CN107709540A

CN107709540A - 新型库德里阿兹威氏毕赤酵母菌种ng7及其用途

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Publication number: CN107709540A
Application number: CN201580044471.5A
Authority: CN
Inventors: 孙廷薰; 朴贤珠; 李善熙; 裴贞勋; 成奉炫
Original assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Current assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Priority date: 2014-06-20
Filing date: 2015-06-22
Publication date: 2018-02-16
Anticipated expiration: 2035-06-22
Also published as: WO2015194921A1; CN107709540B; KR101686900B1; KR20150146459A; US10443078B2; US20170349920A1

Abstract

本发明涉及一种显示耐热性和耐酸性的新型库德里阿兹威氏毕赤酵母菌种NG7；一种用于产生有机酸或醇的组合物，其包含所述菌种及其培养物；以及一种用于产生有机酸或醇的方法，其包括培养所述菌种的步骤。

Description

新型库德里阿兹威氏毕赤酵母菌种NG7及其用途

技术领域

本发明涉及一种具有耐酸性和耐热性的新型库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)NG7微生物、一种包含该微生物或其培养物的用于产生有机酸或醇的组合物和一种包括培养该微生物的产生有机酸或醇的方法。

背景技术

有机酸广泛用于各种工业领域，包括食品、医药和药品、化妆品等。自1880年乳酸的第一次商业化以来，柠檬酸在1923年被商业化，并且接着是乙酸、衣康酸、琥珀酸等的商业化。这些有机酸主要通过发酵或化学合成产生，其中，70种或更多种有机酸通过发酵产生，并通过糖酵解和柠檬酸途径合成。在这些有机酸中，可以大规模生产乙酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸等。特别地，在乳酸的情况下，聚乳酸已经被确认为可以替代由石油生产的塑料的可生物降解聚合物，因此对用作单体的乳酸的需求显著增加。

对于使用乳酸作为聚乳酸的单体，需要选择性地产生乳酸的光学异构体，并且在这点上，使用微生物的方法优于现有的化学合成方法。有许多已知的乳酸杆菌(Lactobacilli)，它们是产生乳酸的微生物。然而，当通过培养这些微生物产生乳酸时，缺点是一起产生两种光学异构体(D-乳酸盐和L-乳酸盐)，因此需要遗传操作，并且该微生物具有弱的耐酸性。

此外，在乳酸发酵过程中积累的乳酸可以酸化给定培养基的pH，从而抑制给定菌株的生长。因此，在乳酸发酵中已使用向培养基中添加中和剂的方法。在上述方法中最广泛使用的碳酸钙可以通过与乳酸结合而形成钙盐，并且通过在发酵过程之后用酸溶液处理沉淀物来回收乳酸的过程期间，可以形成与乳酸的摩尔量相同的石灰。该方法可能使纯化过程复杂化，产生强酸性废水，并形成副产物，从而增加乳酸的生产成本。为了解决这些问题，对能够最小化中和剂的使用的耐酸性微生物的使用越来越感兴趣(BiotechnolbiAdvances，2013；31：877-902)。尽管野生型酵母不能产生乳酸，但是它们具有比细菌显著高的抗逆性，因此基于该特性的酵母中乳酸产生的研究是竞争地进行的。特别地，通过操作耐酸菌株的乙醇产生途径以代替乙醇而产生乳酸，从而在不使用中和剂的酸性条件下在各种酵母中进行乳酸生产的研究(Biotechnol Genet Eng Rev.2010；27：229-256)。

此外，具有高潜力作为绿色燃料的生物乙醇被用作可以解决严重环境问题例如全球变暖的同时减少对油能依赖性的替代燃料。然而，对第一代生物乙醇快速增长的需求已导致作物产品例如玉米和甘蔗的价格飙升，此外，已经引起其它作物的价格上涨，并因此用于解决能源问题的生物乙醇生产正在成为粮食问题的新起因。

由于上述问题，所谓的第二代生物燃料纤维素生物乙醇被聚焦为新的替代物。纤维素生物乙醇是由葡萄糖制备的乙醇，其通过分解地球上最丰富的有机材料和植物细胞壁的主要组成成分即纤维素而产生。因此，与目前通过玉米淀粉的发酵生产乙醇的第一代方法不同，生产纤维素生物乙醇的方法是使用已经丢弃或燃烧的玉米的所有组织例如叶、茎、根等来生产生物乙醇的方法。通过上述方法，可以从所有植物例如玉米糠、米糠、草、芦苇、火焰草、木材废料等的组织中生产生物乙醇。

用作第二代生物燃料的原料的材料称为木质纤维素生物质，并且木质纤维素生物质主要由三种组分组成：纤维素、半纤维素和木质素。其中，半纤维素含有约5％至约20％的量的阿拉伯糖和木糖。使用构成半纤维素的重要部分的戊糖生产生物乙醇目前具有许多限制。

此外，已经积极地进行了对生物柴油的研究，其为一种环境友好的清洁替代能源。然而，生物柴油的缺点在于其产生甘油作为副产物。甘油可以用作化妆品、食品制剂和石化衍生物的原料，但其缺点在于对可以利用其作为糖的原料的宿主细胞存在限制。

发明内容

技术问题

本发明人致力于提供一种酵母微生物，其可以使用各种糖的原料来制备有用产品，同时具有耐热性和耐酸性。因此，他们已成功地分离和鉴定了库德里阿兹威氏毕赤酵母NG7微生物，其为具有优异的耐热性和耐酸性的酵母微生物，并且确认该微生物可以通过遗传操作产生有机酸和醇，从而完成本发明。

技术方案

本发明的目的为提供一种具有耐酸性和耐热性的新型库德里阿兹威氏毕赤酵母NG7微生物。

本发明的另一个目的为提供一种用于产生有机酸或醇的组合物，其包含该微生物或其培养物。

本发明的另一个目的为提供一种产生有机酸或醇的方法，其包括培养该微生物。

本发明的有利技术效果

本发明的新型库德里阿兹威氏毕赤酵母NG7菌株显示出优异的耐热性和耐酸性。因此，关于乳酸产生，该微生物使得能够在不使用中和剂的条件下或使得最小化使用中和剂的条件下高效地产生乳酸。

附图说明

图1表示从葡萄皮分离的酵母根据pH的生长曲线。

图2表示从桃皮分离的酵母根据pH的生长曲线。

图3表示从棕榈污泥分离的酵母根据pH的生长曲线。

图4表示从棕榈污泥堆肥分离的酵母根据pH的生长曲线。

图5分别表示含有0％、4％、5％和6％乳酸的YPD液体培养基中酵母的生长曲线。

图6分别表示通过在30℃、37℃、42℃和50℃下培养的酵母根据培养温度的生长曲线。

图7表示在含甘油培养基中新型酵母微生物(即2-2、NG1和NG7微生物)的生长曲线。

图8表示比较新型酵母微生物(即2-2、NG1和NG7微生物)、酿酒酵母(SC)和马克斯克鲁维酵母(Lluyveromyces marxianus,KM)根据pH的细胞生长和乙醇生产力的图。

图9表示比较新型酵母微生物(即2-2、NG1和NG7微生物)、酿酒酵母(SC)和马克斯克鲁维酵母(KM)根据培养温度的细胞生长和乙醇生产力的图。

图10表示NG7中PDC1基因删除和D型乳酸产生酶的基因导入以及通过PCR确认基因删除和导入结果的示意图。

图11表示比较删除一个PDC1基因拷贝并导入LDH基因的转化NG7微生物(即NG7/D-LDH-1和-2)和如在转化NG7中删除相同基因并导入LDH基因的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)微生物(即CEN.PK/D-LDH)的生长曲线、葡萄糖消耗、乳酸生产力和乙醇生产力的图。

