KR20190043847A - 코마가타에이박터 속 재조합 미생물, 그를 이용하여 셀룰로오스를 생산하는 방법 및 상기 미생물을 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

증가된 셀룰로오스 생산능 및 수율을 갖는 코마가타에이박터 속 미생물, 그를 이용하여 셀룰로오스를 생산하는 방법 및 상기 미생물을 생산하는 방법을 제공한다.

Description

코마가타에이박터 속 재조합 미생물, 그를 이용하여 셀룰로오스를 생산하는 방법 및 상기 미생물을 생산하는 방법{Komagataeibacter genus recombinant microorganism, method for producing cellulose using the same, and method for producing the microorganism}

코마가타에이박터 속 재조합 미생물, 그를 이용하여 셀룰로오스를 생산하는 방법 및 상기 미생물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

식물-기반 셀룰로오스(plant-based cellulose)는 많이 존재하고 저렴하여, 최근 관심이 증가하고 있다. 그러나, 리그노셀룰로오스성 생물질(lignocellulosic biomass) 중 리그닌, 헤미셀룰로오스 및 다른 분자의 존재로 인하여, 의료용을 위하여는 복잡한 공정을 필요하게 한다. 박테리아 셀룰로오스는(bacterial cellulose: BC)는 Acetobacter 속과 같은 박테리아에 의하여 생산되는 불용성 세포외폴리사카리드이다. 박테리아 셀룰로오스는 β-1,4 글루칸이라는 일차 구조로 존재하고, 이들이 여러 가닥의 피브릴(fibril)의 망상 구조를 이루고 있다. 박테리아 셀룰로오스는 미세한 나노-스케일 구조를 가진 셀룰로오스의 높은 순도(highly pure)를 가진 형태이다. 박테리아 셀룰로오스는 높은 기계적 인장 강도(mechanical tensile strength), 순도(purity), 생물분해성(biodegradability), 수분 유지능(water-holding capacity), 및 높은 내열성을 포함한, 우수한 물리 화학적 특성을 가지고 있다. 이런 특성 때문에 박테리아 셀룰로오스는 화장품, 의료용, 식이섬유, 음향기기 진동판, 기능성 필름 등의 다양한 산업에 응용되어 개발되고 있다.

박테리아 셀룰로오스 생산 균주로는 Acetobacter, Agrobacteria, Rhizobia, 또는 Sarcina이 보고되고 있으며 그 중에서 특히 우수한 균주는 Komagataeibacter xylinum ('Gluconacetobacter xylinum'이라고도 함)으로 알려져 있다. 호기적 조건에서 정치 배양하면 배양액 표면에 얇은 막 형태로 3차원 망상 조직의 셀룰로오스가 형성된다. 박테리아를 사용하여 박테리아 셀룰로오스를 생산하는 방법이 알려져 있다.

또한, 셀룰로오스 생산 균주에 다양한 변이를 유도하여 셀룰로오스 생산능을 향상시키는 연구가 진행중에 있다. 그러나, 상기한 종래 기술에 의하더라도 증가된 셀룰로오스 생산능을 갖는 재조합 코마가타에이박터(Komagataeibacter) 속 미생물에 대한 요구가 있다.

일 양상은 코마가타에이박터 속 재조합 미생물을 제공한다.

다른 양상은 상기 미생물을 이용하여 셀룰로오스를 생산하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 상기 미생물을 생산하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 세포, 단백질, 또는 효소의 활성의 검출가능한 증가를 나타낼 수 있다. "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 주어진 유전적 변형 (genetic modification)을 갖지 않은 세포, 단백질, 또는 효소 (예, 본래 또는 "야생형 (wild-type)" 세포, 단백질, 또는 효소)와 같은, 동일한 타입의 비교 세포, 단백질, 또는 효소의 수준보다 더 높은 변형된 (예, 유전적으로 조작된) 세포, 단백질, 또는 효소의 활성을 나타낼 수 있다. "세포의 활성"이란 세포의 특정 단백질 또는 효소의 활성을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 상기 변형된 또는 조작된 세포의 활성은 동일 타입의 조작되지 않은 세포, 또는 모세포 예를 들면, 야생형 세포의 특정 단백질 또는 효소 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 단백질 또는 효소의 증가된 활성을 갖는 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다.

효소 또는 폴리펩티드의 활성 증가는 발현 증가 또는 비활성 (specific activity)의 증가에 의하여 얻을 수 있다. 상기 발현 증가는 효소 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포에 도입되거나 카피 수가 증가되거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 상기 유전자가 도입되는 미생물은 자체적으로 상기 유전자를 포함하는 것, 또는 포함하고 있지 않은 것일 수 있다. 상기 유전자는 그의 발현을 가능하게 하는 조절 서열, 예를 들면, 프로모터, 폴리아데닐화 부위, 또는 그 조합과 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 외부에서 도입되거나 또는 카피 수가 증가되는 폴리뉴클레오티드는 내인성 (endogenous) 또는 외인성 (exogenous)일 수 있다. 상기 내인성 유전자는 미생물 내부에 포함된 유전물질 상에 존재하던 유전자를 말한다. 외인성 유전자는 외부로부터 세포 내로 도입되는 유전자를 의미하며, 도입되는 유전자는 도입되는 숙주세포에 대해 동종 (homologous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. "이종성 (heterologous)"은 천연 (native)이 아닌 외인성 (foreign)을 의미할 수 있다.

용어 "카피 수 증가 (copy number increase)"는 상기 유전자의 도입 또는 증폭에 의한 것일 수 있으며, 조작되지 않은 세포에 존재하지 않는 유전자를 유전적 조작에 의해 갖게 되는 경우도 포함한다. 상기 유전자의 도입은 벡터와 같은 비히클을 매개하여 이루어질 수 있다. 상기 도입은 상기 유전자가 게놈에 통합되지 않은 임시적 (transient) 도입이거나 게놈에 삽입되는 것일 수 있다. 상기 도입은 예를 들면, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 상기 세포로 도입한 후, 상기 벡터가 세포 내에서 복제되거나 상기 폴리뉴클레오티드가 게놈으로 통합됨으로써 이루어질 수 있다.

