KR20160133308A - 내산성을 갖는 효모 세포, 상기 효모 세포를 제조하는 방법 및 이의 용도 - Google Patents

내산성을 갖는 효모 세포, 상기 효모 세포를 제조하는 방법 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

모세포에 비하여 SUL1, STR3, HXT7, ERR1, GRX8, MXR1, GRE1, MRK1, AAD10 또는 그 조합의 활성이 증가되어 있는, 내산성을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포, 그를 제조하는 방법, 및 그를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.

Description

내산성을 갖는 효모 세포, 상기 효모 세포를 제조하는 방법 및 이의 용도 {Yeast cell having acid tolerant property, method for preparing the yeast cell and use thereof}
내산성을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포, 이를 제조하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
유기산은 산업적으로 널리 이용된다. 예를 들면, 락테이트는 식품, 제약, 화학, 전자 등 다양한 산업 분야에서 폭넓게 사용되는 유기산이다. 락테이트는 무색, 무취이고 물에 잘 용해되는 저휘발성 물질이다. 락테이트는 인체에 독성이 없어 향미제, 산미제, 보존제 등으로 활용되고 있고, 또한 환경친화적으로 대체 고분자 물질이고, 생분해성 플라스틱인 폴리락틱산 (polylactic acid: PLA)의 원료이다.
유기산은 그의 pKa 값보다 높은 산도, 예를 들면, 중성 조건에서 수소 이온과 유기산의 음이온으로 분리된다. 그러나, 유기산, 예를 들면, 젖산은 pKa 값보다 낮은 산성 조건에서는 전자기력을 가지지 않는 유리산 (free acid) 형태로 존재한다. 음이온 형태는 세포막을 투과하지 못하나, 유리산 형태는 세포막을 투과할 수 있으므로, 유기산의 농도가 높은 환경에서 세포막 외부의 유기산이 세포 내부로 유입되어 세포 내 pH가 떨어지는 현상이 일어날 수 있다. 또한, 음이온 형태의 유기산은 분리시에 염을 첨가하여 염의 형태로 분리하여야 하는 단점이 있다. 그 결과, 내산성이 결여된 세포는 젖산이 포함된 산성 조건에서 세포의 활성을 잃고 사멸할 수 있다.
따라서, 이러한 산성에 대하여 내성을 갖는 미생물이 요구되고 있다.
일 양상은 내산성을 갖도록 유전적으로 조작된 효모 세포를 제공한다.
다른 양상은 상기 효모 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 유전적으로 조작된 효모 세포를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 세포, 단백질, 또는 효소의 활성의 검출가능한 증가를 나타낼 수 있다. "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 주어진 유전적 변형 (genetic modification)을 갖지 않은 세포, 단백질, 또는 효소 (예, 본래 또는 "야생형 (wild-type)"의 세포, 단백질, 또는 효소)와 같은, 동일한 타입의 비교 세포, 단백질, 또는 효소의 수준 보다 더 높은 변형된 (예, 유전적으로 조작된) 세포, 단백질, 또는 효소의 활성을 나타낼 수 있다. "세포의 활성 (cell activity)"이란 세포의 특정 단백질 또는 효소의 활성을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 상기 변형된 또는 조작된 세포, 단백질, 또는 효소의 활성은 동일 타입의 조작되지 않은 세포, 단백질, 또는 효소, 예를 들면, 야생형 세포, 단백질, 또는 효소의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 세포 중 특정 단백질 또는 효소의 활성은 모세포, 예를 들면, 조작되지 않은 세포 중의 동일 단백질 또는 효소의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 단백질 또는 효소의 증가된 활성을 갖는 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 증가된 활성을 갖는 세포는, 유전적 변형을 갖지 않은 세포에 비하여 하나 이상의 효소 또는 폴리펩티드의 활성을 증가시키는 유전적 변형 (genetic modification)을 갖는 것일 수 있다.
용어 "카피 수 증가 (copy number increase)"는 유전자의 도입 또는 증폭에 의한 것일 수 있으며, 조작되지 않은 세포에 존재하지 않는 유전자를 유전적 조작에 의해 갖게 되는 경우도 포함한다. 상기 유전자의 도입은 벡터와 같은 비히클을 매개하여 이루어질 수 있다. 상기 도입은 상기 유전자가 게놈에 통합되지 않은 임시적 (transient) 도입이거나 게놈에 삽입되는 것일 수 있다. 상기 도입은 예를 들면, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 상기 세포로 도입한 후, 상기 벡터가 세포 내에서 복제되거나 상기 폴리뉴클레오티드가 게놈으로 통합됨으로써 이루어질 수 있다.
외부에서 도입되거나 또는 카피 수가 증가되는 폴리뉴클레오티드는 내인성 (endogenous) 또는 외인성 (exogenous)일 수 있다. 상기 내인성 유전자는 미생물 내부에 포함된 유전물질 상에 존재하던 유전자를 말한다. 외인성 유전자는 숙주 세포 게놈으로 도입 (integration)되는 등의 숙주 세포 내로 유전자가 도입되는 것을 의미하며, 도입되는 유전자는 도입되는 숙주세포에 대해 동종 (homologous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다.
"이종성 (heterologous)"은 천연 (native)이 아닌 외인성 (foreign)을 의미할 수 있다.
용어 "유전자"는 전사 및 번역 중 하나 이상에 의하여 발현 산물, 예를 들면, mRNA 또는 단백질을 생성할 수 있는 핵산 단편을 의미하며, 코딩영역 또는 코딩영역 외 5'-비코딩 서열 (5'-non coding sequence)과 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence) 등의 조절 (regulatory) 서열을 포함할 수 있다.
"세포 (cell)", "균주 (strain)", 또는 "미생물 (microorganism)"은 교체 사용이 가능한 것으로서, 효모, 박테리아, 또는 곰팡이 등을 포함할 수 있다.
반면, 본 명세서에서 사용된 용어 "활성 감소 (decrease in activity)" 또는 "감소된 활성 (decreased activity)"은 모세포 (예, 유전적으로 조작되지 않은 세포) 중에서 측정된 것보다 더 낮은 효소 또는 폴리펩티드의 활성을 갖는 세포를 나타낸다. 또한, "활성 감소 (decrease in activity)" 또는 "감소된 활성 (decreased activity)"은 본래의 (original) 또는 야생형 (wild-type)의 효소 또는 폴리펩티드보다 더 낮은 활성을 갖는 분리된 효소 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 활성 감소 또는 감소된 활성은 활성이 없는 것 (no activity)을 포함한다. 예를 들면, 변형된 (예, 유전적으로 조작된) 세포 또는 효소에 대한 기질로부터 생성물로의 효소 전환 활성이 상기 변형을 갖지 않은 세포 또는 효소, 예를 들면, 모세포 또는 "야생형 (wild-type)"의 세포 또는 효소의 효소 전환활성에 비하여 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다. 효소 또는 세포의 감소된 활성은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 활성 감소는 변형되지 않은 유전자를 갖는 세포, 예를 들면, 모세포 또는 야생형 세포에 비하여, 효소가 발현되더라도 효소의 활성이 없거나 감소된 경우, 효소를 코딩하는 유전자가 발현되지 않거나 발현되더라도 본래 유전자 조작이 되지 않은 유전자에 비하여 발현량이 감소된 경우를 포함한다. 상기 감소된 활성을 갖는 세포는, 유전적 변형을 갖지 않은 세포에 비하여 하나 이상의 효소 또는 폴리펩티드의 활성을 감소시키는 유전적 변형 (genetic modification)을 갖는 것일 수 있다.
용어 "모세포 (parent cell)"는 본래 세포 (original cell), 예를 들면, 조작된 효모 세포에 대하여 동일 타입의 유전적으로 조작되지 않은 세포를 나타낸다. 특정한 유전적 변형에 대하여, 상기 "모세포"는 상기 특정 유전적 변형 (genetic modification)을 갖지 않은 세포이지만, 다른 상항에 대하여는 동일한 것일 수 있다. 따라서, 상기 모세포는 주어진 단백질의 증가된 활성을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포를 생산하는데 출발 물질 (starting material)로 사용된 세포일 수 있다.
용어 “모세포(parent cell)” 또는 “모균주 (parent strain)”는 해당 유전적 변형(subject genetic modification)을 위해 사용된 것일 수 있다. 상기 모세포는 상기 유전적 변형을 제외하고는 해당 세포(subject cell)와 동일하기 때문에, 상기 유전적 변형에 대한 기준 세포(reference cell)일 수 있다. 상기 “유전적 변형(genetic modification)”은 세포의 유전물질의 구성 또는 구조가 인위적으로 변경된 것을 의미한다. 상기 모세포는 해당 유전적 변형, 예를 들면 EDC의 활성이 증가되도록 하는 유전적 변형을 갖지 않는 세포일 수 있다. 상기 모세포는 모 효모 세포(parent yeast cell)일 수 있다.
용어 “야생형(wild-type)” 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 특정 유전적 변형을 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 상기 유전적 변형은 유전적으로 조작된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 수득할 수 있게 하는 것일 수 있다.
용어 "파괴 (disruption)"는 언급된 유전자 (referenced gene)의 발현이 감소되도록 하는 유전적 변형을 나타낸다. 상기 파괴는 언급된 유전자의 발현이 없도록 하는 유전적 변형 (이하, 유전자의 "불활성화 (inactivation)"이라고 한다.) 또는 유전자의 발현은 있으나 감소된 수준으로 발현되도록 하는 유전적 변형 (이하, 유전자의 "감쇄 (attenuation)"이라고 한다.)을 포함한다. 상기 불활성화는 유전자의 기능적 산물 (functional product)이 발현되지 않는 것뿐만 아니라 발현은 되지만 기능적 산물이 발현되지 않는 것을 포함한다. 상기 감쇄는 유전자의 기능적 산물의 발현양 감소를 포함한다. 즉, 상기 감쇄는 유전자의 순 발현량은 증가하였더라도 기능적 산물의 발현량이 감소되는 것을 포함한다. 여기서 유전자의 기능적 산물이란 모세포 또는 야생형 세포에서 상기 유전자의 산물 (예, 효소)이 갖는 생화학적 또는 생리적 기능 (예, 효소 활성)을 보유하고 있는 것을 말한다. 따라서, 상기 파괴는 유전자의 기능적 파괴 (functional disruption)를 포함한다. 상기 유전적 변형은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 변형, 모세포의 유전물질에 대한 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 부가, 삽입, 또는 결실, 또는 모세포의 유전물질에 대한 화학적 변이를 포함한다. 그러한 유전적 변형은 언급된 종 (referenced species)에 대한 이질성 (heterologous), 동질성 (homologous), 또는 이질성 및 동질성 폴리펩티드를 위한 코딩 영역 (coding region) 및 그의 기능적 단편 (functional fragments thereof)에 대한 것을 포함한다. 또한, 상기 유전적 변형은 유전자 또는 오페론의 발현을 변경시키는 비코딩 조절 영역 (non-coding regulatory regions)의 변형을 포함한다. 비코딩 영역은 5'-비코딩 서열(5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence)을 포함한다.
상기 유전자의 파괴는 상동 재조합, 지향된 돌연변이유발 (directed mutagenesis), 또는 분자 진화 (molecular evolution)와 같은 유전적 조작법에 의해 달성될 수 있다. 세포가 복수 개의 동일 유전자, 또는 유전자의 2 이상의 파라로그 (paralogs)를 포함한 경우, 하나 이상의 유전자는 파괴될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전적 변형은 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 세포에 형질전환하고, 세포를 배양하여 상기 서열이 세포의 내인성 유전자와 상동 재조합이 일어나도록 하여 상기 유전자를 파괴되도록 한 후, 상동 재조합이 일어난 세포를 선별 마커를 사용하여 선별함으로써 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유전자"는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미하며, 5'-비코딩 서열 (5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열 (3'-non coding sequence)의 조절 서열 (regulatory sequence)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 발명에서 사용된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 아미노산 잔기 또는 염기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가, 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 핵산이 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 프로그램은 일례로 BLASTN(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), 및 MegAlignTM(DNASTAR Inc)일 수 있다.
여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50%이상, 55%이상, 60%이상, 65%이상, 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100% 등을 포함하는 서열 동일성이다.
본 명세서에 사용된 용어 "외인성 (exogenous)"은 언급된 분자 (referenced molecule) 또는 언급된 활성 (referenced activity)이 숙주 세포로 도입된 것을 의미한다. 분자는 예를 들면, 숙주 염색체 내로의 삽입에 의하는 것과 같은 코딩 핵산 (encoding nucleic acid)의 숙주 유전 물질 내로의 도입 또는 플라스미드와 같은 비염색체 유전물질로서 도입될 수 있다. 코딩 핵산의 발현과 관련하여, 상기 용어 "외인성"은 상기 코딩 핵산이 개체 내로 발현 가능한 형태로 도입된 것을 나타낸다. 생합성 활성과 관련하여, 상기 용어 "외인성"은 숙주 모세포에 도입된 활성을 나타낸다. 그 기원 (source)은 예를 들면, 숙주 모세포에 도입된 후 언급된 활성을 발현하는 동질성 (homologous) 또는 이질성 (heterologous) 코딩 핵산일 수 있다. 그러므로, 용어 "내인성 (endogenous)"은 상기 숙주 세포에 존재하는 언급된 분자 또는 활성을 나타낸다. 비슷하게, 코딩 핵산의 발현과 관련하여, 상기 용어 "내인성"은 개체 내에 포함된 코딩 핵산의 발현을 나타낸다. 용어 "이질성 (heterologous)"은 언급된 종 외의 다른 기원으로부터의 분자 또는 활성을 나타내고 용어 "동질성 (homologous)"은 숙주 모세포로부터의 분자 또는 활성을 나타낸다. 따라서, 코딩 핵산의 외인성 발현은 이질성 (heterologous) 또는 동질성 (homologous) 코딩 핵산 중 어느 하나 또는 둘 다를 이용할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 사용된 용어 "유전적 조작 (genetic engineering)" 또는 "유전적으로 조작된 (genetically engineered)"은 세포에 대하여 하나 이상의 유전적 변형 (genetic modification)을 도입하는 행위 또는 그에 의하여 만들어진 세포를 나타낸다.
본 명세서에 사용된 용어 락테이트(lactate)는 젖산(lactic acid) 자체뿐만 아니라, 음이온 형태, 그의 염, 용매화물, 다형체 또는 그 조합을 포함하는 것으로 해석된다. 상기 염은 예를 들면 무기산염, 유기산염 또는 금속염일 수 있다. 무기산염은 염산염, 브롬산염, 인산염, 황산염 또는 이황산염일 수 있다. 유기산염은 포름산염, 초산염, 아세트산염, 프로피온산염, 젖산염, 옥살산염, 주석산염, 말산염, 말레인산염, 구연산염, 푸마르산염, 베실산염, 캠실산염, 에디실염, 트리플루오로아세트산염, 벤조산염, 글루콘산염, 메탄술폰산염, 글리콜산염, 숙신산염, 4-톨루엔술폰산염, 갈룩투론산염, 엠본산염, 글루탐산염 또는 아스파르트산염일 수 있다. 금속염은 칼슘염, 나트륨염, 마그네슘염, 스트론튬염 또는 칼륨염일 수 있다.
일 양상은 젖산에 의해 발현이 특이적으로 억제되는 유전자의 활성 증가를 통해 상기 젖산에 의한 젖산 생산 저해 효과를 극복하도록 조작된 효모 세포를 제공한다. 상기 효모 세포는 내산성 증가, 상기 효모 세포의 성장 증가, 당 소모 증가로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 가질 수 있다.
일 양상은 모세포에 비하여, SUL1, STR3, AAD10, MXR1, GRX8, MRK1, GRE1, HXT7, 및 ERR1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 산물의 활성이 증가되어 있고, 내산성을 갖고, 포도당 소비가 증가되거나, 이들의 조합의 특성을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포를 제공한다.
상기 하나 이상의 유전자는 젖산의 존재하에서 상기 효모 세포의 모세포가 배양되는 경우, 젖산의 부존재하에서 배양되는 경우에 비하여 그 발현 양이 감소하는 유전자들이다. 이들 유전자는 다음 표 1과 같은 특성을 갖는 것일 수 있다.
분류 명칭 Genebank 감소된 배수* 추정되는 기능
황동화(Sulfur assimilation) SUL1 YBR294W 2.22 술페이트 트랜스포트(sulfate transport)
L-시스테인 생합성 STR3 YGL184C 7.60 메티오닌 생합성 과정
Central metabolism HXT7 YDR342C 2.38 헥소스 트랜스포트
Central metabolism ERR1 YOR393W 3.04 미지(unknown)
Oxidative stress GRX8 YLR364W 1.65 Glutathione-disulfide reductase activity
Oxidative stress MXR1 YER042W 1.57 Cellular response to oxidative stress
Tolerance GRE1 YPL223C 1.83 미지
Tolerance MRK1 YDL079C 1.99 단백질 분해
기타 AAD10 YJR155W 2.56 알데히드 대사 과정
* 감소된 배수는 젖산이 첨가되지 않은 조건에 배양된 대조군 대비 20 g/L의 젖산이 첨가된 조건에서 5 시간 동안 실시예 1과 동일하게 미세호기 상태에서 사카로마이세스 세레비지애를 배양된 경우 발현이 감소된 배수를 나타낸다 (실시예 1 참조).
상기 유전적으로 조작된 효모 세포는 상기 SUL1, STR3, AAD10, MXR1, GRX8, MRK1, GRE1, HTX7, ERR1, 또는 그 조합의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함할 수 있다.
상기 SUL1은 술페이트 퍼미아제 1(sulfate permease 1)일 수 있다. 상기 SUL1은 SFP2로 지칭될 수 있다. 상기 SUL1은 고-친화성 술페이트 트랜스포트 1(high-affinity sulfate transporter 1)일 수 있다. 상기 SUL1은 TCDB (Transporter Classification Database) 2.A.53.1.1로 분류될 수 있다. 상기 SUL1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산일 수 있다. 상기 SUL1 단백질은 일례로 NP_009853.3의 NCBI 참조 서열(NCBI reference sequence)을 갖는 것일 수 있다. SUL1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 유전자일 수 있다. 상기 sul1 유전자는 일례로 NM_001178642.3의 NCBI 참조 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 STR3 단백질은 시스타티오닌 베타-리아제(Cystathionine beta-lyase: CBL)일 수 있다. 상기 STR3은 EC 4.4.1.8로 분류될 수 있다. 상기 STR3 단백질은 베타-시스타티오나제(Beta-cystathionase), 시스테인 리아제(Cysteine lyase), 또는 황 트랜스퍼 단백질 3(Sulfur transfer protein 3)으로 지칭될 수 있다. 상기 STR3 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산일 수 있다. 상기 STR3 단백질은 일례로 NP_011331.3의 NCBI 참조 서열(NCBI reference sequence)을 갖는 것일 수 있다. STR3 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 유전자일 수 있다. 상기 str3 유전자는 일례로 NM_001181049.3의 NCBI 참조 서열을 갖는 것일 수 있다.