图12表示NG7的一个URA3基因拷贝失活和确认转化体的基因导入的PCR结果的示意图。

图13表示NG7微生物的第二URA3基因的失活和确认转化体的基因删除的PCR结果的示意图。

图14表示使用URA3选择标记将D-LDH基因插入PDC1基因的位置后使用每个数目相对应的引物通过PCR确认的结果。

图15表示通过在没有中和剂的情况下培养其中两个PDC1基因拷贝都删除的NG7Δpdc1/D-LDH微生物，并确认它们消耗的葡萄糖、产生的乳酸和乙醇的图。

图16表示确认培养箱中的rpm对其中两个PDC1基因拷贝都删除的NG7Δpdc1/D-LDH微生物在其培养期间的乳酸产生的影响的图。

图17表示当NG7Δpdc1/D-LDH微生物的初始接种体积增加时确认培养箱中rpm的对乳酸产生的影响的图。

图18表示在NG7Δpdc1/D-LDH微生物培养期间添加浓度0％至3％的pH中和剂(CaCO₃)时确认其乳酸产生的图。

图19表示在NG7Δpdc1/D-LDH微生物培养期间向其添加浓度3％和5％的pH中和剂(CaCO₃)时确认其葡萄糖消耗量和乳酸产生量的图。

图20表示在NG7Δpdc1/D-LDH微生物培养期间在pH受控条件下通过补料分批培养时确认其葡萄糖消耗量和乳酸产生量的图。

图21表示NG7Δpdc1/D-LDH微生物培养期间在使用最小量的中和剂的条件下通过补料分批培养时确认其葡萄糖消耗量和乳酸产生量的图。

具体实施方式

为了实现上述目的，示例性实施方式涉及一种显示耐热性和耐酸性的新型库德里阿兹威氏毕赤酵母NG7微生物，具体地，本发明的微生物可以为以收录号KCTC12840BP保藏的微生物。

如本文所用，术语“库德里阿兹威氏毕赤酵母微生物”是指属于子囊菌的一种酵母，并且微生物形成各种假菌丝。属于毕赤酵母属的许多菌株被报道，并且它们可以根据菌株表现出多种生理特性。在一些报道的情况下，即使对于相同的菌株，不同的研究组显示不同的结果。因此，在本发明中，选择具有所需特征的特定库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株是重要的过程。

本发明的库德里阿兹威氏毕赤酵母NG7微生物是从葡萄皮分离的微生物，通过特征分析确认该微生物具有优异的耐热性和耐酸性，因此可以在42℃和pH2下生长。对该微生物的核苷酸序列进行了分析，结果显示该微生物与库德里阿兹威氏毕赤酵母的同源性为98.7％，并因此将该微生物命名为“库德里阿兹威氏毕赤酵母NG7”，并且其ITS1、5.8SrRNA、ITS2和28S rRNA的核苷酸序列收录在NCBI的基因银行GenBank，注册号为KM016456。此外，该微生物于2014年6月17日保藏于韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，收录号为KCCM18297P。根据韩国保藏，该微生物的保藏在2015年6月9日根据布达佩斯条约转换为国际保藏，并分配了KCTC12840BP的收录号。

具体地，本发明的库德里阿兹威氏毕赤酵母NG7微生物可以为其中乳清酸核苷5'-磷酸脱羧酶(URA3)的活性被失活的微生物，并且可以包括但不限于在作为亲本微生物的库德里阿兹威氏毕赤酵母NG7中乳清酸核苷5'-磷酸脱羧酶的活性失活以抑制尿嘧啶合成的任何微生物。

如本文所用，术语“乳清酸核苷5'-磷酸脱羧酶(URA3)”是指参与嘧啶核糖核苷酸的生物合成的酶。其中删除URA3基因的微生物是尿嘧啶营养缺陷型微生物。由于URA3基因可以用作营养缺陷型选择标记基因，因此在本发明的实施方式中，制备了删除库德里阿兹威氏毕赤酵母NG7的乳清酸核苷5'-磷酸脱羧酶的微生物(实施例10)。这样的微生物使得能够使用URA3基因容易地选择基因的导入或删除。

此外，更具体地，本发明的库德里阿兹威氏毕赤酵母NG7微生物可以为其中丙酮酸脱羧酶的活性进一步失活的微生物，但是可以包括但不限于在亲本微生物的库德里阿兹威氏毕赤酵母NG7中丙酮酸脱羧酶的活性失活从而抑制醇生成的任何微生物。

如本文所用，术语“丙酮酸脱羧酶(PDC1)”是指通过作用于丙酮酸而催化产生碳酸和乙醛的反应的酶(CH₃COCOOH→CH₃CHO+CO₂)。关于醇产生，它是醇发酵步骤中必需的酶。因此，本发明可以提供一种微生物，其中存在于上述微生物中的丙酮酸脱羧酶被失活，从而抑制通过发酵生成的醇。

具体地，与其中丙酮酸脱羧酶未失活的微生物相比，该微生物可以为在含糖培养基中培养时乙醇产量降低的微生物。此外，丙酮酸脱羧酶的失活通过在相应酶的基因中的取代、删除或添加来实现。丙酮酸脱羧酶可以通过由序列ID号：20组成的基因表达，但该基因不限于此。

通常地，微生物中的基因失活可以以各种形式进行。例如，可以通过修饰基因表达或反义RNA技术的信号传导结构来降低基因表达。用于基因表达的信号传导结构的示例可以包括抑制基因、激活基因、操纵基因、启动子、弱化子、核糖体结合位点、起始密码子和终止子，但不限于此。

此外，可以使用RNA干扰(RNAi)方法，其采用通过导入双链RNA(dsRNA)以诱导靶基因的mRNA的分解来抑制靶基因表达的机制，所述双链RNA由具有与靶基因的mRNA的同源序列的有义链以及具有靶基因的mRNA的互补序列的反义链组成。或者，可以通过诱导由转座子介导的突变阻断靶基因的功能来进行基因失活，所述转座子为能够移动到单细胞的基因组内不同位置的DNA序列。可以诱导蛋白质催化活性的改变、增加或降低的突变是本领域中已知的(Qiu&Goodman，Journal of Biological Chemistry 272：8611-8617,1997)。

具体地，可以使用选自单个或复合核苷酸序列的修饰、单个或复合核苷酸序列的删除、基因内外源基因的插入、整个基因组的删除，基因组启动子的抑制序列的插入、启动子的突变、基因组表达的抑制控制序列的插入、相对于基因组中单个或复合核苷酸序列的RNAi的导入、转座子介导的突变及其变体的组合中的任何方法来进行基因失活。

上述方法一般可以被本领域普通技术人员理解，并且可以如Sambrook等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Third Edition，Cold Spring Harbor Press2001)描述地进行。

所述方法可以为通过修饰基因的核苷酸序列的活性位点处的单个或复合核苷酸序列以显著降低基因表达的蛋白质活性的方法；或通过删除单个或复合基因或通过在核苷酸序列内插入外源基因例如抗生素抗性基因或另一基因来防止蛋白质完全表达的方法。具体地，可以使用删除存在于染色体中基因的整个核苷酸序列的方法。或者，可以通过上述方法的变体的组合进行基因失活。

此外，本发明的目的是提供一种具有产生有机酸或醇的特性的微生物。为此目的，有机酸和醇可以使用微生物同时产生，其中新型库德里阿兹威氏毕赤酵母NG7微生物中两个PDC1基因拷贝中的一个被删除，并且导入与有机酸的产生相关的外源基因。

在本发明的一个示例性实施方式中，确认其中删除一个PDC1基因拷贝并且导入乳酸脱氢酶(LDH)基因的微生物产生乳酸和乙醇(实施例9)。

此外，本发明的目的为提供一种微生物，其具有仅产生高浓度的有机酸同时最小化乙醇产量的特性。为此目的，可以使用其中新型库德里阿兹威氏毕赤酵母NG7微生物中两个PDC1基因拷贝都删除并且导入与有机酸的产生相关的外源基因的微生物产生有机酸。

在本发明的一个示例性实施方式中，确认其中删除两个PDC1基因拷贝并导入LDH基因的微生物产生乳酸而不产生乙醇(实施例12)。

本发明的微生物可以为其中PDC1的活性被失活并进一步导入了乳酸脱氢酶的活性的库德里阿兹威氏毕赤酵母NG7微生物，具体地为以收录号KCTC12841BP和KCTC12842BP保藏的微生物。然而，为了本发明的目的，可以将外源基因(例如编码参与有机酸产生的除乳酸脱氢酶以外的酶和因子的基因)导入库德里阿兹威氏毕赤酵母NG7微生物中，并且可以根据所导入的基因的种类产生不同种类的有机酸。

如本文所用，术语“外源基因”是指当为了特定目的将原本不存在于给定的野生型微生物中的核酸序列从外部导入微生物中的情况下的基因。特别地，在本发明中，外源基因是指与特定有机酸的产生相关的基因，有机酸可以为乳酸。

