KR102227976B1 - Ｎａｄｈ 데히드로게나제가 불활성화된 효모 세포 및 그를 이용한 락테이트를 생산하는 방법 - Google Patents

Ｎａｄｈ 데히드로게나제가 불활성화된 효모 세포 및 그를 이용한 락테이트를 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제의 활성이 감소된 효모 세포 및 그를 이용한 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.

Description

ＮＡＤＨ 데히드로게나제가 불활성화된 효모 세포 및 그를 이용한 락테이트를 생산하는 방법{Yeast cell with inactivated NADH dehydrogenase and method of producing latate using the same}
NADH 데히드로게나제가 불활성화된 효모 세포 및 그를 이용한 락테이트를 생산하는 방법에 관한 것이다.
락테이트는 식품, 제약, 화학, 전자 등 다양한 산업 분야에서 폭넓게 사용되는 유기산이다. 락테이트는 무색, 무취이고 물에 잘 용해되는 저휘발성 물질이다. 락테이트는 인체에 독성이 없어 향미제, 산미제, 보존제 등으로 활용되고 있고, 또한 환경친화적으로 대체 고분자 물질이고, 생분해성 플라스틱인 폴리락틱산 (polylactic acid: PLA)의 원료이다.
PLA는 기술적으로는 고분자 중합을 위해 다이머인 락티드 (lactide)로 전환하여 개환 중합된 (ring-open polymerization) 폴리에스터계 수지이며, 필름, 시트, 섬유, 사출 등의 다양한 가공이 가능하다. 따라서, PLA는 폴리에틸렌 (PE), 폴리프로필렌 (PP), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET), 폴리스틸렌 (PS) 등 기존 범용 석유화학 플라스틱을 광범위하게 대체할 수 있는 바이오 플라스틱으로서 최근 수요가 크게 증가하고 있다.
또한, 락테이트는 수산기와 카르복실기를 동시에 갖고 있어 반응성이 매우 크고, 그에 따라 락테이트 에스테르, 아세트알데이드, 프로필렌글리콜 등 공업적으로 중요한 화합물로의 전환이 용이하여, 화학공업 분야에 있어서도 차세대 대체 화학 원료로서 주목받고 있다.
현재, 락테이트는 산업적으로 석유화학적 합성 공정과 생물공학적 발효 공정에 의해 생산되고 있다. 석유화학적 합성 공정은, 원유에서 유래된 에틸렌을 산화시키고, 아세트알데히드를 거쳐 시안화수소 첨가 반응에 의해 락토니트릴을 만든 후, 증류시켜 정제하고, 염산이나 황산을 사용하여 가수분해함으로써 제조된다. 또한, 생물공학적 발효 공정은 전분, 수크로스, 말토스, 글루코스, 프럭토스, 자일로스 등의 재생가능한 탄수화물을 기질로 하여 락테이트를 제조할 수 있다.
따라서, 이러한 종래 기술에 의하더라도, 락테이트를 효율적으로 생산할 수 있는 균주 및 그를 이용한 락테이트 생산 방법이 요구되고 있다.
일 양상은 락테이트 생산능이 향상된 효모 세포를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 효모 세포를 이용하여 락테이트를 효율적으로 생산하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 락테이트 생산 효모 중의 락테이트 생산을 증진시키는 방법을 제공한다.
일 양상은 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 (external mitochondral NADH dehydrogenase)와 약 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 단백질의 활성이 그 모세포 (parent cell) (예를 들면, 동일한 타입의 유전적으로 조작되지 않은 효모 세포)에 비하여 감소되어 있고, 락테이트 생산능을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 세포, 단백질, 또는 효소의 활성의 검출가능한증가를 나타낼 수 있다. "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 주어진 변형 (modification)을 갖지 않은 세포, 단백질, 또는 효소 (예, 본래 또는 "야생형 (wild-type)" 세포, 단백질, 또는 효소)와 같은, 동일한 타입의 비교 세포, 단백질, 또는 효소의 수준 보다 더 높은 변형된 (예, 유전적으로 조작된) 세포, 단백질, 또는 효소의 활성을 나타낼 수 있다. "세포의 활성"이란 세포의 특정 단백질 또는 효소의 활성을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 상기 변형된 또는 조작된 세포, 단백질, 또는 효소의 활성은 동일 타입의 조작되지 않은 세포, 단백질, 또는 효소, 예를 들면, 야생형 세포, 단백질, 또는 효소의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 세포 중 특정 단백질 또는 효소의 활성은 모세포, 예를 들면, 조작되지 않은 세포 중의 동일 단백질 또는 효소의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 단백질 또는 효소의 증가된 활성을 갖는 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다.
반면, 본 명세서에서 사용된 용어 "불활성화된(inactivated)" 또는 "감소된(decreased)" 활성은 모세포 (예, 유전적으로 조작되지 않은 세포) 중에서 측정된 것보다 더 낮은 효소 또는 폴리펩티드의 활성을 갖는 세포를 나타낸다. 또한, "불활성화된(inactivated)" 또는 "감소된(decreased)" 활성은 본래의 (original) 또는 야생형 (wild-type) 효소 또는 폴리펩티드보다 더 낮은 활성을 갖는 분리된 효소 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 불활성화된 또는 감소된 활성은 활성이 없는 것 (no actitivity)를 포함한다. 예를 들면, 변형된 (예, 유전적으로 조작된) 세포 또는 효소에 대한 기질에서 생성물로의 효소 전환 활성이 상기 변형을 갖지 않은 세포 또는 효소, 예를 들면, 모세포 또는 "야생형 (wild-type)" 세포 또는 효소의 효소 전환활성에 비하여 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다. 효소 또는 세포의 감소된 효소 활성은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 불활성화 또는 감소는 변형되지 않은 유전자를 갖는 세포, 예를 들면, 모세포 또는 야생형 세포에 비하여, 효소가 발현되더라도 효소의 활성이 없거나 감소된 경우, 효소를 코딩하는 유전자가 발현되지 않거나 발현되더라도 본래 유전자 조작이 되지 않은 유전자에 비하여 발현량이 감소된 경우를 포함한다.
용어 "모세포 (parent cell)"는 본래 세포 (original cell), 예를 들면, 조작된 효모 세포에 대하여 동일 타입의 유전적으로 조작되지 않은 세포를 나타낸다. 특정한 유전적 변형에 대하여, 상기 "모세포"는 상기 특정 유전적 변형을 갖지 않은 세포이지만, 다른 상항에 대하여는 동일한 것일 수 있다. 따라서, 상기 모세포는 주어진 단백질 (예를 들면, 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제와 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질)의 불활성화된 또는 감소된 활성을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포를 생산하는데 출발 물질 (starting material)으로 사용된 세포일 수 있다. 더 설명하면, 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제를 코딩하는 유전자가 변형되어 세포 중 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 활성이 감소된 효모 세포에 대하여, 상기 모세포는 변형된지 않은 "야생형" 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 유전자를 포함하는 효모 세포일 수 있다. 동일한 비교가 다른 유전적 변형에도 적용된다.
상기 효소의 활성은 상기 효소를 코딩하는 유전자의 결실(deletion) 또는 파괴 (disruption)에 의하여 불활성화 또는 감소될 수 있다. 유전자의 상기 "결실 (deletion)" 또는 "파괴 (disruption)"는 상기 유전자의 일부 또는 전체의 돌연변이, 또는 프로모터 또는 터미네이터와 같은 상기 유전자의 조절 서열의 일부 또는 전체의 돌연변이로서, 자연적 유전자 산물에 비하여 상기 유전자가 발현되지 않거나 감소된 수준으로 발현되거나, 또는 활성이 없거나 감소된 활성을 갖는 유전자 산물 (예, 효소)을 발현하도록 하는 것일 수 있다. 상기 돌연변이는 상기 유전자의 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 치환, 삽입, 결실 또는 전환을 포함할 수 있다. 상기 유전자의 결실 또는 파괴는 상동 재조합, 지향된 돌연변이유발 (directed mutagenesis), 또는 분자 진화 (molecular evolution)과 같은 유전적 조작법에 의해 달성될 수 있다. 세포가 복수 개의 동일 유전자, 또는 유전자의 2 이상의 파라로그 (paralogs)를 포함한 경우, 하나 이상의 유전자는 제거 또는 파괴될 수 있다. 예를 들면, 상기 효소의 불활성화 또는 파괴는 상동 재조합에 의하여 야기될 수 있으며, 또는 상기 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 세포에 형질전환하고, 세포를 배양하여 상기 서열이 세포의 내인성 유전자와 상동 재조합이 일어나도록 하여 상기 유전자를 결실 또는 파괴되도록 한 후, 상동 재조합이 일어난 세포를 선별 마커에 의해 선별함으로써 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유전자"는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미하며, 5'-비코딩 서열(5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence)의 조절 서열(regulatory sequence)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가 또는 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 핵산이 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 프로그램의 일례로 BLASTN(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM (DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어서 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50%이상, 55%이상, 60%이상, 65%이상, 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100% 등을 포함하는 서열 동일성이다.
