KR102384227B1 - Nadph 생성이 증가된 유전적으로 조작된 효모 세포, 효모 세포 중 nadph 수준을 증가시키는 방법, 상기 효모 세포를 제조하는 방법 및 상기 효모 세포를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법 - Google Patents

Nadph 생성이 증가된 유전적으로 조작된 효모 세포, 효모 세포 중 nadph 수준을 증가시키는 방법, 상기 효모 세포를 제조하는 방법 및 상기 효모 세포를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

NADPH 생성이 증가된 유전적으로 조작된 효모 세포, 효모 세포 중 NADPH 수준을 증가시키는 방법, 상기 효모 세포를 제조하는 방법 및 상기 효모 세포를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.

Description

NADPH 생성이 증가된 유전적으로 조작된 효모 세포, 효모 세포 중 NADPH 수준을 증가시키는 방법, 상기 효모 세포를 제조하는 방법 및 상기 효모 세포를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법{Genetically engineered yeast cell having increased production of NADPH, method for increasing NADPH levels in a yeast cell, method for preparing the yeast cell and method for producing a lactate using the yeast cell}
NADPH 생성이 증가된 유전적으로 조작된 효모 세포, 효모 세포 중 NADPH 수준을 증가시키는 방법. 상기 효모 세포를 제조하는 방법, 및 상기 효모 세포를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법에 관한 것이다.
락테이트는 식품, 제약, 화학, 전자 등 다양한 산업 분야에서 폭넓게 사용되는 유기산이다. 락테이트는 무색, 무취이고 물에 잘 용해되는 저휘발성 물질이다. 락테이트는 인체에 독성이 없어 향미제, 산미제, 보존제 등으로 활용되고 있고, 또한 환경친화적으로 대체 고분자 물질이고, 생분해성 플라스틱인 폴리락틱산 (polylactic acid: PLA)의 원료이다. PLA는 기술적으로는 고분자 중합을 위해 다이머인 락티드 (lactide)로 전환하여 개환 중합된 (ring-open polymerization) 폴리에스터계 수지이며, 필름, 시트, 섬유, 사출 등의 다양한 가공이 가능하다. 따라서, PLA는 폴리에틸렌 (PE), 폴리프로필렌 (PP), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET), 폴리스틸렌 (PS) 등 기존 범용 석유화학 플라스틱을 광범위하게 대체할 수 있는 바이오 플라스틱으로서 최근 수요가 크게 증가하고 있다. 또한, 락테이트는 수산기와 카르복실기를 동시에 갖고 있어 반응성이 크고, 그에 따라 락테이트 에스테르, 아세트알데이드, 프로필렌글리콜 등 공업적으로 중요한 화합물로의 전환이 용이하여, 화학공업 분야에 있어서도 차세대 대체 화학 원료로서 주목받고 있다.
현재, 락테이트는 산업적으로 석유화학적 합성 공정과 생물공학적 발효 공정에 의해 생산되고 있다. 석유화학적 합성 공정은, 원유에서 유래된 에틸렌을 산화시키고, 아세트알데히드를 거쳐 시안화수소 첨가 반응에 의해 락토니트릴을 만든 후, 증류시켜 정제하고, 염산이나 황산을 사용하여 가수분해함으로써 제조된다. 또한, 생물공학적 발효 공정은 전분, 수크로스, 말토스, 글루코스, 프럭토스, 자일로스 등의 재생가능한 탄수화물을 기질로 하여 락테이트를 제조할 수 있다. 따라서, 이러한 종래 기술에 의하더라도, 락테이트를 효율적으로 생산할 수 있는 균주 및 그를 이용한 락테이트 생산 방법이 요구되고 있다. 이와 같은 니즈에 부합하여 최근 미생물을 이용하여 락테이트를 생산하는 방법이 개발되고 있다. 그러나, 미생물의 경우 항상성으로 인해 하나의 물질만을 대량으로 생산하는 것이 제한된다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 연구하던 과정에서 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 NADPH 생성이 증가되도록 유전적으로 조작된 효모 세포를 제공한다.
다른 양상은 효모 세포 중 NADPH 수준을 증가시키는 방법을 제공한다.
다른 양상은 NADPH 생성이 증가되도록 유전적으로 조작된 효모 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 유전적으로 조작된 효모 세포를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 세포, 단백질, 또는 효소의 활성의 검출가능한 증가를 나타낼 수 있다. "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 주어진 유전적 변형 (genetic modification)을 갖지 않은 세포, 단백질, 또는 효소 (예, 본래 또는 "야생형 (wild-type)"의 세포, 단백질, 또는 효소)와 같은, 동일한 타입의 비교 세포, 단백질, 또는 효소의 수준 보다 더 높은 변형된 (예, 유전적으로 조작된) 세포, 단백질, 또는 효소의 활성을 나타낼 수 있다. "세포의 활성 (cell activity)"이란 세포의 특정 단백질 또는 효소의 활성을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 상기 변형된 또는 조작된 세포, 단백질, 또는 효소의 활성은 동일 타입의 조작되지 않은 세포, 단백질, 또는 효소, 예를 들면, 야생형 세포, 단백질, 또는 효소의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 세포 중 특정 단백질 또는 효소의 활성은 모세포, 예를 들면, 조작되지 않은 세포 중의 동일 단백질 또는 효소의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 단백질 또는 효소의 증가된 활성을 갖는 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 증가된 활성을 갖는 세포는, 유전적 변형을 갖지 않은 세포에 비하여 하나 이상의 효소 또는 폴리펩티드의 활성을 증가시키는 유전적 변형 (genetic modification)을 갖는 것일 수 있다.
본 명세서에 있어서, 용어 "유전적 변형 (genetic modification)"은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 변형 (예, 유전자의 카피수의 증가), 모세포의 유전물질에 대한 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 부가, 삽입, 또는 결실, 또는 모세포의 유전물질에 대한 화학적 변이를 포함한다. 그러한 유전적 변형은 언급된 종 (referenced species)에 대한 이질성 (heterologous), 동질성 (homologous), 또는 이질성 및 동질성 폴리펩티드를 위한 코딩 영역 (coding region) 및 그의 기능적 단편 (functional fragments thereof)에 대한 것을 포함한다. 또한, 상기 유전적 변형은 유전자 또는 오페론의 발현을 변경시키는 비코딩 조절 영역 (non-coding regulatory regions)의 변형을 포함한다. 비코딩 영역은 5'-비코딩 서열 (5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열 (3'-non coding sequence)을 포함한다.
용어 "카피 수 증가 (copy number increase)"는 유전자의 도입 또는 증폭에 의한 것일 수 있으며, 조작되지 않은 세포에 존재하지 않는 유전자를 유전적 조작에 의해 갖게 되는 경우도 포함한다. 상기 유전자의 도입은 벡터와 같은 비히클을 매개하여 이루어질 수 있다. 상기 도입은 상기 유전자가 게놈에 통합되지 않은 임시적 (transient) 도입이거나 게놈에 삽입되는 것일 수 있다. 상기 도입은 예를 들면, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 상기 세포로 도입한 후, 상기 벡터가 세포 내에서 복제되거나 상기 폴리뉴클레오티드가 게놈으로 통합됨으로써 이루어질 수 있다.
외부에서 도입되거나 또는 카피 수가 증가되는 폴리뉴클레오티드는 내인성 (endogenous) 또는 외인성 (exogenous)일 수 있다. 상기 내인성 유전자는 미생물 내부에 포함된 유전물질 상에 존재하던 유전자를 말한다. 외인성 유전자는 숙주 세포 게놈으로 도입 (integration)되는 등의 숙주 세포 내로 유전자가 도입되는 것을 의미하며, 도입되는 유전자는 도입되는 숙주세포에 대해 동종 (homologous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다.
"이종성 (heterologous)"은 천연 (native)이 아닌 외인성 (foreign)을 의미할 수 있다.
용어 "유전자"는 전사 및 번역 중 하나 이상에 의하여 발현 산물, 예를 들면, mRNA 또는 단백질을 생성할 수 있는 핵산 단편을 의미하며, 코딩영역 또는 코딩영역 외 5'-비코딩 서열 (5'-non coding sequence)과 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence) 등의 조절 (regulatory) 서열을 포함할 수 있다.
"세포 (cell)", "균주 (strain)", 또는 "미생물 (microorganism)"은 교체 사용이 가능한 것으로서, 효모, 박테리아, 또는 곰팡이 등을 포함할 수 있다.
반면, 본 명세서에서 사용된 용어 "활성 감소 (decrease in activity)" 또는 "감소된 활성 (decreased activity)"은 모세포 (예, 유전적으로 조작되지 않은 세포) 중에서 측정된 것보다 더 낮은 효소 또는 폴리펩티드의 활성을 갖는 세포를 나타낸다. 또한, "활성 감소 (decrease in activity)" 또는 "감소된 활성 (decreased activity)"은 본래의 (original) 또는 야생형 (wild-type)의 효소 또는 폴리펩티드보다 더 낮은 활성을 갖는 분리된 효소 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 활성 감소 또는 감소된 활성은 활성이 없는 것 (no activity)을 포함한다. 예를 들면, 변형된 (예, 유전적으로 조작된) 세포 또는 효소에 대한 기질로부터 생성물로의 효소 전환 활성이 상기 변형을 갖지 않은 세포 또는 효소, 예를 들면, 모세포 또는 "야생형 (wild-type)"의 세포 또는 효소의 효소 전환활성에 비하여 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다. 효소 또는 세포의 감소된 활성은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 활성 감소는 변형되지 않은 유전자를 갖는 세포, 예를 들면, 모세포 또는 야생형 세포에 비하여, 효소가 발현되더라도 효소의 활성이 없거나 감소된 경우, 효소를 코딩하는 유전자가 발현되지 않거나 발현되더라도 본래 유전자 조작이 되지 않은 유전자에 비하여 발현량이 감소된 경우를 포함한다. 상기 감소된 활성을 갖는 세포는, 유전적 변형을 갖지 않은 세포에 비하여 하나 이상의 효소 또는 폴리펩티드의 활성을 감소시키는 유전적 변형 (genetic modification)을 갖는 것일 수 있다.
용어 "모세포 (parent cell)"는 본래 세포 (original cell), 예를 들면, 조작된 효모 세포에 대하여 동일 타입의 유전적으로 조작되지 않은 세포를 나타낸다. 특정한 유전적 변형에 대하여, 상기 "모세포"는 상기 특정 유전적 변형 (genetic modification)을 갖지 않은 세포이지만, 다른 상항에 대하여는 동일한 것일 수 있다. 따라서, 상기 모세포는 주어진 단백질의 증가된 활성을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포를 생산하는데 출발 물질 (starting material)로 사용된 세포일 수 있다.
용어 “모세포(parent cell)” 또는 “모균주 (parent strain)”는 해당 유전적 변형(subject genetic modification)을 위해 사용된 것일 수 있다. 상기 모세포는 상기 유전적 변형을 제외하고는 해당 세포(subject cell)와 동일하기 때문에, 상기 유전적 변형에 대한 기준 세포(reference cell)일 수 있다. 상기 “유전적 변형(genetic modification)”은 세포의 유전물질의 구성 또는 구조가 인위적으로 변경된 것을 의미한다. 상기 모세포는 해당 유전적 변형, 예를 들면 활성이 증가되도록 하는 유전적 변형을 갖지 않는 세포일 수 있다. 상기 모세포는 모 효모 세포(parent yeast cell)일 수 있다.
용어 “야생형(wild-type)” 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 특정 유전적 변형을 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 상기 유전적 변형은 유전적으로 조작된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 수득할 수 있게 하는 것일 수 있다.
용어 "파괴 (disruption)"는 언급된 유전자 (referenced gene)의 발현이 감소되도록 하는 유전적 변형을 나타낸다. 상기 파괴는 언급된 유전자의 발현이 없도록 하는 유전적 변형 (이하, 유전자의 "불활성화 (inactivation)"이라고 한다.) 또는 유전자의 발현은 있으나 감소된 수준으로 발현되도록 하는 유전적 변형 (이하, 유전자의 "감쇄 (attenuation)"이라고 한다.)을 포함한다. 상기 불활성화는 유전자의 기능적 산물 (functional product)이 발현되지 않는 것뿐만 아니라 발현은 되지만 기능적 산물이 발현되지 않는 것을 포함한다. 상기 감쇄는 유전자의 기능적 산물의 발현양 감소를 포함한다. 즉, 상기 감쇄는 유전자의 순 발현량은 증가하였더라도 기능적 산물의 발현량이 감소되는 것을 포함한다. 여기서 유전자의 기능적 산물이란 모세포 또는 야생형 세포에서 상기 유전자의 산물 (예, 효소)이 갖는 생화학적 또는 생리적 기능 (예, 효소 활성)을 보유하고 있는 것을 말한다. 따라서, 상기 파괴는 유전자의 기능적 파괴 (functional disruption)를 포함한다. 상기 유전적 변형은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 변형, 모세포의 유전물질에 대한 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 부가, 삽입, 또는 결실, 또는 모세포의 유전물질에 대한 화학적 변이를 포함한다. 그러한 유전적 변형은 언급된 종 (referenced species)에 대한 이질성 (heterologous), 동질성 (homologous), 또는 이질성 및 동질성 폴리펩티드를 위한 코딩 영역 (coding region) 및 그의 기능적 단편 (functional fragments thereof)에 대한 것을 포함한다. 또한, 상기 유전적 변형은 유전자 또는 오페론의 발현을 변경시키는 비코딩 조절 영역 (non-coding regulatory regions)의 변형을 포함한다. 비코딩 영역은 5'-비코딩 서열(5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence)을 포함한다.
상기 유전자의 파괴는 상동 재조합, 지향된 돌연변이유발 (directed mutagenesis), 또는 분자 진화 (molecular evolution)와 같은 유전적 조작법에 의해 달성될 수 있다. 세포가 복수 개의 동일 유전자, 또는 유전자의 2 이상의 파라로그 (paralogs)를 포함한 경우, 하나 이상의 유전자는 파괴될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전적 변형은 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 세포에 형질전환하고, 세포를 배양하여 상기 서열이 세포의 내인성 유전자와 상동 재조합이 일어나도록 하여 상기 유전자를 파괴되도록 한 후, 상동 재조합이 일어난 세포를 선별 마커를 사용하여 선별함으로써 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유전자"는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미하며, 5'-비코딩 서열 (5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열 (3'-non coding sequence)의 조절 서열 (regulatory sequence)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 발명에서 사용된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 아미노산 잔기 또는 염기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가, 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 핵산이 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 일례로 BLASTN(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50%이상, 55%이상, 60%이상, 65%이상, 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100% 등을 포함하는 서열 동일성이다.
본 명세서에 사용된 용어 "외인성 (exogenous)"은 언급된 분자 (referenced molecule) 또는 언급된 활성 (referenced activity)이 숙주 세포로 도입된 것을 의미한다. 분자는 예를 들면, 숙주 염색체 내로의 삽입에 의하는 것과 같은 코딩 핵산 (encoding nucleic acid)의 숙주 유전 물질 내로의 도입 또는 플라스미드와 같은 비염색체 유전물질로서 도입될 수 있다. 코딩 핵산의 발현과 관련하여, 상기 용어 "외인성"은 상기 코딩 핵산이 개체 내로 발현 가능한 형태로 도입된 것을 나타낸다. 생합성 활성과 관련하여, 상기 용어 "외인성"은 숙주 모세포에 도입된 활성을 나타낸다. 그 기원 (source)는 예를 들면, 숙주 모세포에 도입된 후 언급된 활성을 발현하는 동질성 (homologous) 또는 이질성 (heterologous) 코딩 핵산일 수 있다. 그러므로, 용어 "내인성 (endogenous)"은 상기 숙주 세포에 존재하는 언급된 분자 또는 활성을 나타낸다. 비슷하게, 코딩 핵산의 발현과 관련하여, 상기 용어 "내인성"은 개체 내에 포함된 코딩 핵산의 발현을 나타낸다. 용어 "이질성 (heterologous)"은 언급된 종 외의 다른 기원으로부터의 분자 또는 활성을 나타내고 용어 "동질성 (homologous)"은 숙주 모세포로부터의 분자 또는 활성을 나타낸다. 따라서, 코딩 핵산의 외인성 발현은 이질성 (heterologous) 또는 동질성 (homologous) 코딩 핵산 중 어느 하나 또는 둘 다를 이용할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 사용된 용어 "유전적 조작 (genetic engineering)" 또는 "유전적으로 조작된 (genetically engineered)"은 세포에 대하여 하나 이상의 유전적 변형 (genetic modification)을 도입하는 행위 또는 그에 의하여 만들어진 세포를 나타낸다.
본 명세서에 사용된 용어 락테이트(lactate)는 젖산(lactic acid) 자체뿐만 아니라, 음이온 형태, 그의 염, 용매화물, 다형체 또는 그 조합을 포함하는 것으로 해석된다. 상기 염은 예를 들면 무기산염, 유기산염 또는 금속염일 수 있다. 무기산염은 염산염, 브롬산염, 인산염, 황산염 또는 이황산염일 수 있다. 유기산염은 포름산염, 초산염, 아세트산염, 프로피온산염, 젖산염, 옥살산염, 주석산염, 말산염, 말레인산염, 구연산염, 푸마르산염, 베실산염, 캠실산염, 에디실염, 트리플루오로아세트산염, 벤조산염, 글루콘산염, 메탄술폰산염, 글리콜산염, 숙신산염, 4-톨루엔술폰산염, 갈룩투론산염, 엠본산염, 글루탐산염 또는 아스파르트산염일 수 있다. 금속염은 칼슘염, 나트륨염, 마그네슘염, 스트론튬염 또는 칼륨염일 수 있다.
일 양상은 모세포에 비하여 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트의 생성이 증가된 유전적으로 조작된 효모 세포를 제공한다.
니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate: NADPH)는 효모 세포 내에 생합성, 예를 들면 동화작용에 관여하는 보조인자이다. 상기 유전적으로 조작된 효모 세포는 그 모세포에 비하여 상기 효모 세포 중 NADPH의 생성이 증가된 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 ADE3, SHM2, MTD1, UTR1, YEF1, POS5, sPOS5, zwf1, 또는 그 조합의 유전자의 활성이 증가되도록 하는 유전적 변형을 포함하거나, 외인성 gpd1, 외인성 SthA, 외인성 LDH 변이체, 또는 그 조합을 포함하는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 모세포에 비하여 ADE3, SHM2, MTD1, 또는 그 조합의 활성이 증가되어 있는 유전적으로 조작된 효모 세포일 수 있다. 상기 유전적으로 조작된 효모 세포는 락테이트를 생산할 수 있다. 상기 효모 세포는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.
ADE3은 C-1-테트라히드로폴레이트 신타제 (C1-THF 신타제)일 수 있다. 상기 ADE3은 1-탄소 대사에 관여하는 것일 수 있다. 상기 대사는 tetrahydrofolate interconversion에 관여하는 것일 수 있다. 상기 ADE3은 EC 1.5.1.5, EC 3.5.4.9, 또는 EC 6.3.4.3으로 분류될 수 있다. 상기 ADE3은 5,10-methylenetetrahydrofolate + NADP+ ↔ 5,10-methenyltetrahydrofolate + NADPH의 반응을 촉매하는 것일 수 있다. 상기 ADE3은 또한 5,10-methenyltetrahydrofolate + H2O ↔ 10-formyltetrahydrofolate의 반응을 촉매하는 것일 수 있다. 상기 ADE3은 또한 10-formyltetrahydrofolate + ADP + phosphate ↔ tetrahydrofolate + ATP + formate의 반응을 촉매하는 것일 수 있다. 상기 ADE3 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산일 수 있다. 상기 ADE3 단백질은 일례로 NP_011720.3의 NCBI 참조 서열(NCBI reference sequence)을 갖는 것일 수 있다. ADE3 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 유전자일 수 있다. 상기 ade3 유전자는 일례로 NM_001181333.3의 NCBI 참조 서열을 갖는 것일 수 있다.
SHM2는 Serine hydroxymethyltransferase(SHMT)일 수 있다. 상기 SHM2는 One-carbon metabolism에 관여하는 것일 수 있다. 상기 대사(metabolism)는 tetrahydrofolate interconversion에 관여하는 것일 수 있다. 상기 SHM2는 Glycine hydroxymethyltransferase 또는 Serine methylase일 수 있다. 상기 SHM2는 EC 2.1.2.1로 분류될 수 있다. 상기 SHM2은 5,10-methylenetetrahydrofolate + glycine + H2O ↔ tetrahydrofolate + L-serine의 반응을 촉매할 수 있다. 상기 SHM2 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산일 수 있다. 상기 SHM2 단백질은 일례로 NP_013159.1의 NCBI 참조 서열(NCBI reference sequence)을 갖는 것일 수 있다. SHM2 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 유전자일 수 있다. 상기 shm2 유전자는 일례로 NM_001181945.1의 NCBI 참조 서열을 갖는 것일 수 있다.