具体地，本发明的微生物的目标有机酸可以为L型或D型旋光异构体，并特别地为L-乳酸或D-乳酸，但不限于此，有机酸可以通过根据待产生的有机酸的旋光异构体的类型导入必需的基因来产生。

具体而言，导入到用于产生作为有机酸之一的乳酸的微生物中的外源基因可以为具有乳酸脱氢酶(LDH)活性的基因。如本文所用，术语“乳酸脱氢酶”通常是指通过使用NAD⁺脱氢将L-乳酸或D-乳酸转化为丙酮酸的酶，并且在其逆反应的催化糖酵解的最后步骤的情况下，酶通过使用NADH还原丙酮酸以产生L-乳酸或D-乳酸。也就是说，本发明的乳酸脱氢酶可以为L-乳酸脱氢酶或D-乳酸脱氢酶，特别地为D-乳酸脱氢酶。

具有乳酸脱氢酶活性的基因不仅可以包括编码天然乳酸脱氢酶的基因，还可以包括与其序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的等价活性的酶的基因。此外，可以包括其中在天然乳酸脱氢酶上诱导突变的那些基因，只要它们具有乳酸脱氢酶的活性即可，而不管它们的序列。

关于乳酸脱氢酶的信息可以在已知数据库例如NCBI的GenBank中确认，并且该基因可以由序列ID号：19的核苷酸序列组成，但不限于此。

具体地，本发明的微生物可以为其中丙酮酸脱羧酶的活性与其内源活性相比被削弱并且进一步导入乳酸脱氢酶的活性的微生物。内源活性的弱化可以通过使存在于野生型微生物中两个丙酮酸脱羧酶基因中拷贝的一个失活来进行，此外，弱化可以通过用编码乳酸脱氢酶的基因取代丙酮酸脱羧酶基因之一来进行。更具体地，本发明的微生物可以为以收录号KCTC12841BP保藏的微生物，但不限于此。

此外，具体地，本发明的微生物可以为其中丙酮酸脱羧酶的活性失活并进一步导入乳酸脱氢酶的活性的微生物。本发明的微生物中的丙酮酸脱羧酶的活性可以通过使存在于野生型微生物中两个丙酮酸脱羧酶基因拷贝失活而失活，此外，可以通过将编码乳酸脱氢酶的基因取代丙酮酸脱羧酶基因而使该活性失活。更具体地，本发明的微生物可以为以收录号KCTC12842BP保藏的微生物，但不限于此。

丙酮酸脱羧酶的活性的削弱意味着丙酮酸脱羧酶的活性与未修饰的微生物的活性相比降低，并且其还可以包括去除丙酮酸脱羧酶的活性的情况。丙酮酸脱羧酶活性的弱化可以通过应用本领域中公知的各种方法进行。

方法的实例可以包括用突变以降低酶活性的基因替换染色体上编码酶的基因的方法，包括当酶的活性被去除时的情况；在染色体上导入编码酶的基因的表达控制序列中的突变的方法；用具有较弱活性的序列替换编码酶的基因的表达控制序列的方法；在染色体上删除编码酶的基因的方法；通过与染色体上的基因的转录物互补结合而导入能够抑制mRNA翻译成蛋白质的反义寡核苷酸的方法等，但是方法不限于此。上述方法可以以相同的方式应用于削弱其它酶的活性。在本发明中，所述方法可以包括替换染色体上编码丙酮酸脱羧酶的基因的方法，但不限于此。

此外，在另一个示例性实施方式中，本发明涉及用于产生有机酸或醇的组合物，其包括所述微生物或其培养物。特别地，所述微生物可以使用甘油作为碳源。

所述微生物与上述解释相同。

如本文所用，术语“培养物”是指包括培养的微生物、其代谢物和额外营养物等的培养基，其通过在能够提供营养物的培养基中培养本发明的库德里阿兹威氏毕赤酵母NG7微生物而获得，以使微生物在体外在特定时间内生长和存活，但其也包括培养微生物后除去微生物的培养液。库德里阿兹威氏毕赤酵母NG7微生物可表现出产生有机酸和醇的能力，特别是产生乳酸和醇的能力，因此微生物或其培养物可以用作产生有机酸或醇的组合物。具体地，有机酸可以为乳酸，醇可以为乙醇。

最近，强调了能够将多糖发酵为乙醇的第二代生物乙醇，并且第二代生物乙醇需要糖基化过程，以将多糖糖基化为可以发酵成乙醇的单糖或二糖。这种糖基化过程可以使用酶或酸进行。

酶的糖基化是使用纤维素分解酶例如纤维素酶将生物质的碳水化合物分解成单糖的过程。酶本身为生物催化剂并且具有的优点在于，其具有相对低的反应温度，由于少的废物产生而为环境友好的，并且需要低能量。然而，酶具有的缺点在于，因为其昂贵并且需要长的反应时间。此外，酶的缺点在于酶活性可能受到各种因素的限制。

同时，酸性糖基化是使用酸在高温下将生物质的碳水化合物经由水解分解成单糖的过程，并且主要使用廉价的酸例如硫酸。因此，酸性糖基化的优点在于该方法具有短的反应时间并且需要低成本。然而，所述方法的缺点在于该方法使用酸，因此需要中和步骤，并且在中和过程中产生废物(沉淀物)，在酸性和高温条件下产生糖酵解产物，糖酵解产物可以作为随后发酵过程的抑制因子，并且分解的进一步进行可能产生不希望的副产物例如甲酸、甲醛等。

因此，使用酶的糖基化被认为是优选的方法，并因此被广泛研究。使用酶的糖基化的反应条件相对温和，并因此可以实现在反应器中同时进行糖基化和发酵过程的整合单一生物过程。当进行整合单一生物过程时，可发酵单糖等一旦产生就通过发酵被消耗。因此，可以自发解决当单独进行糖基化和发酵时由于单糖等(即在酶糖基化过程中积累的产物)的浓度增加而终止反应的缺点。此外，整合单一生物过程具有的优点在于由于酶糖基化过程连续进行，因此可以用少量的酶获得高的糖基化效率，并因此能够降低成本。然而，尽管酶糖基化的反应条件温和，但为了显示酶的最佳活性，必须将反应器的内部温度保持在相对高的温度(约40℃)。因此，为了通过整合单一生物过程生产第二代生物乙醇，必须开发能够在高温下稳定生长、同时具有乙醇生产力的微生物。

在本发明的一个示例性实施方式中，确认了NG7微生物可以在pH 2.0下生长并产生乳酸和乙醇，因此具有优异的耐酸性(图8)。此外，测定乳酸和乙醇根据温度的生长曲线和生产量，结果确认微生物可以在42℃的高温下生长，并且积极地产生乳酸和乙醇(图9)。

由以上确认，本发明的新型库德里阿兹威氏毕赤酵母NG7微生物不仅显示出优异的耐酸性和耐热性，而且也具有乳酸和乙醇的优异生产性，因此所述微生物具有高的工业实用性(图11)。

本发明的微生物可以使用作为通常已知的碳源的糖类和甘油，也可以使用在生物柴油生产过程中产生的粗甘油作为碳源生长，并且所述微生物可以使用其产生有机酸和/或醇。

此外，在本发明的一个示例性实施方式中，即使当使用在生物柴油生产期间产生的甘油作为碳源时，NG7微生物也显示出优异的生长(图7)。

如本文所用，术语“粗甘油”是指生物燃料，或特别是在生物柴油生产期间作为副产物产生的，并且每100kg生物柴油产品产生约10kg粗甘油。除了甘油之外，粗甘油还包括杂质，例如脂肪酸盐(皂)、包括过氧化物的各种盐(K、Na或Cl)、甲醇等，但不限于此。

此外，在本发明的一个示例性实施方式中，测量本发明的微生物的乳酸脱氢酶的活性，如表9中所示，确认了库德里阿兹威氏毕赤酵母NG7微生物的乳酸脱氢酶的活性显著高于阳性对照组的乳酸脱氢酶的活性。

在一个示例性实施方式中，本发明涉及一种产生有机酸或醇的方法，其包括培养所述微生物。

具体地，本发明的产生有机酸或醇的方法可以包括通过在参与醇产生的微生物中删除两个基因拷贝中的一个来培养其中醇产生途径部分地被阻断的转化微生物，并且有机酸和醇的生产力保持在高水平，同时保持生长能力。