상기 효모 세포는 아스코미코타 (Ascomycota)에 속하는 것일 수 있다. 상기 아스코미코타는 사카로미세타세 (Saccharomycetaceae)일 수 있다. 상기 사카로미세타세는 사카로미세스 속 (Saccharomyces genus), 클루이베로미세스 속 (Kluyveromyces genus), 칸디다 속 (Candida genus), 피치아 속 (Pichia genus), 이사첸키아 속 (Issatchenkia genus), 데바리오미세스 속 (Debaryomyces genus), 지고사카로미세스 속 (Zygosaccharomyces genus), 또는 사카로미콥시스 속 (Saccharomycopsis genus)일 수 있다. 상기 사카로마이세스 속은 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae), 사카로마이세스 바야누스 (S. bayanus), 사카로마이세스 보울라디 (S. boulardii), 사카로마이세스 불데리 (S. bulderi), 사카로마이세스 카리오카누스 (S. cariocanus), 사카로마이세스 카리오쿠스 (S. cariocus), 사카로마이세스 체발리에리 (S. chevalieri), 사카로마이세스 다이레넨시스 (S. dairenensis), 사카로마이세스 엘립소이데우스 (S. ellipsoideus), 사카로마이세스 유바야뉴스 (S. eubayanus), 사카로마이세스 엑시거스 (S. exiguus), 사카로마이세스 플로렌티누스 (S. florentinus), 사카로마이세스 클루이베리 (S. kluyveri), 사카로마이세스 마티니에 (S. martiniae), 사카로마이세스 모나센시스 (S. monacensis), 사카로마이세스 노르벤시스 (S. norbensis), 사카로마이세스 파라독서스 (S. paradoxus), 사카로마이세스 파스토리아누스 (S. pastorianus), 사카로마이세스 스펜서로룸 (S. spencerorum), 사카로마이세스 투리센시스 (S. turicensis), 사카로마이세스 우니스포루스 (S. unisporus), 사카로마이세스 우바룸 (S. uvarum), 또는 사카로마이세스 조나투스 (S. zonatus)일 수 있다. 상기 클루이베로미세스 속은 클루이베로미세스 터모톨레란스 (K. thermotolerans)일 수 있다. 상기 칸디다 속은 칸디다 글라브라타 (C. glabrata)일 수 있다. 지고사카로미세스 속은 지고사카로미세스 속은 지고사카로미세스 바일리 (Z. bailli) 또는 지고사카로미세스 로욱시 (Z. rouxii)일 수 있다.
상기 효모 세포 (예, 유전적으로 조작된 효모 세포)는 락테이트 생산능을 갖는 것일 수 있다. 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제의 활성은 락테이트를 생산하는데, 또는 락테이트를 생산하는 효모 세포의 락테이트 생산을 개선하는데, 충분한 정도로 불활성화 또는 감소되어 있는 것일 수 있다.
상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제는 EC.1.6.5.9 또는 EC. 1.6.5.3으로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 NADH 데히드로게나제는 유형 Ⅱ NADH:유비퀴논 옥시도리덕타제 (type Ⅱ NADH:ubiquinone oxidoreductase)일 수 있다. 상기 NADH 데히드로게나제는 세포질 (cytoplasm)을 향하는 내부 미토콘드리아막의 외부면에 위치한 것일 수 있다. 상기 NADH 데히드로게나제는 시토졸 NADH (cytosolic NADH)의 NAD+로의 산화를 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 NADH 데히드로게나제는 해당과정에 의해 형성된 시토졸 NADH의 재산화시키는 것일 수 있다. 상기 NADH 데히드로게나제는 시토졸 NADH를 미토콘드리아 호흡 연쇄 (mitochondrial respiratory chain)에 제공하는 것일 수 있다. 상기 NADH 데히드로게나제는 NDE1, NDE2, 또는 그의 조합일 수 있다. 상기 NADH 데히드로게나제는 미토콘드리아 내부에 위치하여 작용하는 인터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 (internal mitochondral NADH dehydrogenase) NDI1과 구별되는 것일 수 있다. 상기 NDE1 및 NDE2 각각은 개별적으로, 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 NDE1을 코딩하는 유전자 및 상기 NDE2를 코딩하는 유전자 각각은 개별적으로 서열번호 3 및 4의 뉴클레오티드 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포 (예, 유전적으로 조작된 효모 세포)에 있어서, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 활성이 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다. 상기 효모 세포 (예, 유전적으로 조작된 효모 세포)에 있어서, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드의 활성; 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성; 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성; 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드의 활성 및 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성; 또는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드의 활성 및 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성 및 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다.
상기 효모 세포 (예, 유전적으로 조작된 효모 세포)는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다. 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 EC 4.1.1.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase: 예, PDC)를 코딩하는 것일 수 있다. PDC의 PDC1, PDC5, 및 PDC6를 포함한다. 상기 효모 세포 (예, 유전적으로 조작된 효모 세포)에 있어서, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 알콜 데히드로게나제 (alcohol dehydrogenase: 예, ADH)의 활성이 불활성화 또는 감소된 것일 수 있다. ADH의 예는 ADH1, ADH2, ADH3, ADH4, ADH5, ADH6, 및 ADH7을 포함한다. 상기 알콜 데히드로게나제는 NADH 의존성인 것일 수 있다.
상기 효모 세포 (예, 유전적으로 조작된 효모 세포)는 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 시토크롬 c-의존성 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 락테이트 시트크롬-c 옥시도리덕타제 (CYB2)일 수 있다. 상기 락테이트 시트크롬 c-옥시도리덕타제는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.4, 또는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.3으로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 6의 아미노산 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포 (예, 유전적으로 조작된 효모 세포)는 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다. 상기 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드 (예, GPD)는 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제는 NADH의 NAD+로의 산화를 이용하여 디히록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로의 환원을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 GPD1은 EC 1.1.1.8에 속하는 것일 수 있다. 상기 GPD의 예는 GPD1 및 GPD2를 포함한다. 상기 GPD는 서열번호 7의 아미노산 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 GPD를 코딩하는 유전자는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포 (예, 유전적으로 조작된 효모 세포)는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다. 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성은 락테이트를 생산하는데, 또는 락테이트를 생산하는 효모 세포의 락테이트 생산을 개선하는데, 충분한 정도로 증가된 것일 수 있다. 따라서, 상기 효모 세포 (예, 유전적으로 조작된 효모 세포)는 피루베이트로부터 락테이트를 생산할 수 있는 것일 수 있다.
상기 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현의 증가에 의하여 증가될 수 있다. 발현은 상기 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 (예, 외래 유전자)의 상기 효모 세포에의 도입, 및/또는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 내재적 유전자의 발현을 증가시키는 것에 의하여 증가될 수 있다. 상기 발현의 증가는 유전자의 카피 수가 증가되거나 상기 유전자의 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 상기 유전자 카피 수의 증가는 내인성 유전자의 증폭 또는 외인성 유전자의 도입에 의한 것일 수 있다. 상기 유전자의 조절 영역의 변이는 내인성 유전자의 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 상기 유전자의 상기 조절 영역의 돌연변이는 본래 프로모터 영역을, 더 강한 프로모터, 예를 들면, CYC 프로모터, TEF 프로모터, GPD 프로모터, 및 ADH 프로모터로의 치환을 포함할 수 있다. CYC 프로모터, TEF 프로모터, GPD 프로모터, 및 ADH 프로모터는 각각, 서열번호 17, 18, 19 및 20의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 치환은 상동 재조합, 지향된 돌연변이유발 (directed mutagenesis), 또는 분자 진화 (molecular evolution)과 같은 유전적 조작법에 의해 달성될 수 있다. 상기 치환은 LDH 유전자와 같은 다른 유전자의 도입과 함께 또는 도입 없이 달성될 수 있다. 상기 외래 유전자는 동종 (homogenous) 또는 이종 (heterogenous) 유전자일 수 있다.
피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드는 락테이트 데히드로게나제 (예, LDH)일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 피루베이트를 락테이트로의 전환을 촉매할 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 NAD(P)-의존성 효소일 수 있으며, 또한 L-락테이트 또는 D-락테이트에 각각 작용할 수 있다. 상기 NAD(P)-의존성 효소는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.1.27, 또는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.1.28 로 분류되는 효소일 수 있다.
상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 박테리아, 효모, 진균, 및 동물, 예를 들면, 설치류, 포유동물, 양서류 (amphibian) 및 석형류 (Sauropsida)로부터 유래한 것을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 일본자라 (Pelodiscus sinensis japonicus), 오리너구리 (Ornithorhynchus anatinus), 병코돌고래 (Tursiops truncatus), 노르웨이산집쥐 (Rattus norvegicus), 또는 개구리(Xenopus laevis)로부터 선택되는 1종 이상의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일본자라로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 오리너구리로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 병코돌고래로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 및 노르웨이산집쥐로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제는 각각 서열번호 11; 서열번호 12; 서열번호 13; 서열번호 14; 및 서열번호 59 및 61의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 각각 서열번호 11; 서열번호 12; 서열번호 13; 서열번호 14; 및 서열번호 59 및 61의 아미노산 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 15, 56, 57, 58, 60, 또는 62의 뉴클레오티드 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다.
