KR20200093495A - 에탄올 생산 경로가 억제된 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 젖산 생성능이 부여되고, 에탄올 생산 경로가 억제된 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 내산성 효모에서 에탄올 생성을 효과적으로 억제하고, LDH 효소를 강한 발현과 높은 효율로 발현하여, 낮은 pH에서도 성장 저하 없이 젖산을 높은 수율로 생산할 수 있다.

Description

에탄올 생산 경로가 억제된 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법{Acid Resistant Yeast Inhibited Ethanol Production and Method for Preparing Lactic Acid Using The Same}

본 발명은 에탄올 생산 경로가 억제된 내산성 효모를 이용한 젖산의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 젖산 생성능이 부여되고, 에탄올 생산 경로가 억제된 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법에 관한 것이다.

PLA(Polylacic Acid)는 젖산(lactic acid)을 락타이드(lactide)로 전환하고 이를 개환중합하여 만드는 생분해성 폴리머이며, 그 원료인 젖산은 발효를 통하여 생산하고 있다. PLA는 일회용 식품용기에 광범위하게 사용될 수 있으며, 단독 혹은 조성물이나 공중합체의 형태로 자동차 산업을 포함한 다양한 산업적 플라스틱으로도 사용이 가능한 강도를 갖고 있다. 또한 최근에는 3D 프린팅에서도 사용되는 대표적인 폴리머로 특히 3D 프린터 사용시 유해 가스 발생 및 냄새 발생이 적은 친환경 폴리머이다. 이러한 생분해성 폴리머는 최근 세계적인 문제가 되고 있는 폐 플라스틱 및 미세 플라스틱으로 환경파괴가 가속화되고 있는 현실을 해결할 수 있는 유망 폴리머로 선진 각국이 도입 확대를 추진 중에 있으며, PLA를 보다 저가로 생산하기 위하여, 단량체인 젖산의 생산성을 향상시키기 위한 노력이 진행되고 있다.

전통적인 젖산 생산 공정은 유산균을 이용하여 생산하며, 유산균에 의해 생성되는 젖산의 축적에 의하여, 산에 의한 균주 사멸 혹은 성장 멈춤을 방지하기 위하여 다양한 형태의 Ca염이나 암모니아와 같은 중화제를 이용하여 pH를 중성 pH 인 6~8 로 맞추면서 발효를 진행하게 된다. 발효가 종료되면 미생물을 분리하게 되며 Salt 형태로는 물에서의 분리 및 락타이드 전환이 어렵기 때문에 황산을 첨가하여 락테이트를 젖산으로 전환시키면서 Ca염은 CaSO₄ 형태로 제거를 하게 된다. 이와 같은 과정은 젖산 보다도 많은 양의 부산물인 CaSO₄가 발생하며, 공정 경제성을 떨어 뜨리게 된다.

한편, 락테이트(lactate)는 L형과 D형의 광학 이성질체를 가지고 있다. L형을 주로 생산하는 유산균의 경우에도 약 5~10% 의 D형을 같이 생산하는 경우가 많으며, D형을 주로 생산하는 균주의 경우 D형과 L형을 같이 생산하는 형태와 D형과 에탄올을 같이 생산하는 형태로 존재하는 등 많은 다양성을 갖고 있는 미생물 군이 있다(Ellen I. Garvie, Microbiological Reviews, 106-139, 1980).

이러한 광학이성질체 락테이트 중 D형은 주로 의료용/약물전달용으로만 사용하였으나, PLA에 적용시 D형 락타이드에 의한 결정화율이 높아지면서 열적 특성이 좋아지는 현상이 발견되고, 또한 순수 L형 폴리머와 순수 D형 폴리머를 혼합한 가공조건에 따라 구조적으로 Stereocomplex PLA가 형성될 경우 내열성이 기존의 PLA는 물론 PE/PP 보다 높아지는 새로운 폴리머가 발견되는 등 D형에 의한 결정화도 증가 및 이를 통한 PLA 물성을 강화하는 방법에 대한 연구 및 상업화가 빠르게 진행되고 있으며 PLA의 적용 분야가 확장되고 있다.

PLA는 발효를 통하여 젖산을 생산한 후, 정제 공정을 거쳐 락타이드로 전환하는 공정이 일반적이다. 락타이드 전환을 위해서는 젖산을 Hydrogenated form으로 전환하는 공정이 필요하며, 일반적인 중성 발효에의 pH는 6~7이기에 다량의 황산을 이용하여 산성 pH로 전환하게 된다. 이 과정에서 다량의 중화염이 발생하게 되며 이러한 중화염을 제거하기 위한 공정 투자비와 함께 중화염의 낮은 가치로 인하여경제성의 저하가 발생하게 된다.

한편, 자연계에서 젖산을 생산하는 Lactobacillus의 경우 젖산 생산을 상업적 성능으로 내기 위해서는 많은 양의 고가 영양분(nutrient)을 배지로 사용하여야 하며 이러한 과량의 nutrient 성분은 후단 공정의 중합(polymerization) 공정 혹은 락타이드를 중간체로 하는 경우에는 락타이드 전환 공정에 큰 저해를 주게 되어 고수율 고순도의 폴리머 또는 그 전구체를 얻기 위해서는 흡착, 증류, 이온교환과 같은 정제 공정 비용을 필요로 하게 되어 역시 높은 생산 비용의 원인이 된다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 제시된 방법으로 효모(Yeast)를 이용한 연구가 제시되었다. 효모의 경우 저가의 nutrient를 사용하여도 원활히 성장/발효를 진행하는 것으로 알려져 있으며 산성에서의 내성도 높은 것으로 알려져 있다.

산성에서 잘 자라는 효모(이하, 내산성 효모)를 이용하여 젖산을 생산할 경우, 발효 시 중화제를 이용하여 배지를 pH 6~7로 유지할 필요가 없기 때문에 발효 공정이 단순해 지고, 또한 후단 중화제를 제거하는 정제 공정이 필요 없어진다. 또한, 효모는 대사에 필요한 많은 성분을 스스로 만들기 때문에 세균 특히 Lactobacillus에 대비하여 비교적 nutrient 수준이 낮은 배지에서도 배양이 가능하기 때문에, 많은 후단 정제 공정을 생략할 수 있어, 생산 단가를 크게 낮출 수 있다.

그러나 효모를 이용하는 젖산 생산 기술에 대하여 전제 조건이 있는데 그것은 상업화에 적용하기 위해서는 균주 발효 성능 지표인 수율, 생산성, 젖산의 농도가 유산균의 성능에 유사한 수준으로 높게 유지되어야 한다는 전제 조건이 있다.

또한 많은 문헌들이 효모를 사용하여 내산성 젖산 기술 개발을 주장하고 있으나, 실제적으로는 발효에서 중화 반응을 수반하여 pH를 젖산의 pKa value 이상인 3.7 이상으로 유지하여 발효를 해야만 고성능의 발효능을 보이는 경우가 많아서 실제적인 내산성 기술이라고 표현하기에는 어렵고 공정에서의 생산비 절감 효과를 보기도 어렵다(Michael Sauer et al., Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 27:229-256, 2010).

따라서 공정 비용의 절감할 수 있는 내산성 효모는 중화제를 사용하지 않거나 최소량으로 사용하면서 발효액의 pH가 pKa value 이하에서 발효를 마칠수 있어야 하며, 발효 3대 지표가 유산균과 유사한 수준을 달성해야만 상업적 적용 의미가 있다.

일반적 효모는 글루코오스를 발효하면 에탄올을 주 생산물로 대사하며, 젖산을 생산하는 경우는 매우 드물다. 또한 높은 내산성을 갖고 있는 미생물에서 젖산을 생산하는 균주를 선택할 확률이 매우 낮기 때문에, 본 발명자들은 먼저 내산성이 우수한 효모 균주를 선별하고, 선별된 균주를 유전공학적인 방법으로 젖산 생산능을 갖도록 하였다. 또한 실제로 선정된 내산성 균주 library 에서는 모두 에탄올을 생산하는 균주가 선정이 되었다.

젖산의 생산 대사 회로는 피루베이트에서 1단계 반응으로 이루어지며 이 단계는 락테이트 디하이드로게나아제 효소에 의하여 발생되며 이후 transport를 통하여 능동/확산으로 세포 밖으로 배출된다. 이러한 젖산을 주 생산물로 발효하기 위해서는 젖산 생산능을 도입함과 동시에 기존 에탄올 생산능을 제거하기 위한 조작도 수반되어야 한다. 일반적으로 효모에서는 피루베이트에서 에탄올로의 전환은 아세트알데하이드를 거치는 2단계 반응으로 진행이 되며 피루베이트에서 아세트알데하이드로 전환하는 PDC 유전자를 제거하고 LDH를 도입하는 방식이 일반적이다.

그러나 사카로마이세스 세레비지에와 같은 Crab-tree 양성 효모의 경우에는 PDC(pyruvate decarboxylase)를 완전히 차단할 경우 세포의 지질 합성에 필요한 Cytosolic 아세틸-CoA의 공급이 진행되지 않아 성장이 크게 저해가 되며, PDC를 완전 차단하지 않는다면 LDH와 피루베이트라는 동일 기질에 대한 경쟁으로 에탄올 생산을 완전히 차단할 수 없고, 따라서 수율을 유산균 수준으로 높일 수 없는 문제가 발생하게 된다.