此外，本发明的产生有机酸的方法可以包括通过在参与醇产生的微生物中删除两个基因拷贝来培养其中醇产生途径被完全阻断的转化微生物，并且有机酸的生产力维持在高水平，同时保持生长能力。

具体地，有机酸可以为乳酸，醇可以为乙醇，并且参与醇产生的基因可以为编码丙酮酸脱羧酶(PDC1)的基因。

通常地，其中通过删除两个PDC1基因拷贝来完全阻断醇产生途径的酵母经历其生长能力的显著降低，因此不适于产生有机酸。然而，确认了即使当醇产生途径被完全阻断时，本发明的微生物也可有效地用于有机酸的产生(实施例12)。

在本发明中，可以根据公知的方法来培养微生物，并且可以适当地调节培养条件例如温度、时间、培养基的pH等。适当的培养方法的实例可以包括补料分批培养、分批培养和连续培养，并特别为分批培养，但不限于此。

具体地，本发明的产生有机酸或醇的方法可以在不添加中和剂的条件下进行。

在本发明的一个示例性实施方式中，确认了本发明的微生物即使在不调节pH的条件下也产生乳酸，同时表现出高LDH活性(实施例12和13)。

在本发明的另一个示例性实施方式中，确认了微生物可以在中和剂以最小量使用的条件下通过补料分批培养来产生乳酸(实施例17)。

用于培养的培养基必须适当地满足特定菌株的要求。公开了用于各种微生物的培养基(例如，Manual of Methods for General Bacteriology.American Society forBacteriology.Washington D.C.，USA，1981)。作为在培养基中待使用的碳源，可以使用糖和碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)；油和脂肪(例如大豆油、向日葵油、花生油和椰子油)；脂肪酸(例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)；醇(例如甘油和乙醇)；和有机酸(例如乙酸等)。

在本发明中，微生物可以在其中含有葡萄糖和/或甘油作为营养源的培养基中培养；可以使用能够以低价大规模供应的各种生物质衍生的糖类作为营养源进行培养；并且作为在生物柴油生产期间产生的副产物的粗甘油可以用作营养源。

具体地，本发明的产生有机酸或醇的方法可以为用于在含有甘油的培养基中培养微生物的方法，在一个示例性实施方式中，确认了甘油的量、葡萄糖消耗量和乳酸产生量彼此成比例(实施例15)。特别地，确认了当葡萄糖和甘油一起加入时，与当单独包含葡萄糖时相比，葡萄糖的消耗量增加并且乳酸的产生量显著增加约40％。

构成培养基的这些物质可以单独使用或作为混合物使用。作为氮源，可以使用含氮有机化合物(例如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉末和尿素)或无机化合物(例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)，并且这些物质也可以单独使用或作为混合物使用。作为磷源，可以使用磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。另外，培养基可以包括生长所必需的金属盐(例如硫酸镁或硫酸铁)，最后，除了上述物质之外，还可以使用必需的生长促进物质例如氨基酸和维生素。可以将合适的前体进一步加入到培养基中。上述提供的材料可以在培养过程中立即或适当地加入培养物中。

实施例

在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明的目的，并且本发明不受这些实施例的限制。

实施例1、具有耐酸性的新型酵母的分离

为了鉴定具有耐酸性的新型酵母，收集各种样品(位于大田的韩国生命工学研究院(KRIBB)领域内的土壤、葡萄皮、桃皮、棕榈副产物和棕榈副产物堆肥等)。将收集的样品(10g)加入到无菌蒸馏水(40mL)中并通过涡旋混合1小时。然后，将上清液逐步稀释并铺在含有用于抑制细菌生长的抗生素、YMPS(酵母提取物(0.3％)、麦芽提取物(0.3％)、蛋白胨(0.5％)、葡萄糖(1％)，青霉素(50mg/L)和链霉素(50mg/L))的固体培养基上，在30℃下培养48小时，确保形成酵母型菌落而不是真菌孢子型的微生物。

对于分离的微生物的种类分析，在3mL的YMPS液体培养基中在30℃下以180rpm的速率振荡培养每个微生物48小时后，并通过离心仅回收细胞。使用i-基因组BYF DNAExtraction Mini Kit(iNtRON Biotechnology Inc.，Sungnam，Korea(韩国城南市iNtRON生物技术有限公司))提取基因组DNA。为了分析用作真核微生物的进化系统发育研究的最有用的标记ITS1、5.8S rRNA、ITS2和28S rRNA的核苷酸序列，在如此提取的DNA中，使用引物ITS1(序列ID号：1)和LR3R(序列ID号：2)通过聚合酶链反应(PCR)进行基因扩增。此外，为了分析细菌的16S rRNA基因，使用引物27F(序列ID号：3)和1492R(序列ID号：4)。用于扩增核苷酸序列的反应组合物为模板DNA(1μL)、10pmol ITS1(1.5μL)、10pmol LR3R(1.5μL)、EXtaq缓冲液(Takara；5μL)、2.5mM dNTP(4μL)、蒸馏水(36.5μL)和EX taq DNA聚合酶(Takara；0.5μL)。在以下条件下进行PCR：在95℃变性5分钟；30个循环的95℃变性30秒、55℃下退火30秒和72℃下聚合1分30秒；并在72℃下另外反应10分钟。

使用Solgent PCR纯化试剂盒(Solgent，韩国)纯化PCR反应后获得的反应溶液中的PCR产物，并将纯化的PCR产物送至GenoTech Corp.进行核苷酸分析。为了微生物的鉴定，使用国家生物技术信息中心(NCBI)提供的局部序列排比检索基本工具(BLAST)程序比较分析的核苷酸序列。

结果分离了各种酵母微生物，并确认它们为能够乙醇发酵的物种(表1)。此外，确认表1中所示的G-1、G-2、G-3、I-2、2-2等为频繁地用于葡萄酒过程、奶酪发酵等的酵母。根据它们的核糖体DNA的核苷酸序列同源性，确认核糖体DNA从各种种类的酵母微生物中被分离，范围从非常密切相关的物种到远程相关的物种。

将分离的微生物菌落重新接种到YMPS固体培养基中并在其上培养。结果从葡萄皮中分离出10种酵母菌株，桃皮中9种，棕榈副产物中6种，并且棕榈副产物堆肥中12种。

[表1]

实施例2、分离的微生物的耐酸性的分析

为了在实施例1中分离的微生物中选择具有耐酸性的微生物，将微生物分别在具有pH调节至pH 2.0、3.0和6.0的YPD液体培养基(酵母提取物(1％)、蛋白胨(2％)和葡萄糖(2％))上、在30℃下以180rpm的速率培养48小时，并分析生长曲线(图1至4)。结果是，所有酵母微生物的生长在pH 3.0和pH 6.0下相似，并且在pH 2.0下确认了微生物之间的差异。从葡萄皮和桃皮分离的大多数酵母微生物在pH 2.0下显示出快速生长，然而，对于从棕榈副产物和棕榈副产物堆肥分离的微生物，仅有少数微生物在pH 2.0下生长。

实施例3、具有耐乳酸性的微生物的选择

选择在实施例2中显示具有优异的耐酸性的8种微生物，并检查其耐乳酸性。

将分离的微生物接种到含有0％、4％、5％和6％乳酸的YPD液体培养基(酵母提取物(1％)，蛋白胨(2％)和葡萄糖(2％))上，在30℃下以180rpm的速率振动培养48小时，并分析根据时间的生长曲线。

结果确认所有微生物在含有6％乳酸的培养基中生长，其中具体地，2-2、NG1和NG7微生物比其它微生物对6％乳酸显示更高的抗性(图5)。在三种微生物中，通过核糖体RNA的核苷酸序列分析的结果，2-2和NG7微生物被分类为库德里阿兹威氏毕赤酵母微生物。然而，2-2微生物显示出99.8％的同源性，具有几乎与库德里阿兹威氏毕赤酵母微生物的序列相同的序列，然而NG7微生物显示出98.7％的相对低的同源性。