상기 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 박테리아, 효모, 진균, 및 동물, 예를 들면, 설치류, 포유동물, 양서류 (amphibian) 및 석형류 (Sauropsida)로부터 유래한 LDH 유전자를 포함하는 벡터로부터 발현될 수 있다. 상기 벡터는 복제개시점, 프로모터, 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 터미네이터를 포함할 수 있다. 상기 복제 개시점은 효모 자가복제 서열 (autonomous replication sequence, ARS)을 포함할 수 있다. 상기 효모 자가복제서열은 효모 동원체 서열 (centrometric sequence, CEN)에 의해 안정화될 수 있다. 상기 프로모터는 CYC 프로모터, TEF 프로모터, GPD 프로모터, 및 ADH 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 CYC 프로모터, TEF 프로모터, GPD 프로모터, 및 ADH 프로모터는 각각 서열번호 17, 18, 19, 및 20의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 터미네이터는 PGK1 (phosphoglycerate kinase 1), CYC1 (cytochrome c transcription), 및 GAL1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. CYC1 터미네이터는 서열번호 21의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 벡터는 선별 마커를 더 포함할 수 있다.
LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 효모 세포 (예, 유전적으로 조작된 효모 세포)의 게놈에 포함될 수 있다. LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포 내에서 활성 단백질을 생산하기 위해 기능하는 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 "기능성 (functional)"인 것으로 고려된다. LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 L-LDH 또는 D-LDH의 생산에 특이적이어서, 상기 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 효모 세포는 L-락테이트 거울상 이성질체 또는 D-락테이트 거울상 이성질체, 그 조합, 또는 그의 염을 생산할 수 있다.
상기 효모 세포는 단일 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 복수의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 예를 들면, 2 내지 10 카피 수를 포함할 수 있다. 상기 효소 세포는, 예를 들면, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 또는 2 내지 3 카피의 LDH 유전자를 포함할 수 있다. 상기 효모 세포가 복수의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 각각의 폴리뉴클레오티드는 동일한 폴리뉴클레오티드의 카피이거나 둘 이상의 상이한 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 카피를 포함할 수 있다. 외인성 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 복수의 카피는 숙주 세포의 게놈 내에 동일한 유전자좌(locus), 또는 여러 유전자좌에 포함될 수 있다.
또한 상기 효모 세포는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 활성이 불활성화되거나 감소되어 있고, 및 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 증가되어 있는 것인 사카로마이세스 세레비지애일 수 있다. 또한, 상기 효모 세포에 있어서, G3P를 글리세롤로 전환하는 것을 촉매하는 폴리펩티드 (예, GPP1 및 GPP2)의 활성, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 것을 촉매하는 폴리펩티드 (예, ADH)의 활성, 또는 그 조합이 불활성화 또는 감소된 것일 수 있다. 상기 사카로마이에스 세레비지애는 KCTC 12415BP 균주로부터 제작될 수 있다.
상기 효모 세포는 락테이트 생산능이 있고 락테이트를 다른 산물로 전환하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 효모 세포는 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 (external mitochondral NADH dehydrogenase)의 활성이 불활성화 또는 감소되어 있고, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 활성이 불활성화되거나 감소되어 있고, 및 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 증가되어 있는 것인 사카로마이세스 세레비지애일 수 있다.
다른 양상은 상기한 효모 세포를 배양하는 단계; 및 배양물로부터 락테이트를 회수하는 단계;를 포함하는, 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 (external mitochondral NADH dehydrogenase)와 약 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 단백질의 활성이 그 모세포 (parent cell)에 비하여 감소되어 있고, 락테이트 생산능을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포로서, 락테이트를 다른 산물로 전환하는 폴리펩티드 유전자를 더 포함하는 효모 세포를 배양하는 단계; 및 배양물로부터 상기 산물을 회수하는 단계;를 포함하는, 락테이트 유래 산물을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 배양은 탄소원, 예를 들면, 글루코스를 함유하는 배지에서 수행될 수 있다. 효모 세포 배양에 사용되는 배지는 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 숙주 세포의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다.
상기 배양에 사용되는 배지는 특정한 효모 세포의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 염, 미량 원소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다.
상기 유전적으로 조작된 효모 세포에서 락테이트를 수득하기 위하여 배양 조건을 적절히 조절할 수 있다. 상기 세포는 증식을 위하여 호기성 조건에서 배양할 수 있다. 그 후 락테이트를 생산하기 위하여 상기 세포를 미세호기 또는 혐기 조건에서 배양할 수 있다. 상기 혐기 조건 또는 미세호기 조건은 용존산소 (dissolved oxygen: DO) 농도가 0% 내지 10%, 예를 들면 0 내지 8%, 0 내지 6%, 0 내지 4%, 또는 0 내지 2%일 수 있다. 용어 "미세호기 조건 (microaerobic condition)"은 배지 중의 산소 농도가 배지가 통상의 대기 공기와 접촉된 때 얻어지는 산소 농도 보다 낮은 상태를 나타낸다. 산소 농도의 낮은 정도는 예를 들면, 배지가 통상의 대기 공기와 접촉되도록 둔 경우 얻어진 배지 중의 산소 농도 수준의 약 10%이하, 5%이하, 1%이하, 0.1%이하, 0.001%이하, 약 0.01% 내지 약 10%, 약 0.01% 내지 약 5%, 약 0.01% 내지 약 1%, 약 0.01% 내지 약 0.1%, 약 0.1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 9%, 약 2% 내지 약 8%, 약 3% 내지 7%, 또는 약 4% 내지 약 6%일 수 있다.
용어, "배양 조건"은 효모 세포를 배양하기 위한 조건을 의미한다. 이러한 배양 조건은 예를 들어, 효모 세포가 이용하는 탄소원, 질소원 또는 산소 조건일 수 있다. 효모가 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류가 포함된다. 구체적으로 글루코오즈, 프럭토오즈, 만노오즈, 또는 갈락토오즈가 이용될 수 있다. 효모 세포가 이용할 수 있는 질소원은 유기 질소 화합물, 또는 무기 질소 화합물일 수 있다. 구체적으로 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 또는 암모늄염 일 수 있다. 효모 세포를 배양하는 산소 조건에는 정상 산소 분압의 호기성 조건, 미세호기 조건 예를 들면, 통상의 대기 공기와 접촉되도록 둔 경우 얻어진 배지 중의 산소 농도 수준의 약 0.1% 내지 약 10%, 약 0.1% 내지 약 8%, 약 0.1% 내지 약 6%, 약 0.1% 내지 4%, 약 0.1% 내지 약 2%, 약 0.1% 내지 약 1%, 약 1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 8%, 약 4% 내지 약 6%, 약 2% 내지 약 10%, 약 4% 내지 10%, 약 6% 내지 약 10%, 약 8% 내지 약 10%, 약 2% 내지 8%, 약 2% 내지 약 6%, 또는 산소가 없는 혐기성 조건이 있다. 대사 경로는 효모 세포가 실제로 이용 가능한 탄소원 및 질소원에 맞추어 수정될 수 있다.
배양물로부터의 락테이트의 분리는 당해 기술분야에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리 방법은 원심분리, 여과, 이온교환크로마토그래피 또는 결정화 등의 방법일 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을 이온교환크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.
일 양상에 따른 효모 세포에 의하면, 락테이트를 높은 수율로 생산할 수 있다.
일 양상에 따른 락테이트를 생산하는 방법에 의하면, 락테이트를 높은 수율로 생산할 수 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 락테이트 생산능을 가진 효모 세포의 락테이트 생산 경로를 나타낸 도면이다.
도 2는 p416-CCW12p-LDH 벡터를 나타낸 도면이다.
도 3은 pUC57-ura3HA 벡터를 나타내는 도면이다.
도 4는 pUC57-ura3HA-CCW12p-LDH 벡터를 나타내는 도면이다.
도 5는 pUC19-HIS3 벡터를 나타내는 도면이다.
도 6은 pUC19-CCW12p-LDH-His3 벡터를 나타내는 도면이다.
도 7은 일 구체예에 따른 KCTC12415BP+LDH, KCTC12415BP+LDHㅿNDE1 및KCTC12415BP+LDHㅿNDE1ㅿNDE2의 발효 조건에서 락테이트의 생산성을 나타내는 도면이다.
도 8의 A, B, 및 C는 각각 발효 조건에서 KCTC12415BPㅿtrp1+LDH, 변이균주 KCTC12415BPㅿtrp1+LDHㅿNDE1 및 KCTC12415BPㅿtrp1+LDHㅿNDE1ㅿNDE2의 배양 특성을 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 락테이트의 고효율 생산을 위한 균주 제작 및 발현 벡터의 제작
사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (MAT α ura3 -52; trp1 -289; leu2 -3,112; his3 ㅿ 1; MAL2 -8 C ; SUC2 , EUROSCARF accession number: 30000B)를 락테이트 생산 균주로 이용하여, 주요 부산물인 에탄올과 글리세롤 생산 경로 차단을 위해, 알코올 발효의 주요 효소인 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase: pdc1) 유전자, 글리세롤 생합성의 주요 효소인 NAD-의존성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 (NAD-dependent glycerol-3-phosphate dehydrogenase: gpd1) 유전자, 및 락테이트 분해 효소 lactate lyase인 L-락테이트 시토크롬-c 옥시도리덕타제 (L-lactate cytochrome-c oxidoreductase2: cyb2) 유전자를 상동 재조합에 의하여 불활성화시켰다.
(1.1) L- LDH 과발현 벡터 및 pdc1 , gpd1 , 및 cyb2 유전자의 불활성화 벡터의 제조
(1.1.1) L- LDH 과발현 벡터 제조
L-ldh 과발현을 위해 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 22과 23의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 얻어진 CCW12 프로모터 PCR 절편을 SacI과 XbaI으로 절단하고 이를 SacI과 XbaI으로 절단한 p416-GPD (ATCC 87360TM)에 도입하여 p416-CCW12p 벡터를 제작하였다.