MTD1은 Methylenetetrahydrofolate dehydrogenase일 수 있다. 상기 MTD1은 EC 1.5.1.15로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 MTD1은 5,10-methylenetetrahydrofolate + NAD+ ↔ 5,10-methenyltetrahydrofolate + NADH의 반응을 촉매할 수 있다. 상기 MTD1 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산일 수 있다. 상기 MTD1 단백질은 일례로 NP_013006.3의 NCBI 참조 서열(NCBI reference sequence)을 갖는 것일 수 있다. MTD1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 유전자일 수 있다. 상기 mtd1 유전자는 일례로 NM_001179870.3의 NCBI 참조 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 모세포에 비하여 UTR1, YEF1, POS5, 또는 그 조합의 활성이 증가되어 있는 유전적으로 조작된 효모 세포일 수 있다. 상기 효모 세포는 상기 UTR1, YEF1, POS5, 또는 그 조합의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함할 수 있다. 상기 유전적으로 조작된 효모 세포는 락테이트를 생산할 수 있다. 상기 효모 세포는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.
UTR1은 NAD(+) kinase일 수 있다. 상기 UTR1은 EC 2.7.1.23으로 분류될 수 있다. 상기 UTR1은 Unknown transcript 1 protein으로 지칭될 수 있다. 상기 UTR1 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산일 수 있다. 상기 UTR1 단백질은 일례로 NP_012583.1의 NCBI 참조 서열(NCBI reference sequence)을 갖는 것일 수 있다. UTR1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 8의 폴리뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 유전자일 수 있다. 상기 utr1 유전자는 일례로 NM_001181707.1의 NCBI 참조 서열을 갖는 것일 수 있다.
YEF1은 ATP-NADH kinase YEF1일 수 있다. 상기 YEF1은 YEL041W로 지칭될 수 있다. 상기 YEF1은 EC 2.7.1.86으로 분류될 수 있다. 상기 YEF1 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산일 수 있다. 상기 YEF1 단백질은 일례로 NP_010873.1의 NCBI 참조 서열(NCBI reference sequence)을 갖는 것일 수 있다. YEF1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 유전자일 수 있다. 상기 yef1 유전자는 일례로 NM_001178856.1의 NCBI 참조 서열을 갖는 것일 수 있다.
POS5는 NADH kinase POS5, mitochondrial일 수 있다. 상기 POS5는 EC 2.7.1.86으로 분류될 수 있다. 상기 POS5는 미토콘드리아에서의 NADPH의 합성을 촉매할 수 있다. 상기 POS5는 미토콘드리아에서의 ATP + NADH ↔ ADP + NADPH의 반응을 촉매할 수 있다. 상기 POS5 단백질은 서열번호 11의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산일 수 있다. 상기 POS5 단백질은 일례로 NP_015136.1의 NCBI 참조 서열(NCBI reference sequence)을 갖는 것일 수 있다. POS5 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 12의 폴리뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 유전자일 수 있다. 상기 pos5 유전자는 일례로 NM_001184002.1의 NCBI 참조 서열을 갖는 것일 수 있다.
sPOS5는 truncated NADH kinase POS5일 수 있다. 상기 sPOS5는 POS5에서 미토콘드리아 표적 서열(mitochondrial targeting sequence)이 제거된 것일 수 있다. 상기 sPOS5는 세포질에서 발현되도록 조작된 것일 수 있다. 상기 sPOS5는 세포질에서의 NADPH의 합성을 촉매할 수 있다. 상기 sPOS5는 세포질에서의 ATP + NADH ↔ ADP + NADPH의 반응을 촉매할 수 있다. 상기 POS5 단백질은 서열번호 13의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산일 수 있다. sPOS5 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 유전자일 수 있다.
상기 효모 세포는 모세포에 비하여 gpd1의 활성이 증가되어 있는 유전적으로 조작되고, 상기 gpd1의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함할 수 있다. 상기 효모 세포는 외인성 (exogenous) gpd1을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.
상기 gpd1은 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: GAPDH)일 수 있다. 상기 GAP1은 EC 1.2.1.12로 분류될 수 있다. 상기 GAP1은 NADP-의존성 GAPDH일 수 있다. 상기 외인성 gpd1은 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces maxianus) 유래일 수 있다. 상기 gpd1 단백질은 서열번호 15의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산일 수 있다. gpd1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 16의 폴리뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 유전자일 수 있다.
상기 효모 세포는 모세포에 비하여 ZWF1의 활성이 증가되어 있는 유전적으로 조작되고, 상기 ZWF1의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함할 수 있다
ZWF1은 Glucose-6-phosphate1-dehydrogenase(G6PDH)일 수 있다. 상기 ZWF1은 EC 1.1.1.49로 분류될 수 있다. 상기 ZWF1은 oxidative pentose-phosphate pathway의 속도제한 단계를 촉매할 수 있고, NADPH를 통해 환원력을 제공한다. 상기 ZWF1은 D-glucose 6-phosphate + NADP+ ↔ 6-phospho-D-glucono-1,5-lactone + NADPH의 반응을 촉매할 수 있다. 상기 ZWF1 단백질은 서열번호 17의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산일 수 있다. 상기 ZWF1 단백질은 일례로 NP_014158.1의 NCBI 참조 서열(NCBI reference sequence)을 갖는 것일 수 있다. ZWF1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 18의 폴리뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 유전자일 수 있다. 상기 zwf1 유전자는 일례로 NM_001183079.1의 NCBI 참조 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 외인성 SthA 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 상기 SthA는 Soluble pyridine nucleotide transhydrogenase일 수 있다. 상기 SthA는 EC 1.6.1.1로 분류될 수 있다. 상기 SthA는 STH로 지칭될 수 있다. 상기 SthA는 NAD(P)(+) transhydrogenase [B-specific]로 지칭될 수 있다. 상기 SthA는 NADH + NADP+ ↔ NAD+ + NADPH의 반응을 촉매할 수 있다. 상기 외인성 SthA는 에스케리키아 콜라이(E. coli) 유래일 수 있다. 상기 SthA 단백질은 서열번호 19의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산일 수 있다. 상기 SthA 단백질은 일례로 NP_418397.2의 NCBI 참조 서열(NCBI reference sequence)을 갖는 것일 수 있다. SthA 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 20의 폴리뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 유전자일 수 있다. 상기 효모 세포는 NADH로부터 NADPH를 생성하거나, 및/또는 NADPH로부터 NADH를 생성할 수 있다. 상기 효모 세포는 NADH와 NADPH를 상호전환시키는 활성을 포함할 수 있다.
상기 효모 세포는 추가적으로 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 파괴된 변이를 갖는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 아세트알데히드에서 에탄올로 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 상기 폴리펩티드는 EC. 1.1.1.1에 속하는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 NADH로부터 NAD+로의 전환을 이용하여, 아세트알데히드에서 에탄올로의 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 알코올 데히드로게나제 (alcohol dehydrogenase: ADH)일 수 있으며, ADH1, ADH2, ADH3, ADH4, ADH5, 또는 ADH6일 수 있다. 상기 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드에 관해서는 상술한 바와 동일하다.
상기 효모 세포는 추가적으로 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 파괴된 변이를 갖는 것일 수 있다. 상기 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드에 관해서는 상술할 바와 동일하다.
상기 외인성 SthA 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하고; 상기 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 파괴된 변이, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 파괴된 변이, 또는 그 조합을 포함하는 효모 세포는 그 모세포보다 증가된 NADPH 생성 활성을 가질 수 있다. NADH로부터 NAD+로의 전환을 이용하여 상기 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 불활성화로 인하여 상기 효모 세포 내 증가된 NADH는 상기 SthA 단백질이 촉매하는 반응에서 NADH + NADP+로부터 NAD+ + NADPH의 전환으로 작용하게 하고, 이는 상기 효모 세포에서의 증가된 NADPH 생성 활성을 갖도록 할 수 있게 한다.
상기 효모 세포는 락토바실러스 델브루엑키 (Lactobacillus delbrueckii)의 락데이트 데히드로게나제 변이체를 포함할 수 있다. 상기 변이체는 Lactobacillus delbrueckii sbusp . Bulgaricus(Lb) 유래의 LDH 변이체일 수 있다. 상기 변이체는 야생형 Lactobacillus delbrueckii sbusp . Bulgaricus(Lb) 유래의 LDH의 D176A일 수 있다. 상기 변이체는 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 변이체를 코딩하는 유전자는 서열번호 22의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 변이체를 포함하는 효모 세포는 증가된 ZWF1 단백질의 활성을 더 갖고, 상기 ZWF1 단백질의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 상기 발현산물을 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열의 변형을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자의 발현 조절 서열은 상기 유전자 발현을 위한 프로모터 또는 터미네이터일 수 있다. 상기 발현 조절 서열은 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 모티프를 코딩하는 서열일 수 있다. 상기 모티프는 예를 들면, 이차 구조-안정화 모티프, RNA 불안정화 모티프, 스플라이스-활성화 모티프, 폴리아데닐화 모티프, 아데닌-풍부 서열 (adenine-rich sequence), 또는 엔도뉴클레아제 인식 부위일 수 있다.
상기 프로모터는 상기 발현산물을 코딩하는 유전자와 작동가능하게 연결된 외인성 프로모터일 수 있다. 상기 프로모터는 구성적 프로모터(constitutive promoter)일 수 있다. 상기 프로모터는 효모 유전자에 대하여 천연인 프로모터와 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 이상 상동(homologous)인 것일 수 있다. 또한 상기 프로모터는 숙주 세포에 대하여 천연인 유전자에 대한 프로모터와 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 이상 상동인 것일 수 있다. 상기 프로모터는 Covalently linked Cell Wall protein 12 (CCW12), PDC1과 같은 피루베이트 디카르복실라제(pyruvate decarboxylase: PDC), PGK1과 같은 포스포글리세레이트 키나아제 (phosphoglycerate kinase: PGK), TEF-1 및 TEF-2와 같은 transcription elongation factor(TEF), TDH1, TDH2, TDH3, 또는 GPD1와 같은 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, triose phosphate isomerase (TPI1), purine-cytosine permease (PCPL3), alcohol dehydrogenase (ADH1), CYB2와 같은 L-(+)-lactate-cytochromee c oxidoreductase(CYB), xylose reductase (XR), xylitol dehydrogenase (XDH), CYC (cytochrome c), ADH, Histone H3 (e.g., HHT1 또는 HHT2) 프로모터와 약 80%, 85%, 90% 또는 95% 상동인 프로모터, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 유전자로부터 유래된 프로모터일 수 있다. 상기 CYC (cytochrome c), TEF (transcription elongation factor), GPD, ADH, CCW12, HHT2, TPI, 및 PGK 유전자의 프로모터는 각각 서열번호 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 및 134의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 터미네이터는 효모 유전자에 대하여 천연인 터미네이터와 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 이상 상동(homologous)인 것일 수 있다. 또한 상기 프로모터는 숙주 세포에 대하여 천연인 유전자에 대한 터미네이터와 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 이상 상동인 것일 수 있다. 상기 터미네이터는 PGK1 (phosphoglycerate kinase 1), CYC1 (cytochrome c 1), GAL1 (galactokinase 1), 및 TPS1 (trehalose-6-phosphate synthase 1) 유전자의 터미네이터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. CYC1 터미네이터는 서열번호 60의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 벡터는 선별 마커를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 효모 세포는 상기 발현산물을 코딩하는 유전자의 카피수 증가를 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 상기 발현산물을 코딩하는 외인성(exogenous) 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 외인성 유전자는 유전자에 작동 가능하도록 연결된 외인성 프로모터에 의해 적절히 조절되는 것일 수 있다. 상기 프로모터에 관해서는 상술한 바와 같다.
상기 효모 세포는 사카로마이세스 (Saccharomyces), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 캔디다 (Candida), 피치아 (Pichia), 이사첸키아 (Issatchenkia), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces), 쉬조사카로마이스세 (Shizosaccharomyces) 또는 사카로마이콥시스 (Saccharomycopsis) 속에 속하는 것일 수 있다. 사카로마이세스 속은 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae), 사카로마이세스 바야누스 (S. bayanus), 사카로마이세스 보울라디 (S. boulardii), 사카로마이세스 불데리 (S. bulderi), 사카로마이세스 카리오카누스 (S. cariocanus), 사카로마이세스 카리오쿠스 (S. cariocus), 사카로마이세스 체발리에리 (S. chevalieri), 사카로마이세스 다이레넨시스 (S. dairenensis), 사카로마이세스 엘립소이데우스 (S. ellipsoideus), 사카로마이세스 유바야뉴스 (S. eubayanus), 사카로마이세스 엑시거스 (S. exiguus), 사카로마이세스 플로렌티누스 (S. florentinus), 사카로마이세스 클루이베리 (S. kluyveri), 사카로마이세스 마티니에 (S. martiniae), 사카로마이세스 모나센시스 (S. monacensis), 사카로마이세스 노르벤시스 (S. norbensis), 사카로마이세스 파라독서스 (S. paradoxus), 사카로마이세스 파스토리아누스 (S. pastorianus), 사카로마이세스 스펜서로룸 (S. spencerorum), 사카로마이세스 투리센시스 (S. turicensis), 사카로마이세스 우니스포루스 (S. unisporus), 사카로마이세스 우바룸 (S. uvarum), 또는 사카로마이세스 조나투스 (S. zonatus)일 수 있다.
상기 효모 세포는 락테이트 생산능을 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 상기 유전자는 외인성 (exogenous) 유전자일 수 있다. 상기 효모 세포는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다. 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 것을 촉매하는 효소일 수 있으며, 이는 락테이트 데히드로게나제 (LDH)일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 NAD(P)-의존성 효소일 수 있다. 또한 상기 락테이트 데히드로게나제는 스테레오-특이적 (specific)일 수 있다.
상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 박테리아, 효모, 진균, 포유동물 또는 파충류로부터 유래한 것을 포함할 수 있다. 상기 유전자는 락토바실러스 델브루엑키 아종 불가리쿠스 (L. delbrueckii subsp . bulgaicus) 및 L. 불가리쿠스 (L. bulgaricus)와 같은 락토바실러스(Lactobacillus) 속, L. 존소니 (L.johnsonii), L. 플란타룸(L. plantarum), 일본자라 (Pelodiscus sinensis japonicus), 오리너구리 (Ornithorhynchus anatinus), 병코돌고래 (Tursiops truncatus), 노르웨이산집쥐 (Rattus norvegicus), 개구리 (Xenopus laevis), 및 보스 타우루스 (Bos taurus)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 LDH는 D-락테이트를 생산하는 것인 EC 1.1.1.28로 분류되는 효소이거나 L-락테이트를 생산하는 것인 EC 1.1.1.27로 분류되는 효소일 수 있다. D-락테이트 데히드로게나제(D-LDH)는 상기 EC 1.1.1.28로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 D-LDH는 D-특이 2-히드록시산 데히드로게나제(D-specific 2-hydroxyacid dehydrogenase)로 지칭될 수 있다. 상기 D-LDH는 피루베이트와 NADH를 (R)-락테이트와 NAD+로의 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 D-LDH는 서열번호 23의 아미노산 서열과 60%이상, 또는 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 또는 99%이상의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 D-LDH를 코딩하는 유전자는 서열번호 24의 폴리뉴클레오티드 서열과 60%이상, 또는 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다.
L-락테이트 데히드로게나제(L-LDH)는 상기 EC 1.1.1.27로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 L-LDH는 L-특이 2-히드록시산 데히드로게나제(L-specific 2-hydroxyacid dehydrogenase)로 지칭될 수 있다. 상기 L-LDH는 피루베이트와 NADH를 (S)-락테이트와 NAD+로의 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 L-LDH는 서열번호 25, 26, 27, 28, 및 29의 아미노산 서열과 60%이상, 또는 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 또는 99%이상의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 D-LDH를 코딩하는 유전자는 서열번호 30의 폴리뉴클레오티드 서열과 60%이상, 또는 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 또는 99%이상의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다.
상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 벡터 내 포함될 수 있다. 상기 벡터는 복제개시점, 프로모터, 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 터미네이터를 포함할 수 있다. 상기 복제 개시점은 효모 자가복제 서열 (autonomous replication sequence, ARS)을 포함할 수 있다. 상기 효모 자가복제서열은 효모 동원체 서열 (centrometric sequence, CEN)에 의해 안정화될 수 있다. 상기 프로모터는 상술한 바와 동일하다. 상기 터미네이터는 상술한 바와 동일한다. 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 효모 세포의 특정 위치에 게놈에 포함될 수 있다. 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포 내에서 활성 단백질을 생산하기 위해 기능하는 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 "기능성 (functional)"인 것으로 고려된다.
상기 효모 세포는 단일의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 2 내지 10 카피수의 복수의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 효모 세포는 예를 들면 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 또는 1 내지 3 카피의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 효모 세포가 복수의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 각각의 폴리뉴클레오티드는 동일하거나 둘 이상의 상이한 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 조합일 수 있다. 외인성 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 복수의 카피는 숙주 세포의 게놈 내에 동일한 유전자좌 (locus) 또는 여러 유전자좌에 포함될 수 있고, 각 카피의 프로모터나 터미네이터가 동일하거나 상이할 수 있다.
상기 효모 세포는 모세포에 비하여, 추가적으로 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드, 아세트알데히드를 아세테이트로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그의 조합의 활성이 감소되도록 하는 유전적 변형을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 파괴된 변이를 갖는 것일 수 있다. 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 것을 촉매하는 효소일 수 있으며, EC 4.1.1.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 예를 들면, 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase: PDC)일 수 있다. 상기 PDC는 예를 들면 PDC1, PDC5, 또는 PDC6일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 31 또는 33의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 31 또는 33의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 32 또는 34의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 pdc1, pdc5, 또는 pdc6일 수 있다.
상기 효모 세포는 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 파괴된 변이를 갖는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 EC 1.1.1.8, EC 1.1.5.3, 또는 EC 1.1.1.94로 분류되는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제(GPD)일 수 있다. 상기 GPD는 예를 들면 GPD1, GPD2, 또는 GPD3일 수 있다. 상기 효모 세포는 GPD1, GPD2, GPD3, 또는 그의 조합을 코딩하는 유전자가 파괴된 변이를 갖는 것일 수 있다. 상기 GPD1은 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제일 수 있으며, NADH 또는 NADP의 NAD+ 또는 NADP+로의 산화를 이용하여 DHAP를 글리세롤-3-포스페이트로의 환원을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 GPD2는 glycerol-3-phosphate dehydrogenase (quinone)일 수 있다. 상기 GPD3은 glycerol-3-phosphate dehydrogenase (NAD(P)+)일 수 있다. 상기 GPD는 서열번호 35의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 GPD를 코딩하는 유전자(gpd 유전자)는 서열번호 35의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 36의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 파괴된 변이를 갖는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 EC. 1.1.2.4 또는 EC 1.1.2.3으로 분류되는 것일 수 있다.
상기 EC. 1.1.2.4으로 분류되는 폴리펩티드는 D-락테이트 페리시토크롬 C 옥시도리덕타제(D-lactate ferricytochrome C oxidoreductase)일 수 있다. 상기 D-락테이트 페리시토크롬 C 옥시도리덕타제는 D-락테이트 데히드로게나제 (D-lactate dehydrogenase: DLD)로 지칭될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 DLD1, DLD2, 또는 DLD3일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 서열번호 37의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 37의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 일례로 상기 유전자는 서열번호 38의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 EC. 1.1.2.3으로 분류되는 폴리펩티드는 L-락테이트 시토크롬-c 옥시도리덕타제(CYB2)일 수 있고, 또한 CYB2A, 또는 CYB2B로 지칭될 수 있다. 상기 CYB2는 시토크롬 c-의존성 효소일 수 있다. 상기 CYB2는 서열번호 39의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 39의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 40의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 파괴된 변이를 갖는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 아세트알데히드에서 에탄올로 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 EC. 1.1.1.1에 속하는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 NADH로부터 NAD+로의 전환을 이용하여, 아세트알데히드에서 에탄올로의 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 알코올 데히드로게나제 (alcohol dehydrogenase: ADH)일 수 있다. 상기 ADH는, 예를 들면, Adh1, Adh2, Adh3, Adh4, Adh5, 또는 Adh6일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 서열번호 41 또는 43의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 41 또는 43의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 42 또는 44의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 일례로 adh1, adh2, adh3, adh4, adh5, 또는 adh6일 수 있다.
상기 효모 세포는 아세트알데히드를 아세테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 파괴된 변이를 갖는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 아세트알데히드에서 아세테이트로 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 EC 1.2.1.4에 속하는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 Mg2 +에 의하여 활성화되고, NADP에 특이적인 것일 수 있다. 이 효소는 아세테이트의 생성에 관여하는 것일 수 있다. 생성된 아세테이트로부터 세포질 아세틸-CoA가 합성될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 알데히드 데히드로게나제 (alcohol dehydrogenase: ALD)일 수 있다. 상기 ALD는, 예를 들면, ALD6일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 서열번호 45의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 45의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 46의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 일례로 ald6일 수 있다.
상기 효모 세포는 추가적으로 모세포에 비하여 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 것을 촉매하는 효소의 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다.
