5分钟，循环1次；94℃30秒，56℃30秒，68℃20秒，30个循环；68℃10分钟，循环1次。
（三）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测后，得到大小383bp的DNA片段，序列分析表明扩增到的PCR产物与pMOXZα-A中CYC1TT序列一致性为100%，将该片段命名为CYC1TT。CYC1TT的序列如SEQIDNo.1中自5’末端起第13位至第383位核苷酸所示、SEQIDNo.1中自5’末端起第3571位至第3941位核苷酸所示。
（四）将CYC1TT基因与载体pEasyBlunt连接，获得重组质粒pEB-CYC1TT。
（五）根据重组质粒pMOXZ-mazF序列，设计如下引物：
引物5：5'-ATTTGCGGCCGCTCATGCATGAGATCAGATC-3'；
(下划线部分为NotⅠ酶切识别位点)
引物6：5'-AAAGGGCCCGCTAGCATCGATGCCAGCAACGCG-3'。
(下划线部分为ApaⅠ酶切识别位点)
以质粒pMOXZ-mazF为模板，利用引物5和引物6进行PCR扩增。
PCR反应体系：pMOXZ-mazF50ng，引物5终浓度0.3μmol/L，引物6终浓度0.3μmol/L，KOD-Plus-NeoDNA聚合酶1μL，10×KODbuffer5μL，2mMdNTPs5μL，25mMMg2+2μL，用去离子水将体系补至50μL，混匀。
PCR反应条件：94℃5分钟，循环1次；94℃30秒，56℃30秒，68℃3分钟，30个循环；68℃10分钟，循环1次。
PCR产物大小为3.5kb，序列分析表明扩增到的PCR产物与pMOXZ-mazF中mazF和zeoR表达盒序列一致性为100%，说明PCR产物正确，其中包含mazF表达盒和zeoR表达盒，将该片段命名为mazF-zeoR，该片段的核苷酸序列如SEQIDNo.1中5’末端起第415位至第3972位核苷酸所示。
（六）用NotⅠ和ApaⅠ双酶切mazF-zeoR片段，得到基因片段；用NotⅠ和ApaⅠ双酶切pEB-CYC1TT，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒pEBCMMZC。
重组质粒pEBCMMZC物理图谱如图3所示。
重组质粒pEBCMMZC中的DNA片段C-mazF-zeoR，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。
C-mazF-zeoR片段的组成如下：
C-mazF-zeoR含有Zeocin抗性基因zeoR，在基因敲除过程中作为正向筛选标记；含有mazF表达盒，可以作为反向筛选标记；C-mazF-zeoR两端的CYC1TT序列可以作为反向筛选时的同源重组位点，在mazF基因表达带来的致死压力下发生重组，使mazF-zeoR片段删除，以此方法将筛选标记删除。
二、多形汉逊酵母蛋白酶A基因的无标记敲除
（一）PEP4基因5'端序列和3'端序列的PCR扩增
根据多形汉逊酵母蛋白酶A基因PEP4序列(GenBankAccessNo.U67173)，设计如下引物7、8、9和10，其中引物8和引物9中设计了SacⅠ酶切位点。
引物7：5'-TCCTGCAATGGTACAAATGGG-3'；
引物8：5'-GTTTTTCTGGTAAGTGGAGGAGCTCATCGTGGTCGTATTT-3'；
(下划线部分为SacⅠ酶切识别位点)
引物9：5'-AAATACGACCACGATGAGCTCCTCCACTTACCAGAAAAAC-3'；
(下划线部分为SacⅠ酶切识别位点)
引物10：5'-GGAAACACACAGAGCAGCAC-3'。
（二）以多形汉逊酵母HU11的基因组为模板，利用引物7和引物8进行PCR扩增，获得约1kb的PEP4基因的5'端同源序列，该序列如SEQIDNo.4中自5’末端起第1位至第1028位核苷酸所示。
以多形汉逊酵母HU11的基因组为模板，利用引物9和引物10进行PCR扩增，获得约1kb的PEP4基因的3'端同源序列，该序列如SEQIDNo.4中自5’末端起第989位至第2011位核苷酸所示。
PCR反应体系为：基因组DNA50ng，引物7终浓度0.3μmol/L，引物8终浓度0.3μmol/L，KOD-Plus-NeoDNA聚合酶1μL，10×KODbuffer5μL，2mMdNTPs5μL，25mMMg2+2μL，用去离子水将体系补至50μL，混匀。
PCR反应体系为：基因组DNA50ng，引物9终浓度0.3μmol/L，引物10终浓度0.3μmol/L，KOD-Plus-NeoDNA聚合酶1μL，10×KODbuffer5μL，2mMdNTPs5μL，25mMMg2+2μL，用去离子水将体系补至50μL，混匀。
两种PCR反应条件均为：94℃5分钟，循环1次；94℃30秒，56℃30秒，68℃1分钟，30个循环；68℃10分钟，循环1次。
（三）重组质粒pEBS-PEP4-S的构建
以上述步骤（二）获得的PEP4基因的5'端同源序列和3'端同源序列为模板，利用引物7和引物10进行融合PCR扩增。