HXT7은 고-친화성 헥소스 트랜스포터 HXT6 (High-affinity hexose transporter HXT6)일 수 있다. 상기 HXT7은 TCDB 2.A.1.1.31로 분류될 수 있다. 상기 HXT7 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산일 수 있다. 상기 HXT7 단백질은 일례로 NP_010629.3의 NCBI 참조 서열(NCBI reference sequence)을 갖는 것일 수 있다. HXT7 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 유전자일 수 있다. 상기 hxt7 유전자는 일례로 NM_001180650.3의 NCBI 참조 서열을 갖는 것일 수 있다.
ERR1은 에놀라제-관련 단백질 1(Enolase-related protein 1)일 수 있다. 상기 ERR1은 2-포스포-D-글리세레이트 히드로-리아제 (2-phospho-D-glycerate hydro-lyase) 또는 2-포스포글리세레이트 데히드라타제 (2-phosphoglycerate dehydratase)로 지칭될 수 있다. 상기 ERR1은 EC 4.2.1.11로 분륜될 수 있다. 상기 ERR1 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산일 수 있다. 상기 ERR1 단백질은 일례로 NP_015038.1의 NCBI 참조 서열(NCBI reference sequence)을 갖는 것일 수 있다. ERR1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 8의 폴리뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 유전자일 수 있다. 상기 err1 유전자는 일례로 NM_001183813.1의 NCBI 참조 서열을 갖는 것일 수 있다.
GRX8은 글루타레독신-8(Glutaredoxin-8)일 수 있다. 상기 GRX8은 글루타티온-의존 옥시도리덕타제 8 (Glutathione-dependent oxidoreductase 8)로 지칭될 수 있다. 상기 GRX8 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산일 수 있다. 상기 GRX8 단백질은 일례로 NP_013468.3의 NCBI 참조 서열(NCBI reference sequence)을 갖는 것일 수 있다. GRX8 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 유전자일 수 있다. 상기 grx8 유전자는 일례로 NM_001182253.3의 NCBI 참조 서열을 갖는 것일 수 있다.
MXR1은 펩티드 메티오닌 술폭시드 리덕타제(Peptide methionine sulfoxide reductase)일 수 있다. 상기 MXR1은 EC 1.8.4.11로 분류될 수 있다. 상기 MXR1은 펩티드-메티오닌 (S)-S-옥시드 리덕타제(Peptide-methionine (S)-S-oxide reductase), 펩티트 메트(O) 리덕타제(Peptide Met(O) reductase), 또는 단백질-메티오닌-S-옥시드 리덕타제 (Protein-methionine-S-oxide reductase)로 지칭될수 있다. 상기 MXR1 단백질은 서열번호 11의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산일 수 있다. 상기 MXR1 단백질은 일례로 NP_010960.1의 NCBI 참조 서열(NCBI reference sequence)을 갖는 것일 수 있다. MXR1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 12의 폴리뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 유전자일 수 있다. 상기 mxr1 유전자는 일례로 NM_001178933.1의 NCBI 참조 서열을 갖는 것일 수 있다.
MRK1은 세린/트레오닌-단백질 키나아제 MRK1 (Serine/threonine-protein kinase MRK1)일 수 있다. 상기 MRK1은 EC 2.7.11.1로 분류될 수 있다. 상기 MRK1 단백질은 서열번호 13의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산일 수 있다. 상기 MRK1 단백질은 일례로 NP_010204.1의 NCBI 참조 서열(NCBI reference sequence)을 갖는 것일 수 있다. MRK1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 유전자일 수 있다. 상기 mrk1 유전자는 일례로 NM_001180138.1의 NCBI 참조 서열을 갖는 것일 수 있다.
GRE1은 단백질 GRE1(Protein GRE1)일 수 있다. 상기 GRE1은 히드로필린(Hydrophilin)으로 지칭될 수 있다. 상기 GRE1 단백질은 서열번호 15의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산일 수 있다. 상기 GRE1 단백질은 일례로 NP_015101.1의 NCBI 참조 서열(NCBI reference sequence)을 갖는 것일 수 있다. GRE1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 16의 폴리뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 유전자일 수 있다. 상기 gre1 유전자는 일례로 NM_001184037.1의 NCBI 참조 서열을 갖는 것일 수 있다.
AAD10은 추정 아릴-알코올 데히드로게나제 AAD10 (Putative aryl-alcohol dehydrogenase AAD10)일 수 있다. 상기 AAD10은 EC 1.1.1.-로 분류될 수 있다. 상기 AAD10 단백질은 서열번호 17의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산일 수 있다. 상기 AAD10 단백질은 일례로 NP_012689.1의 NCBI 참조 서열(NCBI reference sequence)을 갖는 것일 수 있다. AAD10 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 18의 폴리뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 유전자일 수 있다. 상기 aad10 유전자는 일례로 NM_001181813.1의 NCBI 참조 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 유전적으로 조작된 효모 세포는 모세포에 비하여, 상기 세포 중 S-아데노실 메티오닌의 양이 증가되는 것인 효모 세포일 수 있다. 상기 유전적으로 조작된 효모 세포는 그 모세포에 비하여 sul1, str3, 또는 그 조합의 활성이 증가된 것일 수 있다. 상기 유전적으로 조작된 효모 세포는 모세포에 비하여 상기 세포 중 메티오닌, 시스테인, 또는 그 조합의 양이 증가된 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 모세포에 비하여 메티오닌, 시스테인, 또는 그 조합을 더 많은 양으로 생산할 수 있다.
상기 효모 세포는 상기 발현산물을 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열의 변형을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자의 발현 조절 서열은 상기 유전자 발현을 위한 프로모터 또는 터미네이터일 수 있다. 상기 발현 조절 서열은 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 모티프를 코딩하는 서열일 수 있다. 상기 모티프는 예를 들면, 이차 구조-안정화 모티프, RNA 불안정화 모티프, 스플라이스-활성화 모티프, 폴리아데닐화 모티프, 아데닌-풍부 서열 (adenine-rich sequence), 또는 엔도뉴클레아제 인식 부위일 수 있다.
상기 프로모터는 상기 EDC 단백질을 코딩하는 유전자와 작동가능하게 연결된 외인성 프로모터일 수 있다. 상기 프로모터는 구성적 프로모터(constitutive promoter)일 수 있다. 상기 프로모터는 효모 유전자에 대하여 천연인 프로모터와 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 이상 상동(homologous)인 것일 수 있다. 또한 상기 프로모터는 숙주 세포에 대하여 천연인 유전자에 대한 프로모터와 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 이상 상동인 것일 수 있다. 상기 프로모터는 Covalently linked Cell Wall protein 12 (CCW12), PDC1과 같은 피루베이트 디카르복실라제(pyruvate decarboxylase: PDC), PGK1과 같은 포스포글리세레이트 키나아제 (phosphoglycerate kinase: PGK), TEF-1 및 TEF-2와 같은 transcription elongation factor(TEF), TDH1, TDH2, TDH3, 또는 GPD1와 같은 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, triose phosphate isomerase (TPI1), purine-cytosine permease (PCPL3), alcohol dehydrogenase (ADH1), CYB2와 같은 L-(+)-lactate-cytochromee c oxidoreductase(CYB), xylose reductase (XR), xylitol dehydrogenase (XDH), CYC (cytochrome c), ADH, Histone H3 (e.g., HHT1 또는 HHT2) 프로모터와 약 80%, 85%, 90% 또는 95% 상동인 프로모터, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 유전자로부터 유래된 프로모터일 수 있다. 상기 CYC (cytochrome c), TEF (transcription elongation factor), GPD, ADH, CCW12, 및 HHT2 유전자의 프로모터는 각각 서열번호 49, 50, 51, 52, 53, 및 54의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 터미네이터는 효모 유전자에 대하여 천연인 터미네이터와 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 이상 상동(homologous)인 것일 수 있다. 또한 상기 프로모터는 숙주 세포에 대하여 천연인 유전자에 대한 터미네이터와 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 이상 상동인 것일 수 있다. 상기 터미네이터는 PGK1 (phosphoglycerate kinase 1), CYC1 (cytochrome c 1), GAL1 (galactokinase 1), 및 TPS1 (trehalose-6-phosphate synthase 1) 유전자의 터미네이터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. CYC1 터미네이터는 서열번호 55의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 벡터는 선별 마커를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 효모 세포는 상기 발현산물을 코딩하는 유전자의 카피수 증가를 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 상기 발현산물을 코딩하는 외인성(exogenous) 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 외인성 유전자는 유전자에 작동 가능하도록 연결된 외인성 프로모터에 의해 적절히 조절되는 것일 수 있다. 상기 프로모터에 관해서는 상술한 바와 같다.
용어 내산(acid-resistant, acid-tolerant, acid-tolerating) 및 내산성(acid-resistance, acid tolerance)은 상호교환적으로 사용될 수 있다.
상기 유전적으로 조작된 효모 세포에 있어서, 내산성 (acid tolernace)은 모세포 또는 조작되지 않은 세포에 비하여, 산성 조건에서 더 좋은 성장률(growth rate)을 보이는 것일 수 있다. 상기 산성 조건은 유기산, 무기산 또는 그 조합을 포함하는 산성 조건일 수 있다. 상기 유기산은 C1 내지 C20을 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 3-히드록시프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 옥살산, 아디프산, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 유전적으로 조작된 효모 세포는 모세포에 비하여, pH 2.0 내지 7.0 미만, 예를 들면, pH 2.0 내지 6.5, pH 2.0 내지 6.0, pH 2.0 내지 5.5, pH 2.0 내지 5.0, pH 2.0 내지 4.5, pH 2.0 내지 4.0, pH 2.0 내지 3.8, pH 2.5 내지 3.8, pH 3.0 내지 3.8, pH 2.0 내지 3.0, pH 2.0 내지 2.7, pH 2.0 내지 2.5, 또는 pH 2.5 내지 3.0의 범위에서 더 잘 생장할 수 있는 것일 수 있다. 상기 성장률은 효모 세포의 콜로니를 세거나 상기 콜로니의 광학 밀도 (OD)를 측정하여 측정될 수 있다. 일 예로, 상기 유전적으로 조작된 효모 세포는 산성 조건에서 모세포에 비하여 증가된 광학 밀도 값을 가질 수 있다.
또한 상기 유전적으로 조작된 세포에 있어서, 내산성은 모세포 또는 조작되지 않은 세포에 비하여, 산성 조건에서 더 높은 생존(cell viability)을 보이는 것일 수 있다. 상기 산성 조건은 유기산, 무기산 또는 그 조합을 포함하는 산성 조건일 수 있다. 상기 유기산은 C1 내지 C20을 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 3-히드록시프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 옥살산, 아디프산, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 유전적으로 조작된 효모 세포는 모세포에 비하여, pH 2.0 내지 7.0 미만, 예를 들면, pH 2.0 내지 6.5, pH 2.0 내지 6.0, pH 2.0 내지 5.5, pH 2.0 내지 5.0, pH 2.0 내지 4.5, pH 2.0 내지 4.0, pH 2.0 내지 3.8, pH 2.5 내지 3.8, pH 3.0 내지 3.8, pH 2.0 내지 3.0, pH 2.0 내지 2.7, pH 2.0 내지 2.5, 또는 pH 2.5 내지 3.0의 범위에서 더 잘 생존할 수 있는 것일 수 있다.
또한 상기 유전적으로 조작된 세포에 있어서, 내산성은 모세포 또는 조작되지 않은 세포에 비하여, 산성 조건에서 더 좋은 대사 능력(metabolization ability)을 보이는 것일 수 있다. 상기 대사는 상기 효모 세포 내의 화학적 전환, 예를 들면 효모에 의해 촉매되는 반응을 의미할 수 있다. 상기 효모에 의해 촉매되는 반응은 상기 효모 세포가 성장하고, 번식하고, 산성 조건과 같은 외부 환경에 반응할 수 있게 할 수 있다. 상기 대사 능력의 정도는 세포당 영양분의 소비율 또는 세포당 영양분 흡수율, 예를 들면, 세포당 포도당 흡수율을 통해 측정될 수 있거나, 세포당 산물 배출율, 예를 들면 세포당 이산화탄소 배출율 또는 세포당 젖산 생산율을 통해 측정될 수 있다. 상기 산성 조건은 유기산, 무기산 또는 그 조합을 포함하는 산성 조건일 수 있다. 상기 유기산은 C1 내지 C20을 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 3-히드록시프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 옥살산, 아디프산, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 유전적으로 조작된 효모 세포는 모세포에 비하여, pH 2.0 내지 7.0 미만, 예를 들면, pH 2.0 내지 6.5, pH 2.0 내지 6.0, pH 2.0 내지 5.5, pH 2.0 내지 5.0, pH 2.0 내지 4.5, pH 2.0 내지 4.0, pH 2.0 내지 3.8, pH 2.5 내지 3.8, pH 3.0 내지 3.8, pH 2.0 내지 3.0, pH 2.0 내지 2.7, pH 2.0 내지 2.5, 또는 pH 2.5 내지 3.0의 범위에서 더 잘 대사할 수 있는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 사카로마이세스 (Saccharomyces), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 캔디다 (Candida), 피치아 (Pichia), 이사첸키아 (Issatchenkia), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces), 쉬조사카로마이스세 (Shizosaccharomyces) 또는 사카로마이콥시스 (Saccharomycopsis) 속에 속하는 것일 수 있다. 사카로마이세스 속은 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae), 사카로마이세스 바야누스 (S. bayanus), 사카로마이세스 보울라디 (S. boulardii), 사카로마이세스 불데리 (S. bulderi), 사카로마이세스 카리오카누스 (S. cariocanus), 사카로마이세스 카리오쿠스 (S. cariocus), 사카로마이세스 체발리에리 (S. chevalieri), 사카로마이세스 다이레넨시스 (S. dairenensis), 사카로마이세스 엘립소이데우스 (S. ellipsoideus), 사카로마이세스 유바야뉴스 (S. eubayanus), 사카로마이세스 엑시거스 (S. exiguus), 사카로마이세스 플로렌티누스 (S. florentinus), 사카로마이세스 클루이베리 (S. kluyveri), 사카로마이세스 마티니에 (S. martiniae), 사카로마이세스 모나센시스 (S. monacensis), 사카로마이세스 노르벤시스 (S. norbensis), 사카로마이세스 파라독서스 (S. paradoxus), 사카로마이세스 파스토리아누스 (S. pastorianus), 사카로마이세스 스펜서로룸 (S. spencerorum), 사카로마이세스 투리센시스 (S. turicensis), 사카로마이세스 우니스포루스 (S. unisporus), 사카로마이세스 우바룸 (S. uvarum), 또는 사카로마이세스 조나투스 (S. zonatus)일 수 있다.
상기 효모 세포는 락테이트 생산능을 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 상기 유전자는 외인성 (exogenous) 유전자일 수 있다. 상기 효모 세포는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다. 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 것을 촉매하는 효소일 수 있으며, 이는 락테이트 데히드로게나제 (LDH)일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 NAD(P)-의존성 효소일 수 있다. 또한 상기 락테이트 데히드로게나제는 스테레오-특이적 (specific)일 수 있다.
상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 박테리아, 효모, 진균, 포유동물 또는 파충류로부터 유래한 것을 포함할 수 있다. 상기 유전자는 락토바실러스 델브루엑키 아종 불가리쿠스 (L. delbrueckii subsp . bulgaicus) 및 L. 불가리쿠스 (L. bulgaricus)와 같은 락토바실러스(Lactobacillus) 속, L. 존소니 (L.johnsonii), L. 플란타룸(L. plantarum), 일본자라 (Pelodiscus sinensis japonicus), 오리너구리 (Ornithorhynchus anatinus), 병코돌고래 (Tursiops truncatus), 노르웨이산집쥐 (Rattus norvegicus), 개구리 (Xenopus laevis), 및 보스 타우루스 (Bos taurus)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 LDH는 D-락테이트를 생산하는 것인 EC 1.1.1.28로 분류되는 효소이거나 L-락테이트를 생산하는 것인 EC 1.1.1.27로 분류되는 효소일 수 있다. D-락테이트 데히드로게나제(D-LDH)는 상기 EC 1.1.1.28로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 D-LDH는 D-특이 2-히드록시산 데히드로게나제(D-specific 2-hydroxyacid dehydrogenase)로 지칭될 수 있다. 상기 D-LDH는 피루베이트와 NADH를 (R)-락테이트와 NAD+로의 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 D-LDH는 서열번호 19의 아미노산 서열과 60%이상, 또는 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 또는 99%이상의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 D-LDH를 코딩하는 유전자는 서열번호 20의 폴리뉴클레오티드 서열과 60%이상, 또는 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다.
L-락테이트 데히드로게나제(L-LDH)는 상기 EC 1.1.1.27로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 L-LDH는 L-특이 2-히드록시산 데히드로게나제(L-specific 2-hydroxyacid dehydrogenase)로 지칭될 수 있다. 상기 L-LDH는 피루베이트와 NADH를 (S)-락테이트와 NAD+로의 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 L-LDH는 서열번호 21, 22, 23, 24, 및 25의 아미노산 서열과 60%이상, 또는 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 또는 99%이상의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 D-LDH를 코딩하는 유전자는 서열번호 26의 폴리뉴클레오티드 서열과 60%이상, 또는 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 또는 99%이상의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다.
상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 벡터 내 포함될 수 있다. 상기 벡터는 복제개시점, 프로모터, 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 터미네이터를 포함할 수 있다. 상기 복제 개시점은 효모 자가복제 서열 (autonomous replication sequence: ARS)을 포함할 수 있다. 상기 효모 자가복제서열은 효모 동원체 서열 (centrometric sequence: CEN)에 의해 안정화될 수 있다. 상기 프로모터는 상술한 바와 동일하다. 상기 터미네이터는 상술한 바와 동일한다. 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 효모 세포의 특정 위치에 게놈에 포함될 수 있다. 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포 내에서 활성 단백질을 생산하기 위해 기능하는 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 "기능성 (functional)"인 것으로 고려된다.
상기 효모 세포는 단일의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 2 내지 10 카피수의 복수의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 효모 세포는 예를 들면 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 또는 1 내지 3 카피의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 효모 세포가 복수의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 각각의 폴리뉴클레오티드는 동일하거나 둘 이상의 상이한 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 조합일 수 있다. 외인성 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 복수의 카피는 숙주 세포의 게놈 내에 동일한 유전자좌 (locus) 또는 여러 유전자좌에 포함될 수 있고, 각 카피의 프로모터나 터미네이터가 동일하거나 상이할 수 있다.
상기 효모 세포는 모세포에 비하여, 추가적으로 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드, 아세트알데히드를 아세테이트로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그의 조합의 활성이 감소되도록 하는 유전적 변형을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 파괴된 변이를 갖는 것일 수 있다. 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 것을 촉매하는 효소일 수 있으며, EC 4.1.1.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 예를 들면, 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase: PDC)일 수 있다. 상기 PDC는 예를 들면 PDC1, PDC5, 또는 PDC6일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 27 또는 29의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 5의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 28 또는 30의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 pdc1, pdc5, 또는 pdc6일 수 있다.