이에, 본 발명자들은 내산성 효모를 선별하고, 상기 효모에 젖산 생산능을 부여하기 위하여, 예의 노력한 결과, 상기 내산성 효모에서 에탄올 생산대사 경로의 ADH유전자를 젖산생산 대사 경로의 LDH 유전자로 치환하는 경우, LDH의 발현이 현저히 증가하여, 젖산 생성능이 증가하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 에탄올 생성이 억제되고, 높은 젖산 생성능을 갖는 재조합 내산성 효모를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 내산성 효모를 이용하여 젖산을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 내산성 효모 YBC 균주(KCTC13508BP)에서 g4423 유전자가 결실 또는 약화되고, 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 젖산 생성능을 가지는 재조합 균주를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 균주를 배양하여 젖산을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 젖산을 수득하는 단계를 포함하는 젖산의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프로모터와 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결되어 있는 유전자 구조물 및 상기 구조물을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자 구조물 또는 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 젖산을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 젖산을 수득하는 단계를 포함하는 젖산의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 내산성 효모에서 에탄올 생성을 효과적으로 억제하고, LDH 효소를 강한 발현과 높은 효율로 발현하여, 낮은 pH에서도 성장 저하 없이 젖산을 높은 수율로 생산할 수 있다.

도 1은 기존에 알려진 S. cerevisiae 균주와 본 발명에서 사용한 내산성 균주인 YBC 균주의 젖산에 대한 내성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 YBC 균주에서 ADH 후보 유전자의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 야생형 YBC 균주와 G4423 넉아웃 균주의 에탄올 생성능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 LDH를 allele 별로 발현하거나 목적 유전자를 제거하기 위한 gene cassette의 예제 들이다. (a)는 g4423의 allele1에 LDH를 발현하는 cassette이고, (b)는 g4423의 allele2에 LDH를 발현하는 cassette이며, (c)는 목적 유전자를 제거하기 위한 cassette의 한 예이다.
도 5는 3종의 균주 유래 LDH를 도입한 YBC 재조합 균주의 젖산생성능을 확인한 결과른 나타낸 것이다.
도 6는 YBC 균주의 g4423 유전자의 자리에 LDH 유전자를 2 copy 도입한 재조합 균주의 젖산 생성능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 YBC 균주의 g4423 유전자의 자리에 LDH 유전자를 2 copy 도입한 재조합 균주의 pH 별 젖산 생성능을 비교한 결과를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

내산성 효모는 산성 pH 에서도 당을 빠른 속도로 소모하며 높은 성장률을 나타내고 발효 조건에서는 소모한 당을 산물로 전환하는 특징을 가진다. 본 발명에서는 이러한 특징을 가지는 효모를 여러 효모 라이브러리를 통하여 선별하였으며, 선별된 균주들은 젖산 농도가 40g/L~80g/L인 조건에서도 높은 성장성 및 당소모속도를 보였다. 이러한 선별된 균주를 대상으로 하여 유전 공학을 이용한 대사 회로 조절을 실시하였다.

대사 회로 조절 방법에 대하여 전술한 바와 같이 지금까지 많은 연구자 들은 피루베이트에서 경쟁반응으로 진행되는 pyruvatae decarboxylase 효소를 제거하여 에탄올을 감소하는 연구를 진행하였으며 이에 대하여 Cargill, Toyota, 삼성 등 많은 선행 연구들이 발표된 바 있다(US7534597, US7141410B2, US9353388B2, JP4692173B2, JP2001-204464A, JP4095889B2, KR1686900B1). 이러한 PDC의 제거에 의한 에탄올감소의 효과는 매우 직접적이고 효과가 크나, 효모의 경우 PDC의 제거가 가져오는 심각한 부작용이 있으며 특히 Crab-tree positive 처럼 에탄올 발효가 매우 강한 균주의 경우에는 이 side effect가 더 크다(Yiming Zhang, et al., Microbial Cell Factory,14:116, 2015). 효모에서 중요 대사 산물인 acetyl-CoA는 미토콘드리아에서는 Pdh 효소에 의하여 공급되나, 세포질에서는 당으로부터 대사에서 PDC경로를 통해서 아세트알데하이드를 생산한다. 따라서 PDC유전자를 제거하면 세포질 내 acetyl-CoA의 공급이 중단되고 이로 인하여, 지방산 생성이 중단되어, 세포의 성장 저해가 유발하게 되며 글루코오스에 의한 호흡 관련 유전자가 억제되어 미토콘드리아 내의 TCA 회로가 약화되는 Crab-tree positive 균주에서는 이러한 현상이 매우 강화된다. 이러한 세포질 acetyl-CoA는 다른 부반응 경로로도 공급될 수 있으나 심각한 성장 저해에 의하여, 발효 산물의 생산 속도의 저해로 연결되어 상업용 균주로써의 가치가 없어진다. 이러한 side effect에 대해서는 mutation/evolution을 통하여 acetyl-CoA의 간접적 공급 회로가 강화된 균주를 만들어 내야 하나 이러한 evolution은 장기간의 연구가 필요하며 효과도 균주 별로 상이할 수 있으며 정확한 메카니즘도 알려져 있지 않다.

이와는 다른 접근 방법으로는 PDC의 다음 단계로 ADH를 차단하여 아세트알데하이드로부터 에탄올의 전환을 막는 방법을 사용할 수 있다. 이 ADH의 차단을 통한 방법은 상기의 세포질 acetyl-CoA 공급 부족을 통한 성장저해는 없으나, ADH를 차단에 의하여 에탄올의 전구체이면서 독성물질인 아세트알데하이드가 축적되어 성장이 저해되는 것이다. 이러한 ADH의 차단에 의한 아세트알데하이드 축적은 락테이트 대사경로를 강하게 발현할 수 있도록 도입하여 해소할 수 있다. 락테이트 대사는 아세트알데하이드의 윗단계 반응물인 피루베이트에서 전환이 되기에 이 경로가 강화될수록 PDC 및 ADH로의 flux 는 자연히 감소되며, 이러한 자연적인 flux의 감소는 아세트알데하이드의 축적 농도를 감소시킬 수 있다. 이러한 배경으로 본 발명에서는 ADH를 차단하면서 락테이트 생산을 높이는 효모 균주를 개발하게 되었다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 내산성 효모 YBC 균주(KCTC13508BP)에서 g4423 유전자가 결실 또는 약화되고, 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 젖산 생성능을 가지는 재조합 균주에 관한 것이다.

효모의 에탄올 생산능은 매우 강하며 특히 Crab tree effect를 갖고 있는 효모의 경우, 당농도가 높으면 산소의 존재 하에서도 에탄올을 생산하여 당을 소모한다. 이러한 강한 에탄올 생산능은 효소의 높은 활성 및 이를 강하게 발현하는 프로모터의 작용으로 가능하며 따라서 이러한 에탄올 생산능을 락테이트 생산능으로 바꾸기 위해서는 강한 LDH 효소와 함께 강한 프로모터를 사용하여야 한다. 이를 위하여 본 발명자들은 기존에 알려진 다양한 Saccharomyces cerevisiae의 프로모터를 이용하여 발현 양을 높이는 연구를 하였으나 원하는 발현 양을 나타내는 프로모터를 확보하지 못하였다. 일반적으로 프로모터는 다양한 조절 기작을 갖고 있으며 그에 따라 균주 별로 특화되는 경우가 많기에 본 발명에서는 대상 균주인 YBC 균주(KCTC13508BP)의 해당과정 및 에탄올 생산 유전자에 대하여 발현 양을 확인하여, 가장 강하게 발현되는 ADH 유전자로 g4423 유전자를 확인하였다. 확인된 ADH 유전자(g4423 유전자)를 강한 활성을 갖는 LDH 유전자로 교체한 뒤 g4423 프로모터를 통하여 발현시킬 경우, YBC 균주의 에탄올 생성 flux를 락테이트 생성 flux로 교체할 수 있을 것으로 생각하였다. 또한 YBC 균주에 도입하는 LDH의 유전자는 이로부터 만들어지는 효소의 활성도 강해야 하지만, 기질인 피루베이트에 대하여, YBC 균주 내의 PDC 유전자와 경쟁해야 하기 때문에 피루베이트에 대한 선택도가 좋아야 한다(Km Value가 낮아야 한다). 그러나 Km value를 in vitro로 측정하는 것은 측정 조건에 따른 값의 차이가 크기에 in vivo에서의 결과를 바탕으로 LDH의 선택도를 판정하는 것이 바람직하다. 따라서 높은 활성과 낮은 Km value를 통하여 락테이트를 잘 생산하는 LDH 유전자를 선택하여야 하며, 해당 특성을 확실히 확인하기 위하여, YBC 균주의 g4423 유전자 부위에 직접 여러 알려진 LDH 유전자를 도입하여 락테이트 생산능을 비교하여 최적의 유전자를 선택하였다.