PCR反应体系：5'端同源序列和3'端同源序列各25ng，引物7终浓度0.3μmol/L，引物10终浓度0.3μmol/L，KOD-Plus-NeoDNA聚合酶1μL，10×KODbuffer5μL，2mMdNTPs5μL，25mMMg2+2μL，用去离子水将体系补至50μL，混匀。
PCR反应条件：94℃5分钟，循环1次；94℃30秒，56℃30秒，68℃2分钟，30个循环；68℃10分钟，循环1次。
PCR产物为约2kb的PEP4基因5'端和3'端融合的DNA片段，将其命名为PEP4-S，该序列如SEQIDNo.4所示。将PEP4-S与载体pEasyBluntSimple连接，得到重组质粒pEBS-PEP4-S，将重组质粒测序，结果正确。
（四）重组质粒pCMMZC-PEP4的构建
根据重组质粒pEBCMMZC的序列，设计如下引物：
引物11：5'-AGGGAGCTCATCCAATTGTGACACGTC-3'；
(下划线部分为SacⅠ酶切识别位点)
引物12：5'-AAAGGTCACCGATGCCAGCAACGCG-3'。
(下划线部分为BstEⅡ酶切识别位点)
以重组质粒pEBCMMZC为模板，利用引物11和引物12进行PCR扩增。
PCR反应体系：pEBCMMZC50ng，引物11终浓度0.3μmol/L，引物12终浓度0.3μmol/L，KOD-Plus-NeoDNA聚合酶1μL，10×KODbuffer5μL，2mMdNTPs5μL，25mMMg2+2μL，用去离子水将体系补至50μL，混匀。
PCR反应条件：94℃5分钟，循环1次；94℃30秒，56℃30秒，68℃4分钟，30个循环；68℃10分钟，循环1次。
PCR产物为约3.9kb的DNA片段C-mazF-zeoR，该片段如SEQIDNo.1中自5’末端起第1位至第3598位核苷酸所示。用SacⅠ和BstEⅡ双酶切PCR产物，得到基因片段；用SacⅠ和BstEⅡ双酶切pEBS-PEP4-S，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒pCMMZC-PEP4。
在重组质粒pCMMZC-PEP4中，PEP4的5'端和3'端序列之间约100bp序列被带有正向筛选标记和反向筛选标记的DNA片段C-mazF-zeoR所替换。
（五）片段C的获得
根据重组质粒pCMMZC-PEP4的序列，设计如下引物：
引物13：5'-CGTCCCGGAAGTTCGTGG-3'；
引物14：5'-CCAAGTTGACCAGTGCCGTT-3'。
以重组质粒pCMMZC-PEP4为模板，利用引物7和引物10进行PCR扩增。
PCR反应体系：pCMMZC-PEP450ng，引物7终浓度0.3μmol/L，引物10终浓度0.3μmol/L，KOD-Plus-NeoDNA聚合酶1μL，10×KODbuffer5μL，2mMdNTPs5μL，25mMMg2+2μL，用去离子水将体系补至50μL，混匀。
PCR反应条件：94℃5分钟，循环1次；94℃30秒，56℃30秒，68℃6分钟，30个循环；68℃10分钟，循环1次。
PCR产物为约5.9kb，中间为C-mazF-zeoR、两端分别为PEP4的5'端和3'端序列的DNA片段，将此产物命名为DNA片段C，该片段的序列如SEQIDNo.5所示。
（六）片段C-5和C-3的获得
以重组质粒pCMMZC-PEP4为模板，分别利用引物7和引物13、引物14和引物10进行PCR扩增。
PCR反应体系：pCMMZC-PEP450ng，引物7终浓度0.3μmol/L，引物13终浓度0.3μmol/L，KOD-Plus-NeoDNA聚合酶1μL，10×KODbuffer5μL，2mMdNTPs5μL，25mMMg2+2μL，用去离子水将体系补至50μL，混匀。
PCR反应体系：pCMMZC-PEP450ng，引物14终浓度0.3μmol/L，引物10终浓度0.3μmol/L，KOD-Plus-NeoDNA聚合酶1μL，10×KODbuffer5μL，2mMdNTPs5μL，25mMMg2+2μL，用去离子水将体系补至50μL，混匀。
PCR反应条件：94℃5分钟，循环1次；94℃30秒，56℃30秒，68℃4分钟，30个循环；68℃10分钟，循环1次。
以重组质粒pCMMZC-PEP4为模板，利用引物7和引物13进行PCR得到4.5kb的DNA片段C-5,该片段序列如SEQIDNo.5中自5’末端起第1位至第4469位核苷酸所示。
以重组质粒pCMMZC-PEP4为模板，利用引物14和引物10进行PCR得到1.6kb的DNA片段C-3，该片段序列如SEQIDNo.5中自5’末端起第4209位至第5877位核苷酸所示。
DNA片段C-5包含PEP4基因5'端序列、CYC1TT序列、mazF表达盒及zeoR表达盒的5'端序列（zeoR表达盒的5'端序列是SEQIDNo.5中自5’末端起第3721位至第4469位核苷酸所示）；DNA片段C-3包含zeoR表达盒的3'端序列（zeoR表达盒的3'端序列是SEQIDNo.5中自5’末端起第4209位至第4950位核苷酸所示）及PEP4基因3'端序列；C-5和C-3之间存在261bp的重叠区，可以通过重组形成完整的zeoR表达盒，使转化菌株表现出Zeocin抗性。C-5和C-3这两个片段构成断裂正向筛选标记。