实施例4、选择的具有耐酸性的微生物中耐热性微生物的选择

比较在实施例3中选择为具有高耐乳酸性的微生物的2-2、NG1和NG7微生物的耐热性。

将选择的微生物分别在30℃、37℃、42℃和50℃下接种到YPD液体培养基(酵母提取物(1％)，蛋白胨(2％)和葡萄糖(2％))中，并振荡培养48小时，并且分析生长曲线。对高温具有耐热性的克鲁维酵母和酿酒酵母被用作对照微生物。

结果确认所有三种选择的微生物在30℃下显示最佳生长，2-2微生物显示出与42℃下的克鲁维酵母类似的生长，并且特别地，NG7微生物甚至在50℃下显示出生长。因此，确认了NG7微生物比被分类为与NG7相同的库德里阿兹威氏毕赤酵母的2-2微生物和已知对高温具有耐热性的克鲁维酵母(Kluyveromyces maxianus)具有更高的耐温性(图6)。

实施例5、分离的微生物对抗生素的抗性的确认

检查所选三种不同种类的微生物对各种抗生素的抗生素抗性。所用的抗生素为博莱霉素(100μg/mL)、G418(100μg/mL)、环己酰亚胺(1μg/mL)、金黄担子素A(0.1μg/mL)、诺尔丝菌素(100μg/mL)和潮霉素(100μg/mL)。将分离的微生物的每种细胞培养物点样于YPD固体培养基(酵母提取物(1％)、蛋白胨(2％)、葡萄糖(2％)和琼脂(2％))上，并在30℃下培养。结果确认所有微生物对博莱霉素、G418和环己酰亚胺具有抗性，但对金黄担子素A、诺尔丝菌素和潮霉素没有抗性(表2)。

[表2]

微生物

博莱霉素

G418

环己酰亚胺

金黄担子素A

诺尔丝菌素

潮霉素

NG1

+

-

NG7

+

-

2-2

+

-

实施例6、选择的微生物的糖利用能力的分析

为了确认选择的2-2、NG1和NG7微生物的糖利用能力，API试剂盒分析(基于接种测试微生物悬浮在试剂盒的杯中的基本培养基中后浊度的变化来确定测试微生物的糖利用能力的方法，其中含有碳水化合物作为唯一的碳源)。

结果确认了所有三种微生物都可以利用的糖为葡萄糖和N-乙酰基-D-葡糖胺，并且NG7微生物与其它微生物不同，可以利用甘油(表3)。

[表3]

为了确认在液体培养基中的甘油利用能力，将三种微生物接种到YPG液体培养基(酵母提取物(1％)、蛋白胨(2％)和甘油(2％))中，用振荡培养箱在30℃下以180rpm的速率培养48小时。使用YPD液体培养基(酵母提取物(1％)、蛋白胨(2％)和葡萄糖(2％))作为对照比较微生物的生长。

结果所有三种微生物在YPD液体培养基中显示相似的生长。然而，在含有甘油的YPG培养基中，所有三种微生物显示出生长，但是NG7微生物显示出比其它两种微生物更高的生长，并且YPG液体培养基中的NG7微生物也显示出比YPD液体培养基中更高的生长(图7)。

由于在生物柴油生产期间大量产生甘油，并且甘油也是可以以合理的价格提供的碳源，因此期望NG7微生物具有用于工业用途的大的可用性。

实施例7、选择的微生物的乙醇生产力的确认

检查实施例6中选择的三种微生物(2-2、NG1和NG7)的乙醇生产力。以5％的浓度接种在乙醇发酵培养基(葡萄糖(5％)、蛋白胨(5g/L)、酵母提取物(5g/L)、磷酸钾(5g/L)、硫酸铵(2g/L)、硫酸镁(0.4g/L))中培养的每种微生物，并在四种不同条件(pH 2.0、pH 6.0、37℃和42℃)中以100rpm的速率振荡培养48小时。酿酒酵母和具有耐热性的克鲁维酵母用作对照微生物。

结果确认用作对照的微生物在pH2.0下没有显示任何生长，但是所有三种微生物(2-2、NG1和NG7)在其上显示生长，并产生约25g/L的乙醇。特别地，NG7微生物在其中显示出最快的发酵速率。此外，在NG7微生物的情况下，其在pH 6.0下在约9小时内产生约25g/L的乙醇，而2-2和NG1微生物以及酿酒酵母在pH 6.0下在约12小时内并且克鲁维酵母在约36小时内产生约25g/L的乙醇(图8)。具体而言，2-2、NG1和NG7微生物在pH 2.0和pH 6.0下的生长和乙醇发酵没有差异，因此确认了它们优异的耐酸性。

此外，2-2和NG1微生物在37℃下显示最佳生长，并在约8小时内产生约25g/L的乙醇。在42℃，与克鲁维酵母相比，2-2和NG1微生物显示出更好的生长，并且在约8小时内产生约25g/L的乙醇。相比而言，克鲁维酵母在约15小时内产生约22g/L的乙醇，并且酿酒酵母和NG1微生物产生小于10g/L的乙醇(图9)。此外，在2-2和NG7微生物的情况下，与其它微生物相比，它们在42℃显示出显著优异的生长曲线，因此确认了它们优异的耐热性(图9)。

由以上结果，确认了NG7微生物在高温酸性条件下具有优异的乙醇发酵能力，因此确认了NG7微生物具有优异的耐热性和耐酸性。

因此，选择NG7微生物作为用于产生有机酸或醇的新型耐酸性微生物，并且该微生物于2014年6月17日保藏于韩国生命工学研究院(KRIBB，韩国)的KCTC，收录号为KCTC18297P。基于韩国保藏，保藏的微生物在2015年6月9日根据布达佩斯条约转换为国际保藏，并且分配了KCTC12840BP的收录号。

实施例8、PDC1基因的删除和LDH基因的导入

为了阻断NG7微生物的乙醇生物合成途径并将丙酮酸转化为D-乳酸，用D-乳酸脱氢酶(D-LDH)基因(序列ID号：19)代替丙酮酸脱羧酶(PDC1)基因，其为来源于植物乳杆菌的D-乳酸生产酶。通过PCR扩增PDC1ORF的上游区(500bp)和下游区(500bp)和NG7微生物的基因组DNA的GAPDH启动子，并且合成后扩增NAT基因。使用植物乳杆菌的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增D-LDH基因。用于PCR的引物总结在下表4中。

[表4]

通过重叠延伸PCR连接每个扩增的基因，并通过电穿孔将PCR产品导入其中来转化NG7微生物。将转化微生物涂布在含有诺尔丝菌素(NTSC；100μg/mL)的YPD固体培养基上，并从中选择转化体。使用引物13(序列ID号：17)和引物4(序列ID号：8)；引物7(序列ID号：11)和引物14(序列ID号：18)；引物13和引物8(序列ID号：12)；引物9(序列ID号：13)和引物14；以及引物1(序列ID号：5)和引物12(序列ID号：16)的引物对的组合通过PCR确认转化体。结果在预期位置观察到条带。由于NG7微生物为二倍体，在微生物中有两个PDC1基因拷贝。确认了其中将NTC基因和D-LDH基因导入两个PDC1基因拷贝座之一的两个转化体(图10)。

通过将LDH基因(序列ID号：19)导入如上所述一个PDC1基因拷贝中而制备的NG7/D-LDH微生物于2014年6月17日被保藏在韩国生命工学研究院(KRIBB，韩国)的KCTC，收录号为KCTC18300P，并于2015年6月9日根据布达佩斯条约将该保藏转换为国际保藏，并分配了KCTC12841BP的收录号。

实施例9、通过其中一个PDC1基因拷贝被LDH基因替代的转化微生物确认乳酸产生

为了确认其中删除一个PDC1基因拷贝并表达D-LDH的NG7微生物(NG7/D-LDH)的LDH活性，使酶溶液(0.1mL)与底物溶液(丙酮酸钠；2.7mL)和NADH(0.1mL)反应。然后在340nm处测量吸光度。使用野生型NG7微生物作为阴性对照，并且使用作为表达D-LDH的重组微生物的酿酒酵母CEN.PK/D-LDH作为阳性对照。

结果确认了两种转化体(即NG7/D-LDH-1和NG7/D-LDH-2)显示具有LDH活性(图5)。

[表5]

	LDH活性(ΔA340nm/5分钟)
		阴性对照(NG7wt)	0.019
阳性对照(CEN.PK/D-LDH)	0.078
		NG7/D-LDH-1	0.222
NG7/D-LDH-2	0.238