그 후, 일본 자라 (Pelodiscus sinensis japonicus) 유래의 L-ldh(서열번호 11)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 24와 25의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편과 제작된 p416-CCW12p를 BamHI 과 SalI으로 절단하고 이들을 서로 라이게이션하여 L-ldh 발현 벡터인 p416-CCW12p-LDH을 제작하였다.
또한, 상기 L-ldh 발현 벡터는 서열번호 16의 효모 자가복제 서열(ARS)/효모 동원체 서열(CEN), 서열번호 21의 CYC1 터미네이터 및 서열번호 11의 일본 자라 유래의 L-ldh 유전자를 포함한다. 또한, 상기 CCW12 프로모터는 서열번호 17의 CYC 프로모터, 서열번호 19의 GPD 프로모터, 및 서열번호 20의 ADH 프로모터로 치환될 수 있다.
도 2는 p416-CCW12p-LDH 벡터를 나타낸 도면이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 벡터에 일본 자라 유래의 LDH가 도입되어 있다.
(1.1.2) 유전자 교환 벡터 제조
PDC1, CYB2, 및 GPD1 유전자를 상동성 재조합 방법으로 결실하는 동시에 L-ldh 유전자를 삽입하기 위하여 유전자 교환벡터를 다음과 같이 제작하였다. 도 3은 pUC57-ura3HA 벡터 (서열번호 52)를 나타내는 도면이다. 3HA는 HA (haemagglutinin) 유전자의 3 반복을 나타낸다. 도 4는 pUC57-ura3HA-CCW12p-LDH 벡터를 나타내는 도면이다.
제작된 p416-CCW12p-LDH를 주형으로 하고, 서열번호 26과 27의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편과 제작된 pUC57-ura3HA 벡터를 SacI으로 절단하고 이들을 서로 라이게이션하여 pUC57-ura3HA-CCW12p-LDH 벡터를 제작하였다.
PDC1 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-ura3HA-CCW12p-LDH를 주형으로 하고 서열번호 28와 29의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 PDC1 유전자 결실 카세트를 제작하였다.
CYB2 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-ura3HA-CCW12p-LDH를 주형으로 하고 서열번호 30과 31의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 CYB2 유전자 결실 카세트를 제작하였다.
GPD1 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-ura3HA-CCW12p-LDH를 주형으로 하고 서열번호 32과 33의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 GPD1 유전자 결실 카세트를 제작하였다.
(1.2) pdc1 , gpd1 , 및 cyb2 유전자의 불활성화
사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D에서 pdc1이 결실된 변이균주를 다음과 같이 제작하였다. 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D를 YPD 한천 (10g yeast extract, 20g/L peptone, 20g/L 포도당 및 20g/L 한천) 플레이트에 도말하여 약 24시간 동안 약 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체 배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4-5시간 후, OD600이 약 0.5 정도가 되면 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 약 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그 후, 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 약 15(v/v)% 글리세롤이 첨가된 약 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 약 100 ul씩 분주하였다.
pdc1 유전자 제거를 위해, 실시예 1.1.2에서 제작된 PDC1 결실 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 및 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 배양액을 uracil 무첨가 최소 한천 (YSD (Yeast Synthetic Drop-out) 배지: 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids (Sigma-Aldrich: Cat. no. Y0626), 1.4g/L Yeast synthetic drop-out without uracuk (Sigma-Aldrich: Cat. no. Y1501), 20g/L glucose, 및 20g/L 한천)에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 우라실 무첨가 최소 한천 플레이트에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 pdc1 결실을 확인하기 위해 서열번호 34과 35의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 pdc1 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh+ura3)을 수득하였다.
또한, 상기 유전자 치환 벡터를 이용한 추가 유전자 결실을 위해 상기 CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh+ura3) 균주 제작을 위해 도입된 선발 마커 URA3 유전자를 상기 균주로부터 다음과 같이 제거하였다. 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh+ura3)를 YPD 액체 배지 (10 g/L Yeast extract, 20 g/L peptone and 20 g/L glucose) 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 30℃에서 배양한 후, 5-FOA 함유 YSD 플레이트 (YSD 배지: 6.7 g/L of yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L of yeast synthetic drop-out, 20 g/L glucose, 1ug/L of 5-fluoroorotic acid (5-FOA) 및 20 g/L of agar)에 도말하여 약 24시간 동안 30℃에서 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 10개 (URA3 pop-out 균주)를 선별해 다시 5-FOA 함유 YSD 배지 플레이트에 옮김과 동시에 YPD 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 URA3 pop-out 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 URA3 결실을 확인하기 위해 서열번호 34과 35의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 URA3 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh)을 수득하였다.
사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (Δpdc1::ldh)에서 cyb2가 결실된 변이 균주를 다음과 같이 제작하였다. 수득된 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (Δpdc1::ldh)를 YPD 한천 (10 g/L of yeast extract, 20 g/L of peptone, 20 g/L of glucose, and 20 g/L agar) 플레이트에 도말하여 약 24시간 동안 약 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체 배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4-5시간 후, OD600이 약 0.5 정도가 되면 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 약 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그 후, 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 약 15(v/v)% 글리세롤이 첨가된 약 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 약 100 ul씩 분주하였다.
cyb2 유전자 제거를 위해, 상기 pdc1 유전자 결실과 동일한 방법으로 실시예 1.1.2에서 제작된 cyb2 결실 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 및 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 배양액을 uracil 무첨가 최소 한천 (YSD medium, containing 6.7 g/L of yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L of yeast synthetic drop-out without uracil, 20 g/L glucose, and 20 g/L of agar) 플레이트에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 우라실 무첨가 최소 한천 플레이트에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 cyb2 결실을 확인하기 위해, 서열번호 36과 37의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 cyb2 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh ㅿcyb2::ldh +ura3)을 수득하였다.
또한, 상기 유전자 결실 벡터를 이용한 추가 유전자 결실을 위해 cyb2 결실을 위해 이용한 선별 마커인 URA3 유전자를 상기 기재한 URA3 pop-out 방법을 이용하여 제거하였다. 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (Δpdc1::ldh Δcyb2::ldh +ura3)를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 30℃에서 배양한 후, 5-FOA (YSD, containing 6.7 g/L of yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L of yeast synthetic drop-out, 20 g/L glucose, , 1 ug/L of 5-fluoroorotic acid, and 20 g/L agar)에 도말하여 약 24시간 동안 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (URA3 pop-out 균주) 10개를 선별해 다시 5-FOA 한천 배지에 옮김과 동시에 YPD 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 URA3 pop-out 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 URA3 결실을 확인하기 위해 서열번호 36과 37의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 URA3 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (Δpdc1::ldh Δcyb2::ldh)을 수득하였다.
사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldhΔcyb2::ldh)에서 gpd1이 결실된 변이균주를 다음과 같이 제작하였다. 수득된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (Δpdc1::ldhΔcyb2::ldh)를 YPD 한천 (10 g/L of yeast extract, 20 g/L of peptone, 20 g/L of glucose, and 20 g/L agar) 배지 플레이트에 도말하여 약 24시간 동안 약 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4-5시간 후, OD600이 약 0.5 정도가 되면 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 약 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그 후, 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 약 15(v/v)% 글리세롤이 첨가된 약 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 약 100 ul씩 분주하였다.
gpd1 유전자 제거를 위해, 상기 pdc1 및 cyb2 유전자 결실과 동일한 방법으로 실시예 1.1.2에서 제작된 gpd1 결실 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 및 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 배양액을 uracil 무첨가 최소 한천 (YSD, containing 6.7 g/L of yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L of yeast synthetic drop-out without uracil, 20 g/L glucose, and 20 g/L of agar) 배지 플레이트에 도말하여 30℃에서 24시간 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 uracil 무첨가 최소 한천 배지 플레이트에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 gpd1 결실을 확인하기 위해 서열번호 38과 39의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 gpd1 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh ㅿcyb2::ldhㅿgpd1::ldh +ura3)을 수득하였다.
또한, 상기 유전자 결실 벡터를 이용한 추가 유전자 결실을 위해 gpd1 결실을 위해 이용한 선별 마커인 URA3 유전자를 상기 기재한 URA3 pop-out 방법을 이용하여 제거하였다. 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh Δcyb2::ldh ㅿgpd1::ldh +ura3)를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 30℃에서 배양한 후, 5-FOA 함유 한천 (YSD, containing 6.7 g/L of yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L of yeast synthetic drop-out, 20 g/L glucose, 1 ug/L of 5-fluoroorotic acid, and 20 g/L agar) 플레이트에 도말하여 약 24시간 동안 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (URA3 pop-out 균주) 10개를 선별해 다시 5-FOA 함유 한천 배지 플레이트에 옮김과 동시에 YPD 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 URA3 pop-out 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 URA3 결실을 확인하기 위해 서열번호 38과 39의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 URA3 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh Δcyb2::ldh ㅿgpd1::ldh)을 수득하였다.
사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh ㅿcyb2::ldhΔgpd1::ldh)를 2013년 5월 30일에 한국생명공학연구원(KCTC)에 기탁하고, 수탁번호 제KCTC 12415BP호를 부여받았다.