（七）片段C转化酵母菌
将6μgDNA片段C通过电转化的方法转化到多形汉逊酵母HU11中，在100μg/mLZeocin的YEPD培养基平板上筛选转化子，对能够在上述筛选平板上生长的单菌落的Zeocin抗性进行进一步分析，结果表明所有转化子均可在400μg/mLZeocin的YEPD培养基平板上生长，将此类重组菌命名为HU11-MC。
（八）片段C-5和C-3转化酵母菌
将DNA片段C-5和C-3按摩尔浓度等量混合，然后取6μg电转化多形汉逊酵母HU11；同时分别以6μgDNA片段C-5或DNA片段C-3电转化多形汉逊酵母HU11作为对照，通过Zeocin抗性筛选转化子。
结果显示，DNA片段C-5或DNA片段C-3分别单独转化多形汉逊酵母HU11，在含有Zeocin的YEPD平板上均没有菌落生长；而采用断裂正向筛选标记法，将DNA片段C-5和C-3混合物转化多形汉逊酵母HU11，在100μg/mLZeocin的YEPD平板上均有菌落生长，而且进一步的Zeocin抗性分析表明，所有转化子均可在400μg/mLZeocin的YEPD培养基平板上生长，将此类重组菌命名为HU11-MC5/C3。
（九）同源重组率分析
在多形汉逊酵母中非同源重组频率非常高，同源重组的频率比较低，因此通过Zeocin抗性筛选到的转化子只能说明DNA片段C整合到酵母染色体上，不能保证是同源重组还是非同源重组，因此需要通过PCR分析区分在PEP4基因位点发生同源重组的正确转化菌株和非同源重组的转化菌株，并统计同源重组频率。
依据PEP4基因5'端上游序列和3'端下游序列设计合成引物PEP4-5U和PEP4-3D：
PEP4-5U：5'-GATCAAAACTCCTCGTACAG-3'
PEP4-3D：5'-CTGCTAAAGAAGAGACAATC-3'
随机取上述转化获得的HU11-MC菌株和HU11-MC5/C3菌株各50个，提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，以PEP4-5U和PEP4-3D为引物进行PCR分析，同时以多形汉逊酵母HU11基因组作为对照。
PCR分析表明，用片段C直接转化获得的转化菌株中有15%的菌株中片段C替换了原始菌株染色体上PEP4基因内部序列，另有85%的菌株中片段C插入到染色体上其他的位点，PEP4没有受到影响（即发生了非同源重组），因此同源重组率为15%；而以DNA片段C5和C3同时转化进行的断裂筛选标记法获得的转化菌株中有50%的菌株中片段C替换了原始菌株染色体上PEP4基因内部序列，另有50%的菌株中片段C插入到染色体上其他的位点，即断裂筛选标记法的同源重组率为50%。
将HU11-MC菌株和HU11-MC5/C3菌株中发生正确同源重组的菌株统一命名为HU-pep4-MC。
（十）PEP4基因的无筛选标记敲除
1、将HU-pep4-MC接种于1mL无菌水中制成菌悬液，然后涂布在YEPM平板上，37℃静置培养2-3天。将YEPM平板上出现的单菌落挑于1mL无菌水，各取一接种环的菌悬液点于YEPD和含100μg/mLZeocin的YEPD培养基平板上，同时以多形汉逊酵母HU11和步骤（九）得到的HU-pep4-MC分别为对照。
结果所有菌均能在YEPD平板上正常生长，在含100μg/mLZeocin的YEPD培养基上只有步骤（九）得到的HU-pep4-MC能够生长，说明步骤（九）得到的HU-pep4-MC经过YEPM培养后都失去了Zeocin抗性。
2、利用引物PEP4-5U和PEP4-3D，对步骤1中YEPM平板上出现的单菌落进行PCR分析，同时以多形汉逊酵母HU11和步骤（九）得到的HU-pep4-MC为对照。
结果从菌株HU11中扩增到2.8kb的DNA片段、从菌株HU-pep4-MC中扩增到6.5kb的DNA片段、而从步骤（九）得到的HU-pep4-MC经过YEPM培养出现的单菌落中扩增到3.1kb的DNA片段。
分别对2.8kb和3.1kb的DNA片段进行序列分析，发现二者有相同的5'端序列和3'端序列，但中间序列出现差异，存在于2.8kbDNA片段的约100bp中间序列在3.1kb的DNA片段中不存在，3.1kb的DNA片段中该序列被380bp的CYC1TT替换，将此类菌株命名为HU-pep4-C。
对菌株HU-pep4-MC、HU11和HU-pep4-C的PCR分析结果如图4所示。
图4中，1为以HU-pep4-C基因组为模板的PCR结果（3.1kb），2为以HU-pep4-MC基因组为模板的PCR结果（6.5kb），3为以HU11基因组为模板的PCR结果（2.8kb），M为DNAmarker。
三、按文献(BaeJH,SohnJH,RheeSK,ChoiES.CloningandcharacterizationoftheHansenulapolymorphaPEP4geneencodingproteinaseA.Yeast,2005,22:13-19)所述的方法测定蛋白酶A的活性。