상기 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 것을 촉매하는 효소는 EC 1.2.1.10으로 분류되는 아세틸화 아세트알데히드 데히드로게나제 (acylating acetaldehyde dehydrogenase: A-ALD)인 것일 수 있다. 상기 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 것을 촉매하는 효소의 일 타입은 4-히드록시-2-케토발러레이트 이화(catabolism)에 관련된 이관능성 알돌라제-데히드로게나제 복합체 (bifunctional aldolase-dehydrogenase complex)의 일부인 단백질일 수 있다. 이러한 이관능성 효소는 페놀, 톨루엔, 나프탈렌, 비페닐, 및 다른 방향성 화합물의 분해에서 많은 박테리아 종에서 중간체인, 카테콜의 메타-절단 경로 (meta-cleavage pathway)의 최종 두 단계를 촉매한다. 4-히드록시-2-케토발러레이트는 먼저 4-히드록시-2-케토발러레이트 알돌라제에 의하여 피루베이트와 아세트알데히드로 전환되고, 다음으로 A-ALD에 의하여 아세트알데히드는 Acetly-CoA로 전환된다. A-ALD의 이 타입의 예는 Pseudomonas sp. CF600 (Genbank No: CAA43226)의 DmpF이다. 대장균의 MhpF 단백질은 DmpF에 대한 동족체이다. 상기 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 것을 촉매하는 효소의 다른 일 타입은 엄격하게 (strictly) 또는 선택적(facultative) 혐기성 미생물 유래의 acetyl-CoA와 acetaldehyde의 가역적 전환을 촉매하는 단백질이지만, 알콜 데히드로게나제 활성을 갖지 않은 것일 수 있다. 이 타입의 단백질의 예는 Clostridium kluyveri에서 보고된 것일 수 있다. A-ALD는 Clostridium kluyveri DSM 555 (Genbank No: EDK33116)의 게놈에 주석 (annotation)되어 있다. 동족 단백질 (homologous protein) AcdH가 Lactobacillus plantarum (Genbank No: NP_784141)의 게놈에서 확인되었다. 이 타입의 단백질의 다른 예는 Clostridium beijerinckii NRRL B593 (Genbank No: AAD31841)의 상기 유전자 산물이다. 상기 A-ALD의 일 예는, 대장균 유래의 MhpF 또는 그의 기능적 동족체 (functional homologue), 예를 들면, 대장균 및 S. typhimurium 유래의 EutE (예, 서열번호 48)의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 EutE 유전자 및 서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 EutE 단백질), 또는 Pseudomonas sp . CF600 유래의 dmpF인 것일 수 있다. A-ALD는 NAD(P)+ 의존성일 수 있다. 상기 A-ALD는 하기 반응을 촉매하는 활성을 갖는 것일 수 있다.
아세트알데히드(Acetaldehyde) + CoA(coenzyme A) + NAD+ <=> acetyl-CoA + NADH + H+
상기 A-ALD는 다른 단백질과 복합체 (complex)를 형성하지 않고서 발현된 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 예를 들면, EC 4.1.3.39에 속하는 외인성 효소 또는 그 유전자를 포함하지 않는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 상기 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 것을 촉매하는 효소를 코딩하는 외인성 유전자 (exogenous gene)를 포함하는 것일 수 있다. 상기 A-ALD 외인성 유전자는, 상기 효모 세포에서 그 모세포에 비하여 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 것을 촉매하는 효소의 활성이 증가되기에 충분한 양으로 발현된 것일 수 있다. 상기 A-ALD 외인성 유전자는 서열번호 47의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 것일 수 있다. 상기 A-ALD 외인성 유전자는 서열번호 48의 뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 서열번호 48은 대장균 유래의 A-ALD 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.
상기 효모 세포는 추가적으로 모세포에 비하여 방사선 감수성 보완 키나아제(Radiation sensitivity Complementing Kinase: RCK)의 활성이 증가된 것일 수 있다. 방사선 감수성 보완 키나아제는 세린/트레오닌-프로테인 키나아제 (Serine/threonine-protein kinase)일 수 있다. 상기 키나아제는 EC 2.7.11.1에 속하는 효소일 수 있다. 방사선 감수성 보완 키나아제는 RCK1 또는 RCK2일 수 있다. 방사선 감수성 보완 키나아제는 서열번호 45 또는 47와 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 아미노산 서열 동일성 (identity)을 가진 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 일례로, RCK1 및 RCK2는 각각 서열번호 49 및 51의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 방사선 감수성 보완 키나아제는 서열번호 49 또는 51과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 50 및 서열번호 52의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 일례로 rck1 및 rck2 유전자는 각각 서열번호 50 및 52의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 그 모세포에 비하여 ADE3, SHM2, MTD1, UTR1, YEF1, POS5, sPOS5, zwf1, 또는 그 조합 의 활성이 증가되어 있고; 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 피루베이트를 D-락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 아세트알데히드를 아세테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 또는 그 조합이 파괴된 변이를 갖고; 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 갖고, 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 폴리펩티드를 갖고, 방사선 감수성 보완 키나아제의 활성이 증가된 효모 세포일 수 있다. 상기 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지애일 수 있다.
상기 효모 세포는 외인성 gpd1, 외인성 SthA, 외인성 LDH 변이체, 또는 그 조합의 유전자를 포함하고; 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 피루베이트를 D-락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 아세트알데히드를 아세테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 또는 그 조합이 파괴된 변이를 갖고; 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 갖고, 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 폴리펩티드를 갖고, 방사선 감수성 보완 키나아제의 활성이 증가된 효모 세포일 수 있다. 상기 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지애일 수 있다.
상기 효모 세포는 락테이트로의 대사 산물의 흐름을 방해하는 경로의 활성이 감소된 것일 수 있다. 또한 상기 효모 세포는 락테이트로의 대사 산물의 흐름을 촉진하거나 도와주는 경로의 활성이 증가된 것일 수 있다.
다른 양상은 효모 세포 중 NADPH 수준을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 효모 세포의 ade3, shm2, mtd1, utr1, yef1, POS5, sPOS5, zwf, 또는 그 조합을 과발현시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 효모 세포에 외인성 gpd1, 외인성 SthA 유전자, 외인성 ldh의 변이체를 도입하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 양상은 효모 세포에 ade3, shm2, mtd1, utr1, yef1, POS5, sPOS5, zwf, 또는 그 조합을 과발현시키거나 효모 세포에 외인성 gpd1, 외인성 SthA 유전자, 외인성 ldh의 변이체를 도입하는 단계; 및 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계;를 포함하는 락테이트를 생산하는 효모 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 락테이트를 생산하는 효모 세포를 제조하는 방법은 효모 세포에 ade3, shm2, mtd1, utr1, yef1, POS5, sPOS5, zwf, 또는 그 조합을 과발현시키는 단계, 또는 효모 세포에 외인성 gpd1, 외인성 SthA 유전자, 외인성 ldh의 변이체를 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 단계에 있어서, “효모 세포”, “ade3”, “shm2”, “mtd1”, “utr1”, “yef1”, “POS5”, “sPOS5”, “zwf”, “gpd1”, “SthA”, 및 ldh의 변이체에 대하여는 상술한 바와 같다.
상기 과발현시키는 단계는 상기 ade3, shm2, mtd1, utr1, yef1, POS5, sPOS5, zwf, 또는 그 조합에 의해 코딩되는 단백질을 과발현시킬 수 있다. 상기 과발현은 상기 ade3, shm2, mtd1, utr1, yef1, POS5, sPOS5, zwf, 또는 그 조합의 유전자를 과발현시킨 효모 세포가 그 모세포에 비해 상기 ade3, shm2, mtd1, utr1, yef1, POS5, sPOS5, zwf, 또는 그 조합에 의해 코딩되는 단백질의 활성이 동일한 조건 하에서 모세포에 비해 더 많은 양으로 또는 다소 더 높은 정상 상태 수준으로 생산됨을 의미한다. 또한 이는 상기 단백질을 코딩하는 mRNA가 동일한 조건 하에서 모세포에 비해 더 많은 양으로 또는 다시 다소 더 높은 정상 상태 수준으로 생산됨을 의미한다. 따라서 상기 단백질의 과발현은 적합한 효소 분석을 사용하여 상기 숙주 세포에서 상기 효소의 비활성 수준을 측정함으로써 측정될 수 있다. 상기 과발현시키는 단계는 활성을 증가시키는 유전적 변형을 갖는 것일 수 있다.
상기 락테이트를 생산하는 효모 세포를 제조하는 방법은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 단계에 있어서, “피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드”, 및 “피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자”에 대하여는 상술한 바와 같다. 상기 유전자의 도입은 벡터와 같은 비히클을 매개하여 이루어질 수 있다. 상기 도입은 상기 유전자가 게놈에 통합되지 않은 임시적 도입이거나 게놈에 삽입되는 것일 수 있다. 상기 도입은 예를 들면, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 상기 세포로 도입한 후, 상기 벡터가 세포 내에서 복제되거나 상기 폴리뉴클레오티드가 게놈으로 통합됨으로써 이루어질 수 있다.
또한, 상기 락테이트를 생산하는 효모 세포를 제조하는 방법은 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 아세트알데히드를 아세테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합을 파괴하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 단계에 있어서, “피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드”, “피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자”, “디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드”, “디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자”, “락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드”, “락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자”, “아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드”, “아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자”, “아세트알데히드를 아세테이트로 전환하는 폴리펩티드”, “아세트알데히드를 아세테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자” 및 “파괴”에 대하여는 상술한 바와 같다
또한 상기 락테이트를 생산하는 효모 세포를 제조하는 방법은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계, 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 폴리펩티드를 도입하는 단계, 및 방사선 감수성 보완 키나아제를 과발현시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 폴리펩티드, 및 방사선 감수성 보완 키나아제에 대하여는 상술한 바와 같다.
다른 양상은 상기한 효모 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 효모 세포에 관해서는 상술한 바와 같다.
상기 배양은 탄소원, 예를 들면, 글루코스를 함유하는 배지에서 수행될 수 있다. 효모 세포 배양에 사용되는 배지는 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 숙주 세포의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적합한 배지는 상업적인 판매자로부터 입수 가능하고 또는 공지된 제조법에 따라 제조될 수 있다. 상기 배양에 사용되는 배지는 특정한 효모 세포의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 염, 미량 원소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다.
상기 유전적으로 조작된 효모 세포에서 락테이트를 수득하기 위하여 배양 조건을 적절히 조절할 수 있다. 상기 세포는 증식을 위하여 호기성 조건에서 배양할 수 있다. 그 후 락테이트를 생산하기 위하여 상기 세포를 미세호기 조건 또는 혐기 조건에서 배양할 수 있다. 용어 "혐기 조건 (anaerobic conditions)"은 산소가 없는 환경을 나타낸다. 용어 "미세호기 조건 (microaerobic conditions)"은 배양 또는 성장 조건에 참조되어 사용되는 경우, 배지 중의 용존산소 (dissolved oxygen: DO) 농도가 액체 배지 중의 용존 산소에 대한 포화 (saturation)의 0% 보다 크고 약 10%이하로 유지되는 것을 의미한다. 미세호기 조건은 또한, 1% 미만의 산소를 가진 분위기 (atmosphere)로 유지된 봉인된 챔버 (sealed chamber) 내에 액체 배지 중 또는 고체 아가 플레이트 상에서 세포를 성장시키거나 유지시키는 (resting) 것을 포함한다. 산소의 농도는 예를 들면, 배양물을 N2/CO2 혼합물 또는 다른 적당한 비산소 기체로 스파징함으로써 유지될 수 있다. 상기 산소 조건은 용존산소 (dissolved oxygen: DO) 농도가 0% 내지 10%, 예를 들면 0 내지 8%, 0 내지 6%, 0 내지 4%, 또는 0 내지 2%로 유지하는 것을 포함한다.
용어 "배양 조건"은 효모 세포를 배양하기 위한 조건을 의미한다. 이러한 배양 조건은 예를 들어, 효모 세포가 이용하는 탄소원, 질소원 또는 산소 조건일 수 있다. 효모 세포가 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류가 포함된다. 상기 탄소원은 글루코오즈, 프럭토오즈, 만노오즈, 또는 갈락토오즈일 수 있다. 효모 세포가 이용할 수 있는 질소원은 유기 질소 화합물, 또는 무기 질소 화합물일 수 있다. 질소원의 예는 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 또는 암모늄염일 수 있다.
상기 락테이트를 생산하는 방법은 배양물로부터 락테이트를 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다.
배양물로부터의 락테이트의 회수는 당해 기술분야에서 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리 방법은 원심분리, 여과, 이온교환크로마토그래피 또는 결정화일 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.
일 양상에 따른 NADPH 생성이 증가되도록 유전적으로 조작된 효모 세포에 의하면, 상기 효모 세포 중 NADPH의 수준이 증가될 수 있다.
일 양상에 따른 효모 세포 중 NADPH 수준을 증가시키는 방법에 의하면, 상기 효모 세포 중 NADPH의 수준이 증가될 수 있다.
일 양상에 따른 NADPH 생성이 증가되도록 유전적으로 조작된 효모 세포를 제조하는 방법에 의하면, 효모 세포 중 NADPH의 수준이 증가될 수 있다.
일 양상에 따른 락테이트를 생산하는 방법에 의하면, 락테이트를 효율적으로 생산할 수 있다.
도 1은 p416-ldh-HPH 벡터 개열도를 나타낸 도면이다.
도 2는 pCS-Ex1.1 벡터를 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. D- 락테이트 생산 균주의 제작
사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 야생형 균주(MATαura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3Δ1; MAL2-8C; SUC2, EUROSCARF accession number: 30000B)를 락테이트 생산 균주로 만들기 위해, 다음과 같은 유전적 변형을 갖는 락테이트 생산 균주를 제작하였다.
1. S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh )의 제작
1.1 pdc1 를 결실시키며 ldh 를 도입하기 위한 벡터의 제작
사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D에서 피루베이트로부터 아세트알데히드를 거쳐 에탄올로 가는 경로를 차단하기 위하여 피루베이트 데카르복실라제 1 (pyruvate decarboxylase1: pdc1)을 코딩하는 유전자를 제거하였다. pdc1 유전자를 제거하는 동시에 LbLdh를 발현시키기 위하여 pdc1 유전자를 'ldh 카세트'로 치환하여 pdc1 유전자를 결손시켰다. "카세트"란 달리 언급이 없으면, 프로모터, 코딩 서열, 및 터미네이터가 작동가능하게 연결된 단백질이 발현될 수 있는 단위 서열을 나타낸다.
구체적으로, 'ldh 카세트'를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지애 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 61 및 62의 프라이머쌍을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 얻어진 CCW12 프로모터 서열 (서열번호 57)과 'ldh 유전자 (서열번호 30)'를 각각 SacI/XbaI과 BamHI/SalI로 소화하고, 동일 효소로 소화된 pRS416 vector (ATCC87521TM)에 연결하였다. pRS416 vector는 T7 프로모터, 선택 마커로서 박테리아에서 암피실린 저항성, 효모에서 URA3 카세트를 갖고, 제한효소 클로닝 부위를 갖는 효모 센트로미어 셔틀 플라스미드 (yeast centromere shuttle plasmid)이다.
다음으로, pCEP4 플라스미드 (invitrogen, Cat. no. V044-50)를 주형으로 하고 서열번호 63 및 64의 프라이머쌍을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여, “HPH 카세트“ 서열 (서열번호 65)을 증폭하였다. 증폭된 “HPH 카세트”와 상기 pRS416 벡터를 각각 SacI 효소를 사용하여 절단하고 서로 연결하여, 'ldh 카세트'와 “HPH 카세트”가 작동가능하게 연결된 구조를 포함하는 p416-ldh-HPH 벡터를 제조하였다. 도 2는 p416-ldh-HPH 벡터 개열도를 나타낸 도면이다. 도 2에서."P CCW12" 및 "C2 LDH"는 각각 CCW12 프로모터 및 LDH orf를 나타낸다. pCEP4 플라스미드는 다중클로닝 부위 (multiple cloning site)에 삽입된 재조합 유전자의 높은 수준의 전사를 위한 cytomegalovirus (CMV) immediate early enhance/promoter를 사용하는 에피좀성 포유동물 발현 벡터 (episomal mammalian expression vector)이다. pCEP4는 트란스펙션된 세포 (transfected cell)에서 안정된 선택을 위한 히그로마이신 B 저항성 유전자 (hygromycin B resistance gene)을 갖는다. 여기서 'ldh 카세트'는 ldh 유전자 및 그 조절 영역을 포함하고 있어, ldh 유전자가 발현될 수 있도록 하는 영역을 나타낸다. 상기 ldh 유전자는 CCW12 프로모터 하에서 전사되도록 하였다. 또한, 'HPH (hygromycin B phosphotransferase) 카세트'는 히그로마이신 B 저항성 유전자 (hygromycin B resistance gene) 및 그 조절 영역을 포함하고 있어, 히그로마이신 B 저항성 유전자가 발현될 수 있도록 하는 영역을 나타낸다.
pdc1의 결실용 벡터는 p416-ldh-HPH를 주형으로 하고 서열번호 66 및 67의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR에 의하여 ldh 유전자 절편과 pUC57-Ura3HA 벡터 (DNA2.0 Inc.; 서열번호 68)를 각각 SacI로 소화시킨 후 서로 연결하여 pUC-uraHA-ldh를 제조하였다. 이 벡터로부터 pdc1의 결실용 카세트는 pdc1 유전자와 상동 서열을 갖는 서열번호 69 및 70의 서열을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 증폭하였다.
1.2 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ) 제조
1.1에서 제작한 pdc1 결실용 카세트를 사카로마이세스 세레비지애 (CEN.PK2-1D, EUROSCARF accession number: 30000B)에 도입하였다. 상기 pdc1 결실용 카세트의 도입은 일반적인 열충격 형질전환(heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 pdc1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 세포에 대하여, pdc1의 결실을 확인하기 위하여 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 71 및 72의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 pdc1 유전자 결실 및 ldh 유전자 도입이 이루어진 것을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::Pccw12-Lbldh)를 제조하였다.
2. S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh )의 제조
2.1 gpd1 를 결실시키기 위한 벡터의 제작
실시예 2의 1에서 제조된 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh)에서 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)에서 글리세롤-3-포스페이트로 가는 경로를 차단하기 위하여 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제(glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1: gpd1)을 코딩하는 유전자를 제거하였다.
구체적으로, 실시예 2의 1.1에서 제조된 pUC-uraHA-ldh를 주형으로 하고, 서열번호 73 및 74의 gpd1 상동 재조합 서열을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 gpd1 결실용 카세트를 얻었다.
2.2 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh )의 제조
2.1에서 제작한 gpd1 결실용 카세트를 실시예 2의 1에서 제조한 S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh)에 도입하였다. 도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 gpd1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 균주에 대하여 gpd1의 결실을 확인하기 위하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 75 및 76의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 gpd1 유전자 결실을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh)를 제조하였다.
3. S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿ dld1 :: ldh )의 제작
3.1 dld1 을 결실시키기 위한 벡터의 제작
실시예 2의 2에서 얻어진 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh)에서, D-락테이트에서 피루베이트로 가는 경로를 차단하기 위하여 dld1 유전자를 제거하였다.
구체적으로, 실시예 2의 1.1에서 제조된 pUC-uraHA-ldh를 주형으로 하고, 서열번호 77 및 78의 dld1 상동 재조합 서열을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 dld1 결실용 카세트를 얻었다.
3.2 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿ dld1 :: ldh )의 제조
3.1에서 제작한 dld1 결실용 카세트를 상기한 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh)에 도입하였다. 도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 dld1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 균주에 대하여 dld1의 결실을 확인하기 위하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 79 및 80의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 dld1 유전자 결실된 것을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh,ㅿdld1::ldh)를 제조하였다.
4. S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿ dld1 :: ldh , ㅿ pdc6::ldh)의 제작
4.1 pdc6 유전자 결실용 카세트의 제조
S. cerevisiae CEN . PK2 -1D 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 81 및 82의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여, HHT2 유전자 프로모터를 증폭하고 이 HHT2 유전자 프로모터 증폭 산물 (서열번호 58)과 합성된 ldh 유전자 (서열번호 30)(DNA2.0 Inc., 미국)를 각각 SacI/XbaI과 BamHI/SalI로 절단하고, 동일한 효소로 절단된 pRS416 vector (ATCC87521TM)와 서로 연결하였다.
"HPH 카세트"와 상기 HHT2 유전자 프로모터를 포함하는 pRS416 vector를 각각 SacI 효소를 사용하여 절단하고 서로 연결하여, 벡터 p416-ldh-HPH를 제조하였다. pdc6 결실용 카세트는 p416-ldh-HPH 벡터를 주형으로 하고, 서열번호 83 및 84의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 제작하였다.
4.2 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿ dld1 :: ldh , ㅿ pdc6::ldh)의 제조
S. cerevisiae CEN . PK2 -1D로부터 pdc6 유전자를 ldh 유전자로 치환하기 위하여, 4.1에서 제작된 "pdc6 결실용 카세트"를 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿdld1::ldh) 균주를 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 도입하고, 히그로마이신 200ug/mL이 포함된 YPD 배지 (Yeast extract 1 (w/v)%, peptone 1 (w/v)%, 및 포도당 2 (w/v)%) 중 30℃에서 3일 동안 배양하여 염색체상의 pdc6 유전자를 ldh 유전자로 교체시켜, S. cerevisiae CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿdld1::ldh, ㅿgpd6::ldh) 균주를 제조하였다. 상기 제조된 균주에 대하여 pdc6의 결실을 확인하기 위하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 85 및 86의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 pdc6 유전자 결실된 것을 확인하였다.