상기 유전자의 도입은 형질전환, 형질도입 (transfection), 전기천공 (electroporation)과 같은 알려진 방법에 의하여 수행될 수 있다. 상기 유전자는 운반체 (vehicle)를 통하여 도입되거나, 그 자체로서 도입될 수 있다. 본 명세서에 있어서, "운반체"란 연결되어 있는 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 특정한 유전자의 도입을 매개하는 뉴클레오티드 서열이라는 관점에서, 본 명세서에서 운반체는, 벡터, 핵산 구조체, 및 카세트와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있는 것으로 해석된다. 벡터에는 예를 들면 플라스미드 또는 바이러스 유래 벡터 등이 포함된다. 플라스미드란 추가의 DNA가 연결될 수 있는 원형의 이중가닥 DNA 고리를 포함한다. 벡터에는 예를 들면, 플라스미드 발현벡터, 바이러스 발현벡터, 또는 그 조합이 포함될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 유전자의 조작은 당업계에 공지된 분자생물학적 방법에 의할 수 있다.

용어 "모세포 (parent cell)"는 본래 세포 (original cell), 예를 들면, 조작된 미생물에 대하여 동일 타입의 유전적으로 조작되지 않은 세포를 나타낸다. 특정한 유전적 변형에 대하여, 상기 "모세포"는 상기 특정 유전적 변형을 갖지 않은 세포이지만, 다른 상황에 대하여는 동일한 것일 수 있다. 따라서, 상기 모세포는 주어진 단백질 (예를 들면, 글루코키나제와 약 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질)의 증가된 활성을 갖는 유전적으로 조작된 미생물을 생산하는데 출발 물질 (starting material)로 사용된 세포일 수 있다. 더 설명하면, 글루코키나제를 코딩하는 유전자가 유전적으로 변형되어 세포 중 글루코키나제 활성이 증가된 미생물에 대하여, 상기 모세포는 유전적으로 변형되지 않은 미생물일 수 있다. 동일한 비교가 다른 유전적 변형에도 적용된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "유전자"는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미하며, 5'-비코딩 서열(5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence)의 조절 서열(regulatory sequence)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

본 명세서에 있어서 핵산 또는 폴리펩티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가 또는 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 뉴클레오티드가 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 프로그램의 일례로 BLASTN(NCBI), BLASTP(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlign^TM (DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.

여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어서 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 등을 포함하는 서열 동일성이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "유전적 변형 (genetic modification)"이란 세포의 유전물질의 구성 또는 구조를 인위적으로 변경시키는 것을 포함한다.

일 양상은 글루코키나제 (glucokinase) 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 재조합 미생물을 제공한다. 상기 재조합 미생물은 증가된 셀룰로오스 생산능을 갖는 것일 수 있다.

상기 유전적 변형은 상기 글루코키나제를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 상기 글루코키나제를 코딩하는 유전자의 카피 수 증가 또는 상기 폴리포스페이트 키나아제를 코딩하는 유전자의 발현조절 서열의 변형인 것일 수 있다.

상기 글루코키나제는 ATP + 글루코스를 ADP + 글루코스-6-포스페이트로 가역적으로 전환하는 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 글루코키나제는 EC 2.7.1.2에 속하는 것일 수 있다. 상기 글루코키나제는 서열번호 2, 4, 또는 6의 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드인 것일 수 있다. 이들 폴리펩티드는 각각 대장균, Saccharomyces cerevisiae, 및 Zymomonas mobilis 유래의 것이다. 상기 글루코키나제는 서열번호 1, 3, 또는 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 재조합 미생물은 글루코스 페르메아제 (glucose permease) 활성을 증가시키는 유전적 변형, 포스포글루코뮤타제(phosphoglucomutase: PGM) 활성을 증가시키는 유전적 변형, 및 UTP-글루코스 피로포스포릴라제(UTP-glucose pyrophosphorylase: UGP) 활성을 증가시키는 유전적 변형 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

상기 유전적 변형은 각 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 각 효소를 코딩하는 유전자의 카피 수 증가 또는 각 효소를 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열의 변형인 것일 수 있다.

상기 글루코스 페르메아제는 상기 글루코스 페르메아제는 세포 밖에 있는 글루코스를 세포 내부로의 수송을 촉매하는 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 글루코스 페르메아제는 서열번호 8의 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드인 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 대장균 galP 산물이다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 PGM은 글루코스의 1' 위치의 포스페이트를 6' 위치로 이동시키거나 그 반대방향으로 이동시키는 것을 촉매하는 것일 수 있다. 상기 PGM은 EC 5.4.2.2에 속하는 것일 수 있다. 상기 PGM은 서열번호 10, 12, 또는 14의 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드인 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 9, 11 또는 13의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 서열번호 10, 12, 또는 14의 폴리펩티드는 각각 Xanthomonas campestris xanA, Bacillus subtilis pgca, 및 Komagataeibacter xylinus pgm 유전자 발현 산물이다.

상기 UGP는 하기 반응을 촉매하는 것일 수 있다.

글루코스-1-포스페이트+UTP ↔UDP-글루코스+피로포스페이트

상기 UGP는 EC 2.7.7.9에 속하는 것일 수 있다. 상기 UGP는 서열번호 16, 18, 또는 20의 의 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드인 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 15, 17 또는 19의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 서열번호 16, 18, 또는 20의 폴리펩티드는 각각 E.coli galU, Mycobacterium tuberculosis ugp, 및 Xanthomonas campestris ugp 유전자의 발현 산물이다.

상기 미생물은 glcP 유전자; PGM 유전자; UGP 유전자; glcP 유전자 및 PGM 유전자; glcP 유전자 및 UGP 유전자; PGM 유전자 및 UGP 유전자; glcP 유전자 및 PGM 유전자 및 UGP 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형을 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 유전적 변형은 glk, 및 glcP, PGM, UGP, 또는 이들을 조합을 각각 코딩하는 유전자가 도입된 것, 예를 들면 벡터와 같은 비히클을 통하여 도입된 것일 수 있다. 상기 glk를 코딩하는 유전자 및 및 glcP, PGM, UGP, 또는 이들을 조합을 코딩하는 유전자 중 하나 이상은 염색체 내 또는 염색체 외에 존재할 수 있다. 상기 유전자는 각각 복수 개, 예를 들면, 2 이상, 5 이상, 10 이상, 30 이상, 50 이상, 100 이상, 또는 1000 이상일 수 있다.

상기 미생물은 Komagataeibacter, Acetobacter, Gluconacetobacter, 또는 Enterobacter 속에 속하는 것과 같은 박테리아 셀룰로오스 생산능을 갖는 것일 수 있다. 상기 미생물은 Komagataeibacter 속에 속하는 것으로서 박테리아 셀룰로오스 생산능을 갖는 것일 수 있다. 상기 미생물은 K. xylinus ("G. xylinus"라고도 한다), K.rhaeticus, K. swingsii , K. kombuchae , K. nataicola , 또는 K. sucrofermentans 일 수 있다.