상기 효모 세포는 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 파괴된 변이를 갖는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 EC 1.1.1.8, EC 1.1.5.3, 또는 EC 1.1.1.94로 분류되는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제(GPD)일 수 있다. 상기 GPD는 예를 들면 GPD1, GPD2, 또는 GPD3일 수 있다. 상기 효모 세포는 GPD1, GPD2, GPD3, 또는 그의 조합을 코딩하는 유전자가 파괴된 변이를 갖는 것일 수 있다. 상기 GPD1은 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제일 수 있으며, NADH 또는 NADP의 NAD+ 또는 NADP+로의 산화를 이용하여 DHAP를 글리세롤-3-포스페이트로의 환원을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 GPD2는 glycerol-3-phosphate dehydrogenase (quinone)일 수 있다. 상기 GPD3은 glycerol-3-phosphate dehydrogenase (NAD(P)+)일 수 있다. 상기 GPD는 서열번호 31의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 GPD를 코딩하는 유전자(gpd 유전자)는 서열번호 9의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 32의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 파괴된 변이를 갖는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 EC. 1.1.2.4 또는 EC 1.1.2.3으로 분류되는 것일 수 있다.
상기 EC. 1.1.2.4으로 분류되는 폴리펩티드는 D-락테이트 페리시토크롬 C 옥시도리덕타제(D-lactate ferricytochrome C oxidoreductase)일 수 있다. 상기 D-락테이트 페리시토크롬 C 옥시도리덕타제는 D-락테이트 데히드로게나제 (D-lactate dehydrogenase: DLD)로 지칭될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 DLD1, DLD2, 또는 DLD3일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 서열번호 33의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 33의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 일례로 상기 유전자는 서열번호 34의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 EC. 1.1.2.3으로 분류되는 폴리펩티드는 L-락테이트 시토크롬-c 옥시도리덕타제(CYB2)일 수 있고, 또한 CYB2A, 또는 CYB2B로 지칭될 수 있다. 상기 CYB2는 시토크롬 c-의존성 효소일 수 있다. 상기 CYB2는 서열번호 35의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 7의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 36의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 파괴된 변이를 갖는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 아세트알데히드에서 에탄올로 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 EC. 1.1.1.1에 속하는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 NADH로부터 NAD+로의 전환을 이용하여, 아세트알데히드에서 에탄올로의 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 알코올 데히드로게나제 (alcohol dehydrogenase: ADH)일 수 있다. 상기 ADH는, 예를 들면, Adh1, Adh2, Adh3, Adh4, Adh5, 또는 Adh6일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 서열번호 37 또는 39의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 16의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 38 또는 40의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 일례로 adh1, adh2, adh3, adh4, adh5, 또는 adh6일 수 있다.
상기 효모 세포는 아세트알데히드를 아세테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 파괴된 변이를 갖는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 아세트알데히드에서 아세테이트로 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 EC. 1.2.1.4에 속하는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 Mg2 +에 의하여 활성화되고, NADP에 특이적인 것일 수 있다. 이 효소는 아세테이트의 생성에 관여하는 것일 수 있다. 생성된 아세테이트로부터 세포질 아세틸-CoA가 합성될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 알데히드 데히드로게나제 (alcohol dehydrogenase: ALD)일 수 있다. 상기 ALD는, 예를 들면, ALD6일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 서열번호 41의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 16의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 42의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 일례로 ald6일 수 있다.
상기 효모 세포는 추가적으로 모세포에 비하여 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 것을 촉매하는 효소의 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다.
상기 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 것을 촉매하는 효소는 EC 1.2.1.10으로 분류되는 아세틸화 아세트알데히드 데히드로게나제 (acylating acetaldehyde dehydrogenase: A-ALD)인 것일 수 있다. 상기 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 것을 촉매하는 효소의 일 타입은 4-히드록시-2-케토발러레이트 이화(catabolism)에 관련된 이관능성 알돌라제-데히드로게나제 복합체 (bifunctional aldolase-dehydrogenase complex)의 일부인 단백질일 수 있다. 이러한 이관능성 효소는 페놀, 톨루엔, 나프탈렌, 비페닐, 및 다른 방향성 화합물의 분해에서 많은 박테리아 종에서 중간체인, 카테콜의 메타-절단 경로 (meta-cleavage pathway)의 최종 두 단계를 촉매한다. 4-히드록시-2-케토발러레이트는 먼저 4-히드록시-2-케토발러레이트 알돌라제에 의하여 피루베이트와 아세트알데히드로 전환되고, 다음으로 A-ALD에 의하여 아세트알데히드는 Acetly-CoA로 전환된다. A-ALD의 이 타입의 예는 Pseudomonas sp. CF600 (Genbank No: CAA43226)의 DmpF이다. 대장균의 MhpF 단백질은 DmpF에 대한 동족체이다. 상기 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 것을 촉매하는 효소의 다른 일 타입은 엄격하게 (strictly) 또는 선택적(facultative) 혐기성 미생물 유래의 acetyl-CoA와 acetaldehyde의 가역적 전환을 촉매하는 단백질이지만, 알콜 데히드로게나제 활성을 갖지 않은 것일 수 있다. 이 타입의 단백질의 예는 Clostridium kluyveri에서 보고된 것일 수 있다. A-ALD는 Clostridium kluyveri DSM 555 (Genbank No: EDK33116)의 게놈에 주석 (annotation)되어 있다. 동족 단백질 (homologous protein) AcdH가 Lactobacillus plantarum (Genbank No: NP_784141)의 게놈에서 확인되었다. 이 타입의 단백질의 다른 예는 Clostridium beijerinckii NRRL B593 (Genbank No: AAD31841)의 상기 유전자 산물이다. 상기 A-ALD의 일 예는, 대장균 유래의 MhpF 또는 그의 기능적 동족체 (functional homologue), 예를 들면, 대장균 및 S. typhimurium 유래의 EutE (예, 서열번호 44)의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 EutE 유전자 및 서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 EutE 단백질), 또는 Pseudomonas sp . CF600 유래의 dmpF인 것일 수 있다. A-ALD는 NAD(P)+ 의존성일 수 있다. 상기 A-ALD는 하기 반응을 촉매하는 활성을 갖는 것일 수 있다.
아세트알데히드(Acetaldehyde) + CoA(coenzyme A) + NAD+ <=> acetyl-CoA + NADH + H+
상기 A-ALD는 다른 단백질과 복합체 (complex)를 형성하지 않고서 발현된 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 예를 들면, EC 4.1.3.39에 속하는 외인성 효소 또는 그 유전자를 포함하지 않는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 상기 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 것을 촉매하는 효소를 코딩하는 외인성 유전자 (exogenous gene)를 포함하는 것일 수 있다. 상기 A-ALD 외인성 유전자는, 상기 효모 세포에서 그 모세포에 비하여 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 것을 촉매하는 효소의 활성이 증가되기에 충분한 양으로 발현된 것일 수 있다. 상기 A-ALD 외인성 유전자는 서열번호 43의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 것일 수 있다. 상기 A-ALD 외인성 유전자는 서열번호 44의 뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 서열번호 44는 대장균 유래의 A-ALD 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.
상기 효모 세포는 추가적으로 모세포에 비하여 방사선 감수성 보완 키나아제(Radiation sensitivity Complementing Kinase: RCK)의 활성이 증가된 것일 수 있다. 방사선 감수성 보완 키나아제는 세린/트레오닌-프로테인 키나아제 (Serine/threonine-protein kinase)일 수 있다. 상기 키나아제는 EC 2.7.11.1에 속하는 효소일 수 있다. 방사선 감수성 보완 키나아제는 RCK1 또는 RCK2일 수 있다. 방사선 감수성 보완 키나아제는 서열번호 45 또는 47와 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 아미노산 서열 동일성 (identity)을 가진 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 일례로, RCK1 및 RCK2는 각각 서열번호 45 및 47의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 방사선 감수성 보완 키나아제는 서열번호 45 또는 47과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 46 및 서열번호 48의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 일례로 rck1 및 rck2 유전자는 각각 서열번호 46 및 48의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 그 모세포에 비하여 SUL1, STR3, HXT7, ERR1, GRX8, MXR1, GRE1, MRK1, AAD10, 또는 그 조합의 활성이 증가되어 있고; 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 피루베이트를 D-락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 아세트알데히드를 아세테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 또는 그 조합이 파괴된 변이를 갖고; 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 갖고, 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 폴리펩티드를 갖고, 방사선 감수성 보완 키나아제의 활성이 증가된 효모 세포일 수 있다. 상기 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지애일 수 있다.
상기 효모 세포는 락테이트로의 대사 산물의 흐름을 방해하는 경로의 활성이 감소된 것일 수 있다. 또한 상기 효모 세포는 락테이트로의 대사 산물의 흐름을 촉진하거나 도와주는 경로의 활성이 증가된 것일 수 있다.
다른 양상은 효모 세포에 SUL1, STR3, HXT7, ERR1, GRX8, MXR1, GRE1, MRK1, AAD10, 또는 그 조합을 과발현시키는 단계를 포함하는 내산성을 갖는 효모 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 내산성을 갖는 효모 세포를 제조하는 방법은 효모 세포에 SUL1, STR3, HXT7, ERR1, GRX8, MXR1, GRE1, MRK1, AAD10, 또는 그 조합을 과발현시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 단계에 있어서, “효모 세포”, “SUL1”, “STR3”, “HXT7”, “ERR1”, “GRX8”, “MXR1”, “GRE1”, “MRK1”, 및 “AAD10” 에 대하여는 상술한 바와 같다.
SUL1, STR3, HXT7, ERR1, GRX8, MXR1, GRE1, MRK1, AAD10, 또는 그 조합의 단백질을 과발현시키는 단계는 SUL1, STR3, HXT7, ERR1, GRX8, MXR1, GRE1, MRK1, AAD10, 또는 그 조합을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 것일 수 있다. 상기 과발현은 상기 유전자를 과발현시킨 효모 세포가 그 모세포에 비해 상기 SUL1, STR3, HXT7, ERR1, GRX8, MXR1, GRE1, MRK1, 및 AAD10의 각각의 효소 활성이 동일한 조건 하에서 모세포에 비해 더 많은 양으로 또는 다소 더 높은 정상 상태 수준으로 생산됨을 의미한다. 또한 이는 상기 단백질을 코딩하는 mRNA가 동일한 조건 하에서 모세포에 비해 더 많은 양으로 또는 다시 다소 더 높은 정상 상태 수준으로 생산됨을 의미한다. 따라서 상기 단백질의 과발현은 적합한 효소 분석을 사용하여 상기 숙주 세포에서 상기 효소의 비활성 수준을 측정함으로써 측정될 수 있다. 상기 과발현시키는 단계는 활성을 증가시키는 유전적 변형을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 내산성을 갖는 효모 세포를 제조하는 방법은 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 아세트알데히드를 아세테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합을 파괴하는 단계; 및 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 도입시키는 단계; 방사선 감수성 보완 키나아제(RCK)를 과발현시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 단계에 있어서, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 아세트알데히드를 아세테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 파괴에 대하여는 상술한 바와 같다. 또한 상기 단계에 있어서, 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 폴리펩티드 및 RCK에 대하여는 상술한 바와 같다.
다른 양상은 효모 세포를 배양하여 락테이트를 생산하는 단계를 포함하는 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 효모 세포에 대해서는 상술한 바와 같다.
상기 락테이트를 생산하는 효모 세포를 제조하는 방법은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 단계에 있어서, “피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드”, 및 “피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자”에 대하여는 상술한 바와 같다. 상기 유전자의 도입은 벡터와 같은 비히클을 매개하여 이루어질 수 있다. 상기 도입은 상기 유전자가 게놈에 통합되지 않은 임시적 도입이거나 게놈에 삽입되는 것일 수 있다. 상기 도입은 예를 들면, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 상기 세포로 도입한 후, 상기 벡터가 세포 내에서 복제되거나 상기 폴리뉴클레오티드가 게놈으로 통합됨으로써 이루어질 수 있다.
상기 배양은 탄소원, 예를 들면, 글루코스를 함유하는 배지에서 수행될 수 있다. 효모 세포 배양에 사용되는 배지는 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 숙주 세포의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적합한 배지는 상업적인 판매자로부터 입수 가능하고 또는 공지된 제조법에 따라 제조될 수 있다. 상기 배양에 사용되는 배지는 특정한 효모 세포의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 염, 미량 원소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다.
상기 유전적으로 조작된 효모 세포에서 락테이트를 수득하기 위하여 배양 조건을 적절히 조절할 수 있다. 상기 세포는 증식을 위하여 호기성 조건에서 배양할 수 있다. 그 후 락테이트를 생산하기 위하여 상기 세포를 미세호기 조건 또는 혐기 조건에서 배양할 수 있다. 용어 "혐기 조건 (anaerobic conditions)"은 산소가 없는 환경을 나타낸다. 용어 "미세호기 조건 (microaerobic conditions)"은 배양 또는 성장 조건에 참조되어 사용되는 경우, 배지 중의 용존산소 (dissolved oxygen: DO) 농도가 액체 배지 중의 용존 산소에 대한 포화 (saturation)의 0% 보다 크고 약 10% 이하로 유지되는 것을 의미한다. 미세호기 조건은 또한, 1% 미만의 산소를 가진 분위기 (atmosphere)로 유지된 봉인된 챔버 (sealed chamber) 내에 액체 배지 중 또는 고체 아가 플레이트 상에서 세포를 성장시키거나 유지시키는 (resting) 것을 포함한다. 산소의 농도는 예를 들면, 배양물을 N2/CO2 혼합물 또는 다른 적당한 비산소 기체로 스파징함으로써 유지될 수 있다. 상기 산소 조건은 용존산소 (dissolved oxygen: DO) 농도가 0% 내지 10%, 예를 들면 0 내지 8%, 0 내지 6%, 0 내지 4%, 또는 0 내지 2%로 유지하는 것을 포함한다.
용어 "배양 조건"은 효모 세포를 배양하기 위한 조건을 의미한다. 이러한 배양 조건은 예를 들어, 효모 세포가 이용하는 탄소원, 질소원 또는 산소 조건일 수 있다. 효모 세포가 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류가 포함된다. 상기 탄소원은 글루코오즈, 프럭토오즈, 만노오즈, 또는 갈락토오즈일 수 있다. 효모 세포가 이용할 수 있는 질소원은 유기 질소 화합물, 또는 무기 질소 화합물일 수 있다. 질소원의 예는 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 또는 암모늄염일 수 있다.
상기 락테이트를 생산하는 방법은 배양물로부터 락테이트를 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다.
배양물로부터의 락테이트의 회수는 당해 기술분야에서 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리 방법은 원심분리, 여과, 이온교환크로마토그래피 또는 결정화일 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.
일 양상에 따른 효모 세포에 의하면, 내산성을 갖는 효모 세포를 제조할 수 있다.
일 양상에 따른 효모 세포를 제조하는 방법에 의하면, 내산성을 갖는 효모 세포를 효율적으로 제조할 수 있다.
일 양상에 따른 락테이트를 생산하는 방법에 의하면, 락테이트를 효율적으로 생산할 수 있다.
도 1a는 D-LA에 의한 글루코스 소모량을 나타내고, 도 1b는 D-LA에 의한 글루코스 흡수율을 나타내고, 도 1c는 D-LA에 의한 D-LA 생산량을 나타내고, 및 도 1d는 D-LA에 의한 D-LA 생산성을 나타낸다.
도 2는 젖산이 포함된 YPD 산성 배지 위에서 여러 효모 세포를 배양한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 사카로마이세스에서 젖산이 글루코스 소비 및 젖산 생산에 미치는 영향의 확인
본 실시예에서는 D-젖산의 존재하에서 사카로마이세스 세레비지애를 배양하고, 글루코스 소비 속도 및 젖산 생산량을 측정함으로써, 상기 D-젖산이 사카로마이세스 세레비지애에 의한 글루코스 소비 및 젖산 생산에 미치는 영향을 확인하였다.
먼저, 사카로마이세스 세레비지애에서 젖산에 의한 포도당 소비 및 젖산 생산의 저해가 있는지를 확인하기 위해, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿdld1::ldh, ㅿpdc6::ldh, ㅿadh1, ㅿald6::EcEutE, ㅿadh5::rck1) 균주(이하 “SP3027 균주”라 하고, 그 제조 방법은 실시예 2에 기재됨)를 대상으로 D-젖산 저해 분석(D-lactic acid inhibition assay)을 수행하였다.
구체적으로, 상기 SP3027 균주를 YPD 아가 플레이트에서 2일 동안 30℃에서 배양한 후, 단일 콜로니를 YPD broth에서 stationary phase까지 배양하였다. 얻어진 배양액을 멸균수로 씻어준 후 SD (pH 3.0) 배지로 resuspending 후 세포 밀도를 측정하였다. 상기 배양된 세포를 각각 0 g/L, 20 g/L, 및 40 g/L 농도의 D-LA가 첨가된 1 ml의 SD (60 g/L glucose, pH 3.0)에 첨가하고 OD600을 15.0으로 맞춘 후, 12 웰-플레이트에서 30°C, 90 rpm에서 배양한 후 시간별로 당 소모, D-LA 생산을 측정하였다.
도 1a는 D-LA에 의한 글루코스 소모량을 나타내고, 도 1b는 D-LA에 의한 글루코스 흡수율을 나타내고, 도 1c는 D-LA에 의한 D-LA 생산량을 나타내고, 및 도 1d는 D-LA에 의한 D-LA 생산성을 나타낸다. 도 1a 내지 1d 에 나타낸 바와 같이, 세포외 D-LA에 의해 글루코스 소모 및 D-LA 생산이 저해됨을 확인하였다. 도 1b 및 1d에 나타낸 바와 같이, D-LA에 의한 당모소 저해보다 D-LA 생산성에 대한 저해가 더 큼을 알 수 있다. 도 1c에 나타낸 바와 같이, 세포외 D-LA 농도가 높을수록 D-LA 생산 저해가 큼을 알 수 있다.
실시예 2. D- 락테이트 생산 균주의 제작
사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 야생형 균주(MATαura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3Δ1; MAL2-8C; SUC2, EUROSCARF accession number: 30000B)를 락테이트 생산 균주로 만들기 위해, 다음과 같은 유전적 변형을 갖는 락테이트 생산 균주를 제작하였다.
1. S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh )의 제작
1.1 pdc1 를 결실시키며 ldh 를 도입하기 위한 벡터의 제작
사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D에서 피루베이트로부터 아세트알데히드를 거쳐 에탄올로 가는 경로를 차단하기 위하여 피루베이트 데카르복실라제 1 (pyruvate decarboxylase1: pdc1)을 코딩하는 유전자를 제거하였다. pdc1 유전자를 제거하는 동시에 LbLdh를 발현시키기 위하여 pdc1 유전자를 'ldh 카세트'로 치환하여 pdc1 유전자를 결손시켰다. "카세트"란 달리 언급이 없으면, 프로모터, 코딩 서열, 및 터미네이터가 작동가능하게 연결된 단백질이 발현될 수 있는 단위 서열을 나타낸다.