5 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿ dld1 :: ldh , ㅿpdc6::ldh, ㅿ adh1 )의 제작
adh1 유전자 결실용 카세트는 결실용 벡터인 pUC57-ura3HA를 주형으로 하고, 서열번호 87 및 88의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 증폭하였다.
S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿdld1::ldh, ㅿpdc6::ldh) 균주로부터 adh1 유전자를 결실하기 위하여, 제작된 "adh1 결실용 카세트"를 상기 균주에 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 도입하고, 열충격 후 선택 마커인 Minimal Ura-drop out 배지 중 30℃에서 3일 동안 배양하여 염색체상의 adh1 유전자를 결실시켰다. 제조된 균주의 유전형을 분석하기 위하여, 제조된 균주의 게놈을 주형으로 하고, 서열번호 89 및 90의 프라이머 세트로 사용한 PCR에 의하여 adh1 유전자 결실 여부를 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿdld1::ldh, ㅿpdc6::ldh, ㅿadh1) 균주가 제조된 것을 확인하였다.
6. S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿ dld1 :: ldh , ㅿpdc6::ldh, ㅿ adh1 , ㅿ ald6 :: EcEutE )의 제작
6.1 ald6 를 결실하기 위한 벡터의 제작 및 도입
아세트알데히드 데히드로게나제 6 (acetaldehyde dehydrogenase 6: ald6) 유전자 결실용 카세트는 결실용 벡터인 pUC57-ura3HA를 주형으로 하고, 서열번호 91 및 92의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 증폭하였다. 서열번호 91 및 92의 서열은 S. cerevisiae의 염색체의 상동 서열과 재조합되어 ald6 유전자와 치환될 부분을 포함한다.
6.2 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh ,ㅿadh1, ㅿ ald6 ) 균주 제작
S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿdld1::ldh, ㅿpdc6::ldh, ㅿadh1) 균주로부터 ald6 유전자를 결실하기 위하여, 6.1에서 제작된 "ald6 결실용 카세트"를 상기 균주에 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 도입하고, 열충격 후 선택마커인 Minimal Ura-drop out 배지 중 30℃에서 3일 동안 배양하여 염색체상의 ald6 유전자를 결실시켰다. 제조된 균주의 유전형을 분석하기 위하여, 제조된 균주의 게놈을 주형으로 하고, 서열번호 93 및 94의 프라이머 세트로 사용한 PCR에 의하여 ald6 유전자 결실 여부를 확인하였다.
그 결과, S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿdld1::ldh, ㅿpdc6::ldh, ㅿadh1, ㅿald6) 균주가 제조된 것을 확인하였다.
6.3 효모 이목적 ( dual function ) 과발현 벡터 pCS - Ex1 의 제작
효모 과발현 벡터로 널리 사용되고 있는 pRS426GPD 벡터로부터 서열번호 95 및 96의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 689 bp의 DNA 조각 (GPD 프로모터)을 얻었다. 이 DNA 조각을 KpnI으로 처리한 pCtB1 벡터 (Genbank Accession Number KJ922019)와 섞어 In-fusion 키트 (Clonetech, cat. 639650)를 이용하여 클로닝한 후, 통상적인 방법을 통해 클로닝용 대장균 균주인 TOP10 균주 (Invitrogen, cat. C4040-06)에 도입하였다. 도입 후 균주를 카나마이신이 50ug/ml 농도로 포함된 LB 한천 배지 (Bacto Tryptone 10g/L, Yeast Extract 5g/L, NaCl 10g/L, 및 Bacto Agar 15g/L)에 도말하고 배양하여 형성된 콜로니들 중에서 플라스미드 DNA를 분리하여 그 중 플라스미드 서열이 서열번호 97과 같은 플라스미드를 확인하였다. 그 결과, 효모 이목적 과발현 벡터인 pCS-Ex1 벡터를 얻었다. 여기서, 이목적이란 유전자의 게놈 삽입 후 발현 목적 및 벡터 상에서의 유전자 발현 목적을 나타낸다.
6.4 효모 이목적 대장균 eutE 유전자 과발현 벡터의 제작　
대장균 MG1655 균주의 게놈 DNA로부터 서열번호 98 및 99의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 1447 bp의 DNA 조각, 즉 EutE 유전자를 얻었다. 이 DNA 조각을 KpnI과 SacI으로 처리한 pCS-Ex1 벡터와 섞어 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝한 후, 통상적인 방법을 통해 클로닝용 대장균주인 TOP10 균주 (Invitrogen cat. C4040-06)에 도입하였다. 도입 후 균주를 카나마이신이 50ug/ml 농도로 포함된 LB 한천 배지에 도말하고 배양하여 형성된 콜로니들 중에서 플라스미드 DNA를 분리하여 그 중 플라스미드 서열이 서열번호 100과 같은 플라스미드를 확인하였다. 그 결과, 효모 이목적 대장균 eutE 유전자 과발현 벡터인 MD1040 벡터를 얻었다.
6.5 대장균 eutE 유전자가 과발현된 효모의 제작　
제작된 MD1040 벡터로부터 서열번호 101 및 102의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 3985bp의 DNA 조각을 얻었다. 이 조각을 통상적인 방법으로 S.cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿdld1::ldh, ㅿpdc6::ldh, ㅿadh1, ㅿald6)에 도입한 후 우라실이 포함되어 있지 않은 최소 배지인 SD-URA 한천배지 (Yeast nitrogen base without amino acids (Sigma-Aldrich: Cat. no. Y0626) 6.7 g/L, Yeast synthetic drop-out without uracil(Sigma-Aldrich: Cat. no. Y1501) 1.9 g/L, D-glucose 20g/L, 및 Bacto Agar 20g/L)에 도말하였다. 사흘 후 형성되는 콜로니들 중에서, 서열번호 103 및 104의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행했을 때 4,357bp의 DNA 조각을 확인할 수 있는 콜로니를 선별하였다. 자연형 균주의 게놈 DNA에서는 서열번호 98 및 99의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하면 2,300bp의 DNA 조각을 얻을 수 있다.
얻어진 클론을 YPD 배지 (Bacto Peptone 20g/L, Yeast Extract 10g/L, 및 D-glucose 20g/L)에 접종하여 30℃에서 230rpm으로 교반하여 배양한 후, 5-FOA가 포함된 역선별배지 (Yeast nitrogen base without amino acids (Sigma-Aldrich: Cat. no. Y0626) 6.7 g/L, Yeast synthetic drop-out without uracil(Sigma-Aldrich: Cat. no. Y1501) 1.9 g/L, Uracil 0.1g/L, D-glucose 20g/L, 5-fluoroorotic acid (5-FOA) 1g/L, 및 Bacto Agar 20g/L)에 도말하였다. 사흘 후 형성되는 콜로니들 중에서, 서열번호 105 및 106의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행했을 때 2,963 bp의 DNA 조각을 확인할 수 있는 콜로니를 선별하였다.
그 결과, S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿdld1::ldh, ㅿpdc6::ldh, ㅿadh1, ㅿald6::EcEutE) 를 제조하였다.
7. S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿ dld1 :: ldh , ㅿpdc6::ldh, ㅿ adh1 , ㅿ ald6 :: EcEutE , ㅿ adh5 :: rck1 )의 제작
7.1 효모 이목적 대장균 rck1 유전자 과발현 벡터의 제작　
사카로마이세스 세레비지애 게놈 DNA로부터 서열번호 107 및 108의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 RCK1 유전자를 얻었다. 이 DNA 조각을 KpnI과 SacI으로 처리한 pCS-Ex1 벡터와 섞어 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝한 후, 통상적인 방법을 통해 클로닝용 대장균주인 TOP10 균주 (Invitrogen cat. C4040-06)에 도입하였다. 도입 후 균주를 카나마이신이 50ug/ml 농도로 포함된 LB 한천 배지에 도말하고 배양하여 형성된 콜로니들 중에서 플라스미드 DNA를 분리하여 그 중 플라스미드 서열이 RCK1와 같은 플라스미드를 확인하였다. 그 결과, 효모 이목적 대장균 RCK1 유전자 과발현 벡터인 MD1167 벡터를 얻었다.
7.2 RCK1 유전자가 과발현된 효모의 제작　
제작된 MD1167 벡터로부터 서열번호 109 및 110의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 RCK1 도입용 카세트 조각을 얻었다. 이 조각을 통상적인 방법으로 S.cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿdld1::ldh, ㅿpdc6::ldh, ㅿadh1, ㅿald6)에 도입한 후 우라실이 포함되어 있지 않은 최소 배지인 SD-URA 한천배지 (Yeast nitrogen base without amino acids (Sigma-Aldrich: Cat. no. Y0626) 6.7 g/L, Yeast synthetic drop-out without uracil(Sigma-Aldrich: Cat. no. Y1501) 1.9 g/L, D-glucose 20g/L, 및 Bacto Agar 20g/L)에 도말하였다. 사흘 후 형성되는 콜로니들 중에서, 서열번호 106 및 107의 프라이머 조합을 이용하여 RCK1 유전자가 ADL6 위치에 삽입된 균주를 확인하였다.
얻어진 클론을 YPD 배지 (Bacto Peptone 20g/L, Yeast Extract 10g/L, 및 D-glucose 20g/L)에 접종하여 30℃에서 230rpm으로 교반하여 배양한 후, 5-FOA가 포함된 역선별배지 (Yeast nitrogen base without amino acids (Sigma-Aldrich: Cat. no. Y0626) 6.7 g/L, Yeast synthetic drop-out without uracil(Sigma-Aldrich: Cat. no. Y1501) 1.9 g/L, Uracil 0.1g/L, D-glucose 20g/L, 5-fluoroorotic acid (5-FOA) 1g/L, 및 Bacto Agar 20g/L)에 도말하였다. 사흘 후 형성되는 콜로니들 중에서, 서열번호 111 및 112의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행함으로써 URA3 유전자가 제거된 균주를 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿdld1::ldh, ㅿpdc6::ldh, ㅿadh1, ㅿald6::RCK1) (이하 'SP3027'이라고 명명)를 수득하였다.
실시예 2. C1 경로가 증가된 락테이트 생산 균주의 제작
1. ade3 , shm2 , 및 mtd1 이 과발현된 균주의 제작
(1) SP3027 ㅿ NDT1 :: P ccw12 - ADE3 균주의 제작
'ADE3 카세트'를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 균주의 게놈 DNA로부터 ADE3의 코딩 부위 함유 서열 (서열번호 2)을 서열번호 113 및 114의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 증폭하고, XhoI과 XbaI으로 처리한 pCS-Ex1.1 벡터와 섞어 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝하여 효모 ADE3 유전자 과발현 벡터인 pCCW12-ADE3 벡터를 얻었다. 상기 벡터에서 ADE3 유전자는 CCW12 프로모터 하에서 전사된다. 도 2는 pCS-Ex1.1 벡터를 나타낸 도면이다.
제작된 pCCW12-ADE3 벡터로부터 NDT1 유전자와 상동 서열을 갖는 서열번호 115 및 116의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 ADE3 도입용 카세트 조각을 얻었다. 이 ADE3 카세트 조각을 사카로마이세스 세레비지애 SP3027 균주에 도입하였다. 상기 ADE3 카세트의 도입은 일반적인 열충격 형질전환(heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 NDT1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 세포에 대하여, ADE3의 도입을 확인하기 위하여 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 117 및 118의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 ndt1 유전자 결실 및 ade3 유전자 도입이 이루어진 것을 확인하였다. 그 결과, SP3027(ㅿndt1::ade3)를 제조하였다.
또한, ndt1 유전자 결실용 카세트는 결실용 벡터인 pUC57-ura3HA를 주형으로 하고, 서열번호 119 및 120의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 증폭하였다.
S. cerevisiae CEN.PK2-1D SP3027 균주로부터 ndt1 유전자를 결실하기 위하여, 제작된 "ndt1 결실용 카세트"를 상기 균주에 열충격 형질전환에 의하여 도입하고, 열충격 후 선택 마커인 Minimal Ura-drop out 배지 중 30℃에서 3일 동안 배양하여 염색체상의 ndt1 유전자를 결실시켰다. 제조된 균주의 유전형을 분석하기 위하여, 제조된 균주의 게놈을 주형으로 하고, 서열번호 117 및 118의 프라이머 세트로 사용한 PCR에 의하여 ndt1 유전자 결실 여부를 확인하였다. 그 결과, S.cerevisiae CEN.PK2-1D SP3027(ㅿndt1) 균주가 제조된 것을 확인하였다.
(2) SP3027 ㅿ NDT1 :: P gpd - SHM2 균주의 제작
'SHM2 카세트'를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 균주의 게놈 DNA로부터 SHM2의 코딩 부위 함유 서열 (서열번호 4)을 서열번호 121 및 122의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 증폭하고, XhoI과 XbaI으로 처리한 pCS-Ex1 벡터와 섞어 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝하여 효모 SHM2 유전자 과발현 벡터인 pGPD-SHM2 벡터를 얻었다. 상기 벡터에서 SHM2 유전자는 GPD 프로모터 하에서 전사된다.
제작된 pGPD-SHM2 벡터로부터 NDT1 유전자와 상동 서열을 갖는 서열번호 115 및 116의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 SHM2 도입용 카세트 조각을 얻었다. 이 SHM2 카세트 조각을 사카로마이세스 세레비지애 SP3027 균주에 도입하였다. 상기 SHM2 카세트의 도입은 일반적인 열충격 형질전환(heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 NDT1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 세포에 대하여, SHM2의 도입을 확인하기 위하여 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 117 및 118의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 ndt1 유전자 결실 및 SHM2 유전자 도입이 이루어진 것을 확인하였다. 그 결과, SP3027(ㅿndt1::shm2)를 제조하였다.
(3) SP3027 ㅿ NDT1 :: P gpd - MTD1 균주의 제작
'MTD1 카세트'를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 균주의 게놈 DNA로부터 MTD1의 코딩 부위 함유 서열 (서열번호 6)을 서열번호 123 및 124의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 증폭하고, XhoI과 XbaI으로 처리한 pCS-Ex1 벡터와 섞어 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝하여 효모 MTD1 유전자 과발현 벡터인 pGPD-MTD1 벡터를 얻었다. 상기 벡터에서 MTD1 유전자는 GPD 프로모터 하에서 전사된다.
제작된 pGPD-MTD1 벡터로부터 NDT1 유전자와 상동 서열을 갖는 서열번호 115 및 116의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 MTD1 도입용 카세트 조각을 얻었다. 이 MTD1 카세트 조각을 사카로마이세스 세레비지애 SP3027 균주에 도입하였다. 상기 MTD1 카세트의 도입은 일반적인 열충격 형질전환(heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 NDT1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 세포에 대하여, MTD1의 도입을 확인하기 위하여 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 117 및 118의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 ndt1 유전자 결실 및 mtd1 유전자 도입이 이루어진 것을 확인하였다. 그 결과, SP3027(ㅿndt1::mtd1)를 제조하였다.
2. ade3 , shm2 , 및 mtd1 이 과발현된 균주의 락테이트 생산 및 세포 성장
상기에서 제조된 형질전환 효모 세포를 60g/L의 글루코스를 함유한 YPD 배지 20 ml에 OD600 값이 1이 되도록 접종하고, 36℃에서 90 rpm으로 교반하면서 48 시간 동안 미세호기 조건에서 배양하였다. 배양 중 세포 성장은 분광계 (spectrophotometer)를 이용하여 OD600 값을 측정하였다. 생산된 락테이트 농도, 잔류 에탄올 및 잔류 글루코스의 농도는 HPLC (High performance liquid chromatography)를 이용하여 분석하였다
배양 결과, 세포 성장 즉, 배양물의 OD600 값, 및 글루코스 소모, 생산된 락테이트 농도, 및 생산된 에탄올 농도는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
균주 글루코스 소모(g/L) OD600 락테이트 (g/L) 락테이트 수율(%) 에탄올 (g/L) 에탄올 수율 (%)
SP3027 26.88 2.70
 19.59 72.90 1.06 3.94
SP3027(ㅿndt1) 27.07 2.89 19.47 71.95 1.19 4.38
SP3027(ㅿndt1::ade3) 28.94 3.34 22.55 77.92 1.441.44 4.98
SP3027(ㅿndt1::shm2) 29.39 3.21 22.64 77.01 1.411.41 4.79
SP3027(ㅿndt1::mtd1) 29.10 2.90 23.06 79.24 1.481.48 5.09
표 1에 나타낸 바와 같이, ade3 과발현 균주는 대조군에 비하여 글루코스 소모, 세포 성장, 락테이트 생산 및 에탄올 생산이 증가하였다. 또한, shm2 과발현 균주는 대조군에 비하여 글루코스 소모, 세포 성장, 락테이트 생산 및 에탄올 생산이 증가하였다. 또한, mtd1 과발현 균주는 대조군에 비하여 글루코스 소모, 세포 성장, 락테이트 생산 및 에탄올 생산이 증가하였다.
실시예 3. NADH 키나아제가 증가된 락테이트 생산 균주의 제작
1. UTR1 , YEF1 , sPOS5 , POS5 가 과발현된 균주의 제작
(1) SP3027 ㅿ NDT1 :: P HHT2 - UTR1 균주의 제작
'UTR1 카세트'를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 균주의 게놈 DNA로부터 UTR1의 코딩 부위 함유 서열 (서열번호 8)을 서열번호 125 및 126의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 증폭하고, XhoI과 XbaI으로 처리한 pCS-Ex1.9 벡터와 섞어 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝하여 효모 UTR1 유전자 과발현 벡터인 pHHT2-UTR1 벡터를 얻었다. 상기 벡터에서 UTR1 유전자는 HHT2 프로모터 하에서 전사된다.
제작된 pHHT2-UTR1 벡터로부터 NDT1 유전자와 상동 서열을 갖는 서열번호 115 및 116의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 UTR1 도입용 카세트 조각을 얻었다. 이 UTR1 카세트 조각을 사카로마이세스 세레비지애 SP3027 균주에 도입하였다. 상기 UTR1 카세트의 도입은 일반적인 열충격 형질전환(heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 NDT1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 세포에 대하여, UTR1의 도입을 확인하기 위하여 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 117 및 118의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 ndt1 유전자 결실 및 UTR1 유전자 도입이 이루어진 것을 확인하였다. 그 결과, SP3027(ㅿndt1::utr1)를 제조하였다.
(2) SP3027 ㅿ NDT1 :: P HHT2 - YEF1 균주의 제작
'YEF1 카세트'를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 균주의 게놈 DNA로부터 YEF1의 코딩 부위 함유 서열 (서열번호 10)을 서열번호 126 및 127의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 증폭하고, XhoI과 XbaI으로 처리한 pCS-Ex1.9 벡터와 섞어 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝하여 효모 YEF1 유전자 과발현 벡터인 pHHT2-YEF1 벡터를 얻었다. 상기 벡터에서 YEF1 유전자는 HHT2 프로모터 하에서 전사된다.
제작된 pHHT2-YEF1 벡터로부터 NDT1 유전자와 상동 서열을 갖는 서열번호 115 및 116의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 YEF1 도입용 카세트 조각을 얻었다. 이 YEF1 카세트 조각을 사카로마이세스 세레비지애 SP3027 균주에 도입하였다. 상기 YEF1 카세트의 도입은 일반적인 열충격 형질전환(heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 NDT1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 세포에 대하여, YEF1의 도입을 확인하기 위하여 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 117 및 118의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 ndt1 유전자 결실 및 YEF1 유전자 도입이 이루어진 것을 확인하였다. 그 결과, SP3027(ㅿndt1::yef1)를 제조하였다.
(3) SP3027 ㅿ NDT1 :: P HHT2 - sPOS5 균주의 제작
'sPOS5 카세트'를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 균주의 게놈 DNA로부터 sPOS5의 코딩 부위 함유 서열 (서열번호 14)을 서열번호 128 및 129의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 증폭하고, XhoI과 XbaI으로 처리한 pCS-Ex1.9 벡터와 섞어 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝하여 효모 sPOS5 유전자 과발현 벡터인 pHHT2-sPOS5 벡터를 얻었다. 상기 sPOS5의 코딩 부위 함유 서열은 서열번호 12의 POS5 유전자서열에서 5'의 미토콘드리아 표적 서열(mitochondrial targeting sequence) 132 bp를 제거하고 atg를 추가하여 제작하였다. 상기 미토콘드리아 표적 서열은 MITOPROT (M.G. Claros et al., Eur. J. Biochem. 241, 779-786 (1996).)를 이용하여 예측하였다. 상기 MITOPROT은 http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html에서 사용하였다. 상기 벡터에서 sPOS5 유전자는 HHT2 프로모터 하에서 전사된다.