다른 양상은 상기한 글루코키나제 (glucokinase) 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 재조합 미생물을 배지 중에서 배양하여 셀룰로오스를 생성하는 단계; 및 상기 배양물로부터 상기 셀룰로오스를 회수하는 단계를 포함하는 셀룰로오스를 생산하는 방법을 제공한다.

상기 방법에서, 재조합 미생물에 대하여는 상기한 바와 같다.

상기 배양은 탄소원, 예를 들면, 글루코스를 함유하는 배지에서 수행될 수 있다. 미생물 배양에 사용되는 배지는 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 숙주 세포의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적합한 배지는 상업적인 판매자로부터 입수 가능하고 또는 공지된 제조법에 따라 제조될 수 있다.

상기 배양에 선택되는 산물에 따라 특정한 미생물의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 염, 미량 원소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다.

상기 배양의 조건은 선택되는 산물, 예를 들면, 셀룰로오스 생산에 적합하게 적절히 조절될 수 있다. 상기 배양은 세포 증식을 위하여 호기성 조건에서 이루어질 수 있다. 상기 배양은 교반 배양 (spinner culture)하거나 또는 교반 없이 정치 배양 (static culture)하는 것일 수 있다. 상기 미생물의 농도는 셀룰로오스의 생성에 방해가 되지 않는 정도의 간격이 주어지도록 하는 농도일 수 있다.

용어, "배양 조건"은 미생물을 배양하기 위한 조건을 의미한다. 이러한 배양 조건은 예를 들어, 미생물이 이용하는 탄소원, 질소원 또는 산소 조건일 수 있다. 미생물이 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류를 포함할 수 있다. 상기 탄소원은 자화가능한 당으로서, 글루코스, 프럭토스, 만노스, 또는 갈락토스를 포함할 수 있다. 상기 질소원은 유기 질소 화합물, 또는 무기 질소 화합물일 수 있다. 상기 질소원은 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 또는 암모늄염 일 수 있다. 미생물을 배양하는 산소 조건에는 정상 산소 분압의 호기성 조건, 또는 대기중에 0.1% 내지 10%의 산소를 포함하는 저산소 조건이 있다. 대사 경로는 미생물가 실제로 이용 가능한 탄소원 및 질소원에 맞추어 수정될 수 있다.

상기 배지는 에탄올 또는 셀룰로오스를 포함할 수 있다. 상기 에탄올은 배지 부피에 대하여 0.1 내지 5%(v/v), 예를 들면, 0.3 내지 2.5%(v/v), 0.3 내지 2.0%(v/v), 0.3 내지 1.5%(v/v), 0.3 내지 1.25%(v/v), 0.3 내지 1.0%(v/v), 0.3 내지 0.7%(v/v), 또는 0.5 내지 3.0%(v/v)일 수 있다. 상기 셀룰로오스는 배지 중량에 대하여 0.5 내지 5%(w/v), 0.5 내지 2.5%(w/v), 0.5 내지 1.5%(w/v), 또는 0.7 내지 1.25%(w/v)일 수 있다. 상기 셀룰로오스는 카로복실화된 셀룰로오스일 수 있다. 상기 셀룰로오스는 CMC일 수 있다. 상기 CMC는 소듐CMC일수 있다.

상기 방법은 상기 배양물로부터 상기 셀룰로오스를 회수하는 단계를 포함한다. 상기 분리는 예를 들면 배지 상단에 형성된 셀룰로오스 박막(cellulose pellicle)을 회수하는 것일 수 있다. 상기 셀룰로오스 박막은 물리적으로 걷어내거나 배지를 제거함으로써 회수될 수 있다. 상기 분리는 셀룰로오스 박막의 모양을 훼손시키지 않고 유지한 채로 회수하는 것일 수 있다.

다른 양상은 셀룰로오스 생산능을 갖는 미생물에 글루코키나제를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계를 포함하는, 셀룰로오스 생산능이 증가된 미생물을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 또한 상기 미생물에 글루코키나제를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 유전자를 도입하는 단계는 상기 유전자를 포함하는 비히클을 상기 미생물에 도입하는 것일 수 있다. 상기 방법에 있어서, 상기 유전적 변형은 상기 유전자를 증폭하는 것, 상기 유전자의 조절 서열을 조작하는 것, 또는 상기 유전자 자체의 서열을 조작하는 것을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조작은 뉴클레오티드의 삽입, 치환, 전환 또는 부가인 것일 수 있다.

상기 방법은 glcP 유전자; PGM 유전자; UGP 유전자 또는 이들의 조합을 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다.

일 양상에 따른 재조합 미생물에 의하면, 셀룰로오스를 고효율로 생산하는데 사용할 수 있다.

다른 양상에 따른 셀룰로오스를 생산하는 방법에 의하면, 셀룰로오스를 효율적으로 생산할 수 있다.

다른 양상에 따른 셀룰로오스 생산능이 증가된 미생물을 제조하는 방법에 의하면, 셀룰로오스 생산능이 증가된 미생물을 효율적으로 제조할 수 있다.

도 1은 4개 유전자를 삽입하는데 사용하기 위한 벡터 pIN04를 나타낸 도면이다.
도 2는 유전자 4개를 포함하는 pIN04-galP-xanA-galU-glk를 나타낸 도면이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 글루코스 페르메아제 , GLK1 , PGM , 및 UGP 유전자를 포함하는 K.xylinus 의 제작 및 셀룰로오스의 생산

본 실시예에서는 글루코스를 당원으로 하여 셀룰로오스 합성 경로에 작용하는 4개의 유전자 즉, 글루코스 페르메아제, GLK1, PGM, 및 UGP 유전자를 선정하였다. 선정된 4개의 유전자를 각각 또는 그 조합을 Komagataeibacter xylinus (한국 미생물보존센터 KCCM 41431) 및 GDH 유전자가 결실된 K. xylinus에 도입하여, 셀룰로오스 생산능에 미치는 영향을 확인하였다.

(1) GDH 유전자가 결실된 K. xylinus 의 제작

Komagataeibacter xylinus (한국 미생물보존센터 KCCM 41431) 중의 막 결합된 PQQ-의존성 글루코스 데히드로게나제(GDH) 유전자를 상동 재조합(homologous recombination)에 의하여 불활성화시켰다. 구체적 과정은 다음과 같다.