(1.3) LDH 강화
제작된 KCTC12415BP호에 산화 환원 밸런스 (redox balance) 강화와 같은 락테이트의 생산 증가를 위하여 추가 변형 및/또는 락테이트 생산 경로의 강화를 위해 L-ldh를 게놈 내에 추가적으로 도입할 수 있다. 그 방법은 다음과 같다.
(1.3.1) L- ldh 유전자 게놈 내 도입 벡터 제조
L-ldh의 추가 도입을 위해 유전자 도입 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 도 5는 pUC19-HIS3 벡터 (서열번호 53)를 나타낸다. pRS413 (ATCC8758) 벡터를 주형으로 하고 서열번호 54 및 55의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 HIS3 PCR 단편을 SalI으로 자르고, 이를 SalI으로 자른 pUC19 벡터 (NEB, N3041)에 삽입하여, HIS3 유전자를 위한 선택 마커로서 사용될 수 있는 pUC19-HIS3 벡터를 제조하였다. 도 6은 pUC19-CCW12p-LDH-HIS3 벡터를 나타내는 도면이다.
제작된 상기의 p416-CCW12p-LDH를 주형으로 하고, 서열번호 26과 27의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편과 제작된 pUC19-HIS3 벡터를 SacI으로 절단하고 이들을 서로 라이게이션하여 pUC19-CCW12p-LDH-HIS3를 제작하였다.
또한, KCTC12415BP 균주의 게놈 내에 L-ldh 추가 도입하기 위하여, 제작된 pUC19-CCW12p-LDH-HIS3를 주형으로 하고 서열번호 40과 41의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 TRP1 (phosphoribosyl-anthranilate isomerase) 유전자 위치에 삽입하기 위한 카세트를 제작하였다.
상기 L-ldh를 포함하는 카세트는 TRP1의 유전좌에 삽입될 수 있고, 이 경우 TRP1 유전자가 결실되면서 L-ldh가 삽입될 수 있다. L-ldh 삽입 변이 균주는 다음과 같이 제작하였다.
상기 제작된 KCTC12415BP 균주를 YPD 한천 플레이트agar plate (10 g/L of yeast extract, 20 g/L of peptone, 20 g/L of glucose, and 20 g/L of agar)에 도말하여 24시간 동안 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 10ml에 접종하여 18시간 동안 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250ml 플라스크에 담긴 YPD 액체배지 50ml에 1%(v/v) 접종하여 230rpm, 30℃ 배양기에서 배양하였다.
약 4-5시간 후, OD600이 0.5 정도가 되면 4,500rpm, 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 100mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그리고 다시 4,500rpm, 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 15(v/v)% 글리세롤이 첨가된 1M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 100ul씩 분주하였다.
TRP1 결실과 동시에 L-ldh 발현을 위해 실시예 1.3.1에서 제작된 HIS3 유전자를 선별마커로 포함한 L-ldh 발현 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 및 single stranded carrier DNA와 혼합 한 다음 42℃ 수조에서 1시간 동안 반응 후 배양액을 히스티딘(his) 무첨가 최소 한천 배지 플레이트 (YSD, containing 6.7 g/L of yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L of yeast synthetic drop-out without histidine (Sigma-Aldrich: Cat. no. Y1751), 20 g/L glucose, and 20 g/L of agar)에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 히스티딘(his) 무첨가 최소 한천 배지 플레이트에 옮김과 동시에 히스티딘(his) 무첨가 최소 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여, TRP1 결실을 확인하기 위해 서열번호 42과 43의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 L-ldh 발현 카세트 삽입을 확인하였다.이렇게 얻은 균주를 CEN . PK2 -1D KCTC12415BP ㅿtrp1::ldh로 명명하였다.
실시예 2. nde1 유전자 결실 카세트의 제조 및 nde1 이 결실된 사카로마이세스 세레비지애 균주의 제조
(2.1) nde1 유전자 결실 카세트의 제조
nde1 유전자를 상동성 재조합 방법으로 결실시키기 위하여 nde1 유전자의 불활성화용 벡터는 상기 실시예 1.1.2에서 제작된 pUC57-ura3HA를 이용하였다. Nde1 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-ura3HA를 주형으로 하고 서열번호 44와 45의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 nde1 유전자 결실 카세트를 제작하였다.
(2.2) nde1 이 결실된 사카로마이세스 세레비지애 균주의 제조
사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldh)에서 nde1이 결실된 변이균주를 다음과 같이 제작하였다. 수득된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldh)를 YPD 한천 배지 (10 g/L of yeast extract, 20 g/L of peptone, 20 g/L of glucose, and 20 g/L of agar) 플레이트에 도말하여 약 24시간 동안 약 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체 배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4-5시간 후, OD600이 약 0.5 정도가 되면 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 약 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그 후, 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 약 15(v/v)% 글리세롤이 첨가된 약 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 약 100 ul씩 분주하였다.
nde1 유전자 제거를 위해, 상기 pdc1, cyb2 및 gpd1 유전자 결실과 동일한 방법으로 실시예 2.1에서 제작된 nde1 유전자 결실 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 및 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 배양액을 우라실(ura) 무첨가 최소 한천 배지(YSD, containing 6.7 g/L of yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L of yeast synthetic drop-out without uracil, 20 g/L glucose , and 20 g/L of agar) 플레이트에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 우라실 무첨가 최소 한천 배지에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 nde1 결실을 확인하기 위해 서열번호 46과 47의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 nde1 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1+ura3)을 수득하였다.
또한, 상기 유전자 결실 벡터를 이용한 추가 유전자 결실을 위해 nde1 결실을 위해 이용한 선별 마커인 URA3 유전자를 상기 기재한 URA3 pop-out 방법을 이용하여 제거하였다. 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1+ura3)를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 30℃에서 배양한 후, 5-FOA 함유 한천 배지 (YSD, containing 6.7 g/L of yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L of yeast synthetic drop-out , 20 g/L glucose, 1 ug/L of 5-fluoroorotic acid, and 20 g/L agar) 플레이트에 도말하여 약 24시간 동안 30℃에서 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (URA3 pop-out 균주) 10개를 선별해 다시 5-FOA 함유 한천 배지 플레이트에 옮김과 동시에 YPD 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 URA3 pop-out 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 URA3 결실을 확인하기 위해 서열번호 46과 47의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 URA3 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1)을 수득하였다.
실시예 3. nde2 유전자 결실 카세트의 제조, 및 nde1 및 nde2 이 결실된 사카로마이세스 세레비지애 균주의 제작
(3.1) nde2 유전자의 결실 카세트의 제조
nde2 유전자를 상동성 재조합 방법으로 결실시키기 위하여 nde2 유전자의 불활성화용 벡터는 상기 실시예 1.1.2에서 제작된 pUC57-ura3HA를 이용하였다. Nde2 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-ura3HA를 주형으로 하고 서열번호 48와 49의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 nde2 유전자 결실 카세트를 제작하였다.
(3.2) nde1 및 nde2 이 결실된 S. cerevisiae 균주의 제조
사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1)에서 nde2가 결실된 변이균주를 다음과 같이 제조하였다.
수득된 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1)를 YPD 한천 배지 (10 g/L of yeast extract, 20 g/L of peptone, 20 g/L of glucose, and 20 g/L of agar)플레이트에 도말하여 약 24시간 동안 약 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4-5시간 후, OD600이 약 0.5 정도가 되면 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 약 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그 후, 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 약 15(v/v)% 글리세롤이 첨가된 약 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 약 100 ul씩 분주하였다.
nde2 유전자 제거를 위해, 상기 pdc1, cyb2, gpd1 및 nde1 유전자 결실과 동일한 방법으로 실시예 3.1에서 제작된 nde2 유전자 결실 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 및 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음, 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 배양액을 우라실 무첨가 최소 한천 배지 (YSD, containing 6.7 g/L of yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L of yeast synthetic drop-out without uracil, 20 g/L glucose, and 20 g/L of agar) 플레이트에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 우라실 무첨가 최소 한천 배지 플레이트에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 nde2 결실을 확인하기 위해 서열번호 50과 51의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 nde2 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1Δnde2+ura3)을 수득하였다.
또한, 상기 유전자 결실 벡터를 이용한 추가 유전자 결실을 위해 nde2 결실을 위해 이용한 선별 마커인 URA3 유전자를 상기 기재한 URA3 pop-out 방법을 이용하여 제거하였다. 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1Δnde2+ura3)를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 30℃에서 배양한 후, 5-FOA 함유 배지 (YSD, containing 6.7 g/L of yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L of yeast synthetic drop-out, 20 g/L glucose, 1 ug/L of 5-fluoroorotic acid, and 20 g/L of agar) 플레이트에 도말하여 약 24시간 동안 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (URA3 pop-out 균주) 10개를 선별해 다시 5-FOA 함유 배지에 옮김과 동시에 YPD 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 URA3 pop-out 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 URA3 결실을 확인하기 위해 서열번호 50과 51의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 URA3 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1Δnde2)을 수득하였다.
실시예 4. nde1 이 불활성화된 균주 및 nde1 / nde2 가 불활성화된 균주 각각을 이용한 락테이트 생산
실시예 2 및 3에서 제조된 균주 각각을 YPD 한천 배지에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양한 후 40 g/L 포도당을 포함한 50 ml YPD 액체 배지에 접종하여 호기 조건으로 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 발효는 상기의 50ml의 균주 배양액내의 세포농도를 분광광도계를 이용 흡광도가 600 nm에서 5.0이 되는 양을 정량한 후 원심분리 하여 상층액을 버린 후 세포를 재현탁하여 80 g/L 포도당이 포함된 새로운 50 ml의 YPD 액체 배지에 다시 접종하여 실시하였다.