구체적으로, 'ldh 카세트'를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지애 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 56 및 57의 프라이머쌍을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 얻어진 CCW12 프로모터 서열 (서열번호 53)과 'ldh 유전자 (서열번호 26)'를 각각 SacI/XbaI과 BamHI/SalI로 소화하고, 동일 효소로 소화된 pRS416 vector (ATCC87521TM)에 연결하였다. pRS416 vector는 T7 프로모터, 선택 마커로서 박테리아에서 암피실린 저항성, 효모에서 URA3 카세트를 갖고, 제한효소 클로닝 부위를 갖는 효모 센트로미어 셔틀 플라스미드 (yeast centromere shuttle plasmid)이다.
다음으로, pCEP4 플라스미드 (invitrogen, Cat. no. V044-50)를 주형으로 하고 서열번호 58 및 59의 프라이머쌍을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여, “HPH 카세트“ 서열 (서열번호 60)을 증폭하였다. 증폭된 “HPH 카세트”와 상기 pRS416 벡터를 각각 SacI 효소를 사용하여 절단하고 서로 연결하여, 'ldh 카세트'와 “HPH 카세트”가 작동가능하게 연결된 구조를 포함하는 p416-ldh-HPH 벡터를 제조하였다. 도 2는 p416-ldh-HPH 벡터 개열도를 나타낸 도면이다. 도 2에서."P CCW12" 및 "C2 LDH"는 각각 CCW12 프로모터 및 LDH orf를 나타낸다. pCEP4 플라스미드는 다중클로닝 부위 (multiple cloning site)에 삽입된 재조합 유전자의 높은 수준의 전사를 위한 cytomegalovirus (CMV) immediate early enhance/promoter를 사용하는 에피좀성 포유동물 발현 벡터 (episomal mammalian expression vector)이다. pCEP4는 트란스펙션된 세포 (transfected cell)에서 안정된 선택을 위한 히그로마이신 B 저항성 유전자 (hygromycin B resistance gene)을 갖는다. 여기서 'ldh 카세트'는 ldh 유전자 및 그 조절 영역을 포함하고 있어, ldh 유전자가 발현될 수 있도록 하는 영역을 나타낸다. 상기 ldh 유전자는 CCW12 프로모터 하에서 전사되도록 하였다. 또한, 'HPH (hygromycin B phosphotransferase) 카세트'는 히그로마이신 B 저항성 유전자 (hygromycin B resistance gene) 및 그 조절 영역을 포함하고 있어, 히그로마이신 B 저항성 유전자가 발현될 수 있도록 하는 영역을 나타낸다.
pdc1의 결실용 벡터는 p416-ldh-HPH를 주형으로 하고 서열번호 61 및 62의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR에 의하여 ldh 유전자 절편과 pUC57-Ura3HA 벡터 (DNA2.0 Inc.; 서열번호 63)를 각각 SacI로 소화시킨 후 서로 연결하여 pUC-uraHA-ldh를 제조하였다. 이 벡터로부터 pdc1의 결실용 카세트는 pdc1 유전자와 상동 서열을 갖는 서열번호 64 및 65의 서열을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 증폭하였다.
1.2 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ) 제조
1.1에서 제작한 pdc1 결실용 카세트를 사카로마이세스 세레비지애 (CEN.PK2-1D, EUROSCARF accession number: 30000B)에 도입하였다. 상기 pdc1 결실용 카세트의 도입은 일반적인 열충격 형질전환(heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 pdc1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 세포에 대하여, pdc1의 결실을 확인하기 위하여 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 66 및 67의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 pdc1 유전자 결실 및 ldh 유전자 도입이 이루어진 것을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::Pccw12-Lbldh)를 제조하였다.
2. S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh )의 제조
2.1 gpd1 를 결실시키기 위한 벡터의 제작
실시예 2의 1에서 제조된 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh)에서 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)에서 글리세롤-3-포스페이트로 가는 경로를 차단하기 위하여 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제(glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1: gpd1)을 코딩하는 유전자를 제거하였다.
구체적으로, 실시예 2의 1.1에서 제조된 pUC-uraHA-ldh를 주형으로 하고, 서열번호 68 및 69의 gpd1 상동 재조합 서열을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 gpd1 결실용 카세트를 얻었다.
2.2 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh )의 제조
2.1에서 제작한 gpd1 결실용 카세트를 실시예 2의 1에서 제조한 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh)에 도입하였다. 도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 gdp1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 균주에 대하여 gpd1의 결실을 확인하기 위하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 70 및 71의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 gpd1 유전자 결실을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh)를 제조하였다.
3. S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿ dld1 :: ldh )의 제작
3.1 dld1 을 결실시키기 위한 벡터의 제작
실시예 2의 2에서 얻어진 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh)에서, d-락테이트에서 피루베이트로 가는 경로를 차단하기 위하여 dld1 유전자를 제거하였다.
구체적으로, 실시예 2의 1.1에서 제조된 pUC-uraHA-ldh를 주형으로 하고, 서열번호 72 및 73의 dld1 상동 재조합 서열을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 dld1 결실용 카세트를 얻었다.
3.2 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿ dld1 :: ldh )의 제조
3.1에서 제작한 dld1 결실용 카세트를 상기한 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh)에 도입하였다. 도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 dld1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 균주에 대하여 dld1의 결실을 확인하기 위하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 74 및 75의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 dld1 유전자 결실된 것을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh,ㅿdld1::ldh)를 제조하였다.
4. S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿ dld1 :: ldh , ㅿ pdc6::ldh)의 제작
4.1 pdc6 유전자 결실용 카세트의 제조
S. cerevisiae CEN . PK2 -1D 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 76 및 77의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여, HHT2 유전자 프로모터를 증폭하고 이 HHT2 유전자 프로모터 증폭 산물 (서열번호 54)과 합성된 ldh 유전자 (서열번호 26)(DNA2.0 Inc., 미국)를 각각 SacI/XbaI과 BamHI/SalI로 절단하고, 동일한 효소로 절단된 pRS416 vector (ATCC87521TM)와 서로 연결하였다.
"HPH 카세트"와 상기 HHT2 유전자 프로모터를 포함하는 pRS416 vector를 각각 SacI 효소를 사용하여 절단하고 서로 연결하여, 벡터 p416-ldh-HPH를 제조하였다. pdc6 결실용 카세트는 p416-ldh-HPH 벡터를 주형으로 하고, 서열번호 78 및 79의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 제작하였다.
4.2 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿ dld1 :: ldh , ㅿ pdc6::ldh)의 제조
S. cerevisiae CEN . PK2 -1D로부터 pdc6 유전자를 ldh 유전자로 치환하기 위하여, 4.1에서 제작된 "pdc6 결실용 카세트"를 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿdld1::ldh) 균주를 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 도입하고, 히그로마이신 200ug/mL이 포함된 YPD 배지 (Yeast extract 1 (w/v)%, peptone 1 (w/v)%, 및 포도당 2 (w/v)%) 중 30℃에서 3일 동안 배양하여 염색체상의 pdc6 유전자를 ldh 유전자로 교체시켜, S. cerevisiae CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿdld1::ldh, ㅿgpd6::ldh) 균주를 제조하였다. 상기 제조된 균주에 대하여 pdc6의 결실을 확인하기 위하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 80 및 81의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 pdc6 유전자 결실된 것을 확인하였다.
5 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿ dld1 :: ldh , ㅿpdc6::ldh, ㅿ adh1 )의 제작
adh1 유전자 결실용 카세트는 결실용 벡터인 pUC57-ura3HA를 주형으로 하고, 서열번호 82 및 83의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 증폭하였다.
S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿdld1::ldh, ㅿpdc6::ldh) 균주로부터 adh1 유전자를 결실하기 위하여, 제작된 "adh1 결실용 카세트"를 상기 균주에 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 도입하고, 열충격 후 선택 마커인 Minimal Ura-drop out 배지 중 30℃에서 3일 동안 배양하여 염색체상의 adh1 유전자를 결실시켰다. 제조된 균주의 유전형을 분석하기 위하여, 제조된 균주의 게놈을 주형으로 하고, 서열번호 84 및 85의 프라이머 세트로 사용한 PCR에 의하여 adh1 유전자 결실 여부를 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿdld1::ldh, ㅿpdc6::ldh, ㅿadh1) 균주가 제조된 것을 확인하였다.
6. S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿ dld1 :: ldh , ㅿpdc6::ldh, ㅿ adh1 , ㅿ ald6 :: EcEutE )의 제작
6.1 ald6 를 결실하기 위한 벡터의 제작 및 도입
아세트알데히드 데히드로게나제 6 (acetaldehyde dehydrogenase 6: ald6) 유전자 결실용 카세트는 결실용 벡터인 pUC57-ura3HA를 주형으로 하고, 서열번호 86 및 87의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 증폭하였다. 서열번호 86 및 87의 서열은 S. cerevisiae의 염색체의 상동 서열과 재조합되어 ald6 유전자와 치환될 부분을 포함한다.
6.2 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh ,ㅿadh1, ㅿ ald6 ) 균주 제작
S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿdld1::ldh, ㅿpdc6::ldh, ㅿadh1) 균주로부터 ald6 유전자를 결실하기 위하여, 6.1에서 제작된 "ald6 결실용 카세트"를 상기 균주에 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 도입하고, 열충격 후 선택마커인 Minimal Ura-drop out 배지 중 30℃에서 3일 동안 배양하여 염색체상의 ald6 유전자를 결실시켰다. 제조된 균주의 유전형을 분석하기 위하여, 제조된 균주의 게놈을 주형으로 하고, 서열번호 88 및 89의 프라이머 세트로 사용한 PCR에 의하여 ald6 유전자 결실 여부를 확인하였다.
그 결과, S.cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿdld1::ldh, ㅿpdc6::ldh, ㅿadh1, ㅿald6) 균주가 제조된 것을 확인하였다.
6.3 효모 이목적 ( dual function ) 과발현 벡터 pCS - Ex1 의 제작
효모 과발현 벡터로 널리 사용되고 있는 pRS426GPD 벡터로부터 서열번호 90 및 91의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 689 bp의 DNA 조각 (GPD 프로모터)을 얻었다. 이 DNA 조각을 KpnI으로 처리한 pCtB1 벡터 (Genbank Accession Number KJ922019)와 섞어 In-fusion 키트 (Clonetech, cat. 639650)를 이용하여 클로닝한 후, 통상적인 방법을 통해 클로닝용 대장균 균주인 TOP10 균주 (Invitrogen, cat. C4040-06)에 도입하였다. 도입 후 균주를 카나마이신이 50ug/ml 농도로 포함된 LB 한천 배지 (Bacto Tryptone 10g/L, Yeast Extract 5g/L, NaCl 10g/L, 및 Bacto Agar 15g/L)에 도말하고 배양하여 형성된 콜로니들 중에서 플라스미드 DNA를 분리하여 그 중 플라스미드 서열이 서열번호 92와 같은 플라스미드를 확인하였다. 그 결과, 효모 이목적 과발현 벡터인 pCS-Ex1 벡터를 얻었다. 여기서, 이목적이란 유전자의 게놈 삽입 후 발현 목적 및 벡터 상에서의 유전자 발현 목적을 나타낸다.
6.4 효모 이목적 대장균 eutE 유전자 과발현 벡터의 제작　
대장균 MG1655 균주의 게놈 DNA로부터 서열번호 93 및 94의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 1447 bp의 DNA 조각, 즉 EutE 유전자를 얻었다. 이 DNA 조각을 KpnI과 SacI으로 처리한 pCS-Ex1 벡터와 섞어 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝한 후, 통상적인 방법을 통해 클로닝용 대장균주인 TOP10 균주 (Invitrogen cat. C4040-06)에 도입하였다. 도입 후 균주를 카나마이신이 50ug/ml 농도로 포함된 LB 한천 배지에 도말하고 배양하여 형성된 콜로니들 중에서 플라스미드 DNA를 분리하여 그 중 플라스미드 서열이 서열번호 95와 같은 플라스미드를 확인하였다. 그 결과, 효모 이목적 대장균 eutE 유전자 과발현 벡터인 MD1040 벡터를 얻었다.
6.5 대장균 eutE 유전자가 과발현된 효모의 제작　
제작된 MD1040 벡터로부터 서열번호 96 및 97의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 3985bp의 DNA 조각을 얻었다. 이 조각을 통상적인 방법으로 S.cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿdld1::ldh, ㅿpdc6::ldh, ㅿadh1, ㅿald6)에 도입한 후 우라실이 포함되어 있지 않은 최소 배지인 SD-URA 한천배지 (Yeast nitrogen base without amino acids (Sigma-Aldrich: Cat. no. Y0626) 6.7 g/L, Yeast synthetic drop-out without uracil(Sigma-Aldrich: Cat. no. Y1501) 1.9 g/L, D-glucose 20g/L, 및 Bacto Agar 20g/L)에 도말하였다. 사흘 후 형성되는 콜로니들 중에서, 서열번호 98 및 99의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행했을 때 4,357bp의 DNA 조각을 확인할 수 있는 콜로니를 선별하였다. 자연형 균주의 게놈 DNA에서는 서열번호 98 및 99의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하면 2,300bp의 DNA 조각을 얻을 수 있다. 얻어진 클론을 YPD 배지 (Bacto Peptone 20g/L, Yeast Extract 10g/L, 및 D-glucose 20g/L)에 접종하여 30℃에서 230rpm으로 교반하여 배양한 후, 5-FOA가 포함된 역선별배지 (Yeast nitrogen base without amino acids (Sigma-Aldrich: Cat. no. Y0626) 6.7 g/L, Yeast synthetic drop-out without uracil(Sigma-Aldrich: Cat. no. Y1501) 1.9 g/L, Uracil 0.1g/L, D-glucose 20g/L, 5-fluoroorotic acid (5-FOA) 1g/L, 및 Bacto Agar 20g/L)에 도말하였다. 사흘 후 형성되는 콜로니들 중에서, 서열번호 100 및 101의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행했을 때 2,963 bp의 DNA 조각을 확인할 수 있는 콜로니를 선별하였다.
그 결과, S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿdld1::ldh, ㅿpdc6::ldh, ㅿadh1, ㅿald6::EcEutE) 를 제조하였다.
7. S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿ dld1 :: ldh , ㅿpdc6::ldh, ㅿ adh1 , ㅿ ald6 :: EcEutE , ㅿ adh5 :: rck1 )의 제작
7.1 효모 이목적 대장균 rck1 유전자 과발현 벡터의 제작　
사카로마이세스 세레비지애 게놈 DNA로부터 서열번호 102 및 103의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 RCK1 유전자를 얻었다. 이 DNA 조각을 KpnI과 SacI으로 처리한 pCS-Ex1 벡터와 섞어 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝한 후, 통상적인 방법을 통해 클로닝용 대장균주인 TOP10 균주 (Invitrogen cat. C4040-06)에 도입하였다. 도입 후 균주를 카나마이신이 50ug/ml 농도로 포함된 LB 한천 배지에 도말하고 배양하여 형성된 콜로니들 중에서 플라스미드 DNA를 분리하여 그 중 플라스미드 서열이 RCK1와 같은 플라스미드를 확인하였다. 그 결과, 효모 이목적 대장균 RCK1 유전자 과발현 벡터인 MD1167 벡터를 얻었다.
7.2 RCK1 유전자가 과발현된 효모의 제작　
제작된 MD1167 벡터로부터 서열번호 104 및 105의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 RCK1 도입용 카세트 조각을 얻었다. 이 조각을 통상적인 방법으로 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿdld1::ldh, ㅿpdc6::ldh, ㅿadh1, ㅿald6)에 도입한 후 우라실이 포함되어 있지 않은 최소 배지인 SD-URA 한천배지 (Yeast nitrogen base without amino acids (Sigma-Aldrich: Cat. no. Y0626) 6.7 g/L, Yeast synthetic drop-out without uracil(Sigma-Aldrich: Cat. no. Y1501) 1.9 g/L, D-glucose 20g/L, 및 Bacto Agar 20g/L)에 도말하였다. 사흘 후 형성되는 콜로니들 중에서, 서열번호 106 및 107의 프라이머 조합을 이용하여 RCK1 유전자가 ADL6 위치에 삽입된 균주를 확인하였다. 얻어진 클론을 YPD 배지 (Bacto Peptone 20g/L, Yeast Extract 10g/L, 및 D-glucose 20g/L)에 접종하여 30℃에서 230rpm으로 교반하여 배양한 후, 5-FOA가 포함된 역선별배지 (Yeast nitrogen base without amino acids (Sigma-Aldrich: Cat. no. Y0626) 6.7 g/L, Yeast synthetic drop-out without uracil(Sigma-Aldrich: Cat. no. Y1501) 1.9 g/L, Uracil 0.1g/L, D-glucose 20g/L, 5-fluoroorotic acid (5-FOA) 1g/L, 및 Bacto Agar 20g/L)에 도말하였다. 사흘 후 형성되는 콜로니들 중에서, 서열번호 106 및 107의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행함으로써 URA3 유전자가 제거된 균주를 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿdld1::ldh, ㅿpdc6::ldh, ㅿadh1, ㅿald6::RCK1) (이하 'SP3027'이라고 명명)를 수득하였다.
실시예 3. 과발현 균주의 제작
1. Sul1 과발현 균주의 제작
SUL1 유전자의 프로모터를 CCW12 유전자의 프로모터로 치환하는 카세트를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지애 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 108과 109 및 서열번호 110과 111의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 SUL1 upstream region과 downstream region을 증폭하였다. 이 DNA 조각을 XhoI과 XbaI으로 처리한 pMSK+ 벡터와 섞어 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝한 후, 통상적인 방법을 통해 클로닝용 대장균주인 TOP10 균주 (Invitrogen cat. C4040-06)에 도입하였다. 이렇게 제작된 pMSK-SUL1 벡터의 EcoRI site에 pCS-EX1 벡터를 주형으로 서열번호 112 및 113의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 증폭된 PCR 단편을 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝한 후, 통상적인 방법을 통해 클로닝용 대장균주인 TOP10 균주 (Invitrogen cat. C4040-06)에 도입하였다. 그 결과, SUL1 유전자의 프로모터를 CCW12 유전자의 프로모터로 치환하는 카세트를 포함하는 벡터인 pCCW12-SUL1 벡터를 얻었다.
제작된 pCCW12-SUL1 벡터로부터 서열번호 108 및 111의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 CCW12 프로모터 치환용 카세트 조각을 얻었다. 이 조각을 통상적인 방법으로 SP3027 에 도입한 후 우라실이 포함되어 있지 않은 최소 배지인 SD-URA 한천배지 (Yeast nitrogen base without amino acids (Sigma-Aldrich: Cat. no. Y0626) 6.7 g/L, Yeast synthetic drop-out without uracil(Sigma-Aldrich: Cat. no. Y1501) 1.9 g/L, D-glucose 20g/L, 및 Bacto Agar 20g/L)에 도말하였다. 사흘 후 형성되는 콜로니들 중에서, 서열번호 114 및 115의 프라이머 조합을 이용하여 SUL1 유전자의 프로모터가 CCW12 프로모터로 치환된 균주를 확인하였다.