确认了被确认具有LDH活性的两种转化微生物的乳酸生产力。在30℃下以180rpm的速率在YPD液体培养基(酵母提取物(1％)、蛋白胨(2％)和葡萄糖(2％))中培养微生物。回收并接种细胞到含有10％葡萄糖的YPD液体培养基中，以使OD为10，并在30℃下以80rpm的速率培养84小时。在两种转化微生物的情况下，确认它们与阳性对照相比连续地保持其随时间的生长，并且它们还显示更高的葡萄糖消耗量。

此外，通过HPLC检测两种微生物的乳酸生产量，结果表明它们分别产生36.2g/L和31.3g/L量的乳酸，以及32.6g/L和34.2g/L量的乙醇(表6和图11)。由于本发明中制备的微生物仍然具有剩余的一个PDC1基因拷贝，因此产生的乙醇量类似于乳酸量。然而，确认了在不调节pH的条件下仍然产生显著量的乳酸。

[表6]

	乳酸生产量(g/L)	乙醇生产量(g/L)
			CEN.PK/D-LDH	12.5	47
NG7/D-LDH-1	36.2	32.6
			NG7/D-LDH-2	31.3	34.2

实施例10、尿嘧啶营养缺陷型微生物(NG7/Δura3)的制备

URA3基因为选择标记基因，同时它是在5-氟乳清酸(FOA)培养基中能够进行阴性选择的基因，因此具有可以重复使用该基因的优点。为了利用该特性，首先，制备尿嘧啶营养缺陷型NG7微生物。

因为NG7微生物为二倍体，所以分别使两个URA3基因拷贝失活。在确认NG7微生物对诺尔丝菌素(NTC)没有抗性之后，使用诺尔丝菌素乙酰转移酶(NAT)基因作为选择标记的破坏盒以便试图失活URA3基因。通过PCR扩增URA3ORF的上游区(500bp)和下游区(500bp)以及NG7微生物的基因组DNA的GAPDH启动子，并且合成后扩增NAT基因。通过重叠延伸PCR连接每个扩增的基因，并通过电穿孔将PCR产物导入NG7微生物以进行第一次转化。用于PCR的引物总结在下表7中。

[表7]

序列号	引物	识别位点	序列(5’->3’)
				21	15	URA启动子正方向	GAGGAAACTTCAATCGTCGAAGAAGATAAG
22	16	URA启动子反方向	GTTTGTTTGTCAAGGGGGCTAGATTTCGAT
				23	17	GAPDH启动子正方向	ATCGAAATCTAGCCCCCTTGACAAACAAAC
24	18	NTC反方向	ATCTTTGTGTAAGAAGTCGACTTATGGACA
				25	19	URA3终止子正方向	TGTCCATAAGTCGACTTCTTACACAAAGAT
26	20	URA3终止子正方向	TACCAAGAAGACGTTCATGTATGTTTCTGT

将转化微生物接种在含有NTC(100μg/mL)的YPD固体培养基上，并从中选择转化体。使用引物15(序列ID号：21)和引物20(序列ID号：26)通过PCR确认转化的存在。结果确认了将NTC盒导入URA3基因座并且仍然保留一个URA3基因拷贝(图12)。

为了失活剩余的URA3基因拷贝，使用相同的破坏盒转化其中一个URA3基因拷贝失活的NG7微生物。

将转化的微生物接种在含有5-FOA的固体培养基(不含氨基酸的酵母氮源(6.7g/L)、葡萄糖(2％)、琼脂(2％)、尿嘧啶(100μg/mL)和FOA(500μg/mL))上，并且从中选择转化体。使用引物15和20通过PCR确认T转化体。结果确认了NTC盒适当地插入URA3基因座并且不存在URA3基因(图13)。

实施例11、两个PDC1基因拷贝的删除和使用尿嘧啶营养缺陷选择标记导入LDH基因

如实施例9中确认那样，当在仅删除一个PDC1基因拷贝的微生物中表达LDH基因时，乙醇产生量与乳酸产生量相同。因此，为了提高乳酸生产力，尝试制备其中删除两个PDC1基因拷贝从而仅产生乳酸同时完全阻断乙醇产生途径的微生物。

为了阻断NG7微生物的乙醇产生途径并将丙酮酸转化为乳酸，用作为来源于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的D-乳酸生产酶的D-乳酸脱氢酶(D-LDH)基因(序列ID号：19)替换PDC1基因。

NG7微生物的基因组DNA的PDC1ORF、PDC1终止子(300bp)和URA启动子-URA ORF-URA终止子(1.5kb)的上游区(500bp)和下游区(500bp)通过PCR扩增，并使用来源于植物乳杆菌的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增D-LDH基因。用于PCR的引物总结在下表8中。

[表8]

通过重叠延伸PCR连接各扩增基因，并通过电穿孔将PCR产物导入其中以转化NG7/Δura3微生物。将转化微生物接种在UD固体(不含氨基酸的酵母氮源(6.7g/L)、葡萄糖(2％)、琼脂(2％)和酪蛋白氨基酸(5g/L))上并且从中选择转化体。使用引物13(序列ID号：17)和引物4(序列ID号：8)；引物22(序列ID号：28)和引物23(序列ID号：29)；引物1(序列ID号：5)和引物23(序列ID号：29)；引物13和引物12(序列ID号：16)；以及引物25(序列ID号：31)和引物26(序列ID号：32)的引物对的组合通过PCR确认转化的存在。结果在预期位置观察到DNA条带，从而分别确保转化体中LpLDH基因插入PDC1基因的每个基因座(图14)。

其中如上所述将LDH基因(序列ID号：19)分别导入每个PDC1基因拷贝的NG7Δpdc1/D-LpLDH微生物于2015年6月2日保藏在韩国生命工学研究院(KRIBB，韩国)的KCTC，收录号为KCTC18394P，保藏于2015年6月9日根据布达佩斯条约转换为国际保藏，并分配了KCTC12842BP的收录号。

实施例12、在不调节pH的情况下确认乳酸产生

为了确认其中删除2个PDC1基因拷贝并表达D-LDH的NG7微生物的LDH活性，使酶溶液(0.1mL)与底物溶液(丙酮酸钠；2.7mL)和NADH(0.1mL)反应，并在340nm处测定所得物的吸光度。使用野生型NG7微生物作为阴性对照，并使用作为表达D-LDH的重组微生物的酿酒酵母CEN.PK/D-LDH作为阳性对照。

结果确认了NG7Δpdc1/D-LpLDH转化体显示具有高LDH活性(表9)。

[表9]

确认了被确认具有LDH活性的转化的NG7Δpdc1/D-LpLDH微生物的乳酸生产力。在30℃下以180rpm的速率在YPD液体培养基(酵母提取物(1％)、蛋白胨(2％)和葡萄糖(2％))中培养微生物。回收并接种细胞到含有10％葡萄糖的YPD液体培养基中以在OD₆₀₀处具有10的吸光度并且在30℃下以80rpm的速率在无pH调节的条件下培养96小时。

通过HPLC检测NG7Δpdc1/D-LpLDH微生物的乳酸产生量，结果显示微生物产生21.2g/L量的乳酸，消耗36.5g/L量的葡萄糖，但是不产生乙醇(表10和图15)。

[表10]

	乳酸产生量(g/L)	葡萄糖消耗量(g/L)	乙醇产生量(g/L)
				NG7Δpdc1/D-LpLDH	21.2	36.5	0.3

实施例13、在不调节pH的情况下根据各种培养条件确认乳酸产生

为了建立通过NG7Δpdc1/D-LpLDH微生物产生乳酸的最佳条件，在各种rpm条件和接种细胞浓度下检查乳酸生产力。实验在80rpm、120rpm、160rpm和180rpm下进行，并且接种细胞的浓度在OD₆₀₀＝5或OD₆₀₀＝10的条件下。所有实验在无pH调节的条件下进行。

首先，当在各种rpm下以细胞浓度(OD₆₀₀＝5)培养微生物时，检查微生物的乳酸产生量。结果确认微生物在80rpm下以17.16g/L、在120rpm下以16.99g/L、在160rpm下以20.11g/L、和在180rpm下以20.06g/L的量产生乳酸(表11、图16)。