GDH 유전자를 상동성 재조합 방법으로 결실하기 위하여 GDH 유전자의 5' 말단과 3' 말단의 단편을 K.xylinus의 게놈 서열을 주형으로 하여 각각 GDH-5-F(서열번호 21)와 GHD-5-R(서열번호 22) 프라이머 세트와 GDH-3-F(서열번호 23)와 GHD-3-R(서열번호 24) 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭에 의해 얻었다. 또한 Tn5 유래 카나마이신 내성 유전자인 neo 유전자(nptII) 단편을 서열번호 25와 서열번호 26 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭에 의해 얻었다. 상기 GDH 유전자의 5' 말단 단편과 3' 말단 단편 및 카나마이신 저항성 유전자 단편 3종을 pGEM-3zf 벡터(#P2271, Promega Corp.)의 SacI과 XbaI 제한효소 위치에 In-fusion HD cloning kit(#PT5162-1, Clontech)를 이용하여 클로닝함으로써 pGz-dGDH를 제작하였다. 얻어진 벡터를 K.xylinus에 전기충격(electroporation) 방법에 의하여 형질도입하였다. 형질도입된 K.xylinus 균주를 100 ㎍/ml의 카나마이신이 첨가된 HS-agar 배지(peptone 0.5%, yeast extract 0.5%, Na₂HPO₄ 0.27%, Citric acid 0.15%, glucose 2%, 및 박토-아가 1.5%) 배지에 도말하여 30℃에서 배양했다. 카나마이신 내성을 갖는 균주를 선별함으로써 GDH 유전자가 결실되도록 하였다. 그 결과, GDH 유전자가 결실된 것을 확인하고, 이 균주를 K.xylinus(△gdh)로 명명하였다.

(2) 글루코스 페르메아제 유전자의 도입

K.xylinus(△gdh)에 Escherichia coli galP 유전자 즉, 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 도입하였다. Escherichia coli galP는 갈락토스-프로톤 심포터(galactose-proton symporter)이다. 이 효소는 양이온의 수반된 수송과 함께 경계막(boundary membrane)을 가로질러 갈락토스 및 글루코스를 세포 내로 섭취하게 한다. 구체적인 도입 과정은 다음과 같다.

프라이머 세트 즉, Ec.galP-F(서열번호 17과 18)의 프라이머를 프라이머로 하고, E.coli의 각 게놈 서열을 주형으로 하여 PCR 함으로써 상기 미생물 유래의 글루코스 페르메아제 유전자를 얻었다.

이를 pCSa(서열번호 29)의 PstI 제한효소 위치에 In-fusion HD cloning kit(#PT5162-1, Clontech)를 이용하여 클로닝함으로써 Tac promoter 하에서 발현되도록 하였다. 얻어진 벡터를 K.xylinus(△gdh)에 전기충격(electroporation) 방법에 의하여 형질도입하였다. 형질도입된 K.xylinus(△gdh) 균주를 100 ㎍/ml의 클로람페니콜이 첨가된 HS-agar 배지(peptone 0.5%, yeast extract 0.5%, Na₂HPO₄ 0.27%, Citric acid 0.15%, glucose 2%, 및 박토-아가 1.5%)에 도말하여 30℃에서 배양했다. 클로람페니콜 내성을 갖는 균주를 선별함으로써 글루코스 페르메아제 유전자가 과발현된 균주를 제작하였다.

(3) 글루코키나제 유전자의 도입

K.xylinus(△gdh)에 Escherichia coli glk, Saccharomyces cerevisiae glk, 및 Zymomonas mobilis glk 유전자 즉, 각각 서열번호 1, 3, 또는 5의 뉴클레오티드 서열을 도입하였다. 구체적인 도입 과정은 다음과 같다.

3개 프라이머 세트 즉, 서열번호 30와 31; 서열번호 32와 33; 및 서열번호 34와 35;의 프라이머를 프라이머로 하고, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, 및 Zymomonas mobilis의 각 게놈 서열을 주형으로 하여 PCR 함으로써 상기 미생물 유래의 glk 유전자를 각각 얻었다.

이를 pCSa(서열번호 29)의 PstI 제한효소 위치에 In-fusion HD cloning kit(#PT5162-1, Clontech)를 이용하여 클로닝함으로써 Tac promoter 하에서 발현되도록 하였다. 얻어진 벡터를 K.xylinus(△gdh)에 전기충격(electroporation) 방법에 의하여 형질도입하였다. 형질도입된 K.xylinus(△gdh) 균주를 100 ㎍/ml의 클로람페니콜이 첨가된 HS-agar 배지(peptone 0.5%, yeast extract 0.5%, Na₂HPO₄ 0.27%, Citric acid 0.15%, glucose 2%, 및 박토-아가 1.5%)에 도말하여 30℃에서 배양했다. 클로람페니콜 내성을 갖는 균주를 선별함으로써 glk 유전자가 과발현된 균주를 제작하였다.

(4) 포스포글루코뮤타제 유전자의 도입

K.xylinus(△gdh)에 Xanthomonas campestris xanA, Bacillus subtilis pgca, 및 Komagataeibacter xylinus pgm 유전자 즉, 각각 서열번호 9, 11, 또는 13의 뉴클레오티드 서열을 도입하였다. 구체적인 도입 과정은 다음과 같다.

3개 프라이머 세트 즉, 서열번호 36과 37; 서열번호 38와 39; 서열번호 40와 41의 프라이머를 프라이머로 하고, Xanthomonas campestris, Bacillus subtilis, 및 K.xylinus의 각 게놈 서열을 주형으로 하여 PCR 함으로써 상기 미생물 유래의 pgm 유전자를 각각 얻었다.

이를 pCSa(서열번호 29)의 PstI 제한효소 위치에 In-fusion HD cloning kit(#PT5162-1, Clontech)를 이용하여 클로닝함으로써 Tac promoter 하에서 발현되도록 하였다. 얻어진 벡터를 K.xylinus에 전기충격(electroporation) 방법에 의하여 형질도입하였다. 형질도입된 K.xylinus 균주를 100 ㎍/ml의 클로람페니콜이 첨가된 HS-agar 배지(peptone 0.5%, yeast extract 0.5%, Na₂HPO₄ 0.27%, Citric acid 0.15%, glucose 2%, 및 박토-아가 1.5%)에 도말하여 30℃에서 배양했다. 클로람페니콜 내성을 갖는 균주를 선별함으로써 gpm 유전자가 과발현된 균주를 제작하였다.