2. Str3 과발현 균주의 제작
STR3 유전자의 프로모터를 CCW12 유전자의 프로모터로 치환하는 카세트를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지애 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 116과 117 및 서열번호 118과 119의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 STR3 upstream region과 downstream region을 증폭하였다. 이 DNA 조각을 XhoI과 XbaI으로 처리한 pMSK+ 벡터와 섞어 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝한 후, 통상적인 방법을 통해 클로닝용 대장균주인 TOP10 균주 (Invitrogen cat. C4040-06)에 도입하였다. 이렇게 제작된 pMSK-STR3 벡터의 EcoRI site에 pCS-EX1 벡터를 주형으로 서열번호 120 및 121의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 증폭된 PCR 단편을 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝한 후, 통상적인 방법을 통해 클로닝용 대장균주인 TOP10 균주 (Invitrogen cat. C4040-06)에 도입하였다. 그 결과, STR3 유전자의 프로모터를 CCW12 유전자의 프로모터로 치환하는 카세트를 포함하는 벡터인 pCCW12-STR3 벡터를 얻었다.
제작된 pCCW12-STR3 벡터로부터 서열번호 116 및 119의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 CCW12 프로모터 치환용 카세트 조각을 얻었다. 이 조각을 통상적인 방법으로 SP3027 에 도입한 후 우라실이 포함되어 있지 않은 최소 배지인 SD-URA 한천배지 (Yeast nitrogen base without amino acids (Sigma-Aldrich: Cat. no. Y0626) 6.7 g/L, Yeast synthetic drop-out without uracil(Sigma-Aldrich: Cat. no. Y1501) 1.9 g/L, D-glucose 20g/L, 및 Bacto Agar 20g/L)에 도말하였다. 사흘 후 형성되는 콜로니들 중에서, 서열번호 114 및 122의 프라이머 조합을 이용하여 STR3 유전자의 프로모터가 CCW12 프로모터로 치환된 균주를 확인하였다.
3. hxt7 과발현 균주의 제작
HXT7 유전자의 프로모터를 CCW12 유전자의 프로모터로 치환하는 카세트를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지애 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 123과 124 및 서열번호 125과 126의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 HXT7 upstream region과 downstream region을 증폭하였다. 이 DNA 조각을 XhoI과 XbaI으로 처리한 pMSK+ 벡터와 섞어 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝한 후, 통상적인 방법을 통해 클로닝용 대장균주인 TOP10 균주 (Invitrogen cat. C4040-06)에 도입하였다. 이렇게 제작된 pMSK-HXT7 벡터의 EcoRI site에 pCS-EX1 벡터를 주형으로 서열번호 127 및 128의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 증폭된 PCR 단편을 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝한 후, 통상적인 방법을 통해 클로닝용 대장균주인 TOP10 균주 (Invitrogen cat. C4040-06)에 도입하였다. 그 결과, HXT7 유전자의 프로모터를 CCW12 유전자의 프로모터로 치환하는 카세트를 포함하는 벡터인 pCCW12-HXT7 벡터를 얻었다.
제작된 pCCW12-HXT7 벡터로부터 서열번호 123 및 126의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 CCW12 프로모터 치환용 카세트 조각을 얻었다. 이 조각을 통상적인 방법으로 SP3027 에 도입한 후 우라실이 포함되어 있지 않은 최소 배지인 SD-URA 한천배지 (Yeast nitrogen base without amino acids (Sigma-Aldrich: Cat. no. Y0626) 6.7 g/L, Yeast synthetic drop-out without uracil(Sigma-Aldrich: Cat. no. Y1501) 1.9 g/L, D-glucose 20g/L, 및 Bacto Agar 20g/L)에 도말하였다. 사흘 후 형성되는 콜로니들 중에서, 서열번호 114 및 129의 프라이머 조합을 이용하여 HXT7 유전자의 프로모터가 CCW12 프로모터로 치환된 균주를 확인하였다.
4. err1 과발현 균주의 제작
ERR1 유전자의 프로모터를 CCW12 유전자의 프로모터로 치환하는 카세트를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지애 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 130과 131 및 서열번호 132과 133의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 ERR1 upstream region과 downstream region을 증폭하였다. 이 DNA 조각을 XhoI과 XbaI으로 처리한 pMSK+ 벡터와 섞어 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝한 후, 통상적인 방법을 통해 클로닝용 대장균주인 TOP10 균주 (Invitrogen cat. C4040-06)에 도입하였다. 이렇게 제작된 pMSK-ERR1 벡터의 EcoRI site에 pCS-EX1 벡터를 주형으로 서열번호 134 및 135의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 증폭된 PCR 단편을 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝한 후, 통상적인 방법을 통해 클로닝용 대장균주인 TOP10 균주 (Invitrogen cat. C4040-06)에 도입하였다. 그 결과, ERR1 유전자의 프로모터를 CCW12 유전자의 프로모터로 치환하는 카세트를 포함하는 벡터인 pCCW12-ERR1 벡터를 얻었다.
제작된 pCCW12-ERR1 벡터로부터 서열번호 130 및 133의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 CCW12 프로모터 치환용 카세트 조각을 얻었다. 이 조각을 통상적인 방법으로 SP3027 에 도입한 후 우라실이 포함되어 있지 않은 최소 배지인 SD-URA 한천배지 (Yeast nitrogen base without amino acids (Sigma-Aldrich: Cat. no. Y0626) 6.7 g/L, Yeast synthetic drop-out without uracil(Sigma-Aldrich: Cat. no. Y1501) 1.9 g/L, D-glucose 20g/L, 및 Bacto Agar 20g/L)에 도말하였다. 사흘 후 형성되는 콜로니들 중에서, 서열번호 114 및 136의 프라이머 조합을 이용하여 ERR1 유전자의 프로모터가 CCW12 프로모터로 치환된 균주를 확인하였다.
5. grx8 과발현 균주의 제작
GRX8 유전자의 프로모터를 CCW12 유전자의 프로모터로 치환하는 카세트를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지애 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 137과 138 및 서열번호 139과 140의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 GRX8 upstream region과 downstream region을 증폭하였다. 이 DNA 조각을 XhoI과 XbaI으로 처리한 pMSK+ 벡터와 섞어 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝한 후, 통상적인 방법을 통해 클로닝용 대장균주인 TOP10 균주 (Invitrogen cat. C4040-06)에 도입하였다. 이렇게 제작된 pMSK-GRX8 벡터의 EcoRI site에 pCS-EX1 벡터를 주형으로 서열번호 141 및 142의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 증폭된 PCR 단편을 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝한 후, 통상적인 방법을 통해 클로닝용 대장균주인 TOP10 균주 (Invitrogen cat. C4040-06)에 도입하였다. 그 결과, GRX8 유전자의 프로모터를 CCW12 유전자의 프로모터로 치환하는 카세트를 포함하는 벡터인 pCCW12-GRX8 벡터를 얻었다.
제작된 pCCW12-GRX8 벡터로부터 서열번호 137 및 140의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 CCW12 프로모터 치환용 카세트 조각을 얻었다. 이 조각을 통상적인 방법으로 SP3027 에 도입한 후 우라실이 포함되어 있지 않은 최소 배지인 SD-URA 한천배지 (Yeast nitrogen base without amino acids (Sigma-Aldrich: Cat. no. Y0626) 6.7 g/L, Yeast synthetic drop-out without uracil(Sigma-Aldrich: Cat. no. Y1501) 1.9 g/L, D-glucose 20g/L, 및 Bacto Agar 20g/L)에 도말하였다. 사흘 후 형성되는 콜로니들 중에서, 서열번호 114 및 143의 프라이머 조합을 이용하여 GRX8 유전자의 프로모터가 CCW12 프로모터로 치환된 균주를 확인하였다.
6. mxr1 과발현 균주의 제작
MXR1 유전자의 프로모터를 CCW12 유전자의 프로모터로 치환하는 카세트를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지애 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 144과 145 및 서열번호 146과 147의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 MXR1 upstream region과 downstream region을 증폭하였다. 이 DNA 조각을 XhoI과 XbaI으로 처리한 pMSK+ 벡터와 섞어 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝한 후, 통상적인 방법을 통해 클로닝용 대장균주인 TOP10 균주 (Invitrogen cat. C4040-06)에 도입하였다. 이렇게 제작된 pMSK-MXR1 벡터의 EcoRI site에 pCS-EX1 벡터를 주형으로 서열번호 148 및 149의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 증폭된 PCR 단편을 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝한 후, 통상적인 방법을 통해 클로닝용 대장균주인 TOP10 균주 (Invitrogen cat. C4040-06)에 도입하였다. 그 결과, MXR1 유전자의 프로모터를 CCW12 유전자의 프로모터로 치환하는 카세트를 포함하는 벡터인 pCCW12-MXR1 벡터를 얻었다.
제작된 pCCW12-MXR1 벡터로부터 서열번호 144 및 147의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 CCW12 프로모터 치환용 카세트 조각을 얻었다. 이 조각을 통상적인 방법으로 SP3027 에 도입한 후 우라실이 포함되어 있지 않은 최소 배지인 SD-URA 한천배지 (Yeast nitrogen base without amino acids (Sigma-Aldrich: Cat. no. Y0626) 6.7 g/L, Yeast synthetic drop-out without uracil(Sigma-Aldrich: Cat. no. Y1501) 1.9 g/L, D-glucose 20g/L, 및 Bacto Agar 20g/L)에 도말하였다. 사흘 후 형성되는 콜로니들 중에서, 서열번호 114 및 150의 프라이머 조합을 이용하여 MXR1 유전자의 프로모터가 CCW12 프로모터로 치환된 균주를 확인하였다.
7. gre1 과발현 균주의 제작
GRE1 유전자의 프로모터를 CCW12 유전자의 프로모터로 치환하는 카세트를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지애 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 151과 152 및 서열번호 153과 154의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 GRE1 upstream region과 downstream region을 증폭하였다. 이 DNA 조각을 XhoI과 XbaI으로 처리한 pMSK+ 벡터와 섞어 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝한 후, 통상적인 방법을 통해 클로닝용 대장균주인 TOP10 균주 (Invitrogen cat. C4040-06)에 도입하였다. 이렇게 제작된 pMSK-GRE1 벡터의 EcoRI site에 pCS-EX1 벡터를 주형으로 서열번호 155 및 156의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 증폭된 PCR 단편을 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝한 후, 통상적인 방법을 통해 클로닝용 대장균주인 TOP10 균주 (Invitrogen cat. C4040-06)에 도입하였다. 그 결과, GRE1 유전자의 프로모터를 CCW12 유전자의 프로모터로 치환하는 카세트를 포함하는 벡터인 pCCW12-GRE1 벡터를 얻었다.
제작된 pCCW12-GRE1 벡터로부터 서열번호 151 및 154의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 CCW12 프로모터 치환용 카세트 조각을 얻었다. 이 조각을 통상적인 방법으로 SP3027 에 도입한 후 우라실이 포함되어 있지 않은 최소 배지인 SD-URA 한천배지 (Yeast nitrogen base without amino acids (Sigma-Aldrich: Cat. no. Y0626) 6.7 g/L, Yeast synthetic drop-out without uracil(Sigma-Aldrich: Cat. no. Y1501) 1.9 g/L, D-glucose 20g/L, 및 Bacto Agar 20g/L)에 도말하였다. 사흘 후 형성되는 콜로니들 중에서, 서열번호 114 및 157의 프라이머 조합을 이용하여 GRE1유전자의 프로모터가 CCW12 프로모터로 치환된 균주를 확인하였다.
8. mrk1 과발현 균주의 제작
MRK1 유전자의 프로모터를 CCW12 유전자의 프로모터로 치환하는 카세트를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지애 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 158과 159 및 서열번호 160과 161의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 MRK1 upstream region과 downstream region을 증폭하였다. 이 DNA 조각을 XhoI과 XbaI으로 처리한 pMSK+ 벡터와 섞어 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝한 후, 통상적인 방법을 통해 클로닝용 대장균주인 TOP10 균주 (Invitrogen cat. C4040-06)에 도입하였다. 이렇게 제작된 pMSK-MRK1 벡터의 EcoRI site에 pCS-EX1 벡터를 주형으로 서열번호 162 및 163의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 증폭된 PCR 단편을 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝한 후, 통상적인 방법을 통해 클로닝용 대장균주인 TOP10 균주 (Invitrogen cat. C4040-06)에 도입하였다. 그 결과, MRK1 유전자의 프로모터를 CCW12 유전자의 프로모터로 치환하는 카세트를 포함하는 벡터인 pCCW12-MRK1 벡터를 얻었다.
제작된 pCCW12-MRK1 벡터로부터 서열번호 158 및 161의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 CCW12 프로모터 치환용 카세트 조각을 얻었다. 이 조각을 통상적인 방법으로 SP3027 에 도입한 후 우라실이 포함되어 있지 않은 최소 배지인 SD-URA 한천배지 (Yeast nitrogen base without amino acids (Sigma-Aldrich: Cat. no. Y0626) 6.7 g/L, Yeast synthetic drop-out without uracil(Sigma-Aldrich: Cat. no. Y1501) 1.9 g/L, D-glucose 20g/L, 및 Bacto Agar 20g/L)에 도말하였다. 사흘 후 형성되는 콜로니들 중에서, 서열번호 114 및 164의 프라이머 조합을 이용하여 MRK1유전자의 프로모터가 CCW12 프로모터로 치환된 균주를 확인하였다.
9. aad10 과발현 균주의 제작
AAD10 유전자의 프로모터를 CCW12 유전자의 프로모터로 치환하는 카세트를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지애 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 165과 166 및 서열번호 167과 168의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 AAD10 upstream region과 downstream region을 증폭하였다. 이 DNA 조각을 XhoI과 XbaI으로 처리한 pMSK+ 벡터와 섞어 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝한 후, 통상적인 방법을 통해 클로닝용 대장균주인 TOP10 균주 (Invitrogen cat. C4040-06)에 도입하였다. 이렇게 제작된 pMSK-AAD10 벡터의 EcoRI site에 pCS-EX1 벡터를 주형으로 서열번호 169 및 170의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 증폭된 PCR 단편을 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝한 후, 통상적인 방법을 통해 클로닝용 대장균주인 TOP10 균주 (Invitrogen cat. C4040-06)에 도입하였다. 그 결과, AAD10 유전자의 프로모터를 CCW12 유전자의 프로모터로 치환하는 카세트를 포함하는 벡터인 pCCW12-AAD10 벡터를 얻었다.
제작된 pCCW12-AAD10 벡터로부터 서열번호 165 및 168의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 CCW12 프로모터 치환용 카세트 조각을 얻었다. 이 조각을 통상적인 방법으로 SP3027 에 도입한 후 우라실이 포함되어 있지 않은 최소 배지인 SD-URA 한천배지 (Yeast nitrogen base without amino acids (Sigma-Aldrich: Cat. no. Y0626) 6.7 g/L, Yeast synthetic drop-out without uracil(Sigma-Aldrich: Cat. no. Y1501) 1.9 g/L, D-glucose 20g/L, 및 Bacto Agar 20g/L)에 도말하였다. 사흘 후 형성되는 콜로니들 중에서, 서열번호 114 및 171의 프라이머 조합을 이용하여 AAD10유전자의 프로모터가 CCW12 프로모터로 치환된 균주를 확인하였다.
실시예 4. 과발현 균주의 내산성 측정
1. Spotting Assay
본 실시예에서는 효모 세포에 각각 sul1, str3, hxt7, err1, grx8, mxr1, gre1, mrk1, 및 aad10 유전자를 도입하여 과발현시키고, 그 과발현이 효모 세포의 내산성에 미치는 영향을 확인하였다.
실시예 2에서 제조된 균주로서 대조군으로 SP3027 균주, 및 실시예 3에서 제조된 균주로서 실험군으로 SP3027(sul1+), SP3027(str3+), SP3027(hxt7+), SP3027(err1+), SP3027(grx8+), SP3027(mxr1+), SP3027(gre1+), SP3027(mrk1+), 및 SP3027(aad10+) 균주 각각을 3 ml YPD (Bacto Peptone 20 g/L, Yeast Extract 10 g/L, D-glucose 20 g/L)에 접종한 후 30℃에서 약 230 rpm으로 교반하면서 총 24시간 동안 배양후 cell density (OD600)을 1.0으로 맞춘 후 5 ul 씩 2%의 D-LA, 2.5%의 D-LA, 및 3%의 D-LA가 첨가된 YPD 플레이트에 spotting 하였다. 이를 30℃에서 2 days 동안 배양하여 growth 유무를 관찰 하였다.
도 2는 젖산이 포함된 YPD 산성 배지 위에서 여러 효모 세포를 배양한 결과이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 2% D-LA, 2.5% D-LA를 함유하는 배지에서 대조군의 경우 콜로니가 관찰되지 않는 반면에, sul1, str3, hxt7, err1, grx8, mxr1, gre1, mrk1, 및 aad10가 과발현된 균주의 경우, 2% D-LA, 2.5% D-LA를 함유하는 배지에서 대조군보다 더 잘 성장한 것을 확인할 수 있다.
2. 세포 성장 및 글루코스 소모 측정
대조군으로 SP3027 균주, 및 실시예 3에서 제조된 균주로서 실험군으로 SP3027(sul1+), SP3027(str3+), SP3027(hxt7+), SP3027(err1+), SP3027(grx8+), SP3027(mxr1+), SP3027(gre1+), SP3027(mrk1+), 및 SP3027(aad10+) 균주 각각을 YPD 아가 플레이트에서 2일 동안 30℃에서 배양한 후, 단일 콜로니를 YPD broth에서 stationary phase까지 배양하였다. 얻어진 배양액을 멸균수로 씻어준 후 SD/-U (pH 3.0) 배지로 resuspending 후 세포 밀도를 측정하였다. 상기 배양된 세포를 각각 0 g/L, 20 g/L, 및 40 g/L 농도의 D-LA가 첨가된 1 ml의 SD/-URA (60 g/L glucose, pH 3.0)에 첨가하고 OD600을 4.0으로 맞춘 후, 12 웰-플레이트에서 30°C, 90 rpm에서 배양한 후 시간별로 당 소모, D-LA 생산을 측정하였다.
배양 중 주기적으로 시료를 채취하고, 시료를 약 13,000rpm에서 약 10 분 동안 원심분리한, 상등액의 각종 대사 산물 및 락테이트와 포도당의 농도를 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분석하였다. 상기 배양 상등액을 0.45um 시린지 필터를 사용하여 여과한 후, L-락테이트, 및 포도당을 HPLC 기기 (Waters e2695 Separation Module instrument equipped with a Waters 2414 Differential Refractometer and a Waters 2998 Photodiode Array Detector (Waters, Milford, MA))를 사용하여 정량하였다. HPLC 칼럼은 물 중 2.5mM H2SO4로 60?에서 0.5mL/min 유속으로 평형화된 Aminex HPX-87H Organic Acid Analysis Column (300mmx7.8mm;Bio-Rad)을 사용하였다.