此外，当在各种rpm下以细胞浓度(OD₆₀₀＝10)培养微生物时，检查微生物的乳酸产生量。结果是，确认微生物产生在80rpm下为16.14g/L，在120rpm下为18.36g/L，在160rpm下为20.01g/L，和在180rpm下为19.89g/L量的乳酸(表12，图17)。

[表11]

rpm	乳酸产生量(g/L)	葡萄糖消耗量(g/L)
			80	17.16	30.73
120	16.99	31.71
			160	20.11	34.72
180	20.06	33.29

[表12]

rpm	乳酸产生量(g/L)	葡萄糖消耗量(g/L)
			80	16.14	29.68
120	18.36	32.96
			160	20.01	34.62
180	19.89	33.03

总结各种条件下的结果，确认接种细胞的浓度或rpm对NG7Δpdc1/D-LpLDH微生物中的乳酸生产力几乎没有影响。然而，当在OD₆₀₀＝5时调节接种细胞的浓度后以160rpm的速率培养微生物时，乳酸产量达到最高水平。

实施例14、通过pH调节确认乳酸产生

为了确认培养基的pH调节对由NG7Δpdc1/D-LpLDH微生物产生乳酸的影响，通过向培养基中添加碳酸钙来确认乳酸生产力。将碳酸钙分别加入到含有10％葡萄糖的YPD液体培养基中至1％、2％和3％的浓度，并在30℃以160rpm的速率培养100小时。

结果当没有添加碳酸钙时，微生物产生23.83g/L的乳酸并消耗36.89g/L的葡萄糖。当加入1％碳酸钙时，微生物产生40.96g/L的乳酸并消耗59.69g/L的葡萄糖。当加入2％碳酸钙时，微生物产生57.22g/L的乳酸并消耗85.21g/L的葡萄糖。最后，当添加3％碳酸钙时，微生物产生73.09g/L的乳酸并消耗100g/L的葡萄糖(表13、图18)。

[表13]

碳酸钙(％)	乳酸产生量(g/L)	葡萄糖消耗量(g/L)
			0	23.83	36.89
1	40.96	59.69
			2	57.22	85.21
3	73.09	100

此外，将碳酸钙分别加入含有15％葡萄糖的YPD液体培养基中至3％和5％的浓度，并在30℃以160rpm的速率培养100小时。当加入3％碳酸钙时，微生物产生79g/L的乳酸并消耗85g/L的葡萄糖。当加入5％碳酸钙时，微生物产生112g/L的乳酸并消耗140g/L的葡萄糖(表14、图19)。

[表14]

碳酸钙(％)	乳酸产生量(g/L)	葡萄糖消耗量(g/L)
			3	79	85
5	112	140

从上述实验中，当在培养基中以各种浓度添加碳酸钙时，确认了乳酸的生产力随着碳酸钙的浓度增加而增加，并且通过适当调节发酵pH可以使乳酸生产力最大化。

实施例15、通过利用甘油来增加乳酸产量

由于NG7微生物具有与其它酵母微生物不同的优异的甘油利用能力，因此检查了微生物在含甘油培养基中的乳酸生产力。比较NG7Δpdc1/D-LpLDH微生物在含有各种甘油浓度的培养基中的乳酸生产力。将微生物接种到YPD液体培养基(酵母提取物(1％)、蛋白胨(2％)和葡萄糖(5％)，其中葡萄糖调节至5％)中，其中加入甘油以具有0至10％的浓度，以达到OD₆₀₀＝5的浓度，并在30℃下以160rpm的速率在不调节pH的情况下培养48小时。

[表15]

碳源	乳酸产生量(g/L)	葡萄糖消耗量(g/L)
			葡萄糖(5％)	13.7	20
葡萄糖(5％)+甘油(1％)	17.2	24
			葡萄糖(5％)+甘油(3％)	18.1	24
葡萄糖(5％)+甘油(5％)	18.2	30
			葡萄糖(5％)+甘油(7％)	20.3	27
葡萄糖(5％)+甘油(10％)	21.3	27

当甘油与葡萄糖一起加入培养基中时，用作碳源的甘油的量非常少。然而，随着葡萄糖消耗量与加入其中的甘油量的增加成比例地增加，乳酸产生量也增加，当加入浓度为5％或更高的甘油时，乳酸产生量增加40％或更高。认为发生这种效应是因为甘油可有助于在酸性条件下稳定微生物或甘油的代谢可有利地作用于乳酸生产。因此，对于乳酸的产生，通过甘油利用以提高乳酸生产力的能力可以提供作为乳酸生产微生物的各种优点。

实施例16、通过补料分批培养的NG7Δpdc1/D-LpLDH微生物的乳酸生产检查通过补料分批培养的NG7Δpdc1/D-LpLDH微生物的乳酸生产力。在YPD10(酵母提取物(3％)、蛋白胨(1.5％)和葡萄糖(10％))中接种NG7Δpdc1/D-LpLDH微生物的两步补料分批培养中进行培养，在30℃下以500rpm(叶轮转速)在需氧条件下培养12小时，再次补充10％葡萄糖，然后在60小时内进一步补充5％葡萄糖。在使用NaOH的整个发酵过程中，培养基的pH保持在pH6.0。

结果乳酸产生的浓度增加直至培养的120小时，并且微生物消耗约200g/L的葡萄糖以产生116g/L(0.57g/g)的乳酸(图20)。

实施例17、在使用最少量的中和剂的条件下通过补料分批培养来确认乳酸产生

在酸性发酵条件下检查通过补料分批培养的NG7Δpdc1/D-LpLDH微生物的乳酸生产力，使中和剂的使用最小化。将NG7Δpdc1/D-LpLDH微生物接种到YPD10(酵母提取物(3％)、蛋白胨(1.5％)、葡萄糖(10％)和甘油(2％))中，并在30℃下以700rpm(叶轮转速)培养18小时以经过细胞生长阶段，并且在将叶轮转速调节至400rpm之后培养5小时以转化为厌氧条件，并且供应10％葡萄糖并且使用NaOH将培养基的pH维持在pH 5.5。为了通过发酵过程中产生的乳酸引起的pH的自然降低而进一步进行酸发酵，在35小时后不再调节pH。

结果在pH调节阶段，微生物显示出5g/L/hr的高生产力，但是在没有pH调节的阶段，微生物减少乳酸产生，最终获得118g/L的乳酸。在厌氧条件下，微生物没有生长，但继续产生乳酸20小时或更长，并且最终发酵培养基的pH为4.6。

因此，确认了本发明中提供的微生物通过调节发酵期间使用的中和剂的量可以最大化乳酸产量(118g/L)，通过酸化最终发酵液体的pH而降低后处理的成本，并最小化废物即石膏的产生(图21)。

上述结果表明，在本发明中新分离和鉴定的具有耐酸性和耐热性的库德里阿兹威氏毕赤酵母NG7微生物可以用作使用各种糖原料产生各种有用的有机酸和/或醇的微生物。

根据前述内容，本发明所属领域的技术人员将能够理解的是，在不改变本发明的技术概念或本质特征的情况下，本发明可以以其它具体形式实施。在这点上，本文中公开的示例性实施方式仅用于说明性目的，而不应被解释为限制本发明的范围。相反地，本发明旨在不仅涵盖示例性实施方式，而且涵盖可以包括在由所附权利要求限定的本发明的精神和范围内的各种替代、修改、等同物和其它实施方式。

<110> 韩国生命工学研究院

<120> 新型库德里阿兹威氏毕赤酵母菌种NG7及其用途

<130> OPA15125

<150> KR10-2014-0075461

<151> 2014-06-20

<160> 32

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ITS1 引物

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LR3R 引物

<400> 2

ggtccgtgtt tcaagac 17

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 27F 引物

<400> 3

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1492R 引物

<400> 4

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 1

<400> 5

atttcagtgc accattttaa tttctattgc 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 2

<400> 6

tgcaataatt ttcatatttt tatgttttgc 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 3

<400> 7

gcaaaacata aaaatatgaa aattattgca 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 4

<400> 8

tacattcaga tgtcattagt caaacttaac 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 5

<400> 9

gttaagtttg actaatgaca tctgaatgta 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 6

<400> 10

atcgaaatct agcccgatgg attgttttag 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 7