발효조건은 약 90 rpm을 유지하는 교반 배양기에서 30℃에서 24시간 이상 동안 배양하였다. 발효 중 플라스크로부터 주기적으로 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료는 약 13,000 rpm에서 약 10분 동안 원심분리 후, 상층액의 각종 대사산물 및 락테이트와 포도당의 농도를 액체크로마토그래피 (HPLC)로 분석하였다.
표 1에 나타낸 바와 같이 KCTC12415BPΔtrp1::ldhㅿnde1는 KCTC12415BPΔtrp1::ldh에 비해 L-락테이트 생산성은 32.8 g/L에서 34.4 g/L로 상승하였다. 또한, KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1Δnde2는 KCTC12415BPΔtrp1::ldh에 비해 락테이트 생산성은 32.8 g/L에서 37.7 g/L로 상승하였고, 수율은 44.2%에서 48.2%로 증가하였다.
균주 O D 600 L- 락테이트
생산성 (g/L) 		수율
(%)
KCTC12415BPΔtrp1::ldh 11.74 32.8 44.2
KCTC12415BPΔtrp1::ldhㅿnde1 12.78 34.4 44.2
KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1ㅿnde2 11.64 37.7 48.2
50 ml 플라스크, 약 30 시간 배양
실시예 5. KCTC12415BP Δ trp1 :: ldh ㅿ nde1 균주를 이용한 락테이트 생산
실시예 2에서 제조된 KCTC12415BPΔtrp1::ldhㅿnde1 균주를 YPD 한천 배지에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양한 후, 80 g/L 포당을 포함한 100 ml YPD에 접종하여 호기 조건으로 30℃에서 16시간 동안 배양하였다.
발효는 100 ml의 상기 균주 배양액을 1 L의 합성 배지 (60 g/L of glucose, 20 g/L of a yeast extract, 50 g/L of K2HPO4, 10 g/L of MgSO4, 0.1 g/L of tryptophane, and 0.1 g/L of histidine) 를 함유한 미생물 반응기 (bioreactor)에 별도로 접종하여 수행하였으며 발효 조건은 초기 60 g/L 포도당 및 20 g/L 효모 추출물로 30℃로 하였다. 발효 중 pH는 5N Ca(OH)2 를 이용하여 16시간까지 pH5, 24시간까지 pH4.5 그리고 60시간까지 pH3.0을 유지하였고 포도당 농도가 20 g/L가 유지되도록 하였다. 추가적인 합성배지 성분은 포도당을 포함한 50 g/L K2HPO4, 10 g/L MgSO4, 0.1 g/L 트립토판, 및 0.1 g/L 히스티딘으로 구성되어 있다.
배양액 내의 세포농도는 분광광도계를 이용하여 추정하였으며, 발효 중 생물 반응기로부터 주기적으로 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 후, 상층액의 각종 대사산물 및 락테이트와 포도당의 농도를 액체크로마토그래피 (HPLC)로 분석하였다.
도 7은 일 구체예에 따른 KCTC12415BPΔtrp1::ldh, KCTC12415BPΔtrp1::ldhㅿnde1 및 KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1Δnde2의 발효 조건에서 락테이트의 생산성을 나타내는 도면이다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 재조합 KCTC12415BPΔtrp1::ldhㅿnde1 균주는 우수한 락테이트 생산성을 보일 뿐만 아니라 모균주에 비해 수율도 상승하였다. 대조군인 KCTC12415BPΔtrp1::ldh 에 비해 락테이트 생산성은 91 g/L에서 105 g/L로 상승하였다.
실시예 6. KCTC12415BP ㅿ trp1 :: ldh ㅿ nde1 Δ nde2 균주를 이용한 락테이트 생산
실시예 3에서 제조된 KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1Δnde2균주를 YPD 한천 배지에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양한 후, 80 g/L 포당을 포함한 100 ml YPD에 접종하여 호기 조건으로 30℃에서 16 시간 동안 배양하였다. 발효는 100 ml의 상기 균주 배양액을 1 L의 합성 배지(60 g/L of glucose, 20 g/L of a yeast extract, 50 g/L of K2HPO4, 10 g/L of MgSO4, 0.1 g/L of tryptophane, and 0.1 g/L of histidine) 를 함유한 미생물 반응기에 별도로 접종하여 수행하였다.
발효 조건은 초기 60 g/L 포도당 및 20 g/L 효모 추출물을 첨가하고 30℃ 하에서 발효하였다. 발효 중 pH는 5N Ca(OH)2 를 이용하여 16시간까지 pH 5, 24 시간까지 pH 4.5 및 60 시간까지 pH 3.0을 유지하였고 포도당 농도가 20 g/L가 유지되도록 하였다. 추가적인 합성배지 성분은 포도당을 포함한 50 g/L K2HPO4, 10 g/L MgSO4, 0.1 g/L 트립토판, 및 0.1 g/L 히스티딘으로 구성되어 있다.
배양액 내의 세포농도는 분광광도계를 이용하여 추정하였으며, 발효 중 생물 반응기로부터 주기적으로 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리 후, 상층액의 각종 대사산물 및 락테이트와 포도당의 농도를 액체크로마토그래피 (HPLC)로 분석하였다.
도 7 에 나타낸 바와 같이, 재조합 KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1Δnde2 균주는 우수한 락테이트 생산성을 보일 뿐만 아니라 모균주에 비해 수율도 상승하였다. 대조군인 KCTC12415BP ㅿtrp1::ldh에 비해 락테이트 생산성은 91 g/L에서 111 g/L로 상승하였다.
도 8A, 8B 및 8C는 각각 발효 조건에서 KCTC12415BPㅿtrp1+LDH, 변이균주 KCTC12415BPㅿtrp1+LDHㅿNDE1 및 KCTC12415BPㅿtrp1+LDHㅿNDE1ㅿNDE2의 배양 특성을 나타낸 도면이다.
한국생명공학연구원 KCTC12415BP 20130530
<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Yeast cell with inactivated NADH dehydrogenase and method of producing latate using the same <130> PX43918EP <160> 62 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 560 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 Met Ile Arg Gln Ser Leu Met Lys Thr Val Trp Ala Asn Ser Ser Arg 1 5 10 15 Phe Ser Leu Gln Ser Lys Ser Gly Leu Val Lys Tyr Ala Lys Asn Arg 20 25 30 Ser Phe His Ala Ala Arg Asn Leu Leu Glu Asp Lys Lys Val Ile Leu 35 40 45 Gln Lys Val Ala Pro Thr Thr Gly Val Val Ala Lys Gln Ser Phe Phe 50 55 60 Lys Arg Thr Gly Lys Phe Thr Leu Lys Ala Leu Leu Tyr Ser Ala Leu 65 70 75 80 Ala Gly Thr Ala Tyr Val Ser Tyr Ser Leu Tyr Arg Glu Ala Asn Pro 85 90 95 Ser Thr Gln Val Pro Gln Ser Asp Thr Phe Pro Asn Gly Ser Lys Arg 100 105 110 Lys Thr Leu Val Ile Leu Gly Ser Gly Trp Gly Ser Val Ser Leu Leu 115 120 125 Lys Asn Leu Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Val Val Val Val Ser Pro Arg 130 135 140 Asn Tyr Phe Leu Phe Thr Pro Leu Leu Pro Ser Thr Pro Val Gly Thr 145 150 155 160 Ile Glu Leu Lys Ser Ile Val Glu Pro Val Arg Thr Ile Ala Arg Arg 165 170 175 Ser His Gly Glu Val His Tyr Tyr Glu Ala Glu Ala Tyr Asp Val Asp 180 185 190 Pro Glu Asn Lys Thr Ile Lys Val Lys Ser Ser Ala Lys Asn Asn Asp 195 200 205 Tyr Asp Leu Asp Leu Lys Tyr Asp Tyr Leu Val Val Gly Val Gly Ala 210 215 220 Gln Pro Asn Thr Phe Gly Thr Pro Gly Val Tyr Glu Tyr Ser Ser Phe 225 230 235 240 Leu Lys Glu Ile Ser Asp Ala Gln Glu Ile Arg Leu Lys Ile Met Ser 245 250 255 Ser Ile Glu Lys Ala Ala Ser Leu Ser Pro Lys Asp Pro Glu Arg Ala 260 265 270 Arg Leu Leu Ser Phe Val Val Val Gly Gly Gly Pro Thr Gly Val Glu 275 280 285 Phe Ala Ala Glu Leu Arg Asp Tyr Val Asp Gln Asp Leu Arg Lys Trp 290 295 300 Met Pro Glu Leu Ser Lys Glu Ile Lys Val Thr Leu Val Glu Ala Leu 305 310 315 320 Pro Asn Ile Leu Asn Met Phe Asp Lys Tyr Leu Val Asp Tyr Ala Gln 325 330 335 Asp Leu Phe Lys Glu Glu Lys Ile Asp Leu Arg Leu Lys Thr Met Val 340 345 350 Lys Lys Val Asp Ala Thr Thr Ile Thr Ala Lys Thr Gly Asp Gly Asp 355 360 365 Ile Glu Asn Ile Pro Tyr Gly Val Leu Val Trp Ala Thr Gly Asn Ala 370 375 380 Pro Arg Glu Val Ser Lys Asn Leu Met Thr Lys Leu Glu Glu Gln Asp 385 390 395 400 Ser Arg Arg Gly Leu Leu Ile Asp Asn Lys Leu Gln Leu Leu Gly Ala 405 410 415 Lys Gly Ser Ile Phe Ala Ile Gly Asp Cys Thr Phe His Pro Gly Leu 420 425 430 Phe Pro Thr Ala Gln Val Ala His Gln Glu Gly Glu Tyr Leu Ala Gln 435 440 445 Tyr Phe Lys Lys Ala Tyr Lys Ile Asp Gln Leu Asn Trp Lys Met Thr 450 455 460 His Ala Lys Asp Asp Ser Glu Val Ala Arg Leu Lys Asn Gln Ile Val 465 470 475 480 Lys Thr Gln Ser Gln Ile Glu Asp Phe Lys Tyr Asn His Lys Gly Ala 485 490 495 Leu Ala Tyr Ile Gly Ser Asp Lys Ala Ile Ala Asp Leu Ala Val Gly 500 505 510 Glu Ala Lys Tyr Arg Leu Ala Gly Ser Phe Thr Phe Leu Phe Trp Lys 515 520 525 Ser Ala Tyr Leu Ala Met Cys Leu Ser Phe Arg Asn Arg Val Leu Val 530 535 540 Ala Met Asp Trp Ala Lys Val Tyr Phe Leu Gly Arg Asp Ser Ser Ile 545 550 555 560 <210> 2 <211> 545 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 Met Leu Pro Arg Leu Gly Phe Ala Arg Thr Ala Arg Ser Ile His Arg 1 5 10 15 Phe Lys Met Thr Gln Ile Ser Lys Pro Phe Phe His Ser Thr Glu Val 20 25 30 Gly Lys Pro Gly Pro Gln Gln Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Ala Val 35 40 45 Phe Lys Lys Trp Phe Val Arg Gly Leu Lys Leu Thr Phe Tyr Thr Thr 50 55 60 Leu Ala Gly Thr Leu Tyr Val Ser Tyr Glu Leu Tyr Lys Glu Ser Asn 65 70 