蛋白酶A能够切割羧肽酶Y前体，产生有活性的羧肽酶Y，羧肽酶Y降解底物N-苯甲酰-L-酪氨酸-p-硝基苯胺使其呈现黄色，生成物在415nm有光吸收。
测定方法如下：
将HU-pep4-C以及HU-pep4-MC和HU11在5mLYEPD液体培养基中培养至OD600值为3.0。取1ml各培养液5000rpm离心5分钟收集菌体，分别用无菌水和Tris-HCl(pH7.5)洗涤菌体，然后将菌体重悬于50μL2.5mg/mLN-苯甲酰-L-酪氨酸-p-硝基苯胺(溶于二甲基甲酰胺中)和200μLpH7.5的Tris-HCl溶液中。37℃，200rpm摇床培养10小时，各取200μL上清于96孔板中，以不加酵母细胞的反应液为对照调零，于415nm检测各上清的吸光值，每组设三个平行，结果取平均值。结果如表1所示。
表1蛋白酶A活性测定结果
| 菌株 | OD415 |
| HU11 | 1.56 |
| HU-pep4-MC | 0.69 |
| HU-pep4-C | 0.70 |
表1表明，菌株HU-pep4-MC和HU-pep4-C中蛋白酶A活性缺失，其中HU-pep4-C蛋白酶A活性缺失说明通过甲醇诱导的mazF表达盒为反向筛选标记实现了多形汉逊酵母中蛋白酶A基因PEP4的敲除。
上述结果说明，在甲醇诱导下，多形汉逊酵母菌株HU-pep4-MC中mazF基因表达产物对酵母细胞造成致死压力，迫使基因组上筛选标记两侧同向重复序列CYC1TT发生同源重组，将筛选标记(mazF表达盒和zeoR表达盒)剔除，只留下一个CYC1TT取代了目标基因PEP4的中间序列，使目标基因失去活性，实现了目标基因的无筛选标记敲除。
实施例3、mazF表达盒和zeoR表达盒在基因无痕敲除中的应用
一、PEP45'UP和mazF-zeoR的扩增
（一）根据PEP4基因序列及pMOXZ-mazF中mazF-zeoR序列设计并合成如下引物：
引物15：5'-AAAGAGCTCTCGACGCGGAGAACGATCTC-3'；
(下划线部分为SacⅠ酶切识别位点)
引物16：5'-GATGAGCATTCAGAGCTGTTGCAAATTAAAGCCTTCGAGC-3'；
引物17：5'-GCTCGAAGGCTTTAATTTGCAACAGCTCTGAATGCTCATC-3'；
引物18：5'-AAAGGTCACCAGCTCGGCCCGCCAGAAAT-3'。
(下划线部分为BstEⅡ酶切识别位点)
（二）以pMOXZ-mazF为模板，利用引物15和引物16进行PCR扩增，获得3.5kb的mazF-zeoR序列，该序列如SEQIDNo.6中自5’末端起第1位至第3449位核苷酸所示。
PCR反应体系：pMOXZ-mazF50ng，引物15终浓度0.3μmol/L，引物16终浓度0.3μmol/L，KOD-Plus-NeoDNA聚合酶1μL，10×KODbuffer5μL，2mMdNTPs5μL，25mMMg2+2μL，用去离子水将体系补至50μL，混匀。
PCR反应条件：94℃5分钟，循环1次；94℃30秒，56℃30秒，68℃3分钟，30个循环；68℃10分钟，循环1次。
以多形汉逊酵母HU11的基因组为模板，利用引物17和引物18进行PCR扩增，获得0.5kb的PEP4基因5'端上游序列，记作PEP45'UP，该序列如SEQIDNo.6中自5’末端起第3450位至第3967位核苷酸所示。
PCR反应体系：多形汉逊酵母HU11的基因组50ng，引物17终浓度0.3μmol/L，引物18终浓度0.3μmol/L，KOD-Plus-NeoDNA聚合酶1μL，10×KODbuffer5μL，2mMdNTPs5μL，25mMMg2+2μL，用去离子水将体系补至50μL，混匀。
PCR反应条件：94℃5分钟，循环1次；94℃30秒，56℃30秒，68℃30秒，30个循环；68℃10分钟，循环1次。
（三）将mazF-zeoR和PEP45'UP混合，作为模板，利用引物15和18进行融合PCR，PCR体系和程序如实施例2的步骤二的（三），但68℃反应时间改为4分钟，获得约4kb的DNA片段，命名为mazF-zeoR-PEP45'UP，该序列如SEQIDNo.6所示。
（四）用SacⅠ和BstEⅡ双酶切mazF-zeoR-5'UP，得到基因片段；用SacⅠ和BstEⅡ双酶切pEBS-PEP4-S，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒pMMZUP-PEP4，该质粒包含PEP4基因5'端序列、mazF-zeoR-PEP45'UP和PEP4基因3'端序列，该片段的序列如SEQIDNo.7所示。
（五）以pMMZUP-PEP4为模板，以引物7和引物13进行PCR扩增，得到约4.1kb的DNA片段U-5，该片段的序列如SEQIDNo.7中自5’末端起第1位到第4027位核苷酸所示；
以pMMZUP-PEP4为模板，以引物14和引物10进行PCR扩增，得到约2.1kb的DNA片段U-3，该片段的序列如SEQIDNo.7中自5’末端起第3767位到第5870位核苷酸所示；