본 발명에 있어서, 상기 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 g4423 유전자의 프로모터(서열번호 3 또는 서열번호 4)에 의해 발현조절되도록 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 락토바실러스 플랜타룸 유래인 것을 특징으로 할 수 있고, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 g4423 유전자의 결실 또는 약화에 의하여 모균주인 YBC 균주(KCTC13508BP) 보다 에탄올 생성능이 감소되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서는 상기 락토바실러스 플랜타룸 유래의 LDH를 g4423 유전자를 대체하여 삽입한 YBC의 재조합 균주에서 57.1g/L의 락테이트를 생성하였다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, (a) 상기 재조합 균주를 배양하여 젖산을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 젖산을 수득하는 단계를 포함하는 젖산의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명을 통하여 락테이트 생산이 크게 증가하고 에탄올 생산이 크게 감소한 우수한 내산성 균주를 확보할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프로모터와 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결되어 있는 유전자 구조물 및 상기 구조물을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자 구조물은 서열번호 5 또는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 터미네이터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 유전자 구조물 또는 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물 및 (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 젖산을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 젖산을 수득하는 단계를 포함하는 젖산의 제조방법에 관한 것이다.

상기 g4423 프로모터는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 서열과 바람직하게 90% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 상동성을 나타내는 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 g4423 프로모터와 90% 이상의 상동성을 가지면서 동등한 수준의 발현효율을 나타낸다면 실질적으로 균등한 프로모터라 할 수 있다.

경우에 따라서, 본 발명에 따른 g4423 프로모터는 목적 유전자의 발현 효율을 높이기 위해 당업계에 알려진 공지의 기술을 적용하여 변이시킬 수도 있다.

본 발명에 있어서, 재조합 효모가 내산성이 있는 것을 특징으로 할 수 있고, 본 발명에 적합한 내산성 재조합 효모를 제작하기 위해서는 유기산에 내산성을 가지는 숙주효모를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 내산성 효모는 사카로마이세스 속, 카자크스타니아 사카로마이세스 및 칸디다 속으로 구성된 군에서 선택되는 내산성을 가지는 효모일 수 있으며, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 카자크스타니아 엑시구아 (Kazachstania exigua), 카자크스타니아 불데리 (Kazachstania bulderi), 및 칸디다 휴밀리스 (Candida humilis)로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

'내산성 효모'란 3-HP나 Lactic acid 등의 유기산에 대한 저항성을 가지는 효모를 의미하는 것으로, 내산성은 다양한 농도의 유기산을 포함하는 배지에서의 생장을 평가하여 확인할 수 있다. 즉, '내산성 효모'란 고농도의 유기산을 포함하는 배지 내에서 일반 효모에 비하여 높은 생장률 및 바이오매스 소모율을 나타내는 효모를 의미한다.

본 발명에 있어서,'내산성 효모'란 유기산의 pKa 값 미만의 pH에서, 배지에 유기산이 함유되지 않은 경우에 비해, 배지에 1M 이상의 유기산(특히, 젖산)이 함유된 경우, 적어도 10%의 바이오매스 소모율 (당소모율 등) 또는 적어도 10%의 비생장률을 유지할 수 있는 효모로 정의한다. 보다 구체적으로, 본 발명에서,'내산성 효모'란 pH 7인 경우에 비해, pH 2~4에서 적어도 10%의 바이오매스 소모율 (당소모율 등) 또는 적어도 10%의 비생장률을 유지할 수 있는 효모로 정의한다.

본 발명에 따른 재조합효모는 통상의 방법에 따라 상기 유전자를 숙주 효모의 염색체(chromosome) 상에 삽입시키거나, 상기 유전자를 포함하는 벡터를 숙주 효모에 도입시킴으로써 제조할 수 있다.

상기 숙주효모는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 통상적으로 사용되며, 본 발명의 일 실시예에서는 내산성 효모를 이용하였으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 목적 DNA가 충분히 발현될 수 있는 것이라면 어떠한 종류의 효모라도 무방하다.

상기 재조합효모는 임의의 형질전환(transformation) 방법에 따라 제조할 수 있다. "형질전환"이란 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미하며, 일반적인 형질전환 방법에는 전기천공법(electroporation), 초산 리튬-PEG법 등이 있다.

또한, 본 발명에서 유전자를 숙주 미생물의 염색체 상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 임의의 유전자 조작방법을 사용할 수 있으며, 일 예로는 레트로바이러스벡터, 아데노바이러스벡터, 아데노-연관 바이러스벡터, 헤르페스심플렉스 바이러스벡터, 폭스바이러스벡터, 렌티바이러스벡터, 비바이러스성벡터 등을 이용하는 방법이 있다. "벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물 일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이며 또한 Linearized DNA 또한 효모의 게놈 Integration을 위하여 통상적으로 사용하는 형태이다.

전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 또는 영양 요구 마커 유전자 (auxotrophic marker gene) 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있도록 하는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation) 할 수 있다.

아울러, 상기 유전자는 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비리더(leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.

일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션 (연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않고, 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 상태에서, 다른 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택하여 적용할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에 서 복제되어야만 하기 때문이고, 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.

본 발명에 있어서, 탄소원은 글루코즈, 자일로즈, 아라비노즈, 수크로즈, 프룩토즈, 셀룰로오즈, 갈락토오스, 글루코즈 올리고머 및 글리세롤로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 배양은 미생물 예를 들어 대장균 등이 더 이상 작용하지 못하도록 (예를 들어, 대사체 생산 불가능) 하는 조건에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 배양은 pH 1.0 내지 6.5, 바람직하게 pH 1.0 내지 6.0, 보다 바람직하게는 2.6 내지 4.0인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 내산성 균주 YBC 의 선정 및 효과

본 발명자들은 다양한 효모 균주에 대한 테스트를 통하여 내산성을 갖는 균주 군을 선별한바 있다(대한민국 특허공개 제2017-0025315호). 상기 선별된 효모 균에 대하여 젖산을 배양 초기에 배지에 첨가하여 미생물의 성장 및 당소모 속도를 확인하면서 내산성이 가장 좋은 균주를 선별하였다. 이때 접종 OD 는 4, 배지는 YP 배지(20g/L Peptone, 10g/L Yeast extract)에 Glucose 3.5%를 사용하였으며 50ml의 Flask culture로 30℃, 100 rpm 조건에서 실험을 실시하였으며, 젖산 농도는 각 초기 60g/L로 하여 배양을 실시하였다. 이 결과를 비교 분석하여 내산성이 가장 우수한 균주인 YBC 균주를 선정하고, 2018 년 4월 11일자로 기탁기관 한국생명공학연구원 생물자원센터에 (KCTC13508BP) 으로 기탁하였다.

계통분석을 통하여 YBC 균주는 S. cerevisiae와 유사한 균주이며 2배체의 유전자를 갖고 있고 (Diploid), Crab-tree positive 한 특성을 갖고 있다는 것을 확인하였다.

선별된 내산성 YBC 균주의 내산성을 확인하기 위하여, S. cerevisiae (CEN.PK 113-7D) 균주와 동일 조건에서 배양을 하였다. 40g/L 의 글루코스 농도의 YP 배지에 30g/L 및 60g/L의 젖산을 각각 첨가한 후 30℃, 200rpm 에서 50시간 배양 하면서, 배양액의 OD 값을 비교하였으며, 도 1에 나타난 바와 같이, YBC 균주의 경우는 60g/L의 고농도 젖산 환경에서도 성장이 가능한 반면, S. cerevisiae CEN.PK 균주는 60g/L의 젖산 농도에서 전혀 성장하지 못하는 것을 확인할 수 있다.

실시예 2: YBC 균주에서 알코올 생산 유전자의 발현율을 확인하여 주 발현 유전자 확인

본 실시예에서는 YBC 균주에서 글루코오스 존재 하에서 강하게 발현하는 해당과정(glycolysis) 및 에탄올 생산 관련 유전자를 대상으로 강한 발현과 함께 해당 유전자 치환시 성장에 영향이 없으면서도 효과가 높은 유전자를 선택하고자, ADH 유전자를 타겟으로 하였다. 특히 미생물 성장에 직접적인 영향을 주지 않기 위해서는 해당과정에 관련된 유전자를 회피하여야 하는데 이는 해당과정 관련 유전자가 없어지거나 약화될 경우 미생물 성장에 중요한 피루베이트 생성이 억제되거나 연쇄반응의 균형에 문제가 생기게 되어 미생물의 성장에 영향을 주고 결론적으로 발효능이 떨어지게 되기 때문이다. 따라서 유전자 치환을 위한 내재 유전자로는 대상 균주가 에탄올생산 균주인 경우는 PDC 유전자 혹은 ADH의 유전자 중 선택하게 되며 PDC의 넉아웃(K/O) 시의 Negative 효과를 고려하여, ADH를 선택하여 제거하는 것으로 선정하였다.

효모와 같이 에탄올 발효능이 강한 균주는 매우 다양한 강도 및 역할을 담당하는 ADH들이 존재하게 되며, YBC 균주의 ADH 중 에탄올을 생산을 담당하는 주된 ADH를 확인하고 해당 프로모터를 사용하기 위하여 YBC의 유전체 정보 및 S. cerevisiae 의 알려진 ADH 유전자 정보를 비교하여 여러 후보유전자를 선정하였고 이에 대한 qPCR 을 실시하였다.

Genome Full sequencing Data에서 S. cerevisiae 및 Bioinformatics 정보를 이용하여 YBC 균주의 게놈에 존재하는 ADH 유전자 후보 7종을 선별하였으며, 선별 유전자에 특이적인 올리고머를 디자인하여 RT-qPCR 를 수행하였다.