표 2는 SD 배지 중에서 미세호기 조건에서 배양 24 시간 배양한 후 측정된 배지 중의 세포농도를 나타낸다.
균주 0 g/L의 D-LA가 첨가된 배지에서의 세포 농도 (OD600) 40 g/L의 D-LA 가 첨가된 배지에서의 세포 농도 (OD600)
SP3027 6.96 3.28
SP3027(sul1+) 7.72 7.08
SP3027(str3+) 7.62 7.02
SP3027(hxt7+) 7.40 6.84
SP3027(err1+) 7.34 7.20
SP3027(grx8+) 7.44 6.44
SP3027(mxr1+) 7.76 6.04
SP3027(gre1+) 8.48 7.14
SP3027(mrk1+) 7.92 6.68
SP3027(aad10+) 7.40 5.68
표 2에서, 각각 sul1, str3, hxt7, err1, grx8, mxr1, gre1, mrk1, 및 aad10이 과발현된 균주는 대조군 SP3027에 비하여 40 g/L의 D-LA가 첨가된 배지에서 각각의 균주의 세포 농도가 증가하였다. 이는 상기 과발현된 균주가 D-LA 내성으로 인하여 40 g/L D-LA 존재 하에서도 세포 성장이 D-LA가 존재하지 않는 경우와 비슷한 수준의 세포 성장을 갖는 것을 나타낸다.
표 3은 SD 배지 중에서 미세호기 조건에서 배양 24 시간 배양한 후 측정된 배지 중의 글루코스 소모량을 나타낸다.
균주 0 g/L의 D-LA가 첨가된 배지에서의 글루코스 소모 (g/L) 40 g/L의 D-LA 가 첨가된 배지에서의 글루코스 소모 (g/L)
SP3027 18.54 7.86
SP3027(sul1+) 33.63 25.30
SP3027(str3+) 29.80 27.69
SP3027(hxt7+) 31.01 24.75
SP3027(err1+) 31.93 28.53
SP3027(grx8+) 36.39 27.82
SP3027(mxr1+) 31.88 26.29
SP3027(gre1+) 26.85 24.59
SP3027(mrk1+) 35.00 28.44
SP3027(aad10+) 29.52 24.34
표 3에서, 각각 sul1, str3, hxt7, err1, grx8, mxr1, gre1, mrk1, 및 aad10이 과발현된 균주는 대조군 SP3027에 비하여 40 g/L의 D-LA가 첨가된 배지에서 각각의 균주의 글루코스 소모가 증가하였다. 이는 상기 과발현된 균주가 D-LA 내성 증대로 인해 40 g/L D-LA 존재 이하에서도 세포 성장이 D-LA가 존재하지 않는 경우와 비슷한 수준의 대사 능력을 갖는 것을 나타낸다. 따라서, 각각 sul1, str3, hxt7, err1, grx8, mxr1, gre1, mrk1, 및 aad10이 과발현된 경우, S. cerevisiae는 그렇지 않은 균주에 비하여 내산성이 예기치 않게 높았다.
3. 메티오닌, 시스테인 및 S-아데노실 메티오닌 의 생산량 측정
대조군으로 SP3027 균주, 및 실시예 3에서 제조된 균주로서 실험군으로 SP3027(sul1+), 및 SP3027(str3+) 균주 각각을 YPD 아가 플레이트에서 2일 동안 30℃에서 배양한 후, 단일 콜로니를 YPD broth에서 stationary phase까지 배양하였다. 얻어진 배양액을 멸균수로 씻어준 후 SD/-U (pH 3.0) 배지로 resuspending 후 세포 밀도를 측정하였다. 상기 배양된 세포를 각각 0 g/L, 및 20 g/L 농도의 D-LA가 첨가된 1 ml의 SD/-URA (60 g/L glucose, pH 3.0)에 첨가하고 OD600을 4.0으로 맞춘 후, 12 웰-플레이트에서 30°C, 90 rpm에서 배양하였다.
배양 중 시료를 채취하고, 시료를 약 13,000rpm에서 약 10 분 동안 원심분리한, 상등액의 메티오닌, 시스테인, 및 S-아데노실 메티오닌의 농도를 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분석하였다. 상기 배양 상등액을 0.45um 시린지 필터를 사용하여 여과한 후, HPLC 기기 (Waters e2695 Separation Module instrument equipped with a Waters 2414 Differential Refractometer and a Waters 2998 Photodiode Array Detector (Waters, Milford, MA))를 사용하여 메티오닌, 시스테인, 및 S-아데노실 메티오닌을 각각 정량하였다. HPLC 칼럼은 물 중 2.5mM H2SO4로 60?에서 0.5mL/min 유속으로 평형화된 Aminex HPX-87H Organic Acid Analysis Column (300mmx7.8mm;Bio-Rad)을 사용하였다.
표 4는 SD 배지 중에서 미세호기 조건에서 약 5시간 배양한 후 측정된 배지 중의 세포 농도를 나타낸다.
대사체 SP3027 SP3027 SP3027(sul1+) SP3027(str3+)
0 g/L의 D-LA가 첨가된 배지에서의 대사체의 세포내 농도 (nmol/107 cells) 20 g/L의 D-LA가 첨가된 배지에서의 대사체의 세포내 농도 (nmol/107 cells) 20 g/L의 D-LA가 첨가된 배지에서의 대사체의 세포내 농도 (nmol/107 cells) 20 g/L의 D-LA가 첨가된 배지에서의 대사체의 세포내 농도 (nmol/107 cells)
Met 7.57 ± 1.74 6.77±0.42 9.25±2.10 12.67±1.44
Cys 0.30 ± 0.00 0.40 ± 0.23 0.57 ± 0.08 0.76 ±0.05
S-아데노실 메티오닌 79.82 ± 5.53 82.88 ± 3.46 270.51 ± 8.16 458.42 ±17.81
표 4에 나타낸 바와 같이, 각각 sul1, 및 str3이 과발현된 균주는 대조군 SP3027에 비하여 20 g/L의 D-LA가 첨가된 배지에서 각각의 균주의 메티오닌, 시스테인, 및 S-아데노실 메티오닌의 농도가 증가하였다.
<110> Samsung Electronic Co. Ltd <120> Yeast cell having acid tolerant property, method for preparing the yeast cell and use thereof <130> PN109148 <160> 171 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 859 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 Met Ser Arg Lys Ser Ser Thr Glu Tyr Val His Asn Gln Glu Asp Ala 1 5 10 15 Asp Ile Glu Val Phe Glu Ser Glu Tyr Arg Thr Tyr Arg Glu Ser Glu 20 25 30 Ala Ala Glu Asn Arg Asp Gly Leu His Asn Gly Asp Glu Glu Asn Trp 35 40 45 Lys Val Asn Ser Ser Lys Gln Lys Phe Gly Val Thr Lys Asn Glu Leu 50 55 60 Ser Asp Val Leu Tyr Asp Ser Ile Pro Ala Tyr Glu Glu Ser Thr Val 65 70 75 80 Thr Leu Lys Glu Tyr Tyr Asp His Ser Ile Lys Asn Asn Leu Thr Ala 85 90 95 Lys Ser Ala Gly Ser Tyr Leu Val Ser Leu Phe Pro Ile Ile Lys Trp 100 105 110 Phe Pro His Tyr Asn Phe Thr Trp Gly Tyr Ala Asp Leu Val Ala Gly 115 120 125 Ile Thr Val Gly Cys Val Leu Val Pro Gln Ser Met Ser Tyr Ala Gln 130 135 140 Ile Ala Ser Leu Ser Pro Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ser Phe Ile Gly 145 150 155 160 Ala Phe Ile Tyr Ser Leu Phe Ala Thr Ser Lys Asp Val Cys Ile Gly 165 170 175 Pro Val Ala Val Met Ser Leu Gln Thr Ala Lys Val Ile Ala Glu Val 180 185 190 Leu Lys Lys Tyr Pro Glu Asp Gln Thr Glu Val Thr Ala Pro Ile Ile 195 200 205 Ala Thr Thr Leu Cys Leu Leu Cys Gly Ile Val Ala Thr Gly Leu Gly 210 215 220 Ile Leu Arg Leu Gly Phe Leu Val Glu Leu Ile Ser Leu Asn Ala Val 225 230 235 240 Ala Gly Phe Met Thr Gly Ser Ala Phe Asn Ile Ile Trp Gly Gln Ile 245 250 255 Pro Ala Leu Met Gly Tyr Asn Ser Leu Val Asn Thr Arg Glu Ala Thr 260 265 270 Tyr Lys Val Val Ile Asn Thr Leu Lys His Leu Pro Asn Thr Lys Leu 275 280 285 Asp Ala Val Phe Gly Leu Ile Pro Leu Val Ile Leu Tyr Val Trp Lys 290 295 300 Trp Trp Cys Gly Thr Phe Gly Ile Thr Leu Ala Asp Arg Tyr Tyr Arg 305 310 315 320 Asn Gln Pro Lys Val Ala Asn Arg Leu Lys Ser Phe Tyr Phe Tyr Ala 325 330 335 Gln Ala Met Arg Asn Ala Val Val Ile Val Val Phe Thr Ala Ile Ser 340 345 350 Trp Ser Ile Thr Arg Asn Lys Ser Ser Lys Asp Arg Pro Ile Ser Ile 355 360 365 Leu Gly Thr Val Pro Ser Gly Leu Asn Glu Val Gly Val Met Lys Ile 370 375 380 Pro Asp Gly Leu Leu Ser Asn Met Ser Ser Glu Ile Pro Ala Ser Ile 385 390 395 400 Ile Val Leu Val Leu Glu His Ile Ala Ile Ser Lys Ser Phe Gly Arg 405 410 415 Ile Asn Asp Tyr Lys Val Val Pro Asp Gln Glu Leu Ile Ala Ile Gly 420 425 430 Val Thr Asn Leu Ile Gly Thr Phe Phe His Ser Tyr Pro Ala Thr Gly 435 440 445 Ser Phe Ser Arg Ser Ala Leu Lys Ala Lys Cys Asn Val Arg Thr Pro 450 455 460 Phe Ser Gly Val Phe Thr Gly Gly Cys Val Leu Leu Ala Leu Tyr Cys 465 470 475 480 Leu Thr Asp Ala Phe Phe Phe Ile Pro Lys Ala Thr Leu Ser Ala Val 485 490 495 Ile Ile His Ala Val Ser Asp Leu Leu Thr Ser Tyr Lys Thr Thr Trp 500 505 510 Thr Phe Trp Lys Thr Asn Pro Leu Asp Cys Ile Ser Phe Ile Val Thr 515 520 525 Val Phe Ile Thr Val Phe Ser Ser Ile Glu Asn Gly Ile Tyr Phe Ala 530 535 540 Met Cys Trp Ser Cys Ala Met Leu Leu Leu Lys Gln Ala Phe Pro Ala 545 550 555 560 Gly Lys Phe Leu Gly Arg Val Glu Val Ala Glu Val Leu Asn Pro Thr 565 570 575 Val Gln Glu Asp Ile Asp Ala Val Ile Ser Ser Asn Glu Leu Pro Asn 580 585 590 Glu Leu Asn Lys Gln Val Lys Ser Thr Val Glu Val Leu Pro Ala Pro 595 600 605 Glu Tyr Lys Phe Ser Val Lys Trp Val Pro Phe Asp His Gly Tyr Ser 610 615 620 Arg Glu Leu Asn Ile Asn Thr Thr Val Arg Pro Pro Pro Pro Gly Val 625 630 635 640 Ile Val Tyr Arg Leu Gly Asp Ser Phe Thr Tyr Val Asn Cys Ser Arg 645 650 655 His Tyr Asp Ile Ile Phe Asp Arg Ile Lys Glu Glu Thr Arg Arg Gly 660 665 670 Gln Leu Ile Thr Leu Arg Lys Lys Ser Asp Arg Pro Trp Asn Asp Pro 675 680 685 Gly Glu Trp Lys Met Pro Asp Ser Leu Lys Ser Leu Phe Lys Phe Lys 690 695 700 Arg His Ser Ala Thr Thr Asn Ser Asp Leu Pro Ile Ser Asn Gly Ser 705 710 715 720 Ser Asn Gly Glu Thr Tyr Glu Lys Pro Leu Leu Lys Val Val Cys Leu 725 730 735 Asp Phe Ser Gln Val Ala Gln Val Asp Ser Thr Ala Val Gln Ser Leu 740 745 750 Val Asp Leu Arg Lys Ala Val Asn Arg Tyr Ala Asp Arg Gln Val Glu 755 760 765 Phe His Phe Ala Gly Ile Ile Ser Pro Trp Ile Lys Arg Ser Leu Leu 770 775 780 Ser Val Lys Phe Gly Thr Thr Asn Glu Glu Tyr Ser Asp Asp Ser Ile 785 790 795 800 Ile Ala Gly His Ser Ser Phe His Val Ala Lys Val Leu Lys Asp Asp 805 810 815 Val Asp Tyr Thr Asp Glu Asp Ser Arg Ile Ser Thr Ser Tyr Ser Asn 820 825 830 Tyr Glu Thr Leu Cys Ala Ala Thr Gly Thr Asn Leu Pro Phe Phe His 835 840 845 Ile Asp Ile Pro Asp Phe Ser Lys Trp Asp Val 850 855 <210> 2 <211> 2581 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 atgtcacgta agagctcgac tgaatatgtg cataatcagg aggatgctga tatcgaagta 60 tttgaatcag aataccgcac atatagggaa tctgaggcgg cagaaaacag agacggactt 120 cacaatggtg atgaggaaaa ttggaaggtt aatagtagta agcagaaatt tggggtaacg 180 aaaaatgagc tatcagatgt cctgtacgat tccattccag cgtatgaaga gagcacagtc 240 actttgaagg agtactatga tcattctatc aaaaacaatc taactgcgaa atcggcagga 300 agttacctcg tatctctttt tcctattata aaatggtttc ctcattataa ctttacgtgg 360 ggctatgctg atttagtggc aggaattaca gttggctgcg tactcgtgcc ccaatctatg 420 tcatacgcac aaatcgctag tttatctcct gaatatggtt tgtattcctc ctttattggt 480 gcgtttatat attctttgtt tgccacatcg aaagatgttt gtattggtcc ggtcgctgta 540 atgtcactac aaactgccaa agtcattgct gaagttctaa aaaaatatcc cgaagaccag 600 acagaagtta cagctcctat cattgcaact accctttgtt tgctttgtgg gattgtcgcc 660 actgggttgg gtatactgcg tttaggcttt ttagtggaac ttatttctct aaatgctgtt 720 gctggcttca tgaccggttc cgcatttaac atcatctggg gtcaaattcc ggctctcatg 780 ggatacaact cattagtgaa taccagagaa gcaacgtata aggttgtaat taacactctg 840 aaacatttac caaacacaaa gttagacgcc gtttttggct tgattccgtt ggtaatcctc 900 tatgtatgga aatggtggtg tggtacattt ggtataactt tggcagatag atattatcga 960 aatcaaccaa aggtagcaaa tagactgaaa tccttctatt tctatgcaca agctatgaga 1020 aatgccgtcg tcatagtagt ttttactgcc atatcgtgga gcataacaag aaacaaatct 1080 tcaaaagacc gtccaatcag tattctgggt acagttccct cgggcttaaa tgaggtggga 1140 gttatgaaaa tcccagacgg tctgctatct aatatgagtt cagaaatacc tgcttcaatt 1200 atcgttctgg tgttagaaca catcgctatt tcaaaatcct ttggtagaat taacgactac 1260 aaggttgtcc ctgaccaaga acttattgcg attggtgtga caaatttgat agggacattt 1320 tttcactcat atccagcaac tgggtcattt tccagatctg ctttgaaagc 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tttttcccaa 2220 gttgctcaag tggattcaac cgctgttcaa agcctggttg atctgagaaa agctgtgaat 2280 aggtatgcgg atagacaagt cgaattccat tttgccggaa ttatatctcc atggatcaaa 2340 agaagtcttt tgagtgttaa attcggaact acaaatgagg aatatagtga cgactctatt 2400 atcgctggcc attctagttt tcacgttgca aaagttttga aggatgatgt ggattatact 2460 gatgaagaca gccgtataag cacatcttac agtaactatg aaacattatg tgctgcaact 2520 gggacaaatt taccgttttt tcatatcgat atacccgatt tttctaaatg ggacgtttag 2580 a 2581 <210> 3 <211> 465 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 Met Pro Ile Lys Arg Leu Asp Thr Val Val Val Asn Thr Gly Ser Gln 1 5 10 15 Asn Asp Gln His Ser Ala Ser Val Pro Pro Val Tyr Leu Ser Thr Thr 20 25 30 Phe Lys Val Asp Leu Asn Asn Glu Asp Ala Gln Asn Tyr Asp Tyr Ser 35 40 45 Arg Ser Gly Asn Pro Thr Arg Ser Val Leu Gln His Gln Ile Gly Lys 50 55 60 Leu Tyr Arg Val Pro Gln Glu Asn Val Leu Ala Val Ser Ser Gly Met 65 70 75 80 Thr Ala Leu Asp Val Ile Leu Arg Gly Leu Val Leu Leu Asn Gly Thr 85 90 95 Asp Asn His Thr Pro Thr Ile Ile Ala Gly 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ccttcaacac 180 cagattggta agctttatcg tgtcccacag gaaaacgtat tagctgtgag cagtggtatg 240 acggcgctag acgtcatcct gcgtgggctc gtcttactta acggcactga caaccatacg 300 ccaacaataa tagccggcga tgatctttat ggaggcaccc aaaggctgct gaattttttc 360 aagcaacaga gtcatgcagt ctctgttcat gtggacactt ccgattttga aaagttcaaa 420 accgttttcc agtctttaga taaagttgat tgtgttcttc tagagtctcc gaccaatccg 480 ctttgcaagg ttgtagatat ccctagaata ttacgttttg tgaaatgcat atctcccgac 540 actacagttg tcgttgataa tactatgatg agtggactca attgtaatcc tcttcaactg 600 aatccaggct gcgatgtcgt atacgaatct gctaccaagt acttgaatgg tcatcacgat 660 ttgatggggg gtgttattat cagcaaaaca ccagaaatag cctcgaagct ttactttgtc 720 attaattcta caggagctgg attatcccca atggattctt ggctacttgt gaggggccta 780 aaaactctag gagttagatt atatcaacag cagagaaatg ctatgatatt ggctcattgg 840 ctagaaaatt catgcggatt caaacctacc agaacaaaca aggctacgaa aactagattt 900 gttggattac gctccaaccc ggatttcaag ctgcataaat cgttcaataa tggcccaggt 960 gccgtgttat ccttcgaaac ggggtccttc gaacattcaa agagactggt cagttccaaa 1020 aaactgagta tatgggctgt gacggtatct ttcgggtgtg taaattcgct tctatctatg 1080 ccttgcaaaa tgtcccatgc ttccattgat cccgaattaa ggaaagagag agattttcct 1140 gaagatttgg ttcgtctttg ctgcggtatc gaaaatatag tagatttgaa gaaagattta 1200 ttagcggcga tggttgacgc tgatattata gaagtaagag aaaatggcaa atatcttttc 1260 aacaaattga ataagaacct agctgtgaac actaccatcg atgacctgca taagccttta 1320 agtatttacg aagaatttta caatcaagat ctcatcagaa aggactcaga attgaatatt 1380 aagagttcga aattgtaaa 1399 <210> 5 <211> 1399 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 5 Ala Thr Gly Cys Cys Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly Ala Gly Ala Thr 1 5 10 15 Thr Ala Gly Ala Thr Ala Cys Ala Gly Thr Thr Gly Thr Gly Gly Thr 20 25 30 Ala Ala Ala Thr Ala Cys Cys Gly Gly Cys Thr Cys Thr Cys Ala Ala 35 40 45 Ala Ala Thr Gly Ala Cys Cys Ala Ala Cys Ala Thr Thr Cys Ala Gly 50 55 60 Cys Cys Thr Cys Cys Gly Thr Gly Cys Cys Ala Cys Cys Gly Gly Thr 65 70 75 80 Gly Thr Ala Thr Thr Thr Gly Thr Cys Gly Ala Cys Thr Ala Cys Cys 85 90 95 Thr Thr Cys Ala Ala Ala Gly Thr Gly 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agaattgcgt tccaaaaagt tgttggtagc agaaacttac caacgatagt tgtcaatggt 240 aaattctggg gtactgagag tcaattgcat agatttgaag caaaaggcac tcttgaggag 300 gaattgacta aaatcgggct tctgccttga a 331 <210> 11 <211> 160 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 11 Met Ser Ser Leu Ile Ser Lys Thr Ile Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Arg 1 5 10 15 Ile Val Asp Cys Lys Val Gly Tyr Ala Asn Gly Glu Glu Ser Lys Lys 20 25 30 Asp Ser Pro Ser Ser Val Ser Tyr Lys Arg Val Cys Gly Gly Asp Thr 35 40 45 Asp Phe Ala Glu Val Leu Gln Val Ser Tyr Asn Pro Lys Val Ile Thr 50 55 60 Leu Arg Glu Leu Thr Asp Phe Phe Phe Arg Ile His Asp Pro Thr Thr 65 70 75 80 Ser Asn Ser Gln Gly Pro Asp Lys Gly Thr Gln Tyr Arg Ser Gly Leu 85 90 95 Phe Ala His Ser Asp Ala Asp Leu Lys Glu Leu Ala Lys Ile Lys Glu 100 105 110 Glu Trp Gln Pro Lys Trp Gly Asn Lys Ile Ala Thr Val Ile Glu Pro 115 120 125 Ile Lys Asn Phe Tyr Asp Ala Glu Glu Tyr His Gln Leu Tyr Leu Asp 130 135 140 Lys Asn Pro Gln Gly Tyr Ala Cys Pro Thr His Tyr Leu Arg Glu Met 145 150 155 160 <210> 12 <211> 484 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 12 atgtcgtcgc ttatttcaaa aaccattaag aagtatttga atgaccgtat agtggattgt 60 aaagtaggtt acgctaatgg agaagagtct aaaaaggata gcccctctag tgtctcttat 120 aagagagttt gtggtggtga cacagatttt gcggaggttt tacaagtatc ctataatccc 180 aaagtgataa ctttgagaga attaactgat ttctttttta gaatccatga tcctactaca 240 tctaattcac aaggacctga taaaggtaca cagtatcgca gtggattgtt cgctcattca 300 gatgctgatt taaaagaatt agccaaaata aaggaagaat ggcaaccaaa atggggtaat 360 aagattgcca cagttattga accaatcaag aacttttacg atgctgaaga ataccaccag 420 ttatatttag ataagaatcc acagggatat gcatgcccta ctcattatct gagagaaatg 480 taga 484 <210> 13 <211> 501 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 13 Met Thr Asp Val Leu Arg Ser Leu Val Arg Lys Ile Ser Phe Asn Asn 1 5 10 15 Ser Asp Asn Leu Gln Leu Lys His Lys Thr Ser Ile Gln Ser Asn Thr 20 25 30 Ala Leu Glu Lys Lys Lys Arg Lys Pro Asp Thr Ile Lys Lys Val Ser 35 40 45 Asp Val Gln Val His His Thr Val Pro Asn Phe Asn Asn Ser Ser Glu 50 55 60 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Ala Leu Asn Tyr Leu His Asn Val Pro Arg