제작된 pHHT2-sPOS5 벡터로부터 NDT1 유전자와 상동 서열을 갖는 서열번호 115 및 116의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 sPOS5 도입용 카세트 조각을 얻었다. 이 sPOS5 카세트 조각을 사카로마이세스 세레비지애 SP3027 균주에 도입하였다. 상기 sPOS5 카세트의 도입은 일반적인 열충격 형질전환(heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 NDT1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 세포에 대하여, sPOS5의 도입을 확인하기 위하여 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 117 및 118의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 ndt1 유전자 결실 및 sPOS5 유전자 도입이 이루어진 것을 확인하였다. 그 결과, SP3027(ㅿndt1::sPOS5)를 제조하였다.
(4) SP3027 ㅿ NDT1 :: P HHT2 - POS5 균주의 제작
'POS5 카세트'를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 균주의 게놈 DNA로부터 POS5의 코딩 부위 함유 서열 (서열번호 12)을 서열번호 128 및 129의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 증폭하고, XhoI과 XbaI으로 처리한 pCS-Ex1.9 벡터와 섞어 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝하여 효모 POS5 유전자 과발현 벡터인 pHHT2-POS5 벡터를 얻었다. 상기 벡터에서 POS5 유전자는 HHT2 프로모터 하에서 전사된다.
제작된 pHHT2-POS5 벡터로부터 NDT1 유전자와 상동 서열을 갖는 서열번호 115 및 116의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 POS5 도입용 카세트 조각을 얻었다. 이 POS5 카세트 조각을 사카로마이세스 세레비지애 SP3027 균주에 도입하였다. 상기 POS5 카세트의 도입은 일반적인 열충격 형질전환(heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 NDT1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 세포에 대하여, POS5의 도입을 확인하기 위하여 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 117 및 118의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 ndt1 유전자 결실 및 POS5 유전자 도입이 이루어진 것을 확인하였다. 그 결과, SP3027(ㅿndt1::POS5)를 제조하였다.
2. UTR1 , YEF1 , sPOS5 , POS5 가 과발현된 균주의 LA 생산 및 세포 성장
상기에서 제조된 형질전환 효모 세포를 60g/L의 글루코스를 함유한 YPD 배지 20 ml에 OD600 값이 1이 되도록 접종하고, 36℃에서 90 rpm으로 교반하면서 48 시간 동안 미세호기 조건에서 배양하였다. 배양 중 세포 성장은 분광계 (spectrophotometer)를 이용하여 OD600 값을 측정하였다. 생산된 락테이트 농도, 잔류 에탄올 및 잔류 글루코스의 농도는 HPLC (High performance liquid chromatography)를 이용하여 분석하였다
배양 결과, 세포 성장 즉, 배양물의 OD600 값, 및 글루코스 소모, 생산된 락테이트 농도, 및 생산된 에탄올 농도는 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.
균주 글루코스 소모(g/L) OD600 락테이트 (g/L) 락테이트 수율(%) 에탄올 (g/L) 에탄올 수율 (%)
SP3027 27.30 2.86
 22.28 81.59 1.49 5.47
SP3027(ㅿndt1) 27.61 2.88 22.23 80.51 1.53 5.53
SP3027(ㅿndt1::urt1) 32.08 3.52 26.29 81.95 1.96 6.10
SP3027(ㅿndt1::yef1) 31.57 3.19 26.20 82.99 1.75 5.56
SP3027(ㅿndt1::sPOS5) 31.73 3.20 26.38 83.13 1.75 5.50
SP3027(ㅿndt1::POS5) 30.43 3.35 24.61 80.86 1.81 5.95
표 2에 나타낸 바와 같이, urt1 과발현 균주는 대조군에 비하여 글루코스 소모, 세포 성장, 락테이트 생산 및 에탄올 생산이 증가하였다. 또한, yef1 과발현 균주는 대조군에 비하여 글루코스 소모, 세포 성장, 락테이트 생산 및 에탄올 생산이 증가하였다. 또한, sPOS5 과발현 균주는 대조군에 비하여 글루코스 소모, 세포 성장, 락테이트 생산 및 에탄올 생산이 증가하였다. 또한, POS5 과발현 균주는 대조군에 비하여 글루코스 소모, 세포 성장, 락테이트 생산 및 에탄올 생산이 증가하였다.
실시예 4. NADP -의존성 GAPDH 가 도입된 락테이트 생산 균주의 제작
1. 도입된 균주의 제작
클루이베로마이세스 마르시아누스의 gDNA를 주형으로 하고 서열번호 130 및 131의 프라이머쌍을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 서열번호 16의 gpd1을 코딩하는 유전자를 증폭하였다.
'gpd1 카세트'를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지애 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 132 및 133의 프라이머쌍을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 얻어진 PGK 프로모터 서열 (서열번호 134)과 'gpd1 유전자 (서열번호 2)'를 각각 SacI/XbaI과 BamHI/SalI로 소화하고, 동일 효소로 소화된 pRS416 vector (ATCC87521)에 연결하여, pRS416-pPGK-gpd1 벡터를 제조하였다. 상기 벡터에서 gpd1 유전자는 PGK 프로모터 하에서 전사된다.
pRS416-pPGK-gpd1 를 주형으로 하고 서열번호 132 및 135의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR에 의하여 gpd1 유전자 절편과 pUC57-Ura3HA 벡터 (DNA2.0 Inc.; 서열번호 68)를 각각 SacI로 소화시킨 후 서로 연결하여 pUC-uraHA- gpd1을 제조하였다. 이 벡터로부터 gpd1 카세트는 ndt1 유전자와 상동 서열을 갖는 서열번호 119및 120의 서열을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 증폭하였다.
제작한 gpd1 카세트를 사카로마이세스 세레비지애 SP3027 균주에 도입하였다. 상기 gpd1 카세트의 도입은 일반적인 열충격 형질전환(heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 ndt1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다. 그 결과 얻어진 세포에 대하여, gpd1의 도입을 확인하기 위하여 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 117 및 118의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 gpd1 유전자 결실 및 ade3 유전자 도입이 이루어진 것을 확인하였다. 그 결과, SP3027(ㅿndt1:: gpd1)를 제조하였다.
2. NADP -의존성 GAPDH 가 도입된 균주의 LA 생산 및 세포 성장
상기에서 제조된 형질전환 효모 세포를 60g/L의 글루코스를 함유한 YPD 배지 20 ml에 OD600 값이 1이 되도록 접종하고, 36℃에서 90 rpm으로 교반하면서 48 시간 동안 미세호기 조건에서 배양하였다. 배양 중 세포 성장은 분광계 (spectrophotometer)를 이용하여 OD600 값을 측정하였다. 생산된 락테이트 농도, 잔류 에탄올 및 잔류 글루코스의 농도는 HPLC (High performance liquid chromatography)를 이용하여 분석하였다
배양 결과, 세포 성장 즉, 배양물의 OD600 값, 및 글루코스 소모, 생산된 락테이트 농도, 및 생산된 에탄올 농도는 하기 표 3에 나타낸 바와 같다.
균주 글루코스 소모(g/L) OD600 락테이트 (g/L) 락테이트 수율(%) 에탄올 (g/L) 에탄올 수율 (%)
SP3027 24.90 ±0.67 2.46±0.12 21.02±0.38 84.43±0.76 1.57±0.07 6.30±0.14
SP3027(ㅿndt1) 25.15 ±0.51 2.74±0.25 21.27±1.24 84.56±3.24 1.54±0.02 6.14±0.19
SP3027(ㅿndt1::gpd1) 27.41 ±0.31 3.26±0.16 23.43±0.16 85.49±0.53 1.26±0.06 4.59±0.18
표 3에 나타낸 바와 같이, K. maxianus 유래의 gpd1이 도입된 균주는 대조군에 비하여 글루코스 소모, 세포 성장, 락테이트 생산 및 에탄올 생산이 증가하였다.
실시예 5. Pentose phosphate pathway 가 증가된 락테이트 생산 균주의 제작
1. zwf1 이 과발현된 균주의 제작
사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 136 및 137의 프라이머쌍을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 서열번호 59의 TPI 프로모터(PTPI)를 코딩하는 유전자를 증폭하였다. 또한, pUC57-Ura3HA 벡터 (DNA2.0 Inc.; 서열번호 68)를 주형으로 하고 서열번호 138 및 139을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 서열번호140의 URA 카세트를 증폭하였다. 'URA 카세트'는 URA3 유전자 및 그 조절 영역을 포함하고 있어, URA3 유전자가 발현될 수 있도록 하는 영역을 나타낸다.
URA 카세트와 TPI 프로모터를 포함하는 서열번호 141의 DNA단편을 제조하기 위하여, 수득된 URA 카세트와 TPI 프로모터를 섞어 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 연결하였다. 다음으로, 상기 DNA 단편(서열번호 141)을 주형으로 ZWF1유전자의 프로모터 영역과 상동 서열을 갖는 서열번호 142 및 143의 프라이머를 사용하여 PCR하여 ZWF1 프로모터 치환 카세트를 증폭하였다.
제작한 zwf1 프로모터 치환 카세트를 사카로마이세스 세레비지애 SP3027 균주에 도입하였다. 상기 zwf1 프로모터 치환 카세트의 도입은 일반적인 열충격 형질전환에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하였다.
그 결과 얻어진 세포에 대하여, zwf1 프로모터 치환을 확인하기 위하여 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 144 및 145의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 zwf1 프로모터 치환이 이루어진 것을 확인하였다. 그 결과, SP3027(zwf1+)를 제조하였다. 상기 균주에서zwf1 유전자는 TPI1 프로모터 하에서 전사된다.
2. zwf1 이 과발현된 균주의 LA 생산 및 세포 성장
상기에서 제조된 형질전환 효모 세포를 60g/L의 글루코스를 함유한 YPD 배지 20 ml에 OD600 값이 1이 되도록 접종하고, 36℃에서 90 rpm으로 교반하면서 48 시간 동안 미세호기 조건에서 배양하였다. 배양 중 세포 성장은 분광계 (spectrophotometer)를 이용하여 OD600 값을 측정하였다. 생산된 락테이트 농도, 잔류 에탄올 및 잔류 글루코스의 농도는 HPLC (High performance liquid chromatography)를 이용하여 분석하였다
배양 결과, 세포 성장 즉, 배양물의 OD600 값, 및 글루코스 소모, 생산된 락테이트 농도, 및 생산된 에탄올 농도는 하기 표 4에 나타낸 바와 같다.
균주 글루코스 소모(g/L) OD600 락테이트 (g/L) 락테이트 수율(%) 에탄올 (g/L) 에탄올 수율 (%)
SP3027 30.46±1.25 03.74±0.17
 24.27±1.00 79.69±0.01 2.25±0.09 7.40±0.01
SP3027(zwf1) 36.92±0.11 4.47±0.07 29.77±0.04 80.63±0.12 3.07±0.05 8.32±0.15
표 4에 나타낸 바와 같이, zwf1 과발현 균주는 대조군에 비하여 글루코스 소모, 세포 성장, 락테이트 생산 및 에탄올 생산이 증가하였다.
실시예 6. transhydrogenase 가 도입된 락테이트 생산 균주의 제작
1. E. coli 유래 SthA 유전자가 도입된 균주의 제작
E. coli유래 sthA 유전자(서열번호 20)를 합성(DNA 2.0 Inc., USA) 제작하고 서열번호 146 및 147의 프라이머로 PCR하여 sthA를 코딩하는 유전자를 증폭하였다.
'sthA 카세트'를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 상기 증폭된 sthA 유전자를 XhoI과 XbaI으로 처리한 pCS-Ex1.1 벡터와 섞어 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝하여 E. coli sthA 유전자 과발현 벡터인 pCCW12-sthA 벡터를 얻었다. 상기 벡터에서 sthA 유전자는 CCW12 프로모터 하에서 전사된다.
제작된 pCCW12-sthA 벡터로부터 NDT1 유전자와 상동 서열을 갖는 서열번호 115 및 116의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 sthA 도입용 카세트 조각을 얻었다. 이 sthA 카세트 조각을 사카로마이세스 세레비지애 SP3027 균주에 도입하였다. 상기 sthA 카세트의 도입은 일반적인 열충격 형질전환(heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 NDT1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 세포에 대하여, sthA의 도입을 확인하기 위하여 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 117 및 118의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 ndt1 유전자 결실 및 sthA 유전자 도입이 이루어진 것을 확인하였다. 그 결과, SP3027(ㅿndt1::sthA)를 제조하였다.
2. E. coli 유래 SthA 유전자가 도입된 균주의 LA 생산 및 세포 성장
상기에서 제조된 형질전환 효모 세포를 60g/L의 글루코스를 함유한 YPD 배지 20 ml에 OD600 값이 1이 되도록 접종하고, 36℃에서 90 rpm으로 교반하면서 48 시간 동안 미세호기 조건에서 배양하였다. 배양 중 세포 성장은 분광계 (spectrophotometer)를 이용하여 OD600 값을 측정하였다. 생산된 락테이트 농도, 잔류 에탄올 및 잔류 글루코스의 농도는 HPLC (High performance liquid chromatography)를 이용하여 분석하였다
배양 결과, 세포 성장 즉, 배양물의 OD600 값, 및 글루코스 소모, 생산된 락테이트 농도, 및 생산된 에탄올 농도는 하기 표 5에 나타낸 바와 같다.
균주 글루코스 소모(g/L) OD600 락테이트 (g/L) 락테이트 수율(%) 에탄올 (g/L) 에탄올 수율 (%)
SP3027 27.30 2.86 22.28 81.59 1.49 5.47
SP3027(ㅿndt1) 27.61 2.88 22.23 80.51 1.53 5.53
SP3027(ㅿndt1::SthA) 30.58 3.24 24.79 81.09 1.53 5.00
표 5에 나타낸 바와 같이, sthA 과발현 균주는 대조군에 비하여 글루코스 소모, 세포 성장, 락테이트 생산이 증가하였다.
실시예 7. NADH 및 NADPH 를 동시에 사용하는 LDH 효소가 도입된 락테이트 생산 균주의 제작
1. L. delbrueckii sbusp . Bulgaricus 유래의 LDH 의 변이체가 도입된 균주의 제작
L. delbrueckii sbusp . Bulgaricus의 gDNA를 주형으로 하고 서열번호 148 및 149의 프라이머쌍을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 ldh를 코딩하는 유전자를 증폭하였다. 수득된 야생형의 락테이트 데히드로게나제 유전자(서열번호 24)를 주형으로 하여 site direct mutagenesis를 하여 락테이트 데히드로게나제 변이체를 코딩하는 유전자(이하 'LbLDH(D176A)'라 명칭)를 수득하였다. 상기 변이체를 코딩하는 유전자는 D176A로 서열번호 22의 폴리뉴클레오티드 서열를 갖는다.
'LbLDH(D176A) 카세트'를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 서열번호 188 및 189의 프라이머로 증폭된 LbLDH(D176A) 유전자를 XhoI과 XbaI으로 처리한 pCS-Ex1.1 벡터와 섞어 In-fusion 키트 (Clonetech cat. 639650)를 이용하여 클로닝하여 E. coli sthA 유전자 과발현 벡터인 pCCW12-LbLDH(D176A) 벡터를 얻었다. 상기 벡터에서 LbLDH(D176A) 유전자는 CCW12 프로모터 하에서 전사된다.
제작된 pCCW12-sthA 벡터로부터 NDT1 유전자와 상동 서열을 갖는 서열번호 115 및 116의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하여 LbLDH(D176A) 도입용 카세트 조각을 얻었다. 이 LbLDH(D176A) 카세트 조각을 사카로마이세스 세레비지애 SP3027(zwf1+) 균주에 도입하였다. 상기 LbLDH(D176A) 카세트의 도입은 일반적인 열충격 형질전환(heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 NDT1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 세포에 대하여, LbLDH(D176A)의 도입을 확인하기 위하여 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 117 및 118의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 ndt1 유전자 결실 및 LbLDH(D176A) 유전자 도입이 이루어진 것을 확인하였다. 그 결과, SP3027(zwf1+, ㅿndt1::sthA)를 제조하였다. 야생형 LbLDH가 도입된 SP3027(zwf1+,ㅿndt1::LbLDH)도 동일한 방법으로 제조하였다.
2. L. delbrueckii sbusp . Bulgaricus 유래의 LDH 의 변이체가 도입된 균주의 LA 생산 및 세포 성장
상기에서 제조된 형질전환 효모 세포를 60g/L의 글루코스를 함유한 YPD 배지 20 ml에 OD600 값이 1이 되도록 접종하고, 36℃에서 90 rpm으로 교반하면서 48 시간 동안 미세호기 조건에서 배양하였다. 배양 중 세포 성장은 분광계 (spectrophotometer)를 이용하여 OD600 값을 측정하였다. 생산된 락테이트 농도, 잔류 에탄올 및 잔류 글루코스의 농도는 HPLC (High performance liquid chromatography)를 이용하여 분석하였다
배양 결과, 세포 성장 즉, 배양물의 OD600 값, 및 글루코스 소모, 생산된 락테이트 농도, 및 생산된 에탄올 농도는 하기 표 6에 나타낸 바와 같다.
균주 글루코스 소모(g/L) OD600 락테이트 (g/L) 락테이트 수율(%) 에탄올 (g/L) 에탄올 수율 (%)
SP3027(zwf1+) 45.89 3.17
 37.90 82.60 2.13 4.63
SP3027(zwf1+, ㅿndt1) 46.17 3.17 39.61 85.80 2.06 4.47
SP3027(zwf1+,ㅿndt1::urt1) 42.93 2.82 40.25 93.74 1.74 4.06
표 6에 나타낸 바와 같이, LbLDH(D176A)를 코딩하는 유전자가 도입된 균주는 대조군에 비하여 글루코스 소모, 세포 성장, 락테이트 생산 및 에탄올 생산이 증가하였다.