S. cerevisiae의 게놈 전체 서열 데이터에서 Bioinformatics 정보를 이용하여 ADH 유전자 후보 7종을 선별하였으며(표 1), 선별 유전자에 특이적인 올리고머를 디자인 (표 2) 하여 RT-qPCR 를 수행하였다.

S.cerevisiae gene	Homolog in YBC	Identity-% (protein)	Genomic location*	Targetingsignal
ADH1	g4423	89.1 %	ADH5	no
ADH2	g4423	77.2 %	ADH5	no
ADH3	g2289	80.4 %	ADH3	mitochondrial
ADH4	No homologs
ADH5	g4423	74.4 %	ADH5	no
SFA1	g4117	79.5 %	SFA1
ADH6	g5126	63.4 %	-	no
	g1044	64.1 %	-	no
	g4395	64.0 %	-	no
	g727	63.7 %	-	no
	g2807	60.4 %	-	no
ADH7	g5126	63.0 %	-	no
	g1044	60.0 %	-	no
	g4395	61.8 %	-	no
	g727	62.1 %	-	no
	g2807	58.0 %	-	no

* S. cerevisiae genome와 비교하여 YBC에서 유사한 유전자 순서를 갖고 있는 유전자

qPCR 용 프라이머

이름	서열번호	Sequence	설명
oSK-1318	11	CGGACTTTAGAGCCTTGTAGAC	g4423 qPCR fwd
oSK-1319	12	ATCTGGTTACACTCACGATGG	g4423 qPCR rev
oSK-1320	13	CCAAGTACGTTAGAGCTAACGG	g4423 qPCR 2 fwd
oSK-1321	14	GAGCTTCTCTGGTATCAGCT	g4423 qPCR 2 rev
oSK-1322	15	AGCTTTAGCAAACATTAGACCC	g1044 qPCR fwd
oSK-1323	16	ATTCCATCCGAATATGCTGGT	g1044 qPCR rev
oSK-1324	17	GGAACCTAAATGACTGTTGGCA	g1044 qPCR 2 fwd
oSK-1325	18	AGGATGTTGATTTCGACTCGT	g1044 qPCR 2 rev
oSK-1326	19	TTCCAAAGGGTACCAATTTAGCTG	g2289 qPCR fwd
oSK-1327	20	GTACCGCTAATGAACCTAAACCA	g2289 qPCR rev
oSK-1328	21	AGAGCTGACACTAGAGAAGCC	g2289 qPCR 2 fwd
oSK-1329	22	GATGTGTCTACGACGTATCTACC	g2289 qPCR 2 rev
oSK-1330	23	GTACTGGTAACGTCCAAGTC	g4117 qPCR fwd
oSK-1331	24	GAACCCTTCCATACTCTACCA	g4117 qPCR rev
oSK-1332	25	TTCAGTTCGTGCTACTCAAGG	g4117 qPCR 2 fwd
oSK-1333	26	TCAATTGCAACGACAGAGAC	g4117 qPCR 2 rev
oSK-1334	27	CCGTACCCTGAAGAGTTTACTG	g2807 qPCR fwd
oSK-1335	28	CAACCATAGATTCACGAATTGCTC	g2807 qPCR rev
oSK-1336	29	AGTGGATTTGGATTAATGGGTG	g2807 qPCR 2 fwd
oSK-1337	30	GCTTCTGTAACACCTTTAACAC	g2807 qPCR 2 rev
oSK-1338	31	AAATTGGTGACCGTGTTGGT	g727 qPCR fwd
oSK-1339	32	AACCACCTTTACTACGGTAACCA	g727 qPCR rev
oSK-1340	33	TTTAGTCGTCATCTGTTCAGGT	g727 qPCR 2 fwd
oSK-1341	34	GAGACACCTAACAAACCAAATGG	g727 qPCR 2 rev
oSK-1342	35	GATTCAAGCTTCTTCTCGTATCGG	g3610 qPCR fwd (ALG9 homolog)
oSK-1343	36	GGAAATGATACCATTCACGACCT	g3610 qPCR rev (ALG9 homolog)
oSK-1350	37	GTTCCGTCAAAGAAATCAAGCA	g5126 qPCR fwd
oSK-1351	38	TGGTAAACCTGTATCTGACATCAC	g5126 qPCR rev
oSK-1352	39	TTTAGTTGTCATTTGTGCCGGT	g5126 qPCR 2 fwd
oSK-1353	40	GACACCTAACAAACCAAACGGA	g5126 qPCR 2 rev
oSK-1386	41	CTTTGAGTGCAAGTATCGCC	ALG9 qPCR fwd
oSK-1387	42	TGTGTAATTGTTCACCAAAGCC	ALG9 qPCRrev

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, g4423 유전자의 발현량이 현저히 높은 것으로 나타나, g4423이 주 에탄올 생산 유전자로 확인되었다.

실시예 3: YBC 균주에서 g4423을 제거하여 에탄올 생성 저하 효과 확인

실시예 2에서 확인된 YBC 균주의 주 ADH인 g4423를 넉아웃시킨 재조합 균주를 제작하고, ADH 제거가 균주의 성장에 미치는 영향을 확인하였다.

g4423 및 UTR의 정보를 바탕으로 하여 g4423 ORF가 제거되고 5' 과 3' UTR 및 항생제 마커가 있는 도 4(c)와 유사한 유전자 카세트를 제작하여 Donor DNA로 사용하였다. Donor DNA의 제작에는 전술한 바와 같이 제한효소를 이용한 클로닝 방법과 Gibson assembly를 이용한 방법이 사용되었다. 제작된 Donor DNA를 도입하고 마커유전자에 대응하는 plate에서 자란 콜로니에 대하여 g4423을 확인하기 위한 ORF 용 프라이머(Primer forward(서열번호 43) : GAGATAGCACACCATTCACCA, Primer reverse(서열번호 44): CAACGTTAAGTACTCTGGTGTTTG)를 이용하여 ORF가 제거되었음을 확인하였다.

상기 제작된 g4423 넉아웃 균주를 40g/L의 글루코오스 농도를 갖는 YP 배지에서 150ml 배양하였으며 30℃, 200rpm 에서 배양하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, g4423 넉아웃 균주(도 3의 B)는 에탄올 생성능이 야생형 YBC 균주(도 3의 A)에 비하여 현저히 감소된 것을 확인할 수 있으며, ADH 활성 약화에 따라 NADH 산화반응이 제한되어 글루코오스 uptake 능력이 저하되고, 이에 따른 성장 저하와 이를 보완하기 위한 Glycerol 생산 증대 등의 특징을 나타내었다.

실시예 4: g4423 프로모터를 이용한 공지의 LDH 유전자의 발현 및 최적 LDH 선정

YBC 균주에 도입할 LDH 유전자의 후보 유전자를 문헌을 통하여 선별하였으며 (N. Ishida et. al., Appl. Environ. Micobiol., 1964-1970, 2005; M. Sauer et al., Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 27:1, 229-256, 2010), L. helveticus 유래 LDH 유전자, R. oryzae 유래 LDH 유전자 및 L. plantarum 유래 LDH 유전자로 총 3종의 유전자를 선정하였다.

각 효소의 유전자는 상기 문헌에서 효모에서 발현시 발현양이 좋고 락테이트를 잘 생산하는 LDH를 선택하였으며, 가급적 pH < pKa 인 산성 조건에서 성능이 pH > pKa 보다 높은 일반적인 pH에서의 성능 차이가 적은 효소를 선택하였다. 또한 NADH 이외의 조효소로 Fructose-1,6-diphosphate를 필요로 하지 않는 유전자를 선택하였다. 해당 유전자의 Km value에 대해서는 많은 문헌에서 그 값을 비교할 수 있으며 비교적 Km value가 낮아서 YBC 내부의 PDC 효소와 경쟁시 많은 Flux를 만들 수 있는 것을 선택하였다. 그러나 Km value 경우 in-vitro로 측정시 media, substate 농도, 조효소 농도 등에 따라 그 값이 변하기 때문에 실제의 성능은 각 균주 내에서 직접 발효 결과로 확인하여야 한다.

따라서, 상기 선정된 3개의 유전자를 각각 YBC 균주에 도입하여 g4423 프로모터를 이용하는 재조합 균주를 제작한 후, 각 재조합 균주의 젖산 생성능을 확인하였다.

g4423 및 UTR의 정보를 바탕으로 하여 g4423 ORF가 제거되고 5' 과 3' UTR 및 antibiotic marker 가 있는 도 4(a)의 유전자 카세트를 제작하였으며, g4423의 ORF자리에는 3종의 LDH 에 대하여 Yeast codon usage로 최적화된 서열 (서열번호 2, 8, 및 10의 유전자 서열과 서열번호 1, 7 및 9의 아미노산 서열로로 각 Lactobacillus plantarum, Lactobacillus helveticus, Rhizopus oryzae의 LDH를 합성한 뒤 제한효소를 이용하여 도입하였다.

완성된 카세트에서 Donor DNA를 증폭하고 이를 YBC 균주에 형질전환, 성장한 콜로니에 대하여 g4423 ORF를 확인하는 프라이머와 (Primer forward ORF inside(서열번호 45) : CAACGTTAAGTACTCTGGTGTTTG, Primer reverse ORF inside(서열번호 46): GAGATAGCACACCATTCACCA, Primer forward ORF outside(서열번호 47) 5' : GGATTCCTGTAATGACAACGCGAG, Primer reverse ORF outside (서열번호 48)3' : TGGATACATTACAGATTCTCTATCCT) 각 LDH 의 ORF가 존재하는 것을 다음의 프라이머를 이용하여 각 LDH가 1copy로 도입 되었음을 확인하였다.