其中，DNA片段U-5包含PEP4基因5'端序列、mazF表达盒及zeoR表达盒的5'端序列；DNA片段U-3包含zeoR表达盒的3'端序列、PEP45'UP及PEP4基因3'端序列；U-5和U-3之间存在260bp的重叠区，可以通过重组形成完整的zeoR表达盒，使转化菌株表现出Zeocin抗性，U-5和U-3构成断裂正向筛选标记。
PCR体系和程序如实施例2的步骤二的（六）。
（六）片段U-5和U-3转化酵母菌
具体方法同实施例2的步骤二的（八），最终获得多形汉逊酵母HU11基因组上PEP4内部序列被mazF-zeoR-PEP45'UP替换的重组菌，将其命名为HU-pep4-MU。
（七）PEP4基因的无痕敲除
1、将HU-pep4-MU接种于1mL无菌水中制成菌悬液，然后涂布在YEPM平板上，37℃静置培养2-3天。将YEPM平板上出现的单菌落挑于1mL无菌水，各取一接种环的菌悬液点于YEPD和含100μg/mLZeocin的YEPD培养基平板上，同时以多形汉逊酵母HU11和步骤（六）得到的HU-pep4-MU分别为对照。
结果所有菌均能在YEPD平板上正常生长，在含100μg/mLZeocin的YEPD培养基上只有步骤（六）得到的HU-pep4-MU能够生长，说明步骤（六）得到的HU-pep4-MU经过YEPM培养后都失去了Zeocin抗性。
2、利用引物PEP4-5U和PEP4-3D，对步骤1中YEPM平板上出现的单菌落进行PCR分析，同时以多形汉逊酵母HU11和步骤（六）得到的HU-pep4-MU为对照。
结果从菌株HU11中扩增到2.8kb的DNA片段、从菌株HU-pep4-MU中扩增到6.5kb的DNA片段、而从步骤（六）得到的HU-pep4-MU经过YEPM培养出现的单菌落中扩增到1.5kb的DNA片段。
分别对2.8kb和1.5kb的DNA片段进行序列分析，发现来源于对照菌株HU11的2.8kb的DNA片段含有PEP4基因的完整的5'端及其上游序列、中间序列和3'端序列，而来源于步骤（六）的HU-pep4-MU经过YEPM培养出现的单菌落的1.5kb的DNA片段只有PEP4基因的5'端上游序列(5'UP)和3'端序列，而没有5'端序列和中间序列，也没有其他DNA序列的残留。上述结果说明存在于步骤（六）的多形汉逊酵母HU-pep4-MU基因组上的PEP45'端序列-mazF-zeoR-PEP45'UP-PEP43'端序列，在甲醇诱导mazF表达产生的细胞毒性压力下，迫使筛选标记下游PEP45'UP与上游的PEP45'端上游序列（PEP45'UP）发生同源重组，从而将PEP45'端序列和筛选标记(mazF表达盒和zeoR表达盒)从染色体上剔除，只留下PEP4的5'端上游序列和3'端序列，实现了多形汉逊酵母目标基因PEP4的无痕敲除，将此菌株命名为HU-pep4-U。
将HU-pep4-MU和HU-pep4-U的PCR鉴定结果如图5所示。
图5中，1为以菌株HU11基因组为模板的PCR结果(2.8kb)，2为以菌株HU-pep4-MU基因组为模板的PCR结果(6.5kb)，3为以菌株HU-pep4-U基因组为模板的PCR结果(1.5kb)。
二、蛋白酶A活性分析
按实施例2步骤三对HU-11、HU-pep4-MU和HU-pep4-U的蛋白酶A活性进行检测，结果如表2所示。
表2PEP4无痕敲除菌株与对照菌株蛋白酶A活性测定结果
| 菌株 | OD415 |
| HU11 | 1.54 |
| HU-pep4-MU | 0.67 |
| HU-pep4-U | 0.66 |
实验结果表明HU-pep4-MU和HU-pep4-U中的PEP4被敲除后，酵母细胞蛋白酶A活性缺失，不能有效激活羧肽酶Y的活性。
上述结果说明，在甲醇诱导下，多形汉逊酵母菌株HU-pep4-MU中mazF基因表达产物对酵母细胞造成致死压力，迫使基因组上筛选标记两侧同向重复序列PEP45'端上游序列发生同源重组，将PEP45'端序列和筛选标记(mazF表达盒和zeoR表达盒)从染色体上剔除，只留下PEP4的5'端上游序列和3'端序列，获得多形汉逊酵母菌株HU-pep4-U，实现了多形汉逊酵母目标基因PEP4的无痕敲除。
同样，可以根据PEP4基因序列及pMOXZ-mazF中mazF-zeoR序列设计引物，得到PEP4的3'DOWN-mazF-zeoR，其中3'DOWN为PEP4的3’端下游序列，进而得到重组质粒pMMZDOWN-PEP4，该质粒包含PEP4基因5'端序列、3'DOWN-mazF-zeoR和3'端序列。
以pMMZDOWN-PEP4为模板，以引物7和引物13进行PCR扩增得到D-5，以pMMZDOWN-PEP4为模板，以引物14和引物10进行PCR扩增，得到D-3。
PCR体系和程序如实施例2的步骤二的（六）。
DNA片段D-5包含PEP4基因5'端序列、PEP43'DOWN、mazF表达盒及zeoR表达盒的5'端序列；DNA片段D-3包含zeoR表达盒的3'端序列及PEP4基因3'端序列；D-5和D-3之间存在重叠区，可以通过重组形成完整的zeoR表达盒，使转化菌株表现出Zeocin抗性，D-5和D-3构成断裂正向筛选标记。