(5) UTP- 글루코스 피로포스포릴라제 유전자의 도입

K.xylinus(△gdh)에 Escherichia coli galU, Mycobacterium tuberculosis galU, 또는 Xanthomonas campestris ugp 유전자 즉, 각각 서열번호 15, 42(코돈 최적화된 것), 또는 19의 뉴클레오티드 서열을 도입하였다. 구체적인 도입 과정은 다음과 같다.

3개 프라이머 세트 즉, 서열번호 43와 44; 서열번호 45와 46; 서열번호 47와 48의 프라이머를 프라이머로 하고, Escherichia coli의 게놈 서열, K.xylinus의 선호 코돈으로 최적화하여 합성한 Mycobacterium tuberculosis의 ugp 유전자, 또는 Xanthomonas campestris의 게놈 서열을 주형으로 하여 PCR 함으로써 상기 미생물 유래의 UTP-글루코스피로포스포릴라제 유전자를 각각 얻었다.

이를 pCSa(서열번호 29)의 PstI 제한효소 위치에 In-fusion HD cloning kit(#PT5162-1, Clontech)를 이용하여 클로닝함으로써 Tac promoter 하에서 발현되도록 하였다. 얻어진 벡터를 K.xylinus(△gdh)에 전기충격(electroporation) 방법에 의하여 형질도입하였다. 형질도입된 K.xylinus(△gdh) 균주를 100 ㎍/ml의 클로람페니콜이 첨가된 HS-agar 배지(peptone 0.5%, yeast extract 0.5%, Na₂HPO₄ 0.27%, Citric acid 0.15%, glucose 2%, 및 박토-아가 1.5%)에 도말하여 30℃에서 배양했다. 클로람페니콜 내성을 갖는 균주를 선별함으로써 ugp 유전자가 과발현된 균주를 제작하였다.

(6) 글루코키나제 , 글루코스 페르메아제 , 포스포글루코뮤타제 및 UTP-글루코스 피로포스포릴라제 유전자의 도입

Komagataeibacter xylinus (한국 미생물보존센터 KCCM 41431)에서, 4개 유전자를 상동 재조합(homologous recombination)에 의하여 게놈에 도입하였다. 상기 4개 유전자는 글루코스 페르메아제 활성을 갖고 있는 Escherichia coli galP, 글루코키나제 활성을 갖고 있는 Escherichia coli glk, 포스포글루코뮤타제 활성을 갖고 있는 Xanthomonas campestris xanA, 및 UTP-글루코스 피로포스포릴라제 활성을 갖고 있는 E.coli galU 유전자이다. 구체적 과정은 다음과 같다.

K.xylinus 게놈 삽입용 벡터를 제작하기 위하여, 게놈 중 Gene 00648에 상동성 재조합 방법으로 삽입하기 위하여 Gene 00648 유전자의 5' 말단과 3' 말단의 단편을 K.xylinus의 게놈 서열을 주형으로 하여, 테트라사이클린 내성 유전자, 프로모터, 및 터미네이터를 갖는 유전자를 합성하였다. 합성된 유전자를 주형으로 하여, 각각 서열번호 49와 서열번호 50의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭에 의해 얻은 유전자 단편을 pUC19 벡터 (#N3041S, NEB)의 EcoRI과 HindIII 제한효소 위치에 In-fusion HD cloning kit(#PT5162-1, Clontech)를 이용하여 클로닝함으로써 pIN04(0648-tet-Ptac)(서열번호 52)을 제작하였다. 도 1은 4개 유전자를 삽입하는데 사용하기 위한 벡터 pIN04를 나타낸 도면이다.

Escherichia coli galP 유전자, E.coli glk 유전자, Xanthomonas campestris xanA 유전자, 및 E.coli galU 유전자 단편의 4 종을 합성하여 서열번호 51 및 52의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭에 의해 얻은 유전자 단편을 pIN04(0648-tet-Ptac) 벡터의 SacI과 XbaI 제한효소 위치에 In-fusion HD cloning kit(#PT5162-1, Clontech)를 이용하여 클로닝함으로써 pIN04-galP-xanA-galU-glk(서열번호 53)를 제작하였다.

도 2는 4개 유전자를 포함하는 pIN04-galP-xanA-galU-glk를 나타낸 도면이다. 도 2에서, galP는 Escherichia coli galP, glk는 Escherichia coli glk, galU는 Escherichia coli galU, 및 xanA는 Xanthomonas campestris xanA 유전자를 나타낸다.

얻어진 벡터를 K.xylinus에 전기충격(electroporation) 방법에 의하여 형질도입하였다. 형질도입된 K.xylinus 균주를 100 ㎍/ml의 테트라사이클린이 첨가된 HS-agar 배지(peptone 0.5%, yeast extract 0.5%, Na₂HPO₄ 0.27%, Citric acid 0.15%, glucose 2%, 및 박토-아가 1.5%) 배지에 도말하여 30℃에서 배양했다. 테트라사이클린 내성을 갖는 균주를 선별함으로써 유전자가 삽입되도록 하였다. 그 결과, 4개 유전자가 삽입된 것을 확인하고, 이 균주를 K.xylinus(+4G)로 명명하였다.

(7) 셀룰로오스 생산량의 확인

상기한 (2) 내지 (5)절에서 제작된 지정된 K. xylinus 균주를 HS 배지(peptone 0.5%, yeast extract 0.5%, Na₂HPO₄ 0.27%, Citric acid 0.15%, 및 glucose 4%) 25ml를 함유한 125ml 플라스크(flask)에 접종하고 30℃에서 230rpm으로 교반하면서 5일 동안 배양하고, 셀룰로오스를 측정하였다. 글루코스 페르메아제, glk, pgm, 또는 ugp 유전자가 과발현된 재조합 균주의 경우, 배양시 클로람페니콜 100 ㎍/ml을 배지에 첨가하였다. 글루코스는 Aminex HPX-87H 컬럼 (Bio-Rad, USA)이 장착된 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 분석하였으며, 셀룰로오스 생산량은 플라스크 내 형성된 셀룰로오스 고형물을 0.1 N 수산화나트륨 용액과 물로 세척하여 60℃ 오븐에서 건조 후 중량을 측정하였다. 표 1은 균주에 따른 셀룰로오스 생산량을 나타낸다.