<110> Samsung Electronic Co. Ltd <120> Genetically engineered yeast cell having increased production of NADPH, method for increasing NADPH levels in a yeast cell, method for preparing the yeast cell and method for producing a lactate using the yeast cell <130> PN109152 <160> 149 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 946 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 Met Ala Gly Gln Val Leu Asp Gly Lys Ala Cys Ala Gln Gln Phe Arg 1 5 10 15 Ser Asn Ile Ala Asn Glu Ile Lys Ser Ile Gln Gly His Val Pro Gly 20 25 30 Phe Ala Pro Asn Leu Ala Ile Ile Gln Val Gly Asn Arg Pro Asp Ser 35 40 45 Ala Thr Tyr Val Arg Met Lys Arg Lys Ala Ala Glu Glu Ala Gly Ile 50 55 60 Val Ala Asn Phe Ile His Leu Asp Glu Ser Ala Thr Glu Phe Glu Val 65 70 75 80 Leu Arg Tyr Val Asp Gln Leu Asn Glu Asp Pro His Thr His Gly Ile 85 90 95 Ile Val Gln Leu Pro Leu Pro Ala His Leu Asp Glu Asp Arg Ile Thr 100 105 110 Ser Arg Val Leu Ala Glu Lys Asp Val Asp Gly Phe Gly Pro Thr Asn 115 120 125 Ile Gly Glu Leu Asn Lys Lys Asn Gly His Pro Phe Phe Leu Pro Cys 130 135 140 Thr Pro Lys Gly Ile Ile Glu Leu Leu His Lys Ala Asn Val Thr Ile 145 150 155 160 Glu Gly Ser Arg Ser Val Val Ile Gly Arg Ser Asp Ile Val Gly Ser 165 170 175 Pro Val Ala Glu Leu Leu Lys Ser Leu Asn Ser Thr Val Thr Ile Thr 180 185 190 His Ser Lys Thr Arg Asp Ile Ala Ser Tyr Leu His Asp Ala Asp Ile 195 200 205 Val Val Val Ala Ile Gly Gln Pro Glu Phe Val Lys Gly Glu Trp Phe 210 215 220 Lys Pro Arg Asp Gly Thr Ser Ser Asp Lys Lys Thr Val Val Ile Asp 225 230 235 240 Val Gly Thr Asn Tyr Val Ala Asp Pro Ser Lys Lys Ser Gly Phe Lys 245 250 255 Cys Val Gly Asp Val Glu Phe Asn Glu Ala Ile Lys Tyr Val His Leu 260 265 270 Ile Thr Pro Val Pro Gly Gly Val Gly Pro Met Thr Val Ala Met Leu 275 280 285 Met Gln Asn Thr Leu Ile Ala Ala Lys Arg Gln Met Glu Glu Ser Ser 290 295 300 Lys Pro Leu Gln Ile Pro Pro Leu Pro Leu Lys Leu Leu Thr Pro Val 305 310 315 320 Pro Ser Asp Ile Asp Ile Ser Arg Ala Gln Gln Pro Lys Leu Ile Asn 325 330 335 Gln Leu Ala Gln Glu Leu Gly Ile Tyr Ser His Glu Leu Glu Leu Tyr 340 345 350 Gly His Tyr Lys Ala Lys Ile Ser Pro Lys Val Ile Glu Arg Leu Gln 355 360 365 Thr Arg Gln Asn Gly Lys Tyr Ile Leu Val Ser Gly Ile Thr Pro Thr 370 375 380 Pro Leu Gly Glu Gly Lys Ser Thr Thr Thr Met Gly Leu Val Gln Ala 385 390 395 400 Leu Thr Ala His Leu Gly Lys Pro Ala Ile Ala Asn Val Arg Gln Pro 405 410 415 Ser Leu Gly Pro Thr Leu Gly Val Lys Gly Gly Ala Ala Gly Gly Gly 420 425 430 Tyr Ser Gln Val Ile Pro Met Asp Glu Phe Asn Leu His Leu Thr Gly 435 440 445 Asp Ile His Ala Ile Gly Ala Ala Asn Asn Leu Leu Ala Ala Ala Ile 450 455 460 Asp Thr Arg Met Phe His Glu Thr Thr Gln Lys Asn Asp Ala Thr Phe 465 470 475 480 Tyr Asn Arg Leu Val Pro Arg Lys Asn Gly Lys Arg Lys Phe Thr Pro 485 490 495 Ser Met Gln Arg Arg Leu Asn Arg Leu Gly Ile Gln Lys Thr Asn Pro 500 505 510 Asp Asp Leu Thr Pro Glu Glu Ile Asn Lys Phe Ala Arg Leu Asn Ile 515 520 525 Asp Pro Asp Thr Ile Thr Ile Lys Arg Val Val Asp Ile Asn Asp Arg 530 535 540 Met Leu Arg Gln Ile Thr Ile Gly Gln Ala Pro Thr Glu Lys Asn His 545 550 555 560 Thr Arg Val Thr Gly Phe Asp Ile Thr Val Ala Ser Glu Leu Met Ala 565 570 575 Ile Leu Ala Leu Ser Lys Asp Leu Arg Asp Met Lys Glu Arg Ile Gly 580 585 590 Arg Val Val Val Ala Ala Asp Val Asn Arg Ser Pro Val Thr Val Glu 595 600 605 Asp Val Gly Cys Thr Gly Ala Leu Thr Ala Leu Leu Arg Asp Ala Ile 610 615 620 Lys Pro Asn Leu Met Gln Thr Leu Glu Gly Thr Pro Val Leu Val His 625 630 635 640 Ala Gly Pro Phe Ala Asn Ile Ser Ile Gly Ala Ser Ser Val Ile Ala 645 650 655 Asp Arg Val Ala Leu Lys Leu Val Gly Thr Glu Pro Glu Ala Lys Thr 660 665 670 Glu Ala Gly Tyr Val Val Thr Glu Ala Gly Phe Asp Phe Thr Met Gly 675 680 685 Gly Glu Arg Phe Phe Asn Ile Lys Cys Arg Ser Ser Gly Leu Thr Pro 690 695 700 Asn Ala Val Val Leu Val Ala Thr Val Arg Ala Leu Lys Ser His Gly 705 710 715 720 Gly Ala Pro Asp Val Lys Pro Gly Gln Pro Leu Pro Ser Ala Tyr Thr 725 730 735 Glu Glu Asn Ile Glu Phe Val Glu Lys Gly Ala Ala Asn Met Cys Lys 740 745 750 Gln Ile Ala Asn Ile Lys Gln Phe Gly Val Pro Val Val Val Ala Ile 755 760 765 Asn Lys Phe Glu Thr Asp Thr Glu Gly Glu Ile Ala Ala Ile Arg Lys 770 775 780 Ala Ala Leu Glu Ala Gly Ala Phe Glu Ala Val Thr Ser Asn His Trp 785 790 795 800 Ala Glu Gly Gly Lys Gly Ala Ile Asp Leu Ala Lys Ala Val Ile Glu 805 810 815 Ala Ser Asn Gln Pro Val Asp Phe His Phe Leu Tyr Asp Val Asn Ser 820 825 830 Ser Val Glu Asp Lys Leu Thr Thr Ile Val Gln Lys Met Tyr Gly Gly 835 840 845 Ala Ala Ile Asp Ile Leu Pro Glu Ala Gln Arg Lys Ile Asp Met Tyr 850 855 860 Lys Glu Gln Gly Phe Gly Asn Leu Pro Ile Cys Ile Ala Lys Thr Gln 865 870 875 880 Tyr Ser Leu Ser His Asp Ala Thr Leu Lys Gly Val Pro Thr Gly Phe 885 890 895 Thr Phe Pro Ile Arg Asp Val Arg Leu Ser Asn Gly Ala Gly Tyr Leu 900 905 910 Tyr Ala Leu Ala Ala Glu Ile Gln Thr Ile Pro Gly Leu Ala Thr Tyr 915 920 925 Ala Gly Tyr Met Ala Val Glu Val Asp Asp Asp Gly Glu Ile Asp Gly 930 935 940 Leu Phe 945 <210> 2 <211> 2841 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 atggctggtc aagtgttgga cggcaaagca tgcgctcagc agtttagaag caatattgct 60 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tgagggacat gaaggaacgt attggaagag tcgttgttgc tgctgacgta 1800 aacaggtctc cagtcactgt tgaagatgtg ggttgtaccg gtgccttaac cgctttatta 1860 agagacgcta tcaagcccaa cttgatgcaa actttagaag gtactcctgt cttggtccat 1920 gccggcccat ttgccaacat ctctatcggt gcctcttctg ttattgctga tcgcgtggct 1980 ttgaaattgg ttggtaccga gccagaggca aaaacagaag ctggttatgt ggttactgaa 2040 gcagggttcg atttcactat gggtggtgaa agattcttca acatcaagtg ccgttcctct 2100 ggattgacac ctaatgctgt ggtcttggtt gctactgtta gggcattgaa gtcacacggt 2160 ggtgctccag atgtcaaacc tggccaacct ttaccttccg catacactga agagaatatc 2220 gagtttgtcg aaaaaggtgc cgctaacatg tgtaaacaaa ttgccaacat taagcaattt 2280 ggcgtccccg tcgttgtcgc aattaacaag tttgaaactg acactgaagg tgaaatagcc 2340 gccattagaa aagccgcttt ggaagctggt gcatttgaag ccgtaacctc taaccattgg 2400 gccgaaggtg gtaaaggtgc tatcgacttg gccaaggccg tcatcgaagc ttccaaccaa 2460 ccagtggact tccatttcct atatgacgtt aactcctccg ttgaagacaa attaactact 2520 atcgttcaaa agatgtacgg tggtgccgca atcgatatct tgcctgaagc acaacgcaag 2580 attgacatgt acaaggaaca aggtttcggt aacttgccaa tttgtatcgc caagacacaa 2640 tactctttat cccacgatgc aactttgaaa ggtgttccaa ccgggttcac tttccccatc 2700 agagacgtca gattgtctaa tggtgctgga tacttatacg ctcttgccgc cgaaatacaa 2760 accattcctg gtttggctac ctatgctggt tacatggccg tggaagtcga tgatgacggt 2820 gagatcgatg gcctgttcta a 2841 <210> 3 <211> 469 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 Met Pro Tyr Thr Leu Ser Asp Ala His His Lys Leu Ile Thr Ser His 1 5 10 15 Leu Val Asp Thr Asp Pro Glu Val Asp Ser Ile Ile Lys Asp Glu Ile 20 25 30 Glu Arg Gln Lys His Ser Ile Asp Leu Ile Ala Ser Glu Asn Phe Thr 35 40 45 Ser Thr Ser Val Phe Asp Ala Leu Gly Thr Pro Leu Ser Asn Lys Tyr 50 55 60 Ser Glu Gly Tyr Pro Gly Ala Arg Tyr Tyr Gly Gly Asn Glu His Ile 65 70 75 80 Asp Arg Met Glu Ile Leu Cys Gln Gln Arg Ala Leu Lys Ala Phe His 85 90 95 Val Thr Pro Asp Lys Trp Gly Val Asn Val Gln Thr Leu Ser Gly Ser 100 105 110 Pro Ala Asn Leu Gln Val Tyr Gln Ala Ile Met Lys Pro His Glu Arg 115 120 125 Leu Met Gly Leu Tyr Leu Pro Asp Gly 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720 cgtattaatt tacgaatgag gttgcaatgc aaactctacc gtagaaataa accagaaatt 780 gatgccgcaa ctgggagaaa aatatgttac atcgatttca tctccgaaca tcacgtattg 840 aacgaagtaa ccatagatag aggtccagct ccttgtttat ccctattaga actctatgga 900 aacgactcac taatgactaa ggttcaggga gatggattga ttgttgccac gcctacggga 960 tccacggcat actcattgag tgcaggaggc tctttaatat cgccaagcgt aaatgccata 1020 gcggtgacgc ctatatgtcc tcatactttg agctttaggc ctataatttt accagatagc 1080 atggaattaa aagttagagt agatatgaac tcaagaggga cgtcgtgggt gaattttgac 1140 ggaaaagata gagttgaatt gaaacagggt gactatgttg tgataactgc aagcccctat 1200 tcggtaccga ctatcgagtc atctgccagt gaattttttg aaagtatcag taaaaatctt 1260 aattggaatg accgcgaaga gcagaagcca tttgcacata ttctctcgcc aaaaaatcaa 1320 gaaaaatata gattagactc atcgaaaaat ggaaacgaca ccataagtaa tcccctcgag 1380 agttcatgca taagctcaga tgcacaagat gaggagagga aatccgtaac ggaaacagaa 1440 acagaaatag ttgttgaacg gactcgtcag gctcattttg caatctaa 1488 <210> 11 <211> 414 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 11 Met Phe Val Arg Val 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cerevisiae <400> 12 atgtttgtca gggttaaatt gaataaacca gtaaaatggt ataggttcta tagtacgttg 60 gattcacatt ccctaaagtt acagagcggc tcgaagtttg taaaaataaa gccagtaaat 120 aacttgagga gtagttcatc agcagatttc gtgtccccac caaattccaa attacaatct 180 ttaatctggc agaacccttt acaaaatgtt tatataacta aaaaaccatg gactccatcc 240 acaagagaag cgatggttga attcataact catttacatg agtcataccc cgaggtgaac 300 gtcattgttc aacccgatgt ggcagaagaa atttcccagg atttcaaatc tcctttggag 360 aatgatccca accgacctca tatactttat actggtcctg aacaagatat cgtaaacaga 420 acagacttat tggtgacatt gggaggtgat gggactattt tacacggcgt atcaatgttc 480 ggaaatacgc aagttcctcc ggttttagca tttgctctgg gcactctggg ctttctatca 540 ccgtttgatt ttaaggagca taaaaaggtc tttcaggaag taatcagctc tagagccaaa 600 tgtttgcata gaacacggct agaatgtcat ttgaaaaaaa aggatagcaa ctcatctatt 660 gtgacccatg ctatgaatga catattctta cataggggta attcccctca tctcactaac 720 ctggacattt tcattgatgg ggaatttttg acaagaacga cagcagatgg tgttgcattg 780 gccactccaa cgggttccac agcatattca ttatcagcag gtggatctat tgtttcccca 840 ttagtccctg ctattttaat gacaccaatt tgtcctcgct ctttgtcatt ccgaccactg 900 attttgcctc attcatccca cattaggata aagataggtt ccaaattgaa ccaaaaacca 960 gtcaacagtg tggtaaaact ttctgttgat ggtattcctc aacaggattt agatgttggt 1020 gatgaaattt atgttataaa tgaggtcggc actatataca tagatggtac tcagcttccg 1080 acgacaagaa aaactgaaaa tgactttaat aattcaaaaa agcctaaaag gtcagggatt 1140 tattgtgtcg ccaagaccga gaatgactgg attagaggaa tcaatgaact tttaggattc 1200 aattctagct ttaggctgac caagagacag actgataatg attaa 1245 <210> 13 <211> 371 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 13 Met Ser Ser Ser Ala Asp Phe Val Ser Pro Pro Asn Ser Lys Leu Gln 113 117 122 127 Ser Leu Ile Trp Gln Asn Pro Leu Gln Asn Val Tyr Ile Thr Lys Lys 132 137 142 Pro Trp Thr Pro Ser Thr Arg Glu Ala Met Val Glu Phe Ile Thr His 147 152 157 Leu His Glu Ser Tyr Pro Glu Val Asn Val Ile Val Gln Pro Asp Val 162 167 172 Ala Glu Glu Ile Ser Gln Asp Phe Lys Ser Pro Leu Glu Asn Asp Pro 177 182 187 192 Asn Arg Pro His Ile Leu Tyr Thr Gly Pro Glu Gln Asp Ile Val Asn 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aaggatagca actcatctat tgtgacccat 540 gctatgaatg acatattctt acataggggt aattcccctc atctcactaa cctggacatt 600 ttcattgatg gggaattttt gacaagaacg acagcagatg gtgttgcatt ggccactcca 660 acgggttcca cagcatattc attatcagca ggtggatcta ttgtttcccc attagtccct 720 gctattttaa tgacaccaat ttgtcctcgc tctttgtcat tccgaccact gattttgcct 780 cattcatccc acattaggat aaagataggt tccaaattga accaaaaacc agtcaacagt 840 gtggtaaaac tttctgttga tggtattcct caacaggatt tagatgttgg tgatgaaatt 900 tatgttataa atgaggtcgg cactatatac atagatggta ctcagcttcc gacgacaaga 960 aaaactgaaa atgactttaa taattcaaaa aagcctaaaa ggtcagggat ttattgtgtc 1020 gccaagaccg agaatgactg gattagagga atcaatgaac ttttaggatt caattctagc 1080 tttaggctga ccaagagaca gactgataat gattaa 1116 <210> 15 <211> 353 <212> PRT <213> Kluyveromyces maxianus <400> 15 Met Thr His Glu Ser Ser Ser Lys Ile Pro Gln Ile Asn Ile Gly Ile 1131 1135 1140 1145 Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg Leu Val Leu Arg Ala Ala Leu Ser 1150 1155 1160 His Pro Glu Ile Lys Val Arg Leu Ile Asn Asn Pro Ser Thr 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accggtgctt tcaaggaatt ggacaccgca 360 tccagacaca agggcattaa gaaagtcatt attactgcac catccaagac tgccccaatg 420 tacgtgtttg gtgtaaatca caagaagtac gatcctacca gggacaatat cgtctcgaat 480 gcttcttgta ccaccaattg tttggctcct ttggtgaagg ctctagacga cgaatttggt 540 attgaagaag ctttgatgac taccattcat gccacaactg cctcccaaaa gactgtcgac 600 ggtaccagct ctggtggtaa ggactggaga ggtggaagat catgccaagg taacatcatt 660 ccatcatcta ccggtgccgc caaggctgtc ggaaagattt tgcccgagct caaggacagc 720 attacaggta tgtctatcag agtacctacc atcaacattt cgctggttga tttgacattc 780 cggacacgta agccaacctc ttacgacgaa atcatcagtg cgctagaact aaagtcccgt 840 agagaaatga agggcgtgtt gggagtcact aaagacgccg tcgtctcttc tgatttcact 900 tcagactctc gttcttcaat tgttgatgcc aaagcaggta ttcaactaaa cgatcatttc 960 ttcaaggtcc tttcttggta cgacaatgaa tacggttatt cttcaagagt tgtcgatttg 1020 accatgtaca tggctcaaag agactttgag gcgggtatct aa 1062 <210> 17 <211> 505 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 17 Met Ser Glu Gly Pro Val Lys Phe Glu Lys Asn Thr Val Ile Ser Val 1 5 10 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aaaaacctgg ggcccctctt taaagaagaa 540 gagttgtaca gaattgacca ttacttgggt aaagagttgg tcaagaatct tttagtcttg 600 aggttcggta accagttttt gaatgcctcg tggaatagag acaacattca aagcgttcag 660 atttcgttta aagagaggtt cggcaccgaa ggccgtggcg gctatttcga ctctataggc 720 ataatcagag acgtgatgca gaaccatctg ttacaaatca tgactctctt gactatggaa 780 agaccggtgt cttttgaccc ggaatctatt cgtgacgaaa aggttaaggt tctaaaggcc 840 gtggccccca tcgacacgga cgacgtcctc ttgggccagt acggtaaatc tgaggacggg 900 tctaagcccg cctacgtgga tgatgacact gtagacaagg actctaaatg tgtcactttt 960 gcagcaatga ctttcaacat cgaaaacgag cgttgggagg gcgtccccat catgatgcgt 1020 gccggtaagg ctttgaatga gtccaaggtg gagatcagac tgcagtacaa agcggtcgca 1080 tcgggtgtct tcaaagacat tccaaataac gaactggtca tcagagtgca gcccgatgcc 1140 gctgtgtacc taaagtttaa tgctaagacc cctggtctgt caaatgctac ccaagtcaca 1200 gatctgaatc taacttacgc aagcaggtac caagactttt ggattccaga ggcttacgag 1260 gtgttgataa gagacgccct actgggtgac cattccaact ttgtcagaga tgacgaattg 1320 gatatcagtt ggggcatatt caccccatta ctgaagcaca tagagcgtcc ggacggtcca 1380 acaccggaaa tttaccccta cggatcaaga ggtccaaagg gattgaagga atatatgcaa 1440 aaacacaagt atgttatgcc cgaaaagcac ccttacgctt ggcccgtgac taagccagaa 1500 gatacgaagg ataattag 1518 <210> 19 <211> 466 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 19 Met Pro His Ser Tyr Asp Tyr Asp Ala Ile Val Ile Gly Ser Gly Pro 1 5 10 15 Gly Gly Glu Gly Ala Ala Met Gly Leu Val Lys Gln Gly Ala Arg Val 20 25 30 Ala Val Ile Glu Arg Tyr Gln Asn Val Gly Gly Gly Cys Thr His Trp 35 40 45 Gly Thr Ile Pro Ser Lys Ala Leu Arg His Ala Val Ser Arg Ile Ile 50 55 60 Glu Phe Asn Gln Asn Pro Leu Tyr Ser Asp His Ser Arg Leu Leu Arg 65 70 75 80 Ser Ser Phe Ala Asp Ile Leu Asn His Ala Asp Asn Val Ile Asn Gln 85 90 95 Gln Thr Arg Met Arg Gln Gly Phe Tyr Glu Arg Asn His Cys Glu Ile 100 105 110 Leu Gln Gly Asn Ala Arg Phe Val Asp Glu His Thr Leu Ala Leu Asp 115 120 125 Cys Pro Asp Gly Ser Val Glu Thr Leu Thr Ala Glu Lys Phe Val Ile 130 135 140 Ala Cys Gly Ser Arg Pro Tyr His Pro Thr Asp Val Asp Phe Thr His 145 150 155 160 Pro Arg Ile Tyr Asp Ser Asp Ser Ile Leu Ser Met His His Glu Pro 165 170 175 Arg His Val Leu Ile Tyr Gly Ala Gly Val Ile Gly Cys Glu Tyr Ala 180 185 190 Ser Ile Phe Arg Gly Met Asp Val Lys Val Asp Leu Ile Asn Thr Arg 195 200 205 Asp Arg Leu Leu Ala Phe Leu Asp Gln Glu Met Ser Asp Ser Leu Ser 210 215 220 Tyr His Phe Trp Asn Ser Gly Val Val Ile Arg His Asn Glu Glu Tyr 225 230 235 240 Glu Lys Ile Glu Gly Cys Asp Asp Gly Val Ile Met His Leu Lys Ser 245 250 255 Gly Lys Lys Leu Lys Ala Asp Cys Leu Leu Tyr Ala Asn Gly Arg Thr 260 265 270 Gly Asn Thr Asp Ser Leu Ala Leu Gln Asn Ile Gly Leu Glu Thr Asp 275 280 285 Ser Arg Gly Gln Leu Lys Val Asn Ser Met Tyr Gln Thr Ala Gln Pro 290 295 300 His Val Tyr Ala Val Gly Asp Val Ile Gly Tyr Pro Ser Leu Ala Ser 305 310 315 320 Ala Ala Tyr Asp Gln Gly Arg Ile Ala Ala Gln Ala Leu Val Lys Gly 325 330 335 Glu Ala Thr Ala His Leu Ile Glu Asp Ile Pro Thr Gly Ile Tyr Thr 340 345 350 Ile Pro Glu Ile Ser Ser Val Gly Lys Thr Glu Gln Gln Leu Thr Ala 355 360 365 Met Lys Val Pro Tyr Glu Val Gly Arg Ala Gln Phe Lys His Leu Ala 370 375 380 Arg Ala Gln Ile Val Gly Met Asn Val Gly Thr Leu Lys Ile Leu Phe 385 390 395 400 His Arg Glu Thr Lys Glu Ile Leu Gly Ile His Cys Phe Gly Glu Arg 405 410 415 Ala Ala Glu Ile Ile His Ile Gly Gln Ala Ile Met Glu Gln Lys Gly 420 425 430 Gly Gly Asn Thr Ile Glu Tyr Phe Val Asn Thr Thr Phe Asn Tyr Pro 435 440 445 Thr Met Ala Glu Ala Tyr Arg Val Ala Ala Leu Asn Gly Leu Asn Arg 450 455 460 Leu Phe 465 <210> 20 <211> 1401 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 20 atgccacact catatgacta cgacgctatt gtcattggct caggccctgg gggagaaggc 60 gctgcgatgg ggctagtcaa acaaggagcc agagtagcag tgatcgaaag gtatcagaat 120 gtagggggtg gctgtacaca ctggggtaca atcccatcta aagccttgag acatgctgta 180 tctagaatta tcgaattcaa ccagaaccca ttatactctg atcattccag attacttaga 240 tcctcttttg ctgatatctt gaatcacgca gacaacgtga ttaaccaaca aacgagaatg 300 agacaaggat tttacgaacg taatcactgt gaaattctac aaggtaatgc tagatttgtg 360 gatgagcaca ctttagctct ggattgtcct gatggtagtg tcgaaacatt gacagcagaa 420 aaattcgtta ttgcttgtgg ttctagacca taccatccta ctgacgttga ttttactcat 480 cctagaatat acgactcaga ctctatcttg agtatgcatc atgaaccaag acatgtacta 540 atctacggtg cgggtgtgat