L. helveticus Primer forward(서열번호 49) : ATGAAAATTTTTGCTTATGG

L. helveticus Primer reverse(서열번호 50): TTAATATTCAACAGCAATAG;

R. oryzae Primer forward(서열번호 51): ATGGTTTTGCATTCTAAAGT

R. oryzae Primer reverse(서열번호 52) : TTAACAAGAAGATTTAGAAA

L. plantarum Primer forward(서열번호 53): ATGTCTTCTATGCCAAATCA

L. plantarum Primer reverse(서열번호 54) : TTATTTATTTTCCAATTCAG

YBC 균주는 Diploid 균주이기 때문에 LDH 유전자를 하나 삽입한 상태에서도 다른 g4423 유전자가 작동을 하고 있으며, 이에 따라 에탄올 생산양이 완전히 넉아웃(K/O) 된 균주만큼 줄어들지는 않는다.

상기 제작된 재조합 균주를 플라스크에서, YP 배지에 4% glucose 와 150mg/L의 Uracil을 첨가한 배지를 사용하여, 30℃/100 rpm 에서 24시간 진탕배양하였다.

배양액 내의 락테이트와 에탄올은 HPLC를 통하여 확인하였다. 배양액 중의 글루코오스, 에탄올, L-락테이트 농도는 Waters 1525 Binary HPLC pump에 Bio-Rad Aminex 87-H 컬럼을 장착하여 분석하였다. 글루코오스와 에탄올은 Waters 2414 Refractive Index detector를, 사용하여 분석하였고, L-락테이트는 Waters 2489 UV/Visible Detector(210nm)를 사용하여 분석하였으며, 각 성분 별로 농도에 따른 피크(peak) 면적 스탠다드 커브를 작성하여 농도를 계산하였으며 구체적인 분석 조건은 다음과 같다.

1. Mobile Phase Condition: 0.005M H2SO4 solution

2. Flow rate: 0.6 mL/min

3. Run time: 40 min

4. Column Oven temperature: 60ㅀC

5. Detector temperature: 40ㅀC

6. Injection volume: 10 μL

7. Auto sampler tray temperature: 4ㅀC

그 결과, 도 5 및 표 3에 나타난 바와 같이, 치환된 대상 유전자가 모두 LDH 활성을 나타내는 것이 확인되었으며, L. plantarum 유래 LDH 유전자가 도입된 균주가 가장 높은 젖산 생성능을 나타내었다.

표 3에 해당 LDH 의 문헌 보고된 Km 값을 표시하였다. 그러나 이 수치는 동일 조건에서 테스트된 효소 간의 비교로만 사용할 수 있으며 절대값의 의미는 없다. 당해 실험에서도 Km 값이 상대적으로 높은 L. plantarum 유래의 유전자로부터 발현한 LDH 가 균주내에서 PDC유전자와 경쟁하여 락테이트를 잘 생산할 수 있음을 확인하였다. 또한 상기 결과를 통하여 내산성 균주 YBC에서 PDC와 경쟁하면서 가장 높은 젖산 생성능을 나타내는 유전자는 L. plantarum 유래의 LDH 유전자임을 확인하였다.

	L-LDH
	L. helveticus	R. oryzae	L. plantarum
Km value of enzyme	0.25①	1.3~4.8②	4.3③
락테이트(g/L)	2.3	0.8	6.0

① Kirsi savijoki and Airi Palva, Applied and Environmental Microbiology, 2850-2856, 1997

② Christopher D. S. et al., Enzyme and Microbial Technology 44(2009) 242-247, 2009

③ Anna Feldman-Salit et al., The Journal of Biological Chemistry, 288, 21295-21306. 2013

실시예 5: 선정된 LDH 를 이용하여 에탄올 생산을 차단하고 락테이트 생산능 확인

YBC 균주의 g4423 유전자의 자리에 실시예 4에서 선정된 L. plantarum 유래의 LDH 유전자를 2 copy 도입한 재조합 균주를 제작하고, 젖산 생성능을 확인하였다.

해당 YBC 균주는 dipoloid 로 2배체의 유전자가 존재를 한다. 본 발명자들은 각 allele 별로 도 4의 (a)와 (b) 와 같이 서로 다른 항생제 내성 유전자를 갖는 Donor DNA를 실시예 4의 제작방법으로 완성한 후, 각 Allele 별로 2회에 걸쳐 YBC 균주에 도입을 하였다. 이후 g4423의 ORF Primer를 이용하여 g4423 ORF가 완전히 제거가 되었음을 확인하였으며, 각 항생제 내성 유전자가 존재하는 것으로 2copy의 유전자가 도입된 것을 확인하였다. 항생제 내성 유전자가 있을 경우 향후의 유전자 조작을 할 수 없기에, 각각의 항생제는 카세트에 도입되어 있는 Cre-loxP 법을 이용하여 제거하였다.

상기 재조합 균주를 이용하여 발효기에서 젖산 생성능을 확인하였다. 배지는 Hestrin and Schramme 배지(Glucose 120g/L, Peptone 5g/L, Yeast extract 5g/L, citric acid 1.15 g/L, K2HPO4 2.7g/L, MgSO4ㅇ7H2O 1g/L) 을 사용하였으며 1L 부피로 발효기에서 120g/L 의 당농도로 배양을 하였다. 배양 온도는 30℃ 이고 pH 3으로 조절하였으며 350~450 rpm 수준을 유지하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 일반적으로 ADH가 제거된 균주에서 보이는 아세트알데하이드에 의한 성장저해는 확인되지 않았으며, 글리세롤 생성 증가도 나타나지 않아, 새로이 발현된 LDH 효소에 의하여 NADH의 산화가 잘 일어나고 내부의 산화 환원 균형이 잘 맞고 있다는 것을 확인할 수 있다. 또한 추가 LDH를 발현 시킬 경우 NADH의 산화 속도가 더욱 빨라져서 락테이트 생산성 및 농도가 더욱 증가할 수 있을 것으로 판단된다.

상기의 결과는 기존에 알려진 ADH 차단 및 관련 LDH 발현을 이용한 결과 대비 큰 진전을 이룬 것이다(Kenro Tokuhiro et al., Applied Microbiology and Biotechnology,82:883-890, 2009). 먼저 에탄올 생성이 크게 감소하였음에도 당을 원활히 소모하면서 락테이트로 전환되는 것을 알 수 있으며, 글리세롤의 수준이 낮다는 것은 강하게 발현된 LDH에 의하여 NADH의 산화 반응을 충실히 수행하고 있다는 것을 보여 주는 것이며, 배양액의 OD 값으로부터 젖산에 의한 내산성이 유지되고, 에탄올차단에 따른 중간 산물인 아세트알데하이드의 독성 영향이 매우 적음을 확인할 수 있었다. 이와 같은 성능 지표는 또한 추가로 에탄올 생성을 차단하여 락테이트로 전환할 경우 수율, 농도, 발효 속도의 3대 지표가 원활히 증가하여 상업적 사용이 가능한 균주의 개발이라는 목표를 달성할 수 있을 것이라는 것을 보여준다.

보다 자세히 기존 기술을 예로 하여 설명을 하자면, 전술한 바와 같이 ADH를 차단할 경우 에탄올 생산이 줄어들 수 있으나, 줄어드는 정도와 비례하여 피루베이트와 에탄올의 전구체인 아세트알데하이드가 축적되어 세포에 미치는 독성이 높아지는 경향이 있다. 또한 ADH를 차단하면 ADH를 통하여 발생하는 NADH의 산화반응이 저해되어 심각한 당 소모 속도 저감 및 이를 해소 하기 위하여 다른 환원물질인 글리세롤 생산 증가가 발생하게 되며 이는 젖산의 생산성 감소 및 부산물의 증가가 발생한다. 이때 LDH를 효과적으로 발현시킬 경우 LDH에 의한 NADH 산화로 인하여 이러한 현상이 감소되기는 하나 이러한 LDH의 Km value가 세포 내의 PDC 효소와 경쟁하게되므로, 락테이트를 원활히 생산할 수 있으면서 충분한 양의 효소가 강력하게 발현이 되어야 당 소모속도 저해 및 성장저해를 일으키지 않을 정도로 NADH를 산화할 수 있고, ADH 차단으로 발생하는 문제를 해결할 수 있다. 기존의 기술들은 이러한 문제를 해결하기 어려웠으며 NADH의 산화를 촉진하기 위하여 강한 aeration 을 통한 TCA cycle을 작동하여, 이를 완화 시키고자하였으나 당 소모 속도의 감소문제를 완전히 해결하기는 어려웠다.

관련 예를 하기 표 4 및 표 5에 나타내었다.

주요 ADH가 차단된 균주에서 LDH를 발현하는 경우 (Adh1(pLdhA68X)) 수율 생산성 및 농도에서 현저히 낮은 값을 보이는 것을 알 수 있어서 기존 기술에서 LDH의 강한 발현과 적정한 LDH의 선정을 하지 않을 경우 ADH 차단을 통한 Lactate 생산의 어려움을 알 수 있다. 또한 이러한 기술을 낮은 pH에서 원활히 Lactic acid를 생산하도록 내산성 균주에서 구현하는 것은 더욱 어려운 기술이다.