将D-5和D-3混合转化HU11得到Zeocin抗性的HU-pep4-MD。甲醇诱导HU-pep4-MD，得到HU-pep4-D。HU-pep4-MD中mazF基因表达产物对酵母细胞造成致死压力，迫使基因组上筛选标记两侧同向重复序列PEP43'端下游序列发生同源重组，将PEP43'端序列和筛选标记(mazF表达盒和zeoR表达盒)从染色体上剔除，只留下PEP4的5'端序列和3'端下游序列，得到HU-pep4-D，实现多形汉逊酵母目标基因PEP4的无痕敲除。
实施例4、mazF表达盒和zeoR表达盒在多基因无痕敲除中的应用
一、CPY基因5'端和3'端序列的PCR扩增
（一）根据多形汉逊酵母羧肽酶Y基因CPY序列(GenBankAccessNo.AEOI01000010)，设计如下引物：
引物19：5'-CGAACACCCACCGAAGCCCTTATC-3'；
引物20：5'-ATTGACCATAGCCGGTGACCGAGCCGAGCTCAAAAAGCATTC-3'；
(下划线部分分别为BstEII和SacI酶切识别位点)
引物21：5'-GCTTTTTGAGCTCGGCTCGGTCACCGGCTATGGTCAATAGATGGATAGC-3'；
(下划线部分分别为SacI和BstEII酶切识别位点)
引物22：5'-GATTTGCATGAGCTATTTACGCTC-3'。
（二）以多形汉逊酵母HU11基因组为模板，利用引物19和引物20进行PCR扩增，得到约0.7kb的CPY基因5'端同源序列，该序列如SEQIDNo.8中5’末端起第1位至第752位核苷酸所示。
以多形汉逊酵母HU11基因组为模板，利用引物21和引物22进行PCR扩增，得到约0.8kb的CPY基因3'端同源序列，该序列如SEQIDNo.8中5’末端起第715位至第1583位核苷酸所示。
PCR反应体系为：基因组DNA50ng，引物19终浓度0.3μmol/L，引物20终浓度0.3μmol/L，KOD-Plus-NeoDNA聚合酶1μL，10×KODbuffer5μL，2mMdNTPs5μL，25mMMg2+2μL，用去离子水将体系补至50μL，混匀。
PCR反应体系为：基因组DNA50ng，引物21终浓度0.3μmol/L，引物22终浓度0.3μmol/L，KOD-Plus-NeoDNA聚合酶1μL，10×KODbuffer5μL，2mMdNTPs5μL，25mMMg2+2μL，用去离子水将体系补至50μL，混匀。
两种PCR反应条件均为：94℃5分钟，循环1次；94℃30秒，56℃30秒，68℃1分钟，30个循环；68℃10分钟，循环1次。
（三）以步骤（二）获得的CPY基因5'端同源序列和3'端同源序列为模板，利用引物19和引物22进行融合PCR扩增。
PCR反应体系：5'端同源序列和3'端同源序列各25ng，引物19终浓度0.3μmol/L，引物22终浓度0.3μmol/L，KOD-Plus-NeoDNA聚合酶1μL，10×KODbuffer5μL，2mMdNTPs5μL，25mMMg2+2μL，用去离子水将体系补至50μL，混匀。
PCR反应条件：94℃5分钟，循环1次；94℃30秒，56℃30秒，68℃2分钟，30个循环；68℃10分钟，循环1次。
PCR产物为约1.5kb的CPY基因5'端和3'端融合的DNA片段，将其命名为CPY-S，该DNA片段仅含CPY的5'端和3'端序列，没有中间编码序列，CPY-S序列如SEQIDNo.8所示。将CPY-S与载体pEasyBluntSimple连接，得到重组质粒pEBS-CPY-S，将重组质粒测序，结果正确。
（四）重组质粒pMMZUP-CPY的构建
根据CPY基因序列及pMOXZ-mazF中mazF-zeoR序列设计如下引物：
引物15：5'-AAAGAGCTCTCGACGCGGAGAACGATCTC-3'；
(下划线部分为SacⅠ酶切识别位点)
引物23：5'-GTCAAAATTTGAAGAGGTCTGCAAATTAAAGCCTTCGAGC-3'；
引物24：5'-GCTCGAAGGCTTTAATTTGCAGACCTCTTCAAATTTTGAC-3'；
引物25：5'-AAAGGTCACCAGATTTATCGCATTGGCCTT-3'。
(下划线部分碱基为BstEⅡ酶切位点)
（五）以质粒pMOXZ-mazF为模板，利用引物15和引物23进行PCR扩增。
PCR产物为3.5kb的mazF-zeoR序列。
PCR反应体系为：pMOXZ-mazF50ng，引物15终浓度0.3μmol/L，引物23终浓度0.3μmol/L，KOD-Plus-NeoDNA聚合酶1μL，10×KODbuffer5μL，2mMdNTPs5μL，25mMMg2+2μL，用去离子水将体系补至50μL，混匀。
PCR反应条件为：94℃5分钟，循环1次；94℃30秒，56℃30秒，68℃3分钟，30个循环；68℃10分钟，循环1次。
以多形汉逊酵母HU11基因组为模板，利用引物24和引物25进行PCR扩增。
PCR产物为0.5kb的CPY基因5'端上游序列。