tggatgcgaa tatgcttcta tattcagagg catggatgtt 600 aaagttgact taatcaacac tagagatcgt ttactggcct ttttggacca agagatgagt 660 gatagtctgt cttaccattt ttggaattca ggtgttgtta tcaggcacaa tgaagagtac 720 gagaaaatag aaggttgtga tgatggtgtt atcatgcacc ttaagtctgg caaaaagttg 780 aaagctgact gcctattgta tgcaaacggt cgtacaggta atacagattc attggcatta 840 caaaacatcg ggcttgaaac agattctaga ggtcaactaa aggttaattc catgtatcaa 900 accgcccagc ctcatgtata cgccgtgggg gatgtcatag gttacccaag ccttgcatca 960 gcagcatacg atcaaggcag aattgccgca caggctctcg ttaagggtga agccactgcg 1020 cacttaatcg aggatatacc aactggaata tacacgatac cagaaatttc atccgtcggc 1080 aaaaccgaac aacaattaac tgcaatgaag gtgccatacg aagttggcag agcacaattc 1140 aaacatttgg ctagggctca gattgtagga atgaacgttg gaacattgaa gattctcttt 1200 catcgagaaa ctaaggaaat cttgggtatt cattgctttg gagagagagc cgcagagatc 1260 atccatatcg gccaagctat tatggaacaa aaaggtggtg gtaacacaat tgagtacttc 1320 gttaatacaa ctttcaatta ccctaccatg gctgaagcct atagagtcgc agcccttaat 1380 ggactcaata gactgtttta a 1401 <210> 21 <211> 333 <212> PRT <213> Lactobacillus delbrueckii <400> 21 Met Thr Lys Ile Phe Ala Tyr Ala Ile Arg Glu Asp Glu Lys Pro Phe 1 5 10 15 Leu Lys Glu Trp Glu Asp Ala His Lys Asp Val Glu Val Glu Tyr Thr 20 25 30 Asp Lys Leu Leu Thr Pro Glu Thr Ala Ala Leu Ala Lys Gly Ala Asp 35 40 45 Gly Val Val Val Tyr Gln Gln Leu Asp Tyr Thr Ala Glu Thr Leu Gln 50 55 60 Ala Leu Ala Asp Asn Gly Ile Thr Lys Met Ser Leu Arg Asn Val Gly 65 70 75 80 Val Asp Asn Ile Asp Met Ala Lys Ala Lys Glu Leu Gly Phe Gln Ile 85 90 95 Thr Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu His Ala Ala 100 105 110 Ile Gln Ala Ala Arg Ile Leu Arg Gln Ala Lys Ala Met Asp Glu Lys 115 120 125 Val Ala Arg His Asp Leu Arg Trp Ala Pro Thr Ile Gly Arg Glu Val 130 135 140 Arg Asp Gln Val Val Gly Val Val Gly Thr Gly His Ile Gly Gln Val 145 150 155 160 Phe Met Gln Ile Met Glu Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Ala 165 170 175 Ile Phe Arg Asn Pro Glu Leu Glu Lys Lys Gly Tyr Tyr Val Asp Ser 180 185 190 Leu Asp Asp Leu Tyr Lys Gln Ala Asp Val Ile Ser Leu His Val Pro 195 200 205 Asp Val Pro Ala Asn Val His Met Ile Asn Asp Lys Ser Ile Ala Lys 210 215 220 Met Lys Gln Asp Val Val Ile Val Asn Val Ser Arg Gly Pro Leu Val 225 230 235 240 Asp Thr Asp Ala Val Ile Arg Gly Leu Asp Ser Gly Lys Val Phe Gly 245 250 255 Tyr Ala Met Asp Val Tyr Glu Gly Glu Val Gly Val Phe Asn Glu Asp 260 265 270 Trp Glu Gly Lys Glu Phe Pro Asp Ala Arg Leu Ala Asp Leu Ile Ala 275 280 285 Arg Pro Asn Val Leu Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Thr His 290 295 300 Ala Val Arg Asn Met Val Ile Lys Ala Phe Asp Asn Asn Leu Glu Leu 305 310 315 320 Ile Glu Gly Lys Glu Ala Glu Thr Pro Val Lys Val Gly 325 330 <210> 22 <211> 1002 <212> DNA <213> Lactobacillus delbrueckii sbusp. Bulgaricus <400> 22 atgactaaaa tcttcgctta cgctataaga gaggacgaaa agccattttt gaaagagtgg 60 gaggatgcgc ataaagatgt tgaagttgag tacacggata aacttttaac tcctgaaact 120 gctgcattgg caaagggtgc agacggcgta gtagtatatc aacagcttga ttatacagct 180 gaaaccctcc aagctctcgc tgataatggg attacaaaaa tgtctttgcg taatgtaggt 240 gttgacaaca tagacatggc caaagcaaag gaactaggct ttcaaatcac aaatgtgcct 300 gtgtactcac caaatgctat cgctgaacac gctgccatac aagccgctag aatcttaaga 360 caggcgaagg ctatggatga aaaggttgca agacatgatc taagatgggc tcctactatc 420 ggtagggaag taagagatca agttgtcggt gtggtgggaa caggacatat tggccaagtt 480 ttcatgcaga ttatggaagg attcggggca aaagtcattg cctacgctat ttttcgaaac 540 cctgagctgg agaaaaaggg ttactacgtt gattctctgg atgacctata caaacaagca 600 gatgttattt ctcttcatgt gccagatgtc ccagcaaatg tccacatgat caacgacaaa 660 tcaattgcca agatgaaaca agatgtcgta atcgttaatg tgagtagagg gcctttggtt 720 gacaccgacg ctgttataag gggtttggat tccggtaaag tatttggata tgcgatggat 780 gtttacgaag gtgaagtcgg tgtctttaac gaagattggg aaggcaaaga gttcccagac 840 gcaagattag ccgatttgat cgcaagacca aatgttttag taacaccaca cactgccttc 900 tatacaacac atgccgtgag aaacatggtt attaaggcat ttgataataa cttagaattg 960 atcgaaggca aggaagctga aactccagtt aaggtcggtt aa 1002 <210> 23 <211> 333 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaicus <400> 23 Met Thr Lys Ile Phe Ala Tyr Ala Ile Arg Glu Asp Glu Lys Pro Phe 123 127 132 137 Leu Lys Glu Trp Glu Asp Ala His Lys Asp Val Glu Val Glu Tyr Thr 142 147 152 Asp Lys Leu Leu Thr Pro Glu Thr Ala Ala Leu Ala Lys Gly Ala Asp 157 162 167 Gly Val Val Val Tyr Gln Gln Leu Asp Tyr Thr Ala Glu Thr Leu Gln 172 177 182 Ala Leu Ala Asp Asn Gly Ile Thr Lys Met Ser Leu Arg Asn Val Gly 187 192 197 202 Val Asp Asn Ile Asp Met Ala Lys Ala Lys Glu Leu Gly Phe Gln Ile 207 212 217 Thr Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu His Ala Ala 222 227 232 Ile Gln Ala Ala Arg Ile Leu Arg Gln Ala Lys Ala Met Asp Glu Lys 237 242 247 Val Ala Arg His Asp Leu Arg Trp Ala Pro Thr Ile Gly Arg Glu Val 252 257 262 Arg Asp Gln Val Val Gly Val Val Gly Thr Gly His Ile Gly Gln Val 267 272 277 282 Phe Met Gln Ile Met Glu Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp 287 292 297 Ile Phe Arg Asn Pro Glu Leu Glu Lys Lys Gly Tyr Tyr Val Asp Ser 302 307 312 Leu Asp Asp Leu Tyr Lys Gln Ala Asp Val Ile Ser Leu His Val Pro 317 322 327 Asp Val Pro Ala Asn Val His Met Ile Asn Asp Lys Ser Ile Ala Lys 332 337 342 Met Lys Gln Asp Val Val Ile Val Asn Val Ser Arg Gly Pro Leu Val 347 352 357 362 Asp Thr Asp Ala Val Ile Arg Gly Leu Asp Ser Gly Lys Val Phe Gly 367 372 377 Tyr Ala Met Asp Val Tyr Glu Gly Glu Val Gly Val Phe Asn Glu Asp 382 387 392 Trp Glu Gly Lys Glu Phe Pro Asp Ala Arg Leu Ala Asp Leu Ile Ala 397 402 407 Arg Pro Asn Val Leu Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Thr His 412 417 422 Ala Val Arg Asn Met Val Ile Lys Ala Phe Asp Asn Asn Leu Glu Leu 427 432 437 442 Ile Glu Gly Lys Glu Ala Glu Thr Pro Val Lys Val Gly 447 452 <210> 24 <211> 1002 <212> DNA <213> Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaicus <400> 24 atgactaaaa tcttcgctta cgctataaga gaggacgaaa agccattttt gaaagagtgg 60 gaggatgcgc ataaagatgt tgaagttgag tacacggata aacttttaac tcctgaaact 120 gctgcattgg caaagggtgc agacggcgta gtagtatatc aacagcttga ttatacagct 180 gaaaccctcc aagctctcgc tgataatggg attacaaaaa tgtctttgcg taatgtaggt 240 gttgacaaca tagacatggc caaagcaaag gaactaggct ttcaaatcac aaatgtgcct 300 gtgtactcac caaatgctat cgctgaacac gctgccatac aagccgctag aatcttaaga 360 caggcgaagg ctatggatga aaaggttgca agacatgatc taagatgggc tcctactatc 420 ggtagggaag taagagatca agttgtcggt gtggtgggaa caggacatat tggccaagtt 480 ttcatgcaga ttatggaagg attcggggca aaagtcattg cctacgacat ttttcgaaac 540 cctgagctgg agaaaaaggg ttactacgtt gattctctgg atgacctata caaacaagca 600 gatgttattt ctcttcatgt gccagatgtc ccagcaaatg tccacatgat caacgacaaa 660 tcaattgcca agatgaaaca agatgtcgta atcgttaatg tgagtagagg gcctttggtt 720 gacaccgacg ctgttataag gggtttggat tccggtaaag tatttggata tgcgatggat 780 gtttacgaag gtgaagtcgg tgtctttaac gaagattggg aaggcaaaga gttcccagac 840 gcaagattag ccgatttgat cgcaagacca aatgttttag taacaccaca cactgccttc 900 tatacaacac atgccgtgag aaacatggtt attaaggcat ttgataataa cttagaattg 960 atcgaaggca aggaagctga aactccagtt aaggtcggtt aa 1002 <210> 25 <211> 332 <212> PRT <213> Bos Taurus <400> 25 Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 His Val Pro Gln Asn Lys Ile Thr Ile Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Val 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Met Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Arg Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Ile Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro Asn Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Ile Leu Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ser Leu Lys Asn Leu His Pro Glu Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys 210 215 220 Glu Gln Trp Lys Ala Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu 225 230 235 240 Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val 245 250 255 Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro 260 265 270 Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Asp Val Phe 275 280 285 Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Val Val 290 295 300 Lys Val Thr Leu Thr His Glu Glu Glu Ala Cys Leu Lys Lys Ser Ala 305 310 315 320 Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 325 330 <210> 26 <211> 332 <212> PRT <213> Pelodiscus sinensis japonicus <400> 26 Met Ser Val Lys Glu Leu Leu Ile Gln Asn Val His Lys Glu Glu His 1 5 10 15 Ser His Ala His Asn Lys Ile Thr Val Val Gly Val Gly 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Leu Lys Lys Ser Ala 305 310 315 320 Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 325 330 <210> 28 <211> 332 <212> PRT <213> Tursiops truncatus <400> 28 Met Ala Thr Val Lys Asp Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 His Val Pro Gln Asn Lys Ile Thr Val Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Ile Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Ser Val Thr Ala Asn Ser Lys Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Val Pro Asn Ile Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro His Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Arg Leu Gly Val His 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35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Ile Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Lys Thr Pro Lys Ile Val Ser Ser 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Ser Val Thr Ala Asn Ser Lys Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Val Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro Gln Cys Lys Leu Leu Ile Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Val Leu Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ser Leu Lys Ser Leu Asn Pro Gln Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys 210 215 220 Glu Gln Trp Lys Asp Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu 225 230 235 240 Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val 245 250 255 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tgctcgtttt aggtatctga tgggtgaaag attaggggtt 540 catccattga gttgtcacgg atggattcta ggtgaacatg gagatagttc tgtgcctgtt 600 tggtcaggtg tcaacgtagc aggtgtctct ttgaaaaatc tacacccaga actaggaaca 660 gatgccgaca aggaacaatg gaaggccgtc cacaaacaag tggtggattc tgcctacgaa 720 gtcatcaaat tgaagggcta cacatcttgg gcaattggct tatccgtcgc tgatctggct 780 gaatcaataa tgaaaaacct ccgtagagtg catcctataa gtactatgat taagggttta 840 tacgggatca aggaagatgt ttttctatct gtgccatgta ttttgggcca aaatggaatt 900 tctgacgttg ttaaagtgac acttactcat gaagaggaag cgtgtttgaa aaagagcgca 960 gacaccttat ggggcatcca aaaggaatta caattctaa 999 <210> 31 <211> 563 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 31 Met Ser Glu Ile Thr Leu Gly Lys Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Lys Gln 1 5 10 15 Val Asn Val Asn Thr Val Phe Gly Leu Pro Gly Asp Phe Asn Leu Ser 20 25 30 Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Glu Val Glu Gly Met Arg Trp Ala Gly Asn 35 40 45 Ala Asn Glu Leu Asn Ala Ala Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Ile 50 55 60 Lys Gly Met Ser Cys Ile Ile Thr Thr Phe Gly Val Gly 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ttggtcgact tgaacgtccc agctaagttg 540 ttgcaaactc caattgacat gtctttgaag ccaaacgatg ctgaatccga aaaggaagtc 600 attgacacca tcttggcttt ggtcaaggat gctaagaacc cagttatctt ggctgatgct 660 tgttgttcca gacacgacgt caaggctgaa actaagaagt tgattgactt gactcaattc 720 ccagctttcg tcaccccaat gggtaagggt tccattgacg aacaacaccc aagatacggt 780 ggtgtttacg tcggtacctt gtccaagcca gaagttaagg aagccgttga atctgctgac 840 ttgattttgt ctgtcggtgc tttgttgtct gatttcaaca ccggttcttt ctcttactct 900 tacaagacca agaacattgt cgaattccac tccgaccaca tgaagatcag aaacgccact 960 ttcccaggtg tccaaatgaa attcgttttg caaaagttgt tgaccactat tgctgacgcc 1020 gctaagggtt acaagccagt tgctgtccca gctagaactc cagctaacgc tgctgtccca 1080 gcttctaccc cattgaagca agaatggatg tggaaccaat tgggtaactt cttgcaagaa 1140 ggtgatgttg tcattgctga aaccggtacc tccgctttcg gtatcaacca aaccactttc 1200 ccaaacaaca cctacggtat ctctcaagtc ttatggggtt ccattggttt caccactggt 1260 gctaccttgg gtgctgcttt cgctgctgaa gaaattgatc caaagaagag agttatctta 1320 ttcattggtg acggttcttt gcaattgact gttcaagaaa 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tgcgaaatcc gatttggacg cccattcaga tacctacttc 420 aacacgcatc acccctctcc cgagcaaaga cctaggatta tattattccc tcatactacc 480 gaagaagttt ccaaaatttt gaaaatatgt cacgataaca acatgccagt tgtacccttc 540 tcgggcggaa cgtccttgga ggggcacttc ctgcctacaa gaattggaga taccataacc 600 gtagacctgt ccaagtttat gaataacgtc gtaaaatttg acaagctgga cctggacatc 660 accgtgcagg ccggtctacc ctgggaggat ttgaatgact atttgagcga ccacggtttg 720 atgtttggct gtgaccctgg tccaggtgca cagattggtg gttgcattgc taattcttgt 780 tcaggaacca acgcctaccg ttacggtacc atgaaggaga atattataaa catgactata 840 gtgttgccgg acgggaccat tgtcaagacg aagaaaagac ccagaaagtc gagcgctggc 900 tataacttaa atggtttatt tgtgggaagt gaaggtacct taggtattgt tactgaagct 960 actgtcaagt gtcatgtcaa gcccaaagct gaaactgttg cggtggtatc ctttgatact 1020 atcaaggatg cggccgcatg tgcttctaat ctgactcaga gtggtattca tttgaacgcc 1080 atggagttac tggatgaaaa tatgatgaag ttgatcaacg catctgaatc cacggacaga 1140 tgtgattggg tagagaaacc aactatgttt ttcaagattg gtgggagatc tcccaacatt 1200 gtcaatgctc ttgtggatga agttaaggct gtcgcccagt taaatcactg caacagtttt 1260 cagtttgcta aagatgatga cgaaaaattg gaattatggg aagctagaaa ggtcgcgcta 1320 tggtctgtgc tagacgctga taagagcaaa gacaaatcag ctaaaatttg gacaactgat 1380 gtagctgttc ctgtgtcgca gttcgacaag gttattcacg aaactaaaaa ggacatgcaa 1440 gctagtaagc tgatcaacgc cattgttggt catgcaggtg atggtaactt ccatgcattc 1500 atcgtctaca gaacccctga agaacacgaa acctgtagcc aacttgttga cagaatggtc 1560 aagagagcac tgaacgcaga aggcacttgc acgggtgaac acggtgttgg tattggtaaa 1620 agagagtact tgctcgaaga attaggtgaa gcacccgtcg atttgatgag aaagattaag 1680 ctagctattg acccaaagag aatcatgaac ccggacaaaa tctttaaaac tgatccaaac 1740 gagcccgcta atgattacag gtga 1764 <210> 39 <211> 591 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 39 Met Leu Lys Tyr Lys Pro Leu Leu Lys Ile Ser Lys Asn Cys Glu Ala 1 5 10 15 Ala Ile Leu Arg Ala Ser Lys Thr Arg Leu Asn Thr Ile Arg Ala Tyr 20 25 30 Gly Ser Thr Val Pro Lys Ser Lys Ser Phe Glu Gln Asp Ser Arg Lys 35 40 45 Arg Thr Gln Ser Trp Thr Ala Leu Arg Val Gly Ala Ile Leu Ala Ala 50 55 60 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gcccatattc caccaaacgt caatcttgct gaagttgccc caatcttgtg tgcaggtatc 480 actgtttata aggcgttgaa aagagccaat gtgataccag gccaatgggt cactatatcc 540 ggtgcatgcg gtggcttggg ttctctggca atccaatacg cccttgctat gggttacagg 600 gtcattggta tcgatggtgg taatgccaag cgaaagttat ttgaacaatt aggcggagaa 660 atattcatcg atttcacgga agaaaaagac attgttggtg ctataataaa ggccactaat 720 ggcggttctc atggagttat taatgtgtct gtttctgaag cagctatcga ggcttctacg 780 aggtattgta ggcccaatgg tactgtcgtc ctggttggta tgccagctca tgcttactgc 840 aattccgatg ttttcaatca agttgtaaaa tcaatctcca tcgttggatc ttgtgttgga 900 aatagagctg atacaaggga ggctttagat ttcttcgcca gaggtttgat caaatctccg 960 atccacttag ctggcctatc ggatgttcct gaaatttttg caaagatgga gaagggtgaa 1020 attgttggta gatatgttgt tgagacttct aaatga 1056 <210> 45 <211> 500 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 45 Met Thr Lys Leu His Phe Asp Thr Ala Glu Pro Val Lys Ile Thr Leu 1 5 10 15 Pro Asn Gly Leu Thr Tyr Glu Gln Pro Thr Gly Leu Phe Ile Asn Asn 20 25 30 Lys Phe Met Lys Ala Gln Asp Gly Lys 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ctttgcttct ttatgtaaga aggttggtat tccagctggt 660 gtcgtcaaca tcgttccagg tcctggtaga actgttggtg ctgctttgac caacgaccca 720 agaatcagaa agctggcttt taccggttct acagaagtcg gtaagagtgt tgctgtcgac 780 tcttctgaat ctaacttgaa gaaaatcact ttggaactag gtggtaagtc cgcccatttg 840 gtctttgacg atgctaacat taagaagact ttaccaaatc tagtaaacgg tattttcaag 900 aacgctggtc aaatttgttc ctctggttct agaatttacg ttcaagaagg tatttacgac 960 gaactattgg ctgctttcaa ggcttacttg gaaaccgaaa tcaaagttgg taatccattt 1020 gacaaggcta acttccaagg tgctatcact aaccgtcaac aattcgacac aattatgaac 1080 tacatcgata tcggtaagaa agaaggcgcc aagatcttaa ctggtggcga aaaagttggt 1140 gacaagggtt acttcatcag accaaccgtt ttctacgatg ttaatgaaga catgagaatt 1200 gttaaggaag aaatttttgg accagttgtc actgtcgcaa agttcaagac tttagaagaa 1260 ggtgtcgaaa tggctaacag ctctgaattc ggtctaggtt ctggtatcga aacagaatct 1320 ttgagcacag gtttgaaggt ggccaagatg ttgaaggccg gtaccgtctg gatcaacaca 1380 tacaacgatt ttgactccag agttccattc ggtggtgtta agcaatctgg ttacggtaga 1440 gaaatgggtg aagaagtcta ccatgcatac actgaagtaa aagctgtcag aattaagttg 1500 taa 1503 <210> 47 <211> 316 <212> PRT <213> E.coli <400> 47 Met Ser Lys Arg Lys Val Ala Ile Ile Gly Ser Gly Asn Ile Gly Thr 1 5 10 15 Asp Leu Met Ile Lys Ile Leu Arg His Gly Gln His Leu Glu Met Ala 20 25 30 Val Met Val Gly Ile Asp Pro Gln Ser Asp Gly Leu Ala Arg Ala Arg 35 40 45 Arg Met Gly Val Ala Thr Thr His Glu Gly Val Ile Gly Leu Met Asn 50 55 60 Met Pro Glu Phe Ala Asp Ile Asp Ile Val Phe Asp Ala Thr Ser Ala 65 70 75 80 Gly Ala His Val Lys Asn Asp Ala Ala Leu Arg Glu Ala Lys Pro