<400> 11

ctaaaacaat ccatcgggct agatttcgat 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 8

<400> 12

agacatggtg aattcttttt gtaattgtgt 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 9

<400> 13

acacaattac aaaaagaatt caccatgtct 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 10

<400> 14

cttgggagat agactgtcga cttatggaca 30

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 11

<400> 15

tgtccataag tcgacagtct atctcccaag 30

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 12

<400> 16

ttaagcggct ttagagttga tttcatcaga 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 13

<400> 17

attgtatcct atcctattcg atcctattgt 30

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 14

<400> 18

ttgcaaagac gcaatattct ctctcccatg 30

<210> 19

<211> 999

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(999)

<223> 乳酸脱氢酶

<400> 19

atgaaaatta ttgcatatgc tgtacgtgat gacgaacgtc cattcttcga tacttggatg 60

aaagaaaacc cagatgttga agttaaatta gttccagaat tacttactga agacaacgtt 120

gacttagcta aaggcttcga cggtgccgat gtataccaac aaaaggacta tactgctgaa 180

gtattgaaca agttagccga cgaaggggtt aagaacatct ctcttcgtaa cgttggtgtt 240

gataacttgg acgttcctac tgttaaagca cgtggcttaa acatttctaa cgtacctgca 300

tactcaccaa atgcgattgc tgaattatca gtaacgcaat tgatgcaatt attacgtcaa 360

accccattgt tcaataagaa gttagctaag caagacttcc gttgggcacc agatattgcc 420

aaggaattaa acaccatgac tgttggtgtt atcggtactg gtcggattgg ccgtgctgcc 480

atcgatattt tcaaaggctt cggcgctaag gttatcggtt acgatgttta ccggaatgct 540

gaacttgaaa aggaaggcat gtacgttgac accttggacg aattatacgc ccaagctgat 600

gttatcacgt tacacgttcc tgcattgaag gataactacc acatgttgaa tgcggatgcc 660

ttcagcaaga tgaaagatgg cgcctacatc ttgaactttg ctcgtgggac actcatcgat 720

tcagaagact tgatcaaagc cttagacagt ggcaaagttg ccggtgccgc tcttgatacg 780

tatgaatacg aaactaagat cttcaacaaa gaccttgaag gtcaaacgat tgatgacaag 840

gtcttcatga acttgttcaa ccgcgacaat gttttgatta caccacatac ggctttctac 900

actgaaactg ccgttcacaa catggtgcac gtttcaatga acagtaacaa acaattcatc 960

gaaactggta aagctgatac gcaagttaag tttgactaa 999

<210> 20

<211> 1689

<212> DNA

<213> 库德里阿兹威氏毕赤酵母

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(1689)

<223> 丙酮酸脱羧酶

<400> 20

atgactgaca aaatctccct aggtacttat ctgtttgaaa agttaaagga agcaggctct 60

tattccatct ttggtgttcc tggtgatttc aatttggcat tgttggacca cgttaaggaa 120

gttgaaggca ttagatgggt cggtaacgct aacgagttga atgccggcta cgaagctgat 180

ggttatgcaa gaatcaatgg atttgcatcc ctaatcacca cctttggtgt cggtgaattg 240

tctgccgtca atgccattgc aggttcttat gctgaacacg tcccattgat ccatattgtt 300

ggtatgcctt ccttgtctgc tatgaagaac aacttgttgt tacaccatac cttgggtgac 360

acaagattcg acaacttcac cgaaatgtca aagaaaatca gtgcaaaggt tgagattgtt 420

tacgatttgg aatcagctcc aaaattaatt aataacttga ttgaaaccgc ttatcacaca 480

aagagaccag tctacttggg acttccttcc aactttgctg atgaattggt tccagcggca 540

ttagttaagg aaaacaagtt acatttagaa gaacctctaa acaaccccgt tgctgaagaa 600

gaattcattc ataacgttgt tgaaatggtc aagaaggcag aaaaaccaat cattctcgtt 660

gacgcttgtg ctgcaagaca taacatttct aaggaagtga gagagttggc taaattgact 720

aaattccctg tcttcaccac cccaatgggt aaatctactg ttgatgaaga tgatgaagaa 780

ttctttggct tatacttggg ttctctatct gctccagatg ttaaggacat tgttggccca 840

accgattgta tcttatcctt aggtggttta ccttctgatt tcaacaccgg ttccttctca 900

tatggttaca ctactaagaa tgtcgtttat gaaaacttga tgatgaaggg cgcagtccaa 960

agattgatca gcgaattgaa gaatattaag tattccaatg tctcaacttt atctccacca 1020

aaatctaaat ttgcttacga atctgcaaag gttgctccag aaggtatcat cactcaagat 1080

tacctgtgga agagattatc ttacttctta aagccaagag atatcattgt cactgaaact 1140

ggtacttcct cctttggtgt cttggctacc cacttaccaa gagattcaaa gtctatctcc 1200

caagtcttat ggggttccat tggtttctcc ttaccagctg cagttggtgc tgcatttgct 1260

gctgaagatg cacacaaaca aactggcgaa caagaaagaa gaactgtttt gtttattggt 1320

gatggttctt tacaattgac tgtccaatca atctcagatg ctgcaagatg gaacatcaag 1380

ccatacatct tcatcttaaa caacagaggt tacactatcg aaaagttgat ccacggtcgt 1440

catgaggact acaaccaaat tcaaccatgg gatcaccaat tgttattgaa gctctttgct 1500

gacaagaccc aatatgaaaa ccatgttgtt aaatccgcta aagacttgga cgctttgatg 1560

aaggatgaag cattcaacaa ggaagataag attagagtca ttgaattatt cttggatgaa 1620

ttcgatgctc cagaaatctt ggttgctcaa gctaaattat ctgatgaaat caactctaaa 1680

gccgcttaa 1689

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 15

<400> 21

gaggaaactt caatcgtcga agaagataag 30

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 16

<400> 22

atcgaaatct agcccccttg acaaacaaac 30

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 17

<400> 23

atcgaaatct agcccccttg acaaacaaac 30

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 18

<400> 24

atctttgtgt aagaagtcga cttatggaca 30

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 19

<400> 25

tgtccataag tcgacttctt acacaaagat 30

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 20

<400> 26

tgtccataag tcgacttctt acacaaagat 30

<210> 27

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 21

<400> 27

aaagatcgtt gaacagatgg attgttttag 30

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 22

<400> 28

ctaaaacaat ccatctgttc aacgatcttt 30

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 23

<400> 29

cttgggagat agactaacac ttagaatacg 30

<210> 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 24

<400> 30

cgtattctaa gtgttagtct atctcccaag 30

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 25

<400> 31

tccctaggta cttatctgtt tgaaaagtta 30

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 26

<400> 32

gttgatttca tcagataatt tagcttgagc 30

Claims

1.一种具有耐酸性和耐热性的库德里阿兹威氏毕赤酵母NG7微生物。

2.根据权利要求1所述的微生物，其中，所述微生物以收录号KCTC12840BP保藏。

3.根据权利要求1所述的微生物，其中，乳清酸核苷5'-磷酸脱羧酶(URA3)的活性被进一步失活。

4.根据权利要求1所述的微生物，其中，丙酮酸脱羧酶的活性与其内源活性相比被削弱，并且乳酸脱氢酶的活性被进一步导入。

5.根据权利要求4所述的微生物，其中，所述微生物以收录号KCTC12841BP保藏。

6.根据权利要求1所述的微生物，其中，所述微生物具有使用甘油作为碳源的能力。

7.根据权利要求3所述的微生物，其中，丙酮酸脱羧酶的活性被失活，并且乳酸脱氢酶的活性被进一步导入。

8.根据权利要求7所述的微生物，其中，所述微生物以收录号KCTC12842BP保藏。

9.一种产生有机酸或醇的组合物，其含有根据权利要求1-8中任一项所述的微生物或其培养物。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中，所述组合物还包含甘油。

11.根据权利要求9所述的组合物，其中，所述有机酸为乳酸。

12.一种产生有机酸或醇的方法，其包括在培养基中培养根据权利要求1-8中任一项所述的微生物。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述有机酸为乳酸。

14.根据权利要求12所述的方法，其中，所述培养基包含甘油。

15.根据权利要求12所述的方法，其中，所述培养在不添加中和剂的条件下进行。