비교군으로 ADH가 차단되지 않은 균주에서 LDH를 ADH1 프로모터로 발현하는 경우에는 LDH로 인한 락테이트 생산 및 균주 성장이 잘 되고 있음을 알 수 있어서 (에탄올은 Ldh 와 PDC의 경쟁반응으로 인해 생산량이 줄어드는 효과도 보임) 상기의 Negative 한 영향들이 ADH를 차단함으로써 발생한다는 것을 알 수 있다. 그러나 이렇게 에탄올이 차단되지 않은 균주에서는 피루베이트로부터의 락테이트 및 에탄올의 수율 경쟁으로 인하여 추가의 수율 향상이 불가능하다는 것은 자명한 사실이다.

또한, 참고로 PDC의 활성이 야생형 균주 대비 2% 수준으로 남아 있는 균주에 LDH를 발현시켜 NADH의 산화를 LDH가 담당하면서 젖산을 생산하도록 하는 연구도 첨부하였다. 해당 균주(YSH 4.123.-1C(pLdhA68X))는 전술한 바와 같이 세포질 acetyl-CoA의 공급을 위하여 야생형 대비 2%의 PDC 활성을 남겼다. 이로 인하여 에탄올이 10g/L로 생산되고 있다는 것을 확인하였으며, 이 값은 젖산 생성을 기준으로는 10/92X90.08/46.07 = 0.21의 수율 손해가 있는 것으로 이러한 넉다운(Knock down)을 이용한 PDC 활성 조절만으로 젖산 생산 시 에탄올 생산의 차단이 어렵다는 것을 알 수 있다. 또한 완전히 PDC activity를 제거할 경우에는 문헌에 보고된 바와 같이 Cytosolic acetyl coA 의 공급 제한으로 인한 세포 성장의 심각한 저해가 있음은 이미 잘 알려진 사실이다.

균주와 플라스미드

Strain	Description
YBC-001	YBC wt
YBC-Ldh1	YBC Δg4423::ldh
InvSc1	Saccharomyces cerevisiae, Diploid, Matα, his3Δ1, leu2, trp1-289, ura3-52 (Invitrogen Corp) - Adh 는 intact
Adh1	Saccharomyces cerevisiae, Haploid, Matα, can1-100, ade2-1, lys2-1, ura3-52, leu2-3/112, trp1- Δ901, adh1-0 (Institut fur Mikrobiologie, Frankfurt am Main)
YSH 4.123.-1C	Saccharomyces cerevisiae, Haploid, Matα, leu2-3/112, trp1 -92, tra3-52, pdc1-14 (Gφteborg University) : PDC activity 2% remained
pLdhA68X	Plasmid containing R. oryzae LDH in S. cerevisiae Adh1 promoter

균주들의 젖산 생성능

	Lactic acid (g/L)	Yield (g/g)	생산성 (g/L/hr)	Reference
InvSc1(pLdhA68X)	38.0	0.445	1.2	Christopher D. Skory, J. Ind Microbiol Biotechnol (2003) 30:22-27 : pH > pKa 조건, pH 가 낮아질 경우 Lactic acid 수율 더욱 감소함.
Adh1(pLdhA68X)	17.0	0.17	0.25	상동
YSH 4.123.-1C(pLdhA68X)	31.0	0.336	0.72	상동
YBC-LDH1	57.1	0.53	1.78	본 발명

본 발명을 통하여 락테이트 생산이 크게 증가하고 에탄올 생산이 크게 감소한 우수한 내산성 균주를 확보할 수 있었다.

본 발명의 재조합 균주의 내산성을 확인하기 위하여, 발효 시의 pH 조건을 젖산의 pKa 값 이상인 pH 4와 pH 5로 염기인 NaOH를 이용하여 조정하면서 발효하여 비교하였다. 그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 당해 균주는 pKa보다 낮은 pH에서도 높은 pH에서와 유사한 성능을 보이는 것을 확인할 수 있으며, 이는 기존의 효모를 이용한 젖산 생산 균주에서 보이고 있는 pKa 이하의 pH에서의 성능 저하가 없는 결과로 당해 균주의 내산성을 잘 보여주는 것이다. 또한 본 발명의 재조합 균주는 120g/L의 당을 모두 소모하는 성능을 pH 3, pH 4 및 pH 5에서 모두 보여주었으며, 이 역시 당해 균주의 내산성을 잘 보여 주는 결과라 할 수 있다. 표 6에는 일반적인 효모를 이용한 젖산 생산 균주 개발에서 나타나는 pH에 따른 성능 저하의 예를 나타내었다.

일반적 Yeast를 이용한 젖산 생산 균주들의 pH 별 성능

Yeast	LDH	pH < pKa performance	pH > pKa performance	Reference
S. cerevisiae	B. taurus (multicopy plasmid)	6.1 g/L Lactic acid, 0.23g/L/hr productivity	11.4g/L Lactic acid, 0.3g/L/hr productivity	Michael Sauer et al., Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 27:229-256, 2010
K. marxianus	L. helveticus (integrated into PDC1 locus)	9.1 g/L Lactic acid, 0.13g/L/hr productivity	99g/L Lactic acid, 2g/L/hr productivity	상동
P. stiptis	L. helveticus (integrated, 1 copy)	15 g/L Lactic acid, 0.17g/L/hr productivity	58g/L Lactic acid, 0.39g/L/hr productivity	상동
S. cerevisiae	L. mesenteroides	48.9 g/L Lactic acid, 0.41g/L/hr productivity	112 g/L Lactic acid, 2.2g/L/hr productivity	Seung Ho Baek, et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2016 Mar; 100(6):2737-48.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