Asp 85 90 95 Ile Arg Leu Ile Asp Leu Thr Pro Ala Ala Ile Gly Pro Tyr Cys Val 100 105 110 Pro Val Val Asn Leu Glu Ala Asn Val Asp Gln Leu Asn Val Asn Met 115 120 125 Val Thr Cys Gly Gly Gln Ala Thr Ile Pro Met Val Ala Ala Val Ser 130 135 140 Arg Val Ala Arg Val His Tyr Ala Glu Ile Ile Ala Ser Ile Ala Ser 145 150 155 160 Lys Ser Ala Gly Pro Gly Thr Arg Ala Asn Ile Asp Glu Phe Thr Glu 165 170 175 Thr Thr Ser Arg Ala Ile Glu Val Val Gly Gly Ala Ala Lys Gly Lys 180 185 190 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cggaagaaga cagaaaccta 1440 cggggcagtt ggatcggtga gccaaaagag tgttttacct tagaccttgc aacatcttct 1500 atataccgaa gaaggaagaa caagatattc ttctggtaa 1539 <210> 51 <211> 610 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 51 Met Leu Lys Ile Lys Ala Leu Phe Ser Lys Lys Lys Pro Asp Gln Ala 1 5 10 15 Asp Leu Ser Gln Glu Ser Lys Lys Pro Phe Lys Gly Lys Thr Arg Ser 20 25 30 Ser Gly Thr Asn Asn Lys Asp Val Ser Gln Ile Thr Ser Ser Pro Lys 35 40 45 Lys Ser Phe Gln Asp Lys Asn Ile Val Gln Tyr Pro Ser Val Val Ala 50 55 60 Asp Asp His His Met Lys Ser Leu Thr Asp Glu Leu Val Thr Thr Ile 65 70 75 80 Asp Ser Asp Ser Ser Pro Ser Asp Asn Ile Thr Thr Glu Asn Val Glu 85 90 95 Thr Val Thr Ser Val Pro Ala Ile Asp Val His Glu Ser Ser Glu Gly 100 105 110 Gln Leu Ser Ser Asp Pro Leu Ile Ser Asp Glu Ser Leu Ser Glu Gln 115 120 125 Ser Glu Ile Ile Ser Asp Ile Gln Asp Asp Ser Thr Asp Asp Asp Asn 130 135 140 Met Glu Asp Glu Ile Pro Glu Lys Ser Phe Leu Glu Gln Lys Glu Leu 145 150 155 160 Ile Gly Tyr Lys Leu Ile Asn Lys Ile 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gcgctgacag ccggaacacg gcggcatcag agcagccgat tgtctgttgt gcccagtcat 7200 agccgaatag cctctccacc caagcggccg gagaacctgc gtgcaatcca tcttgttcaa 7260 ttcgagtgca ttcaacatca gccatactct tcctttttca atattattga agcatttatc 7320 agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag 7380 gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cac 7413 <210> 101 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 101 aatcttgtgc tattgcagtc ctcttttata tacagtataa tacgactcac tatagggcg 59 <210> 102 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 102 atgcgaattg cgtaattcac ggcgataacg tagtattaat taaccctcac taaagggaac 60 60 <210> 103 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 103 gcccacaact tatcaagtg 19 <210> 104 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 104 ttataagaca agcgcaggg 19 <210> 105 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 105 gcccacaact tatcaagtg 19 <210> 106 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 106 ttataagaca agcgcaggg 19 <210> 107 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 107 aacactatat caatagaaac aatgtcagta aacccagaat ttatagccga tg 52 <210> 108 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 108 aggataagca gaaccgttac cagaagaata tcttgttctt ccttcttcg 49 <210> 109 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 109 aataagaagt ttggtaatat tcaattcgaa gtgttcagtc ttttacttct cttgttttaa 60 tacgactcac tatagggcg 79 <210> 110 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 110 atatgaaagt attttgtgta tatgacggaa agaaatgcag gttggtacat tacaacaatt 60 aaccctcact aaagggaac 79 <210> 111 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 111 tatgcatcca gcttctatat cg 22 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 112 ccttaggcat ttgcctagag 20 <210> 113 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 113 gtaccgggcc ccccctcgaa aaacgatggc tggtcaagtg ttgga 45 <210> 114 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 114 accgcggtgg cggccgctct agttagaaca ggccatcgat ctc 43 <210> 115 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 115 atgacacaga ctgataatcc tgtccccaac tgcggtttac tgcccgagca acggccagtg 60 aattgtaat 69 <210> 116 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 116 ttaaattacc atagtgctaa tattttctag gcggtttctg aaatactcaa ctaaagggaa 60 caaaagctgg 70 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 117 ggacagcaaa tttcgagaat 20 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 118 gtattaggaa aagagaggct 20 <210> 119 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 119 atgacacaga ctgataatcc tgtccccaac tgcggtttac tgcccgagcc cagtcacgac 60 gttgtaaaa 69 <210> 120 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 120 ttaaattacc atagtgctaa tattttctag gcggtttctg aaatactcaa aggtttcccg 60 actggaaagc 70 <210> 121 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 121 gtaccgggcc ccccctcgaa aaacgatgcc ttacactcta tccga 45 <210> 122 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 122 accgcggtgg cggccgctct agttacacag ccaatgggta ttcg 44 <210> 123 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 123 gtaccgggcc ccccctcgaa aaacgatgtc gaagcctggt cgtac 45 <210> 124 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 124 accgcggtgg cggccgctct agctattttt ctttagacag ttc 43 <210> 125 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 125 accgcggtgg cggccgctct agttatactg aaaaccttgc ttg 43 <210> 126 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 126 gtaccgggcc ccccctcgaa aaacgatgaa aactgataga ttactg 46 <210> 127 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 127 accgcggtgg cggccgctct agttagattg caaaatgagc ctgac 45 <210> 128 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 128 gtaccgggcc ccccctcgaa aaacgatgag ttcatcagca gatttcg 47 <210> 129 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 129 accgcggtgg cggccgctct agttaatcat tatcagtctg tctc 44 <210> 130 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 130 tagtggatcc atgacccacg aatcatcttc 30 <210> 131 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 131 ggtcgactta gatacccgcc tcaaagtc 28 <210> 132 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 132 tggagctcct ttcctctttt tattaacc 28 <210> 133 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 133 gttctagaat ttgttgtaaa aagtagat 28 <210> 134 <211> 798 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGK promoter <400> 134 ctttcctctt tttattaacc ttaattttta ttttagattc ctgacttcaa ctcaagacgc 60 acagatatta taacatctgc ataataggca tttgcaagaa ttactcgtga gtaaggaaag 120 agtgaggaac tatcgcatac ctgcatttaa agatgccgat ttgggcgcga atcctttatt 180 ttggcttcac cctcatacta ttatcagggc cagaaaaagg aagtgtttcc ctccttcttg 240 aattgatgtt accctcataa agcacgtggc ctcttatcga gaaagaaatt accgtcgctc 300 gtgatttgtt tgcaaaaaga acaaaactga aaaaacccag acacgctcga cttcctgtct 360 tcctattgat tgcagcttcc aatttcgtca cacaacaagg tcctagcgac ggctcacagg 420 ttttgtaaca agcaatcgaa ggttctggaa tggcgggaaa gggtttagta ccacatgcta 480 tgatgcccac tgtgatctcc agagcaaagt tcgttcgatc gtactgttac tctctctctt 540 tcaaacagaa ttgtccgaat cgtgtgacaa caacagcctg ttctcacaca ctcttttctt 600 ctaaccaagg gggtggttta gtttagtaga acctcgtgaa acttacattt acatatatat 660 aaacttgcat aaattggtca atgcaagaaa tacatatttg gtcttttcta attcgtagtt 720 tttcaagttc ttagatgctt tctttttctc ttttttacag atcatcaagg aagtaattat 780 ctacttttta caacaaat 798 <210> 135 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 135 cgaagagctc gcaaattaaa gccttcgagc 30 <210> 136 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 136 ttccagtcgg gaaacctatt taaactgtga ggacctt 37 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 137 ttttagttta tgtatgtgtt 20 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 138 ccagtcacga cgttgtaaaa 20 <210> 139 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 139 ggtcctcaca gtttaaatag gtttcccgac tggaaagc 38 <210> 140 <211> 1743 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> URA cassette <400> 140 ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgaattcgag ctcggtacct cgcgaatgca 60 tctagatatc ggatcccgac gagctgcacc gcggtggcgg ccgtatcttt tacccatacg 120 atgttcctga ctatgcgggc tatccctatg acgtcccgga ctatgcagga tcctatccat 180 atgacgttcc agattacgct gctcagtgcg gccgcctgag agtgcaccat accacagctt 240 ttcaattcaa ttcatcattt tttttttatt cttttttttg atttcggttt ctttgaaatt 300 tttttgattc ggtaatctcc gaacagaagg aagaacgaag gaaggagcac agacttagat 360 tggtatatat acgcatatgt agtgttgaag aaacatgaaa ttgcccagta ttcttaaccc 420 aactgcacag aacaaaaacc tgcaggaaac gaagataaat catgtcgaaa gctacatata 480 aggaacgtgc tgctactcat cctagtcctg ttgctgccaa gctatttaat atcatgcacg 540 aaaagcaaac aaacttgtgt gcttcattgg atgttcgtac caccaaggaa ttactggagt 600 tagttgaagc attaggtccc aaaatttgtt tactaaaaac acatgtggat atcttgactg 660 atttttccat ggagggcaca gttaagccgc taaaggcatt atccgccaag tacaattttt 720 tactcttcga agacagaaaa tttgctgaca ttggtaatac agtcaaattg cagtactctg 780 cgggtgtata cagaatagca gaatgggcag acattacgaa tgcacacggt gtggtgggcc 840 caggtattgt tagcggtttg aagcaggcgg cagaagaagt aacaaaggaa cctagaggcc 900 ttttgatgtt agcagaattg tcatgcaagg gctccctatc tactggagaa tatactaagg 960 gtactgttga cattgcgaag agcgacaaag attttgttat cggctttatt gctcaaagag 1020 acatgggtgg aagagatgaa ggttacgatt ggttgattat gacacccggt gtgggtttag 1080 atgacaaggg agacgcattg ggtcaacagt atagaaccgt ggatgatgtg gtctctacag 1140 gatctgacat tattattgtt ggaagaggac tatttgcaaa gggaagggat gctaaggtag 1200 agggtgaacg ttacagaaaa gcaggctggg aagcatattt gagaagatgc ggccagcaaa 1260 actaaaaaac tgtattataa gtaaatgcat gtatactaaa ctcacaaatt agagcttcaa 1320 tttaattata tcagttatta ccctatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 1380 aaataccgca tcaggaaatt gtagcggccg cgaatttgag cttatctttt acccatacga 1440 tgttcctgac tatgcgggct atccctatga cgtcccggac tatgcaggat cctatccata 1500 tgacgttcca gattacgcta ctagcggggg gcccggtgac gggcccgtcg actgcagagg 1560 cctgcatgca agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 1620 gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta 1680 atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 1740 cct 1743 <210> 141 <211> 2243 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> URA cassette + TPI promoter <400> 141 ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgaattcgag ctcggtacct cgcgaatgca 60 tctagatatc ggatcccgac gagctgcacc gcggtggcgg ccgtatcttt tacccatacg 120 atgttcctga ctatgcgggc tatccctatg acgtcccgga ctatgcagga tcctatccat 180 atgacgttcc agattacgct gctcagtgcg gccgcctgag agtgcaccat accacagctt 240 ttcaattcaa ttcatcattt tttttttatt cttttttttg atttcggttt ctttgaaatt 300 tttttgattc ggtaatctcc gaacagaagg aagaacgaag gaaggagcac agacttagat 360 tggtatatat acgcatatgt agtgttgaag aaacatgaaa ttgcccagta ttcttaaccc 420 aactgcacag aacaaaaacc tgcaggaaac gaagataaat catgtcgaaa gctacatata 480 aggaacgtgc tgctactcat cctagtcctg ttgctgccaa gctatttaat atcatgcacg 540 aaaagcaaac aaacttgtgt gcttcattgg atgttcgtac caccaaggaa ttactggagt 600 tagttgaagc attaggtccc aaaatttgtt tactaaaaac acatgtggat atcttgactg 660 atttttccat ggagggcaca gttaagccgc taaaggcatt atccgccaag tacaattttt 720 tactcttcga agacagaaaa tttgctgaca ttggtaatac agtcaaattg cagtactctg 780 cgggtgtata cagaatagca gaatgggcag acattacgaa tgcacacggt gtggtgggcc 840 caggtattgt tagcggtttg aagcaggcgg cagaagaagt aacaaaggaa cctagaggcc 900 ttttgatgtt agcagaattg tcatgcaagg gctccctatc tactggagaa tatactaagg 960 gtactgttga cattgcgaag agcgacaaag attttgttat cggctttatt gctcaaagag 1020 acatgggtgg aagagatgaa ggttacgatt ggttgattat gacacccggt gtgggtttag 1080 atgacaaggg agacgcattg ggtcaacagt atagaaccgt ggatgatgtg gtctctacag 1140 gatctgacat tattattgtt ggaagaggac tatttgcaaa gggaagggat gctaaggtag 1200 agggtgaacg ttacagaaaa gcaggctggg aagcatattt gagaagatgc ggccagcaaa 1260 actaaaaaac tgtattataa gtaaatgcat gtatactaaa ctcacaaatt agagcttcaa 1320 tttaattata tcagttatta ccctatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 1380 aaataccgca tcaggaaatt gtagcggccg cgaatttgag cttatctttt acccatacga 1440 tgttcctgac tatgcgggct atccctatga cgtcccggac tatgcaggat cctatccata 1500 tgacgttcca gattacgcta ctagcggggg gcccggtgac gggcccgtcg actgcagagg 1560 cctgcatgca agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 1620 gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta 1680 atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 1740 cctatttaaa ctgtgaggac cttaatacat tcagacactt ctgcggtatc accctactta 1800 ttcccttcga gattatatct aggaacccat caggttggtg gaagattacc cgttctaaga 1860 cttttcagct tcctctattg atgttacacc tggacacccc ttttctggca tccagttttt 1920 aatcttcagt ggcatgtgag attctccgaa attaattaaa gcaatcacac aattctctcg 1980 gataccacct cggttgaaac tgacaggtgg tttgttacgc atgctaatgc aaaggagcct 2040 atataccttt ggctcggctg ctgtaacagg gaatataaag ggcagcataa tttaggagtt 2100 tagtgaactt gcaacattta ctattttccc ttcttacgta aatatttttc tttttaattc 2160 taaatcaatc tttttcaatt ttttgtttgt attcttttct tgcttaaatc tataactaca 2220 aaaaacacat acataaacta aaa 2243 <210> 142 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 142 tagttttgca cccgtgtaca taagcgtgaa atcaccacaa actgtgtgta ccagtcacga 60 cgttgtaaaa 70 <210> 143 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 143 aagacagata tgacggtatt tttttcgaat ttgacggggc cttcactcat ttttagttta 60 tgtatgtgtt 70 <210> 144 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 144 cctaccactc ggactacatc 20 <210> 145 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 145 caaataaggc gggaaaagtc 20 <210> 146 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 146 gtaccgggcc ccccctcgaa aaacgatgcc acactcatat gactac 46 <210> 147 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 147 accgcggtgg cggccgctct agttaaaaca gtctattgag tcc 43 <210> 148 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 148 gtaccgggcc ccccctcgaa aaacgatgac taaaatcttc gctt 44 <210> 149 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 149 accgcggtgg cggccgctct agttaaccga ccttaactgg ag 42

Claims (20)

  1. 모세포에 비하여 락테이트 생산능이 증가된 유전적으로 조작된 효모 세포로서, 클루이베로마이세스 속 유래 외인성 gpd1 및 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 효모 세포.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 효모 세포는 추가로 ADE3, SHM2, MTD1, UTR1, YEF1, POS5, sPOS5, zwf1, 또는 그 조합의 유전자의 활성이 증가되도록 하는 유전적 변형을 포함하거나, 외인성 SthA, 외인성 LDH 변이체, 또는 그 조합을 포함하거나, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 파괴된 변이를 갖고, 상기 폴리펩티드는 EC 1.1.1.1로 분류되는 알코올 데히드로게나제 (ADH)인 것인 효모 세포.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 유전적 변형은 상기 유전자의 카피 수 증가, 상기 유전자의 발현 조절 서열의 변형, 또는 그 조합인 것인 유전적으로 조작된 효모 세포.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 ADE3, SHM2, MTD1, UTR1, YEF1, POS5, sPOS5, 및 zwf1에 의해 코딩되는 단백질은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 및 13의 아미노산 서열을 갖는 것인 효모 세포.
  5. 삭제
  6. 청구항 2에 있어서, 상기 외인성 SthA는 E.coli 유래인 것인 효모 세포.
  7. 청구항 2에 있어서, 상기 외인성 LDH 변이체는 락토바실러스 속 유래인 것인 효모 세포.
  8. 청구항 2에 있어서, 상기 외인성 LDH 변이체는 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 것인 효모 세포.
  9. 청구항 1에 있어서, 사카로마이세스 (Saccharomyces), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 캔디다 (Candida), 피치아 (Pichia), 이사첸키아 (Issatchenkia), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces), 쉬조사카로마이스세 (Shizosaccharomyces) 또는 사카로마이콥시스 (Saccharomycopsis) 속인 것인 효모 세포.
  10. 삭제
  11. 청구항 1에 있어서, 추가로 모세포에 비하여 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드, 아세트알데히드를 아세테이트로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 활성이 감소된 것인 효모 세포.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 EC 4.1.1.1로 분류되는 피루베이트 데카르복실라제(PDC)이고, 상기 DHAP를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드는 EC 1.1.1.8, EC 1.1.5.3, 또는 EC 1.1.1.94로 분류되는 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제(GPD)이고, 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 EC 1.1.2.4으로 분류되는 D-락테이트 페리시토크롬 C 옥시도리덕타제 또는 EC 1.1.2.3으로 분류되는 L-락테이트 시토크롬-c 옥시도리덕타제이고, 상기 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드는 EC 1.1.1.1로 분류되는 알코올 데히드로게나제 (ADH)이고, 상기 아세트알데히드를 아세테이트로 전환하는 폴리펩티드는 EC 1.2.1.4로 분류되는 알데히드 데히드로게나제 (ALD)인 것인 효모 세포.
  13. 청구항 1에 있어서, 추가로 모세포에 비하여 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 폴리펩티드, 방사선 감수성 보완 키나아제, 또는 그 조합의 활성이 증가된 것인 효모 세포로서, 상기 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 폴리펩티드는 EC 1.2.1.10으로 분류되는 아세틸화 아세트알데히드 데히드로게나제 인 것이 효모 세포.
  14. 효모 세포에 클루이베로마이세스 속 유래 외인성 gpd1 및 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함하는, 효모 세포 중 락테이트 생산을 증가시키는 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 효모 세포의 ade3, shm2, mtd1, utr1, yef1, POS5, sPOS5, zwf, 또는 그 조합을 과발현시키거나 효모 세포에 외인성 SthA 유전자, 외인성 ldh의 변이체를 도입하는 단계, 또는 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 파괴하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 청구항 14에 있어서, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 아세트알데히드를 아세테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합을 파괴하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  17. 청구항 14에 있어서, 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 폴리펩티드를 도입하는 단계, 및 방사선 감수성 보완 키나아제를 과발현시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  18. 청구항 14에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애인 것인 방법.
  19. 청구항 1의 효모 세포를 배양하여 락테이트를 생산하는 단계를 포함하는 락테이트를 생산하는 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 배양물로부터 락테이트를 회수하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
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