Ile Cys His Arg 275 280 285 Asp Ile Lys Pro Gln Asn Leu Leu Val Asp Pro Thr Thr Phe Ser Phe 290 295 300 Lys Ile Cys Asp Phe Gly Ser Ala Lys Cys Leu Lys Pro Asp Gln Pro 305 310 315 320 Asn Val Ser Tyr Ile Cys Ser Arg Tyr Tyr Arg Ala Pro Glu Leu Met 325 330 335 Phe Gly Ala Thr Asn Tyr Ser Asn Gln Val Asp Val Trp Ser Ser Ala 340 345 350 Cys Val Ile Ala Glu Leu Leu Leu Gly Lys Pro Leu Phe Ser Gly Glu 355 360 365 Ser Gly Ile Asp Gln Leu Val Glu Ile Ile Lys Ile Met Gly Ile Pro 370 375 380 Thr Lys Asp Glu Ile Ser Gly Met Asn Pro Asn Tyr Glu Asp His Val 385 390 395 400 Phe Pro Asn Ile Lys Pro Ile Thr Leu Ala Glu Ile Phe Lys Ala Glu 405 410 415 Asp Pro Asp Thr Leu Asp Leu Leu Thr Lys Thr Leu Lys Tyr His Pro 420 425 430 Cys Glu Arg Leu Val Pro Leu Gln Cys Leu Leu Ser Ser Tyr Phe Asp 435 440 445 Glu Thr Lys Arg Cys Asp Thr Asp Thr Tyr Val Lys Ala Gln Asn Leu 450 455 460 Arg Ile Phe Asp Phe Asp Val Glu Thr Glu Leu Gly His Val Pro Leu 465 470 475 480 Val Glu 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tacatgcctc agtcgttata ccaaaggctt cgtcattttg ttaatttgaa aatgcagatg 780 ccgcgtgttg aaattaaatt ctatgcatac caactattca aagctttaaa ctatttgcat 840 aacgttcctc gaatctgtca cagagatata aaaccgcaaa acctactggt ggatccgaca 900 actttttctt tcaagatttg cgattttggc agtgccaaat gcttgaaacc ggatcagcct 960 aatgtgtctt acatctgttc aaggtactat agggctcccg aactcatgtt tggtgccact 1020 aattactcaa accaggtcga cgtgtggtca agcgcttgtg tcattgctga gttgcttttg 1080 ggcaagccct tgttctctgg tgaaagcggt atagatcagt tggtggaaat tattaagata 1140 atgggcatac ccacaaagga tgaaatttca ggaatgaacc caaattatga agaccatgtt 1200 ttccccaata tcaagcccat tactttggct gaaatattca aagccgaaga tcccgatact 1260 cttgacttgt taacaaaaac tctgaagtat cacccttgcg aaagattggt acctctacaa 1320 tgtctattat caagctattt tgacgaaacc aaacgttgtg ataccgacac ttacgtaaaa 1380 gcacaaaacc tgcgtatatt tgacttcgac gtggaaactg agttgggcca tgttccactt 1440 gtggaacggc ccgccattga agaacggttg aaacattttg tttctgcacc ttcatcgtct 1500 ttgtgaa 1507 <210> 15 <211> 168 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 15 Met Ser Asn Leu Leu Asn Lys Phe Ala Asp Lys Leu His Gly Asn Asp 1 5 10 15 His Asp Glu Arg Tyr Glu Asp Asp Asn Asp Asp Gln Thr Arg Gln Gln 20 25 30 Arg His Glu Lys His Gln Gln Arg Glu Phe Arg Asn Gln Gly Ser Lys 35 40 45 Ala Asp Pro Tyr Gly Glu Glu Asn Gln Gly Asn Phe Pro Gln Arg Gln 50 55 60 Gln Pro Gln Ser Asn Leu Gly Gly Asn Thr Gln Phe Gly Gly Asn Asp 65 70 75 80 Phe Gln Gln Gln Thr Thr Asp Tyr Thr Ala Gly Thr Gly Gly Gly Thr 85 90 95 Tyr Thr Gln Thr Tyr Arg Glu Thr Asn Thr Gln Gly Gln Leu Asp Asp 100 105 110 Asp Glu Asp Asp Asp Phe Leu Thr Ser Gly Gln Gln Gln Lys Gln Gly 115 120 125 Arg Thr Arg Gly Ala Gln Ser Asn Arg Tyr Gln Ser Ser Asn Ile Gly 130 135 140 Ser Gly Arg Arg Asp Leu Ser Gly Ser Gly Asn Asp Glu Tyr Asp Asp 145 150 155 160 Asp Ser Gly Asn Gln Gly Val Trp 165 <210> 16 <211> 508 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 16 atgtccaatc tattaaacaa gtttgctgat aagttgcacg gcaacgatca tgatgaacgt 60 tacgaagacg acaatgacga ccagactaga caacagcgtc atgaaaaaca tcaacagagg 120 gaattcagga atcaaggatc caaggccgat ccctacggcg aagaaaacca agggaatttc 180 cctcaacgcc agcagccaca gtctaatcta ggcggtaaca cgcagtttgg cggtaacgac 240 ttccagcaac aaactactga ctacactgcc ggcactggtg gtggcactta tacccaaact 300 taccgcgaaa ctaacactca aggtcagttg gacgacgatg aagacgatga cttcttgact 360 tcgggccaac agcaaaaaca aggtcgtaca agaggtgctc aaagtaaccg ctaccaatcc 420 tctaatatcg gcagcggtag acgcgatctg tctgggtcag gaaacgatga atatgatgat 480 gatagtggga accaaggcgt ctggtaga 508 <210> 17 <211> 325 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 17 Met Ser Glu Ala Phe Gly Pro Ala Pro Glu Pro Pro Thr Glu Leu Gly 1 5 10 15 Arg Leu Arg Val Leu Ser Lys Thr Ala Gly Ile Arg Val Ser Pro Leu 20 25 30 Ile Leu Gly Gly Met Ser Ile Gly Asp Ala Trp Ser Gly Phe Met Gly 35 40 45 Ser Met Asp Lys Glu Gln Ala Phe Glu Leu Leu Asp Ala Phe Tyr Gln 50 55 60 Ala Gly Gly Asn Phe Ile Asp Thr Ala Asn Asn Tyr Tyr Leu His Val 65 70 75 80 Ser Val Arg Asp Ser Leu Arg Lys Leu Gln Thr Asp Trp Ile Asp Ile 85 90 95 Leu Tyr Val His Trp Trp Asp Tyr Met Ser Ser Ile Glu Glu Val Met 100 105 110 Asp Ser Leu His Ile Leu Val Gln Gln Gly Lys Val Leu Tyr Leu Gly 115 120 125 Val Ser Asp Thr Pro Ala Trp Val Val Ser Ala Ala Asn Tyr Tyr Ala 130 135 140 Thr Ser His Gly Lys Thr Pro Phe Ser Ile Tyr Gln Gly Lys Trp Asn 145 150 155 160 Val Leu Asn Arg Asp Phe Glu Arg Asp Ile Ile Pro Met Ala Arg His 165 170 175 Phe Gly Met Ala Leu Ala Pro Trp Asp Val Met Gly Gly Gly Arg Phe 180 185 190 Gln Ser Lys Lys Ala Val Glu Glu Arg Lys Lys Lys Gly Glu Gly Leu 195 200 205 Arg Thr Phe Phe Gly Thr Ser Glu Gln Thr Asp Met Glu Val Lys Ile 210 215 220 Ser Glu Ala Leu Leu Lys Val Ala Glu Glu His Gly Thr Glu Ser Val 225 230 235 240 Thr Ala Ile Ala Ile Ala Tyr Val Arg Ser Lys Ala Lys His Val Phe 245 250 255 Pro Leu Val Gly Gly Arg Lys Ile Glu His Leu Lys Gln Asn Ile Glu 260 265 270 Ala Leu Ser Ile Lys Leu Thr Pro Glu Gln Ile Lys Tyr Leu Glu Ser 275 280 285 Ile Val Pro Phe Asp Val Gly Phe Pro Thr Asn Phe Ile Gly Asp Asp 290 295 300 Pro Ala Val Thr Lys Lys Pro Ser Phe Leu Thr Glu Met Ser Ala Lys 305 310 315 320 Ile Ser Phe Glu Asp 325 <210> 18 <211> 979 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 18 atgtctgagg cttttggacc tgcacctgaa ccacctaccg agttaggacg tcttagggtc 60 ctatctaaaa cagctggtat aagagtttct ccactaatcc tgggaggtat gtctattggt 120 gacgcctggt ctggattcat gggatcaatg gacaaagaac aagcttttga gctacttgat 180 gctttttacc aagcaggcgg aaatttcatt gatactgcaa ataattatta tttgcatgta 240 agtgtgagag attcccttcg taagttgcaa actgattgga ttgatattct ttacgttcac 300 tggtgggatt atatgagctc cattgaggaa gttatggata gtttgcacat tcttgtgcag 360 cagggcaaag tactctatct aggtgtgtct gatactcctg cctgggttgt ttctgcagca 420 aattactacg ccacatctca tggtaaaact ccctttagta tctatcaagg taaatggaat 480 gtattgaaca gggactttga acgtgatatc attccaatgg ctaggcattt tggtatggct 540 cttgctccat gggatgttat gggaggcggg agatttcaga gtaaaaaggc agtggaagag 600 cggaagaaga aaggagaagg cttgcgtacc ttttttggta cttcggaaca gacggatatg 660 gaggttaaaa tcagcgaagc attgttaaaa gttgcggaag aacatggcac tgagtctgtc 720 actgctattg ccatagctta tgttcggtct aaagcgaaac atgttttccc attagtggga 780 ggaagaaaga tcgaacatct caaacagaac attgaggctt tgagcattaa attaacacca 840 gaacaaataa agtacttaga aagtattgtt ccttttgatg tcggatttcc cactaatttt 900 attggagatg acccagctgt taccaagaaa ccttcatttc tcaccgaaat gtctgccaag 960 attagcttcg aagattaga 979 <210> 19 <211> 333 <212> PRT <213> Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaicus <400> 19 Met Thr Lys Ile Phe Ala Tyr Ala Ile Arg Glu Asp Glu Lys Pro Phe 119 123 128 133 Leu Lys Glu Trp Glu Asp Ala His Lys Asp Val Glu Val Glu Tyr Thr 138 143 148 Asp Lys Leu Leu Thr Pro Glu Thr Ala Ala Leu Ala Lys Gly Ala Asp 153 158 163 Gly Val Val Val Tyr Gln Gln Leu Asp Tyr Thr Ala Glu Thr Leu Gln 168 173 178 Ala Leu Ala Asp Asn Gly Ile Thr Lys Met Ser Leu Arg Asn Val Gly 183 188 193 198 Val Asp Asn Ile Asp Met Ala Lys Ala Lys Glu Leu Gly Phe Gln Ile 203 208 213 Thr Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu His Ala Ala 218 223 228 Ile Gln Ala Ala Arg Ile Leu Arg Gln Ala Lys Ala Met Asp Glu Lys 233 238 243 Val Ala Arg His Asp Leu Arg Trp Ala Pro Thr Ile Gly Arg Glu Val 248 253 258 Arg Asp Gln Val Val Gly Val Val Gly Thr Gly His Ile Gly Gln Val 263 268 273 278 Phe Met Gln Ile Met Glu Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp 283 288 293 Ile Phe Arg Asn Pro Glu Leu Glu Lys Lys Gly Tyr Tyr Val Asp Ser 298 303 308 Leu Asp Asp Leu Tyr Lys Gln Ala Asp Val Ile Ser Leu His Val Pro 313 318 323 Asp Val Pro Ala Asn Val His Met Ile Asn Asp Lys Ser Ile Ala Lys 328 333 338 Met Lys Gln Asp Val Val Ile Val Asn Val Ser Arg Gly Pro Leu Val 343 348 353 358 Asp Thr Asp Ala Val Ile Arg Gly Leu Asp Ser Gly Lys Val Phe Gly 363 368 373 Tyr Ala Met Asp Val Tyr Glu Gly Glu Val Gly Val Phe Asn Glu Asp 378 383 388 Trp Glu Gly Lys Glu Phe Pro Asp Ala Arg Leu Ala Asp Leu Ile Ala 393 398 403 Arg Pro Asn Val Leu Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Thr His 408 413 418 Ala Val Arg Asn Met Val Ile Lys Ala Phe Asp Asn Asn Leu Glu Leu 423 428 433 438 Ile Glu Gly Lys Glu Ala Glu Thr Pro Val Lys Val Gly 443 448 <210> 20 <211> 1002 <212> DNA <213> Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaicus <400> 20 atgactaaaa tcttcgctta cgctataaga gaggacgaaa agccattttt gaaagagtgg 60 gaggatgcgc ataaagatgt tgaagttgag tacacggata aacttttaac tcctgaaact 120 gctgcattgg caaagggtgc agacggcgta gtagtatatc aacagcttga ttatacagct 180 gaaaccctcc aagctctcgc tgataatggg attacaaaaa tgtctttgcg taatgtaggt 240 gttgacaaca tagacatggc caaagcaaag gaactaggct ttcaaatcac aaatgtgcct 300 gtgtactcac caaatgctat cgctgaacac gctgccatac aagccgctag aatcttaaga 360 caggcgaagg ctatggatga aaaggttgca agacatgatc taagatgggc tcctactatc 420 ggtagggaag taagagatca agttgtcggt gtggtgggaa caggacatat tggccaagtt 480 ttcatgcaga ttatggaagg attcggggca aaagtcattg cctacgacat ttttcgaaac 540 cctgagctgg agaaaaaggg ttactacgtt gattctctgg atgacctata caaacaagca 600 gatgttattt ctcttcatgt gccagatgtc ccagcaaatg tccacatgat caacgacaaa 660 tcaattgcca agatgaaaca agatgtcgta atcgttaatg tgagtagagg gcctttggtt 720 gacaccgacg ctgttataag gggtttggat tccggtaaag tatttggata tgcgatggat 780 gtttacgaag gtgaagtcgg tgtctttaac gaagattggg aaggcaaaga gttcccagac 840 gcaagattag ccgatttgat cgcaagacca aatgttttag taacaccaca cactgccttc 900 tatacaacac atgccgtgag aaacatggtt attaaggcat ttgataataa cttagaattg 960 atcgaaggca aggaagctga aactccagtt aaggtcggtt aa 1002 <210> 21 <211> 332 <212> PRT <213> Bos Taurus <400> 21 Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 His Val Pro Gln Asn Lys Ile Thr Ile Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Val 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Met Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Arg Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Ile Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro Asn Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Ile Leu Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ser Leu Lys Asn Leu His Pro Glu Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys 210 215 220 Glu Gln Trp Lys Ala Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu 225 230 235 240 Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val 245 250 255 Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro 260 265 270 Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Asp Val Phe 275 280 285 Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Val Val 290 295 300 Lys Val Thr Leu Thr His Glu Glu Glu Ala Cys Leu Lys Lys Ser Ala 305 310 315 320 Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 325 330 <210> 22 <211> 332 <212> PRT <213> Pelodiscus sinensis japonicus <400> 22 Met Ser Val Lys Glu Leu Leu Ile Gln Asn Val His Lys Glu 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atcattaaaa cctaacgatc ctgaagctga aaaggaagtt 600 attgataccg tactagaatt gatccagaat tcgaaaaacc ctgtcatact atcggatgcc 660 tgtgcttcta ggcacaacgt taaaaaggaa acccagaagt taattgattt gacgcaattc 720 ccagcttttg tgacaccttt aggtaaaggg tcaatagatg aacagcatcc cagatatggc 780 ggtgtttatg tgggaacgct gtccaaacca gacgtgaaac aggccgttga gtcggctgat 840 ttgatccttt cggtcggtgc tttgctctct gattttaaca caggttcgtt ttcctactcc 900 tacaagacta aaaatgtagt ggagtttcat tccgattacg taaaggtgaa gaacgctacg 960 ttccccggcg tacaaatgaa atttgcacta caaaacttac tgaaggttat tcccgatgtt 1020 gttaagggct acaagagcgt tcccgtacca accaaaactc ccgcaaacaa aggtgtacct 1080 gctagcacgc ccttgaaaca agagtggttg tggaacgaat tgtccaagtt cttgcaagaa 1140 ggtgatgtta tcatttccga gaccggcacg tctgccttcg gtatcaatca aactatcttt 1200 cctaaggacg cctacggtat ctcgcaagtg ttgtgggggt ctatcggttt tacaacagga 1260 gcaactttag gtgctgcctt tgccgctgag gagattgacc ccaacaagag agtcatctta 1320 ttcataggtg acgggtcttt gcagttaacc gtccaagaaa tctccaccat gatcagatgg 1380 gggttaaagc cgtatctttt tgtccttaac 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gaacactggt ctgaaacaac agttgcttac 600 cacattccaa aggatttcag aggcgagggc aaggacgtcg accataaggt tctaaaggcc 660 ttgttccaca gaccttactt ccacgttagt gtcatcgaag atgttgctgg tatctccatc 720 tgtggtgctt tgaagaacgt tgttgcctta ggttgtggtt tcgtcgaagg tctaggctgg 780 ggtaacaacg cttctgctgc catccaaaga gtcggtttgg gtgagatcat cagattcggt 840 caaatgtttt tcccagaatc tagagaagaa acatactacc aagagtctgc tggtgttgct 900 gatttgatca ccacctgcgc tggtggtaga aacgtcaagg ttgctaggct aatggctact 960 tctggtaagg acgcctggga atgtgaaaag gagttgttga atggccaatc cgctcaaggt 1020 ttaattacct gcaaagaagt tcacgaatgg ttggaaacat gtggctctgt cgaagacttc 1080 ccattatttg aagccgtata ccaaatcgtt tacaacaact acccaatgaa gaacctgccg 1140 gacatgattg aagaattaga tctacatgaa gattag 1176 <210> 33 <211> 587 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 33 Met Leu Trp Lys Arg Thr Cys Thr Arg Leu Ile Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 15 Pro Arg Gly Arg Leu Val Arg Arg Ser Cys Tyr Arg Tyr Ala Ser Thr 20 25 30 Gly Thr Gly Ser Thr Asp Ser Ser Ser Gln Trp Leu Lys Tyr Ser Val 35 40 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taaacaaaag atttcgcccg ctgaagttgc caagcataac 300 aagcccgatg attgttgggt tgtgatcaat ggttacgtat acgacttaac gcgattccta 360 ccaaatcatc caggtgggca ggatgttatc aagtttaacg ccgggaaaga tgtcactgct 420 atttttgaac cactacatgc tcctaatgtc atcgataagt atatagctcc cgagaaaaaa 480 ttgggtcccc ttcaaggatc catgcctcct gaacttgtct gtcctcctta tgctcctggt 540 gaaactaagg aagatatcgc tagaaaagaa caactaaaat cgctgctacc tcctctagat 600 aatattatta acctttacga ctttgaatac ttggcctctc aaactttgac taaacaagcg 660 tgggcctact attcctccgg tgctaacgac gaagttactc acagagaaaa ccataatgct 720 tatcatagga tttttttcaa accaaagatc cttgtagatg tacgcaaagt agacatttca 780 actgacatgt tgggttctca tgtggatgtt cccttctacg tgtctgctac agctttgtgt 840 aaactgggaa accccttaga aggtgaaaaa gatgtcgcca gaggttgtgg ccaaggtgtg 900 acaaaagtcc cacaaatgat atctactttg gcttcatgtt cccctgagga aattattgaa 960 gcagcaccct ctgataaaca aattcaatgg taccaactat atgttaactc tgatagaaag 1020 atcactgatg atttggttaa aaatgtagaa aagctgggtg taaaggcatt atttgtcact 1080 gtggatgctc caagtttagg tcaaagagaa 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ataggccctc 5100 tttttctctc tctttctttc tctcccgcgc tgatctcttc ttcgaaacat catgaataaa 5160 aagaaaaagg aaatcaagaa aaaaaagcca taatttatcc cacatttttt tttattgtcg 5220 ctgttcacac cgcataacga agatattggc tagctaacca gcttttgttc cctttagtga 5280 gggttaattt cgagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat 5340 ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc 5400 taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga 5460 aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 