균주	셀룰로오스 생산량(mg/L)
대조군	524.0
Ec galP	576.4
Xc xanA	807.0
Ec galU	979.88
Zc glk	602.6

표 1에서, 대조군은 K.xylinus(△gdh)이고, Ec galP, Xc XanA, Ec galU 및 Ec glk는 각각 K.xylinus(△gdh) Escherichia coli galP, Xanthomonas campestris xanA, Escherichia coli galU, 및 Escherichia coli glk 유전자가 도입된 것을 나타낸다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 각 재조합 균주는 대조군에 비하여 증가된 셀룰로오스 생산량을 보였다.

또한, (6)절에서 제작된 K.xylinus(+4G)에 대하여 배양하고 셀룰로오스 생산량을 측정하였다. 배양은 HE 배지에서 1.0(v/v)% 에탄올을 포함하는 HSE 배지를 사용하고, 50 mL 배지의 250 mL 플라스크를 사용하고, 5일 대신 6일 동안 배양한 것을 제외하고는 상기한 바와 동일하게 배양하고, 셀룰로오스를 측정하였다. 그 결과는 표 2에 기재되어 있다.

균주	셀룰로오스 생산량(g/L)
야생형 K.xylinus	5.092
K.xylinus(+4G)	5.804

표 2에 나타낸 바와 같이, 야생형 대조군에 비하여 K.xylinus(+4G)는 현저하게 증가된 셀룰로오스를 생산하였다.