75 80 Pro Pro Lys Gln Val Pro Gln Ser Thr Ala Phe Ala Asn Gly Leu Lys 85 90 95 Lys Lys Glu Leu Val Ile Leu Gly Thr Gly Trp Gly Ala Ile Ser Leu 100 105 110 Leu Lys Lys Leu Asp Thr Ser Leu Tyr Asn Val Thr Val Val Ser Pro 115 120 125 Arg Ser Phe Phe Leu Phe Thr Pro Leu Leu Pro Ser Thr Pro Val Gly 130 135 140 Thr Ile Glu Met Lys Ser Ile Val Glu Pro Val Arg Ser Ile Ala Arg 145 150 155 160 Arg Thr Pro Gly Glu Val His Tyr Ile Glu Ala Glu Ala Leu Asp Val 165 170 175 Asp Pro Lys Ala Lys Lys Val Met Val Gln Ser Val Ser Glu Asp Glu 180 185 190 Tyr Phe Val Ser Ser Leu Ser Tyr Asp Tyr Leu Val Val Ser Val Gly 195 200 205 Ala Lys Thr Thr Thr Phe Asn Ile Pro Gly Val Tyr Gly Asn Ala Asn 210 215 220 Phe Leu Lys Glu Ile Glu Asp Ala Gln Asn Ile Arg Met Lys Leu Met 225 230 235 240 Lys Thr Ile Glu Gln Ala Ser Ser Phe Pro Val Asn Asp Pro Glu Arg 245 250 255 Lys Arg Leu Leu Thr Phe Val Val Val Gly Gly Gly Pro Thr Gly Val 260 265 270 Glu Phe Ala Ala Glu Leu Gln Asp Tyr Ile Asn Gln Asp Leu Arg Lys 275 280 285 Trp Met Pro Asp Leu Ser Lys Glu Met Lys Val Ile Leu Ile Glu Ala 290 295 300 Leu Pro Asn Ile Leu Asn Met Phe Asp Lys Thr Leu Ile Lys Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Asp Leu Phe Ala Arg Asp Glu Ile Asp Leu Gln Val Asn Thr Ala 325 330 335 Val Lys Val Val Glu Pro Thr Tyr Ile Arg Thr Leu Gln Asn Gly Gln 340 345 350 Thr Asn Thr Asp Ile Glu Tyr Gly Met Leu Val Trp Ala Thr Gly Asn 355 360 365 Glu Pro Ile Asp Phe Ser Lys Thr Leu Met Ser Arg Ile Pro Glu Gln 370 375 380 Thr Asn Arg Arg Gly Leu Leu Ile Asn Asp Lys Leu Glu Leu Leu Gly 385 390 395 400 Ser Glu Asn Ser Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Cys Thr Ala His Thr Gly 405 410 415 Phe Phe Pro Thr Ala Gln Val Ala His Gln Glu Gly Glu Tyr Leu Ala 420 425 430 Lys Ile Leu Asp Lys Lys Leu Gln Ile Glu Gln Leu Glu Trp Asp Met 435 440 445 Leu Asn Ser Thr Asp Glu Thr Glu Val Ser Arg Leu Gln Lys Glu Val 450 455 460 Asn Leu Arg Lys Ser Lys Leu Asp Lys Phe Asn Tyr Lys His Met Gly 465 470 475 480 Ala Leu Ala Tyr Ile Gly Ser Glu Thr Ala Ile Ala Asp Leu His Met 485 490 495 Gly Asp Ser Ser Tyr Gln Leu Lys Gly Met Phe Ala Phe Leu Phe Trp 500 505 510 Lys Ser Ala Tyr Leu Ala Met Cys Leu Ser Ile Arg Asn Arg Ile Leu 515 520 525 Ile Ala Met Asp Trp Thr Lys Val Tyr Phe Leu Gly Arg Asp Ser Ser 530 535 540 Val 545 <210> 3 <211> 1683 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 atgattagac aatcattaat gaaaacagtg tgggctaact cctccaggtt tagcctacag 60 agcaagtcgg ggcttgtgaa atatgccaaa aatagatcgt tccatgcagc aagaaatttg 120 ctagaggaca agaaagtcat tttgcaaaaa gtggcgccca ctactggcgt tgttgcgaag 180 cagtcctttt tcaagagaac tgggaaattt actttgaagg ctttattgta ttctgccctc 240 gcgggtacgg cttacgtttc atactcactt taccgagaag ctaacccttc tacccaagtt 300 cctcaatcgg acacttttcc aaacggttca aagaggaaga ctttggtaat tctgggctcc 360 ggttggggtt ctgtgtcgct tttgaaaaat ttggacacca cgttgtataa tgttgttgtt 420 gtttctccaa gaaattattt tctttttact ccgctattgc catctacccc agttggtacc 480 atcgaattga aatctattgt tgaacctgtc aggactattg ctagaagatc gcacggtgaa 540 gtccattact atgaagctga agcgtacgac gttgatcctg aaaacaaaac aattaaggtc 600 aaatcttccg ctaagaataa cgactacgac ttggacttga aatacgacta tctggttgtc 660 ggtgtgggtg ctcaaccaaa cacttttggt actccgggag tttatgaata ttcttctttc 720 ttgaaggaaa tatccgacgc tcaagagatc agattaaaaa ttatgtccag tattgagaaa 780 gctgcctccc tatctccaaa agatcctgag agagcaagat tgttgagctt tgttgtcgtt 840 ggtggtggtc ccaccggtgt cgaatttgcc gctgaattga gagattatgt tgaccaggac 900 ttgagaaaat ggatgcccga attgagtaaa gaaattaaag tcactttggt ggaggctttg 960 ccaaacattt tgaacatgtt tgacaagtat ctcgttgact atgctcaaga tttattcaaa 1020 gaggaaaaaa tcgatttaag attgaaaaca atggttaaga aagttgacgc taccactata 1080 actgccaaaa ctggcgatgg tgacattgaa aatataccgt atggtgtatt agtttgggct 1140 acaggtaatg cgccaagaga agtgtctaag 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Ile Ile Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser 65 70 75 80 Ala Leu Asn Gly Ile Ala Gly Ser Tyr Ala Glu His Val Gly Val Leu 85 90 95 His Val Val Gly Val Pro Ser Ile Ser Ala Gln Ala Lys Gln Leu Leu 100 105 110 Leu His His Thr Leu Gly Asn Gly Asp Phe Thr Val Phe His Arg Met 115 120 125 Ser Ala Asn Ile Ser Glu Thr Thr Ala Met Ile Thr Asp Ile Ala Thr 130 135 140 Ala Pro Ala Glu Ile Asp Arg Cys Ile Arg Thr Thr Tyr Val Thr Gln 145 150 155 160 Arg Pro Val Tyr Leu Gly Leu Pro Ala Asn Leu Val Asp Leu Asn Val 165 170 175 Pro Ala Lys Leu Leu Gln Thr Pro Ile Asp Met Ser Leu Lys Pro Asn 180 185 190 Asp Ala Glu Ser Glu Lys Glu Val Ile Asp Thr Ile Leu Ala Leu Val 195 200 205 Lys Asp Ala Lys Asn Pro Val Ile Leu Ala Asp Ala Cys Cys Ser Arg 210 215 220 His Asp Val Lys Ala Glu Thr Lys Lys Leu Ile Asp Leu Thr Gln Phe 225 230 235 240 Pro Ala Phe Val Thr Pro Met Gly Lys Gly Ser Ile Asp Glu Gln His 245 250 255 Pro Arg Tyr Gly Gly Val Tyr Val Gly Thr Leu Ser Lys Pro Glu Val 260 265 270 Lys Glu Ala Val Glu Ser Ala 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ttattaattt taaacccata taatttatta 240 tttttttatt ctaaagttta aagtaatttt agtagtattt tatattttga ataaatatac 300 tttaaatttt tatttttata ttttattact tttaaaaata atgtttttat ttaaaacaaa 360 attataagtt aaaaagttgt tccgaaagta aaatatattt tatagttttt acaaaaataa 420 attattttta acgtattttt tttaattata tttttgtatg tgattatatc cacaggtatt 480 atgctgaatt tagctgtttc agtttaccag tgtgatagta tgattttttt tgcctctcaa 540 aagctatttt tttagaagct tcgtcttaga aataggtggt gtataaattg cggttgactt 600 ttaactatat atcattttcg atttatttat tacatagaga ggtgctttta attttttaat 660 ttttattttc aataatttta aaagtgggta cttttaaatt ggaacaaagt gaaaaatatc 720 tgttatacgt gcaactgaat tttactgacc ttaaaggact atctcaatcc tggttcagaa 780 atccttgaaa tgattgatat gttggtggat tttctctgat tttcaaacaa gaggtatttt 840 atttcatatt tattatattt tttacattta ttttatattt ttttattgtt tggaagggaa 900 agcgacaatc aaattcaaaa tatattaatt aaactgtaat acttaataag agacaaataa 960 cagccaagaa tcaaatactg ggtttttaat caaaagatct ctctacatgc acccaaattc 1020 attatttaaa tttactatac tacagacaga atatacgaac ccagattaag tagtcagacg 1080 cttttccgct ttattgagta tatagcctta catattttct gcccataatt tctggattta 1140 aaataaacaa aaatggttac tttgtagtta tgaaaaaagg cttttccaaa atgcgaaata 1200 cgtgttattt aaggttaatc aacaaaacgc atatccatat gggtagttgg acaaaacttc 1260 aatcgat 1267 <210> 17 <211> 289 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYC promoter <400> 17 atttggcgag cgttggttgg tggatcaagc ccacgcgtag gcaatcctcg agcagatccg 60 ccaggcgtgt atatatagcg tggatggcca ggcaacttta gtgctgacac atacaggcat 120 atatatatgt gtgcgacgac acatgatcat atggcatgca tgtgctctgt atgtatataa 180 aactcttgtt ttcttctttt ctctaaatat tctttcctta tacattagga cctttgcagc 240 ataaattact atacttctat agacacgcaa acacaaatac acacactaa 289 <210> 18 <211> 401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEF promoter <400> 18 atagcttcaa aatgtttcta ctcctttttt actcttccag attttctcgg actccgcgca 60 tcgccgtacc acttcaaaac acccaagcac agcatactaa atttcccctc tttcttcctc 120 tagggtgtcg ttaattaccc gtactaaagg tttggaaaag aaaaaagaga ccgcctcgtt 180 tctttttctt cgtcgaaaaa 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ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag 2880 tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa 2940 gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc 3000 gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt 3060 taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc 3120 tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta 3180 ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa 3240 taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca 3300 tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 3360 aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta 3420 ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt ctcgcgcgtt 3480 tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc 3540 tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt 3600 gtcggggctg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatgc 3660 ggtgtgaaat 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norvegicus <400> 58 atggcagccc tcaaggacca gctgattgtg aatcttctta aggaagaaca ggtcccccag 60 aacaagatta cagttgttgg ggttggtgct gttggcatgg cttgtgccat cagtatctta 120 atgaaggact tggctgatga gcttgccctt gttgatgtca tagaagataa gctaaaggga 180 gagatgatgg atcttcagca tggcagcctt ttccttaaga caccaaaaat tgtctccagc 240 aaagattata gtgtgactgc aaactccaag ctggtcatta tcaccgcggg ggcccgtcag 300 caagagggag agagccggct caatttggtc cagcgaaacg tgaacatctt caagttcatc 360 attccaaatg ttgtgaaata cagtccacag tgcaaactgc tcatcgtctc aaacccagtg 420 gatatcttga cctacgtggc ttggaagatc agcggcttcc ccaaaaacag agttattgga 480 agtggttgca atctggattc ggctcggttc cgttacctga tgggagaaag gctgggagtt 540 catccactga gctgtcacgg gtgggtcctg ggagagcatg gcgactccag tgtgcctgtg 600 tggagtggtg tgaatgtcgc cggcgtctcc ctgaagtctc tgaacccgca gctgggcacg 660 gatgcagaca aggagcagtg gaaggatgtg cacaagcagg tggttgacag tgcatacgaa 720 gtgatcaagc tgaaaggtta cacatcctgg gccattggcc tctccgtggc agacttggcc 780 gagagcataa tgaagaacct taggcgggtg catcccattt ccaccatgat taagggtctc 840 tatggaatca aggaggatgt cttcctcagc gtcccatgta tcctgggaca aaatggaatc 900 tcagatgttg tgaaggtgac actgactcct gacgaggagg cccgcctgaa gaagagtgca 960 gataccctct ggggaatcca gaaggagctg cagttctaa 999 <210> 59 <211> 334 <212> PRT <213> Xenopus laevis <400> 59 Met Ser Thr Val Gln Glu Lys Leu Ile Thr Asn Val Cys Gln Asp Lys 1 5 10 15 Ala Ala Lys Pro Thr Asn Lys Ile Thr Ile Val Gly Val Gly Gln Val 20 25 30 Gly Met Ala Cys Ala Val Ser Val Leu Leu Lys Glu Leu Ala Asp Glu 35 40 45 Leu Ala Leu Val Asp Ile Leu Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Val Met 50 55 60 Asp Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Lys Thr Pro Thr Ile Val Ala 65 70 75 80 Asp Lys Asp Tyr Ser Val Thr Ala Asn Ser Arg Ile Val Val Val Thr 85 90 95 Gly Gly Val Pro Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln 100 105 110 Arg Asn Val Asn Val Phe Lys Phe Ile Ile Pro Gln Val Val Lys Tyr 115 120 125 Ser Pro Asp Cys Ile Ile Ile Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu 130 135 140 Thr Tyr Val Thr Trp Lys Leu Ser Gly Leu Pro Gln His Arg Ile Ile 145 150 155 160 Gly 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Claims (22)

  1. 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 (external mitochondral NADH dehydrogenase)와 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 단백질의 활성이 그 모세포 (parent cell)에 비하여 감소되어 있고, 락테이트 생산능을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포로서, 상기 유전적으로 조작된 효모 세포 중의 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성이 모세포에 비하여 증가되어 있고 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 그 모세포에 비하여 감소되어 있는 것인 효모 세포.
  2. 청구항 1에 있어서, 사카로마이세스 속에 속하는 것인 효모 세포.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제는 EC. 1.6.5.9 또는 EC. 1.6.5.3.에 속하는 것인 효모 세포.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제는 NDE1, NDE2, 또는 그의 조합인 것인 효모 세포.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 효모 세포.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제를 코딩하는 유전자가 상기 유전적으로 조작된 효모 세포 중에서 불활성화 또는 결실된 것인 효모 세포.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 것인 효모 세포.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 3 또는 4의 뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 효모 세포.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제와 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질의 활성은 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체의 치환, 부가 또는 결실 돌연변이에 의하여 감소된 것인 효모 세포.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 유전적으로 조작된 효모 세포 중의 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 활성이 그 모세포에 비하여 감소되어 있는 것인 효모 세포.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 및 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드는 각각 서열번호 5, 6, 및 7의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 효모 세포.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 또는 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 불활성화 또는 결실에 의하여 감소되어 있는 것인 효모 세포.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 8, 9, 및 10의 뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 효모 세포.
  14. 삭제
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성은 그 모세포에 비하여 상기 유전적으로 조작된 효모 세포 중의 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현의 증가에 의하여 증가되어 있는 것인 효모 세포.
  16. 청구항 1에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 외래 유전자를 포함하는 것인 효모 세포.
  17. 청구항 1에 있어서, 상기 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 11; 서열번호 12; 서열번호 13; 서열번호 14; 서열번호 59 또는 61의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 효모 세포.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 15, 56, 57, 58, 60, 또는 62의 뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 효모 세포.
  19. 청구항 1의 상기 유전적으로 조작된 효모 세포를 배양하여, 상기 효모 세포가 락테이트를 생산하는 단계; 및
    배양물로부터 락테이트를 회수하는 단계;를 포함하는 락테이트를 생산하는 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 청구항 1의 상기 유전적으로 조작된 효모 세포는 혐기 조건에서 배양되는 것인 방법.
  21. 락테이트 생산 효모 (lactate-producing yeast) 중 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제의 발현 및 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드의 발현을 불활성화시키는 단계를 포함하는, 락테이트 생산 효모 중의 락테이트 생산을 증진시키는 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제의 발현 및 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드의 발현은 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제를 코딩하는 유전자 및 상기 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 돌연변이 또는 결실에 의하여 불활성화된 것인 방법.
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