5520 attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg 5580 cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac 5640 gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg 5700 ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 5760 agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 5820 tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 5880 ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 5940 gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 6000 ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 6060 gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 6120 aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg 6180 aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 6240 ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 6300 gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 6360 gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa 6420 tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacat cagaagaact 6480 cgtcaagaag gcgatagaag gcgatgcgct gcgaatcggg agcggcgata ccgtaaagca 6540 cgaggaagcg gtcagcccat tcgccgccaa gctcttcagc aatatcacgg gtagccaacg 6600 ctatgtcctg atagcggtcc gccacaccca gccggccaca gtcgatgaat ccagaaaagc 6660 ggccattttc caccatgata ttcggcaagc aggcatcgcc atgggtcacg acgagatcct 6720 cgccgtcggg catgctcgcc ttgagcctgg cgaacagttc ggctggcgcg agcccctgat 6780 gctcttcgtc cagatcatcc tgatcgacaa gaccggcttc catccgagta cgtgctcgct 6840 cgatgcgatg tttcgcttgg tggtcgaatg ggcaggtagc cggatcaagc gtatgcagcc 6900 gccgcattgc atcagccatg atggatactt tctcggcagg agcaaggtga gatgacagga 6960 gatcctgccc cggcacttcg cccaatagca gccagtccct tcccgcttca gtgacaacgt 7020 cgagcacagc tgcgcaagga acgcccgtcg tggccagcca cgatagccgc gctgcctcgt 7080 cttgcagttc attcagggca ccggacaggt cggtcttgac aaaaagaacc gggcgcccct 7140 gcgctgacag ccggaacacg gcggcatcag agcagccgat tgtctgttgt gcccagtcat 7200 agccgaatag cctctccacc caagcggccg gagaacctgc gtgcaatcca tcttgttcaa 7260 ttcgagtgca ttcaacatca gccatactct tcctttttca atattattga agcatttatc 7320 agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag 7380 gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cac 7413 <210> 96 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 96 aatcttgtgc tattgcagtc ctcttttata tacagtataa tacgactcac tatagggcg 59 <210> 97 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 97 atgcgaattg cgtaattcac ggcgataacg tagtattaat taaccctcac taaagggaac 60 60 <210> 98 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 98 gcccacaact tatcaagtg 19 <210> 99 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 99 ttataagaca agcgcaggg 19 <210> 100 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 100 gcccacaact tatcaagtg 19 <210> 101 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 101 ttataagaca agcgcaggg 19 <210> 102 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 102 aacactatat caatagaaac aatgtcagta aacccagaat ttatagccga tg 52 <210> 103 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 103 aggataagca gaaccgttac cagaagaata tcttgttctt ccttcttcg 49 <210> 104 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 104 aataagaagt ttggtaatat tcaattcgaa gtgttcagtc ttttacttct cttgttttaa 60 tacgactcac tatagggcg 79 <210> 105 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 105 atatgaaagt attttgtgta tatgacggaa agaaatgcag gttggtacat tacaacaatt 60 aaccctcact aaagggaac 79 <210> 106 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 106 tatgcatcca gcttctatat cg 22 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 107 ccttaggcat ttgcctagag 20 <210> 108 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 108 gggccccccc tcgaggatct cgtgtaattg tccaaatctg 40 <210> 109 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 109 tacgtgacat gaattcccat gtgcattaca acacatttta c 41 <210> 110 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 110 atgggaattc atgtcacgta agagctcgac 30 <210> 111 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 111 ggcggccgct ctagagtaac ttcctgccga tttcg 35 <210> 112 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 112 tgcacatggg aattccggcc agtgaattgt aatacg 36 <210> 113 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 113 acgtgacatg aattctgttt tattgatata gtgtttaagc gaatgacag 49 <210> 114 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 114 ctttcctaac ataccaagaa attaatcttc 30 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 115 gccagcaaca gcatttagag 20 <210> 116 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 116 gggccccccc tcgaggcata gagcttgcag attagc 36 <210> 117 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 117 tgatcggcat gaattcgcta cgtatgcgcc agttg 35 <210> 118 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 118 tagcgaattc atgccgatca agagattaga tacag 35 <210> 119 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 119 ggcggccgct ctagagtatg gttgtcagtg ccgttaag 38 <210> 120 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 120 atacgtagcg aattccggcc agtgaattgt aatacg 36 <210> 121 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 121 gatcggcatg aattctgttt tattgatata gtgtttaagc gaatgacag 49 <210> 122 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 122 gaagaggatt acaattgagt ccac 24 <210> 123 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 123 gggccccccc tcgaggaaat gcatgcagtg gcag 34 <210> 124 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 124 tcttgtgaca gaattcgcca ataagttaca ggggatctc 39 <210> 125 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 125 tggcgaattc tgtcacaaga cgctgctatt g 31 <210> 126 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 126 ggcggccgct ctagagcttc ataccaaatc ttctgatgaa atc 43 <210> 127 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 127 cttattggcg aattccggcc agtgaattgt aatacg 36 <210> 128 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 128 cttgtgacag aattctgttt tattgatata gtgtttaagc gaatgacag 49 <210> 129 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 129 ggtagcaaga gactaaagta cc 22 <210> 130 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 130 gggccccccc tcgagggaag tacttgggag ctttc 35 <210> 131 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 131 tgatggacat gaattcggta aacgaggagt ctttcaatat c 41 <210> 132 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 132 taccgaattc atgtccatca cgaaggtaca tg 32 <210> 133 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 133 ggcggccgct ctagaggtta cacataagtc ggacttg 37 <210> 134 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 134 tcgtttaccg aattccggcc agtgaattgt aatacg 36 <210> 135 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 135 gatggacatg aattctgttt tattgatata gtgtttaagc gaatgacag 49 <210> 136 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 136 cttcaaatga tggtaaacct cc 22 <210> 137 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 137 gggccccccc tcgaggagaa aagctgcccc attg 34 <210> 138 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 138 aggcagacat gaattcgcaa cgcatttttt ctattggata ac 42 <210> 139 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 139 ttgcgaattc atgtctgcct ttgttactaa agctg 35 <210> 140 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 140 ggcggccgct ctagagcaga agcccgattt tagtc 35 <210> 141 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 141 atgcgttgcg aattccggcc agtgaattgt aatacg 36 <210> 142 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 142 ggcagacatg aattctgttt tattgatata gtgtttaagc gaatgacag 49 <210> 143 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 143 cgttggtaag tttctgctac c 21 <210> 144 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 144 gggccccccc tcgagggatc ttacacagga cgaac 35 <210> 145 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 145 gcgacgacat gaattcgtgc tactgctatc actgtc 36 <210> 146 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 146 gcacgaattc atgtcgtcgc ttatttcaaa aac 33 <210> 147 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 147 ggcggccgct ctagagatgt agtaggatca tggattctaa aaaag 45 <210> 148 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 148 cagtagcacg aattccggcc agtgaattgt aatacg 36 <210> 149 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 149 cgacgacatg aattctgttt tattgatata gtgtttaagc gaatgacag 49 <210> 150 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 150 cctttatcag gtccttgtga attag 25 <210> 151 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 151 gggccccccc tcgaggcctt agttgtaagt aattaaccaa tcc 43 <210> 152 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 152 gattggacat gtcgacggat ttcggtcttt tctaaccatt tc 42 <210> 153 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 153 atccgtcgac atgtccaatc tattaaacaa gtttgctg 38 <210> 154 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 154 ggcggccgct ctagagtttc gcggtaagtt tgggtataa 39 <210> 155 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 155 ccgaaatccg tcgaccggcc agtgaattgt aatacg 36 <210> 156 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 156 attggacatg tcgactgttt tattgatata gtgtttaagc gaatgacag 49 <210> 157 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 157 gtttgggtat aagtgccacc 20 <210> 158 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 158 gggccccccc tcgagggaaa ccatatcctc ctagtgg 37 <210> 159 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 159 catcggtcat gaattcgctc tccggtagat cctaac 36 <210> 160 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 160 gagcgaattc atgaccgatg tgttgagaag 30 <210> 161 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 161 ggcggccgct ctagaggcaa cttttccatc tgttttac 38 <210> 162 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 162 cagtagcacg aattccggcc agtgaattgt aatacg 36 <210> 163 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 163 cgacgacatg aattctgttt tattgatata gtgtttaagc gaatgacag 49 <210> 164 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 164 cccgtttatg aactaaacct atgttag 27 <210> 165 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 165 gggccccccc tcgagccatt ggaagccttg caac 34 <210> 166 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 166 cctcagacat gaattccgat ttcggtacga agttttctta c 41 <210> 167 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 167 atcggaattc atgtctgagg cttttggacc 30 <210> 168 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 168 ggcggccgct ctagaagaaa ttggcactct tcccc 35 <210> 169 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 169 ccgaaatcgg aattccggcc agtgaattgt aatacg 36 <210> 170 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 170 ctcagacatg aattctgttt tattgatata gtgtttaagc gaatgacag 49 <210> 171 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 171 gcagttttct tgatgccatc c 21

Claims (20)

  1. 모세포에 비하여 SUL1, STR3, HXT7, ERR1, GRX8, MXR1, GRE1, MRK1, AAD10 또는 그 조합의 활성이 증가되어 있고, 내산성을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포로서, 상기 효모 세포는 상기 SUL1, STR3, HXT7, ERR1, GRX8, MXR1, GRE1, MRK1, AAD10 또는 그 조합의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 것인 효모 세포.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 효모 세포는 SUL1, STR3, HXT7, ERR1, GRX8, MXR1, GRE1, MRK1, AAD10 또는 이들의 조합을 코딩하는 유전자의 발현이 증가되어 있는 것인 유전적으로 조작된 효모 세포.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 효모 세포는 상기 SUL1, STR3, HXT7, ERR1, GRX8, MXR1, GRE1, MRK1, AAD10 또는 이들의 조합을 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열의 변형을 갖는 것인 유전적으로 조작된 효모 세포.
  4. 청구항 5에 있어서, 상기 SUL1, STR3, HXT7, ERR1, GRX8, MXR1, GRE1, MRK1, 및 AAD10은 각각 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 및 17의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 효모 세포.
  5. 청구항 5에 있어서, 상기 SUL1, STR3, HXT7, ERR1, GRX8, MXR1, GRE1, MRK1, 및 AAD10을 코딩하는 유전자는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 및 18의 폴리뉴클레오티드 서열과 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 효모 세포.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 유전적으로 조작된 효모 세포는 상기 세포 중 S-아데노실 메티오닌의 양이 증가되는 것인 효모 세포.
  7. 청구항 1에 있어서, 사카로마이세스 (Saccharomyces), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 캔디다 (Candida), 피치아 (Pichia), 이사첸키아 (Issatchenkia), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces), 쉬조사카로마이스세 (Shizosaccharomyces) 또는 사카로마이콥시스 (Saccharomycopsis) 속인 것인 효모 세포.
  8. 청구항 1에 있어서, 사카로마이에스 세레비지애인 것인 효모 세포.
  9. 청구항 1에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 효모 세포.
  10. 청구항 1에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드는 EC 1.1.1.28 또는 EC 1.1.1.27인 것인 락테이트 데히드로게나제인 것인 효모 세포.
  11. 청구항 1에 있어서, 추가로 모세포에 비하여 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드, 아세트알데히드를 아세테이트로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 활성이 감소된 것인 효모 세포.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 EC 4.1.1.1로 분류되는 피루베이트 데카르복실라제(PDC)이고, 상기 DHAP를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드는 EC 1.1.1.8, EC 1.1.5.3, 또는 EC 1.1.1.94로 분류되는 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제(GPD)이고, 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 EC 1.1.2.4으로 분류되는 D-락테이트 페리시토크롬 C 옥시도리덕타제 또는 EC 1.1.2.3으로 분류되는 L-락테이트 시토크롬-c 옥시도리덕타제이고, 상기 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드는 EC 1.1.1.1로 분류되는 알코올 데히드로게나제 (ADH)이고, 상기 아세트알데히드를 아세테이트로 전환하는 폴리펩티드는 EC 1.2.1.4로 분류되는 알데히드 데히드로게나제 (ALD)인 것인 효모 세포.
  13. 청구항 1에 있어서, 추가로 모세포에 비하여 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 폴리펩티드, 방사선 감수성 보완 키나아제, 또는 그 조합의 활성이 증가된 것인 효모 세포로서, 상기 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 폴리펩티드는 EC 1.2.1.10으로 분류되는 아세틸화 아세트알데히드 데히드로게나제 인 것이 효모 세포.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 유전적으로 조작된 효모 세포는 젖산에 대하여 내산성을 갖는 것인 효모 세포.
  15. 효모 세포에 SUL1, STR3, AAD10, MXR1, GRX8, MRK1, GRE1, HXT7, ERR1, 또는 그 조합을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 내산성을 갖는 효모 세포를 제조하는 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 아세트알데히드를 아세테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합을 파괴하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  17. 청구항 15에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계, 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 폴리펩티드를 도입하는 단계, 및 방사선 감수성 보완 키나아제를 과발현시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  18. 청구항 15에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애인 것인 효모 세포.
  19. 청구항 9의 효모 세포를 배양하여 락테이트를 생산하는 단계를 포함하는 락테이트를 생산하는 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 배양물로부터 락테이트를 회수하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
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