<110> Samsung Electronics Co., Ltd. <120> Komagataeibacter genus recombinant microorganism, method for producing cellulose using the same, and method for producing the microorganism <130> PN118829kr <160> 54 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 966 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 atgacaaagt atgcattagt cggtgatgtg ggcggcacca acgcacgtct tgctctgtgt 60 gatattgcca gtggtgaaat ctcgcaggct aagacctatt cagggcttga ttaccccagc 120 ctcgaagcgg tcattcgcgt ttatcttgaa gaacataagg tcgaggtgaa agacggctgt 180 attgccatcg cttgcccaat taccggtgac tgggtggcga tgaccaacca tacctgggcg 240 ttctcaattg ccgaaatgaa aaagaatctc ggttttagcc atctggaaat tattaacgat 300 tttaccgctg tatcgatggc gaacccgatg ctgaaaaaag agcatctgat tcagtttggt 360 ggcgcagaac cggtcgaagg taagcctatt gcggtttacg gtgccggaac ggggcttggg 420 gttgcgcatc tggtccatgt cgataagcgt tgggtaagct tgccaggcga aggcggtcac 480 gttgattttg cgccgaatag tgaagaagag gccattatcc tcgaaatatt gcgtgcggaa 540 attggtcatg tttcggcgga ggcgtgcctt tctggccctg ggctggtgaa tttgtatcgc 600 gcaattgtga 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Glu His Leu Ile Gln Phe Gly Gly Ala Glu Pro Val Glu Gly Lys 115 120 125 Pro Ile Ala Val Tyr Gly Ala Gly Thr Gly Leu Gly Val Ala His Leu 130 135 140 Val His Val Asp Lys Arg Trp Val Ser Leu Pro Gly Glu Gly Gly His 145 150 155 160 Val Asp Phe Ala Pro Asn Ser Glu Glu Glu Ala Ile Ile Leu Glu Ile 165 170 175 Leu Arg Ala Glu Ile Gly His Val Ser Ala Glu Ala Cys Leu Ser Gly 180 185 190 Pro Gly Leu Val Asn Leu Tyr Arg Ala Ile Val Lys Ala Asp Asn Arg 195 200 205 Leu Pro Glu Asn Leu Lys Pro Lys Asp Ile Thr Glu Arg Ala Leu Ala 210 215 220 Asp Ser Cys Thr Asp Cys Arg Arg Ala Leu Ser Leu Phe Cys Val Ile 225 230 235 240 Met Gly Arg Phe Gly Gly Asn Leu Ala Leu Asn Leu Gly Thr Phe Gly 245 250 255 Gly Val Phe Ile Ala Gly Gly Ile Val Pro Arg Phe Leu Glu Phe Phe 260 265 270 Lys Gly Ser Gly Phe Arg Ala Ala Phe Glu Asp Lys Gly Arg Phe Lys 275 280 285 Glu Tyr Val His Asp Ile Pro Val Tyr Leu Ile Val His Asp Asn Pro 290 295 300 Gly Leu Leu Gly Ser Gly Ala His Leu Arg Gln Thr Leu Gly His Ile 305 310 315 320 Leu <210> 3 <211> 1503 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 atgtcattcg acgacttaca caaagccact gagagagcgg tcatccaggc cgtggaccag 60 atctgcgacg atttcgaggt tacccccgag aagctggacg aattaactgc ttacttcatc 120 gaacaaatgg aaaaaggtct agctccacca aaggaaggcc acacattggc ctcggacaaa 180 ggtcttccta tgattccggc gttcgtcacc gggtcaccca acgggacgga gcgcggtgtt 240 ttactagccg ccgacctggg tggtaccaat ttccgtatat gttctgttaa cttgcatgga 300 gatcatactt tctccatgga gcaaatgaag tccaagattc ccgatgattt gctagacgat 360 gagaacgtca catctgacga cctgtttggg tttctagcac gtcgtacact ggcctttatg 420 aagaagtatc acccggacga gttggccaag ggtaaagacg ccaagcccat gaaactgggg 480 ttcactttct cataccctgt agaccagacc tctctaaact ccgggacatt gatccgttgg 540 accaagggtt tccgcatcgc ggacaccgtc ggaaaggatg tcgtgcaatt gtaccaggag 600 caattaagcg ctcagggtat gcctatgatc aaggttgttg cattaaccaa cgacaccgtc 660 ggaacgtacc tatcgcattg ctacacgtcc gataacacgg actcaatgac gtccggagaa 720 atctcggagc cggtcatcgg atgtattttc ggtaccggta ccaatgggtg ctatatggag 780 gagatcaaca agatcacgaa 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Asp Asp Phe Glu Val Thr Pro Glu Lys Leu 20 25 30 Asp Glu Leu Thr Ala Tyr Phe Ile Glu Gln Met Glu Lys Gly Leu Ala 35 40 45 Pro Pro Lys Glu Gly His Thr Leu Ala Ser Asp Lys Gly Leu Pro Met 50 55 60 Ile Pro Ala Phe Val Thr Gly Ser Pro Asn Gly Thr Glu Arg Gly Val 65 70 75 80 Leu Leu Ala Ala Asp Leu Gly Gly Thr Asn Phe Arg Ile Cys Ser Val 85 90 95 Asn Leu His Gly Asp His Thr Phe Ser Met Glu Gln Met Lys Ser Lys 100 105 110 Ile Pro Asp Asp Leu Leu Asp Asp Glu Asn Val Thr Ser Asp Asp Leu 115 120 125 Phe Gly Phe Leu Ala Arg Arg Thr Leu Ala Phe Met Lys Lys Tyr His 130 135 140 Pro Asp Glu Leu Ala Lys Gly Lys Asp Ala Lys Pro Met Lys Leu Gly 145 150 155 160 Phe Thr Phe Ser Tyr Pro Val Asp Gln Thr Ser Leu Asn Ser Gly Thr 165 170 175 Leu Ile Arg Trp Thr Lys Gly Phe Arg Ile Ala Asp Thr Val Gly Lys 180 185 190 Asp Val Val Gln Leu Tyr Gln Glu Gln Leu Ser Ala Gln Gly Met Pro 195 200 205 Met Ile Lys Val Val Ala Leu Thr Asn Asp Thr Val Gly Thr Tyr Leu 210 215 220 Ser His Cys Tyr Thr Ser Asp Asn Thr Asp Ser Met Thr Ser Gly Glu 225 230 235 240 Ile Ser Glu Pro Val Ile Gly Cys Ile Phe Gly Thr Gly Thr Asn Gly 245 250 255 Cys Tyr Met Glu Glu Ile Asn Lys Ile Thr Lys Leu Pro Gln Glu Leu 260 265 270 Arg Asp Lys Leu Ile Lys Glu Gly Lys Thr His Met Ile Ile Asn Val 275 280 285 Glu Trp Gly Ser Phe Asp Asn Glu Leu Lys His Leu Pro Thr Thr Lys 290 295 300 Tyr Asp Val Val Ile Asp Gln Lys Leu Ser Thr Asn Pro Gly Phe His 305 310 315 320 Leu Phe Glu Lys Arg Val Ser Gly Met Phe Leu Gly Glu Val Leu Arg 325 330 335 Asn Ile Leu Val Asp Leu His Ser Gln Gly Leu Leu Leu Gln Gln Tyr 340 345 350 Arg Ser Lys Glu Gln Leu Pro Arg His Leu Thr Thr Pro Phe Gln Leu 355 360 365 Ser Ser Glu Val Leu Ser His Ile Glu Ile Asp Asp Ser Thr Gly Leu 370 375 380 Arg Glu Thr Glu Leu Ser Leu Leu Gln Ser Leu Arg Leu Pro Thr Thr 385 390 395 400 Pro Thr Glu Arg Val Gln Ile Gln Lys Leu Val Arg Ala Ile Ser Arg 405 410 415 Arg Ser Ala Tyr Leu Ala Ala Val Pro Leu Ala Ala Ile Leu Ile Lys 420 425 430 Thr Asn Ala Leu Asn Lys Arg Tyr His Gly Glu Val Glu Ile Gly Cys 435 440 445 Asp Gly Ser Val Val Glu Tyr Tyr Pro Gly Phe Arg Ser Met Leu Arg 450 455 460 His Ala Leu Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Glu Gly Glu Arg Lys Val 465 470 475 480 His Leu Lys Ile Ala Lys Asp Gly Ser Gly Val Gly Ala Ala Leu Cys 485 490 495 Ala Leu Val Ala 500 <210> 5 <211> 984 <212> DNA <213> Zymomonas mobilis <400> 5 atggaaattg ttgcgattga catcggtgga acgcatgcgc gtttctctat tgcggaagta 60 agcaatggtc gggttctttc tcttggagaa gaaacaactt ttaaaacggc agaacatgct 120 agcttgcagt tagcttggga acgtttcggt gaaaaactgg gtcgtcctct gccacgtgcc 180 gcagctattg catgggctgg cccggttcat ggtgaagttt taaaacttac caataaccct 240 tgggtattaa gaccagctac tctgaatgaa aagctggaca tcgatacgca tgttctgatc 300 aatgacttcg gcgcggttgc ccacgcggtt gcgcatatgg attcttctta tctggatcat 360 atttgtggtc ctgatgaagc gcttcctagc gatggtgtta tcactattct tggtccggga 420 acgggcttgg gtgttgccca tctgttgcgg actgaaggcc gttatttcgt catcgaaact 480 gaaggcggtc atatcgactt tgctccgctt gacagacttg aagacaaaat tctggcacgt 540 ttacgtgaac gtttccgccg 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Gln Pro Gly Leu Leu Gly Ala Gln Leu Pro Met Pro Thr Asn Ile 305 310 315 320 Leu Lys Leu Asn Asn Ile Phe 325 <210> 7 <211> 1395 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 7 atgcctgacg ctaaaaaaca ggggcggtca aacaaggcaa tgacgttttt cgtctgcttc 60 cttgccgctc tggcgggatt actctttggc ctggatatcg gtgtaattgc tggcgcactg 120 ccgtttattg cagatgaatt ccagattact tcgcacacgc aagaatgggt cgtaagctcc 180 atgatgttcg gtgcggcagt cggtgcggtg ggcagcggct ggctctcctt taaactcggg 240 cgcaaaaaga gcctgatgat cggcgcaatt ttgtttgttg ccggttcgct gttctctgcg 300 gctgcgccaa acgttgaagt actgattctt tcccgcgttc tactggggct ggcggtgggt 360 gtggcctctt ataccgcacc gctgtacctc tctgaaattg cgccggaaaa aattcgtggc 420 agtatgatct cgatgtatca gttgatgatc actatcggga tcctcggtgc ttatctttct 480 gataccgcct tcagctacac cggtgcatgg cgctggatgc tgggtgtgat tatcatcccg 540 gcaattttgc tgctgattgg tgtcttcttc ctgccagaca gcccacgttg gtttgccgcc 600 aaacgccgtt ttgttgatgc cgaacgcgtg ctgctacgcc tgcgtgacac cagcgcggaa 660 gcgaaacgcg aactggatga aatccgtgaa agtttgcagg ttaaacagag 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aacgtgtaaa acgtcaactg cttgatgaag tgcagtctat ttgtccaccg 300 cacgtgacta ttatgcaagt tcgtcagggt ctggcgaaag gcctgggaca cgcggtattg 360 tgtgctcacc cggtagtggg tgatgaaccg gtagctgtta ttttgcctga tgttattctg 420 gatgaatatg aatccgattt gtcacaggat aacctggcag agatgatccg ccgctttgat 480 gaaacgggtc atagccagat catggttgaa ccggttgctg atgtgaccgc atatggcgtt 540 gtggattgca aaggcgttga attagcgccg ggtgaaagcg taccgatggt tggtgtggta 600 gaaaaaccga aagcggatgt tgcgccgtct aatctcgcta ttgtgggtcg ttacgtactt 660 agcgcggata tttggccgtt gctggcaaaa acccctccgg gagctggtga tgaaattcag 720 ctcaccgacg caattgatat gctgatcgaa aaagaaacgg tggaagccta tcatatgaaa 780 gggaagagcc atgactgcgg taataaatta ggttacatgc aggccttcgt tgaatacggt 840 attcgtcata acacccttgg cacggaattt aaagcctggc ttgaagaaga gatgggcatt 900 aagaagtaa 909 <210> 16 <211> 302 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 16 Met Ala Ala Ile Asn Thr Lys Val Lys Lys Ala Val Ile Pro Val Ala 1 5 10 15 Gly Leu Gly Thr Arg Met Leu Pro Ala Thr Lys Ala Ile Pro Lys Glu 20 25 30 Met Leu Pro Leu Val 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gacgatccca acgtgctgaa ggtccggggc 600 atggtcgaaa agcccaaagc cgaaacggcg ccgtcgcggt atgcggcagc agggcggtac 660 gttcttgacc gcgcgatctt cgatgcgctc cgccgcattg accagggggc cggcggggaa 720 gtgcagctca ccgatgcgat tgcgctgctg attgcggaag gccatcccgt tcatgtggtc 780 gtccaccagg ggtcccgcca tgacctgggc aatccgggcg ggtatctcaa agcggcggtt 840 gattttgccc ttgatcgcga tgattatggc ccggatctcc ggcgctggct cgtggcgcgc 900 cttgggctta ccgaacagtg a 921 <210> 18 <211> 306 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 18 Met Ser Arg Pro Glu Val Leu Thr Pro Phe Thr Ala Ile Val Pro Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Gly Thr Arg Phe Leu Pro Ala Thr Lys Thr Val Pro Lys 20 25 30 Glu Leu Leu Pro Val Val Asp Thr Pro Gly Ile Glu Leu Val Ala Ala 35 40 45 Glu Ala Ala Ala Ala Gly Ala Glu Arg Leu Val Ile Val Thr Ser Glu 50 55 60 Gly Lys Asp Gly Val Val Ala His Phe Val Glu Asp Leu Val Leu Glu 65 70 75 80 Gly Thr Leu Glu Ala Arg Gly Lys Ile Ala Met Leu Ala Lys Val Arg 85 90 95 Arg Ala Pro Ala Leu Ile Lys Val Glu Ser Val Val Gln Ala Glu Pro 100 105 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Claims (20)