PCR反应体系为：基因组DNA50ng，引物24终浓度0.3μmol/L，引物25终浓度0.3μmol/L，KOD-Plus-NeoDNA聚合酶1μL，10×KODbuffer5μL，2mMdNTPs5μL，25mMMg2+2μL，用去离子水将体系补至50μL，混匀。
PCR反应条件为：94℃5分钟，循环1次；94℃30秒，56℃30秒，68℃1分钟，30个循环；68℃10分钟，循环1次。
（六）以3.5kb的mazF-zeoR序列和0.5kb的CPY基因5'端上游序列共同为模板，利用引物15和引物25进行融合PCR。
PCR反应体系：mazF-zeoR序列和CPY基因5'端上游序列各25ng，引物15终浓度0.3μmol/L，引物25终浓度0.3μmol/L，KOD-Plus-NeoDNA聚合酶1μL，10×KODbuffer5μL，2mMdNTPs5μL，25mMMg2+2μL，用去离子水将体系补至50μL，混匀。
PCR反应条件：94℃5分钟，循环1次；94℃30秒，56℃30秒，68℃3分钟，30个循环；68℃10分钟，循环1次。
PCR获得约4.0kb的DNA片段，将其命名为mazF-zeoR-CPY5'上游序列，该序列如SEQIDNo.9中自5’末端起第728位至第4714位核苷酸所示。
（七）用SacⅠ和BstEⅡ双酶切mazF-zeoR-CPY5'上游序列，得到基因片段；用SacⅠ和BstEⅡ双酶切的pEBS-CPY-S，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，获得重组质粒pMMZUP-CPY，该质粒含有CPY5’-mazF-zeoR-CPY5'上游序列-CPY3’序列，该序列如SEQIDNo.9所示。将重组质粒测序，结果正确。
（八）以重组质粒pMMZUP-CPY为模板，利用引物19和引物13进行PCR扩增，得到3.7kb的DNA片段CMZ-5；以重组质粒pMMZUP-CPY为模板，利用引物14和引物22进行PCR扩增，得到1.5kb的DNA片段CMZ-3。
PCR反应体系：pMMZUP-CPY50ng，引物19终浓度0.3μmol/L，引物13终浓度0.3μmol/L，KOD-Plus-NeoDNA聚合酶1μL，10×KODbuffer5μL，2mMdNTPs5μL，25mMMg2+2μL，用去离子水将体系补至50μL，混匀。
PCR反应体系：pMMZUP-CPY50ng，引物14终浓度0.3μmol/L，引物22终浓度0.3μmol/L，KOD-Plus-NeoDNA聚合酶1μL，10×KODbuffer5μL，2mMdNTPs5μL，25mMMg2+2μL，用去离子水将体系补至50μL，混匀。
PCR反应条件：94℃5分钟，循环1次；94℃30秒，56℃30秒，68℃3分钟，30个循环；68℃10分钟，循环1次。
其中，DNA片段CMZ-5包含CPY基因5'端序列、mazF表达盒及zeoR表达盒的5'端序列；DNA片段CMZ-3包含zeoR表达盒的3'端序列、CPY基因5'端上游序列及CPY基因3'端序列；CMZ-5和CMZ-3之间存在约260bp的重叠区，可以通过重组形成完整的zeoR表达盒，使转化菌株表现出Zeocin抗性，CMZ-5和CMZ-3构成断裂正向筛选标记。
二、CMZ-5和CMZ-3转化酵母菌
将DNA片段CMZ-5和CMZ-3按摩尔浓度等量混合，然后取6μg电转化蛋白酶A基因PEP4被无痕敲除的多形汉逊酵母HU-pep4-U，得到重组菌HU-pep4-cpy-CMZ。
三、目的基因CPY的无痕敲除
（一）将HU-pep4-cpy-CMZ接种于1mL无菌水中制成菌悬液，然后涂布在YEPM培养基平板上，37℃静置培养2-3天。将YEPM平板上出现的单菌落挑于1mL无菌水，各取一接种环的菌悬液点于YEPD和含100μg/mLZeocin的YEPD培养基平板上，同时以多形汉逊酵母HU11和步骤二得到的HU-pep4-cpy-CMZ分别为对照。
结果所有菌均能在YEPD平板上正常生长，在含100μg/mLZeocin的YEPD培养基上只有步骤二得到的HU-pep4-cpy-CMZ能够生长，说明步骤二得到的HU-pep4-cpy-CMZ经过YEPM培养后都失去了Zeocin抗性，将该菌株命名为HU-pep4-cpy。
（二）根据CPY基因5'端上游序列设计合成引物CPY-5U（5'-CCTGCTTTGCCTGAATCTGC-3'），利用引物CPY-5U和引物22从菌株HU11中扩增到3.2kb的DNA片段、从菌株HU-pep4-cpy-CMZ中扩增到6.3kb的DNA片段、而从HU-pep4-cpy中扩增到1.5kb的DNA片段。
对菌株HU-pep4-cpy-CMZ、菌株HU11和菌株HU-pep4-cpy的PCR验证结果如图6所示。
图6中，1为以菌株HU-pep4-cpy-CMZ基因组DNA为模板的PCR结果(6.3kb)，2为以菌株HU11基因组DNA为模板的PCR结果(3.2kb)，3为以菌株HU-pep4-cpy基因组DNA为模板的PCR结果(1.5kb)。
分别对3.2kb和1.5kb的DNA片段进行序列分析，发现来源于菌株HU11的3.2kb的DNA片段含有完整的CPY基因（包括5'端序列、中间序列和3'端序列）及其上游序列，而来源于HU-pep4-cpy的1.5kb的DNA片段只有CPY基因的5'端上游序列和3'端序列，而没有5'端序列、中间序列，也没有其他DNA序列的残留。