기탁기관명 : 한국생명공학연구원

수탁번호 : KCTC13508BP

수탁일자 : 20180411

<110> SK Inovation <120> Acid Resistant Yeast Inhibited Ethanol Production and Method for Preparing Lactic Acid Using The Same <130> P18-B060 <160> 54 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 320 <212> PRT <213> Lactobacillus plantarum <400> 1 Met Ser Ser Met Pro Asn His Gln Lys Val Val Leu Val Gly Asp Gly 1 5 10 15 Ala Val Gly Ser Ser Tyr Ala Phe Ala Met Ala Gln Gln Gly Ile Ala 20 25 30 Glu Glu Phe Val Ile Val Asp Val Val Lys Asp Arg Thr Lys Gly Asp 35 40 45 Ala Leu Asp Leu Glu Asp Ala Gln Ala Phe Thr Ala Pro Lys Lys Ile 50 55 60 Tyr Ser Gly Glu Tyr Ser Asp Cys Lys Asp Ala Asp Leu Val Val Ile 65 70 75 80 Thr Ala Gly Ala Pro Gln Lys Pro Gly Glu Ser Arg Leu Asp Leu Val 85 90 95 Asn Lys Asn Leu Asn Ile Leu Ser Ser Ile Val Lys Pro Val Val Asp 100 105 110 Ser Gly Phe Asp Gly Ile Phe Leu Val Ala Ala Asn Pro Val Asp Ile 115 120 125 Leu Thr Tyr Ala Thr Trp Lys Phe Ser Gly Phe Pro Lys Glu Arg Val 130 135 140 Ile Gly Ser Gly Thr Ser Leu Asp Ser Ser Arg Leu Arg Val Ala Leu 145 150 155 160 Gly Lys Gln Phe Asn Val Asp Pro Arg Ser Val Asp Ala Tyr Ile Met 165 170 175 Gly Glu His Gly Asp Ser Glu Phe Ala Ala Tyr Ser Thr Ala Thr Ile 180 185 190 Gly Thr Arg Pro Val Arg Asp Val Ala Lys Glu Gln Gly Val Ser Asp 195 200 205 Asp Asp Leu Ala Lys Leu Glu Asp Gly Val Arg Asn Lys Ala Tyr Asp 210 215 220 Ile Ile Asn Leu Lys Gly Ala Thr Phe Tyr Gly Ile Gly Thr Ala Leu 225 230 235 240 Met Arg Ile Ser Lys Ala Ile Leu Arg Asp Glu Asn Ala Val Leu Pro 245 250 255 Val Gly Ala Tyr Met Asp Gly Gln Tyr Gly Leu Asn Asp Ile Tyr Ile 260 265 270 Gly Thr Pro Ala Ile Ile Gly Gly Thr Gly Leu Lys Gln Ile Ile Glu 275 280 285 Ser Pro Leu Ser Ala Asp Glu Leu Lys Lys Met Gln Asp Ser Ala Ala 290 295 300 Thr Leu Lys Lys Val Leu Asn Asp Gly Leu Ala Glu Leu Glu Asn Lys 305 310 315 320 <210> 2 <211> 963 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum <400> 2 atgtcttcta tgccaaatca tcaaaaagtt gttttggttg gtgatggtgc tgttggttct 60 tcttatgctt ttgctatggc tcaacaaggt attgctgaag aatttgttat tgttgatgtt 120 gttaaagata gaactaaagg tgatgctttg gatttggaag atgctcaagc ttttactgct 180 ccaaaaaaaa tttattctgg tgaatattct gattgtaaag atgctgattt ggttgttatt 240 actgctggtg ctccacaaaa accaggtgaa tctagattgg atttggttaa taaaaatttg 300 aatattttgt cttctattgt taaaccagtt gttgattctg gttttgatgg tatttttttg 360 gttgctgcta atccagttga tattttgact tatgctactt ggaaattttc tggttttcca 420 aaagaaagag ttattggttc tggtacttct ttggattctt ctagattgag agttgctttg 480 ggtaaacaat ttaatgttga tccaagatct gttgatgctt atattatggg tgaacatggt 540 gattctgaat ttgctgctta ttctactgct actattggta ctagaccagt tagagatgtt 600 gctaaagaac aaggtgtttc tgatgatgat ttggctaaat tggaagatgg tgttagaaat 660 aaagcttatg atattattaa tttgaaaggt gctacttttt atggtattgg tactgctttg 720 atgagaattt ctaaagctat tttgagagat gaaaatgctg ttttgccagt tggtgcttat 780 atggatggtc aatatggttt gaatgatatt tatattggta ctccagctat tattggtggt 840 actggtttga aacaaattat tgaatctcca ttgtctgctg atgaattgaa aaaaatgcaa 900 gattctgctg ctactttgaa aaaagttttg aatgatggtt tggctgaatt ggaaaataaa 960 taa 963 <210> 3 <211> 988 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> g4423 promotor region Allele 1 <400> 3 gttaactcag ttttctctct ttccctccac cccacgttac tctgcgaaca aaaatacgca 60 cagaatgaac atctgattga ttaatattta tatattactt agtggcaccc ctacaaacaa 120 accaattttg aatatttctc accatcatga tatttattta gggcaagaat ttcatgtaca 180 tacgtgcgtg tactgcatag ttttgttata tgtaaataac cagcaatata tcaccaatga 240 taaatgctca gtaatttatt tggaaccaaa atagtttcag taatcaaata atacaataac 300 taacaagtgc tgattataca acagctgtta acaacacaaa cacgctctct tctattctct 360 tccctgcttg ttcgtgtggt atattcccga atttgcaatt tagaaattat attttttaaa 420 agaattgttc tccattttct ggtagtcgta agtggcaaat tggatcataa gacacaatct 480 tgttagttcg actgctaaca ccagacaaga ccgaacgaaa acagaaaaaa aagataattt 540 tgttattctg ttcaattctc tctctctttt taaggtatct ttacattaca ttacatatcc 600 caaattacaa caagagcaag aaatgaagca caacaacacg ccatctttcg tgattatttt 660 atcatttcta tatcgtaact aaattaacaa atgctatgtt tcttaatttt taatgataaa 720 tctaactgct accttaattt ctcatggaaa gtggcaaata cagaaattat atattcttat 780 tcattttctt ataattttta tcaattacca aatatatata aatgcaatta attgattgtt 840 cctgtcacat aatttttttt gtttgttacc tttattcttt atccatttag tttagttctt 900 atatctttct tttctatttc tctttttcgt ttaatctcac cgtacacata tatatccata 960 tatcaataca aataaaaatc atttaaaa 988 <210> 4 <211> 961 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> g4423 promotor region Allele 2 <400> 4 gttaactcag ttttctctct ttccctccac cccacgttac tctgcgaaca aaaaatacgc 60 acagaatgaa catctgattg attaatattt atatattact cagtggcacc cctacaaaca 120 aaccaatttt gaatattgtt caccatcatg atatttattt agggcaagaa tttcatgtac 180 atacgtgcgt gtactgcata gttttgttat atgaaaataa ccagcaatat atcaccaatg 240 aataaattct caataattta tttggaacca aataatgcaa taactagcaa actaagtggt 300 gattatacaa cagctgttaa caacacaaac atacgctctc ttctattatc tcttccctgc 360 ttgttcgtgt ggtatattca cgaatttgca atttagaaat tatatttttt aaaagaattg 420 ttctccattt tctggtagtc gtaagtggca aattggatca taagacacaa tcttgttagt 480 tcgactgcta acaccagaca acaccgaacg aaaacaagaa aaaataatta ttctctctct 540 ttttaaggta tcttacatta catatcccaa attacaacaa gagcaagaaa tgaggcacaa 600 caacacacca tcatctttcg tgattatttt tatcatttct atcatgtaat taaattaaca 660 aatgttaagt ttattaattt ttaatgataa atctagttgc taccttaatt tctcatggaa 720 agtggcaaat actgaaatta tttaattcta ctttcatttt cttataattt ttatcaatta 780 ccaaatatat ataaatgcaa ttaattgatt gttcctgtca cataattttt tttgtttgtt 840 acctttattc tttatccatt taatttattt cttgtatctt tcttttctat ttctcttttc 900 tgtttaatct caccgtacac atatatatcc atatatcaat acaaataaaa atcatttaaa 960 a 961 <210> 5 <211> 1017 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> g4423 terminator region Allele 1 <400> 5 taagtcattt aatttattct tttagaatat atttattttg tctttatttt tgaaatgtta 60 atagtctttt ttttttactt tgaacaaaaa aaagtaaaat taaaacttat cttatatacg 120 cttttaaaca ttaaactcgt taacgaatta tataatgatt ttatcgaact actttatgtt 180 tttttaatag aataatcttc tttattaata taacttacta cttcttaatc ttgttgtcct 240 ccattcgaaa ctcgagtgga acattttctg agtatctctc gcgtctgttc gtaccgtttt 300 tccaatttct ttcgggaaac ggaactggac gcattttatt tgactgttga aagggagatt 360 taatatttat atagcgagat ataacaacta acttataagt ttacacaggc tgttatcaca 420 tatatatata tatatcaaca gaggactagc tcactagact aacattagat atgtcgatgc 480 tgaaccgttt gtttggtgtt agatccattt cacaatgtgc tactcgttta caacgttcta 540 cagggacaaa tatatcagaa ggtccactaa gaattattcc acaattacaa actttctatt 600 ctgctaatcc aatgcatgat aacaatatcg acaagctaga aaatcttcta cgtaaatata 660 tcaagttacc aagtacaaac aatttattga agacacatgg gaatacatct acagaaattg 720 atccaacaaa attattacaa tcacaaaatt cttcacgtcc tttatggtta tcattcaagg 780 attatacagt gattggaggt ggttcacgtt taaaacctac tcaatacacg gaacttttat 840 ttctattgaa taaactacat agtatcgatc cacaattaat gaatgatgat attaagaacg 900 aattagctca ttattataag aatacttcac aggaaactaa taaagtcacc atccctaaat 960 tggatgaatt cggtagaagt attggaatcg gtagaaggaa atccgcaact gcaaaag 1017 <210> 6 <211> 1018 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> g4423 terminator region Allele 2 <400> 6 taagtcattt aatttattct tttagaatat atttattttg tctttatttt tgaaatgtta 60 atagtctttt ttttactttg aaaaaaaaaa aaagtaaaat taaacttatc ttatatacgc 120 ttttaaacat taaactcgtt aacgaattat ataatgattt tatcgaacta ctttatgttt 180 ttttaataga ataatcttct ttattaatat aacttactac ttcttaatct tgttgtcctc 240 cattcgaaac tcgagaggaa caatttctga gtctctctcg caccctttcg tacgtaccgt 300 ttttccaatt tctttcggga aacggaactg gacgcatttt atttgactgt tgaaagggag 360 atttaatatt tatatagaga gatataacaa ctaacttata agtttataca ggctgttatc 420 acatatatat atatatcaac agaggactag ctcaatagaa taacattaga tatgtcgatg 480 ctgaaccgtt tgtttggtgt tagatccatt tcacaatgtg ctactcgttt acaacgttct 540 acagggacaa atatatcaga aggtccacta agaattattc cacaattaca aactttctat 600 tctgctaatc caatgcatga taacaatatc gacaagctag aaaatcttct acgtaaatat 660 atcaagttac caagtacaaa taacttattg aagacacatg ggaatacatc tacagaaatc 720 gatccaacaa aattattaca atcacaaaat tcttcacgtc ctttatggtt atcattcaag 780 gattatacag tgattggagg tggttcacgt ttaaaaccta ctcaatacac agaactttta 840 tttctattga ataaactaca tagtatcgat ccacaattaa tgaatgatga tattaagaac 900 gaattagctc attattataa gaatacttca caggaaacta ataaagtcac catccctaaa 960 ttggatgaat tcggtagaag tattggaatc ggtagaagga aatccgcaac tgcaaaag 1018 <210> 7 <211> 323 <212> PRT <213> Lactobacillus helveticus <400> 7 Met Ala Arg Glu Glu Lys Pro Arg Lys Val Ile Leu Val Gly Asp Gly 1 5 10 15 Ala Val Gly Ser Thr Phe Ala Phe Ser Met Val Gln Gln Gly Ile Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Gly Ile Ile Asp Ile Ala Lys Glu His Val Glu Gly Asp 35 40 45 Ala Ile Asp Leu Ala Asp Ala Thr Pro Trp Thr Ser Pro Lys Asn Ile 50 55 60 Tyr Ala Ala Asp Tyr Pro Asp Cys Lys Asp Ala Asp Leu Val Val Ile 65 70 75 80 Thr Ala Gly Ala Pro Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp Leu Val 85 90 95 Asn Lys Asn Leu Lys Ile Leu Ser Ser Ile Val Glu Pro Val Val Glu 100 105 110 Ser Gly Phe Glu Gly Ile Phe Leu Val Val Ala Asn Pro Val Asp Ile 115 120 125 Leu Thr His Ala Thr Trp Arg Met Ser Gly Phe Pro Lys Asp Arg Val 130 135 140 Ile Gly Ser Gly Thr Ser Leu Asp Thr Gly Arg Leu Gln Lys Val Ile 145 150 155 160 Gly Lys Met Glu Asn Val Asp Pro Ser Ser Val Asn Ala Tyr Met Leu 165 170 175 Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Phe Pro Ala Trp Ser Tyr Asn Asn Val 180 185 190 Ala Gly Val Lys Val Ala Asp Trp Val Lys Ala His Asn Met Pro Glu 195 200 205 Ser Lys Leu Glu Asp Ile His Gln Glu Val Lys Asp Met Ala Tyr Asp 210 215 220 Ile Ile Asn Lys Lys Gly Ala Thr Phe Tyr Gly Ile Gly Thr Ala Ser 225 230 235 240 Ala Met Ile Ala Lys Ala Ile Leu Asn Asp Glu His Arg Val Leu Pro 245 250 255 Leu Ser Val Pro Met Asp Gly Glu Tyr Gly Leu His Asp Leu His Ile 260 265 270 Gly Thr Pro Ala Val Val Gly Arg Lys Gly Leu Glu Gln Val Ile Glu 275 280 285 Met Pro Leu Ser Asp Lys Glu Gln Glu Leu Met Thr Ala Ser Ala Asp 290 295 300 Gln Leu Lys Lys Val Met Asp Lys Ala Phe Lys Glu Thr Gly Val Lys 305 310 315 320 Val Arg Gln <210> 8 <211> 972 <212> DNA <213> Lactobacillus helveticus <400> 8 atggctagag aagaaaaacc aagaaaagtt attttggttg gtgatggtgc tgttggttct 60 acttttgctt tttctatggt tcaacaaggt attgctgaag aattgggtat tattgatatt 120 gctaaagaac atgttgaagg tgatgctatt gatttggctg atgctactcc atggacttct 180 ccaaaaaata tttatgctgc tgattatcca gattgtaaag atgctgattt ggttgttatt 240 actgctggtg ctccacaaaa accaggtgaa actagattgg atttggttaa taaaaatttg 300 aaaattttgt cttctattgt tgaaccagtt gttgaatctg gttttgaagg tatttttttg 360 gttgttgcta atccagttga tattttgact catgctactt ggagaatgtc tggttttcca 420 aaagatagag ttattggttc tggtacttct ttggatactg gtagattgca aaaagttatt 480 ggtaaaatgg aaaatgttga tccatcttct gttaatgctt atatgttggg tgaacatggt 540 gatactgaat ttccagcttg gtcttataat aatgttgctg gtgttaaagt tgctgattgg 600 gttaaagctc ataatatgcc agaatctaaa ttggaagata ttcatcaaga agttaaagat 660 atggcttatg atattattaa taaaaaaggt gctacttttt atggtattgg tactgcttct 720 gctatgattg ctaaagctat tttgaatgat gaacatagag ttttgccatt gtctgttcca 780 atggatggtg aatatggttt gcatgatttg catattggta ctccagctgt tgttggtaga 840 aaaggtttgg aacaagttat tgaaatgcca ttgtctgata aagaacaaga attgatgact 900 gcttctgctg atcaattgaa aaaagttatg gataaagctt ttaaagaaac tggtgttaaa 960 gttagacaat aa 972 <210> 9 <211> 320 <212> PRT <213> Rhizopus oryzae <400> 9 Met Val Leu His Ser Lys Val Ala Ile Val Gly Ala Gly Ala Val Gly 1 5 10 15 Ala 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Ala Cys Ala Ala Asp Leu Val His Thr Ile 225 230 235 240 Met Leu Asn Arg Lys Ser Val His Pro Val Ser Val Tyr Val Glu Lys 245 250 255 Tyr Gly Ala Thr Phe Ser Met Pro Ala Lys Leu Gly Trp Arg Gly Val 260 265 270 Glu Gln Ile Tyr Glu Val Pro Leu Thr Glu Glu Glu Glu Ala Leu Leu 275 280 285 Val Lys Ser Val Glu Ala Leu Lys Ser Val Glu Tyr Ser Ser Thr Lys 290 295 300 Val Pro Glu Lys Lys Val His Ala Thr Ser Phe Ser Lys Ser Ser Cys 305 310 315 320 <210> 10 <211> 963 <212> DNA <213> Rhizopus oryzae <400> 10 atggttttgc attctaaagt tgctattgtt ggtgctggtg ctgttggtgc ttctactgct 60 tatgctttga tgtttaaaaa tatttgtact gaaattatta ttgttgatgt taatccagat 120 attgttcaag ctcaagtttt ggatttggct gatgctgctt ctatttctca tactccaatt 180 agagctggtt ctgctgaaga agctggtcaa gctgatattg ttgttattac tgctggtgct 240 aaacaaagag aaggtgaacc aagaactaaa ttgattgaaa gaaattttag agttttgcaa 300 tctattattg gtggtatgca accaattaga ccagatgctg ttattttggt tgttgctaat 360 ccagttgata ttttgactca tattgctaaa actttgtctg gtttgccacc aaatcaagtt 420 attggttctg gtacttattt ggatactact agattgagag ttcatttggg tgatgttttt 480 gatgttaatc cacaatctgt tcatgctttt gttttgggtg aacatggtga ttctcaaatg 540 attgcttggg aagctgcttc tattggtggt caaccattga cttcttttcc agaatttgct 600 aaattggata aaactgctat ttctaaagct atttctggta aagctatgga aattattaga 660 ttgaaaggtg ctacttttta tggtattggt gcttgtgctg ctgatttggt tcatactatt 720 atgttgaata gaaaatctgt tcatccagtt tctgtttatg ttgaaaaata tggtgctact 780 ttttctatgc cagctaaatt gggttggaga ggtgttgaac aaatttatga agttccattg 840 actgaagaag aagaagcttt gttggttaaa tctgttgaag ctttgaaatc tgttgaatat 900 tcttctacta aagttccaga aaaaaaagtt catgctactt ctttttctaa atcttcttgt 960 taa 963 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 11 cggactttag agccttgtag ac 22 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 12 atctggttac actcacgatg g 21 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 13 ccaagtacgt tagagctaac gg 22 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 14 gagcttctct ggtatcagct 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 15 agctttagca aacattagac cc 22 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 16 attccatccg aatatgctgg t 21 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 17 ggaacctaaa tgactgttgg ca 22 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 18 aggatgttga tttcgactcg t 21 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 19 ttccaaaggg taccaattta gctg 24 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 20 gtaccgctaa tgaacctaaa cca 23 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 21 agagctgaca ctagagaagc c 21 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 22 gatgtgtcta cgacgtatct acc 23 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 23 gtactggtaa cgtccaagtc 20 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 24 gaacccttcc atactctacc a 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 25 ttcagttcgt gctactcaag g 21 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 26 tcaattgcaa cgacagagac 20 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 27 ccgtaccctg aagagtttac tg 22 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 28 caaccataga ttcacgaatt gctc 24 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 29 agtggatttg gattaatggg tg 22 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 30 gcttctgtaa cacctttaac ac 22 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 31 aaattggtga ccgtgttggt 20 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 32 aaccaccttt actacggtaa cca 23 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 33 tttagtcgtc atctgttcag gt 22 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 34 gagacaccta acaaaccaaa tgg 23 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 35 gattcaagct tcttctcgta tcgg 24 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 36 ggaaatgata ccattcacga cct 23 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 37 gttccgtcaa agaaatcaag ca 22 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 38 tggtaaacct gtatctgaca tcac 24 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 39 tttagttgtc atttgtgccg gt 22 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 40 gacacctaac aaaccaaacg ga 22 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 41 ctttgagtgc aagtatcgcc 20 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for qPCR <400> 42 tgtgtaattg ttcaccaaag cc 22 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 gagatagcac accattcacc a 21 <210> 44 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 caacgttaag tactctggtg tttg 24 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 caacgttaag tactctggtg tttg 24 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 gagatagcac accattcacc a 21 <210> 47 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 ggattcctgt aatgacaacg cgag 24 <210> 48 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 tggatacatt acagattctc tatcct 26 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 atgaaaattt ttgcttatgg 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 ttaatattca acagcaatag 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 atggttttgc attctaaagt 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 ttaacaagaa gatttagaaa 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 atgtcttcta tgccaaatca 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 ttatttattt tccaattcag 20

Claims (7)

1. 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프로모터와 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결되어 있는 유전자 구조물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 유전자 구조물.
   
3. 제1항에 있어서, 서열번호 5 또는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 터미네이터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 구조물.
   
4. 제1항의 유전자 구조물을 포함하는 재조합 벡터.
   
5. 제1항의 유전자 구조물 또는 제4항의 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물.
   
6. 제5항에 있어서, 효모인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
   
7. 다음을 단계를 포함하는 젖산의 제조방법;
   (a) 제1항의 유전자 구조물 또는 제1항의 유전자 구조물을 포함하는 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 배양하여 젖산을 생성시키는 단계; 및
   (b) 상기 생성된 젖산을 수득하는 단계.
   
   

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