1. 글루코키나제 (glucokinase) 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 재조합 코마가타에이박터(Komagataeibacter) 속 미생물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 유전적 변형은 상기 글루코키나제를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 것인 미생물.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 유전적 변형은 상기 글루코키나제를 코딩하는 유전자의 카피 수 증가 또는 상기 폴리포스페이트 키나아제를 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열의 변형인 것인 미생물.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 글루코키나제는 EC 2.7.1.2에 속하는 것인 미생물.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 글루코키나제는 ATP + 글루코스를 ADP + 글루코스-6-포스페이트로 가역적으로 전환하는 활성을 갖는 것인 미생물.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 글루코키나제는 서열번호 11, 12, 또는 13의 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드인 것인 미생물.
7. 청구항 1에 있어서, 글루코스 페르메아제 (glucose permease) 활성을 증가시키는 유전적 변형, 포스포글루코뮤타제(phosphoglucomutase: PGM) 활성을 증가시키는 유전적 변형, 및 UTP-글루코스 피로포스포릴라제(UTP-glucose pyrophosphorylase: UGP) 활성을 증가시키는 유전적 변형 중 하나 이상을 더 포함하는 것인 미생물.
8. 청구항 7에 있어서, 상기 유전적 변형은 각 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 것인 미생물.
9. 청구항 7에 있어서, 상기 유전적 변형은 각 효소를 코딩하는 유전자의 카피 수 증가 또는 각 효소를 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열의 변형인 것인 미생물.
10. 청구항 7에 있어서, 상기 글루코스 페르메아제는 세포 밖에 있는 글루코스를 세포 내부로 수송하는 활성을 갖는 것이고, PGM, 및 UGP는 각각 EC 5.4.2.2, 및 EC 2.7.9에 속하는 것인 미생물.
11. 청구항 7에 있어서, 상기 글루코스 페르메아제, PGM, 및 UGP는 각각 서열번호 1, 2, 및 3의 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드인 것인 미생물.
12. 청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 Komagataeibacter xylinus인 것인 미생물.
13. 청구항 1의 미생물을 배지 중에서 배양하여 셀룰로오스를 생성하는 단계; 및
    상기 배양물로부터 상기 셀룰로오스를 회수하는 단계를 포함하는 셀룰로오스를 생산하는 방법.
14. 청구항 13에 있어서, 상기 유전적 변형은 상기 글루코키나제를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 것인 방법.
15. 청구항 14에 있어서, 상기 유전적 변형은 상기 글루코키나제를 코딩하는 유전자의 카피 수 증가 또는 상기 글루코키나제를 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열의 변형인 것인 방법.
16. 청구항 14에 있어서, 상기 미생물은 글루코스 페르메아제 (glucose permease) 활성을 증가시키는 유전적 변형, 포스포글루코뮤타제(phosphoglucomutase: PGM) 활성을 증가시키는 유전적 변형, 및 UTP-글루코스 피로포스포릴라제(UTP-glucose pyrophosphorylase: UGP) 활성을 증가시키는 유전적 변형 중 하나 이상을 더 포함하는 것인 방법.
17. 청구항 16에 있어서, 상기 유전적 변형은 상기 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 것인 방법.
18. 청구항 16에 있어서, 상기 유전적 변형은 각 효소를 코딩하는 유전자의 카피 수 증가 또는 각 효소를 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열의 변형인 것인 방법.
19. 청구항 16에 있어서, 상기 글루코스 페르메아제는 세포 밖에 있는 글루코스를 세포 내부로 수송하는 활성을 갖는 것이고, PGM, 및 UGP는 각각 EC 5.4.2.2, 및 EC 2.7.9에 속하는 것인 방법.
20. 셀룰로오스 생산능을 갖는 미생물에 글루코키나제를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계를 포함하는, 셀룰로오스 생산능이 증가된 미생물을 제조하는 방법.

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