结果说明存在于多形汉逊酵母HU-pep4-cpy-CMZ基因组上的CPY5'-mazF-zeoR-CPY5'端上游序列-CPY3'序列，在甲醇诱导mazF表达产生的细胞毒性压力下，迫使筛选标记两侧同向重复序列(CPY5'端上游序列)发生同源重组，将筛选标记(mazF表达盒和zeoR表达盒)及CPY5'端序列剔除，只留下CPY的5'端上游序列和3'端序列，实现了多形汉逊酵母目标基因CPY的无痕敲除，获得的CPY无痕敲除菌株命名为HU-pep4-cpy。
四、蛋白酶A和羧肽酶Y活性分析
按实施例2步骤三检测酵母菌株HU-11、HU-pep4-U、HU-pep4-cpy-CMZ和HU-pep4-cpy的蛋白酶A和羧肽酶Y活性，结果如表3所示。
实验结果表明PEP4和CPY同时被敲除后，酵母细胞蛋白酶A和羧肽酶Y活性都缺失，不能降解底物N-苯甲酰-L-酪氨酸-p-硝基苯胺产生黄色的化合物，因此在415nm没有吸收值。
表3PEP4和CPY无痕敲除菌株与对照菌株蛋白酶A和羧肽酶Y活性测定结果
| 酵母菌株 | OD415 |
| HU11 | 1.54 |
| HU-pep4-U | 0.67 |
| HU-pep4-cpy-CMZ | 0.00 |
| HU-pep4-cpy | 0.00 |
上述结果说明，以zeoR表达盒为正向筛选标记、以mazF表达盒为反向筛选标记，并采用断裂标记筛选法，可以快速实现对多形汉逊酵母单基因或多基因的无痕敲除，为多形汉逊酵母基因功能研究、表达调控机制研究、以及生理和代谢功能改造提供了高效的遗传操作策略。
本发明在多形汉逊酵母中的应用不限于上述实施例，而是可以应用到所有多形汉逊酵母的遗传操作中。
Claims (5)
1.一种用于对多形汉逊酵母中目的基因进行敲除的DNA片段组，由DNA片段甲和DNA片段乙组成；
沿着5’端至3’端的方向，DNA片段甲的结构为：目的基因5’端序列—m—mazF表达盒—抗性筛选标记基因表达盒部分片段A；
沿着5’端至3’端的方向，DNA片段乙的结构为：抗性筛选标记基因表达盒部分片段B—n—目的基因3’端序列；
抗性筛选标记基因表达盒是用于筛选重组多形汉逊酵母菌的；
mazF表达盒能够在重组多形汉逊酵母菌中表达mazF蛋白；
抗性筛选标记基因表达盒部分片段A为抗性基因表达盒的一部分片段，不是完整的抗性筛选标记基因表达盒，其从抗性筛选标记基因表达盒的5’末端开始至抗性筛选标记基因表达盒的中间某个碱基处结束；抗性筛选标记基因表达盒部分片段B为抗性筛选标记基因表达盒的一部分片段，不是完整的抗性筛选标记基因表达盒，其从抗性筛选标记基因表达盒的中间某个碱基开始至抗性筛选标记基因表达盒3’末端结束；抗性筛选标记基因表达盒部分片段A的3’端与抗性筛选标记基因表达盒部分片段B的5’端有部分重叠序列，该部分重叠序列供DNA片段甲和DNA片段乙发生同源重组从而在汉逊酵母细胞内形成完整的抗性筛选标记基因表达盒；
mazF表达盒中的启动子是甲醇诱导的MOXp启动子；
mazF的氨基酸序列是如SEQIDNo.2所示；
m和n为如下中的任一种：
（1）m为空白序列，n为目的基因5’端上游序列；
（2）m为目的基因3’端下游序列，n为空白序列；
（3）m为空白序列，n为目的基因5’端序列；
（4）m为目的基因3’端序列，n为空白序列。
2.根据权利要求1所述的DNA片段组，其特征在于：所述抗性筛选标记基因为Zeocin抗性基因。
3.根据权利要求1或2所述的DNA片段组，其特征在于：所述mazF表达盒的核苷酸序列如SEQIDNo.1中自5’末端起第443位至第2697位核苷酸所示；
所述抗性筛选标记基因表达盒部分片段A的核苷酸序列为如SEQIDNo.5中自5’末端起第3721位至第4469位核苷酸所示；
所述抗性筛选标记基因表达盒部分片段B的核苷酸序列为如SEQIDNo.5中自5’末端起第4209位至第4950位核苷酸所示。
4.一种敲除多形汉逊酵母中一个目的基因的方法，包括如下步骤：将权利要求1-3中任一所述的DNA片段甲和DNA片段乙一起转入多形汉逊酵母中，通过所述抗性筛选标记进行抗性筛选获得重组酵母；将所述重组酵母进行甲醇诱导培养，得到目的重组菌，目的重组菌中所述目的基因被敲除、所述抗性筛选标记基因表达盒丢失、所述mazF表达盒丢失。
5.一种敲除多形汉逊酵母中多个目的基因的方法，包括如下步骤：
（1）敲除宿主多形汉逊酵母中的目的基因A：
按照权利要求4所述的方法敲除多形汉逊酵母中的目的基因A，将所得重组菌记作重组菌A；
（2）敲除宿主多形汉逊酵母中的目的基因B：
再将权利要求1-3中任一所述的DNA片段甲和DNA片段乙一起转入重组菌A中，通过所述抗性筛选标记进行抗性筛选获得重组酵母；将所述重组酵母进行甲醇诱导培养，得到目的重组菌，目的重组菌中所述目的基因B和目的基因A均被敲除、所述抗性筛选标记基因表达盒丢失、所述mazF表达盒丢失。
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